CN115896344A - 一种重组腺相关病毒滴度检测引物探针组、试剂盒和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种重组腺相关病毒滴度检测引物探针组、试剂盒和应用。所述引物探针组包括引物探针组A或/和引物探针组B，所述引物探针组A在重组腺相关病毒载体基因组和ITR的交界处设计，所述引物探针组B在重组腺相关病毒骨架和ITR的交界处设计。本发明可以满足不同转基因的rAAV病毒样品，大大减少了物料成本和时间成本；引物探针组A不会检测到反向包装的病毒基因组，降低了对病毒滴度的高估。同时，只有发出双荧光信号的颗粒才会判断为完整颗粒，也排除了部分包装的不完整病毒颗粒的干扰；引物探针组B可用于鉴定rAAV病毒基因组中反向包装颗粒比值，评估生产中rAAV病毒包装的质量。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种重组腺相关病毒滴度检测引物探针组、试剂盒和应用。
背景技术
重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)因其非整合、无致病性、携带的治疗基因表达时间长、靶向性好等特点被广泛应用于基础研究和临床基因治疗中。重组腺相关病毒(rAAV)是一种非包膜病毒，包含一个被二十面体外壳包裹的单链DNA基因组，但是，含有转基因的基因组载体在rAAV生产过程中会有发生错误包装的情况，导致获得的产品中既有完整基因组也有部分小于单位长度的病毒基因组(如图1)。rAAV的质量直接影响临床基因治疗的疗效，包括临床前和临床研究的结果。因此，准确评估病毒中包装基因组的长度/大小是至关重要的。病毒滴度(vg/ml)是rAAV临床治疗中衡量rAAV病毒剂量的重要指标。rAAV的滴度通常是通过测量衣壳蛋白或rAAV基因组来确定的。由于空衣壳的存在不具有治疗价值，病毒基因组滴度是临床给药、生产和分析测试的首选方法。
目前应用最广泛的rAAV病毒滴度测定方法是实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-time PCR，qPCR)；近几年来，液滴数字PCR(ddPCR)的应用也越来越被重视。这两种方法的检测原理都是基于SYBR Green I法和TaqMan探针法，只是定量方式上有所不同。
qPCR法是在PCR体系中加入荧光基团以实时监测扩增过程中荧光信号的变化，然后通过标准曲线对待测样品进行定量，相对于SYBR Green I法，TaqMan探针法虽然成本较高，但从原理上讲，TaqMan探针法需要一对引物的同时还加入一个与靶序列互补配对的寡核苷酸链(TaqMan探针)，其5’末端包含荧光报告基团R，3’末端为淬灭基团Q，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步；并且可以进行同一体系多靶标检测，重复性、特异性和灵敏度较高。
但是近二十年来，人们在qPCR标准品制备、样品处理、引物/探针设计等方面做了大量的测试，qPCR方法对rAAV基因组滴度的测定仍然不稳定，不同实验室或同一实验室之间测定的滴度可相差10倍以上。液滴数字PCR(ddPCR)的出现似乎有可能解决rAAV基因组滴度测定的一个潜在偏差，相较于qPCR来说，ddPCR对结果的判定不依赖于扩增曲线，不受扩增效率的影响，ddPCR在检测时将大量稀释后的样品分散至芯片的微反应器或者微滴当中，根据泊松分布使得每个反应器的核酸模板数少于1或者等于1。经过PCR扩增之后，有核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器没有荧光信号，再根据有无荧光信号的相对比例、反应器的体积和泊松分布公式可以推算出样品原始溶液的浓度。因此，可以实现更高的准确性和精密度，而不需要标准曲线。利用ddPCR平台建立合适的质量鉴定方法以确定生产中rAAV病毒的质量显得至关重要。
目前，对rAAV滴度的检测主要采用两种策略，一种是针对特定的转基因序列或者polyA序列来设计ddPCR引物/探针；另外一种是将ddPCR引物/探针完全设计在rAAV载体的ITR上。设计在转基因序列或者polyA序列的引物/探针由于不同AAV载体中转基因及polyA序列的可变性，引物/探针并不通用，每一次引物/探针的更换都需要对其扩增效率进行测试，成本高，速度慢，且靶向转基因序列或者polyA会检测出随机包装进AAV衣壳的碎片化序列(如图1中的II、III、IV、V、VI、VII、VIII)，高估病毒滴度；另一种是在rAAV载体的ITR上设计引物/探针，则会出现以下问题，1、可检测到反向包装骨架序列的病毒颗粒(如图2)；2、检测到部分序列(包含左边或右边ITR和部分转基因序列，如图1中除V外的所有类型)包装的病毒颗粒。即使用ITR探针进行检测，含有小于单位长度基因组的病毒(如图1中除V外的所有类型)也会被误检，从而高估了病毒质量。
上述两种策略，都会受到不完全包装的rAAV基因组的影响，造成对病毒质量的高估。因此，引物/探针在rAAV基因组中的位置是相对关键的，引物/探针在不同位置上会对rAAV的定量有较大影响。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种重组腺相关病毒滴度检测引物探针组、试剂盒和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供了一种重组腺相关病毒检测引物探针组，包括引物探针组A或/和引物探针组B，所述引物探针组A在重组腺相关病毒载体基因组和ITR的交界处设计，所述引物探针组B在重组腺相关病毒骨架和ITR的交界处设计。
本申请的发明人结合TaqMan探针和ddPCR的高准确性和高精密度，经过大量研究及试验发现，设计出双引物探针体系实现对重组腺相关病毒(rAAV)基因组的检测，其中，引物探针组A设计在重组腺相关病毒载体基因组和ITR的交界处，可以检测具有完整基因组的病毒颗粒；引物探针组A和引物探针组B相隔较远，如果同一个液滴发出来两个荧光探针的信号，这表明载体基因组是存在和完整的，通过微滴中探针的荧光数量说明样品中rAAV病毒基因组质量。
引物探针组B设计在重组腺相关病毒骨架和ITR的交界处，可以用于检测反向包装骨架的病毒颗粒，若液滴发出荧光信号，则说明rAAV病毒基因组存在反向包装的颗粒，通过液滴中探针的荧光数量，反向说明样品中rAAV病毒基因组质量。
作为本发明所述重组腺相关病毒检测引物探针组的优选实施方式，所述引物探针组A包括具有SEQ ID NO:1-3所示核苷酸序列的引物以及含有SEQ ID NO:4-5所示核苷酸序列的探针；所述引物探针组B包括具有SEQ ID NO:1、6-7所示核苷酸序列的引物以及含有SEQ ID NO:8-9所示核苷酸序列的探针。
本发明将引物探针组A和引物探针组B设计在上述位置时，可以作为通用型的引物/探针，可以满足不同转基因的rAAV病毒样品，大大减少了物料成本和时间成本；引物探针组A不会检测到反向包装的病毒基因组，降低了对病毒滴度的高估。同时，只有发出双荧光信号的颗粒才会判断为完整颗粒，也排除了部分包装的不完整病毒颗粒的干扰，创新性地开发了有效病毒检测的方法。引物探针组B可用于鉴定rAAV病毒基因组中反向包装颗粒比值，评估生产中rAAV病毒包装的质量，提高临床用药的安全性。
作为本发明所述重组腺相关病毒检测引物探针组的优选实施方式，所述SEQ IDNO:4-5所示的探针、SEQ ID NO:8-9所示的探针的5’端连接有荧光报告基因，3’端连接有淬灭荧光基团。
作为本发明所述重组腺相关病毒检测引物探针组的优选实施方式，所述SEQ IDNO:4所示的探针5’端连接的荧光报告基团为FAM，3’端连接的淬灭荧光基团为TAM；
所述SEQ ID NO:5所示的探针5’端连接的荧光报告基团为VIC，3’端连接的淬灭荧光基团为TAM；
所述SEQ ID NO:8所示的探针5’端连接的荧光报告基团为FAM，3’端连接的淬灭荧光基团为TAM；
所述SEQ ID NO:9所示的探针5’端连接的荧光报告基团为VIC，3’端连接的淬灭荧光基团为TAM。
其中，引物和探针具体的核苷酸序列如下所示：
Primer ITR-F：CGGCCTCAGTGAGCGA(SEQ ID NO.1)；
Primer CR：CAACTTTTCTATACAAAGTTGTC(SEQ ID NO.2)
Primer DF：GGAAGAGAATAGCAGGCAT(SEQ ID NO.3)
Probe D-FAM：5’FAM-TTCCTGCGGCCCTCCCCAG-3’TAM(SEQ ID NO.4)；
Probe C-VIC：5’VIC-CACTAGGGGTTCCTTCTAGACAACT-3’TAM(SEQ ID NO.5)；
Primer-EF：CTCTGACTTGAGCGTCGATTT(SEQ ID NO.6)；
Primer-FR：ATGGTTGCTTTGACGTATGC(SEQ ID NO.7)；
Probe E-FAM：5’FAM-TGGCCTTTTGCTCACATGTCCTGCA-3’TAM(SEQ ID NO.8)；
Probe F-VIC：5’VIC-TACCGCATCAGGCGCCCCTGCA-3’TAM(SEQ ID NO.9)。
第二目的，本发明提供了上述重组腺相关病毒检测引物探针组在制备腺相关病毒滴度检测试剂中的应用。
第三目的，本发明提供了一种检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的重组腺相关病毒检测引物探针组。
作为本发明所述检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括待测样品的标准品。
第四目的，本发明提供了一种重组腺相关病毒滴度检测方法，包括以下步骤：
1)将重组腺相关病毒转导至宿主细胞中；
2)提取宿主细胞DNA；
3)用上述的重组腺相关病毒检测引物探针组或检测试剂盒进行扩增，进而分析病毒滴度。
第五目的，本发明提供了上述重组腺相关病毒检测引物探针组中的引物探针组A在制备检测具有完整基因组的病毒颗粒试剂中的应用。
第六目的，本发明提供了上述重组腺相关病毒检测引物探针组中的引物探针组B在制备检测反向包装重组腺相关病毒颗粒试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种重组腺相关病毒滴度检测引物探针组、试剂盒和应用，引物探针组包括引物探针组A或/和引物探针组B，将引物探针组A设计在重组腺相关病毒载体基因组和ITR的交界处，引物探针组B设计在重组腺相关病毒骨架和ITR的交界处，可以满足不同转基因的rAAV病毒样品，大大减少了物料成本和时间成本；含有引物探针组A的试剂盒不会检测到反向包装的病毒基因组，降低了对病毒滴度的高估。同时，只有发出双荧光信号的颗粒才会判断为完整颗粒，也排除了部分包装的不完整病毒颗粒的干扰；含有引物探针组B的试剂盒可用于鉴定rAAV病毒基因组中反向包装颗粒比值，评估生产中rAAV病毒包装的质量，提高临床用药的安全性。
附图说明
图1为不同完整性rAAV基因组图示；
图2为反向包装rAAV基因组图示；
图3为引物探针组A和引物探针组B的位置图；
图4为AAV病毒样品在体系1和体系2的基因组完整性检测数据汇总图；
图5为AAV病毒样品在体系3基因组反向包装检测数据汇总图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明结合TaqMan探针和ddPCR的高准确性和高精密度，使用ddPCR技术，设计了双引物探针体系对rAAV病毒基因组进行检测，引物探针组A在重组腺相关病毒载体基因组和ITR的交界处设计，所述引物探针组B在重组腺相关病毒骨架和ITR的交界处设计，引物探针的具体位置如图3所示。其中，引物探针组A用于检测具有完整基因组的病毒颗粒，如果同一个液滴发出来两个荧光探针的信号，这表明载体基因组是存在和完整的，通过微滴中Probe C-VIC和Probe D-FAM的荧光数量说明样品中rAAV病毒基因组质量。引物探针组B用于检测反向包装骨架的病毒颗粒，若液滴发出荧光信号，则说明rAAV病毒基因组存在反向包装的颗粒，通过液滴中Probe E和Probe F荧光数量，反向说明样品中rAAV病毒基因组质量。
具体引物和探针的核苷酸序列如表1所示。
表1
实施例1
1、制备质粒对照品：
1)pAAV[Exp]-CMV>EGFP:WPRE(ID：VB010000-9394npt，载体总长：5118bp，以下称为：Vector 3)酶切：
Control PstI：PstI酶切1μg Vector 3，37℃孵育1h后加10μL 50mM EDTA，终止反应；作为质粒对照品(Control PstI)，PstI酶切后的Vector 3保留了完整ITR序列，模拟rAAV病毒基因组；
Control PstI用Qubit 4.0测得浓度如表2，根据以下公式将单位换算成拷贝数如表1：
根据浓度、片段大小、平均每对碱基分子量(660)计算分子数，计算方法为：X＝A×6.02×1023×10-9/(660×B)。
其中X为每微升样品的拷贝数，A为片段所测的浓度(单位ng/μL)，B为片段大小(碱基对)。
表2质粒对照品浓度
| 名称 | 浓度(ng/μL) | 浓度(copies/μL) |
| Control PstI | 11.4 | 2.0E+9 |
2、AAV病毒样品制备：
1)消化外源DNA：
吸取2μL AAV病毒(AAV1和AAV2)，加入2μL DNaseI buffer(10x)和5U DNaseI，即1μL，最后用去离子水补足20μL，放在PCR仪里反应，反应程序如表3。
表3外源DNA消化反应程序
2)裂解释放AAV基因组：
往上一步所得的液体分别加入19μL AAV裂解液(0.1％SDS、10mM Tris、1mMEDTA)，获得体积为40μL的AAV裂解液；在PCR仪中反应，反应程序如表4：
表4 AAV基因组裂解反应程序
3)分别取10μL反应后的AAV裂解液(AAV1和AAV2)稀释至90μL ddH2O中，获得100μLAAV1待测样品和AAV2待测样品。
3、将步骤1制备的质粒对照品和步骤2制备的AAV病毒样品作为ddPCR模板，按表5配制反应体系进行ddPCR检测。
其中对照引物/探针Primer AF、Primer AR和Probe A-FAM靶向polyA区域，PrimerITR-F、Primer ITR-R和Probe ITR-VIC靶向ITR区域。
Primer ITR-F：CGGCCTCAGTGAGCGA(SEQ ID NO.1)；
Primer AF：CTTCTAGTTGCCAGCCATCT(SEQ ID NO.10)；
Primer AR：CCTACTCAGACAATGCGATG(SEQ ID NO.11)；
Probe A-FAM：5’FAM-CCGTGCCTTCCTTGACCCTGGA-3’TAM(SEQ ID NO.12)；
Primer ITR-R：GGAACCCCTAGTGATGGAGTT(SEQ ID NO.13)；
Probe ITR-VIC：5’VIC-CCACTCCCTCTCTGCGCGCTC-3’TAM(SEQ ID NO.14)。
使用的引物/探针和不同检测体系如下表所示：
表5
ddPCR不同测试体系样品浓度对比如表6所示。
表6
其中，体系1靶向左右ITR和内部固定序列的交界处，根据双荧光信号，检测具有完整基因组的病毒颗粒；体系2靶向基因组内部序列polyA和ITR序列，既可以检测基因组完整的病毒颗粒，也可以检测基因组不完整的病毒颗粒；体系3靶向左右ITR和骨架序列的边界处，可检测反向包装rAAV病毒颗粒，rAAV基因组完整性检测数据如图4所示。
从图4可看出，与质粒对照品Control PstI相比，2个AAV样品在不同检测体系中都出现了较高的单阳率，且双阳性比例在29％-83％之间，说明AAV病毒质粒在包装过程中确实出现不同程度的包装不完全。Probe A-FAM+Probe ITR-VIC(体系2)为文献中常用于AAV滴度检测的引物/探针，在2个AAV样品中Probe A-FAM的单阳率比Probe ITR-VIC分别少3.6、23.4倍，这是因为Probe A-FAM靶向rAAV基因组中的Poly A，可以检测到部分包装不完全的病毒颗粒(图1中的IV、V、VI、VII、和VIII)，而Probe ITR-VIC靶向rAAV基因组两端的ITR序列，可检测到大部分包装不完全的病毒颗粒(图1中除V外的所有类型)和反向包装的病毒颗粒(图2)；Probe A-FAM+Probe ITR-VIC(体系2)的双阳性率比Probe C-VIC+ProbeD-FAM(体系1)高，证明Probe A-FAM+Probe ITR-VIC(体系2)对于部分不完全包装的rAAV基因组也可以检测到双荧光信号(图1中的IV、VI、VII、和VIII)，因此易造成病毒滴度的高估；而Probe C-VIC+Probe D-FAM(体系1)中Probe C-VIC和Probe D-FAM分别靶向左右ITR和内部固定序列的交界处(见图3)，所以只有当rAAV为完整基因组时，才有双荧光信号；因此本发明Probe C-VIC+Probe D-FAM(体系1)在检测rAAV病毒基因组的完整性上更特异，有利于提高临床用药的安全性。
从表6的数据对比2个AAV样品的浓度，Probe A-FAM+Probe ITR-VIC(体系2，文献中常用)检测的样品浓度是Probe C-VIC+Probe D-FAM(体系1)的1.59和1.93倍，说明ProbeA-FAM+Probe ITR-VIC(体系2)受不完全包装病毒颗粒(图1中的IV、VI、VII、和VIII)的影响，导致滴度偏高，且其浓度较接近qPCR染料法测试的理论拷贝数(qPCR染料法因其检测原理的限制，特异性相对较差，会造成浓度偏高)。证明本发明的体系1(Probe D-FAM+ProbeC-VIC)特异性更高，可有效排除滴度值的高估。
根据图5，2个AAV样品都可检测到少量的荧光信号，说明rAAV载体在病毒包装过程确实是有反向包装(图2)可能存在，但基本都是不完全反向包装，因为双荧光比例极低，因此，在rAAV载体的ITR上设计检测病毒滴度的引物/探针，容易造成对病毒滴度的高估，本发明的体系3(Probe E-FAM+Probe F-VIC)可做为反向评估病毒质量的参考方法。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种重组腺相关病毒检测引物探针组，其特征在于，包括引物探针组A或/和引物探针组B，所述引物探针组A在重组腺相关病毒载体基因组和ITR的交界处设计，所述引物探针组B在重组腺相关病毒骨架和ITR的交界处设计。
2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒检测引物探针组，其特征在于，所述引物探针组A包括具有SEQ ID NO:1-3所示核苷酸序列的引物以及含有SEQ ID NO:4-5所示核苷酸序列的探针；所述引物探针组B包括具有SEQ ID NO:1、6-7所示核苷酸序列的引物以及含有SEQID NO:8-9所示核苷酸序列的探针。
3.如权利要求2所述的重组腺相关病毒检测引物探针组，其特征在于，所述SEQ ID NO:4-5所示的探针、SEQ ID NO:8-9所示的探针的5’端连接有荧光报告基因，3’端连接有淬灭荧光基团。
4.如权利要求3所述的重组腺相关病毒检测引物探针组，其特征在于，
所述SEQ ID NO:4所示的探针5’端连接的荧光报告基团为FAM，3’端连接的淬灭荧光基团为TAM；
所述SEQ ID NO:5所示的探针5’端连接的荧光报告基团为VIC，3’端连接的淬灭荧光基团为TAM；
所述SEQ ID NO:8所示的探针5’端连接的荧光报告基团为FAM，3’端连接的淬灭荧光基团为TAM；
所述SEQ ID NO:9所示的探针5’端连接的荧光报告基团为VIC，3’端连接的淬灭荧光基团为TAM。
5.如权利要求1-4任一项所述的重组腺相关病毒检测引物探针组在制备腺相关病毒滴度检测试剂中的应用。
6.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-4任一项所述的重组腺相关病毒检测引物探针组。
7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括待测样品的标准品。
8.一种重组腺相关病毒滴度检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将重组腺相关病毒转导至宿主细胞中；
2)提取宿主细胞DNA；
3)用权利要求1-4任一项所述的重组腺相关病毒检测引物探针组或如权利要求6或7所述的检测试剂盒进行扩增，进而分析病毒滴度。
9.如权利要求2所述的重组腺相关病毒检测引物探针组中的引物探针组A在制备检测具有完整基因组的病毒颗粒试剂中的应用。
10.如权利要求2所述的重组腺相关病毒检测引物探针组中的引物探针组B在制备检测反向包装重组腺相关病毒颗粒试剂中的应用。
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