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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsäuren in einer Probe unter Anwendung von Nukleinsäure-Amplifizierung, wobei der Probe vor dem Amplifizierungsschritt eine gegebene Menge eines bekannten Nukleinsäuremoleküls als interner Standard zugegeben wird, welches StandardNukleinsäuremolekül sich von der zu quantifizierenden Nukleinsäure zumindest in einem detektierbaren Merkmal unterscheidet
Bekannt ist eine quantitative PCR Methode, die auf einer kompetitiven PCR-Reaktion beruht (Gilliland, PNAS 87 (1990), 2725). Zur Bestimmung von DNA-Mengen wird eine Verdünnungsreihe des internen Standard verwendet, die gleichzeitig mit der Probe amplifiziert wird. Die PCR-Reaktion wird bis zur Sättigung durchgeführt.
Dies erlaubt auch die Detektion der PCR-Produkte mittels Ethidiumbromidfärbung. Die PCR-Produkte werden anschliessend auf einem Gel aufgetrennt und die Kopienzahl der Probe mit der Kopienzahl der Standard-Verdünnungsreihe verglichen und so die Konzentration der Probe abgeschätzt. Diese Konzentrationsabschätzung ist dann exakt, wenn die Konzentration des Standards und der Probe etwa im Verhältnis 1 : 1 in einem Reaktionsgefäss amplifiziert wurden. Dies wiederum impliziert, dass die Bestimmung der DNA-Menge umso genauer erfolgt, je mehr Standardverdünnungen verwendet werden.
Eine Methode zur Quantifizierung von RNA wurde von Wang et al. (PNAS 86 (1989), 9717) vorgeschlagen. Diese PCR-Reaktion wird in der exponentielle Phase gestoppt. Die Autoren schaffen sich durch Amplifikation unterschiedlicher Standardkonzentrationen eine Eichkurve. Da in der exponentiellen Reaktionsphase die Kopienzahl bzw. die Konzentration der RNA direkt proportional zur Anzahl der PCR-Zyklen steigt, ist diese Eichkurve eine Gerade, in der man schliesslich die Konzentration einer amplifizierten Probe ablesen kann.
Ein Nachteil dieser Methode ist, dass die Endkonzentration der PCR-Produkte relativ gering ist, sodass man für die Detektion empfindliche Nachweismethoden anwenden muss Wang et al. benutzen radioaktiv markierte Nukleotide.
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rung der PCR-Produkte mit einem automatischen Laser-Fluoreszenz-DNA-Sequencer
Alle diese Methoden ermöglichen zwar die Quantifizierung bestimmter Gene, viraler DNA-Abschnitte oder mRNA, aber aufgrund unterschiedlicher Amplifizierung von Standard und Probe kommt es Immer wieder zu falschen Ergebnissen ; es ist auch bekannt, dass die Effizienz der PCR-Reaktion oftmals von Reaktionsgefäss zu Reaktionsgefäss unterschiedlich sein kann. Dieser Effizienzunterschied kann Unterschiede In den Ergebnissen von bis zu 105 ergeben.
Die Reproduzierbarkeit der mit den bekannten Methoden erhaltenen Quantifizierungsdaten ist daher immer noch nicht ausreichend.
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zur Verfügung zu stellen, welches eine sehr genaue und vor allem eine gut reproduzierbare Information bezüglich der Menge an Nukleinsäure in einer Probe ermöglicht und gleichzeitig Aussagen über die Nachweisgrenze der zu bestimmenden Nukleinsäure erlaubt.
Das erfindungsgemässe Verfahren der eingangs erwähnten Art ist dadurch gekennzeichnet, dass der Probe vor der Nukleinsäure-Amplifizierung bekannte Mengen von mindestens zwei sich zumindest in einem detektierbaren Merkmal voneinander und von der zu quantifizierenden Nukleinsäure unterscheidenden bekannten Nukleinsäuremolekülen als interner Standard zugegeben werden, die erhaltenen Mengen an amplifizierter Proben- und Standard-Nukleinsäure bestimmt werden und aus den erhaltenen Mengen die ursprünglich In der Probe vorhandene Menge an zu quantifizierender Nukleinsäure bestimmt wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht überraschenderweise eine sehr exakte und darüberhinaus gut reproduzierbare Quantifizierung von Nukleinsäuren aller Art.
Unter Nuklelnsäure-Amplifizlerung sind pnnzipiell Verfahren zu verstehen, welche auf der von Muslis et al. (U. S PS 4, 683, 195 und 4, 683, 202) entwickelten Technologie beruhen, beispielsweise die PolymeraseKettenreaktion (PCR), die reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) oder die Llgase-PCR (LCR).
Die Standard-Nukleinsäure muss sich in wenigstens einem detektierbaren Merkmal von der zu quantifizierenden Nukleinsäure unterscheiden, sie sollte aber mit Hilfe der gleichen Primer amplifiziert werden können. Als praktisch haben sich Standard-Nukleinsäuren erwiesen, die eine andere Grösse als die zu
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re ist bel Bestimmung von DNA-Mengen vorzugsweise eine DNA und bel Bestimmung von RNA-Mengen vorzugsweise eine RNA.
Bevorzugte Standards unterscheiden sich von der zu quantifizierenden Nukleinsäure in 1 % bis 20 % Ihrer Länge bzw durch mindestens 3, maximal 50 Nukleotide, wobei eine Standardnu- kleinsäure, die länger ist als die zu bestimmende Nukleinsäure, als "plus" (" + ") -Standard bezeichnet wird, und eine Standardnukleinsäure, die kleiner ist als die zu bestimmende Nukleinsäure, alss"mlnus" ("-")- Standard bezeichnet wird. Die genaue Sequenz der Standard-Nukleinsäure sollte natürlich bekannt sein.
Die Standards werden im erfindungsgemässen Verfahren bevorzugt In unterschiedlicher Konzentration eingesetzt, wobei einer der Standards In einer Konzentration knapp oberhalb der Nachweisgrenze zugege-
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ben wird.
Die beim Amplifizieren verwendeten Primer enthalten vorzugsweise Gruppen, welche die Nachweisgrenze der amplifizierten Nukleinsäuren erhöhen, beispielsweise fluoreszierende oder radioaktive Gruppen oder chemische Gruppen, die mit affinen Proteinen und nachgestalteten Detektionsreaktionen detektiert werden können (z. B. Biotin-Avidin, DIG-Markierung, etc.), wobei Primer mit fluoreszierenden Gruppen besonders bevorzugt sind.
Die Bestimmung der Nukleinsäure-Mengen (unter Nukleinsäure-Menge versteht man prinzipiell die Quantität an DNA oder RNA ; eine Nukleinsäure-Menge kann z. B. in Form von Masse (mg, u. g. ng. pg....) oder als Anzahl der Kopien eines bestimmten Nukleinsäure-Moleküls angegeben werden) nach der Amplifizierung kann auf unterschiedlichste Art erfolgen, meist jedoch ist ein Schritt vorzusehen, bei
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getrennt wird und die getrennten Nukleinsäure-Mengen separat bestimmt werden. Vorzugsweise besteht dieser Trennungsschritt In einer Gelelektrophorese oder in einem chromatographisches Verfahren.
Als besonders geeignet haben sich Detektionsverfahren erwiesen, welche automatisch erfolgen und den Trennungs- und Quantifizierungsschritt kombinieren. Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht daher darin, dass die Bestimmung der Mengen an amplifizierter Nukleinsäure unter Verwendung eines Nukleinsäure-Detektionsgerätes, vorzugsweise eines fluoreszenz-empfindlichen Nukleinsäure-Detektionsgerätes, erfolgt. Beispiele für solche Nukleinsäure-Detektionsgeräte sind automatische DNA-Sequenzer mit laserinduzierten Fluoreszenz-Messeinrichtungen (z. B. Gene Scanner@373A der Firma Applied Biosystems) oder HPLC-Anlagen.
Bei diesen Geräten ist es möglich, Nukleinsäure-Moleküle voneinander zu trennen, die sich lediglich um ein bp in der Länge unterscheiden.
Ein besonderer Vorteil des Gene Scanner9 ist es, unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe in einer einzigen Spur unterscheiden zu können. Dies ermöglicht die gleichzeitige Aufarbeltung einer Vielzahl von Proben auf einem Gel, da alle am Gel zur Verfügung stehenden Spuren für Proben verwendet werden können. Weiters ist es möglich, eine Vielzahl von PCR-Produkten, markiert mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Farbstoffen, in einer einzigen Bahn zu analysieren (Multiplex-PCR). Beim gleichzeitigen Nachweis von beispielsweise zwei verschiedenen Nukleinsäuren in einer Probe werden ausserdem Aufwand und Kosten nahezu halbiert. Dies ist beim Einsatz des erfindungsgemässen Verfahrens im Routinebetrieb von besonderem Vorteil, wenn beispielsweise eine Blutprobe auf HIV und HBV getestet werden soll.
Im Gegensatz dazu kann der von Porcher et al. zur Analyse der PCR-Produkte verwendete automatische Laser-Fluoreszenz- DNA-Sequenzer nur einen Fluoreszenzfarbstoff (und damit nur eine DNA) pro Spur analysieren.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens betnfft daher ein Verfahren, bel dem mehrere erhaltene Mengen an amplifizierter Proben- und Standard-Nukleinsäuren in der gleichen Probe mittels der Multiplex-Analyse bestimmt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird der Amplifizierungsschntt bereits in der exponentielle Phase gestoppt.
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einzigen Standards die Kopienanzahl der zu bestimmenden Nukleinsäure festgestellt werden. In diesem Punkt ist die erfindungsgemässe Methode der oft verwendeten Methode von G ! ! ! iiand et al welt überlegen, da pro Probe lediglich eine Messung mit wenigstens zwei verschiedenen Standard-Molekülen durchgeführt werden muss, wogegen die Methode nach Gilliland um so genauer wird, je mehr Standards in verschiedenen Verdünnungen In verschiedenen Proben verwendet werden.
Ein besonders bevorzugtes Anwendungsgebiet des erfindungsgemässen Verfahrens besteht in der Quantifizierung viraler Nukleinsäuren, vorzugsweise Nukleinsäuren aus HIV, Parvovirus, Herpesvirus, HAV, HBV, HCV, Baculovirus, Adenovirus oder Vacciniavirus. Diese Viren sind sowohl als Pathogene als auch wegen ihrer Verwendung in der Herstellung von Impfstoffen und rekombinanten Proteinen interessant.
Es werden vorzugsweise virale Nukleinsäuren in einer biologischen Probe, insbesondere In humanen Plasmen und deren Denvaten, gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren quantifiziert. Beispielsweise kann mit der vorliegenden Methodik der Verlauf einer Infektion oder die Überwachung von Impfungs- bzw Therapiebehandlungen besser und genauer überwacht werden.
Dabei ist es von besonderer Bedeutung, dass mit dem erfindungsgemässen Verfahren pathogene Viren in einer Konzentration bestimmt werden können, die mindestens eine Zehnerpotenz unterhalb der infektiöse Dosis diese Viren liegt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betnfft daher ein Verfahren zur Bestimmung der Nachweisgrenze von bestimmten Nukleinsäuren, bei welchem mindestens eine Standard-Nukleinsäure mit einer Konzentration von knapp oberhalb der Nachweisgrenze eingesetzt wird.
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Vorzugsweise wird die Menge an Nukleinsäure in pg/ml nach der folgenden Formel berechnet : mprobe AProbe/Astandard*NStandard*F*D worin Aprobe die Peak-Fläche der amplifizierten Nukleinsäuren der Probe, Astandard der Mittelwert, der aus der Peak-Fläche der amplifizierten internen Standards resultiert, NStandard der errechnete Mittelwert der eingesetzten Kopien des internen Standards, F das Verhältnis des Volumens des Standards zum extrahierten Volumen und D der Verdünnungsfaktor (falls die Probe vor der Extraktion verdünnt worden ist).
Da nach dem erfindungsgemässen Verfahren mindestens zwei Standards in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt werden, erhält man nach der oben beschriebenen Berechnung mindestens zwei Werte für die Konzentration der Probe, aus denen man schliesslich den Mittelwert berechnet. Im Routinebetrieb werden von jeder Probe In der Regel zwei Ansätze mit jeweils zwei Primern und mindestens zwei Standards analysiert, wodurch schliesslich ein Mittelwert aus vier Werten für die Konzentration der Probe gebildet werden kann.
Die Reproduzierbarkeit der erfindungsgemässen Methode beträgt 95%. Um dies zu erreichen, muss darauf geachtet werden, dass die Effizienz der PCR-Reaktion für den Standard und die Probe gleich gross ist.
Die Effizienz der PCR-Reaktion ist vor allem dann von Bedeutung, wenn die PCR-Reaktion wie bei der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in der exponentiellen Phase gestoppt wird. Im Sättigungsbereich fällt eine unterschiedliche Effizienz für Standard und Probe nicht so sehr Ins Gewicht.
Beeinflusst wird die Effizienz der PCR-Reaktion zum Beispiel von der Art des zu amplifizierenden Nukleinsäure-Moleküls. Wird die erfindungsgemässe Methode zur Bestimmung von RNA-Viren herangezogen, so kämpft man mit dem allgemein bekannten Problem, dass die reverse Transkription nur unvollständig ist und lediglich wenige Prozent der vorhandenen RNA auch wirklich transkribiert werden. Weiters hat sich gezeigt, dass die Effizienz für den + bzw. - Standard nicht unbedingt gleich ist. Dadurch kommt es zu Schwankungen in den zu bestimmenden Konzentrationen.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden daher zur Vergrösserung der erhaltenen Information unterschiedliche Mengen der mindestens zwei Standard-Nukleinsäuren der Probe vor der Amplifizlerung zugegeben werden.
Ein bevorzugtes Verhältnis der Standards ist ein Verhältnis von 1 : 3. Bei der oben erwähnten RNAAnalyse schwanken zwar die erhaltenen Verhältnisse zwischen 1 : 1 und 1 : 6, aus den Ergebnissen vieler Versuche und vor allem unter Verwendung des vorliegenden Verfahrens kann aber gezeigt werden, dass im Mittel ein Verhältnis der internen Standards von rund 1 : 3 evaluiert werden kann.
Um weitere Ungenauigkeit in der Konzentrationsbestimmung der Probe auszuschliessen, werden daher im Routineverfahren zwei Aliquote jeder Probe bestimmt, bei denen jeweils mindestens zwei Standards mitamplifiziert werden. So erhält man vier Messwerte pro Probe, aus denen man sich dann einen Mittelwert errechnen kann. In den Beispielen ist die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Methode gut demonstnert. Es wird auch gezeigt, dass die Methode über einen grossen Konzentrationsbereich reproduzierbare Ergebnisse liefert.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens kommen zwei Stan- dard-Nukleinsäuren zum Einsatz, welche eine gegenüber der zu quantifizierenden Nukleinsäure unterschiedliche Länge aufweisen, vorzugsweise eine Standard-Nukieinsäuresequenz, weiche kürzer, und eine Standard-Nukleinsäuresequenz, welche länger ist als die zu quantifizierende Nukleinsäure Ein besonders bevorzugter Längenunterschied liegt zwischen 1 % und 20 %.
Es hat sich für die erfindungsgemässe Methode von Vorteil erwiesen, die Nukleinsäure der Internen Standards in linearisierter Form der PCR-Reaktion zuzusetzen. Dadurch werden weitere Unterschiede in der Effizienz der Reaktion ausgeglichen, die auf die unterschiedliche Form der zu amplifizierenden Nukleinsäu- re zurückzuführen sind
Wichtige Kriterien bei der Quantifizierung von Nukleinsäuren sind-wie erwähnt-die Sensitivität und die Reproduzierbarkeit Mit dem erfindungsgemässen Verfahren können Nukleinsäure-Mengen Im Bereich von 1 bis 100 pg wesentlich präziser und reproduzierbarer als mit den im Stand der Technik beschriebenen Methoden bestimmt werden.
Damit ist aber keineswegs die Sensitivitätsgrenze der Methode erreicht
Das Verwendungsspektrum des erfindungsgemässen Verfahrens umfasst beispielsweise die qualitative und quantitative Analyse von biologischen Proben auf Nukleinsäuren, insbesondere Blut und Blutderivate und biotechnologische Produkte.
Eine weitere beispielhafte Einsatzmöglichkeit liegt in der Diagnose und/oder der Überwachung des Verlaufes von Infektionen sowie in der Überwachung von Impf- und Therapiebehandlungen
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Ein wichtiger Aspekt der Erfindung betrifft daher biologische, insbesondere biotechnologische Produkte, die zumindest einen unterhalb der erlaubten Grenzen von 10 bzw. 100 pg pro Dosis und mit dem vorliegenden Verfahren gemessenen Gehalt an Nukleinsäuren aufweisen und damit als im wesentlichen frei von Nukleinsäuren gelten können.
Zu den bevorzugten Produkten gehören virale Proteine, wie gp160, rekombinante Blutfaktoren, Plasmaproteine, sowie Impfstoffe, insbesondere gegen Herpes-, Influenza- oder TBE-Viren, und monoklonale Antikörper.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung des erfindunggemässen Verfahrens zur Detektion von Nukleinsäuren in biologischen Proben.
Im weiteren kämpft die Qualitätskontrolle insbesondere bei Impfstoffen oder biotechnologisch erzeugten Proteinen mit Background-Problemen. So kann man beim Bestimmen von kontaminierender Nukleinsäure (chromosomal DNA, RNA, virale DNA und RNA) bei Primaten-Zell kulturen auch die Verunreinigungen durch die Handhabung während der Produktion oder während der Aufarbeitung der Produkte durch das erfindungsgemässe Verfahren erfassen, wenn die eingesetzten Primer spezifisch sind.
Erfolgt die Produktion von rekombinanten Proteinen allerdings in Nicht-Primaten-Zellkulturen, wie zum Beispiel CHO (Chinese Hamster Ovarien), BHK (Baby Hamster Nierenzellen) oder CEC (Hühner-Embryozellen), so ist die Nachweisgrenze mit der erfindungsgemässen Methode weit niedriger, da das Problem der Verunreinigungen durch die Handhabung der Probe wegfällt. Besonders bevorzugt wird die erfindungsgemässe Quantifizierungsmethodik bei Nukleinsäuren aus CHO-, Vero- (Affenzellinie), BHK-, SK-Hep1- (menschliche Leberzelli- nie), Hybridom- oder CEC-Zellen angewendet, da diese Zellkulturen am gebräuchlichsten sind bel der Produktion von Impfstoffen oder biotechnologisch hergestellten Proteinen.
Die Auswahl der Primerpaare ist selbstverständlich ebenfalls ein wichtiger Faktor, um eine gute Quantifizierung zu erhalten. Daher betrifft die vorliegende Erfindung gemäss einem weiteren Aspekt Primer, welche im vorliegenden Verfahren zur Anwendung kommen, nämlich
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<tb>
<tb> HAV+2058 <SEP> : <SEP> ACTGCCATTGGGAAGCTTATTGTG <SEP> HAV <SEP> 2058-2081 <SEP> Seq. <SEP> ID <SEP> 3, <SEP>
<tb> HAV-2172 <SEP> : <SEP> CATCCATAGCATGATAAAGAGGAGC <SEP> (Numerierung <SEP> HAV <SEP> 2196-2172 <SEP> Seq. <SEP> ID <SEP> 4,- <SEP>
<tb> nach <SEP> Cohen <SEP> et <SEP> al. <SEP> (J. <SEP> viroI. <SEP> 61 <SEP> (1987) <SEP> 50-59)
<tb> HCV32 <SEP> : <SEP> CTGTGAGGAACTACTGTCTT <SEP> HCV <SEP> 45-64 <SEP> Seq. <SEP> 1D <SEP> 5, <SEP>
<tb> HCVPT4 <SEP> :
<SEP> CGGTTCCGCAGACCACTATG <SEP> (Numerierung <SEP> nach <SEP> Han <SEP> HCV <SEP> 158-139 <SEP> Seq <SEP> ID <SEP> 6,
<tb> et <SEP> al. <SEP> (PNAS <SEP> 88 <SEP> (1991) <SEP> 1711-1715)
<tb> HBV <SEP> + <SEP> 1780B <SEP> : <SEP> CATTGATCCTTATAAAGAATTTGGAGC <SEP> HBV <SEP> 1780-1806 <SEP> Seq. <SEP> ID <SEP> 7 <SEP> und
<tb> HBV-1950B <SEP> :
<SEP> CCAGCAGAGAATTGCTTGCCTGAG <SEP> (Numerierung <SEP> HBV <SEP> 1973-1950 <SEP> Seq. <SEP> ID <SEP> 8
<tb> nach <SEP> Fujiyama <SEP> et <SEP> al. <SEP> (Nucleic <SEP> Acids <SEP> Res. <SEP> 11 <SEP> (1983) <SEP> 4601-4610)
<tb>
und Plasmide für die Herstellung der Standards, nämlich pgag1 (bestehend aus dem bekannten pBS/SK--Plasmid und einem Insert zwischen der Pst I und der Apa I Stelle der multiplen Klonierungsstelle, welches Insert die Basenpaare (bp) 1417 bis 2008 der HIV-1 Sequenz aus Ratner et al.
(Nature 313 (1985), 277-284) enthält), pgag-15 (abgeleitet aus pgag1 mit einer Deletion von 15 bp ab bp 1593 der HIV-1 Sequenz aus Ratner et al.), pgag+12 (abgeleitet aus pgag1, indem eine 12 Nukleotide lange Insertion an der bp1593-Stelle eingefügt wurde), pHAV-wt (bestehend aus dem bekannten pCRII-Plasmid) und einem Insert an der multiplen Klonierungsstelle des pCRII-Plasmids, welches Insert die bp 2020 bis 2226 der cDNA-Sequenz aus Cohen et al. enthält), pHAV-10bp (abgeleitet aus pHAV-wt mit einer Deletion von 10 bp ab bp 2100 der HAV-Sequenz aus Cohen et al.
eingefügt wurde), pHAV+9bp (abgeleitet aus pHAV-wt, Indem eine 9 Nukleotide lange Insertion an der bp2100-Stelle eingefügt wurde), pHCV-wt (bestehend aus dem bekannten pBS/SK-Plasmid und einem Insert an der EcoRV-Stelle diese Plasmids, welches Insert die bp 27 bis 313 der cDNA-Sequenz aus Han et al. enthält), pHCV-7bp (abgeleitet aus pHCV-wt mit einer Deletion von 7bp ab bp 126 der HCV-Sequenz aus Han et al. eingefügt wurde), pHCV+8bp (abgeleitet aus pHCV-wt, indem eine 8 Nukleotide lange Insertion an der bp126-Stelle eingefügt wurde), pHBV-wt (bestehend aus dem bekannten pBluescript 11 < SK-P ! asmid und einem Insert an der EcoRI-Stelle diese Plasmids, welches Insert die bp 1763 bis 2032 des HBV-Genoms gemäss Fujiyama et al.
enthält),
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pHBV-9bp (abgeleitet aus pHBV-wt mit einer Deletion von 9bp ab bp 1868 der HBV-Sequenz aus Fujlyama et al. eingefügt wurde) und pHBV+12bp (abgeleitet aus pHBV-wt, indem eine 12 Nukleotide lange Insertion an der bp1868-Stelle eingefügt wurde).
Die Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen und den dazugehörigen Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, noch weiter erläutert. Insbesondere wird in den Beispielen gezeigt, dass das erfindungsgemässe Verfahren sich hervorragend für eine routinemässige, schnelle und trotzdem genaue und reproduzierbare Quantifizierung von Nukleinsäuren in unterschiedlichsten Proben eignet.
Es zeigen : Fig. 1 die Klonierung von pgag-15 und pgag + 12 ; Fig. 2 die Ergebnisse der Quantifizierung von HAV mit RT-PCR ; Fig. 3 die Ergebnisse der Quantifizierung von HBV ; und Fig. 4 ist das Sequenzprotokoll.
Beispiele 1. Allgemeine Arbeitsvorschriften : 1. 1. Prinzip des Verfahrens
Nukleinsäuren unterschiedlicher Herkunft werden mittels PCR unter Verwendung von Primern, welche fluoreszierende Gruppen haben, amplifiziert (Saiki et al., Science 239 (1985) 487-491). Die Analyse und die Quantifizierung der erhaltenen amplifizierten PCR-Produkte wurde mit Hilfe eines automatischen DNASequenzierers mit laserinduzierter Fluoreszenz-Messeinrichtung (DNA-Sequenzierer 373A mit Gene Scan@- Software von Applied Biosystems) ausgeführt. Dieses Instrument ist in der Lage, die Fluoreszenz-markierten PCR-Produkte mittels einer Gelelektrophorese in einem Polyacrylamidgel unter denatunerenden Bedingungen der Grösse nach aufzutrennen und deren Menge quantitativ zu bestimmen.
Die Kopienzahl bestimmter Sequenzen in der Probe wird auf Grundlage der erhaltenen Intensitäten der PCR-Produkte von zu quantifizierender Nukleinsäure und mindestens zwei internen Standards bestimmt.
1. 2. 1. Extraktion viraler DNA
500 ul der Probe werden für 20 min bei 70000 rpm In einer Ultrazentrifuge zentrifugiert. Das Pellet wird
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20% SDS aufgelöst. Nach Inkubation über Nacht bei 37. C oder für 4 h bei 56. C wird eine bestimmte Menge an Standard-Nukleinsäure zugesetzt, die Probe nacheinander mit Phenol und Chloroform extrahiert und 10 ul Glykogen (Boehringer Mannheim, 20 mg/mi) zugesetzt. Anschliessend wird mit Ethanol präzipitiert, zentrifugiert, das Pellet gewaschen und schliesslich In Wasser wieder gelöst.
1. 2. 2. Extraktion proviraler DNA
5 x 105 Zellen werden in 100 ul Lysis-Puffer (1 X PCR-Puffer von Boehringer, 0, 5 mg/mi Proteinase K, 0, 45 % Tween) 5 h bei 56. C Iyslert. Aliquote davon werden für die PCR eingesetzt.
1. 2. 3. Extraktion von RNA
1 ml Plasma bzw. mit PBS verdünntes Plasma wird bei 100000 rpm 15 min zentrifugiert. Der Überstand wird durch Absaugen entfernt. Das Pellet wird in 1 ml Guanidiumisothiocyanat-Lösung (RNAzole der Firma Biotexc) aufgenommen und 5 ul 1 mg/mi t-RNA aus Hefe und 20 ul Standard-RNA zugegeben Es werden 400 und 1200 Kopien des Minus- und Plus-RNA-Standards zugegeben und gevortext. Die Lösung wird 10 min bei 70. C erhitzt, dann 1/10 Volumen Chloroform zugegben und für 10 min auf Eis inkubiert. Dann wird für 5 min In einer Tischzentrifuge zentrifugiert, der Überstand In neue Röhrchen transfenert. 500 ul Isopropanol wird zugegeben und 15 min auf -80. C gestellt.
Anschliessend wird 10 min zentnfuglert, 2 X mit 70 % Ethanol gewaschen und das Pellet in 25 ul Wasser aufgenommen. Für die RTPCR-Reaktion werden 5 ul eingesetzt.
1 3. PCR
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Wasser. Die PCR wird gemäss den Angaben des Herstellers von Puffer und Enzym bzw. gemäss üblicher Arbeitsvorschriften (Mullis et al., Methods in Enzymology 155 (1987), 335) in einem PCR-Apparatur (GeneAmp PCR System 9600 der Firma Perkin-Elmer) durchgeführt.
1. 4. Analyse der Produkte
Für die Bestimmung und Quantifizierung der PCR-Produkte werden der PCR-Lösung 0, 5 bis 1, 0 ul entnommen und in einem 373A Instrument der Firma Applied Biosystems gemäss den Angaben des Herstellers analysiert.
2. Beispiel 1 : Quantifizierung von HIV durch reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR)
Bei dieser Quantifizierung werden Primer verwendet, welche in den cDNA-Sequenzen des HIV-1 binden und durch RT-PCR von Wildtyp-RNA ein 115 bp grosses Produkt ergeben, nämlich
SK38 : ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT HIV-1 1551-1578 Seq. ID 1 SK39 : TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC HIV-1 1665-1638 Seq. ID 2 (Numerierung nach Ratner et al.). Die Primer wurden unter Verwendung der Phosphoamidit-Chemie auf einem DNA-Synthesizer hergestellt (Applied Biosystems 394 DNA Synthesizer).
Die Standard-Plasmide pgag-15 und pgag+12 sind abgeleitet aus dem Plasmid pgag1, welches aus dem bekannten pBS/SK--Plasmid (Firma Stratagene) und einem Insert in der multiplen Klonierungsstelle dieses Plasmids besteht, welches Insert die bp 1417 bis 2008 des HIV-1 aus Ratner et al. enthält.
In pgag-15 wurden die bp 1593 bis 1607 deletiert, in pgag+12 ein 12 bp langes Insert an der Stelle 1593 eingefügt (siehe Fig. 1). Die Plasmide wurde gereinigt (QUIAGEN-Verfahren), die Konzentration durch spektroskopische Messung bei 260 nm bestimmt, mit EcoRI geschnitten und in einem 10mM TRIS/HCI pH 8/0, 1 mM EDTA-Puffer verdünnt (Sambrook et al. Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor (1989)).
In vitro Transkription mit T3-Polymerase gemäss Sambrook et al. ergibt ein 644"+"Transkript und ein 617 b "-"Transkript, welche mit einer Guanidinisothiocyanatlösung extrahiert und durch spektrophotometrische Messungen bei 260 nm quantifiziert werden.
Diese RNA-Präparationen dienen als Standard für die RT-PCR.
Die Länge der RT-PCR-Produkte von Standard und Wildtyp-DNA betragen daher 127 (gag+12), 100 (pgag-15) und 115 bp (wt).
3. Beispiel 2 : Quantifizierung von HAV durch RT-PCR
Bei dieser Quantifizierung werden Primer verwendet, welche in den cDNA-Sequenzen des HAV binden und durch RT-PCR von Wildtyp-RNA ein 139 bp grosses Produkt ergeben, nämlich HAV+2058 : ACTGCCATTGGGAAGCTTATTGTG HAV 2058-2081 Seq. ID 3 und
HAV-2172 : CATCCATAGCATGATAAAGAGGAGC HAV 2196-2172 Seq. ID 4 (Numerierung nach Cohen et al. (J. Virol. 61 (1987) 50-59). Die Primer wurden unter Verwendung der Phosphoamidit-Chemie auf einem DNA-Synthesizer hergestellt (Applied Biosystems 394 DNA Synthesizer).
Die Standard-Plasmide pHAV-10 und pHAV+9 sind abgeleitet aus dem Plasmid pHAV-wt, welches aus dem bekannten pCRII-Plasmid (Firma In Vitrogen) und einem Insert in der multiplen Klonierungsstelle dieses Plasmids besteht, welches Insert die bp 2020 bis 2226 des HAV aus Cohen et al. enthält.
In pHAV-10 wurden die bp 2100 bis 2109 deletiert, in pHAV+9 ein 9 bp langes Insert an der Stelle 2100 eingefügt. Die Plasmide wurden gereinigt (QUIAGEN-Verfahren), die Konzentration durch spektroskopische Messung bei 260 nm bestimmt, mit AlwNI geschnitten und in einem 10mM TRIS/HCI pH 8/0, 1 mM EDTA-Puffer verdünnt (Sambrook et al. Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor (1989)).
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gemässDiese RNA-Präparationen dienen als Standard für die RT-PCR.
Die Länge der RT-PCR-Produkte von Standard und Wildtyp-DNA betragen 148 (pHAV+9), 129 (pHAV- 10) und 139 bp (wt).
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geben die Menge an eingesetzten Minus-Standard und Plus-Standard an. Spalten 3 und 4 bezeichnen Verdünnung und eingesetztes Volumen. In Spalte 5 ist die Probe angegeben, Spalte 6 bezeichnet das Virus, auf das untersucht wird. Die Kopienzahlen der Proben wurden sowohl anhand des Minus-Standards (N-Base ; Spalte 7) als auch anhand des Plus-Standards (N + Base ; Spalte 8) berechnet ; der Mittelwert beider Bestimmungen ergibt das Messergebnis. Spalte 9 blieb leer. Spalte 10 gibt die Nummer des Probenlaufes an. Die Spalten 11,12 und 13 geben die Fläche der detektierten Peaks an.
Fig. 2 zeigt die graphische Auswertung der HAV-Untersuchung, wobei in den verschiedenen Bahnen die Intensitäten der Fluoreszenzsignale der PCR-Produkte (und Nebenprodukte) dargestellt. Die Produkte sind anhand ihrer definierten Grösse (in bp) identifizierbar. Die Standards sind 148 und 129 bp lang, der Wildtyp 139.
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900 <SEP> 300 <SEP> 1 <SEP> 0,25 <SEP> PL <SEP> 1 <SEP> HAV <SEP> 910 <SEP> 077 <SEP> - <SEP> 314, <SEP> 17 <SEP> 22213 <SEP> 5666 <SEP> 10040
<tb> 900 <SEP> 300 <SEP> 1 <SEP> 0,25 <SEP> AIDUMIN <SEP> 1 <SEP> HAV <SEP> -1 <SEP> -1 <SEP> - <SEP> 314. <SEP> 18 <SEP> 19095 <SEP> -1 <SEP> 2014
<tb> 000 <SEP> 300 <SEP> 1 <SEP> 0,25 <SEP> Hunian <SEP> Albumin <SEP> 1 <SEP> HAV <SEP> -1 <SEP> -1 <SEP> - <SEP> 314. <SEP> 19 <SEP> 13995 <SEP> -1 <SEP> 7308
<tb> 800 <SEP> 300 <SEP> 1 <SEP> 0,25 <SEP> PL <SEP> 2 <SEP> HAV <SEP> -1 <SEP> -1 <SEP> - <SEP> 314. <SEP> 20 <SEP> 29283 <SEP> -1 <SEP> 4276
<tb>
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Die Ergebisse dieser Untersuchungen zeigten, dass Plasma 1 positiv war (798 Kopien/ml), während die
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4. Beispiel 3: Quantifizierung von HCV durch RT-PCR
Bei dieser Quantifizierung werden Primer verwendet, welche in den cDNA-Sequenzen des HCV binden und durch RT-PCR von Wildtyp-RNA ein 114 bp grosses Produkt ergeben, nämlich
HCV32 : CTGTGAGGAACTACTGTCTT HCV 45-64 Seq. ID 5 und HCVPT4 : CGGTTCCGCAGACCACTATG HCV 158-139 Seq ID 6 (Numerierung nach Han et al. (PNAS 88 (1991) 1711-1715). Die Primer wurden unter Verwendung der Phosphoamidit-Chemie auf einem DNA-Synthesizer hergestellt (Applied Biosystems 394 DNA Synthesizer).
Die Standard-Plasmide pHCV-7 und pHCV+8 sind abgeleitet aus dem Plasmid pHCV-wt, welches aus dem bekannten pBS/SK--Plasmid (Firma Statagene) und einem Insert in der multiplen Klonierungsstelle dieses Plasmids besteht, welches Insert die bp 27 bis 313 des HCV aus Han et al. enthält.
In pHCV-7 wurden die bp 126 bis 135 deletiert, in pHCV+8 ein 8 bp langes Insert an der Stelle 126 eingefügt. Die Plasmide wurde gereinigt (QUIAGEN-Verfahren), die Konzentration durch spektroskopische Messung bei 260 nm bestimmt, mit Xmnl geschnitten und in einem 10mM TRIS/HCI pH 8/0, 1 mM EDTAPuffer verdünnt (Sambrook et al. Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor (1989)).
EMI9.1
1370 b"-"Transkript und ein 1377 b "wt"Transkript, welche mit einer Guanidinisothiocyanatlösung extrahiert und durch spektrophotometrische Messungen bei 260 nm quantifiziert werden.
Diese RNA-Präparationen dienen als Standard für die RT-PCR.
Die Länge der RT-PCR-Produkte von Standard und Wildtyp-DNA betragen daher 122 (pHCV+8), 107 (pHCV-7) und 114 bp (wt).
5. Beispiel 4 : Quantifizlerung von HIV-proviraler DNA
Bel dieser Quantifizierung werden Primer verwendet, welche in den cDNA-Sequenzen des HIV-1 binden und durch PCR von proviraler HIV-DNA ein 115 bp grosses Produkt ergeben, nämlich SK38 : ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT HIV-1 1551-1578 Seq. lD 1
SK39 : TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC HIV-1 1665-1638 Seq. ID 2 (Numerierung nach Ratner et al.). Die Primer wurden unter Verwendung der Phosphoamidit-Chemie auf einem DNA-Synthesizer hergestellt (Applied Biosystems 394 DNA Synthesizer).
Die Standard-Plasmide pgag-15 und pgag+12 sind abgeleitet aus dem Plasmid pgag1, welches aus dem bekannten pBS/SK--Plasmid (Firma Stratagene) und einem Insert in der multiplen Kionierungsstelle- dieses Plasmids besteht, welches Insert die bp 1417 bis 2008 der HIV-1 aus Ratner et al enthält.
In pgag-15 wurden die bp 1593 bis 1607 deletiert, in pgag + 12 ein 12 bp langes Insert an der Stelle 1593 eingefügt (siehe Fig. 1). Die Plasmide wurde gereinigt (QUIAGEN-Verfahren), die Konzentration durch spektroskopische Messung bei 260 nm bestimmt, mit EcoRI geschnitten und in einem 10mM TRIS/HCI pH 8/0, 1 mM EDTA-Puffer verdünnt (Sambrook et al. Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spnng Harbor (1989)).
Diese DNA-Präparationen dienen als Standard für die PCR.
Die Länge der PCR-Produkte von Standard und Wildtyp-DNA betragen daher 127 (gag+12), 100 (pgag-15) und 115 bp (wt).
6 Beispiel 5. Quantifizierung von HBV
Bei dieser Quantifizierung werden Primer verwendet, welche im Genom des HBV binden und durch PCR von Wildtyp-DNA ein 182 bp grosses Produkt ergeben, nämlich HBV + 1780B : CATTGATCCTTATAAAGAATTTGGAGC HBV 1780-1806 Seq. ID 7 und HBV-1950B : CCAGCAGAGAATTGCTTGCCTGAG HBV 1973-1950 Seq. ID 8 (Numenerung nach Fujiyama et al.).
Die Primer wurden unter Verwendung der Phosphoamidit-Chemie auf einem DNA-Synthesizer hergestellt (Applied Blosystems 394 DNA Synthesizer)
Die Standard-Plasmide pHBV-9 und pHBV+ 12 sind abgeleitet aus dem Plasmid pHBV-wt, welches aus dem bekannten pBluescript 11 SK-Plasmid (Firma Stratagene) und einem Insert in der multiplen Klonie- - Jngsstelle dieses Plasmids besteht, welches Insert die bp 1763 bis 1868 der HBV aus Fujiyama et al. enthält
In pHBV-9 wurden die bp 1868 bis 1876 deletiert, In pHBV + 12 ein 12 bp langes Insert an der Stelle 1858 eingefügt.
Die Plasmide wurden gereinigt (QUIAGEN-Verfahren), die Konzentration durch spektroskopische Messung bei 260 nm bestimmt, mit einem Restnktlonsenzym einmal geschnitten und In einem
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10mM TRIS/HCI pH 8/0, 1 mM EDTA-Puffer verdünnt (Sambrook et al. Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor (1989)).
Diese DNA-Präparationen dienen als Standard für die PCR.
Die Länge der PCR-Produkte von Standard und Wildtyp-DNA betragen daher 194 (pHBV+12), 173 (pHBV-9) und 182 bp (wt).
Die Ergebnisse eine-Quantifizierungsreihe sind in Tabelle 2 wiedergegeben und in der Figur 3 graphisch veranschaulicht. Die Amplifizierungsreaktion wurde ausgehend von jeweils 150 Kopien pHBV-9 und 50 Kopien von HBV+12 und unterschiedlichen Mengen an pHBV-wt (400, 200, 100, 50 und 0 Kopien) durchgeführt. Jeder Ansatz wurde vierfach gemessen.
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EMI11.1
<tb>
<tb>
LANE <SEP> OODE <SEP> A-9 <SEP> A-WT <SEP> A+12 <SEP> coples-9 <SEP> coples+12 <SEP> COPIES <SEP> 1 <SEP> COPIES <SEP> 2 <SEP> AVERAGE <SEP> RESULTS <SEP> A-12/A-15
<tb> 16000 <SEP> 5000 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 3,0
<tb> lane <SEP> 1 <SEP> 400Kp. <SEP> 19196 <SEP> 28877 <SEP> 2932 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 420,0 <SEP> 683,5 <SEP> 551,6 <SEP> 4,8
<tb> lane <SEP> 2 <SEP> 400Kp. <SEP> 11405 <SEP> 13730 <SEP> 4481 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 361,2 <SEP> 307,8 <SEP> 334,5 <SEP> 2,8
<tb> lane <SEP> 3 <SEP> 400Kp. <SEP> 33124 <SEP> 31652 <SEP> 9666 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 266,7 <SEP> 327,4 <SEP> 307,0 <SEP> 3,4
<tb> lane <SEP> 4 <SEP> 400Kp. <SEP> 29358 <SEP> 22759 <SEP> 11270 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 232.6 <SEP> 201.9 <SEP> 217.3 <SEP> 2,8
<tb> lane <SEP> 5 <SEP> 200Kp.
<SEP> 29944 <SEP> 17841 <SEP> 12476 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 178,7 <SEP> 143,0 <SEP> 160,9 <SEP> 2,4
<tb> lane <SEP> 6 <SEP> 200Kp. <SEP> 18598 <SEP> 15523 <SEP> 6960 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 250,4 <SEP> 223,0 <SEP> 236,7 <SEP> 2,7
<tb> lane <SEP> 7 <SEP> 200Kp. <SEP> 30630 <SEP> 19323 <SEP> 6360 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 189,3 <SEP> 230,6 <SEP> 209,9 <SEP> 3,7
<tb> lane <SEP> 8 <SEP> 200Kp. <SEP> 23039 <SEP> 15874 <SEP> 12087 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 208,0 <SEP> 132,2 <SEP> 170,1 <SEP> 1,9
<tb> lane <SEP> 9 <SEP> 100Kp. <SEP> 24400 <SEP> 5270 <SEP> 6731 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 64,8 <SEP> 78,3 <SEP> 71,5 <SEP> 3,6
<tb> lane <SEP> 10 <SEP> 100Kp. <SEP> 18766 <SEP> 7532 <SEP> 5581 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 120,4 <SEP> 135,0 <SEP> 127,7 <SEP> 3,4
<tb> lane <SEP> 11 <SEP> 100Kp.
<SEP> 32503 <SEP> 18983 <SEP> 11517 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 175,2 <SEP> 164,8 <SEP> 170,0 <SEP> 2,6
<tb> lane <SEP> 12 <SEP> 100Kp. <SEP> 21417 <SEP> 10635 <SEP> 6758 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 151,8 <SEP> 160,3 <SEP> 156,1 <SEP> 3,2
<tb> lane <SEP> 13 <SEP> 50Kp. <SEP> 34103 <SEP> 4244 <SEP> 8193 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 37,3 <SEP> 51,8 <SEP> 44,6 <SEP> 4,2
<tb> lane <SEP> 14 <SEP> 50Kp.
<SEP> 27636 <SEP> 735 <SEP> 8094 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 8,0 <SEP> 0,1 <SEP> 0,5 <SEP> 3,4
<tb> lane <SEP> 15 <SEP> 50Kp <SEP> 13782 <SEP> 3806 <SEP> 7203 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 82,3 <SEP> 52,8 <SEP> 67,8 <SEP> 1,9
<tb> lane <SEP> 16 <SEP> 50Kp <SEP> 28818 <SEP> 3591 <SEP> 8570 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 37,4 <SEP> 41,8 <SEP> 39,8 <SEP> 3,4
<tb> lane <SEP> 17 <SEP> K5 <SEP> 33264 <SEP> -1 <SEP> 10199 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 0,0 <SEP> 0,0 <SEP> 0,0 <SEP> 3,3
<tb> lane <SEP> 18 <SEP> K5 <SEP> 15217 <SEP> -1 <SEP> 5303 <SEP> 150 <SEP> 50 <SEP> 0,0 <SEP> 0,0 <SEP> 0,0 <SEP> 2,
9
<tb> lane <SEP> 19 <SEP> k3 <SEP> -1 <SEP> -1 <SEP> -1
<tb> lane <SEP> 20 <SEP> K3 <SEP> -1 <SEP> -1 <SEP> -1
<tb> lane <SEP> 21
<tb> lane <SEP> 22
<tb> lane <SEP> 23
<tb> lane <SEP> 24
<tb> lane <SEP> 25
<tb> lane <SEP> 26
<tb> lane <SEP> 27
<tb> lane <SEP> 28
<tb> lane <SEP> 29
<tb> lane <SEP> 30
<tb> lane <SEP> 31
<tb> lane <SEP> 32
<tb> lane <SEP> 33
<tb> lane <SEP> 34
<tb> lane <SEP> 35
<tb>
TABELLE 2
Die Ergebnisse zeigen, dass der festgestellte DNA-Gehalt sehr gut reproduzierbar ist.
**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.