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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und zum
Quantifizieren des CYP1A1-Gens der menschlichen P450 molekularen
Spezies und ein Kit zur Verwendung in dem Verfahren.
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Hintergrund
der Erfindung
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Cytochrom
P450 ist eines der Enzyme, das am Stoffwechsel chemischer Substanzen
teilnimmt, wie z.B. als Wirkstoffverbindungen in Arzneimitteln.
Eine Anzahl molekularer Spezies von Cytochrom P450 existieren bekanntlich
und ungefähr
30 molekulare Spezies wurden bis jetzt beim Menschen bestätigt. Obwohl
sich diese molekularen Spezies im Hinblick auf ihre Enzymaktivität voneinander
unterscheiden, wird von ihnen jeweils berichtet, dass sie am Stoffwechsel
aktiver Wirkstoffverbindungen in Arzneimitteln teilnehmen (z.B.
Wirkstoffverbindungen in tricyclischen Antidepressiva, Antiepileptika,
Benzodiazepinpräparationen,
Betablockern, schlafinduzierende Barbiturat-Hypnotika und anderen
Arzneimitteln, Dimethylnitrosamin usw.), Benzol und anderen organischen
Lösungsmitteln,
niedermolekularen Karzinogenen in der Umwelt oder ähnlichen
(beispielsweise Yoo, J.S.H., Chung, R., C., Wade, D., & Yang, C.S. (1987)
Cancer Res., 47, 3378–3383).
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Bei
der Entwicklung eines neuen Arzneimittels ist es wichtig, seine
Wirkungen (Veränderungen
im Expressionsniveau) von molekularen Spezies von menschlichem Cytochrom
P450 (hiernach einfach bezeichnet als "P450")
bei Verabreichung des neuen Arzneimittels zu verstehen. Das liegt
daran, dass wenn die Veränderungen
in den Expressionsniveaus der P450 molekularen Spezies unbekannt
sind, es unmöglich
wird, einen Anstieg oder eine Abnahme der Wirksamkeit und Nebenwirkungen
des neuen Arzneimittels, ausgelöst
durch ein Arzneimittel oder eine andere Substanz, die mit dem neuen
Arzneimittel gleichzeitig verabreicht wird, vorherzusagen oder einen
Anstieg oder eine Abnahme der Wirksamkeit und Nebenwirkungen des
gleichzeitig verabreichten Arzneimittels. So kann die Sicherheit
des neuen Arzneimittels nicht bestätigt werden.
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So
war es auf dem pharmazeutischen Gebiet, wie z.B. der Entwicklung
neuer Arzneimittel erwünscht, Informationen
hinsichtlich der P450 molekularen Spezies und insbesondere eine
Technik zur Messung der Niveaus der P450 molekularen Spezies individuell
zum Erhalt von Informationen, betreffend jede P450 molekulare Spezies
zu erhalten. Die Entwicklung einer Technik zur Messung der molekularen
Spezies auf individuelle Weise würde
es beispielsweise ermöglichen,
die Interaktion eines neuen Arzneimittels mit einem anderen Arzneimittel
und den Einfluss des neuen Arzneimittels auf den Organismus in einem
spezifischen Krankheitszustand einfach zu verstehen und Informationen über die
Nebenwirkungen des neuen Arzneimittels zu erhalten und dadurch seine
Sicherheit sicherzustellen.
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Die
Polymerasekettenreaktion (PCR) ist ein bereits bekanntes Verfahren
zur Amplifikation von Nukleinsäuren.
Von den PCR-Techniken
werden RT-PCR (Reverse Transkriptions-PCR), kompetitive RT-PCR und ähnliche
zum Nachweis und zum Quantifizieren einer Spurenmenge mRNA und zur
Darstellung ihrer Wirksamkeit verwendet.
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In
den letzten Jahren wurde eine quantitative Echtzeit-Nachweistechnik unter
Verwendung der PCR etabliert (TagMan PCR, Genome Res., 6(10), 986(1996),
ABI PRISMTM Sequence Detection System, Applied Biosystems).
Diese Technik misst die Menge an Nukleinsäuren unter Verwendung einer
bestimmten, mit Fluoreszenz markierten Sonde (TagMan-Sonde). Genauer
gesagt verwendet diese Technik die folgenden Prinzipien:
beispielsweise
wird eine Fluoreszenz-markierte Sonde mit einem Reporterfarbstoff
am 5'-Ende und einem Quencherfarbstoff
am 3'-Ende an die
Ziel-DNA angehaftet und die DNA wird einer normalen PCR unterworfen. Wenn
die Verlängerungsreaktion
fortschreitet, wird die Sonde vom 5'-Ende durch die 5'-3'-Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase hydrolysiert.
Im Ergebnis wird der Reporterfarbstoff am 5'-Ende vom Quencherfarbstoff am 3'-Ende abgetrennt
und eliminiert dadurch den FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer,
die Reduktion der Fluoreszenzintensität aufgrund der Abnahme des
Energieniveaus des Reporterfarbstoffs, ausgelöst durch die Resonanz der zwei
fluoreszierenden Farbstoffe)-Effekt, erzeugt durch die räumliche
Nähe zwischen
den beiden Farbstoffen und erhöht
die Fluoreszenzintensität
des Reporterfarbstoffes, kontrolliert durch den Quencherfarbstoff.
Die Zielnukleinsäure
kann selektiv in Echtzeit durch Messung des Anstiegs der Fluoreszenzintensität quantifiziert
und nachgewiesen werden.
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Diese
Technik ist darin vorteilhaft, dass verschiedene Proben simultan
in kurzer Zeit getestet werden können,
da, anders als beim Nachweis und der Quantifizierung unter Verwendung
konventioneller PCR keine komplizierten Schritte involviert sind,
wie z.B. eine Agarosegelelektrophorese des amplifizierten Produkts
nach der PCR und Analyse von Elektrophoresemustern.
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Allgemein
ist es bei der Durchführung
klinischer Tests in einem klinischen Testcenter oder ähnlichen notwendig,
eine extrem große
Anzahl von Proben innerhalb einer begrenzten Zeit zu überprüfen. Daher
besteht ein deutlicher Bedarf an der Entwicklung effizienter Testverfahren.
Die quantitative Echtzeit-Nachweistechnik ist ein vielversprechender
Kandidat, um diesen Bedürfnissen
zu entsprechen.
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Die
gegenwärtigen
Erfinder haben ihre Aufmerksamkeit auf die quantitative Echtzeit-Nachweistechnik unter
Verwendung von PCR gerichtet und festgestellt, dass, wenn die Nachweistechnik
zum Nachweis einer menschlichen P450 molekularen Spezies verwendet
werden kann, die molekulare Spezies individuell unter Verwendung
desselben Apparats unter Verwendung derselben PCR-Bedingungen nachgewiesen
und quantifiziert werden kann.
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Wie
oben beschrieben, gibt es jedoch ungefähr 30 gegenwärtig bekannte
P450 molekulare Spezies, die an dem Stoffwechsel chemischer Substanzen
teilnehmen. Obwohl die mRNA-Sequenz jeder Spezies bekannt ist, wurde
es als schwierig angesehen, Oligonukleotide (zur Verwendung als
Primerpaare) aufzufinden, die nicht überlappen und dazu in der Lage
sind, diese molekulare Spezies als Ziel-Gene ausreichend zu amplifizieren,
und mit bestimmten Teilen der Ziel-Gene zu hybridisieren. Es wurde
auch als schwierig angesehen, in einem spezifischen Bereich zwischen
dem Primerpaar eine Sonde zu bilden, die dazu in der Lage ist, schneller
mit dem Ziel-Gen
zu hybridisieren als die Primer unter denselben PCR-Bedingungen und die
für nur
eine molekulare Spezies spezifisch ist. Insbesondere ist bekannt,
obwohl die Einfachheit einer Hybridisierung zwischen zwei Nukleinsäuren bekannter
Nukleotidsequenzen in einem gewissen Ausmaß durch Berechnung des Schmelzpunktes
(Tm) geschätzt
werden kann, die Kombination von Primern und einer Sonde, selektiert
basierend auf der Schätzung,
nicht notwendigerweise guter Ergebnisse bei der DNA-Messung hervorruft.
Daher werden viele Trial- und Error-Experimente durch Experten erwartet,
um für
alle gegenwärtig
bekannten P450 molekularen Spezies eine Kombination aus Primerpaar
und Sonde für
einen Echtzeit-PCR-Nachweis
zu selektieren, durch den das Gen individuell gemessen werden kann.
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Offenbarung
der Erfindung
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Eine
Aufgabe der gegenwärtigen
Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweis und zur
Quantifizierung des CYP1A1-Gens, das eine P450 molekulare Spezies
codiert und insbesondere eines Verfahrens zum Nachweis und zur Quantifizierung
des Gens durch das quantitative Echtzeit-Nachweisverfahren.
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Eine
andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung
von Sonden und Primerpaaren zur Verwendung in dem obigen Verfahren.
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Um
die obigen Aufgaben zu lösen,
haben die gegenwärtigen
Erfinder wiederholt eine große
Anzahl von Experimenten und Forschungen an P450 molekularen Spezies
durchgeführt.
Im Ergebnis waren die gegenwärtigen
Erfinder beim Auffinden von Sets, bestehend aus einem Primerpaar
und einer Sonde, die für
29 bestimmte Gene von P450 molekularen Spezies spezifisch sind,
d.h. Sets eines Primerpaars und einer Sonde, die dazu in der Lage
sind, individuell die Gene, die die molekulare Spezies codieren,
nachzuweisen und zu quantifizieren erfolgreich. Die gegenwärtige Erfindung
wurde basierend auf dieser Feststellung bewirkt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Kit zum Nachweis und zur Quantifizierung
des CYP1A1-Gens der menschlichen Cytochrom P450 molekularen Spezies,
umfassend einen Satz eines Primerpaars eines Vorwärts-Primers,
umfassend ein Oligonukleotid, das mit der 589–610 Region des CYP1A1-Gens
hybridisiert, und eines Rückwärts-Primers,
umfassend ein Oligonukleotid, das mit der 685–664 Region des CYP1A1-Gens
hybridisiert, und eine Sonde, umfassend ein Oligonukleotid, das
mit der 616–641
Region des CYP1A1-Gens hybridisiert, zur Verfügung.
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Genauer
gesagt stellt die vorliegende Erfindung das obige Kit bereit, worin
die Sonde weiterhin einen Reporterfarbstoff und einen Quencherfarbstoff
umfasst, beide angehaftet an das Oligonukleotid.
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Vorzugsweise
ist der Satz aus einem Primerpaar und einer Sonde in dem obigen
Kit ein Satz eines Primerpaares, umfassend die Sequenzen, wie dargestellt
in SEQ ID NO: 36 und 37 und einer Sonde, umfassend die in SEQ ID
NO: 1 dargestellte Sequenz.
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Der
obige Satz wird zum Nachweis und Quantifizierung der folgenden P450
molekularen Arten verwendet.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Nachweis
und der Quantifizierung eines CYP1A1-Gens der P450 molekularen Spezies
bereit, wobei das Verfahren die unten beschriebenen Schritte (a)
bis (c) umfasst, insbesondere ein Verfahren, worin in Schritt (c)
die hydrolysierte Sonde oder Sonden durch Nachweis der Fluoreszenz
nachgewiesen und quantifiziert wird (werden), erzeugt durch Bestrahlung
mit Anregungslicht und Messung des Grads der Fluoreszenz:
- (a) Herstellung einer Probe, enthaltend ein
menschliches P450-Gen oder -Gene;
- (b) Unterwerfen der Probe einer Polymerasekettenreaktion (PCR,
kann eine RT-PCR sein) unter Verwendung eines Kits gemäß der vorliegenden
Erfindung, umfassend den obigen Satz aus Primerpaar und Sonde, um
das CYP1A1-Gen der P450 molekularen Spezies in der Probe zu amplifizieren
und
- (c) Nachweis und Messung der Sonde oder Sonden, die während der
Polymerasekettenreaktion hydrolysiert sind.
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In
dieser Beschreibung sind die Abkürzungen
für Aminosäuren, Peptide,
Nukleotidsequenzen, Nukleinsäuren
usw. diejenigen, die in der IUPAC-IUB Communication on Biological
Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9(1984) oder "Guideline for preparation
of a specification containing nucleotide sequences or amino acid sequences" (JPO) bereitgestellt
werden oder diejenigen, die konventionellerweise auf diesem Gebiet
verwendet werden.
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Die
Bezeichnung "Gen" in dieser Beschreibung
beinhaltet doppelsträngige
DNA und einzelsträngige Sinn-
oder Antisinn-DNA,
die doppelsträngige
DNA bildet. Die Bezeichnung beinhaltet weiterhin mRNA, die an der
Expression dieser Gene beteiligt ist und cDNA, die zu der mRNA komplementär ist. Die
Bezeichnung "Nukleotid" ("Oligonukleotid") beinhaltet RNA
und DNA.
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Es
wird besonders bevorzugt, das Verfahren der gegenwärtigen Erfindung
gemäß dem Echtzeit-Nachweisverfahren
unter Verwendung einer Sonde durchzuführen, die mit einem Reporterfarbstoff
und einem Quencherfarbstoff markiert ist.
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Das
Echtzeit-Nachweisverfahren kann einfach und schnell die Gene der
molekularen Spezies individuell in Echtzeit quantifizieren, unter
denselben PCR- oder RT-PCR-Bedingungen und das Etablieren dieser Technik
ist für
die klinischen und pharmazeutischen Gebiete sehr günstig. Beispielsweise
kann die Technik einfach die P450 mRNA-Expression in einer menschlichen
Probe quantifizieren, was für
kinetische Tests im Hinblick auf die Entwicklung von Arzneimitteln
wichtig ist und es so möglich
macht, die Aktivität
einer P450 molekularen Spezies zu kennen, wenn diese einer chemischen
Substanz, wie z.B. einem Arzneimittel, ausgesetzt wird. Insbesondere
müssen
Forscher bei der Entwicklung neuer Arzneimittel die Aktivität des Stoffwechsels durch
P450 untersuchen. Konventionell wurde die Aktivität des Stoffwechsels
von P450 durch Messung des Expressionsniveaus jeder P450 molekularen
Spezies separat in einem komplizierten zeit- und arbeitsaufwendigen
Prozess gemessen. Demgegenüber
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum einfachen und schnellen
Quantifizieren von Expressionsniveaus der P450 molekularen Spezies
unter denselben Bedingungen bereit, was insbesondere für die Entwicklung
neuer Arzneimittel extrem nützlich
ist.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung ist auch zur Untersuchung der
mRNA-Expression der P450 molekularen Spezies in einem isolierten
Gewebe oder einem Gewebe, das durch eine Biopsie erhalten wurde, effektiv.
So ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung darin vorteilhaft,
dass es einfach und schnell eine Vielzahl von Proben verarbeiten
kann und den gewünschten
Nachweis unter Verwendung der Gesamt-RNA, extrahiert aus einer geringen
Gewebemenge, erreichen kann.
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Es
gibt eine Möglichkeit,
dass die Veränderung
des Expressionsniveaus der P450 molekularen Spezies durch Enzyminduktion
oder einen anderen Prozess in der Leber, der Niere oder ähnlichem
mit der Veränderung
des Expressionsniveaus im Blut (nukleäre Zellen im Blut) in Beziehung
steht. Da jedoch das Expressionsniveau im Blut niedrig ist, ist
eine große
Blutmenge für
die Messung notwendig. Das Messverfahren der vorliegenden Erfindung,
das irgendeinen Satz der obigen Primerpaare und Sonden verwendet,
entworfen von den gegenwärtigen
Erfindern, kann die P450 molekulare Spezies unter Verwendung einer
geringen Menge der Probe und üblicher
Ausrüstung
einfach und schnell nachweisen und quantifizieren. Daher kann das
erfindungsgemäße Verfahren
das Gen, das die P450 molekulare Spezies im Blut codiert oder eine ähnliche
Probe nachweisen und quantifizieren und ermöglicht es so, die Expressionsniveaus
der molekularen Spezies einzuschätzen.
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Sonden und
Primer der vorliegenden Erfindung
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Die
Sonden und Primer der vorliegenden Erfindung umfassen jeweils ein
Oligonukleotid, hybridisierbar mit einem spezifischen Bereich des
CYP1A1-Gens.
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Wie
hier verwendet, bedeutet die Bezeichnung "hybridisierbar" die Fähigkeit, mit dem spezifischen
Bereich unter den folgenden PCR(RT-PCR)-Bedingungen zu hybridisieren:
1 Zyklus für
30 Minuten bei 48°C,
1 Zyklus für
10 Minuten bei 95°C
und 50 Zyklen, die jeweils aus 15 Sekunden bei 95°C und 1 Minute
bei 60°C bestehen.
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Allgemein
gesprochen hat das hybridisierbare Oligonukleotid eine komplementäre Nukleotidsequenz zu
derjenigen des spezifischen Bereichs. Es ist auf diesem Gebiet jedoch
bekannt, dass selbst wenn ein Primer oder eine Sonde, hergestellt
aus beispielsweise ungefähr
20 Nukleotiden, ungefähr
1 oder 2 Fehlpaarungen in dem Matrizenstrang aufweist, der Primer
oder die Sonde mit dem Matrizenstrang hybridisiert und so als PCR-Primer
oder als Nachweissonde wirkt. Dementsprechend beinhalten die Primer
und Sonden der vorliegenden Erfindung diejenigen, umfassend eine
Nukleotidsequenz mit einer geringeren Zahl an Fehlpaarungen. Die
Zahl an Fehlpaarungen ist jedoch vorzugsweise so gering wie möglich.
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Die
Sonden und Primer der vorliegenden Erfindung müssen die folgenden Merkmale
aufweisen: sie ergeben Amplifikationsprodukte mit einer Länge von
ungefähr
50 bis ungefähr
400 bp; die Primer in jedem Satz liegen so eng wie möglich an
der Sonde; der Anteil an G (Guanin) und C (Cytosin) in jeder Sequenz
liegt so nah wie möglich
an 50 und sie enthalten nicht vier oder mehr G (Guanin) nukleotide
in einer Reihe. Ein weiteres Merkmal, das für die Sonden der vorliegenden
Erfindung benötigt
wird, ist dasjenige, dass sie einen Tm von ungefähr 70°C aufweisen. Weiterhin müssen die
Primer einen Tm von ungefähr
60°C aufweisen.
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Die
Zahl an Nukleotiden in dem Oligonukleotid für jeden Primer oder jede Sonde,
die den obigen Anforderungen entsprechen, beträgt mindestens 15, in der Regel
15 bis 50, vorzugsweise 20 bis 40. Wenn die Zahl an Nukleotiden
in Primer oder der Sonde sehr viel größer ist als im obigen Bereich,
ist es schwierig, den Primer oder die Sonde mit einer einzelsträngigen DNA
zu hybridisieren. Wenn die Zahl an Nukleotiden andererseits zu gering
ist, reduziert sich die Hybridisierungsspezifität.
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Spezifische
Beispiele für
Nukleotidsequenzen für
die Primer und Sonden sind wie oben beschrieben. Die in SEQ ID NO:
1 dargestellte Sequenz (Sonde) und SEQ ID NO: 36 bis 37 (Primer)
werden verwendet.
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Vorzugsweise
bestehen die Oligonukleotide zur Verwendung als Sonden und Primer
der vorliegenden Erfindung aus der in diesen SEQ ID NOS dargestellten
Nukleotidsequenz. Sie sind jedoch nicht auf solche Oligonukleotide
begrenzt und können
eine geringe Zahl an Fehlpaarungen aufweisen, solange sie im wesentlichen
eine dieser Nukleotidsequenzen umfassen.
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Die
mRNA-Sequenzen der P450 molekularen Spezies sind bekannt und sind
in GenBank unter den folgenden Hinterlegungsnummern registriert.
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(1) Das CYP1A1-Gen: NM_000499.
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In
dieser Beschreibung sind die spezifischen Regionen der molekularen
Spezies durch die Gensequenzen, registriert unter den obigen Hinterlegungsnummern
angegeben.
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Die
Oligonukleotide zur Verwendung als Sonden und Primer der vorliegenden
Erfindung können
einfach auf Routineweise synthetisiert werden, wobei ein automatischer
Synthetisierer verwendet wird, wie z.B. ein DNA-Synthetisierer (Perkin-Elmer) oder ähnliches.
Die erhaltenen Oligonukleotide können
unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Reinigungskartusche
oder von ähnlichem
gereinigt werden, falls gewünscht.
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Echtzeitquantifizierung
und Nachweis
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Das
P450 molekulare Spezies- Echtzeit-Nachweisverfahren durch PCR unter
Verwendung der Primerpaare und Sonden der vorliegenden Erfindung
wird unten im Detail beschrieben.
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Die
Echtzeitnachweissonden der vorliegenden Erfindung umfassen einen
Reporterfarbstoff, der an ein Ende angehaftet ist, beispielsweise
das 5'-Ende und
einen Quencherfarbstoff, angehaftet an das andere Ende, beispielsweise
das 3'-Ende. Der
Reporterfarbstoff emittiert Fluoreszenz beispielsweise bei Bestrahlung
mit anregendem Licht und der Quencherfarbstoff wirkt auf den Reporterfarbstoff,
um die Fluoreszenzemission zu unterdrücken, wenn er sich in enger
Nachbarschaft zu dem Reporterfarbstoff befindet. Beispiele für die Reporterfarbstoffe
beinhalten 6-Carboxyfluorescein (FAM), Tetrachlor-6-carboxyfluorescein
(TET), 2,7-Dimethoxy-4,5-dichlor-6-carboxyfluorescein
(JOE), Hexachlor-6-carboxyfluorescein
(HEX) und ähnliche.
Beispiele für die
Quencherfarbstoffe beinhalten 6-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA)
und ähnliche.
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Eine
Sonde der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden, indem
ein Reporter- und ein Quencherfarbstoff an ein Oligonukleotid mit
der spezifischen Sequenz angehaftet wird. Beispielsweise kann ein FAM-Molekül in Form
eines Phosphorsäureesters
an die Phosphorsäuregruppe
am 5'-Ende der Sonde
angehaftet werden, wobei üblicherweise
etliche Methylenketten als Linker verwendet werden. Weiterhin kann ein TAMRA-Molekül an das
3'-Ende durch eine
Amidbindung über
die folgende Struktureinheit angehaftet werden:
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Es
ist für
das Verfahren der vorliegenden Erfindung essenziell, eins oder mehr
der Primerpaare und Sonden der vorliegenden Erfindung zu verwenden.
Andererseits kann das Verfahren gemäß bekannten PCR (beispielsweise
Science, 230, 1350(1985)) oder RT-PCR (Genome Res., 6(10), 986(1996)),
insbesondere den Echtzeitnachweisverfahren (beispielsweise TagMan
PCR, ABI PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied Biosystems,
Ver1, Juni 1996), durchgeführt
werden.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung ist insbesondere zur Messung
der mRNA oder cDNA der P450 molekularen Zielspezies nützlich,
um das Expressionsniveau der P450 molekularen Spezies zu bestimmen.
In diesem Fall wird eine Gewebe, das eine spezifische molekulare
Spezies exprimiert, ausgeschnitten und die Gesamt-RNA wird auf Routineweise
extrahiert. Dann wird eine cDNA, die zu der RNA komplementär ist, auf
Routineweise synthetisiert, gefolgt von einer PCR unter Verwendung
von ein oder mehr der Primerpaare und Sonden der vorliegenden Erfindung.
Alternativ kann die RNA nach Extraktion der Gesamt-RNA auf Routineweise
direkt einer RT-PCR
unter Verwendung von ein oder mehr der Primer und Sonden der vorliegenden Erfindung
unterworfen werden.
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PCR
und RT-PCR können
im Grunde gemäß bekannten
Verfahren durchgeführt
werden. Die PCR- oder RT-PCR-Bedingungen können gemäß dem bekannten Verfahren gewählt werden
und sind ähnlich
wie die hier verwendeten. Spezifisch können die in den hiernach gegebenen
Beispielen dargestellten Bedingungen vorzugsweise verwendet werden.
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Der
Nachweis kann im Grunde auch gemäß konventionellen
Verfahren geschehen, beispielsweise durch Bestrahlung der PCR-Mischung
mit Argonlaserlicht und Nachweis der emittierten Fluoreszenz unter
Verwendung einer CCD-Kamera.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann einfach und schnell die jeweiligen Gene der P450 molekularen Spezies
messen und nachweisen.
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Kit zum Nachweis und Quantifizierung
der P450 molekularen Spezies
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Kit zur Durchführung des
obigen Verfahrens bereit. Das Kit umfasst den Satz der obigen Primerpaare
und Sonden. Das Kit kann weiterhin eine bekannte Nukleinsäure zur Verwendung
als Kontrolle und ein Primerpaar und eine Sonde zur Messung der
Nukleinsäure
enthalten.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die P450 molekulare Spezies
individuell nachweisen und quantifizieren. Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren
die P450 molekulare Spezies schnell und akkurat quantifizieren.
Dementsprechend ermöglicht
es die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, effizient fundamentelle
Daten im Hinblick auf die Wechselwirkung und Inkompatibilität eines
neuen Arzneimittels mit einem anderen Arzneimittel beim Menschen
zu erhalten.
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Beste Ausführungsform
der Erfindung
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Testbeispiele
und Beispiele werden unten angegeben, um die vorliegende Erfindung
im weiteren Detail zu illustrieren.
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Testbeispiel 1 Herstellung
von Kalibrierungskurven durch die Echtzeit-Nachweistechnik
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(1) Testverfahren
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Die
einstufige Echtzeit-RT-PCR-Technik, die in diesem Test verwendet
wurde, kann bis zu 96 Proben gleichzeitig untersuchen, indem bis
zu 96 unterschiedliche Reaktionen unter Verwendung von 96 Vertiefungen durchgeführt werden.
Außerdem
kann durch diese Technik RT und PCR in einem Röhrchen durchgeführt werden.
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Die
Quantifizierung wird unter Verwendung von zwei fluoreszierenden
Farbstoffen in enger Nachbarschaft, basierend auf erzeugte FRET,
wenn die Wellenlängenbereiche
der Fluoreszenzwellenlänge
von einem Farbstoff (Reporterfarbstoff) und die Anregungslichtwellenlänge des
anderen Farbstoffs (Quencherfarbstoff) miteinander überlappen,
durchgeführt.
Eine Sonde (TagMan-Sonde), worin die beiden Farbstoffe, die FRET auslösen, an
den Enden angehaftet sind, hybridisiert mit einer cDNA, abstammend
von einer bestimmten P450 molekularen Spezies und amplifiziert durch
PCR. Die PCR-Verlängerungsreaktion
beginnt in diesem Zustand und die TagMan-Sonde wird durch die 5'-3'-Endonukleaseaktivität der TagDNA-Polymerase hydrolysiert,
so dass der Reporterfarbstoff freigesetzt und die physikalische
Entfernung zwischen den beiden Farbstoffen erhöht wird. Im Ergebnis wird sich
die Fluoreszenzintensität
des Reporterfarbstoffs, die durch FRET unterdrückt wurde, erhöhen. Da
der Anstieg der Fluoreszenzintensität proportional zum Anstieg
der Menge des PCR-Amplifikationsprodukts
ist, kann die gewünschte
cDNA- Quantifizierung
durch Messung des Anstiegs der Fluoreszenzintensität nach jedem
PCR-Zyklus erreicht werden.
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In
diesem Test wurde FAM als Reporterfarbstoff an das 5'-Ende der Sonde angehaftet
und TAMRA wurde als Quencherfarbstoff an das 3'-Ende angehaftet. Die Anhaftung dieser
Farbstoffe und die Herstellung der TagMan-Sonde wurden durch die
in der Literatur beschriebenen Verfahren durchgeführt (Genome
Res., 6(10), 986(1996)).
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Die
Oligonukleotide zur Verwendung als Primer und Sonden wurden unter
Verwendung eines automatischen DNA/RNA-Synthetisierers (ABI), eines dNTP-Substrats
und vorgeschriebenen Reagenzien synthetisiert.
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Als
Proben-RNAs wurden die folgenden RNAs isoliert, gereinigt und in
Form von Gesamt-RNAs verwendet: CYP4B1 und CYP2F1 aus der Lunge;
CYP1B1 aus dem Dünndarm;
CYP3A7 aus dem fötalen
Leberpool; CYP4F8 aus der Prostatadrüse; CYP19 aus der Plazenta
und CYP11B1, CYP11B2 und CYP17 aus der Nebenniere. Als Proben-RNAs
anderer molekularer Spezies wurden Gesamt-RNAs, gereinigt aus einem Erwachsenen-Leberpool,
verwendet. Alle diese Gesamt-RNAs wurden von Clontech Laboratories,
Inc. erworben.
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Die
Gesamt-RNAs wurden mit RNase-freiem Wasser auf 20 μg/ml verdünnt und
dann fünffach
seriell mit Hefe-tRNA (GIBCO) mit einer Konzentration von 50 μg/ml verdünnt. Fünf Mikroliter
jeder Lösung
wurden bei der Messung verwendet.
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Die
RT-PCR wurde in einem 50 μl/Röhrchensystem
unter Verwendung von TagMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents
Kit (PE Applied Biosystems) durchgeführt, umfassend einen 300 nM
Forwardprimer, einen 900 nM Reverseprimer und eine 200 nM TagMan-Sonde
und dem ABI PRISMTM 7700 Sequence Detection System
(PE Applied Biosystems).
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Die
PCR-Bedingungen waren wie folgt: 1 Zyklus für 30 Minuten bei 48°C, 1 Zyklus
für 10
Minuten bei 95°C
und 50 Zyklen, jeweils bestehend aus 15 Sekunden bei 95°C und 1 Minute
bei 60°C.
Die Fluoreszenzintensität
wurde nach jedem Zyklus gemessen.
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Tabelle
1 zeigt die molekulare Zielspezies und Primerpaare und Sonden, die
im obigen Test verwendet wurden. Tabelle 2 präsentiert die Testergebnisse
(Kalibrierungskurven).
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- * Ziel der vorliegenden Erfindung
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- * Ziel der vorliegenden Erfindung
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In
Tabelle 2 zeigen die Kalibrierungskurven, hergestellt von RNA-Lösungen,
die fünffach
seriell verdünnt
wurden von 100.000 pg Gesamt-RNA/50 μl Reaktionsmischung, dass: CYP3A4
in einer Konzentration so niedrig wie 1,28 pg Gesamt-RNA/50 μl Reaktionsmischung
quantifizierbar ist und dass die Korrelationskoeffizienten (r) der
Kalibrierungskurven anderer molekularer Spezies 0,99 oder höher lagen,
wenn die Quantifizierungsgrenze 1,28 pg bis 4.000 pg Gesamt-RNA
betrug. Der Koeffizient der Korrektur der Kalibrierungskurve von
CYP4A11 betrug 0,96.
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Testbeispiel 2
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Bestätigung der P450 molekularen
Spezies-Spezifität
der entworfenen Primer-Sonden-Sätze
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(1) Testverfahren
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Dieser
Test wurde wie folgt durchgeführt
um zu demonstrieren, dass das erfindungsgemäße Verfahren spezifisch P450
molekulare Spezies unterscheiden kann. Die Expression der P450 molekularen
Spezies in Geweben der Nebennieren, Leber, fötalen Leber, Dünndarm,
Nieren, Lunge, Gehirn, Prostatadrüse, Hoden, Uterus und Plazenta
wurden durch das erfindungsgemäße Verfahren
getestet, auf dieselbe Weise wie in Testbeispiel 1. Die erhaltenen
Ergebnisse werden mit den in der Literatur angegebenen Ergebnissen
verglichen.
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GAPDH
(Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase) wurde als innerer Standard
verwendet und der Test wurde im Triplikat durchgeführt.
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Die
Gesamt-RNA-Pools der Gewebe wurden von Clontech Laboratories, Inc.
erworben.
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Die
Gesamt-RNA-Konzentration betrug 20.000 pg Gesamt-RNA/50 μl Reaktionslösung für die für die Herstellung der Kalibrierungskurven
verwendeten Gewebe und 100.000 pg Gesamt-RNA/50 μl Reaktionsmischung für die anderen
Gewebe.
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Die
Tabellen 3 und 4 zeigen die Ergebnisse. Die Tabellen zeigen auch
die Charakteristika (Poolzahl, Alter, Geschlecht, Rasse und Todesursache)
der Ableitungen der Gesamt-RNAs. In den Tabellen bedeutet "ND" weniger als die
Quantifizierungsgrenze.
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- * Ziel der gegenwärtigen
Erfindung
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- * Ziel der gegenwärtigen
Erfindung
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- * Ziel der gegenwärtigen
Erfindung
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- * Ziel der gegenwärtigen
Erfindung
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Die
in den Tabellen dargestellten Ergebnisse wurden mit denjenigen verglichen,
die durch Techniken aus dem Stand der Technik erhalten wurden, die
in den folgenden Dokumenten 1 bis 5 dargestellt sind und es erwies
sich, dass sie im wesentlichen damit korrelieren. Weiterhin können molekulare
Spezies, die durch die Techniken des Standes der Technik nicht nachgewiesen
werden können,
durch das erfindungsgemäße Verfahren
nachgewiesen werden. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erreichten Ergebnisse
zeigen gewebsspezifische Expressionsmuster, die nicht miteinander überlappen.
So wurde demonstriert, dass das erfindungsgemäße Verfahren individuell P450
molekulare Spezies quantifizieren kann.
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- Dokument 1: Drug Metabolism and Disposition
27, 804–809
(1999)
- Dokument 2: Exp. Toxic. Pathol., 51, 412–417 (1999)
- Dokument 3: Biochemical Pharmacology, 52, 379–383 (1996)
- Dokument 4: Biochemical Pharmacology, 57, 1407–413 (1999)
- Dokument 5: Pharmacology & Therapeutics,
84, 429–445
(1999).
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Gewerbliche
Anwendbarkeit
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum einfachen und schnellen
Nachweis und zur Quantifizierung von menschlichen P450 molekularen
Spezies individuell in Echtzeit unter denselben PCR-Reaktionsbedingungen
bereit und Sonden und Primer zur Verwendung in den Verfahren. Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist auf dem klinischen und medizinischen Gebiet nützlich.
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