CN116875743B

CN116875743B - 一次性检测两种猫肠道病毒的荧光定量pcr试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN116875743B
Application number: CN202311149473.3A
Authority: CN
Inventors: 刘家森; 贾洪林; 姜骞; 康洪涛; 梁雨萌; 郭焕平
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2023-09-07
Filing date: 2023-09-07
Publication date: 2023-12-29
Anticipated expiration: 2043-09-07
Also published as: CN116875743A

Abstract

本发明公开了一种一次性检测两种猫肠道病毒的荧光定量PCR试剂盒及其应用。所述的两种猫肠道病毒为猫冠状病毒（Feline coronavirus，FCoV）以及猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)，所述的试剂盒中含有分别用于检测猫冠状病毒以及猫细小病毒的特异性引物和探针组合。本发明建立的方法通用性好，可以检测到GenBank中收录的所有已知序列的FCoV毒株。灵敏度实验结果表明，使用本发明试剂盒检测的最低FCoV标准品质粒拷贝数为94copics/μL和最低FPV标准品质粒拷贝数为69copics/μL。本发明的提出为检测猫冠状病毒以及猫细小病毒提供了新的技术手段。

Description

一次性检测两种猫肠道病毒的荧光定量PCR试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种猫肠道病毒的荧光定量PCR试剂盒及其应用，特别涉及一种一次性检测两种猫肠道病毒的荧光定量PCR试剂盒及其应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

猫冠状病毒（Feline coronavirus，FCoV）属于冠状病毒科，是一种大型球状有囊膜的单股正链 RNA 病毒，属于冠状病毒科的 α 冠状病毒。FCoV 普遍引起猫肠道感染，称之为猫肠道冠状病毒（Feline enteric coronavirua，FECV）。基因组发生突变后，偶尔会导致高致死的免疫介导血管炎，通常称为猫传染性腹膜炎（feline infectiousperitonitis，FIP），诱导致死性免疫介导疾病。

猫细小病毒病，又称猫泛白细胞减少症(Feline panleukopenia，FP)，也叫猫瘟热、猫传染性肠炎，是由猫细小病毒(Feline parvovirus, FPV) 引起猫的一种发热性、高度接触性、致死性传染病(亢文华, 2008)。其典型的临床特征为：发热、呕吐、腹泻及白细胞数目严重减少。

上述两种病毒的主要感染的靶器官都是肠道、消化道，针对肠道样本一次性检测是否存在两种病毒，对于临床诊断具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以一次性检测两种猫肠道病毒的荧光定量PCR试剂盒及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一次性检测两种猫肠道病毒的荧光定量PCR试剂盒，所述的两种猫肠道病毒为猫冠状病毒（Feline coronavirus，FCoV）以及猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV) ，所述的试剂盒中含有分别用于检测猫冠状病毒以及猫细小病毒的特异性引物和探针组合；其中，用于检测猫冠状病毒的特异性引物和探针序列如下：

FCOV-1-F：TCCCTGTTTGGTAAGTCGTCTAGT；

FCOV-1-R：GGAAGGCTAGGAACGTTGAC；

FCOV-1-P：FAM-TCTCCCTCGCCGGCCGCCA-BHQ1；

用于检测猫细小病毒的特异性引物和探针序列如下：

FPV-3-F：CCAGAAACCGTTGAAACCACAG；

FPV-3-R：TGTGCCATCATTTCAATATAACTATCTGG；

FPV-3-P：VIC-CAGCACAGGAAACAAAGCGCGGGAGAAT-BHQ1。

其中，优选的，所述的荧光定量PCR试剂盒中还含有One Step PrimeScript IIIRT-qPCR with UNG (2X)。

其中，优选的，使用所述的荧光定量PCR试剂盒检测时，检测体系如下所示：

其中，优选的，使用所述的荧光定量PCR试剂盒检测时，反应条件为：

进一步的，本发明还提出了所述的荧光定量PCR试剂盒在制备检测试剂中的应用，所述的试剂是用于一次性检测猫冠状病毒以及猫细小病毒的试剂。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明公开了一种可以一次性检测两种猫肠道病毒的荧光定量PCR试剂盒。本发明建立的方法通用性好，可以检测到GenBank中收录的所有已知序列的FCoV毒株。灵敏度实验结果表明，使用本发明试剂盒检测的最低FCoV标准品质粒拷贝数为94copics/μL和最低FPV标准品质粒拷贝数为69copics/μL。本发明的提出为检测猫冠状病毒以及猫细小病毒提供了新的技术手段。

附图说明

图1为标准质粒的构建；

图2为标准曲线的检测结果；

图3为TaqMan荧光定量PCR敏感性扩增曲线；

图4为TaqMan荧光定量PCR特异性扩增曲线；

图5为CN114277189A中引物的比对结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但该实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1一次性检测两种猫肠道病毒的荧光定量PCR方法的建立

1材料和方法

1.1毒株来源

用于方法建立的FCoV、FPV毒株均为本实验室保存。

1.2主要试剂及仪器设备

大肠杆菌DH5α；

pMD18TM-T Vector；

DNA Marker DL2000购自TaKaRa公司；

核酸提取试剂盒购自济凡生物科技有限公司；

One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix, with UNG购自TaKaRa公司；

琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒以及普通质粒小量提取试剂盒均购自Omega公司；

QuantStudio™3&5荧光定量PCR仪；

超微量分光光度计。

1.3引物和探针的设计与合成

通过对FCoV和FPV所有已知序列利用MegAlign进行同源性分析，确定其保守序列，利用Oligo 7设计软件，针对FCoV设计7对特异性引物和7条探针（表1）；针对FPV设计7对特异性引物和7条探针（表2），用于双重TaqMan荧光定量PCR方法引物和探针的筛选。用Primer-BLAST对引物和探针的特异性进行验证。每一套引物探针设计用于检测单一目标病原体。引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.4 FCoV和FPV总核酸提取

本研究使用的猫感染性腹膜炎病毒(FIPV) DF-2株(GenBank:JQ408981.1)、猫细小病毒(FPV) XJ-1株、猫疱疹病毒(FHV) HRB-2019株和猫杯状病毒(FCV) FCV-2280株(GenBank:KC835209.1)已在本实验室保存。FIPV和FPV均用CRFK细胞培养，CRFK细胞用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI Medium 1640 basic培养基培养。在哈尔滨某猫舍采集疑似FCoV和FPV的猫肛拭子，- 80℃保存。

采用FineQuick病毒DNA/RNA提取试剂盒(北京吉帆公司)按照说明书提取FCoVRNA和FPV DNA。使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录反应，按照制造商的说明书(Vazyme，南京，中国)合成FCoV的第一链cDNA。所有产品均储存在−80℃下使用。

1.5 阳性质粒标准品的制备

以实验室保存的FCoV、FPV毒株提取的核酸为模板，分别使用标准品引物（表3）扩增目的片段，按照以下体系进行PCR扩增。PCR扩增体系： 2×Premix Taq™（Ex TaqVersion 2.0 plus dye） 10 μL；上游引物（10μM）1μL；下游引物（10 μM）1μL；模板基因组1μL；ddH₂O 7μL；反应条件按照说明书进行设置，退火温度设置为 55℃。

扩增的PCR产物参照pMD18-T Vector Cloning Kit的说明书，将目的基因片段插入pMD18- T Vector载体中，将连接产物化学转化至DH5a感受态细胞中，将转化后的细胞涂于含有氨苄抗性的LB琼脂平板，于37℃温箱中培养过夜。次日挑选单克隆菌落于含有氨苄抗性的LB培养基于37℃、180r/min振荡培养12h后，将菌液作为模板，分别利用表3中的标准品引物，进行菌液的PCR鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液进行测序。利用SnapGene软件比对测序结果，选择序列完全正确的菌液保存菌株。提取重组后的质粒，利用超微量分光光度计测定质粒浓度，按照以下公式计算质粒拷贝数：6.02×10¹⁴×质粒浓度(ng/uL×10^-9)/DNAlength×660(Dolton/碱基数)=(质粒拷贝数)copies/μL，获得阳性质粒标准品。标记为pMD18-T-1FCoV、pMD18-T-2FCoV和pMD18-T-1FPV、pMD18-T-2FPV、pMD18-T-3FPV。

1.6 一步法双重TaqMan荧光定量PCR引物和探针的筛选组合

首先清理超净台，75%酒精喷洒台面，5min后擦净。在超净台中放入荧光定量 PCR试剂、移液枪、枪头盒、96孔板、PCR管等实验器材，喷洒核酸清洁液后开启超净台风机，静置10min去除核酸污染。

分别FCoV、FPV毒株提取的核酸为模板，使用表1、2中的引物和探针进行荧光定量PCR，分别验证引物及探针的有效性。以最低的阈值循环数(Cyclethreshold，Ct)和最高的荧光强度增加值(ΔRn)为鉴定标准，筛选最优的引物和探针。参照 2×探针 qPCR Mix说明书设定反应体系和条件，反应体系为：One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix, withUNG (2X) 10μL、PCR 正向引物(10 μM) 0.4 μL、PCR反向引物(10 μM) 0.4 μL、探针（10 μM）0.4 μL、模板2μL、ddH₂O 6.8 μL，反应条件为：保温阶段 25℃ 10 min、52℃ 5 min、95℃10 sec、循环阶段: 95℃ 5 sec、60℃ 30 sec，40个循环。

将最优的两组引物和探针进行组合建立FCoV、FPV双重TaqMan荧光定量一步法PCR检测方法，并与单重的荧光定量PCR结果进行比较，观察有无交叉反应和相互影响。

1.7 一步法双重TaqMan荧光定量PCR反应条件的优化

1.7.1退火温度的优化

设定退火温度分别为 58°C、59℃、60℃、61℃、 62℃、63℃，反应体系和反应条件如上所述，除退火温度改变，其余设定不变，进行一步法实时荧光定量PCR反应条件优化，选择Ct值最低且ΔRn较高的温度为最佳退火温度。

1.7.2引物与探针浓度的确定

应用上述试验得到的最佳退火温度，引物浓度分别设计为 0.1 μM、0.2 μM、0.3 μM、0.4 μM、0.5μM 进行优化，探针浓度分别设计为 0.1 μM、0.2 μM、0.3 μM、0.4 μM，进行一步法实时荧光定量PCR反应条件优化，选择Ct值最低且ΔRn较高的温度为最佳退火温度。

1.8 一步法双重TaqMan荧光定量PCR反应体系的确定

根据上述试验结果，确定最终的双重TaqMan荧光定量一步法PCR 的反应体系。

1.9一步法双重TaqMan荧光定量PCR 标准曲线的建立

将已测定好浓度的标准品质粒进行10倍倍比稀释，稀释至10^-2-10^-9 ，使用梯度稀释的质粒标准品为模板，选择商品化的 DNase/RNase-free 去离子水为阴性对照，利用本研究建立的方法进行双重TaqMan荧光定量一步法PCR 扩增，运用QuantStudio^TMDesign&Analysis Software 软件分析试验结果，绘制标准曲线。

1.10一步法双重TaqMan荧光定量PCR敏感性、特异性和重复性试验

为了评估灵敏度，将FPV和FCoV标准品质粒做连续10倍稀释，稀释后取10¹⁰copics/μL-10¹copics/μL的质粒作为模板进行敏感性实验。

为了确定双重荧光定量PCR检测方法的特异性，使用10⁴copics/μL FPV和10⁴拷贝/mL FCoV质粒标准品及其他2种猫科病毒（FHV和FCV）作为模板。使用优化后的反应条件进行双重荧光定量PCR扩增，以评估所建方法的特异性。

为了评估实验的稳定性，分别用以上的方法稀释质粒标准品，分别选取10⁷copics/μL、10⁶copics/μL 10⁵copics/μL的质粒标准品作为模板，利用优化好的反应条件，进行敏感性试验。分别使用相同批次的模板稀释样品做三次重复，及浓度相同的3个不同批次的模板稀释样品分别做3次重复实验，即批内重复实验和批间重复实验。计算最终变异系数（CV）。数据越稳定，CV值就越小。

2 实验结果

2.1引物和探针的初步筛选结果

提取的FCoV和FPV总核酸只作为检测模板，以表1中针对FCoV病毒的7对特异性引物和7条探针，表2中针对FPV的7对特异性引物和7条探针进行初步筛选，筛选出FCoV 1号和2号组合，FPV的1~3号组合进行下一步的研究使用。

2.2 一步法双重TaqMan荧光定量PCR阳性质粒标准品的鉴定

对构建的重组质粒进行PCR扩增，分别获得562bp、573bp、792bp、541bp、929bp大小的目的片段，与预期相符。测序结果进一步证实重组质粒构建成功。（图1）。

2.3 一步法双重TaqMan荧光定量PCR引物和探针的筛选结果

FCoV、FPV特异性引物和探针筛选结果见表4，选择Ct值较低且扩增曲线明显的引物和探针组合，FCOV、FPV特异性引物和探针序列如下：

FCOV-1-F：TCCCTGTTTGGTAAGTCGTCTAGT

FCOV-1-R：GGAAGGCTAGGAACGTTGAC

FCOV-1-P：FAM-TCTCCCTCGCCGGCCGCCA-BHQ1

FPV-3-F：CCAGAAACCGTTGAAACCACAG

FPV-3-R：TGTGCCATCATTTCAATATAACTATCTGG

FPV-3-P：VIC-CAGCACAGGAAACAAAGCGCGGGAGAAT-BHQ1

将最优的两组引物和探针进行组合建立FCoV、FPV双重TaqMan荧光定量一步法PCR检测方法，并与单重的荧光定量PCR结果进行比较，发现双重荧光定量 PCR 方法中两个荧光信号相互的影响很小，对 Ct 值的影响在误差范围内，证明本研究建立的方法无交叉反应和相互影响（表5）。

2.4一步法双重TaqMan荧光定量PCR反应条件的优化

通过对FCoV、FPV双重实时荧光定量PCR条件的优化，选择FCoV-1-F/R/P的终浓度为0.2mM、FPV-3-F/R/P的终浓度为0.2mM，退火温度为59℃时，对同一检测样品的检测信号最强，Ct值最小。

2.5一步法双重TaqMan荧光定量PCR反应体系的确定

根据上述实验结果，确定FCoV、FPV双重TaqMan荧光定量一步法PCR的反应体系。总体积为20mL的反应体系见表6，反应条件见表7。

2.6 一步法双重TaqMan荧光定量PCR标准曲线的建立

测定pMD18-T-1FCoV质粒标准品的浓度为333.57ng/ml，pMD18-T-3FPV质粒标准品的浓度为274.59ng/ml；通过公式计算pMD18-T-1FCoV质粒标准品的拷贝数（6.02×10²³×333.57ng/ml×10^-9 ）/660×(2692bp+562bp)=9.4×10¹⁰copies/ml，pMD18-T-3FPV质粒标准品的拷贝数（6.02×10²³× 274.59ng/ml×10^-9 ）/660× （2692bp+ 929bp）=6.9×10¹⁰copies/ ml；分别将pMD18-T-1FCoV、pMD18-T-3FPV的质粒标准品十倍倍比稀释，稀释至10^-2-10^-9，使用梯度稀释的质粒标准品为模板进行双重荧光定量PCR扩增，获得标准曲线（如图2）；结果显示标准曲线线性关系良好，质粒拷贝数（X）于Ct值（Y）的标准曲线方程为：pMD18-T-1FCoV:Y=-3.308lgX+39.662，R²=0.999;pMD18-T-3FPV：Y=-3.192lgX+39.641，R²=0.999。

2.7 一步法双重TaqMan荧光定量PCR敏感性实验

将FCoV、FPV标准品质粒，用核酸蛋白检测仪测定其浓度，计算其拷贝数，然后进行10倍系列梯度稀释，分别获得9.4×10⁹copies/mL-9.4×10⁰copies/mL和6.9×10⁹copies/mL -6.9×10⁰copies/mL，利用本发明建立的一步法FCoV和FPV双重实时荧光定量进行扩增，得到FCoV和FPV TaqMan探针法实时荧光定量PCR的动力学扩增曲线。如图3所示，其中，FCoV核酸浓度1-8：9.4×10⁹-9.4×10²copics/μL，9：94 copics/μL和FPV核酸浓度a-h：6.9×10⁹-6.9×10²copics/μL；i：69 copics/μL，在Ct<40范围内可以检出的最低FCoV标准品质粒拷贝数为94copics/μL（表8）和最低FPV标准品质粒拷贝数为69copics/μL（表9）。

表8 FCoV标准品质粒拷贝数对应的Ct值

2.8 荧光定量PCR重复性实验

结果见表10，上述实验结果显示批内重复性和批间重复性试验的变异系数均低于2%，表明本实验建立的方法具有良好的重复性和稳定性。

2.9 荧光定量PCR特异性实验

分别以实验室保存的猫杯状病毒（FCV）、猫疱疹病毒（FHV）、FCoV、FPV的基因组核酸为模板，利用本研究建立的双重荧光定量PCR方法检测。结果显示， FCoV、FPV有明显的扩增曲线，其他病毒无明显扩增曲线，如图4所示，其中，1：FCoV；2：FPV；3：FCV；4：FHV；5：Negative control。实验结果表明，该方法具有良好的特异性。

实施例2 本发明建立的FCoV和FPV双重TaqMan 实时荧光定量一步法PCR 检测方法与公开号为CN114277189A中FCoV TaqMan 实时荧光定量PCR 检测方法比较的优势

根据针对特异性引物靶位点的碱基突变情况，合成7条（表11）核苷酸序列并构建到puC57载体，此7种重组质粒，涵盖了特异性引物靶位点的所有碱基突变情况，用该方法对实验室保存的FCoV毒株以及构建的重组质粒进行检测，结果显示，均有相应的扩增曲线，表明本发明方法的通用性好，可以检测到GenBank中收录的所有已知序列的FCoV毒株。

公开号为CN114277189A的专利申请，公开了一种猫和/或犬病原体的PCR检测试剂盒及检测方法和应用，其中，所述用于检测猫细小病毒的引物及探针序列为：

FF3：5’-TGGAACTAGTGGCACACCAA-3’，

FR3：5’-AAATGGTGGTAAGCCCAATG-3’，

FP3：5’-ROX-CAGGTGATGAATTTGCTACAGG-BHQ2-3’；

所述用于检测猫冠状病毒的引物及探针序列为：

FF4：5’-GATTTGATTTGGCAATGCTAGATTT-3’，

FR4：5’-AACAATCACTAGATCCAGACGTTAGCT-3’，

FP4：5’-FAM-TCCATTGTTGGCTCGTCATAGCGGA-BHQ1-3’。

然而，CN114277189A中建立的FCoV检测方法，不能检测到UG-FH8这株毒（GenBankKX722529.1），是由于该株毒特异性引物靶位点部分碱基缺失。因此该方法无法检测到GenBank中收录的所有已知序列的FCoV毒株（图5）。

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Claims

1.一次性检测两种猫肠道病毒的荧光定量PCR试剂盒，所述的两种猫肠道病毒为猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)以及猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)，其特征在于，所述的试剂盒中含有分别用于检测猫冠状病毒以及猫细小病毒的特异性引物和探针组合；其中，用于检测猫冠状病毒的特异性引物和探针序列如下：

FCOV-1-F：TCCCTGTTTGGTAAGTCGTCTAGT；

FCOV-1-R：GGAAGGCTAGGAACGTTGAC；

FCOV-1-P：FAM-TCTCCCTCGCCGGCCGCCA-BHQ1；

用于检测猫细小病毒的特异性引物和探针序列如下：

FPV-3-F：CCAGAAACCGTTGAAACCACAG；

FPV-3-R：TGTGCCATCATTTCAATATAACTATCTGG；

FPV-3-P：VIC-CAGCACAGGAAACAAAGCGCGGGAGAAT-BHQ1。

2.如权利要求1所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的荧光定量PCR试剂盒中还含有One Step PrimeScript III RT-qPCR with UNG。

3.如权利要求1所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，使用所述的荧光定量PCR试剂盒检测时，检测体系如下所示：One Step PrimeScript III RT-qPCR with UNG 10μl，10μM的FCOV-1-F 0.4μl，10μM的FCOV-1-R0.4μl，10μM的FPV-3-F 0.4μl，10μM的FPV-3-R 0.4μl，10μM的FCOV-1-P0.4μl，10μM的FPV-3-P 0.4μl，核酸2μl，灭菌水5.6μl，Total 20μl。

4.如权利要求3所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，使用所述的荧光定量PCR试剂盒检测时，反应条件为：

反转录反应：25℃10min，52℃5min；95℃10s，1循环；

PCR反应：95℃5s，59℃30s，40循环。

5.权利要求1-4任一项所述的荧光定量PCR试剂盒在制备检测试剂中的应用，其特征在于，所述的试剂是用于一次性检测猫冠状病毒以及猫细小病毒的试剂。