CN116716392A - 基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字PCR检测试剂盒，利用四个宿主基因ZDHHC19、C9orf95、HLA‑DPB1、C3AR1转录水平的检测，选用四个宿主基因中转录水平适中的C3AR1基因的检测值作为分母对其他通道的宿主基因的检测值进行标准化处理，利用四个宿主基因转录水平的变化关系计算得到四基因打分，通过四基因打分进行脓毒症的判断，具有特异性更高结果更准确的效果。另外，本方案设计了针对四个宿主基因的引物探针序列，可更为准确地检测到对应的基因转录水平。
Description
技术领域
本发明涉及基因领域，特别涉及一种基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字PCR检测试剂盒。
背景技术
脓毒症是由感染引起的全身炎症反应，可导致严重脓毒症和脓毒症休克。罹患这些严重病症的患者需要长期住院治疗，并且发病率和死亡率很高。全世界每年有2000至3000万例脓毒症患者，每3-4秒就有1人死于脓毒症。它由身体免疫系统针对严重感染产生的急性反应所引起。严重的脓毒症会导致器官功能障碍，如果低血压持续，身体还可能会进入致命性极高的脓毒性休克状态。脓毒症对其幸存者的长期影响包括永久性的器官损伤，以及生理和智力障碍。
尽管医学在不断进步，但严重脓毒症的发病率却在迅速上升。随着脓毒症的发病率上升，其治疗成本也在提高：在美国，1997年到2008年间的住院治疗费用上升了11.9％；在德国，据报道，典型案例的治疗成本在过去十年间增加了一倍多。早诊断在脓毒症治疗过程中起着决定性的作用。
目前针对脓毒症病原学的诊断方法包括：1.血培养，血培养结果阳性是诊断脓毒症的“金标准”，但并非所有脓毒症患者都可以获取阳性血培养结果，血培养阳性率受到采血量、采血时间、采血次数等因素的影响；2.血常规：血常规检测结果往往缺乏敏感度和特异性，因为血常规异常可能是很多其他原因造成的；3.炎性指标：临床上常用C反应蛋白和降钙素原进行脓毒症的诊断，但是这些指标也容易受到其他因素的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字PCR检测试剂盒，通过对四个宿主基因的转录水平进行检测并通过打分规则计算出脓毒症感染概率，实现特异性更好的脓毒症诊断。
本方案选用四个宿主基因的转录水平情况实现对脓毒症的准确检测，四个宿主基因分别为ZDHHC19、C9orf95、HLA-DPB1、C3AR1。这四个宿主基因在宿主感染脓毒症病原体时都会发生一定的变化，ZDHHC19在病毒感染的细胞中转录水平上调；通过单细胞测序和数字PCR技术筛选出的单核细胞差异基因C9orf95和C3AR1在早期脓毒症患者中高转录水平；HLA-DPB1与移植的免疫调节相关。
另外，本方案开发的检测体系使用同一扩增体系的不同通道同时检测四个基因，也就是说，一个样本的四个基因在同一个扩增管中进行扩增，这样的好处在于可以确保加样量完全一致而不需要持家基因的归一化。且因为不同患者单核细胞的含量差异较大，单核细胞的收集量差异也较大，因此不同样本的总RNA量不一样，检也较测时即使加相同体积的模板，检测值差异大，为了避免扩增时模板总量不同造成的差异，本方案选择四个宿主基因中转录水平比较适中的C3AR1检测值作为分母，每个通道的其他宿主基因的检测值作为分子进行检测值标准化处理，利用四个宿主基因的转录水平的检测值进行打分得到脓毒症感染值。
第一方面，本方案提供了一种宿主基因转录水平在进行脓毒症诊断时的应用，其中宿主基因ZDHHC19、C9orf95、HLA-DPB1、C3AR1，包括：获取宿主基因ZDHHC19、C9orf95、HLA-DPB1、C3AR1的转录水平，按照如下公式计算得到四基因打分：
四基因打分＝Bz/Bh+Bc9/Bh+Bc3/Bh；
其中Bz为ZDHHC19的转录水平，Bh为HLA-DPB1的转录水平，Bc9是C9orf95的转录水平，Bc3是C3AR1的转录水平，若四基因打分大于设定阈值则判断患有脓毒症。
在一些实施例中，若四基因打分大于2.18的话，判断感染脓毒症的概率大。
在一些实施例中，通过数字PCR方法进行四个宿主基因转录水平的检测。数字PCR的技术原理是通过分区扩增后检测所有反应单元的荧光信号，利用数字模型统计分析直接计算出目标靶分子的浓度或者拷贝数，无需对照标准样本和标准曲线，不依赖于CT值就可以实现决定定量分析。
在一些实施例中，在同一扩增体系的不同通道内检测四个宿主基因，获取对应通道的检测值作为宿主基因的转录水平。
在一些实施中，将特异性扩增宿主基因ZDHHC19、C9orf95、HLA-DPB1、C3AR1以及外源内参的引物探针混合得到引物探针混合液，并混合所述引物探针混合液制备ddPCR反应体系，将待测血液样本提取的RNA和ddPCR反应体系混合后在设定的扩增程序下进行扩增检测得到宿主基因转录水平的检测。
在一些实施例中，特异性扩增宿主基因ZDHHC19的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示，对应的标记序列如SEQ ID N0:17所示。在一些实施例中，特异性检测宿主基因ZDHHC19的探针序列的修饰荧光基团为FAM和MGB。
特异性扩增宿主基因C9orf95的引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，探针序列如SEQ ID NO:6所示，对应的标记序列如SEQ ID N0:18所示。
在一些实施例中，特异性检测宿主基因C9orf95的探针序列的修饰荧光基团为ROX和MGB。
特异性扩增宿主基因HLA-DPB1的引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，探针序列如SEQ ID NO:9所示，对应的标记序列如SEQ ID N0:19所示。在一些实施例中，特异性检测宿主基因HLA-DPB1的探针序列的修饰荧光基团为VIX和MGB。
特异性检测宿主基因C3AR1的引物序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示，探针序列如SEQ ID NO:12所示，对应的标记序列如SEQ ID N0:20所示。在一些实施例中，特异性检测宿主基因C3AR1的探针序列的修饰荧光基因为CY5和MGB。
本方案还随机生成了如SEQ ID NO:13-14的随机引物和SEQ ID NO:15的探针作为外源内参，对应的标记序列如SEQ ID N0:16所示。
具体的序列如下表一所示：
第二方面，本方案提供了一种基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字PCR检测试剂盒，包括：
特异性扩增宿主基因ZDHHC19的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示；
特异性扩增宿主基因C9orf95的引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，探针序列如SEQ ID NO:6所示；
特异性扩增宿主基因HLA-DPB1的引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，探针序列如SEQ ID NO:9所示；
特异性检测宿主基因C3AR1的引物序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示，探针序列如SEQ ID NO:12所示。
在一些实施例中，数字PCR检测试剂盒还包括如SEQ ID NO:13-14的随机引物和SEQ ID NO:15的探针作为外源内参。
在一些实施例中，数字PCR检测试剂盒还包括：水、ddPCR Mix，序列如SEQ ID N0:16所示的标记序列。
在一些实施例中，该数字PCR检测试剂盒用于数字PCR检测，在同一扩增管的不同通道内进行检测，获取不同通道的检测值作为对应宿主基因的转录水平，基于按照如下公式计算得到四基因打分：
四基因打分＝(Bz/Bh+Bc9/Bh+Bc3/Bh)/Bc3；
其中Bz为ZDHHC19的转录水平，Bh为HLA-DPB1的转录水平，Bc9是C9orf95的转录水平，Bc3是C3AR1的转录水平。
在一些实施例中，扩增程序为：95℃5min；【95℃15s，60℃30s】*40。
在一些实施例中，针对待测患者的血液样本进行检测。
第三方面，本方案提供了一种基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字PCR检测试剂盒的应用，用于非诊断目的的脓毒症诊断。
相较于现有技术，本技术方案具有以下特点和有益效果：
本方案利用数字PCR扩增技术在同一扩增管的不同通道内同时检测四个宿主基因的转录水平，不需要持家基因的归一化。且为了避免扩增时模板总量不同而带来的差异，本方案选用四个宿主基因中转录水平适中的C3AR1基因的检测值作为分母对其他通道的基因检测值进行标准化处理，利用四个宿主基因转录水平的变化关系计算得到四基因打分，通过四基因打分进行脓毒症的判断，具有特异性更高结果更准确的效果。另外，本方案设计了针对四个宿主基因的引物探针序列，可更为准确地检测到对应的基因转录水平。
附图说明
图1是45名患者临床血液样本的检测结果的散点分布图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了验证本方案的可行性，本申请人构建了数字PCR检测体系并进行了如下的实验验证：
数字PCR检测体系的构建：
混合得到引物探针混合液，引物探针混合液的混合体系如下表二所示：
表二引物探针混合液体系
| 组分 | 储存液(μM) | 体积(μL/人份) |
| ZDHHC19-F-1 | 100 | 0.1 |
| ZDHHC19-R-1 | 100 | 0.03 |
| ZDHHC19-P-1 | 100 | 0.1 |
| C9orf95-F-1 | 100 | 0.1 |
| C9orf95-R-1 | 100 | 0.03 |
| C9orf95-P-1 | 100 | 0.1 |
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| C3AR1-P | 100 | 0.15 |
| IC-F | 100 | 0.15 |
| IC-R | 100 | 0.045 |
| 合计 | / | 1.265 |
混合得到ddPCR反应体系，ddPCR反应体系如下表三所示：
表三ddPCR反应体系
| 试剂 | 体积(μL) | 终浓度 |
| 水 | 4.735 | |
| 引物探针混合液 | 1.265 | |
| 5XddPCR Mix | 3 | 1X |
| IC-S | 1 | |
| DNA | 5 | |
| 合计 | 15 |
DNA为待测样本的DNA。
扩增程序如下：
95℃5min；【95℃15s，60℃30s】*40。
验证：
选择8例正常人的血液样本进行检测，过柱法提取RNA，选择菌DNA样品：外购灭活菌，磁珠法提取基因组DNA。检测结果如下表四所示：
表四8例正常人血液样本检测
可见，本体系检测检测多种常见的细菌真菌的特异性正常，且8例正常人的血液样本，通过该试剂盒检测打分-0.02-0.36之间，重复性较好。
实施例一：空白检出限(LoB)值：
每天提取20份去离子水作为模板，在不同扩增仪上分别使用以上的ddPCR反应体系连续做三天，除所有检测值都为0的以外，使用spss23.0软件S-W分析检测结果是否服从正态分布，若服从正态分布则用参数法分析LoB值；若不服从正态分布则用非参数法分析LoB值。结果如下表五所示：
表五空白检出限值
| ZDHHC19 | C9orf95 | HLA-DPB1 | C3AR1 | |
| 第一天 | 0.09 | 0 | 0 | 0 |
| 第二天 | 0 | 0 | 0.09 | 0 |
| 第三天 | 0.09 | 0 | 0 | 0.09 |
检测靶标取3次计算结果的最大值为LoB值，即ZDHHC19、HLA-DPB1和C3AR1为0.09copies/μl，C9orf95为0copies/μl。
实施例2.空白检出限(LoD)值
1.1最低检出限(LoD)
若LoB＝0，则采用概率单位方案；若LoB≠0，则采用经典方案。配制3批试剂中最大的LOD作为最终报告值。
1.1.1概率单位方案
使用超纯水作为基质，分别掺入不同靶基因已知浓度的DNA，作为阳性标本。再使用超纯水，分别进行梯度稀释。
使用同一套仪器，包括液滴生成仪、PCR扩增仪、芯片阅读仪，使用3个批号试剂，分别重复检测各个靶基因标本不同浓度梯度30次。
分别计算各个靶基因标本每个浓度梯度的阳性检出率，选择阳性检出率≥95％的最低浓度，作为各个靶基因的LoD值。
1.1.2经典方案
使用超纯水作为基质，分别掺入不同靶基因已知浓度的DNA，作为阳性标本。再使用相应的超纯水，分别稀释至1×LoB、2×LoB、3×LoB、4×LoB、5×LoB五个浓度，作为低值标本。
使用同一套仪器，包括液滴生成仪、PCR扩增仪、芯片阅读仪，使用3个批号试剂，分别重复检测各个靶基因五个低值标本至少12次，合计至少60个低值标本测量结果。
分别计算各个靶基因LoD值，方法为：
1)分析每个批号试剂至少60个低值标本测量结果的数据分布。
2)若数据呈正态分布，则采用参数统计方法进行分析。
3)若数据呈偏态分布，则采用非参数统计方法进行分析。
结果如下表六：
表六空白检出限值
检测限为LoD值，C9orf95和HLA-DPB1为0.18copies/μl，ZDHHC19和C3AR1为0.27copies/μl。
实施例三.临床阈值线划分：
通过对150例疑似脓毒症的患者进行检测(年龄为18-89岁ICU入住患者，满足以下条件的两种或两种以上：1、体温在38℃以上或低于36℃；2、心率大于每分钟90次；3、呼吸急促大于每分钟呼吸20次或PaCO2小于32毫米汞柱；4、白细胞(WBC)计数大于12,000/mm3或小于4000/mm3；5、未成熟中性粒细胞大于10％)。把正常人与血脓毒症的宿主四基因打分检测阈值线划为2.18。
如下表七所示：
表七得分值
| -1-2.18 | ≥2.18 | |
| 四基因打分 | 正常人 | 脓毒症患者 |
故本方案选择2.18作为四基因打分的阈值，若大于2.18则认为为脓毒症患者，若小于2.18则认为是正常人。
实施例四真实样本验证：
在以上检测阈值线的基础上，检测了45例未知患者临床信息的血液样本，在检测过程中详细记录患者的样本信息，在根据检测结果，核查这批患者的临床信息把检测结果做成散点图记录如图1所示。
通过临床信息查对得到：宿主四基因打分大于2.18的11位患者通过打分分析SOFA≥2，判为脓毒症患者；宿主四基因打分小于2.18的34位患者通过打分分析SOFA＜2；判为非脓毒症患者，可见本方案的四基因打分可以很好的判断脓毒症。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种宿主基因转录水平在进行脓毒症诊断时的应用，其中宿主基因ZDHHC19、C9orf95、HLA-DPB1、C3AR1，其特征在于，包括：获取宿主基因ZDHHC19、C9orf95、HLA-DPB1、C3AR1的转录水平，按照如下公式计算得到四基因打分：
四基因打分＝Bz/Bh+Bc9/Bh+Bc3/Bh；
其中Bz为ZDHHC19的转录水平，Bh为HLA-DPB1的转录水平，Bc9是C9orf95的转录水平，Bc3是C3AR1的转录水平；
若四基因打分大于设定阈值则判断患有脓毒症。
2.根据权利要求1所述的宿主基因转录水平在进行脓毒症诊断时的应用，其特征在于，基于数字PCR方法进行四个宿主基因转录水平的检测。
3.根据权利要求2所述的宿主基因转录水平在进行脓毒症诊断时的应用，其特征在于，在同一扩增体系的不同通道内检测四个宿主基因，获取对应通道的检测值作为宿主基因的转录水平。
4.根据权利要求1所述的宿主基因转录水平在进行脓毒症诊断时的应用，其特征在于，若四基因打分大于2.18的话，判断感染脓毒症的概率大。
5.一种基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：
特异性扩增宿主基因ZDHHC19的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示；
特异性扩增宿主基因C9orf95的引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，探针序列如SEQ ID NO:6所示；
特异性扩增宿主基因HLA-DPB1的引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，探针序列如SEQ ID NO:9所示；
特异性检测宿主基因C3AR1的引物序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示，探针序列如SEQ ID NO:12所示。
6.根据权利要求5所述的基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，包括如SEQ ID NO:13-14的随机引物和SEQ ID NO:15的探针作为外源内参。
7.根据权利要求5所述的基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，用于数字PCR检测，在同一扩增管的不同通道内进行检测，获取不同通道的检测值作为对应宿主基因的转录水平，基于按照如下公式计算得到四基因打分：
四基因打分＝Bz/Bh+Bc9/Bh+Bc3/Bh；
其中Bz为ZDHHC19的转录水平，Bh为HLA-DPB1的转录水平，Bc9是C9orf95的转录水平，Bc3是C3AR1的转录水平；若四基因打分大于设定阈值则判断患有脓毒症。
8.根据权利要求7所述的基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，若四基因打分大于2.18的话，判断感染脓毒症的概率大。
9.一种根据权利要求5到8任一所述的基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字PCR检测试剂盒的应用，其特征在于，用于非诊断目的的脓毒症诊断。
10.根据权利要求9所述的基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字PCR检测试剂盒的应用，其特征在于，将特异性扩增宿主基因ZDHHC19、C9orf95、HLA-DPB1、C3AR1以及外源内参的引物探针混合得到引物探针混合液，并混合所述引物探针混合液制备ddPCR反应体系，将待测血液样本提取的RNA和ddPCR反应体系混合后在设定的扩增程序下进行扩增检测得到宿主基因的转录水平的检测。
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| CN202310469955.0A CN116716392A (zh) | 2023-04-26 | 2023-04-26 | 基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字pcr检测试剂盒 |
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