DE60132335T2

DE60132335T2 - Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Zielmolekülen unter Verwendung eines enzymverknüpften Sondeneinfangtests sowie geeignetes Testsystem dafür

Info

Publication number: DE60132335T2
Application number: DE60132335T
Authority: DE
Inventors: Albert Cheung-Hoi Kowloon Yu; Lok-Ting Kowloon Lau; Richard Anthony Kowloon Collins; Ka-Yan Kowloon Chan; Lung-Sang Kowloon Ko; Sau-Wah Kowloon Lin
Original assignee: Hong Kong DNA Chips Ltd
Current assignee: Hong Kong DNA Chips Ltd
Priority date: 2001-11-09
Filing date: 2001-11-09
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2021-11-10
Also published as: EP1310565A1; ATE383441T1; EP1310565B1; DE60132335D1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäure-Zielmolekülen, vor allem amplifizierten Nukleinsäureprodukten nach Amplifikation auf Nukleinsäuresequenzbasis (NASBA) unter Verwendung eines enzymverknüpften Sondeneinfangtests nach Anspruch 1, sowie einen Kit dafür nach Anspruch 15.
Stand der Technik
Für den Nachweis von Nukleinsäuren wurden bereits viele Techniken beschrieben. Zu diesen gehören Techniken, die auf der Absorptionscharakteristik des Nukleinsäuremoleküls (z. B. dem Verhältnis der Absorptionen bei 260 nm und 280 nm), der Fähigkeit der Nukleinsäure, mit verschiedenen Farbstoffen und interkalierenden Agentien (z. B. Ethidiumbromid, Propidiumiodid) und der Fähigkeit der Nukleinsäure, an verschiedene Oberflächen zu binden (z. B. Nylon) beruhen. Dabei liegt der Schlüssel für einen erfolgreichen Nachweis in der Möglichkeit, spezifische Bereiche der Nukleinsäure um das zig Hundertfache zu amplifizieren. Es wurden bereits mehrere Verfahren beschrieben, die die Amplifikation von Nukleinsäure-Zielmolekülen gestatten (z. B. unter anderem die Polymerasekettenreaktion (PCR), die Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR), der verzweigte-DNA-Signalamplifikationstest sowie NASBA).
Denaturierte einzelsträngige DNA oder RNA besitzt die Eigenschaft mit einer komplementären Oligonukleotidsonde zu hybridisieren, wobei diese Eigenschaft sich in der Molekularbiologie als besonders nützlich erwiesen hat. Diese Eigenschaft wurde in Techniken, wie z. B. NASBA, ausgenutzt.
Bei der NASBA handelt es sich um ein Verfahren auf Enzymbasis zur Amplifikation von Nukleinsäure (Romano et al., 1996, Clin. Lab. Med. 16(1), 89–103). Die Technik eignet sich insbesondere zur Amplifikation einzelsträngiger RNA und konnte erfolgreich beim Nachweis zahlreicher unterschiedlicher RNA- und DNA-Viren, Bakterien, Pilze, Parasiten und Cytokine eingesetzt werden. So sind beispielsweise NASBA-Vorschriften für das menschliche Immunschwächevirus Typ 1 (Romano et al., 1996), Affenimmunschwächevirus (Romano et al., 2000, J. Virol. Methods 86(1), 61–70), das Cytomegalovirus (Blok et al., 1999, Transplant. Proc. 31(1–2), 308–309), das Hepatitis-C-Virus (Damen et al., 1999, J. Virol. Methods 82(1), 45–54), das Epstein-Barr-Virus (Hayes et al., 1999, Mol. Pathol. 52(2), 97–103), Masern (Chadwick et al., 1998, J. Virol. Methods 70(1), 59–70), Varicella-Zoster (Mainka et al., 1998, J. Med. Virol. 56(1), 91–98), das menschliche Rhinovirus (Samuelson et al., 1998, J. Virol. Methods 71(2), 197–209), das menschliche Papillomavirus Typ 16 (Smits et al., 1995, J. Virol. Methods 54(1), 75–81), das „Potato Leafroll"-Virus (Leone et al., 1997, J. Virol. Methods 66(1), 19–27), Salmonella enterica (Simkins et al., 2000, Lett. Appl. Microbiol. 30(1), 75–79), Chlamydia trachomatis (Mahony et al., 2001, J. Clin. Microbiol. 39(4), 1429–1435), Campylobacter jejuni (Uyttendaele et al., 1997, Int. J. Food Microbiol. 37(1), 13–20), Mycobacterium leprae (van der Vliet et al., 1996, Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 64(4), 396–403), Listeria monocytogenes (Uyttendaele et al., 1995, Int. J. Food Microbiol. 27(1), 77–89), Candida spp (Borst et al., 2001, Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 39(3), 155–160), Aspergillus spp (Loeffler et al., 2001, J. Clin. Microbiol. 39(4), 1626–1629), Plasmodium falciparum (Schoone et al., 2000, J. Clin. Microbiol. 38(11), 4072–4075), die aus Makrophagen stammende Chemokin-mRNA (Romano et al., 2001, Cytokine 13(6), 325–333), die Gewebefaktor-mRNA (van Deursen et al., 1999, Nucleic Acids Res. 25(17), e15) und die menschliche TNF-Alpha-mRNA (Darke et al., 1998, J. Immunol. Methods 212(1), 19–28), um nur einige zu nennen, beschrieben. Die NASBA-Technik läßt sich auf viele andere Situationen anwenden, bei denen eine Nukleinsäureamplifikation erforderlich ist. Bei dem Verfahren, wie es im Handel erhältlich ist, wird die amplifizierte Zielnukleinsäure mit einer mit dem elektrochemilumineszenten (ECL-)Molekül Rutheniumbipyridin markierten Oligonukleotidsonde nachgewiesen (z. B. Romano et al., 1996). Allerdings erfordert die ECL-Technik die Verwendung einer speziellen Nachweisvorrichtung, die relativ teuer, nicht allgemein verfügbar ist, einen relativ niedrigen Probendurchsatz aufweist und relativ kostenaufwendig in der Unterhaltung ist. Ein alternatives Verfahren zum Nachweis der amplifizierten Nukleinsäureprodukte aus der NASBA unter Verwendung günstigerer und leichter verfügbarer Nachweisverfahren und Vorrichtungen mit hohem Durchsatz wäre vorteilhaft. Ein solches Verfahren stellt der enzymverknüpfte Sondeneinfangtest dar, der sich im 96-Loch-Mikrotiterplattenformat durchführen läßt. Standardmikrotiterplatten-Spektrophotometer sind für Nachweiszwecke leicht erhältlich. Eines der Hauptmerkmale von NASBA ist der Einbau einer zu einer gewählten Oligonukleotidnachweissonde komplementären Oligonukleotidsequenz während des Amplifikationsvorgangs. Dies gestattet dem Anwender, amplifizierte Nukleinsäure auf hochspezifische Weise nachzuweisen.
Zu den möglichen Zielen für die NASBA gehören Organismen wie z. B. Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten. Influenzaviren vom Typ A infizieren verschiedene Tiere, einschließlich Schweine, Pferde, Meeressäuger und Vögel, sowie den Menschen. Phylogenetische Untersuchungen von Grippeviren vom Typ A zeigten Spezies-spezifische Stammbäume viraler Gene. Es wurde die Theorie aufgestellt, daß Wasservögel die Quelle für alle Grippeviren in anderen Spezies darstellen. Ein Typ-A-Grippevirusgenom umfaßt acht einzelsträngige RNA-Gensegmente, die für zehn unterschiedliche Proteine codieren (Swayne und Suarez, 2000, Rev. Sci. Tech. 19(2), 463–482). Die Proteine lassen sich in Oberflächen- und innere Proteine einteilen. Zu den Oberflächenproteinen gehören Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und Matrix-2-Proteine. Die Proteine HA und NA liefern die wichtigsten Antigenstellen für die Erzeugung einer schützenden Immunantwort, vorwiegend in Form eines neutralisierenden Antikörpers. Unter diesen Proteinen gibt es eine große antigene Variation, wobei 15 HA- und neun NA-Subtypen erkannt wurden, und zwar bezogen auf Tests für Hämagglutinierungsinhibition (HI) bzw. Neuraminidaseinhibition (NI).
1997 wurde Geflügel in Hong Kong mit der hochpathogenen H5N1-Vogelgrippe infiziert. Das Virus trug zum Tod von sechs Personen bei. Als Bekämpfungsmaßnahme wurde das gesamte Geflügel in Hong Kong vernichtet. Das Virus kehrte 2001 zurück und führte zu großer wirtschaftlicher Not bei Geflügelzüchtern und -händlern. Es besteht ein Bedarf an einem Routine-Screening auf H5-Virus in Tieren, insbesondere Geflügel, als Hilfe bei der Verhinderung der Ausbreitung des Virus. Somit würde ein Verfahren zum genauen Nachweis des Vorhandenseins von H5 in Geflügelproben der Geflügelindustrie entscheidende Vorteile bringen, indem infizierte Vögel schneller als mit existierenden Verfahren auf Antikörperbasis identifiziert würden.
Die Hämagglutinin-RNA wird in ein einziges Vorläuferpolypeptid mit der Bezeichnung HA0 und einer Länge von ungefähr 556 Resten translatiert (Zambon, 1999, J. Antimicrob. Chemother. 44 (Suppl. B), 3–9). Ein Nachweisverfahren, bei dem der gesamte oder ein Teil des konservierten Bereichs des Grippe-Hämagglutinin-Gens genutzt würde, wäre ein geeignetes Mittel zum Nachweis des Vorhandenseins bzw. der Abwesenheit spezifischer Subtypen des Grippevirus A in einer biologischen Probe.
Für die Virusidentifizierung werden zur Zeit viele Verfahren eingesetzt, einschließlich Zellkultur, Hämagglutinininhibition, Fluoreszenzantikörper und Enzymimmuntest, sowie die Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR). Allerdings teilen alle diese Verfahren die gleichen Probleme – sie besitzen eine relativ geringe Empfindlichkeit und geringe Spezifität. Darüber hinaus kann die Nachweiszeit für routinemäßige Nachweiszwecke zu lang sein, und außerdem sind derartige Verfahren relativ schwierig anzuwenden. Weiterhin dürfte die zugrundeliegende genetische Beschaffenheit eines Ziels nicht unmittelbar erhältlich sein, da das Ziel immundiagnostischer Tests üblicherweise ein spezifisches Protein ist. Schließlich hängt die erste Herleitung von Antikörpern letztendlich von der Antigenität des Proteins im immunen Wirtstier ab, weswegen Kreuzreaktivität auftreten kann.
Zwar stellt die Viruskultur ein genaues und kostengünstiges Nachweisverfahren dar, doch ist es relativ arbeitsaufwendig und erfordert viel Raum zur Inkubation. Der Kultivierungsprozeß kann langsam sein und die Forderung nach einer täglichen Inspektion nicht erfüllen. Darüber hinaus können von der Viruskultur die Nachweisergebnisse nicht direkt erhalten werden, und man ist auf eine weitere Bestätigung durch andere Nachweisverfahren, die sehr teuer sein können, angewiesen.
Enzymverknüpfte Sondeneinfangtestvorschriften sind im allgemeinen einfach anzuwenden, wobei Materialien und Geräte leicht verfügbar sind. Bei dem enzymverknüpften Sondeneinfangtest handelt es sich um eine robuste Technik, die viele Anwendungen findet. Die Hauptverwendung eines enzymverknüpften Sondeneinfangtests besteht im Nachweis von Proteinantigenen.
Zu spezifischen Veröffentlichungen, die für diese Anmeldung relevant sind, gehört die US5783391 (Rossi et al.), in der ein Nachweisverfahren auf einer NASBA-Basis beschrieben wird. Allerdings wird in der US5783391 kein auf einem enzymverknüpften Sondeneinfangtest beruhender Nachweisschritt eingesetzt. Darüber hinaus wird in zahlreichen Veröffentlichungen über die Verwendung enzymverknüpfter Sondeneinfangtests beim Nachweis zahlloser unterschiedlicher biologischer Elemente berichtet. In keinem dieser Dokumente wird das Verfahren der vorliegenden Anmeldung noch die Verwendung der Methodik der US5783391 mit einem Nachweissystem auf Basis eines enzymverknüpften Sondeneinfangtests gelehrt.
Im US-Patent US 5,639,609 wird ein Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren durch Hybridisieren der Nukleinsäure mit einer Fängersonde beschrieben.
Ein Verfahren zum schnellen Nachweis spezifischer Nukleinsäureziele in einem Format mit hohem Durchsatz, wie z. B. ein enzymverknüpfter Sondeneinfangtest, ist wünschenswert.
Aufgabe der Erfindung
Eine Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zum schnellen Nachweis von Nukleinsäure-Zielmolekülen, bei denen es sich um die durch NASBA amplifizierten Reaktionsprodukte des Subtyps H5 des Vogelgrippe-A-Virus handelt, in einem Format mit hohem Durchsatz und hoher Empfindlichkeit.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines benutzerfreundlichen Kits zum schnellen Nachweis von Nukleinsäure-Zielmolekülen, bei denen es sich um die durch NASBA amplifizierten Reaktionsprodukte des Subtyps H5 des Vogelgrippe-A-Virus handelt, in einem Format mit hohem Durchsatz und hoher Empfindlichkeit.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis eines Nukleinsäure-Zielmoleküls bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte:

(A) Einfangen des Nukleinsäuremoleküls mit einer Fängersonde, um das Nukleinsäure-Zielmolekül zu immobilisieren, wobei die Fängersonde: (i) eine zum Nukleinsäure-Zielmolekül wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz und (ii) eine Markierung für die Bindung an einen Immobilisator enthält;
(B) Gestatten der Bindung einer Nachweissonde an das immobilisierte Nukleinsäure-Zielmolekül in Schritt (A), wobei die Nachweissonde: (i') eine zum Nukleinsäure-Zielmolekül wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz und (ii') eine Markierung für die Bindung an einen Signalerzeuger enthält;
(C) Erzeugen und Nachweisen des Signals, wobei es sich bei dem Nukleinsäure-Zielmolekül um das NASBA-amplifizierte Reaktionsprodukt des Subtyps H5 des Vogelgrippe-A-Virus handelt, wobei die Primer für NASBA eine zu einem konservierten Teil des Hämagglutinin-Gens des Subtyps H5 des Vogelgrippe-A-Virus komplementäre Nukleinsäuresequenz enthalten, der innerhalb von jeweils 100 Nt vor und hinter der HA1/HA2-Schnittstelle liegt.

Vorzugsweise werden die Schritte (A) und (B) gleichzeitig durchgeführt.
Ebenso wird durch die vorliegende Erfindung ein Kit zum Nachweis eines Nukleinsäure-Zielmoleküls bereitgestellt, der folgendes umfaßt: (A) eine Fängersonde zum Einfangen des Nukleinsäure-Zielmoleküls, die (i) eine zum Nukleinsäure-Zielmolekül wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz und (ii) eine Markierung für die Bindung an einen Immobilisator enthält;

(B) eine Nachweissonde zum Nachweisen des Nukleinsäure-Zielmoleküls, die (i') eine zum Nukleinsäure-Zielmolekül wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz und (ii') eine Markierung für die Bindung an einen Signalerzeuger enthält; und
(C) Primer für NASBA, die eine zu einem konservierten Teil des Hämagglutinin-Gens des Subtyps H5 des Vogelgrippe-A-Virus wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz enthalten, der innerhalb von jeweils 100 Nt vor und hinter der HA1/HA2-Schnittstelle liegt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In 1 ist das Fließdiagramm der gesamten Verfahrensweisen des Nachweises von aus einer NASBA-Reaktion erhaltenen Nukleinsäure-Zielmolekülen mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung dargestellt.
In 2 ist das allgemeine Schema zum Nachweis von aus einer NASBA-Reaktion erhaltenen Nukleinsäure-Zielmolekülen mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung dargestellt.
In 3 sind die ausführlichen Verfahrensweisen zum Nachweis von aus einer NASBA-Reaktion erhaltenen Nukleinsäure-Zielmolekülen mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung dargestellt.
In 4 und 5 sind die Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 und 2 dargestellt, die in den DNA-Molekülen des Nachweissystems für Nachweiszwecke verwendet werden.
Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Im folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mit Bezug auf die Figuren beschrieben. Bei der Liste 1 handelt es sich um eine Bestandteilliste, so daß auf die Bezugsziffern in den Figuren leicht Bezug genommen werden kann.

Bezugsziffer	Beschreibung
10	Ziel-RNA-Molekül
12	Fängersonde
14	Nachweissonde
20	Biotin
22	Digoxigenin
24	Mikrotiterplatte
26	Streptavidinbeschichtung
28	Signalerzeuger

Durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis eines Nukleinsäure-Zielmoleküls bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte:

(A) Einfangen des Nukleinsäuremoleküls mit einer Fängersonde, um das Nukleinsäure-Zielmolekül zu immobilisieren, wobei die Fängersonde
(i) eine zum Nukleinsäure-Zielmolekül wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz und
(ii) eine Markierung für die Bindung an einen Immobilisator enthält;
(B) Gestatten der Bindung einer Nachweissonde an das immobilisierte Nukleinsäure-Zielmolekül in Schritt (A), wobei die Nachweissonde
(i') eine zum Nukleinsäure-Zielmolekül wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz und
(ii') eine Markierung für die Bindung an einen Signalerzeuger enthält;
(C) Erzeugen und Nachweisen des Signals, wobei es sich bei dem Nukleinsäure-Zielmolekül um das NASBA-amplifizierte Reaktionsprodukt des Subtyps H5 des Vogelgrippe-A-Virus handelt, wobei die Primer für NASBA eine zu einem konservierten Teil des Hämagglutinin-Gens des Subtyps H5 des Vogelgrippe-A-Virus komplementäre Nukleinsäure-sequenz enthalten, der innerhalb von jeweils 100 Nt vor und hinter der HA1/HA2-Schnittstelle liegt.

Die Nukleinsäure umfaßt DNA oder RNA, vorausgesetzt, daß die Konzentration des Nukleinsäure-Zielmoleküls für den Nachweis hoch genug ist. Beispielsweise kann es sich bei dem Nukleinsäure-Zielmolekül um ein über ein NASBA-Verfahren amplifiziertes RNA-Produkt handeln. NASBA ist ein Verfahren auf Enzymbasis zur Amplifikation von Nukleinsäure. Die Technik eignet sich insbesondere zur Amplifikation einzelsträngiger RNA und konnte erfolgreich beim Nachweis zahlreicher unterschiedlicher RNA- und DNA-Viren, Bakterien, Pilze, Parasiten und Cytokine eingesetzt werden. Bei dem Nukleinsäure-Zielmolekül handelt es sich um das NASBA-amplifizierte Nukleinsäuremolekül des Subtyps H5 des Vogelgrippevirus. Bei den in der obenerwähnten NASBA-Reaktion verwendeten Primern handelt es sich um NASBA-PP1 und NASBA-PP2, erhalten von Gibco BRL, Life Technologies Inc. (NY, USA).
Die erfindungsgemäße Fängersonde umfaßt:

(i) eine zum Nukleinsäure-Zielmolekül wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz und
(ii) eine Markierung für die Bindung an einen Immobilisator; wobei es sich bei der zum Nukleinsäure-Zielmolekül wenigstens teilweise komplementären Nukleinsäuresequenz um eine Sequenz handelt, die für die Bindung an das Nukleinsäure-Zielmolekül spezifisch konstruiert ist. Es gibt keine weiteren Beschränkungen für die Sequenz, vorausgesetzt, daß sie an das Zielnukleinsäuremolekül binden kann. Die Bindung bedeutet hier allgemein, daß die Fängersonde mit dem Zielnukleinsäuremolekül unter herkömmlichen, im Fachgebiet allgemein bekannten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren kann. So hybridisiert die Fängersonde beispielsweise mit dem Nukleinsäure-Zielmolekül unter einer stringenten Hybridisierungsbedingung.

Die Fängersonde läßt sich auf der Grundlage der bekannten Sequenz des Nukleinsäure-Zielmoleküls mit einem herkömmlichen Verfahren, wie beispielsweise einem chemischen Syntheseverfahren, synthetisieren.
In einer Ausführungsform umfaßt die Fängersonde eine in der SEQ ID Nr. 1 angegebene Sequenz, die zum Nachweis des Subtyps H5 des Vogelgrippevirus verwendet wird. Die in SEQ ID Nr. 1 angegebene Sequenz ist von den Erfindern konstruiert und wird kommerziell von der Firma Bioasia Co. (Shanghai, China) synthetisiert.
Darüber hinaus umfaßt die Fängersonde auch eine Markierung. Vorzugsweise ist die Markierung dabei an einem Ende der Sequenz der Sonde gebunden. Stärker bevorzugt ist die Markierung kovalent an das 5'-Ende der Sequenz der Sonde gebunden. Bei der Markierung der Fängersonde kann es sich um eine der im Fachgebiet allgemein bekannten Markierungen handeln. So läßt sich beispielsweise die Fängersonde mit einer Markierung markieren, die aus der Gruppe Biotin, Streptavidin, Fluoreszein, Protein A oder einem anderen zur Durchführung der gleichen Funktion fähigen Molekül ausgewählt ist. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Markierung um eine am 5'-Ende der Sequenz der Fängersonde gebundene Biotinmarkierung.
Bei dem Immobilisator handelt es sich üblicherweise um ein Festphasenmaterial, das von einem Liganden bedeckt ist, der an die Markierung der Fängersonde binden kann. Vorzugsweise wird die Fängersonde mit einem Biotin markiert, wobei es sich bei dem Immobilisator um eine Mikrotiterplatte oder einen Streifen handelt, die bzw. der mit dem Liganden spezifisch gegen die Markierung, d. h. Streptavidin, bedeckt ist.
Anschließend wird der Reaktionsbehälter bei Raumtemperatur etwa 30 min bis 2 Stunden, vorzugsweise 1 Stunde, unter Schütteln auf einer Schüttelplattform inkubiert. Bei dem Reaktionsbehälter handelt es sich um einen Behälter, der sich einfach an einem herkömmlichen Spektrophotometer, vorzugsweise einem üblichen ELISA Reader, verwenden läßt. Beispielsweise handelt es sich bei dem Container um ein Mikroröhrchen, eine 24-Loch-Mikrotiterplatte oder eine 96- Loch-Mikrotiterplatte. In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Behälter um eine 96-Loch-Mikrotiterplatte.
Vorzugsweise wird der den Komplex aus der Fängersonde und dem Nukleinsäure-Zielmolekül enthaltende Reaktionsbehälter mit einer Pufferlösung, beispielsweise einem Hybridisierungspuffer, mehrere Male gewaschen, um so die anderen, im Reaktionsgemisch vorhandenen Substanzen abzutrennen, die die erfindungsgemäße Reaktion stören könnten, beispielsweise die weitere Nukleinsäure neben der Zielnukleinsäure, die nicht gebundenen Fängersonden usw.
Nach der Immobilisierung des Nukleinsäure-Zielmoleküls an einen Immobilisator durch die Einwirkung der Fängersonde wird der Reaktionsansatz der Bindung an eine Nachweissonde unterzogen, wobei die Nachweissonde eine zum Nukleinsäure-Zielmolekül wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz sowie eine Markierung zur Bindung an einen Signalerzeuger umfaßt.
Bei der Sequenz der Nachweissonde handelt es sich um eine Sequenz, die spezifisch für die Bindung an wenigstens einen Teil des Nukleinsäure-Zielmoleküls konstruiert ist. Die Herstellung der Sequenz kann mit einem herkömmlichen Verfahren im Stand der Technik, wie z. B. einem chemischen Syntheseverfahren, durchgeführt werden. Vorzugsweise wird zum Nachweis von NASBA-Reaktionsprodukten eine Sequenz spezifisch in die amplifizierten Produkte eingeführt, so daß die amplifizierte Nukleinsäure eine Sequenz umfaßt, die zur Sequenz der Nachweissonde komplementär ist. Der Vorteil des obigen Verfahrens liegt darin, daß die Sequenz einer kommerziellen Sonde in die amplifizierten Produkte eingeführt werden kann, so daß sich eine kommerzielle Sonde verwenden läßt und eine neue Sonde nicht synthetisiert zu werden braucht. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die Sequenz der Nachweissonde eine in der SEQ ID Nr. 2 angegebene Sequenz.
Bei der Markierung der Nachweissonde kann es sich um beliebige geeignete Marker, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind, handeln, wie z. B. Digoxigenin (DIG), Biotin, Streptavidin u. a. Bei dem Signalerzeuger kann es sich um ein radioaktives (z. B. ³²P), chemilumineszierendes (z. B. Luciferin/Luciferase), fluoreszierendes (z. B. Fluoreszein), enzymatisches (z. B. alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, Beta-Glucuronidase) oder elektrolumineszierendes Molekül (z. B. Rutheniumbipyridin) handeln. In einer Ausführungsform umfaßt der Signalerzeuger einen enzymkonjugierten Anti-DIG-Antikörper (in geeigneter Weise im Hybridisierungspuffer verdünnt).
Anschließend wird der Behälter bei Raumtemperatur etwa mehrere Minuten bis mehrere Stunden, vorzugsweise 30 min, unter Schütteln inkubiert.
Vorzugsweise wird der nicht gebundene Signalerzeuger, wie z. B. der nicht gebundene Antikörper, durch mehrmaliges Spülen des Reaktionsbehälters mit einem Puffer, wie z. B. 1 × Trisgepufferte Kochsalzlösung (1 × TBS) abgetrennt. Vorzugsweise wird die Spülung noch einmal wiederholt.
Vorzugsweise werden die Fängersonde und die Nachweissonde zusammen zu den im Behälter enthaltenen Nukleinsäure-Zielmolekülen gegeben.
Anschließend wird die Substratlösung zu dem Reaktionsansatz gegeben. Nach einer entsprechend langen Inkubationszeit, vorzugsweise 30 min unter Schütteln, wird die Enzymreaktion durch Zugabe einer Stopplösung gestoppt. In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Signalerzeuger um eine Anti-DIG-alkalische Phosphatase. Das Substrat ist p-Nitrophenylphosphat und die Stopplösung 3M NaOH.
Anschließend wird das Signal an einem üblichen Spektrophotometer, wie z. B. einem ELISA Reader, abgelesen.
Durch die vorliegende Erfindung wird ebenso ein Kit zur Durchführung des obenerwähnten Verfahrens bereitgestellt. Dabei umfaßt der Kit: (A) eine Fängersonde zum Einfangen des Nukleinsäure-Zielmoleküls, die (i) eine zum Nukleinsäure-Zielmolekül wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz und (ii) eine Markierung für die Bindung an einen Immobilisator enthält; (B) eine Nachweissonde zum Nachweisen des Nukleinsäure-Zielmoleküls, die (i') eine zum Nukleinsäure-Zielmolekül wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz und (ii') eine Markierung für die Bindung an einen Signalerzeuger enthält; und
(C) Primer für NASBA, die eine zu einem konservierten Teil des Hämagglutinin-Gens des Subtyps H5 des Vogelgrippe-A-Virus wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz enthalten, der innerhalb von jeweils 100 Nt vor und hinter der HA1/HA2-Schnittstelle liegt. Vorzugsweise umfaßt der Kit auch weitere Komponenten, wie z. B. Enzymsubstrat und/oder Stopplösung und/oder Hybridisierungspuffer.
Die Sequenzen der Fängersonde und der Nachweissonde sind spezifisch auf der Grundlage des spezifischen Nukleinsäure-Zielmoleküls konstruiert. Das Enzymsubstrat und die Stopplösung ändern sich nach dem in der Reaktion verwendeten Signalerzeuger. Als Hybridisierungspuffer dient ein im Stand der Technik allgemein verwendeter Puffer wie z. B. 20 × SSPE.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden nicht beschränkenden Beispiele veranschaulicht. Dabei sollte angemerkt werden, daß auf das folgende Beispiel und die folgenden Verfahren verschiedene Änderungen und Modifikationen angewandt werden könnten, ohne daß dabei vom Umfang der vorliegenden Erfindung abgewichen wird. Daher sollte angemerkt werden, daß das folgende Beispiel lediglich als zur Veranschaulichung dienend interpretiert und keinesfalls eine Beschränkung darstellen soll.
Durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis von NASBA-amplifizierten Reaktionsprodukten des Subtyps A5 des Vogelgrippe-A-Virus unter Verwendung eines enzymverknüpften Sondeneinfangtests der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
Die Konzentration des Grippevirus A oder eines anderen Organismus in einer biologischen Probe, beispielsweise Blut, kann sehr niedrig sein, so daß der Nachweis des Vorhandenseins der RNA des Organismus nicht direkt an der biologischen Probe durchgeführt werden kann. Um die Anzahl der RNA-Moleküle des infektiösen Organismus für Nachweiszwecke ausreichend zu erhöhen, wird eine geeignete Amplifikationstechnologie benötigt. Es ist bekannt, daß die Amplifikation auf Nukleinsäuresequenzbasis (NASBA) eine flexible Technologie darstellt und sich insbesondere für die Amplifikation von RNA eignet. Die amplifizierten RNA-Moleküle können dann mit einer geeigneten Technologie nachgewiesen werden. Beim enzymverknüpften Sondeneinfangtest handelt es sich um ein schnelles, hochempfindliches und hochspezifisches Verfahren, das zum Nachweis spezifischer Nukleinsäureziele nach deren Amplifikation durch NASBA angewandt werden kann. Dabei lassen sich Ergebnisse bereits nach einem Tag erhalten.
Das Vogelgrippevirus enthält sein genetisches Material in Form von acht Einzelsträngen von Ribonukleinsäure (RNA). Die RNA aller Mitglieder der Familie Vogelgrippevirus A enthält die für deren Reproduktion notwendigen Gene, wobei eines der essentiellen Gene Hämagglutinin genannt wird. Dieses Gen weist eine Länge von ungefähr 1756 Nukleotiden auf, wobei die Nukleotide vom 5'-Ende des Moleküls aus gezählt werden.
In 1 sind die Gesamtverfahrensweisen zum Nachweis von spezifischen Nukleinsäurezielen mit dem Nachweiskit dargestellt. Wie in 1 gezeigt, werden die Zielnukleinsäuremoleküle, die in Form eines einzelnen Strangs RNA vorliegen, zunächst aus einer biologischen Probe extrahiert. Zu den kompatiblen Arten von biologischen Proben können Blut, Serum/Plasma, mononukleäre periphere Blutzellen/periphäre Blutlymphozyten (PBMC/PBL), Speichel, Uron, Fäzes, Rachenabstriche, Abstriche von Hautläsionen, Liquor, Zervixabstriche, Eiterproben, Lebensmittelmatrizes und Gewebe aus verschiedenen Körperteilen, einschließlich Hirn, Milz und Leber, gezählt werden. Andere Proben, die hier nicht aufgeführt sind, können ebenso geeignet sein.
Nach Extraktion der Ziel-RNA-Moleküle aus der biologischen Probe kann es sein, daß die Menge an RNA-Molekülen in der Probe nicht ausreicht, um nachgewiesen zu werden. Daher wird ein Teil des RNA-Moleküls mittels NASBA zu einem Zielnukleinsäuremolekül repliziert. Die Zielnukleinsäuremoleküle können dann mit geeigneten Verfahren, beispielsweise einem enzymverknüpften Sondeneinfangtest, nachgewiesen werden.
Nach der Beschreibung der Gesamtverfahrensweisen des erfindungsgemäßen Nachweiskits soll nun jede Verfahrensweise im einzelnen erörtert werden.
Der Nachweis des Ziel-RNA-Moleküls (10) ist in 3 dargestellt. Das Ziel-RNA-Molekül (10) ist in einem Gemisch zusammen mit anderen unerwünschten Bestandteilen, einschließlich den in der ursprünglichen Probe enthaltenen nicht amplifizierten Nukleinsäuren, den zur Erzeugung des Zielmoleküls verwendeten Primern, den nicht umgesetzten Nukleotiden und, ganz besonders wichtig, den nicht gebundenen Nachweismolekülen, enthalten. Daher kann das Ziel-RNA-Molekül (10) von einem Fängermolekül, beispielsweise der Fängersonde (12), immobilisiert werden, so daß die unerwünschten Bestandteile weggewaschen werden können. Die Fängersonde (12) ist in der Lage, an das Ziel-RNA-Molekül (10) zu binden. Dies kann dadurch erreicht werden, daß eine für einen Teil der RNA-Sequenz, der zu der im Ziel-RNA-Molekül (10) codierten Sequenz komplementär ist, codierende Nukleinsäuresequenz mit enthalten ist. Die Fängersonde (12) wird ferner an einen Immobilisator (24) gebunden, der das Ziel-RNA-Molekül (10) immobilisieren kann, so daß andere unerwünschte Bestandteile weggewaschen werden können. Bei dem Immobilisator (24), wie er in 3 dargestellt ist, handelt es sich um eine Mikrotiterplatte bzw. einen Streifen oder eine ähnliche Oberfläche mit Streptavidinbeschichtung.
Um den Nukleinsäurenachweisvorgang zu starten, wird ein Teil der amplifizierten Nukleinsäure aus einer NASBA-Reaktion mit Sondenlösung (mit Fängersonde (12) und Nachweissonde (14)) und Hybridisierungspuffer in einem geeigneten Behälter, beispielsweise einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, gemischt. In dieser Ausführungsform wird die Fängersonde an ihrem 5'-Ende mit Biotin (20) markiert. Als Alternative besteht auch die Möglichkeit, daß Biotin mit einer anderen Markierung, die die gleiche Funktion, d. h. die Immobilisierung des Ziel-RNA-Moleküls, durchführen kann, zu ersetzen, wobei beispielsweise Markierungen, wie z. B. Digoxigenin, Streptavidin, Protein A, verwendet werden können. In diesem Fall muß das Immobilisierungsagens geändert werden, um die Bindung der markierten Fängersonde zu gestatten. Die mit Biotin markierte Fängersonde (12) umfaßt die in der SEQ ID Nr. 1 (4) angegebene DNA-Sequenz. Als Alternative enthält die Fängersonde eine zu einem beliebigen Teil des amplifizierten Ziel-RNA-Moleküls komplementäre Nukleinsäuresequenz. Das Ziel-RNA-Molekül (10) kann durch Bindung an die Nachweissonde (14) nachgewiesen werden. In dieser Ausführungsform ist die Nachweissonde mit Digoxigenin (DIG) (22) markiert. Als Alternative besteht die Möglichkeit, DIG durch andere Markierungen, beispielsweise Biotin, Streptavidin, Fluoreszein, Protein A, oder ein anderes Molekül, das die gleiche Funktion, d. h. Bindung an den Signalerzeuger, durchführen kann, zu ersetzen. Die Sequenz der Nachweissonde (14) kann zu einem beliebigen Bereich des amplifizierten RNA-Produkts (10), dessen Enden durch die zur Amplifikation des Zielmoleküls verwendeten Oligonukleotidprimer definiert sind, komplementär sein. Allerdings kann die Sequenz der Nachweissonde (14) nicht mit der Fängersonde (12) überlappen, da dies sich auf die Wechselwirkung der amplifizierten RNA mit der Fängersonde und umgekehrt auswirken würde.
Wie in 3 gezeigt, kann das Ziel-RNA-Molekül (10) zusammen mit der Nachweissonde (14) immobilisiert werden. Daher braucht hinsichtlich des Zeitpunkts der Zugabe der Fängersonde (12) in den Ansatz keine Beschränkung bestehen. Die Fängersonde (12) kann nach oder vor der Zugabe der Nachweissonde (10) zugegeben werden, solange die Fängersonde (12) vor dem Waschschritt zugegeben wird.
Die mit DIG markierte Nachweissonde (14) umfaßt die in der SEQ ID Nr. 2 (5) angegebenen DNA-Sequenz. Als Alternative kann eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die zum Ziel-RNA-Molekül komplementär ist und die Bindung der Fängersonde nicht stört, als geeignete Nachweissonde dienen.
Die SEQ ID Nr. 1 ist Änderungen unterworfen, falls andere Fängersondennukleinsäuresequenzen verwendet werden. In dieser Ausführungsform erfolgt die Immobilisierung des Ziel-RNA-Moleküls auf einer 96-Loch-Kunststoffmikrotiterplatte (24). Als Alternative besteht die Möglichkeit, die 96-Loch-Mikrotiterplatte durch andere Materialien, beispielsweise 8-Loch-Mikrotiterstreifen oder eine andere Oberfläche, die die gleiche Funktion erfüllen kann, zu ersetzen. Jede zu testende Probe wird in eine separate Vertiefung einer mit Streptavidin beschichteten 96-Loch-Mikrotiterplatte (24) gegeben. Die Mikrotiterplatte (24) mit den zugegebenen Proben wird eine Stunde auf einer Schüttelplattform bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubation gestattet der mit Biotin markierten Fängersonde (12), an die Streptavidinbeschichtung (26) der Mikrotiterplatte (24) zu binden. Darüber hinaus hybridisiert das amplifizierte Nukleinsäure-Zielmolekül (10) aus der NASBA-Reaktion mit der Biotin-markierten Fängersonde (12) und der DIG-markierten Nachweissonde (14) während der Inkubation.
Es ist wichtig, daß eventuell vorhandene nicht gebundene Moleküle (überschüssiges amplifiziertes Nukleinsäure-Zielmolekül (10), nicht gebundene Fängersonde (12) und nicht gebundene Nachweissonde (14) und deren Komplexe) abgetrennt werden, so daß diese den Nachweisvorgang nicht stören. Dementsprechend wird jede Vertiefung der Mikrotiterplatte (24) jeweils mehrmals mit Hybridisierungspuffer gespült.
In dieser Ausführungsform umfaßt der Signalerzeuger (28) einen enzymkonjugierten Anti-DIG-Antikörper. Als Alternative kann es sich bei dem Signalerzeuger (28) um ein radioaktives (z. B. ³²P), chemilumineszierendes (z. B. Luciferin/Luciferase), fluoreszierendes (z. B. Fluoreszein), enzymatisches (z. B. alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, Beta-Glucuronidase) oder elektrolumineszierendes Molekül (z. B. Rutheniumbipyridin) handeln. Der Nachweisvorgang erfordert, daß der enzymkonjugierte Anti-DIG-Antikörper (in geeigneter Verdünnung im Hybridisierungspuffer) mit dem in jeder Vertiefung der mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatte (24) vorhandenen immobilisierten Nukleinsäurekomplex inkubiert wird. Um die maximale Wechselwirkung des Antikörpers mit seinem Zielantigen zu gestatten, wird die die Antikörperlösung enthaltende Mikrotiterplatte (24) 30 Minuten auf einer Schüttelplattform bei Raumtemperatur inkubiert.
Dabei ist wichtig, daß nicht gebundene Antikörper abgetrennt werden, da diese die Nachweisreaktion stören würden. Dementsprechend wird die Mikrotiterplatte (24) mehrmals mit 1 × Tris-gepufferter Kochsalzlösung (1 × TBS) gespült.
Das amplifizierte Nukleinsäure-Zielmolekül (10) wird durch Zugabe von Substratlösung zu jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte (24) nachgewiesen. Die Mikrotiterplatte (24) mit zugegebener Substratlösung wird dann 30 Minuten auf einer Schüttelplattform bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ablauf der entsprechenden Inkubationszeit wird die Enzymreaktion durch Zugabe von Stopplösung zu jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte (24) gestoppt. Das Substrat wird durch das konjugierte Enzym umgewandelt, so daß sich ein Produkt ergibt, das in einer geeigneten Nachweisvorrichtung, beispielsweise einem Mikrotiterplattenspektrophotometer, nachgewiesen werden kann. Somit wird unter Standardbedingungen nur von Mikrotiterplattenvertiefungen, die durch die Fängersonde immobilisierte und an die Nachweissonde hybridisierte RNA-Zielmoleküle enthalten, ein Signal produziert, das größer als das Hintergrundsignal ist.
Da die Nukleinsäuresequenzen der Fängersonde (12) und der Nachweissonde (14) nun bekannt sind, ist dem Fachmann die Synthese der entsprechenden komplementären DNA-Moleküle ersichtlich. Solche komplementären DNA-Moleküle können als Matrizen bei der Synthese der Fängersonde (12) und Nachweissonde (14) eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden nicht beschränkenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiele
Beispiel 1: Nachweis des NASBA-amplifizierten Produkts des Subtyps H5 des Vogelgrippevirus A
Material und Methoden
a. Viren
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Viren wurden durch Inokulation in der allantoischen Kavität von 9–11 Tage alten Hühnerembryos (Anon, 1992) am Castle Peak Verternary Lab (Agriculture, Fisheries and Conservation Department, Hong Kong SAR, China) isoliert.
b. Sequenzgegenüberstellung und Primerauswahl
Die Nukleotidsequenzen des Hämagglutiningens aus etwa 50 Isolaten des Subtyps H5 von Vogelgrippevirus A, die von GenBank erhalten wurden, wurden unter Verwendung des Softwareprogramms BioEdit (Hall, 1997) vergleichend gegenübergestellt. Für die Primerauswahl wurden konservierte Sequenzen innerhalb von 100 Nt auf beiden Seiten der HA1/HA2-Schnittstelle verwendet.
c. Nukleinsäureisolierung
Kurz gesagt wurde ein Volumen klinisches Präparat (Vollblut, Plasma, Serum, Sputum, Zellen, Gewebehomogenat, Liquor usw.) zu neun Volumen Lysepuffer gegeben. Die Probe wurde vorsichtig durch Verwirbeln gemischt. Dadurch wurde infektiöses Virus inaktiviert und die Nukleinsäuren wurden durch Denaturierung der Nukleasen stabilisiert. Das Lysat wurde mit säurebehandeltem Siliciumdioxid (50 μl, 1 mg/ml) versetzt. Man ließ die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen, wobei alle zwei Minuten stark verwirbelt wurde. Die freigesetzten Grippevirus-RNA-Segmente banden an das Siliciumdioxid und sammelten sich in der Festphase an. Der Komplex aus Siliciumdioxid und Nukleinsäure wurde 30 Sekunden bei 10 000 g durch Zentrifugation sedimentiert und wiederholt gewaschen (zweimal mit 5,25 M CuSCN, 50 mM Tris, pH 6,4, 20 mM EDTA; zweimal mit 70%igem Ethanol und einmal mit Aceton). Das Aceton wurde von dem sedimentierten Siliciumdioxid durch 10minütiges Erwärmen der Probe in einem 56°C warmen Wasserbad abgedampft. Das trockene Pellet wurde mit DEPC-behandeltem Wasser (50 μl) versetzt und 10 Minuten in einem 56°C warmen Wasserbad inkubiert. Das Röhrchen wurde eine Minute bei 10 000 g zentrifugiert, um das Siliciumdioxid von dem die eluierte Nukleinsäure enthaltenden Wasser zu trennen.
d. NASBA-Primer
In der vorliegenden Erfindung wurden zwei Paare von DNA-Oligonukleotidprimern verwendet. Die zur Amplifikation des Subtyps H5 verwendeten Primer waren NASBA-PP1 und NASBA-PP2, erhalten von Gibco BRL, Life Technologies Inc. (NY, USA).
e. Amplifikation durch NASBA
5 μl Nukleinsäureextrakt, 10 μl eines Gemischs mit 80 mM Tris, pH 8,3, 24 mM MgCl₂, 140 mM KCl, 10 mM DTT, jeweils 2 mM dNTP, jeweils 4 mM NTP, 30% DMSO und jeweils 0,4 μM Primer wurden zugegeben. Dieser Ansatz wurde fünf Minuten in einem Wasserbad auf 65°C erhitzt und anschließend fünf Minuten auf 41°C abgekühlt. Nach dem Abkühlen wurden 5 μl Enzym-Mix (6,4 Einheiten/μl T7-RNA-Polymerase, 103 Einheiten/μl AMV-RT, 0,02 Einheiten/μl RNase H und 0,42 μg/μl BSA) zugegeben und der Reaktionsansatz 90 Minuten in einem Wasserbad bei 41°C inkubiert. Das Endvolumen betrug 20 ml.
f. Herstellung der Sondenlösung
Die Fängersonde umfaßt eine in der SEQ ID Nr. 1 angegebene Sequenz sowie eine Biotinmarkierung am 5'-Ende. Die Nachweissonde umfaßt eine in der SEQ ID Nr. 2 angegebene Sequenz sowie eine Digoxigeninmarkierung am 5'-Ende. Die Sequenzen der Fängersonde und der Nachweissonde sind von den Erfindern konstruiert und werden kommerziell von der Firma Bioasia Co. (Shanghai, China) synthetisiert. Anschließend werden die Fängersonde und die Nachweissonde zusammengemischt, so daß man eine gemischte Sondenlösung erhält, wobei die Sondenlösung 0,26 μM biotinylierte Fängersonde und 0,26 μM DIG-markierte Nachweissonde umfaßt. Die zum Einfangen und Nachweis des amplifizierten Ziel-RNA-Moleküls verwendeten Sonden wurden von der Firma Gibco BRL, Life Technologies Inc. (NY, USA) erhalten.
g. Einfang und Nachweis der NASBA-amplifizierten Produkte
Zum Einfangen und Nachweisen der amplifizierten Nukleinsäure werden die NASBA-amplifizierten Produkte mit der Sondenlösung versetzt, wonach der obige Reaktionsansatz in eine mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatte gegeben und bei Raumtemperatur 60 min inkubiert wird. Die Mikrotiterplatte wird 2–3mal mit Hybridisierungspuffer (20 × SSPE) gewaschen, der Reaktionsansatz mit dem mit alkalischer Phosphotase konjugierten Anti-DIG-Antikörper versetzt und unter Schütteln 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird die Mikrotiterplatte 2–3mal zur Abtrennung von nicht gebundenem Material gewaschen. Das Enzymsubstrat (p-Nitrophenylphosphat) wird zugegeben und die Mikrotiterplatte 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 3M NaOH gestoppt und die Absorption bei 410 nm unter Verwendung eines Standard-Mikrotiterplattenspektrophotometers nachgewiesen.
Das Hämagglutinin-Gen aus Vogelgrippeisolaten wurde mit der NASBA-Technik unter Verwendung eines Paars von DNA-Oligonukleotidprimern nach allgemein etablierten Verfahren amplifiziert. Dabei enthielt ein Primer (NASBA-PP1) eine 5'-Verlängerung, die den Einbau der Bindungsstelle für T7-Bakteriophagen-RNA-Polymerase gestattete, während der andere Primer (NASBA-PP2) eine 5'-Verlängerung enthielt, die den Einbau einer Nachweissequenz gestattete. Nach der NASBA-Reaktion wurde der Amplifikationsansatz nach den oben beschriebenen Verfahrensweisen analysiert. Die amplifizierten H5-Ziel-RNA-Moleküle werden mit dem enzymverknüpften Sondeneinfangtestverfahren nachgewiesen. Nicht-H5-Material wird mit dem beschriebenen Verfahren nicht nachgewiesen. Der Nachweis der NASBA-Produkte erfolgte wie folgt:

1. 2 μl Sondenlösung, 5 μl NASBA-Produkt und 93 μl Hybridisierungspuffer wurden in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben;
2. das Gemisch aus 1 wurde in eine 96-Loch-Mikrotiterplatte gegeben;
3. die Mikrotiterplatte wurde 1 Std. unter Schütteln auf einer Schüttelplattform bei Raumtemperatur inkubiert;
4. die Mikrotiterplatte wurde mit 200 μl Hybridisierungspuffer gespült;
5. die Mikrotiterplatte wurde 5 min in 200 μl 1 × TBS eingeweicht;
6. der Überstand wurde verworfen und die Mikrotiterplatte wiederum mit 200 μl 1 × TBS gespült;
7. 100 μl verdünnte Anti-DIG-alkalische Phosphatase (2 mg/ml) wurden in die Mikrotiterplatte gegeben;
8. die Mikrotiterplatte wurde 30 min unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert;
9. die Mikrotiterplatte wurde einmal mit 200 μl 1 × TBS gespült;
10. die Mikrotiterplatte wurde 5 min mit 200 μl 1 × TBS eingeweicht;
11. Schritt 10 wurde noch mal wiederholt;
12. der Inhalt in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte wurde verworfen und die Mikrotiterplatte mit 200 μl 1 × TBS gespült;
13. 200 μl Substratlösung (2 mg/ml p-Nitrophenylphosphat) wurden zu der Mikrotiterplatte gegeben;
14. die Mikrotiterplatte wurde 30 min unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert;
15. 100 μl Stopplösung (3M NaOH) wurden zu der Mikrotiterplatte gegeben, um die Farbentwicklung zu stoppen;
16. die Signale wurden auf einem Standard-Mikrotiterplattenspektrophotometer abgelesen, wobei als Hintergrundkontrolle 100 μl Substratlösung plus 100 μl Stopplösung verwendet wurden.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt.

	Signal (OD 410 nm) nach 30 min
	Unverdünnte H5-Matrize	1:10 verdünnte H5-Matrize	1:100 verdünnte H5-Matrize	Kontrolle: Nicht-H5-Amplifikat	Kontrolle: ohne Amplifikat zugabe	Hintergrund (nur Substrat)
1	1,584				0,090	0,072
2		1,497	0,303		0,096	0,066
3		1,884	0,370	0,218	0,245	0,080

Wie im obigen Beispiel dargestellt, kann man erkennen, daß das Nachweisverfahren zweckmäßig an verschiedenen Testorten, einschließlich Bauernhöfen, verwendet werden kann. Weiterhin ist das Nachweisverfahren relativ einfacher anzuwenden als bestehende Verfahren und dürfte auch in der Lage sein, die Nachweisergebnisse in einer kürzeren Zeit zu liefern – falls gewünscht, können die Nachweisergebnisse innerhalb von einem Tag zur Verfügung stehen.
Beispiel 2. Kit zum Nachweis der amplifizierten NASBA-Produkte des Subtyps H5 des Vogelgrippevirus unter Verwendung eines enzymverknüpften Fängersondentests
Der Kit umfaßt die folgenden, in getrennten Behältern enthaltenen Komponenten:

1) Sondenlösung, die 0,26 μM biotinylierte Fängersonde und 0,26 μM DIG-markierte spezifische Sonde, gelöst in DEPC-Wasser, enthält, wobei die Fängersonde eine in der SEQ ID Nr. 1 (4) angegebene Sequenz und die Nachweissonde eine in der SEQ ID Nr. 2 (5) angegebene Sequenz umfaßte; die Sequenzen in SEQ ID Nr 1 und 2 wurden kommerziell von der Firma Bioasia Co. (Shanghai, China) hergestellt; anschließend wurden die Sequenzen über herkömmliche Verfahren vom Hersteller mit Biotin und DIG markiert;
2) Nachweislösung, die Anti-DIG-alkalische Phosphatase (1:500 in 1 × Tris-Puffer-Kochsalzlösung) enthielt, wobei die Anti-DIG-alkalische Phosphatase von der Firma Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA, erhalten wurde;
3) Substratlösung, die 2 mg/ml p-Nitrophenylphosphat (pNPP) in Tris-Puffer enthielt, wobei das Substrat p-Nitrophenylphosphat von der Firma Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA, erhalten wurde;
4) Stopplösung, die 3M NaOH enthielt;
5) Hybridisierungslösung, die 20 × SSPE (3M NaCl, 0,02 M EDTA, pH 7,4); pH 7,4, 50 mM Tris-HCl; pH 8,8, 1% (w/v) Rinderserumalbumin) enthielt.

Dem Fachmann ist ersichtlich, daß die Nachweissonde und die Fängersonde sich auch in Form von RNA-Molekülen eignen können. Aufgrund ihrer besseren Stabilität sind DNA-Moleküle bevorzugt. Ebenso ist dem Fachmann ersichtlich, daß andere Konjugatpaare von Bindungsagentien als Streptavidin und Biotin als Immobilisierungsmittel bzw. Fängersondenmarkierung verwendet werden können.

Claims

Verfahren zum Nachweis eines Nukleinsäure-Zielmoleküls, umfassend die folgenden Schritte: (A) Einfangen des Nukleinsäure-Zielmoleküls mit einer Fängersonde, um das Nukleinsäure-Zielmolekül zu immobilisieren, wobei die Fängersonde (i) eine zum Nukleinsäure-Zielmolekül wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz und (ii) eine Markierung für die Bindung an einen Immobilisator enthält; (B) Gestatten der Bindung einer Nachweissonde an das immobilisierte Nukleinsäure-Zielmolekül in Schritt (A), wobei die Nachweissonde (i') eine zum Nukleinsäure-Zielmolekül wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz und (ii') eine Markierung für die Bindung an einen Signalerzeuger enthält; (C) Erzeugen und Nachweisen des Signals, – wobei es sich bei dem Nukleinsäure-Zielmolekül um das NASBA-amplifizierte Reaktionsprodukt des Subtyps H5 des Vogelgrippe-A-Virus handelt, wobei die Primer für NASBA eine zu einem konservierten Teil des Hämagglutinin-Gens des Subtyps H5 des Vogelgrippe-A-Virus komplementäre Nukleinsäuresequenz enthalten, der innerhalb von jeweils 100 Nt vor und hinter der HA1/HA2-Schnittstelle liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei den Nukleinsäuresequenzen der Fängersonde und der Nachweissonde um DNA-Sequenzen handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Signalerzeuger um ein radioaktives, chemilumineszierendes, fluoreszierendes, enzymatisches oder elektrochemilumineszierendes Molekül handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Immobilisator um ein Festphasenmaterial handelt, das mit dem Liganden der Markierung der Fängersonde bedeckt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Markierung der Fängersonde aus der Gruppe Streptavidin, Biotin, Digoxigenin und Protein A ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Markierung der Fängersonde um Biotin handelt und der Immobilisator mit Streptavidin bedeckt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Signalerzeuger um einen enzymkonjugierten Antikörper handelt, der Spezifität gegen die Markierung der Nachweissonde aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nachweissonde mit Digoxigenin markiert ist und es sich bei dem Signalerzeuger um einen enzymkonjugierten Anti-DIG-Antikörper handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man ferner nach Schritt (A) und/oder (B) zur Abtrennung der nicht gebundenen Materialien einen Waschschritt durchführt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Schritte (A) und (B) gleichzeitig durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Fängersonde eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 und die Nachweis-sonde eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Fängersonde mit Biotin markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Nachweissonde mit Digoxigenin markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei dem Immobilisator um eine mit Streptavidin bedeckte Mikrotiterplatte handelt.
Kit zum Nachweis eines NASBA-amplifizierten Nukleinsäure-Zielmoleküls des Subtyps H5 des Vogelgrippe-A-Virus, wobei der Kit folgendes umfaßt: (A) eine Fängersonde zum Einfangen des Nukleinsäure-Zielmoleküls, die (i) eine zum Nukleinsäure-Zielmolekül des Subtyps H5 des Vogelgrippe-A-Virus wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz und (ii) eine Markierung für die Bindung an einen Immobilisator enthält; (B) eine Nachweissonde zum Nachweisen des Nukleinsäure-Zielmoleküls, die (i') eine zum NASBA-amplifizierten Nukleinsäure-Zielmolekül wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz und (ii') eine Markierung für die Bindung an einen Signalerzeuger enthält; und (C) Primer für NASBA, die eine zu einem konservierten Teil des Hämagglutinin-Gens des Subtyps H5 des Vogelgrippe-A-Virus wenigstens teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz enthalten, der innerhalb von jeweils 100 Nt vor und hinter der HA1/HA2-Schnittstelle liegt.
Kit nach Anspruch 15, ferner eine Enzymsubstratlösung und/oder eine Pufferlösung umfassend.
Kit nach Anspruch 15, wobei es sich bei dem Signalerzeuger um ein radioaktives, chemilumines zierendes, fluoreszierendes, enzymatisches oder elektrochemilumineszierendes Molekül handelt.
Kit nach Anspruch 15, wobei es sich bei dem Immobilisator um ein Festphasenmaterial handelt, das mit dem Liganden der Markierung der Fängersonde bedeckt ist.
Kit nach Anspruch 15, wobei die Markierung der Fängersonde aus der Gruppe Streptavidin, Biotin, Digoxigenin und Protein A ausgewählt ist.
Kit nach Anspruch 15, wobei es sich bei der Markierung der Fängersonde um Biotin handelt und der Immobilisator mit Streptavidin bedeckt ist.
Kit nach Anspruch 15, wobei es sich bei dem Signalerzeuger um einen enzymkonjugierten Antikörper handelt, der Spezifität gegen die Markierung der Nachweissonde aufweist.
Kit nach Anspruch 15, wobei die Nachweissonde mit Digoxigenin markiert ist und es sich bei dem Signalerzeuger um einen enzymkonjugierten Anti-DIG-Antikörper handelt.
Kit nach Anspruch 15, wobei die Fängersonde eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 und die Nachweissonde eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 umfaßt.