CN114703324A - 检测禽偏肺炎病毒的试剂及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测禽偏肺炎病毒的试剂及方法，属于微生物的测定或检验方法其所用的组合物技术领域。本发明提供了检测或辅助检测禽偏肺炎病毒的试剂，所述试剂或试剂盒包括禽偏肺炎病毒引物探针，所述禽偏肺炎病毒引物探针包括引物APV‑F和引物APV‑R、探针APV‑Probe，所述引物APV‑F为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的单链DNA；所述引物APV‑R为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA；所述探针APV‑Probe的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4。并对试剂盒的特异性、灵敏性和重复性进行测试，结果表明本发明提供的试剂灵敏性高，特异性强，适用于低拷贝样品的检测。

Description

检测禽偏肺炎病毒的试剂及方法

技术领域

本发明属于微生物的测定或检验方法其所用的组合物技术领域，具体涉及检测禽偏肺炎病毒的试剂及方法。

背景技术

近年来，随着技术的不断进步和发展，微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是近几年出现的新一代聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术。通过油包水技术将反应液分割为数万个纳米级大小的微滴，每一个微滴都是一个独立的PCR反应体系，当PCR扩增完成后，利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，再根据统计学中的泊松分布原理分析阳性微滴的个数与比例，即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，从而实现对低至单个拷贝核酸分子的绝对定量。与传统实时荧光定量PCR(quantitativereal-time PCR，qPCR)方法相比，它不依赖于标准曲线，因而定量结果更为精确，同时也使体系受反应抑制因子的影响大大降低。

禽偏肺炎病毒(avian metapneumovirus,aMPV)，早期称作禽肺炎病毒(avianpneumovirus,APV)是偏肺炎病毒属的成员，属于副黏病毒科，该病毒主要危害火鸡和不同品种的鸡，包括种鸡、商品肉鸡和鸡蛋，发病日龄一般在4-7周龄，5-6周龄为发病高峰，主要引起上呼吸道的症状，以喷嚏，眼结膜潮红，泪腺肿，头部出现皮下水肿，俗称肿头；产蛋鸡感染主要引起产蛋下降2％-40％，孵化率降低；随着病情的发展，还表现出神经症状；该病引起的发病率在1％-90％之间，引起鸡死亡率在1％-20％，在发病期间继发其它疾病的感染，会引起更大的死亡，造成对养禽业尤其是种禽的极大危害。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何准确测定禽偏肺炎病毒。

为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供检测或辅助检测偏肺炎病毒的方法，所述方法包括利用试剂或试剂盒对待测样品进行数字PCR，根据数字PCR产物确定或辅助确定待测样品是否为偏肺炎病毒或，是否含有偏肺炎病毒或，是否感染偏肺炎病毒，

所述试剂或试剂盒为检测或辅助检测禽偏肺炎病毒的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括禽偏肺炎病毒引物探针，所述禽偏肺炎病毒引物探针包括引物APV-F和引物APV-R、探针APV-Probe，

所述引物APV-F为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的单链DNA；

所述引物APV-R为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA；

所述探针APV-Probe的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4。

进一步地，上述的方法中，所述APV-F、APV-R、APV-Probe的物质的量比值为2:2:1。

进一步地，上述的方法中，所述试剂或试剂盒还包括阳性标准品质粒。

进一步地，上述的方法中，所述阳性标准品质粒包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子。

进一步地，上述的方法中，所述数字PCR中采用的PCR体系中所述APV-F的含量为1μmol/μL，所述APV-R的含量为1μmol/μL，所述APV-Probe的含量为0.5μmol/μL。

进一步地，上述的方法中，所述数字PCR中采用的引物退火条件为56℃1分钟。

本发明中，所述APV-Probe为特异性识别禽偏肺炎病毒的探针，所述APV-Probe的5'端连接有荧光基团，3'端连接有淬灭基团。

荧光基团可选自但不限于FAM(5/6-羧基荧光素)、VIC(绿色荧光蛋白)、TET(四氯-6-羧基荧光素)、JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)、HEX(六氯-6-甲基荧光素)、Cy3、TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)、ROX(羧基-X-罗丹明)、Texas Red、LC RED640、Cy5(花菁燃料)、LC RED705、FITC(异硫氰酸荧光素)等常见荧光基团，进行双重PCR检测引物组合物中探针的荧光基团的选择原则是两个荧光的显色不同即可。

所述淬灭基团可选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、Dabcy1中的至少一种。

在20μL ddPCR反应体系中，加入不同的引物浓度和探针浓度，结果当上、下游引物浓度和探针浓度分别为20μmol/μL和10μmol/μL时，即终浓度分别为1μmol/μL和0.5μmol/μL时，阳性微滴信号高，阳性微滴与阴性微滴之间弥散少。

以20μL反应体系为例，本发明优化获得的反应体系及反应条件如下：

反应体系：2×Supermix for probe(No dUTP)10μL，20μmol/μL上、下游引物各1μL，10μmol/μL探针1μL，DNA/RNA模板2μL，用ddH₂O补足至20μL。

反应程序：95℃10min；94℃30s，设置退火温度56℃1min，40个循环；98℃10min；4℃结束。

为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供检测或辅助检测禽偏肺炎病毒的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒为上述的试剂或试剂盒。

进一步地，上述的试剂或试剂盒中，所述APV-F、APV-R和APV-Probe可分别单独包装也可组合包装；所述阳性标准品质粒单独包装。

所述组合包装可为禽偏肺炎病毒引物探针组合物APV-F、APV-Probe和APV-R作为一组包装。

为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供上述的试剂或试剂盒在检测或辅助检测偏肺炎病毒中的应用。

为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供上述的试剂或试剂盒在检测或辅助检测待测样本是否感染偏肺炎病毒的应用。

为解决上述技术问题，第五个方面，本发明提供上述的试剂或试剂盒在检测或辅助检测待测病原是否为偏肺炎病毒的应用。

上述应用或方法为非疾病诊断的应用或方法。上述应用或方法不以获得有生命的人体或动物体的疾病诊断结果或健康状况为直接目的。所述待测样品可为来自非有生命的人体或动物体的样品，如环境样品(如空气)、食品(如冷冻食品或新鲜食品)。

本研究根据APV F基因的保守片段序列，设计合成了1对引物和一条探针，在探针的5’端标志FAM荧光基团，3’端标志BHQ1淬灭基团。通过比较不同引物浓度、探针浓度、最佳退火温度、灵敏度以及检测特异性等方面进行研究，建立了微滴式数字PCR检测APV的绝对定量方法，为绝对定量检测APV提供了技术支撑。

本发明取得的有益技术效果如下：

1、本发明建立了一种绝对定量检测APV的ddPCR方法，并对方法中的引物和探针浓度、退火温度进行优化，发现引物终浓度为1μmol/μL、探针浓度为0.5μmol/μL的情况下，反应具有最低的负荧光幅度(灰色)，阳性微滴信号(蓝色)高，阳性微滴与阴性微滴之间弥散少。退火温度为56℃，阳性微滴信号(蓝色)和阴性微滴信号(灰色)之间的荧光幅度差异最大，且获得阳性微滴数量最大。

2、本发明提供的试剂或试剂盒更适合病毒滴度较低临床样品的检测。因为阳性模板浓度过高，ddPCR扩增的阳性产物超出10000copies/μL时，系统会读不出拷贝数，在这种情况下，为更准确获取扩增阳性的阳性拷贝数，应对模板浓度进行一定浓度的稀释后才能成功获得检测的拷贝数。

附图说明

图1为APV ddPCR退火温度优化结果图。

图2为APV ddPCR引物浓度优化结果图。

图3为APV ddPCR探针浓度优化结果图。

图4为APV ddPCR特异性检测结果图。

图5为APV ddPCR灵敏性检测结果图。

图6为PEV qPCR灵敏性检测结果图。

图7为APV ddPCR标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂或试剂盒等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

禽偏肺炎病毒(APV/MN-10)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV北京株)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV Mass 41)、禽呼肠孤病毒(Reo S1133)、鸡新城疫病毒(NDV LaSota)、鸡毒支原体(MG S6)、禽流感H9N2 066C株(AIV H9N2 066C)、禽脑脊髓炎病毒(AE Van株)、由本实验室保存，在文献“谢志勤等，鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重RT-PCR检测方法的建立.中国兽医杂志，2017，53(2):6-9.”中公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

主要试剂及来源如下：

ddPCR Supermix for Probe(No dUTP(Catalog#:1863024)、ddPCR dropletgeneration oil for Probes、Droplet Reader Oil购自美国Bio-rad公司、EasyPureVirual DNA/RNA Kit(目录号为ER201-01)购自北京全式金生物技术有限公司；RT试剂、PCR试剂盒、100bp DNA Marker等购自宝生物工程(大连)有限公司。

实施例1、ddPCR反应的建立及优化

20μL反应体系：2×Supermix for probe(No dUTP)10μL，5-40μmol/μL上、下游引物各1μL，2.5-40μmol/μL探针1μL，标准模板2μL，用ddH₂O补足至20μL。

生成微滴：在微滴生成卡DG8的第二、三排孔分别加入上述反应液20μL和微滴生成油70μL，盖上专用胶垫，置微滴生成仪上自动生成微滴于第一排。

封膜：吸取生成的微滴至96孔板内，加盖铝膜置PX1热封仪上，180℃10s进行封膜。

PCR扩增：封膜的96孔板放入PCR扩增仪上进行扩增，反应程序：95℃10min；94℃30s，设置退火温度50-60℃1min(2℃/S)，40个循环；98℃10min；4℃结束。

数据读取及分析：反应结束后将96孔板置QX200微滴读取仪上读取信号并进行数据分析。

1.1、ddPCR反应退火温度的优化

ddPCR反应中，退火温度设为50、51、52、54、55、56、58、60℃共8个不同梯度，结果当退火温度在55-58℃时，阳性微滴显示为蓝色，阴性微滴显示为黑色，阳性微滴信号(蓝色)和阴性微滴信号(灰色)之间的荧光幅度差异最大，且获得阳性微滴数量最大，综合这些因素，选择最佳的退火温度为56℃。

ddPCR反应中，采用上、下游引物浓度和探针浓度分别为20μmol/μL和10μmol/μL，模板浓度约为400copies/μL时，退火温度设为50、51、52、54、55、56、58、60℃共8个不同梯度进行ddPCR反应扩增，结果退火温度为56℃时，扩增阳性的微滴数最高，为371copies/μL。

结果如图1所示，图1中，A04表示50℃、B04表示51℃、C04表示52℃、D04表示54℃、E04表示55℃、F04表示56℃、G04表示58℃、H04表示60℃。图1中左图的横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度；图1中右图的横坐标代表不同的退火温度，纵坐标表示获得阳性微滴数量。

当退火温度在55-58℃时，阳性微滴显示为蓝色，阴性微滴显示为黑色，阳性微滴信号(蓝色)和阴性微滴信号(灰色)之间的荧光幅度差异最大，且获得阳性微滴数量最大。综合这些因素，最佳的退火温度为56℃。

1.2、ddPCR反应引物及探针浓度的优化

ddPCR反应中，加入不同的引物浓度和探针浓度，结果当上、下游引物浓度和探针浓度分别为20μmol/μL和10μmol/μL时，即终浓度分别为1μmol/μL和0.5μmol/μL时，阳性微滴信号高，阳性微滴与阴性微滴之间弥散少。

(1)ddPCR反应引物浓度的优化

上述反应体系中保持探针浓度为10μmol/μL，设置4组引物浓度的梯度实验，分别为第一组：正向引物和反向引物分别10μmol/μL，第二组：正向引物和反向引物分别20μmol/μL，第三组：正向引物和反向引物分别30μmol/μL，第四组：正向引物和反向引物分别40μmol/μL。使用等量浓度为30copies/μL的阳性标准品质粒模板及反应条件进行筛选，每组浓度检验3次。

结果如图2所示，图2中，E07表示引物浓度为10μmol/μL、F07表示引物浓度为20μmol/μL、G07表示引物浓度为30μmol/μL、H07表示引物浓度为40μmol/μL，图2中左图的横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度；图2中右图的横坐标代表不同的退火温度，纵坐标表示获得阳性微滴数量。

结果表明：第三组的拷贝数平均值最高，为26.9copies。因此选取最佳引物浓度分别为20μmol/μL。

(2)上述反应体系中保持引物浓度分别为20μmol/μL，设置8组探针浓度的梯度实验，分别为第一组：探针浓度为1.25μmol/μL，第二组：探针浓度为2.5μmol/μL，第三组：探针浓度为5μmol/μL，第四组：探针浓度为10μmol/μL,第五组：探针浓度为15μmol/μL，第六组：探针浓度为20μmol/μL，第七组：探针浓度为25μmol/μL，第八组：探针浓度为30μmol/μL。使用等量浓度为4500copies/μL的阳性标准品质粒模板及反应条件进行筛选，每组浓度检验3次。

结果如图3所示，图3中，A09表示探针浓度为1.25μmol/μL、B09表示探针浓度为2.5μmol/μL、C09表示探针浓度为5μmol/μL、D09表示探针浓度为10μmol/μL，E09表示探针浓度为15μmol/μL，F09表示探针浓度为20μmol/μL，G09表示探针浓度为25μmol/μL，H09表示探针浓度为30μmol/μL，图3中左图的横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度；图3中右图的横坐标代表不同的退火温度，纵坐标表示获得阳性微滴数量。

结果表明：第五组的拷贝数平均值最高，为4310copies。因此选取最佳探针浓度为10μmol/μL。

以上结果表明：当上、下游引物浓度和探针浓度分别为20μmol/μL和10μmol/μL时，即终浓度分别为1μmol/μL和0.5μmol/μL时，阳性微滴信号高，阳性微滴与阴性微滴之间弥散少。

1.3、ddPCR反应的建立及反应程序

20μL反应体系：2×Supermix for probe(No dUTP)10μL，20μmol/μL上、下游引物各1μL，10μmol/μL探针1μL，DNA/RNA模板2μL，用ddH₂O补足至20μL。

反应程序：95℃10min；94℃30s，设置退火温度56℃1min(2℃/S)，40个循环；98℃10min；4℃结束。

实施例2、阳性标准品质粒的构建

2.1、引物设计与合成

利用在线https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/软件设计ddPCR引物和探针，应用BLAST在线对设计的引物和探针序列进行比对份分析，在探针引物的5’端标志FAM荧光基团，3’端标志BHQ1淬灭基团。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成合成，引物和探针寡核苷酸序列见表1。

表1引物和探针寡核苷酸序列

引物和探针	序列(5’-3’)	编号
			APV-F	GTTCTGGGTGCCATAGCATT	SEQ ID No.2
APV-R	CAAGTACCCTCACGCCATTT	SEQ ID No.3
			APV-Probe	FAM-AGAAGGAGAAGTGGCTGCAA-BHQ1	SEQ ID No.4

2.2、病毒核酸的提取

参照EasyPure Virual DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取APV MN/10以及对照毒株的DNA/RNA，提取的DNA/RNA保存于-80℃备用。

2.3、标准模板的制备

用RT方法将APV MN/10的RNA反转录成cDNA，然后用设计的引物APV上、下游引物扩增APV MN/10的cDNA，扩增的PCR产物经15g/L脂糖凝胶电泳，染色后将目的片段的凝胶切下，用凝胶回收试剂盒回收目的片段获得核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子。

将回收的片段与PMD18-T载体连接，转染到大肠杆菌DH5α中。提取转染后大肠杆菌中的质粒DNA，质粒DNA经PCR鉴定为APV阳性。获得的阳性质粒命名为pMD18-T-APV，pMD18-T-APV含有SEQ ID No.1所示的DNA片段。

pMD18-T-APV为禽偏肺炎病毒阳性标准品质粒。

测定阳性质粒DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀值的测定，计算阳性质粒DNA的浓度，按公式换算成拷贝数，拷贝数＝(浓度×阿伏加德罗常数)/(一个碱基对的平均分子量×总长度)。

结果表明pMD18-T-APV质粒的浓度为59.9mg/mL。

实施例3、特异性测定

将禽偏肺炎病毒(APV/MN-10)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV Mass 41)、禽呼肠孤病毒(Reo S1133)、鸡新城疫病毒(NDV LaSota)、禽流感病毒(AIV H9N2 066C)和禽脑脊髓炎病毒(AE Van株)的RNA反转录为cDNA，然后与鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV北京株)和鸡毒支原体(MG S6)的核酸一起，分别加入已优化好的dd PCR反应体系中进行特异性检测。

结果如图4所示，图4中A07代表APV/MN-10；B07代表AIV H9N2 066C；C07代表NDVLaSota；D07代表IBV Mass 41；E07代表Reo S1133；F07代表AE Van；G07代表ILTV北京株；H07代表MG S6。

图4中左图的横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度，右图的横坐标表示样品编号，纵坐标表示阳性微滴数。

结果表明各孔扩增总微滴的生成量都达1万以上，且较均衡，微滴扩增条件成立，出现阳性微滴的样品只有APV/MN-10，其它样品没有出现阳性微滴，表明引物和探针具有良好的特异性。

实施例4、灵敏性及重复性测定

测定APV阳性质粒DNA的浓度，然后以10倍梯度稀释，浓度在10^-2-10^-9，每个稀释度取2μL作为模板加入已优化好的ddPCR反应中，测定ddPCR反应的灵敏性。同时用相同的引物、探针浓度和试剂进行荧光定量PCR检测，比较两种方法的灵敏性。

结果如图5所示，图5中A10、B10、C10、D10、E10、F10、G10、H10分别代表10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9copies/μL的APV阳性标准品质粒浓度。

图5中左图的横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度，右图的横坐标表示样品编号，纵坐标表示阳性微滴数。

qRT-PCR检测结果见图6，结果只检测出10^-7稀释度，低拷贝4.4copies/μL(10^-8稀释度)没有检出。

结果表明ddPCR的最低检测限为4.4copies/μL(10^-8稀释度)，而qPCR只检测出10^-7稀释度，低拷贝4.4copies/μL(10^-8稀释度)没有检出。

分别用核酸稀释度和阳性拷贝数10的对数值绘制标准曲线，发现线性方程为y＝-0.85x+6.31，线性关系R²值为0.9801，结果见图7。图7中横坐标表示样品稀释度的对数值，纵坐标表示获得的阳性拷贝数的对数值。

实施例5、重复性测定

采用三组不同拷贝数浓度的DNA模板来评估ddPCR方法的重复性测试。

取10^-4-10^-6三个梯度稀释的模板进行3次重复试验，以检测dd PCR的重复性。

结果如表2所示，每个稀释度的变异系数均小于5％,说明该方法的重复性好、准确度高，检测结果稳定、可靠。

表2 ddPCR重复试验结果

实施例6、临床样品检测

提取2020年1月份至12月份采集的50份鸡病料样品的核酸，用已优化后ddPCR和荧光PCR进行检测，对比检测结果的一致性。

ddPCR检测结果3份为APV阳性，核酸拷贝数在78-920copies/μL，47份样品为阴性，检出阳性率6.0％(3/50)。qPCR检测获得同样结果。

本研究根据APV F基因的保守片段序列，设计合成了1对引物和一条探针，在探针的5’端标志FAM荧光基团，3’端标志BHQ1淬灭基团。通过比较不同引物浓度、探针浓度、最佳退火温度、灵敏度以及检测特异性等方面进行研究，建立了微滴式数字PCR检测APV的绝对定量方法，为绝对定量检测APV提供了技术支撑。

APV主要引起鸡上呼吸道的症状，以喷嚏，眼结膜潮红，泪腺肿，头部出现皮下水肿为特征，产蛋鸡感染主要引起产蛋下降2％-40％，孵化率降低。其引起的临床症状与NDV、AIV引起的症状很难区分，需要通过实验室方法进行区分，但在病毒载量较低的情况下，常规的方法也很难进行诊断，需要找到一种对低拷贝的检测方法。ddPCR方法的出现，满足了对低拷贝又能绝对定量检测的要求，因此建立ddPCR方法检测APV很有现实意义。

自1985年聚合酶链反应(PCR)检测问世以来，已被广泛应用于生物学、医学等各个领域。随着生物技术的飞速发展和技术进步，PCR技术已发展到荧光定量PCR(qPCR)技术，现今又发展到微滴数字PCR(ddPCR)技术。ddPCR技术是将样品分为油包水型的数百个甚至数百万个独立的反应单元，进而对所有独立的反应单元中包含或者不包含1个或多个拷贝的DNA模板分子进行平行扩增，在扩增结束后读取各个反应单元的阴性或者阳性荧光信号采用终点定量的方法进行分析，按泊松分布的统计学方法计算出原始样本的模板拷贝数从而达到绝对定量的目的。ddPCR与qPCR相比具有较高的灵敏度，在样品浓度较低时能识别目的片段，不需要通过扩增反应的CT值和标准曲线来实现核酸定量。近几年，ddPCR技术已开始在动物疫病检测中发挥了作用。

本试验建立了一种绝对定量检测APV的ddPCR方法，并对方法中的引物和探针浓度、退火温度进行优化，发现引物终浓度为1μmol/μL、探针浓度为0.5μmol/μL的情况下，反应具有最低的负荧光幅度(灰色)，阳性微滴信号(蓝色)高，阳性微滴与阴性微滴之间弥散少。退火温度为56℃，阳性微滴信号(蓝色)和阴性微滴信号(灰色)之间的荧光幅度差异最大，且获得阳性微滴数量最大。

本试验建立的ddPCR方法，与qPCR检测方法在灵敏性检测方面进行了比较。在定量检测相同稀释度的APV质粒DNA 时，ddPCR和qPCR的定量值均呈线性正相关，且ddPCR方法比qPCR方法检测的拷贝数更低1个滴度，更为灵敏。

本方法中，阳性模板浓度过高，ddPCR扩增的阳性产物超出10000copies/μL时，系统会读不出拷贝数，在这种情况下，为更准确获取扩增阳性的阳性拷贝数，应对模板浓度进行一定浓度的稀释后才能成功获得检测的拷贝数。而对临床样品的检测，往往由于样品中的目的模板含量低，因而本方法更适合于临床样品的检测。

本方法中，由于对操作的要求较高，在操作过程中所吸取的液体不能有气泡，而且扩增后读取的微滴总数(阳性和阴性微滴)应大于10000，这样ddPCR读取仪读出来的阳性微滴数比较准确。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 检测禽偏肺炎病毒的试剂及方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 166

<212> DNA

<213> 禽偏肺炎病毒(avian metapneumovirus)

<400> 1

gttctgggtg ccatagcatt aggtgtggca actgctgctg ctgtgacggc tggtgtagcg 60

atagccaaga caattaggct agaaggagaa gtggctgcaa tcaagggtgc tctcaggaaa 120

acaaatgagg ctgtatctac attaggaaat ggcgtgaggg tacttg 166

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 禽偏肺炎病毒(avian metapneumovirus)

<400> 2

gttctgggtg ccatagcatt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 禽偏肺炎病毒(avian metapneumovirus)

<400> 3

caagtaccct cacgccattt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 禽偏肺炎病毒(avian metapneumovirus)

<400> 4

agaaggagaa gtggctgcaa 20

Claims (10)

1.检测或辅助检测禽偏肺炎病毒的方法，其特征在于：所述方法包括利用试剂或试剂盒对待测样品进行数字PCR，根据数字PCR产物确定或辅助确定待测样品是否为禽偏肺炎病毒或，是否含有禽偏肺炎病毒或，是否感染禽偏肺炎病毒，

所述试剂或试剂盒为检测或辅助检测禽偏肺炎病毒的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括禽偏肺炎病毒引物探针，所述禽偏肺炎病毒引物探针包括引物APV-F和引物APV-R、探针APV-Probe，

所述引物APV-F为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的单链DNA；

所述引物APV-R为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA；

所述探针APV-Probe的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述APV-F、APV-R、APV-Probe的物质的量比值为2:2:1。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述试剂或试剂盒还包括阳性标准品质粒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述阳性标准品质粒包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述数字PCR中采用的PCR体系中所述APV-F的含量为1μmol/μL，所述APV-R的含量为1μmol/μL，所述APV-Probe的含量为0.5μmol/μL。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述数字PCR中采用的引物退火条件为56℃1分钟。

7.权利要求1-6中任一项所述的试剂或试剂盒。

8.权利要求7所述的试剂或试剂盒在检测或辅助检测禽偏肺炎病毒中的应用。

9.权利要求7所述的试剂或试剂盒在检测或辅助检测待测样本是否感染禽偏肺炎病毒的应用。

10.权利要求7所述的试剂或试剂盒在检测或辅助检测待测病原是否为禽偏肺炎病毒的应用。

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