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DESCRIPTION QUANTIFICATION DE MOLECULES D'ACIDE NUCLEIQUE ET
TROUSSE DE REACTIFS MISE EN OEUVRE
La présente invention est relative à la quantification de certaines molécules d'acide nucléique, en particulier du degré d'amplification des gènes et/ou des molécules d'ARN messager correspondant, au moyen de la méthode d'hybridation-sandwich ou en solution, et ä la trousse de réactifs mise en oeuvre.
Le nombre de copies de gènes individuels dans le génome est généralement constant. Dans certains cas, il n'y a qu'un gène par génome haplolde et plusieurs dans d'autres. Dans certaines eirconstances, le nombre de copies peut changer. On a trouvé par exemple, que l'amplification de certains gènes est associée au développement du cancer. On sait aussi que des facteurs extérieurs, comme des produits pharmaceutiques et des métaux, etc., provoquent 1'amplification de certains gènes. Le taux d'expression défectueux ou augmente d'un gène, comme un oncogène, c'est-à-dire la quantité d'ARN messager dans la cellule revêt une importance majeure pour le développement d'une maladie.
Un nombre accrû de certains chromosomes est la cause de certaines maladies héréditaires ou d'autres troubles, tandis que certaines maladies héréditaires ne requièrent que la duplication d'un gène récessif. Dans tous les cas, il est important de déterminer le nombre de gènes ou de chromosomes présents.
Le nombre de certaines molécules d'ADN, par exemple le degré d'amplification de gènes donnés, est couramment
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déterminé par digestion de l'ADN extrait à étudier avec des enzymes de restriction et Separation des fragments de nucléotide en fonction de leur longueur, par électrophorèse sur gel d'agarose. L'ADN à brin unique est ensuite transféré et fixé sur un filtre de nitrocellulose, ou l'hybridation a lieu avec le gène à étudier ou une partie du gène en tant que sonde. Les résultats sont obtenus par autoradiographie (Southern, J. Mol. Biol. 98, pp. 503-517, 1975).
Dans chaque analyse parallele, la quantité d'ADN cellulaire est la meine. Les intensites des banques d'hybridation, c'est-a-dire les signaux, sont comparées et les rapports entre les taux de réplication des gènes étudiés dans les échantillons d'essai, sont obtenus par déduction. La méthode ne fournit que des resultats approximatifs. De même, l'ARN est mesuré avec les méthodes de fixation sur papier-filtre (blotting) de Northern ou par points. Ces méthodes sont très imprécises quantitativement (Themas, Methods in Enzymol., 100, pp. 255-266, 1983).
Des méthodes connues, comme les méthodes de fixation sur papier-filtre de Southern et de Northern, sont lentes et difficiles ä réaliser. Comme elles ne fournissent que des résultats approximatifs, leur intérêt diagnostique est douteux
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dans les cas où il est important de connaitre le nombre de certaines molécules d'acide nucléique par unité donnée, telle qu'une cellule.
Les méthodes d'hybridation-sandwich ou en solution, décrites dans le Brevet US n 4. 486. 539 et dans la Demande de Brevet britannique n GB 2. 169. 403 sont quantitatives (Virtanen et coll., Lancet 1, pp. 381-383, 1983). De plus, la méthode de la présente invention nécessite un acide nucléique standard dont le taux de replication est constant et permet la détermination du nombre de molécules d'acide nucléique correspondant par unite donnée, comme une cellule, un noyau, un ribosome ou un chromosome.
La présente invention a pour but de produire une méthode quantitative précise et rapide de determination des
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molecules d'acide nucléique, qui est aussi plus rapide et plus simple à mener que les méthodes utilisées couramment. Elle peut etre utilisée pour des diagnostics de cancer et prénataux, pour détecter des agents qui provoquent une amplification des gènes et pour mettre en évidence le développement par exemple d'une résistance ä un médicament, ainsi que pour déterminer le taux d'expression d'ARN messager.
Il faut procéder ä au moins deux déterminations dans la presente invention. On détermine la molécule d'acide nucléique, qui peut être présente dans plusieurs copies, à savoir l'acide nucléique d'essai. Par ailleurs, on détermine la molecule d'acide nucléique constitutif avantageusement présente en nombre constant, l'acide nucléique étalon dit "standard". Dans la méthode selon la présente invention, une molécule d'acide nucléique représente une certaine séquence de nucléotides de 10 à 12 nucléotides ou un gène contenant plusieurs milliers de nucléotides. Elle peut aussi signifier un ARN messager ou une séquence de nucléotides beaucoup plus longue qulun simple gène, c'est-à-dire un amplicone.
La determination des acides nucléiques d'essai et standard est faite selon une méthode d'hybridation-sandwich par ailleurs normale, décrite par exemple dans le Brevet US nO 4. 486. 539 ou une méthode d'hybridation en solution décrite dans la Demande de Brevet britannique nO GB 2. 169. 403.
L'invention concerne aussi une trousse de réactifs contenant des réactifs d'acide nucléique, comprenant au moins une paire de sondes d'essai et au moins une paire de sondes standards.
Les réactifs ou sondes, utilisés dans cette méthode, sont préparés par des techniques d'ADN recombinant, à partir d'acides nucléiques suffisamment homologues des acides nucléiques d'essai et standard. Des acides nucléiques suffisamment homologues peuvent aussi être prepares, par voie synthétique ou semi-synthétique.
Les acides nucléiques d'essai et standard peuvent être directement isoles a partir des cellules et identifiés par
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diverses techniques d'hybridation. Ces acides nucléiques d'essai et standard sont cependant aussi disponibles industriellement et chez diverses banques de gènes. Des acides nucléiques d'essai et standard peuvent etre des ADN ou des ARN.
Des paires de sondes convenables pour la méthode d'hybridation-sandwich ou en solution, sont préparées à partir d'aeides nucléiques suffisamment homologues des acides nucléiques d'essai et standard par des techniques d'ADN recombinant. Les acides nucléiques correspondants sont digérés par des enzymes de restrietion convenables ; deux au moins des fragments de restrietion résultants situés relativement près les uns des autres sont clonés dans au moins deux vecteurs convenables.
L'un des fragments, la sonde de détection, est marqué avec un marqueur detectable convenable et l'autre, la sonde de capture, est fixé à un support convenable ou bien une substance est fixee à celui-ci, laquelle substance permet la séparation de l'hybride résultant à partir du mélange d'hybridation au moyen d'une autre substance, comme le composant complémentaire d'une paire d'affinité.
Les paires de sondes d'essai et standard peuvent être assemblées dans des trousses de réactifs convenables, dans lesquelles les paires de sondes d'essai et standard sont toutes deux un ADN ou un ARN, ou bien la paire de sondes d'essai est formée d'ADN et la paire de sondes standards d'ARN, ou vice versa.
Le retraitement et le traitement supplémentaire des échantillons avant l'hybridation et les conditions d'hybridation doivent donc convenir aux paires de sondes utilisées dans le test.
La methode de la présente invention convient particulièrement pour déterminer le nombre de molecules d'acide nucléique directement à partir des homogénates cellulaires. La méthode peut évidemment aussi être utilisée pour la détermination d'acides nucléiques purifies ou purs. Cependant, avant d'effectuer la méthode de l'invention, on doit choisir le prétraitement le plus convenable de l'échantillon d'acide nucléique.
Il est possible d'effectuer à la fois des
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determlnaLions d'ADN et d'ARN selon la méthode de l'invention. Les acides désoxyribonucléiques sont dénaturés pour obtenir des brins uniques si cela est necessaire. Des molécules d'ARN messager a brin unique perturbant potentiellement le test d'hybridation, peuvent etre hydrolysées, par exemple par ébullition alcaline. L'échantillon n'est pas dénaturé dans le cas des déterminations d'acide ribonucléique, puisque l'acide désoxyribonucléique à double brin n'interfere pas avec la détermination d'ARN. Il est bien sur possible de briser l'ADN
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avec une désoxyribonucléase ou de la modifier chimiquement ou mécaniquement de telle sorte qu'il ne puisse pas participer ä la réaetion d'hybridation.
A propos des determinations d'ADM et d'ARN, une méthode convenable pour un traitement supplémentaire de l'échantillon doit donc être choisie ou, dans une variante, un tel traitement peut être omis. Le choix d'une méthode convenable pour le traitement supplémentaire dépend bien sûr de la méthode utilisée pour le traitement preliminaire de 1'échanti11on d'acide nucléique. De nombreuses méthodes de retraitement et de traitement supplementaire des échantillons d'acide nucléique ont été décrites dans la littérature, si bien qu'il est possible de choisir la méthode la plus convenable dans chaque cas.
Des déterminations dans lesquelles les acides
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nucléiques à la fois d'essai et standard, sont soit des ADN, soit des ARN, peuvent être réalisées avec un échantillon qui n'est pas divisé. Des déterminations dans lesquelles les acides nucléiques d'essai sont des ADN et les acides nucléiques standards sont des ARN ou vice versa, doivent être effectuées avec un échantillon divisé, dans la mesure où 11 est necessaire de procéder à différentes méthodes pour le traitement supplémentaire.
L'échantillon peut évidemment être divisé, même si les acides nucléiques d'essai et standard sont du même type d'acide nucléique.
Le test d'hybridation lui-même est realise par mise de la solution d'échantillon non divisée, simultanément en contact avec au moins une paire de sondes d'essai, et une paire de
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sondes standards. Si la solution de l'échantillon a été divisée, elle est mise séparément en contact avec au moins une paire de sondes d'essai et une paire de sondes standards. Dans ces cas, la quantité d'acide nucléique d'essai est déterminée dans un réacteur et la quantité d'acide nucléique standard dans un autre.
Que l'échantillon soit divise ou non, on laisse l'hybridation avoir lieu dans les conditions et pendant le temps les plus avantageux dans chaque cas. Lorsque le ou les reactions ont eu lieu, les hybrides d'essai et standard resultants sont séparés du ou des mélanges d'hybridation par le support et lavés, ou par un agent d'isolation comme le membre complémentaire d'une paire d'affinités. Le marqueur attaché aux hybrides d'essai et standard est mesuré et le resultat est comparé à des courbes d'étalonnage. De cette façon, le nombre de molecules d'acide nucléique ä étudier peut être determine par unité choisie.
La méthode de l'invention a un intérêt diagnostique pratique en particulier dans la détection de certains types de
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cancer. Dans le carcinome du poumon à petites cellules, le gène cmyc est souvent amplifie et son taux d'expression considérablement supérieur ä celui qui est observé dans un tissu normal. Dans les cas de neuroblastomes, le gène N-myc est amplifie.
La méthode de la présente invention peut aussi etre utilisée pour mettre en evidence les effets mutagènes ou carcinogènes de certains agents, ou le développement de la résistance ä un médicament. On sait qu'une pression de sélection externe peut aboutir ä l'expression accrue d'un certain gène.
Dans le traitement du cancer, des cellules développent une resistance à un médicament donné par amplification du gène, dont le produit d'expression lnactive le médicament. Un tel cas est celui du méthotrexate qui induit une amplification du gène pour la dihydrofolate réductase (DHFR). Un autre exemple est celui de l'amplification du gène pour la métalloth1onine sous l'influence du cadmium.
Le taux d'expression d'un gène est important du point
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de vue du phénotype et du fonctionnement de la cellule. On peut l'étudier en mesurant la quantité d'ARN messager qui est en relation avec la quantité de protéine codée par celui-ci. Le produit de transcription d'un oncogène détermine la manière avec laquelle il sera finalement exprimé.
Les taux d'expression d'un oncogène varient en fonction du type de cellule, du taux de différenciation et de la phase de développement de la cellule. Par exemple, ä un certain stade du développement foetal, l'oncogène c-myo est rapidement
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e répliqué tandis qu'à un autre stade, cela est très lent. Le degré d'amplification est souvent en correlation avec le taux d'expression du gène, bien que ce dernier puisse augmenter notablement sans que le premier n'augmente. Dans ces cas, le rôle d'un oncogène est mieux déterminé par la mesure de son taux d'expression plutôt que du nombre de replication. Dans certains cas, une determination quantitative de l'ARN messager peut être plus simple et plus commode que la quantification du gène lui-
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même.
On peut mentionner ä titre d'exemple, l'oncogène c-myc, une protéine labile facilement coagulée par la chaleur.
La méthode de l'invention peut aussi être utilisée pour identifier des anomalies chromosomiques numériques comme le syndrome de Down. Dans des diagnostics prénataux, il est aussi possible de déterminer si le foetus est anormal, c'est-à-dire homozygote pour un certain gène récessif.
La méthode de l'invention et les réactifs d'acide nucléique utilises dans la méthode, sont davantage décrits ciaprès.
Exemple 1 : Quantification d'un oncogène amplifie. a) Réactifs d'acide nucléique et leur preparation.
Sondes standards : - Acide nucléique standard de cellule : le gène c-Ki-rasI est présent dans toutes les cellules humaines. Les paires de sondes pour l'hybridation-sandwich ont été préparées par sous-clonage du fragment HindIII du gène c-Ki-rasI, qui a une longueur de
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3, 8 kb et dont la carte de restriction a été décrite par Chang et coll., PNAS 79, pp. 4848-4852, 1982. Le fragment est disponible, par exemple cloné dans le plasmide pBR 322 (ATCC 41032) et peut être obtenu par exemple ä partir de la collection de culture ATCC.
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Traitement supplémentaire de l'acide nucléique standard de cellule. Le clone pBR 322 décrit plus haut a été traité avec les enzymes de restriction BglII et HindIII et les fragments resultants ont été isolés à partir du gel d'agarose ; des fragments purifiés situés dans un proche voisinage, ont été sous-clones dans deux vecteurs convenables pour la preparation des sondes de detection et de capture.
- Sonde de détection standard. Un fragment BglII-BglII mesurant environ 1, 1 kb de long a été sous-clone dans le site de l'enzyme de restrietion BamHI du plasmide pBR 322 et marqué par nick-
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1 C translation avec du dCTP marqué avec de l'I. - Sonde de capture standard. Le fragment BglII-HindIII d'environ
0, 5 kb, a été inséré dans les vecteurs constitués par les phages
M13 mp10 et mp11 entre les sites de restriction des enzymes de restriction BamHI et HindIII et fixé à un filtre de nitrocellulose (150 ng d'ADN/dia 1 cm).
Sondes d'essai : - Acide nucléique d'essai. Une paire de sondes pour l'hybridation-sandwich a été préparée ä partir d'un gène c-myc clone qui peut être obtenu par exemple à partir de la collection de cultures ATCC (ATCC 41010). La carte de restriction du gène a été décrite par Watt et coll., PNAS 80, pp. 6307-6311,1983).
Traitement supplémentaire de l'acide nuclé1que d'essai. Le gène c-myc a été traité avec les enzymes de restriction HindIII,
XbaI et PstI et les fragments Isoles ä partir du gel d'agarose, purifies et sous-clones dans des vecteurs convenables, pour préparer les sondes de détection et de capture.
- Sonde de détection d'essai. Les queues à brin unique du fragment de restriction HindIII-XbaI du gène c-myc, mesurant
3, 7 kb de long, ont été rendues à double brin par l'ADN
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polymerase. Les linkers HindIII ont été insérés par la T4-ADNligase dans les fragments d'ADN à extrémités collantes
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e'e e résultants ; après extraction par du phénol, l'ADN a été traité r avec l'enzyme de restriction HindIII. Le fragment d'ADN a été ensuite clone dans le plasmide pBR 322 au site de restriction de l'enzyme de restriction HindIII et marqué par nick-translation avec du dCTP marqué avec de l' 125I.
- Sonde de capture d'essai. Le fragment XbaI-PstI de 1, 1 kb du gène c-myo a été cloné dans les vecteurs de clonage constitués par les phages M13 mp10 et mp11 entre les sites de restrietion des enzymes de restriction XbaI et PstI et fixé à un filtre de nitrocellulose (150 ng d'ADN/dia 1 cm). b) Determination de la courbe d'étalonnage.
L'échantillon utilisé pour la determination de la courbe d'étalonnage consistait en un clone pBR 322 dénaturé par un alcalin, du gène c-myc. La solution d'hybridation-sandwich à laquelle ont été ajoutées les sondes d'essai ci-dessus, consistait en 4 x SSC, 1 x solution de Denhardt, 200 g/ml d'ADN de sperme de hareng et 0, 2 % de SDS. L'hybridation a eu lieu ä
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650C pendant 17-19 heures, puis les filtres ont été 1avés dans la solution de lavage (0, 1 x SSC, 0, 2 % de SDS) ä 50 C. Le marqueur attaché aux hybrides-sandwich a été ensuite compte dans un compteur gamma.
Tableau I
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<tb>
<tb> Echantillon <SEP> opm
<tb> molécules/essai <SEP> filtre <SEP> c-myc
<tb> 0 <SEP> 40
<tb> 106 <SEP> 75
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 190
<tb> 107 <SEP> 340
<tb> 108 <SEP> 2200
<tb>
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c) Determination du nombre de gènes.
Les échantillons comprenaient 1) des cellules provenant d'un placenta humain et 2) des cellules colo 320, qui peuvent être obtenues par exemple a partir de la collection de cultures ATCC (ATCC-CCC220). L'ADN a été isolé à partir des deux échantillons et la même quantite d'ADN de cellule, dénaturé par un alcalin à l'ébullition, a été ajoutée aux essais. La dénaturation alcaline a hydrolysé tout l'ARN présent dans 1'échantillon.
On a effectué l'essai en ajoutant à chaque échantillon ä la fois les filtres c-myc et c-Ki-rasI et les deux réactifs marqués, ce qui a permis de mesurer a. la fois l'ADN d'essai et standard pour chaque échantillon. En fonction des déterminations c-Ki-rasI, on a trouvé que chaque essai contenait la même quantité d'ADN et on a pu en déduire que le gène c-myc dans les cellules colo 320 est présent selon un taux de replication 16 à 20 fois supérieur à celui qui est observé dans la situation normale. Les résultats sont indiqués dans le Tableau II.
Tableau II
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<tb>
<tb> Echantillon <SEP> Filtre <SEP> Filtre
<tb> c-Ki-rasI <SEP> c-myc
<tb> cpm <SEP> cpm <SEP> nombre
<tb> Cellules <SEP> placentaires
<tb> humaines <SEP> 486 <SEP> 340 <SEP> 107
<tb> Cellules <SEP> colo <SEP> 320 <SEP> 432 <SEP> 3205 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> x <SEP> 108
<tb>
* la lecture obtenue pour le filtre ä blanc a été soustraite des lectures.
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Exemple 2 : Quantification de gène amplifié.
Réactifs d'acide nucléique et leur préparation.
Sondes standards : - Acide nucléique standard de cellule. L'acide nucléique témoin a été pris dans 1a région du promoteur du gène métallothionine
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chez la souris, c'est-a-dire le gène MT avec l'ADN immédiatement en amont de celui-ci. La structure du gène MT a été décrite par Pavlakis and Hamer, PNAS 80, pp. 397-401, 1983.
Le fragment d'acide nucléique de référence est disponible, par exemple, clone dans le vecteur pBPV-MMTneo (432-12) (ATCC
37224) et peut être obtenu par exemple à partir de la collection de cultures ATCC.
- Traitement supplementaire de l'acide nucléique standard de cellule. Le gène MT décrit plus haut a été traité avec les enzymes de restriction Kpnl, BglII et EcoRI pour le sous- clonage dans le plasmide pAT153. La queue Kpnl a été convertie en queue HindIII avec un linker.
- Sonde de détection standard. Le fragment EcoRI-KpnI- (HindIII) mesurant environ 1, 2 kb et situé en amont de la région promotrice du gène méta1lothionine, a été clone dans le plasmide pAT153 entre les sites de restriction des enzymes de restriction EcoRI et HindIII, et marqué par nick-translation
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- 20 avec des nucleosides triphosphate marqués avec du 32p. - Sonde de capture standard. Le fragment KpnI-BglII de 0, 8 kb comprenant la région du promoteur du gène métallothionine et la région en amont de celle-ci, a été clone dans les vecteurs constitués par les phages M13 mp18 et M13 mp19 entre les sites de restriction des enzymes de restriction KpnI et BamHI et fixé ä un filtre de nitrocellulose.
Sondes d'essai : Acide nucléique d'essai. La paire de sondes pour le test d'hybridation-sandwich a été préparée avec le plasmide pMTVdhfr disponible industriellement (Bethesda Research Laboratories, produit n 5369SS) dont la structure est décrite par Lee et coll., Nature 294, pp. 228-232,1981.
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- Traitement supplémentaire de l'acide nucléique d'essai. Le plasmide pMTVdhfr contenant 1'ADNc du gène pour la dihydrofolate réductase (DHFR) a été traité avec les enzymes de restriction HindIII et BglII.
- Sonde de détection d'essai. Le fragment HindIII-BglII mesurant
0,75 kb et correspondant ä la région codant pour le gène DHFR du plasmide pMTVdhfr a été inséré dans le vecteur constitué par le plasmide pAT153 entre les sites de restriction des enzymes de restriction HindIII et BamHI et marqué par nick-translation avec des nuc1éoside-tr1phosphates marqués avec du 32p.
- Sonde de capture d'essai. Un fragment HindIII mesurant 1, 4 kb provenant de la région du gène MMTV du plasmide pMTVdhfr, a été clone dans les vecteurs constitués par les phages M13 mp18 et
M13 mp19. b) Détermination de la courbe d'étalonnage.
L'échantillon utilisé pour l'essai était de l'ADN purifié provenant du plasmide pMTVdhfr. L'essai 1ui-même a été effectué selon 1a procédure de l'Exemple 1b, sauf qu'un compteur à scintillation liquide a été utilisé pour le comptage. La courbe standard résultante est indiquée dans le Tableau III.
Tableau III
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<tb>
<tb> Echantillon <SEP> cpm
<tb> molécules/essai <SEP> filtre <SEP> DHFR
<tb> 0 <SEP> 17
<tb> 106 <SEP> 45
<tb> 3 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 19
<tb> 107 <SEP> 210
<tb>
c) Determination du nombre de gènes.
Des lignées cellulaires provenant de cellule de fibroblaste de souris NIH 3T3 (collection de culture ATCC, CRL, 1658), qui ont été transfectées avec différentes quantités d'ADNc correspondant à l'ARNm du gène DHFR, ont té cultivées sur des
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plaques de culture cellulaire et utilisées comme échantillon. Les cellules ont été lysées avec du dodécylsulfate de sodium et leur ADN a été cisaille par compression à travers une fine aiguille hypodermique depuis une seringue. Un échantillon de 250 l correspondant à environ 106 cellules a été prélevé de l'homogénat
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et 50 pl de NAOH ont été ajoutes. L'échantillon a été chauffé à ébullition et neutralisé avec de l'acide acétique et le mélange d'hybridation. Le volume total était de 0, 5 ml.
Toutes les sondes décrites plus haut ont été ajoutées simultanément et un filtre dit ä blanc a été ajouté en tant que témoin de fond.
L'hybridation, le lavage et le comptage du marqueur ont été réalisés selon la procédure de l'Exemple 1b, sauf qu'un compteur à scintillation liquide a été utilisé pour le comptage. Les résultats sont donnés dans le Tableau IV.
Tableau IV
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<tb>
<tb> Cellule <SEP> MT <SEP> Nbre <SEP> de <SEP> cel- <SEP> DHFR
<tb> cpm* <SEP> lules <SEP> dans <SEP> Nbre <SEP> de <SEP> Nbre
<tb> l'échantillon <SEP> molécules <SEP> de
<tb> dans <SEP> copies
<tb> l'échantillon
<tb> Cellule <SEP> témoin <SEP> (pas <SEP> de
<tb> DHFR-ADNc) <SEP> 182 <SEP> 1, <SEP> 05 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> 21 <SEP> < 106
<tb> Lignée <SEP> I <SEP> 138 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 80 <SEP> 3 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 3
<tb> Lignée <SEP> II <SEP> 210 <SEP> 1,25 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 732 <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 107 <SEP> 40
<tb>
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* cpm : la lecture obtenue avec le filtre à blanc a été soutraite.
Le gène MT est un marqueur interne qui mesure le nombre de cellules présentes dans un échantillon. Les résultats montrent que dans ce test, 106 cellules ont donné un signal spécifique de MT de 165 + 20 cpm. Les réactifs DHFR mesurent la quantité de DHFR-ADNc. Le nombre de cellules a été déduit à partir du signal spécifique de MT. 11 a été done possible de déterminer le nombre de copies de DHFR-ADNc dans différentes 1ignées cellulaires, comme cela est montré dans le Tableau IV.
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Exemple 3 : Quantification d'ARN messager. a) Réactifs d'acide nucléique et leur préparation.
11 est aussi possible de mesurer la quantité d'ARNm dérivé de l'ADNc de DHFR avec les sondes d'esaai décrites dans l'Exemple 2. La structure du plasmide pMTVdhfr est telle que la transcription du gène DHFR commence au promoteur MMTV. Les messagers résultants ont une longueur d'environ 1, 0 kb, dont environ 0, 25 kb sont dérivés de la région promotrice MMTV et le reste de l'ADNc de DHFR (Lee et coll., Nature 284, pp. 228-232, 1981).
Sondes standards :
L'acide nucléique standard de cellule, la sonde de détection standard et la sonde de capture étaient tels que décrits dans l'Exemple 2.
Sondes d'essai :
L'acide nucléique d'essai, la sonde de détection d'essai et la sonde de capture d'essai étaient tels que décrits dans l'Exemple 2. b) Détermination de la courbe d'étalonnage.
L'échantillon utilisé pour la détermination de la courbe d'étalonnage consistait en ARN messager correspondant au gène pour la dihydrofolate réductase produite par une transcription in vitro. L'ADN requis pour la transcription a été préparé par sous-clonage du fragment HindIII de 1, 4 kb du promoteur MMTV du plasmide pMTVdhfr et du fragment HindIII-BglII de 0, 75 kb (ADNc et DHFR) voisins dans le plasmide pSP64 (Promega Biotee) entre les sites de restriction des enzymes de restriction HindIII et BamHI. L'ARN servant d'échantillon a été stocké dans une solution aqueuse ä 0, 2 % de SDS.
Le test d'hybridation-sandwich a été conduit de la façon qui est décrite dans les Exemples 1 b et 2b, mais la dénaturation a été omise.
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f Tableau V
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<tb>
<tb> Echantillon <SEP> cpm
<tb> molécules/essai <SEP> filtre <SEP> DHFR
<tb> 0 <SEP> 20
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 65
<tb> 107 <SEP> 130
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 107 <SEP> 390
<tb> 108 <SEP> 653
<tb>
c) Détermination du nombre de molécules d'ARN messager.
Le nombre de molécules d'ARN messager correspondant au gène DHFR, a été déterminé ä partir des lignées cellulaires décrites dans l'Exemple 2.
EMI15.3
Les cellules ont été lysées avec du dodécylsulfate de sodium et leur ADN a été cisaillé légèrement par compression à travers une fine aiguille hypodermique à partir d'une seringue.
Un échantillon de 250 p1 du produit d'homogénéisation a été prélevé, correspondant à environ 5.106 cellules. L'homogénat a été ensuite ajouté au test d'hybridation-sandwich sans dénaturation. L'hybrydation-sandwich a eu lieu selon la procédure des Exemples 2c et 1b, sauf que les seules sondes DHFR ont été ajoutées à la solution d'hybridation. On a determine le nombre de cellules dans un échantillon parallèle de 250 ul d'homogénate avec la sonde MT telle que décrite dans l'Exemple 2c. Les résultats sont fournis dans le Tableau VI.
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Tableau VI
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<tb>
<tb> Cellule <SEP> MT <SEP> Nbre <SEP> de <SEP> cel- <SEP> DHFR
<tb> lules <SEP> dans <SEP> opm* <SEP> Nbre <SEP> de <SEP> Nbre
<tb> come <SEP> l'échantillon <SEP> molécules <SEP> par
<tb> dans <SEP> cell'échan- <SEP> lule
<tb> tillon
<tb> Lignée <SEP> 1 <SEP> 380 <SEP> 3, <SEP> 5x106 <SEP> 1465 <SEP> 3,45x108 <SEP> 100
<tb> Lignée <SEP> II <SEP> 430 <SEP> 4, <SEP> 2X106 <SEP> 4800 <SEP> 2x109 <SEP> 500
<tb>
* cpm : la lecture obtenue avec le filtre ä blanc a été soustraite.
Les résultats ont montré que la lignée cellulaire I a produit par cellule environ 100 molécules d'ARNm à partir des gènes DHFR et que la 1ignée cellulaire II a produit environ 500 molécules d'ARNm à partir des gènes DHFR.
Exemple, 4 : Quantification des gènes amplifiés par hybridation de la solution. a) Réactifs d'acide nucléique et leur préparation.
Sondes standards :
L'acide nucléique standard de cellule, la sonde de détection standard et la sonde de capture standard ont été les memes que dans l'Exemple 2. Le fragment de 1, 2 kb EcoRI-KpnI- (HindIII) dans le plasmide pAT153 a été marqué par nicktranslation avec de la déoxycytidine marquée à l'1251. Les fragments de 0, 8 kb KpnI-BglII dans les phages M13 mp18 et M13 mp19 ont été modifiés par la biotine en utilisant le réactif PhotoprobeTM (Laboratoires Vector, CA, USA, produit nO SP-1000).
Sondes d'essai :
L'acide nucléique d'essai, la sonde de détection d'essai et la sonde de capture d'essai sont les mêmes que dans l'Exemple 2. Le fragment de 0, 75 kb HindIII-BglII dans le plasmide pAT153 a été marqué avec de la déoxycytidine marquée à @I. Les fragments de 1, 4 kb HindIII dans les phages M13 mp18
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et M13 mp19 ont été biotynilés en utilisant le réactif
Photoprobe comme ci-dessus. b) Détermination des courbes d'étalonnage.
Une courbe d'étalonnage de cellule a été préparée en utilisant une quantité connue de cellules, à partir desquelles le signal d'hybridation a été mesuré en utilisant les sondes standards reconnaissant le gène MT. Une courbe d'étalonnage de l'acide nucléique d'essai a été préparée avec le plasmide pMTVdhfr et les sondes d'essai reconnaissant ce plasmide. Les hybridations ont été effectuées dans 200 ul d'une solution comprenant 0, 6 M de NaCl, 20 mM de tampon phosphate, ä pH 7,5, 1 mM d'EDTA et 4 % de polyéthylène-glycol (PEG 6000) pendant une heure et demi ä 70 C.
Après la réaction, 50 ul d'agarosestreptavidine (Betheseda Research Laboratories, Maryland, USA, produit nO 5942SA), et 1 M de NaCl, 10 mM de phosphate de sodium, à pH 7, 5, 1 mM d'EDTA ont été ajoutés jusqu'à un volume final de 500 p1. Les hybrides ont été recueillis sur l'agarosestreptavidine à 37 C pendant 15 minutes. L'agarose a été lavée une fois pendant 5 minutes avec la solution tamponnée avec 1 M de
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NaCl à 37 C et deux fois pendant 2 minutes avec 15 mM de NaCl, 1, 5 mM de citrate de sodium à 55OC. La quantité d'hybrides lies a été déterminée en mesurant l'agarose dans un compteur gamma (Syvänen et Coll., Nucleic Acids Res. 14,5037-5048, 1986). Les résultats sont indiqués dans les tableaux VII et VIII.
Tableau VII
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<tb>
<tb> Echantillon <SEP> cpm
<tb> cellules/essai <SEP> sondes <SEP> MT
<tb> 0, <SEP> 8 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 162
<tb> 1, <SEP> 6 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 216
<tb> 3 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 298
<tb>
<Desc/Clms Page number 18>
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t Tableau VIII
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<tb>
<tb> Echantillon <SEP> cpm
<tb> molécules/essai <SEP> sondes <SEP> DHFR
<tb> 106 <SEP> 148
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 394
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 107 <SEP> 2240
<tb>
c) Détermination du nombre de gènes.
Des échantillons de lignées cellulaires décrits dans l'Exemple 2 ont été traités de manière similaire, sauf que le
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volume par échantillon correspondant approximativement à 2 x 106 cellules était de 125 pl. Les déterminations du nombre de cellules et du nombre de molécules d'acide nucléique d'essai ont été effectuées dans des fioles différentes en ajoutant l'échantillon de cellule, les sondes de détection et de capture appropriées, et les composés du mélange d'hybridation jusqu'a un volume final de 200 pl. Les essais de contrôle sans l'étalonnage
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de cellule ou d'ADN d'essai ont été inclus. L'hybridation, la collection des hybrides, le lavage et la mesure ont été faits comme décrit dans l'Exemple 4b. Les résultats ont été lus à partir des courbes d'étalonnage en parallèle avec ce qui est décrit dans l'Exemple 4b.
Les resultats sont indiqués dans le Tableau IX.
Tableau IX
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<tb>
<tb> Ce <SEP> 11 <SEP> u <SEP> 1 <SEP> e <SEP> MT <SEP> DHFR
<tb> Nbre <SEP> de <SEP> celcpm* <SEP> lules <SEP> dans <SEP> cpm* <SEP> Nbre <SEP> de <SEP> Nbre
<tb> l'échantillon <SEP> molécules <SEP> de
<tb> dans <SEP> copies
<tb> l'échantillon
<tb> Cellule
<tb> témoin <SEP> 253 <SEP> 2, <SEP> 3x106 <SEP> 73 <SEP> 101
<tb> Lignée <SEP> I <SEP> 210 <SEP> 1, <SEP> 5x <SEP> 1 <SEP> 06 <SEP> 233 <SEP> 3, <SEP> 8x107 <SEP> 3
<tb> Lignée <SEP> II <SEP> 237 <SEP> 2, <SEP> 1x10 <SEP> 3059 <SEP> 8, <SEP> 8x10 <SEP> 42
<tb>
* cpm : les valeurs des essais témoins sans étalonnage de cellule ou d'acide nucléique d'essai ont été détuites.