CN116356081A - 鸡马立克病毒的引物探针组及试剂盒与检测方法和应用 - Google Patents
鸡马立克病毒的引物探针组及试剂盒与检测方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种鸡马立克病毒的引物探针组及试剂盒与检测方法和应用。所述一种鸡马立克病毒的引物探针组包括用于检测鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的引物探针组和用于检测鸡马立克病毒CVI988疫苗株的荧光探针MDV‑P；所述用于检测鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的引物探针组包括上游引物MDV‑WF、下游引物MDV‑WR以及荧光探针MDV‑WP。同时本申请提供一种用于检测鸡马立克病毒的试剂盒。所述试剂盒装载PCR组合物；所述PCR组合物包括检测鸡马立克病毒的引物探针组以及酶混合液。本申请所述试剂盒采用实时荧光PCR方法能够对待测样本进行快速处理。同时，具备成本低、检测精确度高、灵敏性强以及操作简便等优势。
Description
技术领域
本申请涉及检测鸡马立克病毒CVI988疫苗株与血清Ⅰ型野毒株检测技术领域，本申请尤其涉及一种鸡马立克病毒的引物探针组及试剂盒与检测方法和应用。
背景技术
马立克氏病(Marker’s disease,MD)是马立克氏病毒(Marker’s disease virus,MDV)感染引起的一种高度传染性、淋巴细胞增生性疾病，主要特点是各外周神经、内脏器官组织、性腺和虹膜等出现淋巴细胞浸润和肿瘤病灶。根据病毒的血清学反应，分为三个血清型，即MDV血清Ⅰ型、MDV血清Ⅱ型和MDV血清Ⅲ型，仅血清型Ⅰ型感染鸡。
目前，检测MDV的方法包括使用鸡胚胎成纤维细胞(CEF)进行病毒的分离培养、病理组织学切片观察淋巴瘤细胞浸润、琼脂扩散试验(agar gel precipitation，AGP)以及聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)。然而，病毒的分离培养和鉴定所需周期较长，并且影响因素较多；AGP灵敏度较低、易出现假阳性；普通PCR耗时长；而现有技术中荧光PCR检测试剂盒虽然能够检出阳性样品，但需要进行测序才能区分毒株基因型，检测时间长达3～5天，过程复杂，成本高，不符合快速大量检测原则。
发明内容
为了解决上述至少一种技术问题，建立一种操作简单、灵敏度高、特异性强以及能够实现检测鸡马立克氏病毒且能区分毒株基因型的目的，本申请提供一种检测鸡马立克病毒的引物探针组及试剂盒与检测方法和应用。
第一方面，本申请提供一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组，所述引物探针组包括用于检测鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的引物探针组和用于检测鸡马立克病毒CVI988疫苗株的荧光探针MDV-P；
所述用于检测鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的引物探针组包括上游引物MDV-WF、下游引物MDV-WR以及荧光探针MDV-WP；
其中，所述上游引物MDV-WF基因序列如SEQ ID No.1所示；
所述下游引物MDV-WR基因序列如SEQ ID No.2所示；
所述荧光探针MDV-WP基因序列如SEQ ID No.3所示；
所述荧光探针MDV-P基因序列如SEQ ID No.4所示；
所述荧光探针MDV-WP和荧光探针MDV-P基因序列中，5'端方向末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带不同的荧光报告基团；3'端方向一侧末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带非荧光淬灭基团。
通过采用上述技术方案，本申请提高了检测精确度。
可选的，所述荧光探针MDV-WP基因序列中，5'端方向末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的荧光报告基团为VIC，3'端方向一侧末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的非荧光淬灭基团为MGB；荧光探针MDV-P基因序列中，5'端方向末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的荧光报告基团为FAM，3'端方向一侧末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的荧光淬灭基团为MGB。
第二方面，本申请提供一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组在生物检测领域以及制备检测产品领域的应用。
第三方面，本申请提供一种用于检测鸡马立克病毒的检测试剂盒，所述试剂盒装载PCR组合物和阳性对照品；
所述PCR组合物包括本申请所述的用于检测鸡马立克病毒的引物探针组；
所述阳性对照品包括鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的阳性质粒和鸡马立克病毒CVI988疫苗株的阳性质粒。
通过采用上述技术方案，本申请降低了检测成本、提高了检测精确度、同时达到了操作简便的效果。其机理在于：本申请通过提供一种实时荧光PCR检测鸡马立克病毒的检测试剂盒，不仅解决了现有技术中病毒的分离培养方法、普通PCR方法中存在的检测周期较长的问题，同时解决了现有技术中存在的检测精确度不高、灵敏度较低且易出现假阳性的问题，具有成本低、操作简便、灵敏度高以及检测精确度高的优势。
可选的，所述PCR组合物还包括酶混合液。
可选的，所述酶混合液(qProbe qPCR Mix)包括PCR酶、dNTP Mixture、Mg2+以及无核酸酶水。
可选的，所述PCR组合物中SEQ ID No.1终浓度为0.15～0.45μM、SEQ ID No.2终浓度为0.15～0.45μM、SEQ ID No.3终浓度为0.15～0.45μM以及SEQ ID No.4终浓度为0.15～0.45μM。
优选的，所述PCR组合物中SEQ ID No.1终浓度为0.25μM、SEQ ID No.2终浓度为0.25μM、SEQ ID No.3终浓度为0.25μM以及SEQ ID No.4终浓度为0.25μM。
第四方面，本申请提供一种检测鸡马立克病毒的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
S1、提取样本中的基因组DNA；
S2、将提取后的基因组DNA浓度稀释，并进行荧光PCR扩增反应；
S3、荧光PCR扩增反应结束后，根据PCR扩增的结果进行判读，得出鸡马立克病毒具体型别；
其中，所述PCR扩增反应包括本申请所述一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组。
通过采用上述技术方案，本申请通过优化检测鸡马立克病毒的扩增反应条件，提高了检测精确度。同时本申请所选择的用于检测鸡马立克病毒的引物探针组特异性强，结果易于判读，对仪器的要求不高，并且整个PCR过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，使结果更加精准。
可选的，所述荧光PCR扩增反应所需的反应条件为如下：95℃3min；95℃5sec，60℃30sec，40个循环，收集荧光信号。
可选的，所述结果判读依据为如下：
鉴别鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的判读标准：根据PCR扩增的结果进行判读时，若检测在VIC通道中出现特异性扩增曲线，则判定待测样本携带鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株；鉴别鸡马立克病毒CVI988疫苗株的判读标准：根据PCR扩增的结果进行判读时，若检测在FAM通道中出现特异性扩增曲线，则判定待测样本携带鸡马立克病毒CVI988疫苗株。
综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：
1.本申请提供的一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组，具有特异性强的特点。
2.本申请提供的一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组能够实现鉴别鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株与鸡马立克病毒CVI988疫苗株的效果。因此，鸡马立克病毒的引物探针组可用于制备鸡马立克病毒的检测产品。
3.本申请提供的一种用于检测鸡马立克病毒的检测试剂盒能够克服现有技术中存在的成本高、操作复杂、周期长等问题，具有成本低、操作简便、检测时间短等优势。
4.本申请通过优化检测鸡马立克病毒的扩增反应条件，提高了检测精确度。同时本申请所选择的引物探针组特异性强，结果易于判读，对仪器的要求不高，并且整个PCR过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，使检测结果更加精准。
附图说明
图1部分具有鸡马立克病毒CVI988疫苗株的待测样本的荧光PCR扩增曲线图；
图2部分具有鸡马立克病毒CVI988疫苗株的待测样本的荧光PCR结果图；
图3为部分具有鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的待测样本的荧光PCR扩增曲线图；
图4为部分具有鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的待测样本的荧光PCR结果图；
图5单重荧光PCR检测试剂盒部分检测结果。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
第一方面，本申请提供一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组，所述引物探针组包括用于检测鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的引物探针组和用于检测鸡马立克病毒CVI988疫苗株的荧光探针MDV-P；
所述用于检测鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的引物探针组包括上游引物MDV-WF、下游引物MDV-WR以及荧光探针MDV-WP；
其中，所述上游引物MDV-WF基因序列为：
5'-GAGCTAACCGGAGAGGGAGA-3'；
所述下游引物MDV-WR其基因序列为：
5'-CGCATACCGACTTTCGTCAA-3'；
所述荧光探针MDV-WP基因序列为：
5'-VIC-GGCTGTCACAGTGGGAG-3'-MGB；
所述荧光探针MDV-P基因序列为：
5'-FAM-GGCTGTCACGGTGGG-3'-MGB；
所述荧光探针MDV-WP和荧光探针MDV-P基因序列中，5'端方向末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带不同的荧光报告基团；3'端方向一侧末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带非荧光淬灭基团。
可选的，所述荧光探针MDV-WP基因序列中，5'端方向末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的荧光报告基团为VIC，3'端方向一侧末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的非荧光淬灭基团为MGB；荧光探针MDV-P基因序列中，5'端方向末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的荧光报告基团为FAM，3'端方向一侧末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的非荧光淬灭基团为MGB。
第二方面，本申请提供上述用于检测鸡马立克病毒的引物探针组在生物检测领域以及制备检测产品领域的应用。
第三方面，本申请提供一种用于检测鸡马立克病毒的检测试剂盒，所述试剂盒装载PCR组合物和阳性对照品；
所述PCR组合物包括上述用于检测鸡马立克病毒的引物探针组；
所述阳性对照品包括鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的阳性质粒和鸡马立克病毒CVI988疫苗株的阳性质粒；
可选的，所述PCR组合物还包括酶混合液。
可选的，所述酶混合液包括PCR酶、dNTP Mixture、Mg2+以及无核酸酶水。
第四方面，本申请提供了一种检测鸡马立克病毒的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
S1、提取样本中的基因组DNA；
S2、将提取后的基因组DNA浓度稀释，并进行荧光PCR扩增反应；
S3、荧光PCR扩增反应结束后，根据PCR扩增的结果进行判读，得出鸡马立克病毒具体型别；
其中，所述PCR扩增反应包括上述PCR组合物。
可选的，所述荧光PCR扩增反应所需的反应条件为如下：95℃3min；95℃5sec，60℃30sec，40个循环，收集荧光信号。
可选的，所述结果判读依据为如下：
鉴别鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的判读标准：根据PCR扩增的结果进行判读时，若检测在VIC通道中出现特异性扩增曲线，则判定待测样本携带鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株；鉴别鸡马立克病毒CVI988疫苗株的判读标准：根据PCR扩增的结果进行判读时，若检测在FAM通道中出现特异性扩增曲线，则判定待测样本携带鸡马立克病毒CVI988疫苗株。
发明人为了实现对鸡马立克病毒CVI988疫苗株和鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的分型检测，同时达到成本低，灵敏性高以及检测耗时短的目的，首先研究了一种特异性强的、能够鉴别鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株和鸡马立克病毒CVI988疫苗株的引物探针组，所述引物探针组包括用于检测鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的引物探针组和用于检测鸡马立克病毒CVI988疫苗株的荧光探针MDV-P；
所述用于检测鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的引物探针组包括上游引物MDV-WF、下游引物MDV-WR以及荧光探针MDV-WP；
其中，所述上游引物MDV-WF基因序列如SEQ ID No.1所示；
所述下游引物MDV-WR基因序列如SEQ ID No.2所示；
所述荧光探针MDV-WP基因序列如SEQ ID No.3所示；
所述荧光探针MDV-P基因序列如SEQ ID No.4所示；
所述荧光探针MDV-WP和荧光探针MDV-P基因序列中，5'端方向末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带不同的荧光报告基团；3'端方向一侧末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带非荧光淬灭基团。
发明人在已设计引物探针组的基础上，为了解决现有技术中存在的成本高检测精确度不高等问题，设计了包括上述引物探针组的用于检测鸡马立克病毒的试剂盒。所述试剂盒还包括PCR组合物和阳性对照品。
申请人在此基础上提供了一种检测鸡马立克病毒的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
S1、提取样本中的基因组DNA；
S2、将提取后的基因组DNA浓度稀释，并进行荧光PCR扩增反应；
S3、荧光PCR扩增反应结束后，根据PCR扩增的结果进行判读，得出鸡马立克病毒具体型别；
以上检测方法操作简便，检测精确度高，能够特异性鉴别鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株和鸡马立克病毒CVI988疫苗株。同时，使用本申请提供的引物探针组进行荧光定量PCR反应，能够快速、精确、科学、客观地鉴别鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株和鸡马立克病毒CVI988疫苗株。并且通过对鸡马立克病毒CVI988疫苗株与鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株拷贝数的精确检测，明确鸡群的疫苗免疫状态以及野毒感染的进程。
具体实施例
荧光定量PCR引物和探针的设计
为了设计一种在检测鸡马立克病毒的同时，能够鉴别鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株与鸡马立克病毒CVI988疫苗株的引物探针组，本申请首先针对鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株与鸡马立克病毒CVI988疫苗株的基因序列进行了序列比对，发现鸡马立克病毒CVI988疫苗株pp38基因保守区DQ530348.1片段中仅存在两个突变位点，分别为CVI988疫苗株pp38基因片段31号位点上G突变为A，38位点上G突变为A。其余部分序列与鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株pp38基因保守区AF243438.1基因片段高度相似。
因此，本申请根据上述主要突变位点，设计一种能够鉴别鸡马立克病血清I型野毒株和鸡马立克病毒CVI988疫苗株的引物探针组；
所述引物探针组包括用于检测鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的引物探针组和用于检测鸡马立克病毒CVI988疫苗株的荧光探针MDV-P；所述用于检测鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的引物探针组包括上游引物MDV-WF、下游引物MDV-WR以及荧光探针MDV-WP；引物探针组基因序列如表1所示；
表1鸡马立克病毒引物探针组基因序列
样本DNA提取
本实验使用DNA提取试剂盒对已知检测结果的100只鸡的羽毛进行羽髓DNA提取，并将提取的100个羽髓DNA作为本申请待测羽髓样本。
所述100只鸡中，序号为1～45的待测样本为携带鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的鸡羽毛；
序号为46～100的待测样本为携带鸡马立克病毒CVI988疫苗株的鸡羽毛；
荧光定量PCR反应
实施例1～4分别对本申请上述提供的100个已知检测结果的待测羽髓样本进行检测。
实施例1
本实施例使用的引物探针组基因序列如表1所示；
(1)准备待测样本荧光定量PCR反应管：在冰浴条件下，在荧光定量PCR反应管中分别加入如表2所示的引物探针组、待测羽髓样本、qProbe qPCR Mix(2×)以及无核酸酶水；所述PCR反应管中各组分用量及体积如表2所示；
(2)阳性对照品的构建：本申请所述的阳性对照品包括鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的阳性质粒和鸡马立克病毒CVI988疫苗株的阳性质粒；
(3)荧光定量PCR反应：把步骤(1)获得的待测样本荧光定量PCR反应管放置荧光定量PCR仪进行检测；
反应程序设置参数如下：95℃3min；95℃5sec，60℃30sec，40个循环，收集荧光信号并进行结果判读。
所述检测结果判读标准为如下：
鉴别鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的判读标准：根据PCR扩增的结果进行判读时，若检测在VIC通道中出现特异性扩增曲线，则判定待测样本携带鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株；鉴别鸡马立克病毒CVI988疫苗株的判读标准：根据PCR扩增的结果进行判读时，若检测在FAM通道中出现特异性扩增曲线，则判定待测样本携带鸡马立克病毒CVI988疫苗株。
本实施例荧光定量PCR反应管中各组分用量以及终浓度如表2所示；
表2实施例1荧光定量PCR反应管各组分用量及浓度
以上表2所示的各组分用量为一份样品的检测用量。
本实施例总的检测结果如表3所示；其中部分检测结果如图1、图2、图3、图4所示；
其中，图1为部分携带鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的待测样本的荧光PCR扩增曲线图；
图2是图1对应的结果图。所述图2中的样本信息以及样本CT值如表3所示；
表3图2所对应的样品信息以及CT值汇总表
| 样本序号 | 样本名称 | CT值 |
| 13号 | a4 | 34.39 |
| 18号 | f26 | 26.56 |
| 55号 | 14d-4 | 0 |
| 鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的阳性对照品 | w | 17.04 |
从以上表3数据可知，本申请提供的一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组特异性强。其机理在于，检测鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的引物探针组只能检测携带鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的羽髓样本。
图3、图4分别为部分具有鸡马立克病毒CVI988疫苗株的待测样本的荧光PCR扩增曲线图和结果图；
图4中的样本信息以及样本CT值如表4所示；
表4图4所对应的样品信息以及CT值汇总表
从以上表4数据可知，本申请提供的一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组特异性强，其机理在于，检测鸡马立克病毒CVI988疫苗株的引物探针组只能检测携带鸡马立克病毒CVI988疫苗株的羽髓样本。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，在本实施例中荧光探针MDV-P终浓度为0.15μM；上游引物MDV-WF终浓度为0.15μM；下游引物MDV-WR终浓度为0.15μM；荧光探针MDV-WP终浓度为0.15μM；其余条件与实施例1保持一致
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，在本实施例中Taqman探针MDV-P终浓度为0.35μM；上游引物MDV-WF终浓度为0.35μM；下游引物MDV-WR终浓度为0.35μM；荧光探针MDV-WP终浓度为0.35μM；其余条件与实施例1保持一致。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于，在本实施例中Taqman探针MDV-P终浓度为0.45μM；上游引物MDV-WF终浓度为0.45μM；下游引物MDV-WR终浓度为0.45μM；荧光探针MDV-WP终浓度为0.45μM；其余条件与实施例1保持一致。
实施例1～实施例4的检测结果参见表5；
表5实施例1～4检测结果
从以上表5数据可知，各实施例实验检测结果均与实际检测结果一致，因此，可得出，本申请实施例1～4提供的荧光定量PCR反应体系检测精确度高，检测精确度高达100％。同时，可知，本申请提实施例1～4提供的反应体系能够特异性的鉴别诊断鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株与鸡马立克病毒CVI988疫苗株。
灵敏性实验
本实验与实施例1的区别在于，本实施例将对20个已知检测结果的待测羽髓样本进行稀释。
其中序号为1～10的待测羽髓样本携带鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株；序号为11～20的待测羽髓样本携带鸡马立克病毒CVI988疫苗株。
经过对上述待测羽髓样本稀释，获得鸡马立克病毒载量位于100～106copies/μL的待测羽髓样本。本实验检测结果参见表6：
表6灵敏性试验检测结果汇总表
经过对上述稀释后的样本进行分型检测得出，使用本申请提供的一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组，能够检测鸡马立克病毒载量为10copies/μL及以上的鸡马立克病毒样本。而鸡马立克病毒载量低于10copies/μL的样本，由于病毒载量过低无法检测，从而出现假阴性或无法检测外，其余样本均能通过本申请提供的鸡马立克病毒的引物探针组实现精准的分型检测。
对比例1灵敏性试验
本对比例与上述灵敏性实验的区别在于，本对比例采用普通PCR对上述灵敏性实验所述的待测样本进行鉴别鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株和鸡马立克病毒CVI988疫苗株的检测。检测结果显示，普通PCR方法最低只能检测鸡马立克病毒载量为100copies/μL及以上的羽髓样本。
特异性试验
本实验使用实施例1的反应体系对5个鸡易感染的病毒进行检测。所述5个样本分别携带以下5种病毒。所述5种病毒分别为副鸡嗜血杆菌、A型禽流感病毒、鸡脑脊髓炎病毒、鸡马立克病毒CVI988疫苗株、鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株
本实验检测结果如表6所示；
表6特异性实验检测结果
参见表6，结果显示：在使用鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的荧光探针时，只能检测携带鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的样本。在使用鸡马立克病毒CVI988疫苗株的荧光探针时，只能检测携带鸡马立克病毒CVI988疫苗株的样本。因此可知，本申请提供的检测鸡马立克病毒的引物探针组具备特异性强的特点。
本申请所述检测鸡马立克病毒CVI988疫苗株的荧光探针MDV-P和用于检测鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的上游引物MDV-WF、下游引物MDV-WR以及荧光探针MDV-WP能够能够特异性的鉴别诊断马立克病毒血清Ⅰ型野毒株以及马立克病毒CVI988疫苗株。
试剂盒的构建
实施例5
本实施例提供的试剂盒用于鉴别鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株与鸡马立克病毒CVI988疫苗株。
所述试剂盒装载PCR组合物、阳性对照品。
PCR组合物包括检测鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的上游引物MDV-WF(SEQ IDNo.1)、下游引物MDV-WR(SEQ ID No.2)、荧光探针MDV-WP(SEQ ID No.3)以及用于检测鸡马立克病毒CVI988疫苗株的荧光探针MDV-P(SEQ ID No.4)。
PCR组合物还包括酶混合物。
所述酶混合物包括PCR酶、dNTP Mixture、Mg2+以及无核酸酶水。
所述阳性对照品包括鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的阳性质粒和鸡马立克病毒CVI988疫苗株的阳性质粒。
本实施例中，PCR组合物各组分浓度以及用量为如下：荧光探针MDV-P终浓度为0.25μM，用量为0.5μL；上游引物MDV-WF终浓度为0.25μM，用量为0.5μL；下游引物MDV-WR终浓度为0.25μM，用量为0.5μL；荧光探针MDV-WP终浓度为0.25μM，用量为0.5μL；无核酸水用量为3.0μL；dNTP Mixture终浓度1×，用量为10.0μL；Mg2+终浓度为0.25μM，用量为2μL；
实施例6
本实施例与实施例5的区别在于，本实施例中，本实施例中荧光探针MDV-P终浓度为0.15μM；上游引物MDV-WF终浓度为0.15μM；下游引物MDV-WR终浓度为0.15μM；荧光探针MDV-WP终浓度为0.15μM；其余条件与实施例5保持一致。
实施例7
本实施例与实施例5的区别在于，本实施例中荧光探针MDV-P终浓度为0.35μM；上游引物MDV-WF终浓度为0.35μM；下游引物MDV-WR终浓度为0.35μM；荧光探针MDV-WP终浓度为0.35μM；其余条件与实施例5保持一致。
实施例8
本实施例与实施例5的区别在于，本实施例中荧光探针MDV-P终浓度为0.45μM；上游引物MDV-WF终浓度为0.45μM；下游引物MDV-WR终浓度为0.45μM；荧光探针MDV-WP终浓度为0.45μM；其余条件与实施例5保持一致。
使用实施例5～8制备的试剂盒依次对稀释浓度为5ng/μL、20ng/μL、30ng/μL、45ng/μL、60ng/μL、80ng/μL、100ng/μL的30个已知检测结果的待测羽髓DNA样本进行荧光定量PCR反应，反应结束后对检测结果进行判读。
实验检测结果显示，所有待测羽髓DNA样本的检测结果均与已知检测结果相同。
对比例2单重荧光PCR检测试剂盒
本对比例对60个已知检测结果的鸡的羽髓DNA样本进行鉴别鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株和鸡马立克病毒CVI988疫苗株的检测。
本对比例中使用的试剂盒为禽马立克氏病毒单重荧光PCR检测试剂盒，其中部分检测结果如图5所示；
从检测结果可知，本对比例提供的禽马立克氏病毒单重荧光PCR检测试剂盒无法鉴别鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株和鸡马立克病毒CVI988疫苗株。由此可知，本申请提供的双重荧光定量PCR检测试剂盒具备能够对鸡马立克氏病毒分型检测的优势。
对比例3琼脂免疫扩散实验
使用国家标准《鸡马立克氏病诊断技术(GB/T 18643-2002)》对分别携带鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株和鸡马立克病毒CVI988疫苗株的2个鸡进行琼脂免疫扩散实验。
实验结果显示，琼脂扩散技术虽然可以能够实现诊断马立克氏病的病毒抗原或抗体，但无法区分阳性结果是疫苗毒株还是野毒感染。
对比例4病理学诊断实验
使用《鸡马立克氏病诊断技术规程(DB21/T1890-2011)》对分别携带鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株和鸡马立克病毒CVI988疫苗株的2个鸡进行病毒分离与鉴定实验。
检测结果显示，病理学诊断技术对实验人员的要求较高，要求实验人员具备较高的病理学理论知识和较好的实验操作能力，并且检测所需时间较长。同时在鉴别鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株和鸡马立克病毒CVI988疫苗株时可能会出现判断失误。
因此，本申请提供的鸡马立克病毒引物探针组及检测方法具有较高的实用价值。
以上均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括用于检测鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的引物探针组和用于检测鸡马立克病毒CVI988疫苗株的荧光探针MDV-P；
所述用于检测鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的引物探针组包括上游引物MDV-WF、下游引物MDV-WR以及荧光探针MDV-WP；
其中，所述上游引物MDV-WF基因序列如SEQ ID No.1所示；
所述下游引物MDV-WR基因序列如SEQ ID No.2所示；
所述荧光探针MDV-WP基因序列如SEQ ID No.3所示；
所述荧光探针MDV-P基因序列如SEQ ID No.4所示；
所述荧光探针MDV-WP和荧光探针MDV-P基因序列中，5' 端方向末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带不同的荧光报告基团；3' 端方向一侧末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带非荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组，其特征在于，所述荧光探针MDV-WP基因序列中，5' 端方向末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的荧光报告基团为VIC，3' 端方向一侧末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的非荧光淬灭基团为MGB；荧光探针MDV-P基因序列中，5' 端方向末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的荧光报告基团为FAM，3' 端方向一侧末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的非荧光淬灭基团为MGB。
3.一种权利要求1所述的一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组在生物检测领域以及制备检测产品领域的应用。
4.一种用于检测鸡马立克病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒装载PCR组合物、阳性对照品；
所述PCR组合物包括由权利要求1所述的用于检测鸡马立克病毒的引物探针组；
所述阳性对照品包括鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的阳性质粒和鸡马立克病毒CVI988疫苗株的阳性质粒。
5.根据权利要求4所述的用于检测鸡马立克病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR组合物还包括酶混合液。
6.根据权利要求5所述的用于检测鸡马立克病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括PCR酶、dNTP Mixture、Mg2+以及无核酸酶水。
7.根据权利要求6所述的用于检测鸡马立克病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR组合物中SEQ ID No.1终浓度为0.15~0.45μM、SEQ ID No.2终浓度为0.15~0.45μM、SEQ IDNo.3终浓度为0.15~0.45μM以及SEQ ID No.4终浓度为0.15~0.45μM。
8.一种检测鸡马立克病毒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
S1、提取样本中的基因组DNA；
S2、将提取后的基因组DNA浓度稀释，并进行荧光PCR扩增反应；
S3、荧光PCR扩增反应结束后，根据PCR扩增的结果进行判读，得出鸡马立克病毒具体型别；
其中，所述PCR扩增反应包括权利要求2所述的一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组。
9.根据权利要求8所述的一种检测鸡马立克病毒的检测方法，其特征在于，所述结果判读依据为如下：
鉴别鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株的判读标准：根据PCR扩增的结果进行判读时，若检测在VIC通道中出现特异性扩增曲线，则判定待测样本携带鸡马立克病毒血清Ⅰ型野毒株；
鉴别鸡马立克病毒CVI988疫苗株的判读标准：根据PCR扩增的结果进行判读时，若检测在FAM通道中出现特异性扩增曲线，则判定待测样本携带鸡马立克病毒CVI988疫苗株。
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