JPH07506482A - メッセンジャーｒｎａの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 メツセンジャーＲＮ＾の測定法 光肌Ω茸景 光透り利囲分對 この発明はメツセンジャーＲＮ＾（ｍＲＮＡ）の測定法および本方法に有用なポ リヌクレオチド固定化支持体に関する。特に、この発明は種々のｍＲＮＡを同時 に測定できる測定法と試薬に関する。この発明の１実施態様においてはｍＲＮＡ を細胞がら精製して取出す必要はなく、且つｍＲＮＡを高感度で迅速に計量する ことが可能である。

先行技術Ω脱灰 ｍＲＮＡ１１度を測定する技術として以前よりよく知られているものには、ノザ ンプロット法−Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　Ｍｅｔｈｏｄ−（例えば、Ｊ、Ｓ ａｍｂｒｏｏｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　２ ｎｄ　ｅｄ、、　Ｃｏ１ｄ　ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８９　（以後A「モ レキュラー・クローニング」と呼ぶ）を参照）、ドツトプロット法−Ｄｏｔ　Ｂ ｌｏｔ　ｔｎｅｔｈｏｄ−（例えば、「モレキュラー・クローニング」参照）、 リボヌクレアーゼ保護アッセイ−Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉ ｏｎ　Ａｓ５ａｙ−（例えば、「モレキュラー・クローニングＪ参照）および逆 ＰＣＲ法−Ｒｅｖｅｒｓｅ　ＰＣＲＭｅｔｈｏｄ−（Ｉｌ、＾、　Ｅｒ１ｉｃｈ 　（ｅｄ、）、　ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ 　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、 　５狽盾モ汲狽盾■ Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ、　１９８９）が含まれる。これら全 ての先行文献についての開示をここでは参考として組み入れる。

ノザンプロット法は、電気泳動を使って分子量に応じて分離されるｍＲＮＡを検 出するものである。分離分子は股上に固定され、ｍＲＮＡ濃度は標ｍＤＮＡプロ ーブとのハイブリッド形成によって決定される。この方法では、標的ＩＩＩＲＮ ＾の分子量は一般に周知のものでなければならない。この方法を使うことにより 、標識プローブ、ｍＲＮＡおよび不溶性膜の間で複合体が形成される。次いで、 膜上の適当な場所での複合体の標識量が比色定量または放射能によって測定され る。

ドツトプロット法は、精製ｍＲＮＡを膜上にスポットとして固定化した後標識プ ローブとのハイブリッド形成によってｍＲＮＡを検出するものである。この方法 は一度に多くのサンプルを迅速に検査するのに使うことができる。しかし、ドツ トプロットおよびノザンプロットの両方とも検出が望まれる各ｎ＋ＲＮＡに対し 特定の標識プローブを使う必要がある。

リボヌクレアーゼ保護アッセイ法は、ｍＲＮＡを初めに精製した後検出するのに 使用されるものである。精製ｄＮＡは標識ＲＮ＾プローブとハイブリッド形成さ れ、次いで特に一本鎖ＲＮＡを消化するりポヌクレアーゼで処理される。標識Ｒ ＮＡプローブは溶液中にデュプレックス（二重らせん）を形成し、消化から保護 されることになる。次いで、これは二本鎖層＾／プローブ複合体から分離後、膜 上に固定化される。

逆ＰＣＲ法は、逆転写酵素と精製ｍＲＮＡとを使ってｃＤＮＡが合成される場合 に使用される。このｃＤＮＡは膜上に固定化することができる。次いで、合成さ れたｃＤＮＡは標準のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応−−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ 　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を使って増幅される。ｃＤＮＡを電気泳動 によりその分子量に応じて分離した後それは単一バンド（ｓｉｎｇｌｅ　ｂａｎ ｄ）になる。次いで、ＤＮＡは膜上に固定され標！！ＤＮＡとのハイブリッド形 成によって検出される。しかし、ＰＣＲ後は、元のメツセージの増幅のため定量 的情報は何ら残らない。

先行する方法は全て実行するのに長期の期間を要するｍ＝何故なら、使用される ｍＲＮＡは少なくとも部分的に精製された形でなければならないからである。ま た、サンプルの電気泳動および膜への固定化も必要である。これら二つの処置の ためｍＲＮＡ定量化の信頼性は低下することになる。

故に、上記問題を解決し、メツセンジャーＲＮＡ濃度を迅速に決定する測定法お よびかかる方法に有用な測定試薬を提供することが望まれている。

発咀の概要 この発明のｍＲＮＡアッセイ法では第一の及び第二のポリヌクレオチドプローブ が使用できる。サンプルよりむしろプローブ（第一ポリヌクレオチド）の水不溶 性支持体上での固定化によって、ｍＲＮＡを含む沢山の未精製サンプルについて の迅速定量の基礎が与えられることを発明者は見いだしている。出願人は、この 標的のために適切な特殊プローブを同定する効果的方法を提供してきた。この発 明の好ましい形では、第一ポリヌクレオチドプローブはサンプル中のｍＲＮＡに 特有の部位に相補的なヌクレオチド配列を有し、標的ｍＲＮＡのその他の部分に 結合しない。発明者はまた単一種類の第二ポリヌクレオチドプローブは種々のｍ ＲＮＡの同時定量法として使えることを見いだしている。しかし、第一プローブ よりも、異なったｓＲＮ入部位に結合する色々なプローブのどれもがこの目的の ために使用可能である。

このことについて発明者は、１ＩＩＲＮ＾のポリアデニル酸テイル（尾部）に相 補的な配列を含む第二ポリヌクレオチドプローブはそのような同時アッセイ法に 使用できることを見出した。これらのこと及びその他の開示を基礎として発明者 はこの発明を確立した。

この発明の一つの具体例は、細胞からのｍＲＮＡの精製を要しないでサンプル中 のｍＲＮＡを検出・定量するための高感度で定量的且つ迅速な方法である。この 発明の具体例では、その方法は下記の処置段階からなる：（ａ）　ｍＲＮＡに特 有のポリヌクレオチド配列を同定し；（ｂ）　＋ｏＲＮ＾に特有の配列に相補的 な第一配列を有する第一ポリヌクレオチドを不溶性支持体に固定し： （Ｃ）　特有配列が第一ポリヌクレオチドとハイブリダイズする条件下でサンプ ルをインキュベートし、それによってサンプル中に存在するｄＮＡを不溶性支持 体に固定し： （ｄ）　サンプルの非固定成分を不溶性支持体から洗い流し：（ｅ）　支持体上 のｍＲＮＡの量に関連して標識を支持体に取り込ませる方法で支持体上のｍＲＮ Ａを標識し；　そして （ｆ）　支持体上に固定された標識量を測定する。

好ましい実施態様では、支持体上のｍＲＮＡを標識する上記段階には、標識プロ ーブを、最も好ましくはポリｄ（Ｔ）を、標識プローブが支持体上のｍＲＮＡと ハイブリダイズし且つ標識プローブは標識を有し、第一プローブに相補的なｍＲ ＮＡの一部以外のｒｎＲＮ＾の部分に相補的であるという条件下で不溶性支持体 と共に定温保持し、それによってｍＲＮＡとハイブリダイズしている標識プロー ブ上の標識を不溶性支持体に固定し、その後非固定標識プローブはいずれも不溶 性支持体から洗い流す処置が包含される。

加えて、上記のステップ（ｅ）において核酸を標識する方法には、好ましくはオ リゴヌクレオチドを核酸染色剤で、最も好ましくは臭化エチジウム（エチジウム プロミド）　、ｙｏｙｏ−１及びｔｏｔｏ−１からなる群から標識することを含 ませることができる。

更に好ましい具体例では、上記方法に放射性核種またはその代わりとしてビオチ ンを含む標識を使うことができる。ビオチンを使用する方法では保温は好ましく は酵素標識ストレプトアビジン−ｅｎｚｙｍｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　５ｔｒ ｅｐｔａｖｉｄｉｎ−とともに行うことができ；次いで不溶性支持体に結合され た酵素量の測定が行われる。この具体例において、ステップ（ｆ）には、その上 、アルカリ性ホスファターゼに結合されたストレプトアビジンを不溶性支持体に 添加する処置を含ませることができる。

好ましい方法の更に他の具体例では、ｍＲＮＡはβ受容体−βｒｅｃｅｐｔｏｒ −をコードでき、そこでは第一ポリヌクレオチドはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ（配列番 号）：６の配列からなる。

上記方法の代わりの具体例では、Ｇｓプロティンのびサブユニットをコードする ｍＲＮＡを含み、そこでは１第一ポリヌクレオチドはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１． １４５−１４６．２０９−２１２、２６８−２８７．７０５及び７０８よりなる 群から選ばれる配列に相補的な配列を含む。

この発明の方法に使用できるその他の代わりとなるｍＲＮＡ配列はＧ１−２プロ テインをコードし、そこでは第一ポリヌクレオチドはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋７０ ３．８０６．１４２．１４３゜１８７−１９７及び２３８−２５３からなる群か ら選ばれた配列に相補的な配列を含む。

この発明の方法ではまた、サブスタンスＰ受容体をコードするｍＲＮＡも含める ことができ、そこでは第一ポリヌクレオチドはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５の配列か らなる。

Ｇ１−３プロテインをコードするｍＲＮＡもこの発明の方法に包含でき、そこで は第一ポリヌクレオチドはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア０４．７０７．１４４．１９ ８−２０８及び２５４−２６７からなる群から選ばれた配列に相補的な配列を含 む。

上記方法の更に他の具体例では、Ｇ１−１プロテインをコードするｍＲＮＡを含 めることができ、そこでは第一ポリヌクレオチドはＳＥＱ　ＩＤＮ０ニア０２． ８０５．１４１．及び２２４−２３７からなる群から選ばれた配列に相補的配列 を含む。更に好ましい具体例では、Ｇプロテ・インについてコードしているｍＲ ＮＡを含み、そこでは、第一ポリヌクレオチドはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア００． ７０１．１３９．１４０．１４８−１５９．１６２−１７２．１７６−１８６及 び３−４からなる群から選ばれた配列に相補的な配列を含む。

最も好ましくは、第一配列はｍＲＮＡの特有の配列にハイブリダイズしサンプル 中に存在する他のポリヌクレオチドとはハイブリダイズせず、より一層好ましく はサンプルには細胞溶解物が含まれる。

代わりの好ましい具体例では、上記方法における標識はそこから放射される光に よって測定でき、この方法のステップ（ｆ）には標識によって放射される光量測 定が含まれる。光の測定法には、好ましくは、フィルム上の光量の記録：および このフィルムの露光量のデンシトメーターを使った測定を含めることができる。

加えて、光測定にはＡＴｒＯＰＨＯ５を添加すること及び蛍光光度計を使って放 射される蛍光を測定することを二者択一的に含めることができる。

この発明の上記ステップ（ａ）における方法には、好適にはコンピュータプログ ラム、好ましくはＨ−ｓｉｔｅモデル（Ｈサイトモデル）の使用を伴うコンピュ ータプログラムを含むことができる。ステップ（ａ）のＨサイトモデルは、好ま しくは次の操作によってこの方法に関する第一ポリヌクレオチドプローブを同定 するために使われる： 第一ヌクレオチドプローブの最小融解温度及びその生物に特異的なヌクレオチド 配列を特定すること： 任意の核形成部位における塩基対の数に関して最小値を定める核形成しきい値を 特定すること： 第一ヌクレオチドプローブについての融解温度（Ｔ、）及びすべての可能なハイ ブリダイゼーション点におけるその生物に特異的な配列を決定すること；および 最高のＴｍ値を有するヌクレオチドプローブを選択すること。

第一ヌクレオチドプローブを同定するためのコンピユータ化の方法では、次の式 によって決められる融解温度を有することができる：Ｔ、＝　８１．５　−　１ ６．６（ｌｏｇ　［Ｎａ］　）−０，６３％（ホルムアミド）　＋　０．４１（ ％（Ｇ　＋　Ｃ））−６００／ＮA ここでｌｏｇ　［Ｎａｌはナトリウム濃度の対数であり、０．０６３％（ホルム アミド°）はホルムアミドの濃度、％（Ｇ　＋　Ｃ）はマツチ（対合）したＧＣ 塩基対のパーセント、Ｎはプローブの長さである。

加えて、ステップ（ａ）の方法は、Ｈ−ｓｉｔｅコンピュータ化モデルを使い上 記に関連する標識プローブを次の操作で特定するのに使うことができる：標識プ ローブについて最小融解温度及びその生物に特有のヌクレオチド配列を特定する こと。

任意の核形成部位における塩基対の数に関して最小値を定める核形成しきい値を 特定すること： 第一ヌクレオチドプローブについての融解温度（Ｔ、）及びすべての可能なハイ ブリダイゼーション点におけるその生物に特異的な配列を決定すること；および 最小のＴ、値を有する適当な長さのヌクレオチドプローブを選択すること。

第二ヌクレオチドプローブを特定する方法には、次式によって融解温度を決める ことを包含できる： Ｔ、□　８１．５　−　１６．６（ｌｏｇ　［Ｎａ］　）−０，６３％（ホルム アミド）　＋　０．４１（％（Ｇ　＋　Ｃ））−６００／ＮB ここでｌｏｇ　［Ｎａ］はナトリウム濃度の対数であり、０．０６３％（ホルム アミド）はホルムアミドの濃度、％（Ｇ　＋　Ｃ）はマツチしたに塩基対のパー セント、Ｎはプローブの長さである。

この発明の別の具体例は、ＳＤＳおよびＥＤＴＡを含む緩衝系においてＲＮＡを 含むサンプル中のＲＮａｓｅ　（リボヌクレアーゼ）の活性を阻害する方法であ る。

好ましくは、サンプル中のＲＮＡに対してＥＤＴＡのモル数は少なくとも５倍超 であり、最も好ましくはバナジルリボヌクレオシド−ｖａｎａｄｙｌ　ｒｉｂｏ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ−複合体がプロティナーゼと共に添加される。それに代わ る好ましい具体例においては、バナジルリポヌクレオシド複合体がＲＮａｓｉｎ と共に添加される。

この発明の他の別の具体例はポリヌクレオチド固定化支持体であり、これはサン プル中のβ受容体ｍＲＮＡの量を検出・定量するのに有用であり、下記のものを 含む： 不溶性支持体： 支持体に結合された第一ポリヌクレオチドで、β受容体ｍＲＮＡにユニークな配 列に相補的である配列を含む第一ポリヌクレオチド。

より好ましくは、β受容体＋ＩＩＲＮ＾に特有の配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６ からなる群から選択された配列を含む。

この発明の他の好ましい具体例はポリヌクレオチド固定化支持体であり、これは サンプル中のｊｕｎ遺伝子ｍＲＮＡの量を検出・計量するのに有用であり、下記 のものを含む： 不溶性支持体： 支持体に結合された第一ポリヌクレオチドであって、ｊｕｎ遺伝子ｍＲＮＡに特 有なな配列に相補的である配列を含む第一ポリヌクレオチド。

より好ましくは、ｊｕｎ遺伝子ｍＲＮＡに特有の配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１ １−３５．３９−５３゜６２−１３８．３１０−３４２．６００−６０６．６１ ４−６２０．及び６２８−６３４からなる群から選択された配列を含む。

この発明の他の具体例はポリヌクレオチド固定化支持体であり、これはサンプル 中のＧプロティン！ＩＲＮ＾の量を検出・定量するのに有用であり、下記のもの を含む支持体に結合された第一ポリヌクレオチドで、ＧプロティンｍＲＮ＾にユ ニークな配列に相補的である配列を含む第一ポリヌクレオチド。

好マシ＜ハ、ＧプｏティンｍＲＮＡニ特有の配列力＜　１．２．７００−７０９ ．８０５．８０６゜１３９−１５９．１６２−１７２および１７６−３０９から なる群から選択された配列を含む。

この発明の他の好ましい具体例はポリヌクレオチド固定化支持体であり、これは サンプル中のサブスタンスＰ受容体ｍＲＮＡの量を検出・定量するのに有用であ り、下記のものを含む： 不溶性支持体： 支持体に結合された第一ポリヌクレオチドで、サブスタンスＰ受容体ｍＲＮＡに 特有の配列に相補的である配列を含む第一ポリヌクレオチド。

好ましくは、サブスタンスＰ受容体ｍＲＮ人に特有の配列がＳＥＱ　ＩＤＮ０： ５の配列を含む。

回Ω簡単な説■ 図１はマレイミド法−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ　ｍｅｔｈｏｄ−により第一ポリヌク レオチドを不溶性支持体上に固定化する手順を示すものである。

図２はカルボジイミド−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ−法により第一ポリヌクレオ チドを不溶性支持体上に固定化する手順を示すものである。

図３はこの発明によるｍＲＮＡの定量法の原理を示す略図である。

図４（りはノザン膜上のヒトのβ叩アドレナリン受容体ｃＤＮＡプローブに由来 する化学ルミネンス光に露光された瑚フィルムの写真像を示すもので、この膜に は種々の濃度のヒトのβ２アドレナリン受容体ｍＲＮ＾が固定化された。（Ｉｌ 、Ａ）はこの発明によるオリゴ−（ｄＴ）プローブに由来する化学ルミネンス光 に露光された珈フィルムの写真像を示すもので、ここでは種々の濃度のヒトのβ 、アドレナリン受容体ｍＲＮＡが第一オリゴヌクレオチド固定化プラスチック板 上にトラップされた。

（Ｉｌ、Ｂ）は（Ｉｌ、Ａ）に示された像のデンジトゲラムを示す。（１１，ｃ ）は（Ｉｌ、Ａ）で示された像の化学ルミネンス信号の相対強度とｍＲＮＡ濃度 との関係を示す線図である。

図５は図４．ＩＩで示されたものとは別の実験での化学ルミネンス信号の相対強 度とｍＲＮＡ濃度との直線関係を示す線図である。

図６はこの発明の方法のラットのＧｓプロティンａ＋ＲＮＡについての較正線を 図式的に示すものである。

図７はこの発明によるオリゴ−（ｄＴ）プローブに由来する化学ルミネンス光に 露光されたポラロイドフィルムの写真像を示すもので、ここでは種々の細胞中の Ｇ１−２及びＧＳプロティンｍＲＮＡが第一オリゴヌクレオチド固定化プラスチ ック板上にトラップされた。

図８はサザン膜−８ｏｕｔｈｅｒｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ−上のＧ１−２及びＧＳ プロティンｃＤＮＡプローブに由来する化学ルミネンス光に露光されたＸ線フィ ルムの写真像を示すもので、ここでは４つの別々の細胞系からのＰＣＲ増幅Ｇプ ロティン特異的ｃＤＮＡが固定された。

図９はこの発明の方法のヒトのサブスタンスＰ受容体ｍＲＮＡに関する計測線を 図式的に示すものである。

図１ＯはＳＤＳおよびＥＤＴＡを含むｌｌｌＲＮＡ調製物に対する種々のＲＮａ ｓｅ阻害剤の効果を示すゲルを表したものである。

図１１は０才およびＧ、ＰＣＲプライマーで増幅された５つの異なったＧプロテ ィン・オリゴヌクレオチドのゲルを表したもので、またプローブとして５つのＧ プロティン配列を使うサザンプロットを示す。

図１２はＧｔおよびＧ　４ＰＣＲプライマーで増幅された５つの異なったＧプロ ティン・オリゴヌクレオチド（”（“記号の数で表示）の各々の量を変えて含む サンプルのゲルを表したもので、またプローブとして５つのＧプロティン配列を 使ったサザンプロットを示す。

図１３は示されているように５つの異なった各Ｇプロティンプライマーで増幅さ れたラットの下垂体−ｐｆｔｕｉｔａｒｙ−（Ｐ）、腎臓（Ｋ）および腸（１） からのλＺＡＰ　ｃＤＮＡライブラリーのゲルを表したものである。

図１４はＧ２およびＧ、ＰＣＲプライマーで増幅されたヒトの１Ｍ９およびジャ ーカット細胞−Ｊｕｒｋａｔ　ｃｅｌｌ−のｃＤＮＡからの５００　ｂｐ　ＤＮ Ａのゲルを表す。

図１５はＹＯＹＯ−１蛍光と固定化オリゴヌクレオチド量との間の関係を示す図 表である。

図１６はＹＯＹＯ−１分析の時間過程を示す図表である。

図１７はＹＯＹＯ−１濃度の用量反応（ドーズレスポンス）を示す図表である。

図１８は固定化オリゴヌクレオチドの定量化に基づいてＹＯＹＯ−１染色の再現 性を示す棒グラフである。

図１９はヒトの末梢血液の白血球からのｊｕｎ遺伝子のＰＣＲ増幅ｄｓ−ｃＤＮ Ａのアガロスゲルーａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ−電気泳動のポラロイド写真を表す 。

図２０はこの発明の全体構想を説明するコンピュータシステムの簡略ブロック図 である。

図２１＾−２ＩＣはこの発明の主オリゴプローブ設計ステーションの対話（ダイ アログ）ウィンドウの表示画面の表示を示す。

図２２はプログラム及び発明のシーケンスと構造を説明する発明全体の流れ図で ある。

図２３はミツハシプローブ（Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉプローブ）選択ダイアグラム の表示（ディスプレイ）画面の表示を示す。

図２４はプローブインフォーｐｒｏｂｅｉｎｆｏ＝及びマツチインフォーｍａｔ ｃｈｉｎｆｏ−ウィンドウの表示画面の表示を示す。

図２５はプローブエディツト（プローブ編集）　−ｐｒｏｂｅｓｅｄｉｔ−ウィ ンドウの表示画面の表示を示す。

図２６Ａはプローブエディツト出カフアイルの印刷出力である。

図２７はこの発明のミスマツチモデル−Ｍｉｓｍａｔｃｈ　Ｍｃｘｌｅｌ−のｋ 　ｄｉｆｆプログラムの流れ図で、そのシーケンスと構造を含む。

図２８はこの発明のｋ　ｄｉｆｆモジュールの流れ図である。

図２９はこの発明のハツシング−ｈａｓｈｉｎｇ−モジュールの流れ図である。

図３０はこの発明のｔｒａｎモジュールの流れ図である。

図３１はこの発明のｌｅｔ　ｄｉｇモジュールの流れ図である。

図３２はこの発明のアップデート−ｕｐｄａｔｅ−モジュールの流れ図である。

図３３はこの発明のアセンブリーａｓｓｅｍｂｌｙ−モジュールの流れ図である 。

図３４はこの発明の５ｅｑｌｏａｄモジユールの流れ図である。

図３５はこの発明のリード１−ｒｅａｄ　ｌ−モジュールの流れ図である。

図３６はこの発明のｄｉｇ　ｌｅｔモジュールの流れ図である。

図３７はこの発明の（Ｌｃｏｌｏｕｒモジュールの流れ図である。

図３８はこの発明のｈｉｔ　ｅｘｔモジュールの流れ図である。

図３９はこの発明のカラー−ｃｏｌｏｕｒ−モジュールの流れ図である。

図４０はこの発明のミスマツチモデルの出力を含むサンプルファイル印刷出力の 最初の頁である。

図４１はＨ−３ｉｔｅモデル、ステージＩの流れ図で、この発明の前処理準備フ ァイルの作成を網羅している。

図４２はＨ−８ｉｔｅモデル、ステージＩＩの流れ図で、この発明の標的シーケ ンスの準備を網羅している。

図４３はＨ−５ｉ　ｔｅモデル、ステージＩＩＩの流れ図で、この発明のＭＰＳ Ｄデータの計算を網羅している。

図４４＾はミスマツチモデルプログラムの出力を含むサンプルファイル印刷出力 の最初の頁である。

図４４８はＨ−８ｉｔｅモデルプログラムの出力を含むサンプルファイル印刷出 力の最初の頁である。

図４５はＭｉｔｓｕｈａｓｈｉプローブ選択ダイアグラム（ＭＰＳＤ）を作成す るために使われる処理の流れ図である。

図４６はｍａｔｃｈｉｎｆｏウィンドウを作成するために使われる処理の流れ図 である。

図４７はサンプルの標的種ファイルの印刷出力である。

図４８はサンプル準備ファイルの印刷出力である。

発則Ω詳纏を脱型 標的１易 伝染性疾患を分子生物学的に診断するためには、以前はＤＮＡを利用する処置が 一般的に実施された。ＤＮＡ診断によって外的遺伝子の存在を確認できるとはい え、既知の遺伝子が外に表れていないキャリア状態なのかまたは疾病状態で発現 しているのかを決めることは無理である。

生きた生物においては、遺伝子がひとたび活性化すれば、その遺伝子がコードす るＤＮＡがｍＲＮＡに転写され、次いでそのｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される 。このようにして、外的遺伝子の活性化はｍＲＮＡの濃度を測定することにより 確定することができる。

近年、タンパク質の欠乏状態を分子生物学的に診断するため、はとんどの実験者 はＤＮＡ濃度を分析することに限定してきた。しかしこの方法は、転写または翻 訳の異常を判断するためには使うことができない。もしｍＲＮＡ濃度が容易に測 定できるようなら、疾病状態はもっと正確に認知されるであろう。ｍＲＮＡが検 出できない疾病状態では転写に欠陥があるということができ、一方、ｍＲＮＡの 正常濃度が検出されるなら多分翻訳に異常がある。

加えて、細胞中で生成されるｍＲＮＡの量は遺伝子の発現量を反映するので、病 気または薬物反応のような異常状態の過程でｍＲＮＡ濃度を検査するのに有用で あろう。

以下により詳細に議論するように、数多くあるｌｌｌＲＮＡのどれかを測定する ことによって、臨床」―有益な情報を提供することができる。個々の実施例には β受容体、サブスタンスＰ、Ｇプロティン及びがん遺伝子（例えば、ｊｕｎ遺伝 子）に対するｍＲＮＡが包含されている。

前述の理由から、ｍＲＮＡの測定能力は種々の疾病状態の病態生理を診断・認知 するのに有用であろう。この方法は、特に、遺伝性疾患、がん、及び伝染病を診 断するのに有用であろう。

この発明の好ましい標的は、３゛末端にポリアデニル酸テイルを含む真核細胞の ｍＲＮＡである。ｍＲＮＡの特異的なヌクレオチド配列が判れば、実質的にはど のようなｍＲＮＡもこの発明の方法を使って測定することができる。そのような ｍＲＮＡの実施例としては、ヒトのＧプロティン、ヒトのβ！受容体、サブスタ ンス　Ｐ１リンパ球表面抗原、免疫グロブリン、コラーゲン、及びアドレナリン 受容体である。

試験ヤ少ツヲレ 標的ｍＲＮＡを含む試験サンプルはいろいろな検体から得ることができる。好ま しい検体は、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）活性を不活性化処理した生きたサ ンプル即ち細胞液である。標準サンプルとしてｍＲＮＡを精製するのは、通常、 ノザンプロット処理法またはドツトプロット処理法に関連した方法に従って実施 できる。ｍＲＮＡ精製用キットは市販されている。

試験サンプルは、生体サンプルから、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ　）（ ｐＨ８、０）　１０　ｍＭ、　ＮａＣ１Ｏ，２Ｍ、５％ドデシル硫酸ナトリウム （ＳＤＳ）、ＲＮａｓｅ阻害剤５００単位／ａ１１１バナディルリポヌクレオシ ドーＶａｎａｄｙｌ　Ｒ４ｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ−複合体１０　ｍｋｌ及び プロティナーゼＫ　（以後溶解緩衝液と呼ぶ）２００μｇ／ｌで処理して細胞を 溶解させ、ＲＮａｓｅ活性を阻害して作成する。細胞溶解後は、ＮａＣ１濃度を ０．５Ｍに調節する。

關＾を含むサンプルを探査するというこの発明の方法では、すなわぢ四＾の分解 防止が望まれるいかなる処置においても、存在するかも知れないリボヌクレアー ゼ（ＲＮａｓｅ）の活性はいずれも阻害したほうが得策である。使用できるＲＮ ａｓｅの阻害剤の一つが、バナジルリポヌクレオシド複合体（ＶＲＣ）　（Ｂｅ ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒ ｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）である。ＶＲＣは、細胞の分画中及びＲＮ＾調製において 有効であることが報告されており、またＲＮｋのフェノール抽出またはエタノー ル沈澱には干渉しないことが示されている。加えて、ＶＲＣは細胞の他の細胞質 成分に影響を及ぼさない。それ故、ＶＲＣは、多（の実験処理におけるＲＮａｓ ｅに対する理想的阻害剤である。

しかし、ＶＲＣでＲＮａｓｅを阻害する先行技術の処置によって教示されたこと は、ＶＲＣは、ＥＤＴＡまたはＳＤＳを含む緩衝系（こねは分子生物学の分野で 一般的に使われている）では使用すべきではない、ということであった。この禁 忌の理由は、この複合体はそれらの緩衝液があると解離してＲＮａｓｅ阻害活性 の損失を招来すると信じられていたということであった。事実、ＶＲＣ製品に付 いているＢＲＬの添付文書では、液からのＲＮＡのエタノール抽出に先立ちＶＲ Ｃを「破壊」するため、ＥＤＴＡの５から１０倍を越えるモル数の超過分をＶＲ Ｃを含むＲＮＡ液に加えることを推奨している。

ＥＤＴＡとＳＤＳを含む普通の緩衝液とＶＲＣとは明らかに併用できないという ことは、従ってＲＮａｓｅ阻害剤としてのＶＲＣの開発に大きな障害となった。

しかし、ＶＲＣは、事実、ＳＤＳおよび／またはＥＤＴＡが存在していたとして も効果的ＲＮａｓｅ阻害剤であることを我々は見出している。従って、ＶＲＣは 、これまではそのような系では効果がないと信じられていたＳＤＳまたはＥＤＴ Ａを含む緩衝液を使用する分析で使うことができる。ＶＲＣは、ＲＮＡを処理す る時またはその他の各種の分子生物学的技術を使う時に通常使用されるＳＤＳ及 びＥＤＴＡの濃度で効果的なＲＮａｓｅ阻害剤である。例えば、約１ｍＭのＥＤ ＴＡを含む緩衝液中でＶＲＣは効率よ（ＲＮａｓｅを阻害することを我々は見出 している。また、ＶＲＣは０．５％のＳＤＳ溶液で効果があることを見つけてお り、２％、好ましくは１％までの範囲にある液に有効であろうと信じられている 。勿論、ＶＲＣはＥＤＴＡとＳＤＳとを含むその他の溶液で使用することも可能 である。

ＶＲＣは、プロティナーゼにと併用する時は特に有力なＲＮａｓｅ阻害剤である 。プロティナーゼにもＢＲＬから入手できる。図１０のゲルに示すように、Ｕ９ ３７細胞（ヒトのマクロファージ細胞系）から採ったｍＲＮＡはＶＲＣとプロテ イナーゼにとの組み合わせによってＲＮａｓｅ分解から保護された。このゲルの レーンｌは、ＶＲＣ，プロテイナーゼＫ及びＲＮａｓｉｎを含んだ細胞調製物か ら得たｍＲＮＡを示し、一方、レーン２は、ＶＲＣとプロティナーゼＫを含んだ 細胞調製物から得たｍＲＮＡを示す。ＲＮａｓｉｎはマデイソン、マディソン、 Ｗｌのプロメガ−Ｐｒｏｍｅｇａ−から市販されている。レーンｌおよび２にお ける明瞭なバンド１０はレーン７に示されたバンドと一致し、これにはＵ９３７ 細胞のＲＮａｓｅを含まない調製で得られる純粋なりローンｃＤＮＡが含まれて おり、このことからｍＲＮＡは、レーンｌおよび２の調製で実質的なｍＲＮへの 分解に遭わなかったことが示される。

レーンｌおよび２をレーン３から６と比べれば、プロテイナーゼにと組合せられ た場合、ＶＲＣは上記のＵ９３７細胞からのｍＲＮＡの調製において、プロテイ ナーゼにのみ（レーン４）の場合、プロテイナーゼにとＲＮａｓｉｎとの併用（ レーン３）の場合、または［ファーストトラックＪ　（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏｇｅｎ 　ｏｆ　ＳａｎＤｉｅｇｏ、　Ｃａより入手できる）と命名されて市販されてい るＲＮａｓｅ阻害調製物（レーン５）のどれよりも、はるかに広範囲にＲＮａｓ ｅを阻害していることが解る。レーン３−５のどれにも、分解されたｍＲＮＡを 意味する明瞭なバンド１０が表われていない。逆に、Ｌノーン４　（プロテイナ ーゼにのみ）及びレーン５（ファーストトラック）は分解されたｍＲＮＡについ てレーン６（阻害剤無いと同様の度合を示す。また図１０に示されたゲルも、レ ーン２　（ＶＲＣとプロティナーゼＫ）では、レーン４（プロテイナーゼにのみ ）またはレーン３（プロティナーゼにとＲＮａｓｅ）よりｍＲＮＡの分解が少な いことから、ｌ−のＥＤＴＡおよび５％ＳＤＳの緩衝液（［９３７細胞調製に使 われる緩衝液）でのＶＲＣの有効性を示している。

一ボ１ヌ　レオ　゛・プローブ この発明の実施に当たり、第一ポリヌクレオチドプローブカ坏溶性支持体に結合 される。この第一ポリヌクレオチドは標的ｍＲＮ＾を固体支持体にトラップする のに使用される。それ故、第一ポリヌクレオチドプローブは、サンプル中の他の ＲＮＡには生じないｍＲＮＡの配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を 含む。そのような配列はここではｍＲＮＡの特異領域と呼ばれる。好ましくは、 第一ポリヌクレオチドプローブは、特異領域とは別の標的ｍＲＮ＾の部分とは結 合させない。

特異領域は数種類の方法のいずれかで同定することができる。それらには次の方 法が含まれる：（１）いくつかの可能性のあ６ｍＲＮＡとそれらの標的ｍＲＮＡ との間でヌクレオチド配列を比較すること；（２）他のヌクレオチド配列と比較 できる候補配列を得ること：（３）標的＋ａＲＮ＾とペアを組まないヌクレオチ ド配列をコンピュータ・サーチすること。種々の既知ｍＲＮＡ配列に関する情報 はいくつかの遺伝情報データベースから入手可能である。

第一ポリヌクレオチドプローブは、安定なのはＲＮＡよりＤＮＡであるという理 由から、好ましくはオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）よりはむしろオリゴデオ キシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）である。ヌクレオチドの数は制限されない：し かじ、もしオリゴデオキシリボヌクレオチドが第一プローブとして使われるなら 、好ましい長さは１７−４０ヌクレオチドである。もし標的ＲＮＡのｃＤＮＡが 利用できるなら、完全ｃＤＮ＾の一部は第一ヌクレオチドプローブとして使用可 能である。第一ヌクレオチドプローブもＤＮＡシンセサイザーを使うか製造業者 によって容易に製作することができる。

この発明では、使用される第一ヌクレオチドプローブは不溶性支持体に固定され る。固定化についてはポリヌクレオチドの５°末端または３′末端にアミノ基を 付加するなどして化学的に修飾してもよい。

不溶性支持体 この発明の実施に当たり、第一ヌクレオチドプローブは不溶性の支持体に固定化 される。不溶性支持体は各種の不溶性物質、例えば、プラスチック板、膜フイル タ−、マイクロタイタープレートまたはその他ポリヌクレオチドを付着できる不 溶性物質ならどれでもよい。不溶性支持体は、好ましくは第一ヌクレオチドプロ ーブを共有結合で固定化できる物質から作られる。例えば、その表面にカルボキ シル基またはアミノ基を有するポリスチレンのようなプラスチックプレートが使 える。そのようなプレートは市販されている。しかしこれらの残基を導入する手 順は技術的にもよく知られている。市販されているプラスチックプレートの一つ でその表面にカルボキシル基を持つのは住人ベークライト製のＳ＋ｍ１ｌｏｎマ イクロタイタープレートＭＳ−３７９６Ｆである。その表面にアミノ基を有する プラスチックプレートは、ＳｕｍｉｌｏｒｒｖイクロタイタープレートＭＳ−３ ６９６Ｆである。

−ポ菅ヌ　レオ　゛の　・七 この発明の実施に当たり、第一ポリヌクレオチドプローブは不溶性支持体に固定 化される。ポリヌクレオチドを不溶性支持体に固定する方法は共有結合、イオン 結合および物理的吸収法等種々利用できる。しかし、共有結合法が好ましい。

故に、この発明のいくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドはその表面にカル ボキシル残基、アミノ残基、またはヒドロキシル残基のような官能基を有するマ イクロタイタープレートに固定される。

官能基を有する不溶性支持体にポリヌクレオチドを固定するための好ましい処置 としては、ポリヌクレオチドの５°末端を共有結合で官能基に結合することであ る。これらの官能基に対しポリヌクレオチドを共有結合させる方法は種々あり、 どれでも使用可能である。好ましいよく知られた方法の例としては、マレイミド 法およびカルボジイミド法がある。

図１に説明されているマレイミド法には、マレイミド基を含む物質とスルフヒド リル残基（ＳＨ）を含む他の物質との間の反応を伴う。マレイミド法を使って固 定支持体にポリヌクレオチドの５′末端を付着するためには、ポリヌクレオチド の５゛末端はマレイミド化合物と反応させられる。適当なマレイミド化合物は、 スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１− カルボン酸塩（スルホ−３ＭＣＣ：　ｓｕｌｆｏ−３ＭＣＣ）である。

ＳＨ残基は、アミノ基を持つ支持体とスクシンイミジル−８−アセチルチオアセ テート（ＳＡＴＡ）との間の反応、それに続くヒドロキシルアミン（ＮＨ，ＯＨ ）を使う脱アセチル化によって支持体に供給される。（スルホ−３ＭＣＣおよび ５ＡＴＡは、Ｐｉｅｒｃｅ社及び他の各種販売元から容易に入手可能）　結果と して得られた支持体上のＳ諺は、次いでポリヌクレオチドの５′末端のマレイミ ド基と反応してポリヌクレオチド−固定化支持体を形成する。マレイミド法を採 用して経験した一つの問題は、プレート上のＳＨ基は、ポリヌクレオチドの５° 末端でアミノ基と反応するだけではなく、プリン塩基、アデニン及びグアニン上 の第一級アミノ基とも反応するということである。ポリヌクレオチドがそれぞれ の５゛末端で固定化されることを保証するため、固定化に先だってそのポリヌク レオチドと相補的なポリヌクレオチドとを対（ベア）にしてプリン塩基上のアミ ノ基を保護することができる。固定化の後、相補的なポリヌクレオチドは変性（ 例えば、加熱すること）によって取り除かれる。

カルボジイミド法を図２で説明する。この方法には、カルボジイミド化合物を使 ったアミノ基とカルボキシル残基を含む物質との反応が含まれる。カルボジイミ ド化合物の例としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル ボジイミド塩酸塩（以後、ＥＤＣと呼ぶ）がある。この反応は、Ｎ−ヒドロキシ スルホスクシンイミド（以後、スルホ−ＮＨ３（ｓｕｌｆｏ−■Ｓ）と呼ぶ）に よって高めることができる。

ＥＤＣ及びスルホ−ＮＨ８の両方ともＰｉｅｒｃｅ社及び他の有名販売元から入 手可能。

ポリヌクレオチドを支持体に付着させるための好ましいカルボジイミド法の実施 に当たっては、カルボキシル残基が付着されている支持体を使う。ＥＤＣはスル ホ−ＮＨ３との反応によって活性化される。この活性化されたＥＤＣは表面結合 のカルボキシル残基を含む支持体と反応する。次いでこれをそれぞれの５°末端 にアミノ基を持つポリヌクレオチドと反応させて、ポリヌクレオチド固定化支持 体を得る。

ポリヌクレオチドがそれぞれの５゛末端で固定化されることを保証するため、固 定化に先だってヌクレオチドを相補的なポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ ることにより、アデニル、グアニル及びシトシル基土の第一級アミノ基を保護す ることができる。固定化の後、相補的なポリヌクレオチドは変性（例えば、加熱 すること）によって取り除かれる。

不溶性支持体上の活性化されたアミノまたはカルボキシル残基の非特異性結合は 、ポリヌクレオチドが既に固定されているプレートを第一級アミノ化合物、好ま しくはグリシンで処理することにより容易に少なくしまたは排除することができ る。

第一４刃ノ３」ジ忙ヒトとズ見ニブ 第二ヌクレオチドプローブには、第一の結合ヌクレオチド配列によってトラップ される標的ｍＲＮＡとハイブリダイズすることも可能な配列が含まれる。好まし くは、第二ポリヌクレオチドプローブは、第一ポリヌクレオチドプローブとは異 なったｍＲＮＡの部分にハイブリダイズする。特に好ましい具体例においては、 第二ヌクレオチドプローブはｍＲＮＡのポリアデニル酸テイルに相補的なヌクレ オチドを含む。第二ヌクレオチドプローブはまた、ＤＮＡの安定度がより高いと いう理由から、好ましくはＲＮＡよりむしろＤＮＡからなる。ヌクレオチドの数 は制限されない：しかじ、１５−４０のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド が好ましい。故に、１５−４０のヌクレオチドのポリ（ｄＴ）配列は好ましい第 二ポリヌクレオチドプローブである。

そのような第二ポリヌクレオチドプローブは、事実上真核細胞からのどの標的ｍ ＲＮＡに対しても共通の第ニブローブとして役に立つであろう。しかし、標的烈 ＾に対してｃＤＮＡが使用可能なら、このｃＤＮＡの一部または全部も第二ポリ ヌクレオチドプローブとして機能することができる。第二ヌクレオチドプローブ もＤＮＡシンセサイザーまたは製作業者によって容易に製造することができる。

第二ポリヌクレオチドプローブは、その存在を容易に検出するため好ましくは標 識される。標的物質を標識できる種々の化学物質が使われる。例えば、放射性同 位元素、＝ｆｐ、　３６ｓ、　！＋を及び１２′Ｉのような各種放射性核種が使 用できる。酵素も第二ポリヌクレオチドプローブを標識するのに使うことができ る。適当な酵素としては、アルカリ性ホスファターゼ、ルシフェラーゼ、及びペ ルオキシダーゼがある。その他の標識としては、ビオチン、アビジン、ストレプ トアビジン及びジゴキシゲニンーｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉ計のような化合物であろ う。発色または放射能を与える標識が望ましい。好ましい具体例ではビオチンが ヌクレオチドプローブに付けられ、続いてアビジン（例えば、アルカリ性ホスフ ァターゼのような酵素に結合したストレプトアビジン）が付けられる。酵素の存 在は、蛍光定量法によって検出可能な蛍光標識を有するＡＴＴＯＰＨＯ３のよう な種々の物質によって検出することができる。

いくつかの実施態様では、標識化合物の一部または全部を第二ヌクレオチドプロ ーブと置換する。ポリヌクレオチドの一部を置換する技術は各種の標識について よく知られており、それらの多くのものに使えるキットが市販されている。例え ば、ＤＮ＾３゛末端ラベリングキットまたはオリゴデオキシチミジル酸を使って プローブを標識することができる。

核酸も核酸染色剤で染色することにより「標識」することができる。故に、比較 的多量の核酸が存在するところでは、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を使って核酸 の存在を識別することができる。これはこの発明に関して有用である；例えば、 ａ＋ＲＮＡが固定化された短いアンチセンスプローブ−ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ　 ｐｒｏｂｅ−と既にハイブリダイズしているなら、その時はａ＋ＲＮＡが一つも ハイブリダイズしなかった時より実質上多い核酸が固定されることになる。しか し、染色剤の感度が高ければ高いほど好ましい。このような比較的感度の高い染 色剤には、種々のシアニン核酸染色剤、例えば、モレキュラプローブス社−Ｍｏ ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）−から市販されているＰ ＯＰＯ，ＢＯＢＯ，ＹＯＹＯ及びＴＯＴＯ等がある。これらの染色剤は、例えば 、５ｃｉｅｎｃｅ、　２５７：８８５（１９９２）に記載されている。この発明 の関連で使用される特に好ましい染色剤には、比較的短波長型のＴＯＴＯ−１及 びＹＯＹＯ−１，さらにより好ましくはＹＯＹＯ−１がある。４ピコグラム位の 小量の染色されたＤＮＡはトランスイルミネータまたは手持ちの四ランプの照射 により可視蛍光で検出できる。故に、これらの染色剤は核酸の存在を識別する上 で特に容易で且つ感度の良い方法を提供する。

我々は、ここで議論するようにウェルに固定されたオリゴヌクレオチドを染色す るためＹＯＹＯ−１の効力を試験した。先ず、種々の既知量のオリゴヌクレオチ ドをウェルに固定し、非固定化オリゴヌクレオチドを洗い流した。次いで、水で １＝１０００に薄められたＹＯＹＯ−１を加えた。その後、洗わずに直接蛍光定 量計を使用した。

オリゴヌクレオチドの各ピコモル間の関係を図１５の白丸で示す。我々はまたＴ ＯＴＯ−１で染色され固定化されたオリゴヌクレオチドを１０分間インキュベー トし、洗浄して水を加え、続いて蛍光定量計を使用して計った。洗浄した時の結 果を図１５の黒丸で示す。洗浄は染色量にそれほどの影響を及ぼさないこと、及 び染色量はオリゴヌクレオチドの量に関係することが同図から分かる。

我々はまた１時間以上にわたるＹＯＹＯ−１の染色の時間経過を試験した。そこ にはオリゴヌクレオチドがプレートに固定されていない参照試料（コントロール ）を含めた。オリゴヌクレオチドが固定化されたプレートの場合を図１６の白丸 で、コントロールを同図の黒丸で示す。図１６から明らかなように、初期スパイ ク後は比較的一定の染色がみられる。

さらに、ウェルに固定されたオリゴヌクレオチド（図１７白丸）とオリゴヌクレ オチドの無いコントロール用ウェル（図１７黒丸）で一定量のオリゴヌクレオチ ド用量反応（ドーズレスポンス）を試験した。５回実験を繰り返し、オリゴヌク レオチド固定化（＋）及びオリゴヌクレオチド無しく−）の両方のウェルについ てのデータを図１８に示す。このデータから、各々の実験で事実上類似していた ことが分かる。

このように、染色剤としてｙｏｙｏ−ｉを使うことによって、存在しているオリ ゴヌクレオチドの量について信頼できる指標が与えられることが、図１５−１８ に示されたデータから分かる。

丈２プ匹９適里 この発明の好ましい方法では、ＩＤＲＮＡを含むサンプルを第一ポリヌクレオチ ドプローブが既に結合されている不溶性支持体に供される。サンプル中に見られ る標的ｍＲＮ＾はどれも第一ポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせら れる。このことは、通常の技能を有する当業者によく知られているように、種々 の要因に依存する温度で定温保持することにより実行できる。これらの要因には 、相補的なヌクレオチド配列の長さ、相補的なヌクレオチド配列にある全塩基含 量中のグアニンまたはシトシンの比（ＧＣ含量）、緩衝液中のＮａＣｌの濃度、 相補的なヌクレオチド配列とミスマツチする塩基の数、及びヌクレオチドの種類 が含まれる。この発明の好ましい形では、好ましいインキュベーション温度を計 算するために次の式が使える： 丁１．．　＝　１６．６　ｘ　ｌｏｇ（Ｍ）＋　０．４１（ＧＣ）＋　８１．５ −６７５／ｎ　−１５（℃）。

上記の式で、關は液中のＮａＣ１の濃度（Ｍ）、ＧＣはＧＣ含量（％）、ｎはヌ クレオチド配列の長さくヌクレオチドの数）である。

保温時間はまた「モレキュラー・クローニング」のマニュアルに記載されている 方法によっても決めることができる。

インキュベーションに要する時間は、好ましくは１時間から１夜までで、好まし くはインキュベージコン中はサンプルを静かに振盪させること。保温は好ましく は適当な緩衝液中で行う。ノザンプロットまたはドツトプロット法でＲＮＡとＤ ＮＡをハイブリダイズさせるのに使ったものと同じ緩衝液を使うことができる。

緩衝液は、好ましくはＲＮａｓｅで汚染されないような方法で調製する。もし多 少のＲＮａｓｅ汚染がある場合、その活性が出来るだけ低くなるよう制御するこ と。ＲＮａｓｅを含まない緩衝液は、前に示したようなｍＲＮＡ精製キットまた は溶解緩衝液の範囲で市販されている。

この発明の方法に使う水からＲＰＪａｓｅの活性を排除するため、水は好ましく はジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）で処理する。好ましいＤＥＰＣ処理は 、０．１％のＤＥＰＣを水に加え、次いで３７℃での一晩保管及びオートクレー ブ中での滅菌を行う。

洗浄処理 好ましくは、保温後、サンプルのうち結合しない成分を不溶性支持体から洗い流 す。洗浄用の適当な溶液としては、前述の溶解緩衝液またはｍＲＮＡ精製キット に含まれる緩衝液がある。

ニポ１ヌ　し　゛プローブの 第二ポリヌクレオチドプローブは、サンプル中のＩＩＩＲＮ＾の第一ポリヌクレ オチドプローブとのハイブリッド形成に関連して上述したような条件下で、サン プルの未結合成分の洗浄後に不溶性支持体に供される。

これに続いて好ましくは上述のように洗浄する。

定員 サンプル中のｍＲＮＡの量は、不溶性支持体に結合される第二ポリヌクレオチド プローブの量をその適用後この発明に従って測定することにより定量する。この 関連で、物理的または化学的量または第二ポリヌクレオチドプローブ上の標識の 活性が、光学密度、放射光強度、または放射能を含む種々のテクニックにより測 定される。標識自体、この指標を提供でき、あるいはそれに結合又は触媒する他 の化合物を要求することもできる。標識を検出するその他のメカニズムとしては 、標識に対して化学的に反応可能な化合物の使用、色素標識の検出、放射光の検 出、放射線の検出、または触媒活性の使用がある。

好ましい測定技法では、第二ポリヌクレオチドに付ける標識はビオチンである。

この標識の存在は、ペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼのような 酵素との反応によって検出できる。これらの酵素は本質的にアビジンまたはスト レプトアビジンとの結合によってビオチンに配向される。次いで酵素の存在が検 出可能なカラー発色または光放射反応を示す適当な基質を加えることによって検 出される。アルカリ性ホスファターゼ標識化ストレプトアビジンは市場から容易 に入手可能である。アルカリ性ホスファターゼに対する好ましい基質はアダマン チル−１，２−ジオキセタンリン酸−ａｄａｍａｎｔｙｌ−１，２−ｄｉｏｘｅ ｔａｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＭＰＰＤ）である。アルカリ性ホスファター ゼと反応するとＡＭＰＰＤは４４７ｎｍの波長で光を放出する。

この光は周知の技法で検出することができる。

アルカリ性ホスファターゼとＡＭＰＰＤとの反応では、５−Ｎ−テトラデカノイ ル−アミノ−フルオレセインのようなエンハンサ−を添加することができる。５ −Ｎ−テトラデカノイル−アミノ−フルオレセインは、４７７ｎｍの波長の光を より検出が容易な５３０ｎｍの波長に変換する能力を有している。

その他の好ましい標識としては、ジゴキシゲニンのような抗原または抗体が含ま れる。抗原は、それに配向する抗体と結合するという自己能力によって検出され る。そのような抗体、即ち第二ポリヌクレオチドプローブを標識するために直接 使用される抗体はプロティンＡと結合する自己能力によって検出される。抗体自 体は＋２Ｊのような放射性核種で直接標識するか、または放射性核種で標識され たプロティンＡを抗体に結合させて標識することができる。次いで放射性核種は 周知の技法で検出することができる。

標識検出に関してよく知られている技法には、カラー発色反応で出現する標識の 分光光度計による検出がある。その他の類似の技法としては、Ｘ線フィルムまた はインスタントカメラを使う光放射反応の検出、及び放射線カウンターを使う放 射線の検出がある。放射反応は暗室においてＸ線フィルムまたはインスタントカ メラに記録される。放射反応で露光されるＸ線フィルムにはプロット（しみ）と じて記録され、このプロットの濃淡が濃度計で測定される。もしポラロイドのよ うなインスタントカメラを使うときは、その画像をスキャナで読みとり、コンピ ュータでプロットの位置を決め、図形分析のソフトウェアを使ってプロットの濃 淡を測定する。

未知のサンプル液中の標的ｌｌｌＲＮＡの量を測定するため、標的ｍＲＮＡの標 準液と相対濃度との関係をプロットで示す演算図表を使うことができる。標的ｍ ＲＮＡに対する標準液は精製された標的ｍＲＮＡである必要はない。故に、その 標準はその中での標的ｍＲＮＡの量が知られている混合液でもよい。

概葡倒 この発明による模範的方法の略図を図３に示す。標的ｍＲＮＡ　１はポリアデニ ル酸テイル２を持っていることが示されている。第一ヌクレオチドプローブ３は 不溶性支持体４に固定され、次いで標的ｍＲＮＡが混合される。標的ｍＲＮＡ　 ｌは第一ヌクレオチドプローブ３とハイブリダイズし、それによって標的ｍＲＮ Ａを不溶性支持体に固定する。次いで、標識６を有する第二ヌクレオチドプロー ブ５は、第一ヌクレオチドプローブとハイブリダイズしている部分以外の標的ｍ ＲＮ＾の部分とハイブリダイズする。示されているように、第二ヌクレオチドプ ローブ５はポリ（ｄＴ）より成り、標的ｍＲＮＡ　１はポリアデニル酸テイル２ とハイブリダイズする。

その結果生じる複合体７は次いで標識６の有無を検出することにより同定される 有益なことには、この発明によって、先行の方法よりはるかに短時間で実行でき るｍＲＮＡの測定法が提供される。下の表１は、ＤＮＡ測定に要する時間をこの 発明の方法とノザンプロット法とを使って比較したものである。

表１ ｍＲＮＡ　につい　の 本発明　ノザンプロット法 時間（ｈｒ）　時間（ｈｒ） →細胞溶解　１　−ｈｍＲＮＡの精製　４８→ｍＲＮＡに対する第一ヌクレ　→ アカ’　ｒＪ−１ケ１ルを用いた電気泳動オチドのへイフ゛リタ゛イセ゛−シ１ ン　１１こよるｍ　ＲＮＡの分離　１→ｖａＲ）ｉ＾の変性 ！ｌＲＮＡを膜へ移動　ｌ →ｍＲＮＡを膜へ固定　２ →ｍＲＮＡに対する第二ヌクレ　→ｍＲＮ＾とプローブとのオチドのへイフ゛リ タ゛イセ゛−ン曹ン　ｌ　ハイブリダイゼーション　１２→洗浄およびブロッキ ング　０．２　→洗浄およびブロッキング　４→検出　ｌ　→検出　ｌ 計　約５時間　約７０時間 表１に示すように、この発明の方法では、一般的に完了までに約５時間以下を要 し、一方、ノザンプロット法では一般的に約７０時間必要である。これらの時間 には、ヌクレオチドプローブに標識を付ける時間も第一ヌクレオチドプローブを 固定化する時間も含まれていない。何故ならこれらの構成は測定以前に準備でき るためである。

臨床上有用な情報を得るため測定される標的ｍＲＮ＾の特別の実施例を以下に掲 げる。ここに含まれる実施例はこの発明の好ましいいくつかの実施態様を説明す るためのものである。これらの実施例はいかなる方法においてもこの発明の範囲 を限定するものではない。

Ｉ受容体 疾病状態を決定するためにｍＲＮＡ測定を用いる可能性のある目的の１つは、β 受容体に対してｍＲＮＡを利用することである。β受容体はヒトの神経組織にあ るタンパク質である。特に、β２受容体における異常は喘息に密接に関係してい ることが見い出されている。故に、β２受容体に関してｍＲＮＡを測定すること は、喘息患者の病態生理を決めるために用いることができ、また、抗喘息剤の効 能を評価するためにも使用できよう。

実施例１ ヒトβ鵞受容体のｍＲＮＡの測定 （検量線の作成） （１）　−し　゛プロー　の ５′末端にアミノ基を付けた下に示すヌクレオチド配列を含むオリゴデオキシリ ボヌクレオチド・プローブは、Ｇｅｎｏｓｙｓ社（ＴＸ）によって合成された。

この配列で、＾、ＣＳＧおよびＴはそれぞれアデニン、シトシン、グアニンおよ びチミンを表す。

コンピュータ分析（ＤＮＡＳＩＳ、　Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｅｎ ｇｉｎｅｅｒｉｎｇＡｍｅｒｉｃａ、　Ｌｔｄ、　、　ＣＡ）に基づいて、この 配列は、ヒトのβ宜アドレナリン作用受容体のｍＲＮＡと相同−ｈｏａ＋ｏｌｏ ｇｏｕｓ−であることが決定された。

５°−ＮＯ，−＾ＴＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣＧＴＧ　ＡＣＧ　ＣＡＣＡＧＣＡ−３’ 　（Ｓｅｑ　ＩＤ　ＮＯ：６）（２）　−ヌ　し　チ′プローブの・　−へのＥ ＤＣ及びスルホ−？ＪＨ３（Ｐｉｅｒｃｅ、　ＩＬ）の両方をＤＥＰＣ処理の水 にそれぞれ濃度２０ｍＭ及び１０ｍＭで溶解した。次いでＥＤＣ／スルホ−■Ｓ 溶液は、同容積のＥＤＣ及びスルホ−ＮＨ８の両方を混合して作成した。第一ヌ クレオチドプローブをＤＥＰＣ処理の水にｌμｇ／μｍの濃度で溶解し、その後 ＥＤＣ／スルホーＮＨ８溶液と１：２５（Ｖｏｌ：Ｖｏｌ）の比で混合した。

この溶液５０μｍを、マイクロタイタープレート（ＭＳ−３７９６Ｆ住友ベ一ク ライト社）の各ウェルに添加した。このウェルは、その表面にカルボキシル基を 表出していると知られているものである。室温で一晩保温後、反応液をアスビレ ーション（吸引）により取り除いた。

（３）唾ＭΦ準備 ヒトのβ２アドレナリン作用受容体ｃＤＮＡを含むＤＮＡプラスミドｐＵＣ１８ （ｐＴＦ。

Ａｍｅｒｊｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）をＰｓ ｔｌおよびＥｃｏＲＩで消化し、同一の制限酵素で予め消化されているｐＢＣフ ァージミド（ｐＢＣｐｈａｇｅｍｉｄ、　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　ＣＡ）と混 合した。得られたプラスミドはＰｓｔｌで直鎮状にされ、フェノール−クロロホ ルムで一度抽出し、エタノールで沈澱させ、そしてリボプローブシステム及びＴ ７　ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｗｌ　）を使ってヒトのβ２受容 体ｍＲＮＡの転写に使われた。転写されたヒトのβ２受容体ｍＲＮ＾はＲＮａｓ ｅを含まないＤＮａｓｅで処理して、残存している鋳型ｃＤＮ＾を消化し、次い で１サイクルのフェノール抽出とエタノール沈澱によって精製した。得られたｍ ＲＮＡはアガロース（ＦＭＣｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、　ＭＥ）ゲル電気泳動で シングルバンドで示された。メツセンジャーＲＮ＾の濃度は、それぞれ２５ｐｇ 、　２５０ｐｇ。

２．５ｎｇ、２５ｎｇ及び２５０ｎｇの濃度で作られた標準ｍＲＮＡ液に対して 分光光度計により２６０及び２８０　ｎｍで測定された。

（４）　ｍＲＮＡこ・　−ヌ　レオチ゛プローブのバイブ１　ゼーシ　ンウエル からＲＮａｓｅを取り除くため、第一ヌクレオチドプローブが固定されたウェル を、０．５　Ｍ　ＮａＣ１を含む２５０μｌの溶解緩衝液を用いて４５℃で１時 間処理した。緩衝液を個々のウェルからアスピレーションにより取り除き、ヒト の種々の濃度の標準β２受容体ｍＲＮ＾を含む溶解緩衝液５０μｍを各ウェルに 加えた。これらの液はハイブリダイゼーションさせるため５９℃で１時間保温し た。

（５）　ニ　レオ　゛プローブの一成 第二ヌクレオチドプローブは５°末端でビオチンによって標識された１５−ｍｅ ｒオリゴ（ｄＴ）であった。

ステップ（４）で記述したｍＲＮＡと第一ヌクレオチドプローブとのハイブリダ イゼーション後、ハイブリダイゼーシン液をアスピレーションにより取り除き、 各ウェルを２５０μｌの溶解緩衝液を用いて洗浄した。０．５　Ｍ　ＮａＣ１お よび１μｌのビオチン化第ニブローブ液（３５ｐｍｏｌ／μｌ）を含む５０μｌ の溶解緩衝液を各ウェルに加え、室温で１時間追加保温した。

（７）　ニヌ　レオ　゛プローブの４８　の！ステップ（６）に記載したハイブ リダイゼーションに続き、ハイブリダイゼーション液をアスビレーションにより 取り除き、ウェルを２５０μｍの溶解緩衝液を用いて一回洗浄した。（０，０５ ％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ　２０．５００　ｍＭ　ＮａＣ１，１００ＤＭ　トリス −ＨＣｌ、　ｐＨ７゜５）からなるブロッキング緩衝液を各ウェルに加え室温で ５分間保温して非特異的結合を減じた。次いで、反応液をアスビレーションによ り取り除いた。１１５０００ｖｏ１．のアルカリ性ボスファターゼを結合したス トレプトアビジンの溶液（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、ＡＣ）を含むブロッキング液５０ μｍを各ウェルに加え室温で３０分間インキュベートした。各ウェルは、５００ 　ｍＭ　ＮａＣ１，１００ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５とＬｕｍ１ｐｈ ｏｓ５３０溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ４ａｎｎｈｅｉｍ、　ＩＮ）５０μｌを 含む洗浄液２５０μｌで洗浄し、全てのプレートは特殊ホルダー（ＭＹＣ，Ｋｃ ｘｌａｋ、　ＮＹ）内のＸ線フィルム（ＸＡＲ５，Ｋｏｄａｋ、　ＮＹ）の上に 置いた。Ｘ線フィルムを、室温で１時間、放射される化学ルミネッセント光に露 光し、次いでフィルムプロセッサ（ＱＸ−４００，コニカ）で現像した。Ｘ線フ ィルム上の各ウェルの相対強度はデンシトメータ（ｍｏｄｅｌ　６２０．　Ｂｉ ｏ−ｈｄ、　ＣＡ）で定量した。

（８）結果 実施例１の結果を図８に示す。挿入図（Ａ）は、この発明の方法によってｍＲＮ Ａの検出中における化学ルミネッセント光に露光されたＸ線フィルムの結果を示 し；（Ｂ）は（Ａ）におけるのと同じ像のデンジトメトリックな濃淡表示を示し ：（Ｃ）はｍＲＮＡの検量線を例示しており、ここでＸ軸はｍＲＮＡの濃度、Ｙ 軸は個々のウェルにおける化学ルミネッセンスの相対強度を表す。ウェル１．２ ．３．４および５は、それぞれ被験ｍＲＮＡの量２５ｐｇ、　２５０ｐｇ、２． ５ｎｇ、　２５ｎｇおよび２５０ｎｇに対応する。（Ａ）に示されているように 、この発明の方法によってｍＲＮＡは２５　ｐｇを越える量で検出された。（ｃ ）に示す検量線はｍＲＮＡについて濃度を２５ｐｇから２５０ｎｇへ増やしてい く時の信号の直線性が高いことを示している。

比較何１ ンブロ・・　こ　の州Ａの （１）　、ｍＲＮＡの　ガロース゛ル　′０．１％ＤＥＰＣを含む１０　ｍＭリ ン酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ７，０）を−晩３７℃で加熱し、オートクレーブに かけた。この１０　ａ＋ＭのＤＥＰＣ処理をしたリン酸緩衝液を使って１％アガ ロース溶液を作った。その溶液は約５０℃まで冷却し、ヨード酢酸を０．２％（ Ｗ／Ｖ）まで加えた。平板ゲルをコウムを用いて作製（６，５ｃｍ　ｘ　１０　 ｃｌＩｌ）　Ｌ、、室温に１時間置いて硬化させた。２５０ｎｇ、　２５ｎｇ、 　２．５ｎｇ、　２５０ｐｇまたは２５ｐｇのｍＲＮＡを含むＤＥＰＣで処理さ れた水５μｌをローディング緩衝液（１２５μｌ　ＤＭ５０．４２μｍ４０％グ リオキサール、３μＩＩＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０）　７μｌと混 合し、５０℃で１時間インキュベートした。サンプルをゲルに供試し、ＤＥＰＣ 処理の１０　ｍＭリン酸緩衝液中で６Ｖ／ＣＩｌ＋の定電圧で１５分間、環流さ せないで電気泳動させた。さらに１時間の電気泳動を循環して行った。電気泳動 に続いて、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ、順）を含む５０Ｍ 誠の水酸化ナトリウムに２０分間、そして０．１Ｍ１−リスーＥｌ緩衝液ｐ）１ ７．５に４０分間浸した。次いで、ゲルを新鮮な０．１Ｍ＋−リス−ＨＣｌ緩衝 液へ移し、ＵＶ光で撮影した。

（２）吐臥９展会ｐｊブン挺拶 濾紙（３ＭＭ　Ｃｈｒ、　Ｖｈａｔｍａｎ、　ＮＪ）及びナイロン膜（Ｍａｇｎ ａｇｒａｐｈ、　Ｍｉｃｒｏｎ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、　ＭＡ）を無菌水に ２０分間浸し、次いで、ｌＯｘ　５ＳＰＥ（１０Ｎ　ＮａＯＨで調節されたｐＨ ７，４の水中、１．５１　ＮａＣ１，、１１５ｍＭリン酸ナトリウム、１１．５ 　ｍＭ　ＥＤＴＡ）に入れた。プロッティングスポンジ（Ｓｔｒａｔａｇｃｎ、 　ＣＡ）も１０ｘ　５ＳＰＨに入れた。ポジープロットプレッシャープロッター −Ｐｏｓｉ−ｂｌｏｔ　Ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｂｌｏｔｔｅｒ−（Ｓｔａｒａｔａ ｇｅｎ、　ＣＡ）底部より３ＭＭ濾紙、ナイロン膜、アガロースゲル、およびス ポンジを重ね、陽圧（４５分間、８３５ｍｏ＋Ｈｇ）でｍＲＮＡをナイロン膜に 転写させた。ナイロン膜を乾かし、１２０　ｍｊｏｕｌｅｓの出力でＵＶ光によ る架橋結合（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ　１８００．　Ｓｔｒａｔａｇｅｎ、　 ＣＡ）を行いｍＲＮＡを永久的にナイロン膜に固定した。

（３）　−Ｅ、を天２化ψ８プ旦ニブ曵準澹ＤＮＡプローブは、β！受容体ｃＤ ＮＡからＤＮＡ標識キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　ＩＮ ）とビオチン標識化デオキシウリジル酸（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、　ＣＡ）を使って 作製した。簡単に説明すれば、β雪受容体ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＴＦをｐ ｓｔｌとＥｃｏＲＩとで消化し、得られたプラスミドとｃＤＮＡをアガロースゲ ル電気泳動によって分離した。β２受容体ｃＤＮＡ（７）バンドを切り出し、Ｇ ｅｎｅ　ｃｌｅａｎ　ｋｉｔ（Ｂｉｏ　１０１．　ＣＡ）を使ってゲルから取り 出した。５μｌの水に溶解した上記のｃＤＮ八〇へ１ｇｇを９５℃で１０分間イ ンキュベートし、次いで、ヘキサヌクレオチド混合液２μｍ、ｄＮＴＰ　２μｍ およびフレノウ酵素（ＤＮＡ標識キット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｃｒ−Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ、　ＩＮ）　１．ＣＺＩと共に３７℃で１時間インキュベートした。インキ ュベーションに続いて、０．２　Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０を２μ１．４．Ｏ Ｍ　ＬｉＣ１を２゜５μｍ、および１００％エタノールを７５μｌ加えて反応を 終わらせ、−７０℃で３０分間冷却してｃＤＮＡを沈澱させた。遠心分離後、ペ レットを７０％エタノールで一回洗浄し、次いで、５０μｍの水に溶解した。

（４）Ｙオチ之不表駅些り茜込ξのハイ２２１−ダイガニｚ１２ｍＲＮ＾を含む 膜を、０．５　ＩＩ　ＮａＣ１を含むハイブリダイゼーション緩衝液（ＥＣＬ。

Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ル）中、４５℃で１時間インキュベートした。上述のビオ チン化ｃＤＮＡは、先ず９５℃で１０分間熱変性した後、直ちに氷上で冷却し、 次いでハイブリダイゼーション緩衝液に添加した。ハイブリダイゼーションは４ ０℃で一晩続けた。

（５）標識ｃＤＮＡプローブの　＾　の　完ハイブリダイゼーション後、膜ハ３ ６％（ｍｌ／Ｖ）（７）尿素、０．４％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳおよび０．５ＭＮａＣ １を含ませた０、　５ｘ　５ＳＰＥ中で各１５分間２回洗浄し、次いで、０．５ Ｍ　ＮａＣ１を含む２ｘ＆ＳＰＥ中、室温で各５分間２回洗浄した。その後、ブ ロッキング剤（Ｂｏｅｈｒｉ　ｎｇｅｒ−ＭａｎｎｈｅｉｍｌＮ）と１５０　ｍ ＭＮａＣｌを含む１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７，０を用いて膜を室 温で３時間保温した。１１５０００　ｖｏｌのアルカリ性ホスファターゼ標識ス トレプトアビジン（Ｃ１ｏｎ−ｔｅｃｈ、　ＣＡ）を上記の溶液に加え、室温で ３０分間保温した。膜は、１５０　ｒｎＭＮａＣｌを含む１００ｍＭ）リス−〇 ＣＩ　ｐＨ７，０で各３０分間２回室温で洗浄し、続いて、アルカリ性ホスファ ターゼ緩衝液（トリス−ＨＣｌ緩衝液に１０００１Ｍ　ＮａＣ１，５ｍＭ　Ｍｇ Ｃ１−を混入、ｐ）１９．５）を使って室温で２分間１回だけ洗浄した。次いで 膜をＬｕｍ１Ｐｈｏｓ　５３０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　 ＩＮ）に浸し、素早く２枚の透明なプラスチックフィルムの間に入れた。膜の化 学ルミネッセンス信号を、特殊ホルダー（ＭＹＣ，コダック社。

ＮＹ）内のＸ線フィルム（ＸＡＲ５，同社）に室温で１時間露光させた。

（６）結果 比較例１のノザンプロットの結果を図８（■）に示す、ここではｍＲＮＡの化学 ルミネッセンス信号がＸ線フィルムに露光された。図８（Ｉ）のレーンｌ、２． ３．４及び５は、供試されたｍＲＮＡの２５１）ｇ、　２５０ｐｇ、　２．５ｎ ｇ、　２５ｎｇ及び２５０ｎｇにそれぞれ対応する。このｃＤＮ＾ＤＮＡブは実 施例１で用いられたオリゴヌクレオチド・プローブより約１００倍大きいため、 取り込まれたビオチンの量もオリゴヌクレオチドの１００倍以上である。

この結果から、比較例１で使用されたｃＤＮＡプローブはオリゴヌクレオチド・ プローブより約１００倍大度が高いことが示されている。しかし、図８（Ｉ）に 見られるように、従来のノザンプロットでは、２５　ｎｇ以上のｍＲＮＡを含む サンプルしか検出できない。これは図８（■）に例示されているこの発明の方法 よりはるかに低い感度である。また、図８（Ｉ）に記載された発明では、ノザン プロットで使われたｃＤＮＡプローブと較べてより感度の低いオリゴヌクレオチ ド・プローブが用いられた。

実施例２ 未匁巳し乙！少左鄭４と；Ｆの１１受容羽迫肪入ｐ　び　の（１）第二うＬλレ オフジト！ｑニ１！Ｍσ葭およρΔトゲ五溶弧Ｊび１本）２項Ｖｔ化第−ヌクレ オチドプローブは実施例１に記載したように調製し、不溶性支持体上に固定した 。

（２）標準江島ｐ舅玉 ｍＲＮＡは実施例１に記載したように調製した。

（３）細胞溶解吻例與製 ヒトＨＬ６０の前骨髄球白血病細胞を遠心分離で集め、ＰＢＳ（１１ｉｔｅｒの 水にＮａＣ１８ｇ：にＣＩ　０．２ｇ；　Ｎａ＝ＩＰ−１，４４ｇおよびＫＨ， ＰＯ，０，２４ｇを含む、ｐＨ７，４）で洗浄した。次いで、その細胞を溶解緩 衝液中で１　ｘ　ｌＯ’ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で再懸濁した。その液を２１ゲ ージ針付き無菌プラスチックシリンジ中を繰り返し通過させ、ゆっくり振盪する 水槽中で４５℃１時間インキュベートした。

（４）Ｑイブ雪　イゼーシ　ン　び　ウルミ　・・センス　１第一ヌクレオチド プローブのハイブリダイゼーション、第二ヌクレオチドプローブの調製、標識さ れた第二ヌクレオチドプローブのｍＲＮＡポリ（Ａ）テイルとの７Ｎイブリダイ ゼーシヨン、および標識された第二ヌクレオチドプローブの化学活性の測定は、 実施例１に記載したように行われた。

（５）検ユ募少作成 実施例１に記載したように、既知のβ２受容体ｍＲＮＡの濃度に関する検量線を 作成した（図９）。検量線は、対数目盛りでマツプされたｍＲＮＡ濃度とＸ線フ ィルムから読みとられた化学ルミネッセンスの強度とは直線関係にあることを表 している。

（６）再５才七辺評賃 ＨＬ６０細胞溶解物に由来するβ２受容体の特定ａ＋ＲＮＡの濃度は３回測定さ れた。

表２において、β、受容体の特異的なｍＲＮＡの各濃度は上記（５）項で記述し た検量線から決定した。データの平均及び標準誤差（Ｓ、　Ｅ、　）を計算した 。細胞数は位相血球計数器−ｐｈａｓｅ　ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ−（Ａｍ ｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　ＩＬ）でカウント し■B 表２に示すように、３つの別々の分析は、０．９６−１．１２　ｆｇ／ｃｅｌｌ の範囲内に入るよく似たｍＲＮＡ値を示している。このことは、本発明の方法は 、特異的なｍＲＮＡレベルの再現性のある定量法を提供することを示唆している 。

表２ ＨＬ６０細胞中のβ２受容体−特異的ｍＲＮ＾の濃度アッセイＮｏ、　ｍＲＮＡ 濃度［ｆｇ／細胞］平均　±Ｓ、　Ｅ、　１．０３±０．０４Ｇプロテイン ホルモン及び神経伝達物質についての細胞表面受容体は、α、β、およびτのサ ブユニットからなる細胞間へテロ三量体ＧＴＰ結合プロティン−ｉｎｔｒａｃｅ ｌｌｕｌａｒｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ　ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏ ｔｅｉｎｓ　−（Ｇプロティン）と連結していることが分かっている。受容体が 特異的なリガンドによって活性化されると、受容体一連結Ｇプロティンは、信号 を細胞間二次エフェクター系（例えば、アデニリルシクラーゼ、ホスホリパーゼ Ｃ１及びイオンチャネル）に変換する。

最近、受容体とＧプロティンとの相互作用の細胞間メカニズムが不鮮明になって きている。何故なら、超分子クローニングによって、存在するＧプロティンの既 知細胞機能より多くのＧプロティンαサブユニットの下位分類が同定されている からである。更に、単一の受容体が多重Ｇプロティンと連結できることも見いだ されている。例えば、ヒトのＨＬ６０細胞にあるヒスタミンＨ２受容体は、アデ ニリルシクラーゼ及びホスホリパーゼＣをそれぞれ活性化する２つの異なったＧ プロディンと結合した。またＧＡＢＡ−Ｂ受容体は、Ｇｏ、　ＧｏｏおよびＧ１ −１と連結できるが、Ｇ１−５プロテインとはできないことも報告されている。

更に、ＣＨＯ細胞は、同一のホスホリパーゼＣの経路を活性化するが異なった受 容体と選択的に連結する多重Ｇプロティンを表すことが知られている。受容体の 中には、細胞の分化状態または細胞サイクルの特殊な局面に依存してそれらのＧ プロティンサブクラスの関係を変更するものもある。−例としては、Ｇプロティ ンをコードするｍＲＮＡがあげられよう。Ｇプロティンは細胞膜の種々の受容体 の機能と結びつき且つそれらを制御する。それはｃＡＭＰとカルシウムイオンの 存在しない反応系との細胞間反応を促進する。これらの分子は種々の細胞の伝達 物質系に用いられる。

Ｇプロティンは種々の疾病状態を引き起こす際に含まれると信じられている。例 えば、Ｇ、プロティンの遺伝的欠乏は遺伝性の骨栄養失調症−ｏｓｔｅｏｄｙｓ ｔｒｏｐｈｙ−の分子的にみた根拠である。先端巨大症患者の下垂体がんは、変 種のＧ、プロティンを含むことが示されている。Ｇプロティンはまた進行性がん 性黒色腫細胞−１ｎｖａｓｉｖｅａｎｄ　ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ　ｍｅｌａｎｏ ｍａ　ｃｅｌｌｓ−にも含まれている。ストレプトシトシン誘発の実験用真性糖 尿病ラットモデルは、Ｇαプロティンの種々のサブクラスに対するｍＲＮＡの含 量は正常な対照ラットとは顕著に異なっていることを暗示している。更に、百日 咳トキシン感受性のＧプロティンの細胞機能は、アテローム硬化症の豚の冠状血 管動脈で顕著に減少していることが示され、一方、そう病患者の白匍球における Ｇプロティ２機能は過剰であった。故に、Ｇプロティンの不調に関係があると知 られているこれらの疾病には、アテローム硬化症、双極性不調、真性糖尿病、黒 色腫および下垂体がん等が含まれる。

最近有効な免疫学的検出法（ウェスタンプロット）およびｍＲＮＡ検出法（ノザ ンプロット）は敏感ではなく且つ多量の細胞材料を必要とし、疾病におけるＧプ ロティンの役割を研究するのを困難にしている。現れたＧプロティンの量を確か めるのは容易ではない。もしＧプロティンに関連するｍＲＮＡが測定されれば、 前出の疾病のうちの一つを持っている患者の病態生理を認知するのに使えよう。

これらの条件を停止または制御するために考案された薬剤の効果もまたこの技術 を使って測定できよう。Ｇプロティンはα、β、およびγのサブユニットからな る。αサブユニットはいくつかの対立遺伝子変異体を有することが知られている 。故に、ＧプロティンｍＲＮＡの各変異体を測定することにより各変異について 現れる量が推定される。

実施例３ ヒ　のＧプロティンαサブユニ・・　・ＩＩＲＮ＾の（１）　−ヌ　し　゛・プ ローブの・ Ｇｓプロティン特異的ｍＲＮＡ及びＧ１−２プロティン特異的ｍＲＮＡに対して 用いた第一ヌクレオチドオプローブは、オリゴデオキシリボヌクレオチドであっ た。これらのヌクレオチド配列（下に示す）は、それらの５°末端にアミノ基を 含んでおり、Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｅｘａｓ）によって合成された。

Ｇｓ　ｍＲＮＡを定量するのに使われたプローブ配列を下に示す（Ｓｅｑ　ＩＤ 　Ｎｏ、　ｌ）　：５′−ＮＨｚ−ＴＴＣＡＴＣＣＴＣＣＣＡ　ＣＡＧ　ＡＧＣ ＣＴＴ　Ｇ−３′Ｇ１−２　ｍＲＮＡを定量するのに使われたプローブ配列を下 に示す（Ｓｅｑ　１０　Ｎｏ、　２）　：５’　−Ｎｌ２−ＡＴＧ　ＧＴＣＡＧ ＣＣＣＡ　ＧＡＧ　ＣＣＴ　ＣＣＧ　Ｇ−３゜（２））　への　ニヌ　し　チ゛ の 第一ヌクレオチドオプローブは、ＤＥＰＣ処理の水に１Ｍｇ／μｌの割合で溶解 した。

次いで、プローブを実施例１（２）項で記述したＥＤＣ／スルホ−間Ｓ溶液と混 合比ｌ、２５（Ｖｏｌ：Ｖｏｌ）で混合した。サンプル５０μｌをＳｕｍｉｌｏ ｎ　ｖイクロタイタープレート（ＭＳ−３７９６Ｆ、住友ベークライト）の各ウ ェルに添加し、室温で一晩インキユベートした。

インキュベーションに続いて、反応液をアスピレータで取り除いた。

（３）標準−進Ω講ｌ ラットのＧｓプロティンｃＤＮ＾（Ｄｒ、　Ｒ，Ｒ，Ｒｅｅｄ、　Ｊｏｈｎｓ　 Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖ、ＵＳＡより提供を受けた）を含むプラスミドベクタ ーｐＧＥＭ２をＮｈｅｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｖｌ）で消化して直鎖状にした。

Ｇｓプロティン特異的ｍＲＮＡをＴ７ＲＮ＾ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、　 Ｖｌ）を使い、実施例１（３）項で記述した方法によって調製した。得られたｍ ＲＮＡの濃度は分光光度計により測定され、続いて実施例１（３）項で記述した ようにＤＥＰＣ処理の水で希釈した。

（４）縦胞溶脛惣Ω男製 ヒトのリンパ球由来の１Ｍ９細胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、そして実施例 ２で記述したように溶解緩衝液中Ｉ　Ｘ　１０’　ｃｅｌｌ、ｓ／ｍｌに再懸濁 した。次いで細胞を２１ゲージ針付き無菌プラスチックシリンジ中を繰り返し通 過させて溶解し、その後、ゆっ（り振盪する水槽中で４５℃１時間保温した。

（５）第二１クヤオ　ドのｍＲＮＡ　のバイブ１　イゼーシ　ンマイクロタイタ ープレートウエルのＲＮａｓｅの汚染を取り除くため、溶解緩衝液２５０μｌを 実施例１で記述したように各ウェルに４５℃で１時間加えた。緩衝液を吸出し、 ０．５　Ｍ　ＮａＣ１と種々の濃度のヒトのＧｓプロティンｍＲＮＡを含む溶解 緩衝液５０μｌを各ウェルに加えた。各サンプルを５１℃１時間保温して実施例 １で記述したようにハイブリダイゼーションさせた。

（６）、　ニヌ　し　゛プローブのｍＲＮ＾ボＩ　Ａテイル　のバイブ１　ゼー シ旦ンシｆｉｎニヌ　レオ　゛プローブの　８　の“１第一ヌクレオチドプロー ブとのハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション液をアスピレーシヨ ンにより取り除き、各ウェルを２５０μｍの溶解緩衝液を用いて１回洗浄した。

０．５Ｍ　ＮａＣｌおよびｌμｌのビオチン化第ニブロープ液（３５μｍｏｌ／ μｌ）を含む５０μ】の溶解緩衝液を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベ ートしてハイブリダイゼーションさせた。標識第二ヌクレオチドプローブの化学 活性は実施例１に記載したように測定した。

（７）検量縮少作成 標準Ｇｓプロティン特異的ｍＲＮＡに関する検量線を図１０に示す。検量線は、 ｍＲＮＡ濃度に関する通常の対数目盛りとＸ線フィルムに露光された化学ルミネ ッセンスの相対強度との関係を表している。

（８）再現性Ω評価 １Ｍ９細胞溶解物由来のＧｓプロティン及びＧ１−２プロティン特異的ｍＲＮ＾ の濃度は、この発明の再現性を試験するため６回測定された。Ｇ１−２に用いら れた方法はＧｓについて上述したそれと類似しており、Ｇ１−２　ｍＲＮＡのハ イブリダイゼーションに使った保温温度は５９℃であった。表３に検量線から得 られたｍＲＮＡの濃度、平均値及び標準誤差を掲げる。細胞数は位相血球計数器 （Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏ−ｄｕｃｔｓ、　ＩＬ）で カウントした。表３に示すように、６つの分析では、ＧｓおよびＧ１−２の両ｍ ＲＮＡについて類似したＩＩＩＲＮ＾濃度が報告されている。このことは、現行 の発明によって信頼があり再現性のある特定ｍＲＮＡ濃度測定手段が提供される ことを暗示している。

表３ 分析Ｎｏ、　ｍＲＮＡ濃度［ｆｇ／細胞コ平均　士Ｓ、Ｅ、　２２．７±３．８ 　８．７７±１．２４実施例４ 日′に　τ　の々のｒｎＲＲ＾の−　−ＭＳＥ　こ（１）　ｌＩ゛　に　々の　 のＧｍ　びＧｉ−ロー　ンー　ｍＲＮＡのＵ鰺検坦 実施例３に記載の方法を使って、種々の細胞溶解物からのＧｓ及びＧ１−２の両 プロティンに関するｍＲＮＡ、例えば、Ｊｕｒｋａ比トＴ−細胞、ｌ豹ヒトＢ細 胞、Ｕ９３７ヒトの単球及びＨＬ６０ヒト顆粒球が分析された。標識第ニブロー ブの化学活性は、実施例３に記載したようなＸ線フィルムに露光する代わりに、 特殊ホルダー（ｍｏｄｅｌ　９０１Ｔｒｏｐｉｘ、　ＣＡ）におかれたポラロイ ドフィルム（６６７、Ｐｏ１ａｒｏｉｄ、　ＭＡ）に室温で５分間露（ａ）　ｃ ＤＮＡの作成及びＰＣＲによる増幅ｍＲＮ＾は、実施例３（４）項記述の方法で 、種々の細胞溶解物からＦａｓｔＴｒａｃｋキット（Ｉｎｖｉ−ｔｒｏｇｅｎ、 ＣＡ）を使って直接精製した。サンプルをＤＥＰＣ処理水ｌＯμｍに溶解し、５ ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔキツト（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｉｅｓ、　ＭＤ）を使ってｃＤＮＡを合成した。

得られたｃＤＮＡを一度フエノールで抽出し、エタノール中に沈澱させ、ＤＥＰ Ｃ処理水ｌＯμｌに溶解した。

ｃＤＮＡを含む溶液１μｌを１０　ｍｉｌ　ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴｒＰ 　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＩＪＳ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｎi） 各Ｌｔｔｌ、２５ｍＭ　ｊｌｇｃｌｇ　１μｍ、　Ｇプロティン特異的ＰＣＲプ ライマー各１μｍ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｃｘｗｅｇａ、　？＋）０．５μ Ｌ及びＰＣＲ緩衝液５μｍと混合して最終容積を５０μｍになるようにする。セ ンス及びアンチセンス−Ｇプロティン特異的ＰＣＲプライマーを下に示す・ ＡＧＣＡＣＣＡＴｒＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡ　（センス）　（Ｓｅｑ、　Ｉ Ｄ　Ｎｏ、　３）ＣＴＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＣＡＴＣＡＡＡＣＡ　（５°→３ ゛　アンチセンス）　（Ｓｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ、４）これらの配列は種々のＧプロ ティンの巾で充分に保存されていることが知られており、このプライマ一対は、 Ｇｓ、　Ｇ１−１．　Ｇ１−２．　Ｇ１−３及び−プロテイン特定的なｃＤＮＡ を増幅することが予備実験において収集されたデータから知られている。９５’ ＣＩＯ分間の予備変性に続き、Ｆ’ＣＲは、ＤＮＡ熱サイクル装置−ｔｈｅｒｍ ａｌ　ｃｙｃｌｅｒ−（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ、’　ＣＴ）で、 それぞれアニール（５５℃、１．５分間）、伸長（７２℃、４分間）および変性 （９５℃、１．５分間）処理を３０サイクル行った。

（ｂ）壜畷÷れ左憩易りＩガ竺ニスゲル亙気泳動０、００００５％エチジウムプ ロミド、０．００＋、　Ｍ　ＥＤＴＡ及びトリス−酢酸、ｐＨ８，０を含む１． ２％アガロースゲルを作製した。各試験液１０μｍを２μｌのゲル供試緩衝液− ｇｅｌ−１ｏａｄｉ口ｇ　ｂｕｆｆｅｒ−（０，２５％ブロモフェノールブルー 、０．２５％キシレンシアツール及び１５％フィコール（Ｔｙｐｅ　４００．　 Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｂｙ、　Ｎ、　Ｊ、　） を含む水）と混合し、供試に先だって６５℃で５分間加熱した。電気泳動を５Ｖ ／ｃｍで１時間実施した。電気泳動の後、ｃＤＮ＾ＤＮＡをＵＶ光照射の下で検 査した。

次いで、そのゲルを０．２５１　ＨＣＩに３０分間（脱プリン−ｄｅｐｕｒｉｎ ａｔｉｏｎ）　、１．５　ＭＮａＣｌを含む０．５　Ｍ　ＮａＯＨに１時間（変 性）、続いて１．５　ＭＮａＣｌを含むｌｌ　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５に１ 時間（中和）浸した。

（ｃ）増暮ＫＤＮＡ（’ｌ股ユｔぜ１４剣工丈ザーンブ９］」つ−比較例１（２ ）に記載されたようにして増幅されたｃＤＮＡはナイロン股上に転写され、ｉｆ ｆ光によって固定された。

（ｄ）旦本九ン倖識伏易プ旦ニブΩ盟 ＧｓおよびＧ１−２　ｃＤＮ＾クローン各１０ｎｇを、上記（２０ａ）のように 、ｄＴｒＰの２０％がビオチン標ｍｄＵＴＰ（Ｃ１，ｏｎｔｅｃｈ）で置換され るよう加減してＰＣＲで増幅した。サザンブロツトの予備分析で、これらのビオ チン標識ＰＣＲ産物は、特にＧｓおよびＧ１−２とそれぞれハイブリダイズする ことが示されている。

（ｅ）標津ＵきＭズｔデ２股太９か、子ブ旦ダイガニ乞ｌン比較実施例１（４） 項に示すように、ビオチン標ｍＰｃＲ産物を、９５℃、１０分間熱変性し、次い で細胞溶解物由来のＰＣＲ増幅ｃＤＮ＾が固定されたサザン膜とハイプリダイ標 識ｃＤＮＡプローブの化学活性は比較例１（５）項に示すように測定した。

（３）結果 実施例４（１）の結果を図１１に示す。ポラロイドフィルムは１．二の発明の方 法によってオリゴ−（ｄＴ）プローブ（ここには種々の細胞由来のＧ１−２およ びＧｓプロティンｍＲＮＡが第一オリゴヌクレオチド固定化プラスチックプレー トＥにトラップされてる）からの化学ルミネッセンス光に露光された。リン酸緩 衝生理食塩水（ＰＢＳ）をフントロールとして使用した。図１１に示すように、 ｔｎＲＮ＾は全ての細胞系から検出された。

実施例４（２）の結果を図１２に示す。ここでは、Ｇ１−２およびＧｓのｃＤＮ ＾ＤＮＡブがサザンプロットに使われた。４つの異なった細胞系由来のＰＣＲ増 幅Ｇプロティン特異的ＤＮＡを一つの膜に固定した。図１２は、このプローブの 化学ルミネッセンスの結果を詳細に示すＸ線フィルムのコピーである。図１２に 示すように、ｍＲＮＡは全ての細胞系において検出された。したがって、この発 明の方法によって、ｍＲＮＡの定量に使うには十分の高い信頼性が与えられる。

実施例５ ＰＣＲプライ３−」二よＡｌＩＰｊ？〔７増幅広（１）材料 ラットのＧプロティンαサブユニットＣＧ＋−ｒ、　Ｇ、−ｚ、　Ｇ＋−ｊ、　 Ｇ、およびＧ、）は、Ｄｒ、　Ｒ，Ｒ，Ｒｅｅｄ　（Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎ ｓ　Ｕｎｉｖ、、　ＭＤ）より提供を受けた。ラットの下垂体および大腸のλＺ ＡＰライブラリーは、Ｄｒ、　Ｄ、Ｇ、Ｐａｙａｎ　（Ｕｎｉｖ、　Ｃａｔ汀、 Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）より提供を受けた。Ｋｉｒｓｔｅｎのネズミ肉腫 ウィルス（ｍｕｒｉｎｅ　ｓａｒｃｏｍａ　ｖｉｒｕｓ）でトランスフオームさ れたラット腎臓細胞（ＫＮＲＫ）、ヒトの１Ｍ９　ｂ−リンパ球及びヒトのＪｕ ｒｔａｔ　丁−リンパ球は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ ｔｌｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｃｘ：ｋｖｉ撃撃■B ＭＤから得た。細胞培養培地、５ｕｐｃｒｓｃｒｉｐｔ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、 　Ｃａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）、　ＰＣＲ用試薬類（Ｐｒｏｍｅｇａ、 　Ｍａｄｉｓｏｎｊｌ）、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　 Ｈｅｉｇｈｔ、　ＩＬ）、Ｇｅｎ梶Aｕｓ。

Ｌｕｍ１−Ｐｈｏｓ　５３０　＜Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉ ｎｄｉａｎａｐｏｉｉｓ　ＩＮ＞、　ＦａｓｔＴｒａｃｋ（hｎｖｉｔｒｏｇ ｅｎ　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａ）、ヒトのＨＬ−６０細胞のλｇｔｌｏライ ブラリー、ビオチン−ｄＵＴＰ。

アルカリ性ホスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、　Ｐａ １ｏ　Ａｌｔｏ、　Ｃａ）。

ｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）用試薬類は 指定供給元から入手した。その他の薬品はＳｉｇｍａ（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍ Ｏ）より購入した。

（２）槻胞培養 にＲＮに細胞はダルベツコ改変イーグル培地（１０％のウシ胎児血清、１００　 Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）で３７℃ 、５％ＣＯ２／９５％空気の条件下で生育させた。細胞は、毎日培地を交換し、 ０．０２％ＥＤＴＡを含有するＣａ２′″−Ｍｇ２゛を含まない生理食塩水中で ０．１％トリプシンにより７０−９０％の集密度（コンフルエンス状態の７０− ９０％）で継代した。１Ｍ９およびＪｕｒｋａｔ細胞は１０％の仔つシ胎仔血清 を含有するＲＰＭＩ　１６４０中で生育させた。細胞の生育力はトリバンブルー 排除により評価して９０％以上であった。

（３）プライマーの設計 Ｇαプロティンのラットクローン（Ｇ、、、□、（ＲＡＴＢＰＧＴＰＢ）、　Ｇ 、−２（ＲＡＴＢＰＧＴＰＡ）、　Ｇ、−。

（ＲＡＴＢＰＧＴＧ）、　Ｇ、（ＲＡＴＢＰＧＴＰＤ）およびＧｏ　（ＲＡＴＢ ＰＧＴＰＣ）　）は、ＧｅｎＢａｎｋリリース６５．０（ＨＩＢＩＩＯ，Ｈｉｔ ａｃｈｉ　Ａｍｅｒｉｃａ、　Ｂｒ１ｓｂａｎｅ、　ＣＡ）から検索した。次い で、これらのクローンの間のヌクレオチド配列の類似性を多重アライメントプロ グラム（ＤＮＡＳＩＳ。

Ｈｉｔａｃｈｉ）によって分析した。我々はこれらの内で十分に保存されている ７つのエリアを初めに特定済みである。これらの保存されたヌクレオチド配列は 、次いで、その池の類似配列を特定子るためＧｅｎＢａｎｋにある全ての哺乳類 の配列と対照して分析された。設計されたオリゴヌクレオチド（Ｓｅｑ、　ＩＤ 　Ｎｏ、ネ）は、Ｇｅｎｏｓｙｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ。

１ｏｇｉｅｓ（Ｔｏｔｘｌｌａｎｄｓ、　ＴＸ）によって合成され、それを１０ ０　ｐｇ／ｍｌの割合で水に懸濁した。

鋳型ＤＮＡ１μｍをｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ各１ｍＭ、 各ＰＣＲプライ７−１μｌ、２５−ＭｇＣｌ２１μＬ、ＰＣＲ緩衝液５μｍ、及 びＴａｑポリメラーゼ（１８）０．５μｌと混合した。次いでＰＣＲは、ＤＮＡ す・−マルサイクル装置（ｍｏｄｅｌ　４８０．　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　 Ｃｅｔｕｓ、　Ｎｏｒｗａｌｋ。

ＣＴ）でアニール温度（５５℃−６５℃の範囲で１．５分間）、伸長（７２℃、 ４分間）および変性（９５℃、１．５分間）の３０サイクルの処理により行われ た。別の実験で、ビオチン標識プローブを作製するため、ｄＴＴＰの３０％をビ オチン−ｄＵＴＰと置換した。

（５）丈１ｚプ旦ヱ上 １．２％アガロースの電気泳動によってＰＣＢ産物を分離し、臭化エチジウム（ １９）で染色した。次いで、ゲルを０．２５　Ｎ　ＨＣＩ中で３０分間脱プリン 化し、１．５　Ｍ　ＮａＣ１を含有する０、　５　Ｎ　ＮａＯＨで３０分間変性 した。次いで、ゲルを、１．５　Ｍ　ＮａＣ１を含有する１、　０Ｍのトリス、 ｐＨ７，６で３０分間中和した。次いで、ゲルを１０　ｘ　５ＳＰＨに１０分間 浸したナイロン膜（ＭａｇｎａＧｒａｐｈ、　ＭＳｌ、　Ｗｅｓｔｂｏｒｏ、　 １ｉＡ）上に置き、７５ｍｍＨｇの陽圧で６０分間かけて膜上に転写した（Ｐｏ ｓｉｂｌｏｔ、　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）。次い で、ゲルからのＤＮＡは１２０　ｍｊｏｕｌｅｓのＵＶ光（Ｓｔｒａｔａｌｉｎ ｋｅｒ、　Ｓｔｒａｔａｇａｎｅ）により膜と架橋結合させ、それから５％のブ ロッキング試薬（ＥＣＬ）及び０．５　Ｍ　ＮａＣ１を含有するハイブリダイゼ ーション緩衝液を用いて４０℃で１時間以上インキュベートした。次いで、熱変 性されたビオチン標識ＰＣＲプローブを加え、ハイブリダイゼーションを一晩継 続した。

膜を４同各１５分間、４４−６５℃の一次洗浄緩衝液（０，５Ｘ　５ＳＰＥ、　 ３６　Ｗ／Ｖ％尿素、０．４１／Ｖ％５ＤＳ）を用いて洗浄し、続いて室温で２ 回５分間二次洗浄緩衝液（２Ｘ　５ＳＰＥ）を用いて洗浄し、それからブロッキ ング緩衝液（Ｇｅｎｉｕｓ）を用いて室温で少なくとも３時間インキュベートし た。次いで、アルカリ性ホスフォターゼ標識ストレプトアビジン（希釈比：　１ ：５．０００）を加え、さらに３０−６０分間室温でさらにインキュベーション を続けた。膜は４回１５分間、緩衝液Ａ　（１００ｒｎＭ　トリス、　ｐＨ７， ５，１５０ｍＭＮａＣｌ　）を使って室温で洗浄し、更に１回２分間緩衝液Ｃ（ １００ｍＭ　トリス、　ｐＨ９，５゜１００　ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　Ｍｇ Ｃｌ２）で洗浄し、それからＬｕｍ１−Ｐｈｏｓ　５３０に約１−２分浸した。

次いで、膜を透明フィルムで包み、化学ルミネッセンス信号をＸ線フィルムＣＸ ＡＲ−５，Ｋｏｄａｋ、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　ＮＹ）に１０分から１時間露 光させた。

（６）牝巳Ω作成及μψ易凶合成 細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、溶解緩衝液（ＦａｓｔＴｒａｃｋ） 中でホモジナイズし、次いで、４５℃で１時間インキュベートしてＲＮａｓｅ活 性を排除した。

ＮａＣ１の濃度を０．５Ｍに調節し、オリゴ（ｄＴ）セルロース錠を溶解緩衝液 に加えた。次いで、室温で更に４０分間インキュベーションを続けた。オリゴ（ ｄＴ）セルロースを、結合緩衝液で４回洗浄した後、結合したｍＲＮＡをＤＥＰ Ｃ処理水で溶離させた。ｍＲＮＡの濃度を分光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ、　Ｕ− ２０００，Ｉｒｖｉｎｅ、　ＣＡ）を使いＯＤ＊ｓａで測定した。ｃＤＮＡの第 −鎮を、５０ａＭ）リス、ｐＨ８，３，７５ｍＭ　Ｅｌ、　３　ｍＭ　ＭｇＣ１ ｇ、　１０　ｌｌｌ１ｌ　ＤＴＴ、　ｄＡＴＰ。

ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ各０．５ｍＭ、プライマーとしてのポ１バ ｄＴ）、及び逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）の存在下、３７℃で１時間 、鋳型ｍＲＮＡから合成した。次いで、ｃＤＮＡの第二鎖を、２５ｍＭ）リスｐ Ｈ７，５，１００ｍＭ　ＫＣＩ、　５　ｍＭ　ＭｇＣｈ、　１０　ｍＭ（ＮＨ４ ）！ＳＯ４，０１１５ｍＭβ−ＮＡＤ’、　ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ 、及びｄＴＴＰ各２５０．Ｊ、　１．２　ｍＭＤＴＴ、　６５　Ｕ／ｍｌ　ＤＮ ＾リガーゼ、　２５０　Ｕ／ｍｌ　ＤＮ＾ポリメラーゼ及び１３　Ｕ／ｍｌ　Ｒ Ｎａｓｅ　Ｈ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）を含む同じチューブで２時間１６℃で 合成した。合成されたｃＤＮＡは、次いで同容積のフェノール・クロロホルム： イソアミルアルコール（２５：２４：１）で一度抽出し、エタノールで沈澱させ 、モして［２０で再懸濁した。

（７）画像表示 ポラロイドフィルム及びＸ線フィルムに記録したデータは、信号対雑音比最適化 のＳｔｒａｔａｓｃａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により走査し、次いで、デス クトップ出版ソフトウェア（ＰａｇｅＭａｋｅｒ、　Ａｌｄｕｓ、　５ｅａｔｔ ｌｅ、ｆＡ）で編集した。

実施例６ 脂化ノ　Ｇプロティンα　ブユニ・　の　成分の特性（１）緒五 実施例５の方法を使って、我々は、ＰＣＢプライマーとして使用できる５つの異 なったＧプロティンのａサブユニット、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア及びＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：８の中で十分に保存された２つのオリゴヌクレオチド配列を特定し、 性格付けをした。Ｇプロティンの全てのサブクラスの配列は、ラットのＧαプロ ティンクローンから得られたＧプロティン配列および種々のヒトの組織由来のｃ ＤＮＡの両方を含むこれら２つのＰＣＲプライマーとしてのオリゴヌクレオチド を使って同一のＰＣＲ条件下で、増幅できることを我々は見いだしている。

Ｇプロティンは、種々の抗体、抗体産物を使って生物化学および免疫学的見地か ら広く分析されてきたが、種々のサブクラスの間で交差反応を呈することなしに 、すなわち、高い種特異性をもって抗体を生産することは非常に困難であった。

それ故、最近の試みはノザンプロット分析に焦点を絞り、異なった種の様々な組 織または細胞からＧプロティン特異的ｍＲＮＡを同定している。しかし、ノザン プロットでは、大量の出発細胞材料に加えて、経験を積んだ取扱い及びＲＮａｓ ｅ汚染からの防御が必要となる。

これらの従来法とは対照的に、ＰＣＲ法はより便利であり且つ実用上有用である 。

何故なら、材料はノザンプロット分析より少なくてよく、且つ高い感度を有して いるからである。しかし、出発材料でＤＮＡまたはｍＲＮＡの量を定量すること はＰＣＲでは困難である。面白いことに、現行の発明の新しいＧプロティンＰＣ Ｒプライマーを使って得られた最終的ＰＣＲ製品は、出発材料に存在するＧαプ ロティンのサブクラスの各々の相対的組成を反映している。これは多分、５つの 異なったＧαプロティンのｍＲＮＡが、同一のＰＣＲ条件下で一組のにＲプライ マーにより同様の割合で増幅されるからであろう。もしＧαプロティンのサブク ラスの各々の既知の混合物が、図１３に示すように未知のテストサンプルと一緒 に分析されるなら、Ｇαプロティンの相対的組成はかなり正確に決めることがで きる。それ故、現方法は種々の組織または細胞のＧプロティンの性格付けには理 想的である。

本発明のプライマーによるＰＣＲの実行は、また疾病検出時の臨床および診断上 の分析にも有用である。Ｇプロティンの異常は遺伝性疾患、がん、真性糖尿病の 類、及びその他の疾病に関連している故、Ｇプロティン検出・定量用のこのＰＣ Ｒプライマーはこれらの疾病を検出し、それらの進行具合を分析するのに使うこ とができる。

この研究において、我々は本発明のＰＣＲプライマーを使ってＧ１−１＋　ｃｌ −１，Ｇｌ−５ｒＧ６およびＧｏを同定してきた。最近のクローニングによって Ｇプロティンの多くのサブクラスが同定されてきたが、これらの新しく同定され たＧプロティンのｃＤＮＡは他の既知のＧプロティンに対し高い相同性を示した 。それ故、本発明のプライマーは、その上これらのサブクラスを増幅するであろ うこと、及びこのＰＣＲとこのＰＣＲの技法もまたこれらの新しいＧプロティン に応用できること、が期待される。更に、このＰＣＲ法はその上独特のＧプロテ ィン遺伝子にクローンを発生させるのに利用できる。

（２）ズ之イヱユ 我々は、ＰＣＲプライマーとして２つの２２−ｍａｒオリゴヌクレオチド（Ｇ２ 及びＧ４−３ＥＱ　ＩＤ　ＮＯＳニア００および７０１）を設計した。下表４に 示すように、これらのオリゴヌクレオチドには、５つの異なったＧαプロティン ｃＤＮＡの間で十分保存きれている配列が含まれ、これらの配列当たりのミスマ ツチの塩基はわずかにＯ−４である。Ｇ。

−センス及びＧ４−アンチセンス配列の３′末端で４塩基になんらのミスマツチ 対は見られなかった（データ示さず）。更に、Ｇ！およびＧ４は一列に３塩基対 以上の自己相補的配列を持たない。Ｇ２およびＧ４が全てのＧαプロティンに共 通であるが他の無関係の配列にはそうでないかどうかを分析するため、ＧｅｎＢ ａｎｋにある全ての哺乳類の配列を対照してＧ２およびＧ４配列の相同性の探索 （ＤＮＡＳＩＳ）が実施された。結果としては、Ｇ！およびＧ４は全てのＧαプ ロティンおよび様々な種のロドプシンに共通であるが、他の無関係の配列とは相 同性が少ないことが見いだされた（データ示さず）。

表４ Ｇプロティンαサブユニットの５つの異なったｃＤＮＡの中の２つの一致オリゴ ヌクレオチド（Ｇ２およびＧ４）コンセンサス配列（ミスマツチの数’）　［Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：］ＡＧＣＡＣＣＡＴ＋ＧＩＣＡＡｌｉＣＡＧＡＹＧＡ　１７ ００１　Ｌｅｎｇｔｈ　（ｂａｌ　ｒｃマＴＴＩｉＡｒＧＴｌ；ＧＧＡＧＧＣＣ ＡiｔＡＣ１７０１１ Ｃｉｌ　ＡＧＣＡＣ６ＡｆＴＣＩｌｌｉＡＡｌｉＣＡＧＡＴＧＡ　＋＋１１７０ ２１　４７６　１ＧＴ１１ＧｋＱＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＡＧ`Ｇ　＋１１　Ｆ８ ０５１ Ｇｉ−２ＡＣＣＡＣＣＡＴＦ、＋ＫＡＡＧＣＡｌ、ＡＴＧ＆　＋２１　［７０３ １４７９ＴＧＴＴ＋ＧＡＴＧＴＧｌ；ＧｉＧ（，１ｃＡＧｉf　（３１＋８０６ １ ５＋−３ＡＧＨａＣ％＋ｃｔＧａａｇＡＧＡＴＧ１１３１　［７０４１４７６Ｈ ：ＩＩＴＧＡＴＧＴｆｉＧＩ：％ＣＣＡａＡＣ＋３１　＋７O７１ ｃｌ　ＡＧＣＡＣＣＡＴＥ＋ＧＡＡＧＣＡＧＡＩＧＡ　＋Ｏ１１７０５１５２４ ＋ＧＴＴｃＧＡＴＧｒＧＧＧｃＧＧＣＣＡＧｉＧ　ｉ３）　P７０８１ Ｇｏ１０（ＡＣＣ＾１ｉＧＩＧＡＡＧＣＡＧＡＩＧＡ（０１１７０６１４７９Ｔ （＋ＴＴ＋ＧＡｃ（＋Ｔ％ＧｇＧＧＣＣ＾ＧｃＧ＋４１＋７O９１ 表５ ５つの異なったＧαプロティンクローン間のＰＣＲ産物のヌクレオチド配列の類 似性Ｇｉ−Ｉ　Ｇ１−２　Ｇ１−３　ＧＳ　ＧＯ（３）ラットのクローン化Ｇα プロティンｃＤＮＡクローン化されたラットのＧ１−１．　Ｇｌ−！、　Ｇｌ− ｓ、Ｇ−およびＧｏ　ｃＤＮＡを１０ｎｇ／μｍに希釈し、材料及び方法で記述 したように、それをｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴｒＰ各１ｍＭ、 各ＰＣＲプライｖ　−１μＬ　２５ｏＭ　ＭｇＣ１ｔ　１ｇ１％ＰＣＲＩＩＩ衝 液５μｍ、及びＴａｑポリマレーゼ（１８）０．５μｌと混合した。次いでＰＣ Ｒは、アニール温度４５℃で１．５分間、伸長（７２℃、４分間）、変性（９５ ℃、１．５分間）、伸長（７２℃、４分間）および変性（９５℃、１．５分間） の３０サイクルの処理によって行われた。ＰＣＩ産物は続いて１．２％のアガロ ースゲル中で分離され、臭化エチジウムで染色された（上部パネル）。マーカー は、Ｈｉｎｄｌ１１消化のλＤＮＡの０．６［ｂフラグメントを示している。次 いで、材料及び方法に記載したように、ナイロン膜に転写され、サブクラス特異 的ビオチン標識プローブとハイブリダイズさせた。膜を６５℃の一次洗浄緩衝液 （Ｑ、５ｘ　５ＳＰＥ、　３６　ｗ／ｖ％尿素、０、４ｗ／ｖ％５ＤＳ）を用い て洗浄し、続いて室温で２回５分間二次洗浄緩衝液（２Ｘ　５ＳＰＥ）を用いて 洗浄し、それからブロッキング緩衝液を用いて室温で少なくとも３時間インキュ ベートした。次いで、アルカリ性ホスフオターゼ標識ストレプトアビジン（希釈 比：　１：５，０００）を加え、さらに３０分間室温でインキュベーションを続 けた。更に洗浄後、膜をＬｕｍ１−Ｐｈｏｓ　５３０に約１−２分浸した。次い で、化学ルミネッセンス信号をＸ線フィルムに１０分から１時間露光させた（下 部５パネル）。

ＰＣＲは、先ず３７℃から６５℃の範囲の異なるアニール温度で、ヒトのＨＬ− ６０細胞のλｇｔｌｏライブラリーを使って処理された。結果としては、ＰＣＲ 産物は４５℃及び５５℃においてのみ約ｓｏｏ　ｂｐのサイズで見つけられてお り（データ示さず）、このことは理論値（５７６−５２４ｂｐ）　（上表４参照 ）と類似であった。それ故、全てのＰＣＲ産物は、アニール温度４５℃で処理さ れた。

図１４に示すように、クローンラットのＧαプロティンｃＤＮＡ（Ｇｌ−＋、　 ｃ＋−４，Ｇ□−ｓ。

ＧｏおよびＧｏ）は、臭化エチジウムで染色された１、２％のアガロースゲルで 約５００　ｂｐのサイズを持つ同じ組のＰＣＲプライマー（Ｇ２およびＧ４）を 使って首尾よく増幅した。

コンピュータ分析（ＤＮＡＳＩＳ）によれば、増幅ＰＣＲ産物のヌクレオチド配 列は５つのＧαプロティンの間で相同性が少なく、その類似性の割合は７６．８ ％から４７．６％の範囲であっｔ：。このことは、ＰＣＲ増幅後は、たとえ産出 されたＰＣＲ産物サイズが５つのＧαプロティンの中で非常に類似していても、 Ｇαプロティンの各成分は、サザンブロット法によって同定できることを示して いる。それ故、他のＰＣＲは、サブクラス特異的ビオチンプローブを調製するた め、ｄＴｒＰの３０％がビオチン結合ｄＬＩＴＰで置換された条件下で処理され た。サザン膜は次いでこれらのビオチン−ＰＣＲ産物により厳密に調べられた。

図１４に示すように、これらのビオチン−ＰＣＲプローブは、洗浄温度６５℃で 各Ｇαプロティンのサブクラスとは十分特異的であった。穏やかな条件での（１ ，ｏｗ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）洗浄で、これらのプローブはＧαプロティンの別 のサブクラスと交差ハイブリダイズした（データ示さず）。

（４）−ラス上−の−久ｑニンｋｐじ４ｑテア（ン回轡＾！７２功ｈＹ物Ｚ中３ ６１１、　（ｆｌ−２，Ｇ１−５．　ＧｏおよびＧ、のｃＤＮＡを、１０　ｎｇ ／μ１．（＋＋＋）、１００　ｐｇ／μｌ（＋＋）及びｌ　ｐｇ／ｆｚ　１０） に希釈し、これらの希釈ｃＤＮ＾の種々の組み合わせをＰＣＲ鋳型として用いた （」一部パネル）。続いて、ＰＣＲ及びサザンプロットを本実施例の（３）項に 記載したようにして実行した。

Ｇ、およびＧ４の配列を使うことにより、ＧαプロティンｃＤＮＡの全てのサブ クラスは、ｒＩ；１Ｎ（Ｄ　Ｇ、−１，Ｇ１−２．　Ｇ１−３．　Ｇ、およびＧ ｏがテストサンプル（図１３．レーン４．５．　１０）中に存在しているときは ＰＣＲによって増幅された。しかし、もしＧαプロティンｃｃＤＮＡ全ての濃度 が高ければ、Ｇｏはそれほど増幅されないが、これは多分Ｇｏと０４との間のミ スマツチ数が６４と６２配列間のその他のものより多いからであろう。

存在する１つまたは２つのＧαプロティンｃＤＮＡが他のものより小量であった 時は、増幅ｃＤＮ＾の量はｃＤＮＡの出発濃度と相対的に相関関係にあった（図 １３、レーン１．２゜３、８．９）。更に、５つのＧαプロティンｃＤＮＡの１ つがその他のもののそれより多いときは、Ｇプロティンの遺伝子はその他のもの より多く増幅された。

（５）種久Ｑ紙織かム９プヱ上Ωψ濾針体ラット下垂体（Ｐ）及び腸（１）のλ ＺＡＰ　ｅＤＮ＾ライブラリー、及びラット腎臓細胞（ＫＮＰＫ）のＩＩＩＲＮ ＾由来のｃＤＮＡをＰＣＲの鋳型として使用した。次いで、ＰＣＲ及びサザンプ ロットを本実施例の（３）項に記載したようにして実行した。このＰＣＲ法を使 えば、Ｇαプロティン遺伝子はクローンｃＤＮＡからのみならず種々のラットの ｃＤＮＡからも増幅される（図１５）。ラット下垂体豚由来のλＺＡＰ　ｃＤＮ Ａライブラリー及びラット腎臓ＫＮＰＫ由来のｃＤＮＡにおいては、Ｇｏは、Ｇ 、、　Ｇｌ−を及びＧ−より多くあり、Ｇ、−１は検出できなかった（図１５、 レーンｌ、２）。ラットの腸のλＺＡＰ　ｃＤＮ＾ライブラリーは多くの６１− ２、Ｇ１−３、及びＧ、とＧ。を含んでいた（図１５、レーン３）。

（６）同上ｃＱｃｐ易！中３ ヒトの１Ｍ９　Ｂリンパ球及びＪｕｒｋａｔ　Ｔ〜リンパ球のｍＲＮＡ由来のｃ ＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用いた。次いで、ＰＣＲをアニール温度４５℃（ｌ 、２）または５５℃（２，４）で処理した。

続いて、本実施例の（３）項に記載したようにしてサザンプロットを実行した。

配列分析によれば、ラットのＧ１−１＋　Ｇ　ｌ　−”　＋　Ｇ　ｌ　−３＋　 Ｇ　＋およびＧ、配列増幅のＰＣＲ産物はヒトのＧプロティンｃＤＮＡと高度の 相同性を呈した（下表６参照）。更に、図１６に示すように、Ｇ２と０４プライ マーの対を用いたＰＣＲによって、ヒトの１１１１９及びＪｕｒｋａｔ細胞のｃ ＤＮ＾由来の５００　ｂｐ　ＤＮＡが増幅された。ラットのｃＤＮＡとは違って （図１５）、１Ｍ９及びＪｕｒｋａｔ細胞の両方にはＧαプロティンの全てのサ ブクラスが含まれていた（図１６）。しかし、Ｇ１−１は１Ｍ９細胞に比較的多 くあり、一方、Ｇ、およびＧｏはＪｕｒｋａｔ細胞で１１９細胞より多かった（ 図１６）。

表６ ラットとヒトのＧプロティン間のＰＣＲ産物ヌクレオチド配列の類似性Ｇ１−１ 　４７６　４７６　６２　８７．０％Ｇ１−２　４７９　４７９　４４　９０． ８％Ｇ１−３　４７６　４７６　４０　９１．６％Ｇｓ　５２４　４８２　５２ 　８９．２％Ｇ、　４７９　４７９　３９　９１．９％種々の配列は、ここに記 載したように、ＰＣＲ法に使うセンスまたはアンチセンスプライマーとして、ま たはｍＲＮ入の検出用プローブとして役立たせることができることは当業者にと って明かであろう。種々のＧプロティンに共通であるかまたは特殊の種に特異的 であるような配列の同定法を以降に説明する。この同定法の好ましい実施態様に おいては、コンピュータを用いて配列を同定する。そのようなプログラムを使う ことにより、我々は多数の共通及び特異的プライマー及びプローブを同定してき た。表７−１３に与えられているように、種々のセンス配列がＧプロティンプロ ーブ及びプライマーとして有用な、そのようなプログラムの使用を通して同定さ れる。

これらの表に掲げられた全ての配列は、この発明のＰＣＲ法に関連する範囲内で 有用である。相補的なアンチセンス配列もこの発明の一定の状況においては有用 である。当業者に明らかになるように、標的配列とは類似しているが全（同じで はない共通のプローブでは、そうしたプローブが特定の標的配列とノゾブリダイ ズするかまたはハイブリダイズに失敗するよう厳しい条件を（例えば、温度及び 塩分の変化によって）変更することができる。また、この発明の範囲に含まれる ものとしては、掲げられたセンス配列かまたはそれらのアンチセンスの片方と同 じ配列の何れかとハイブリダイズできる配列である。

Ｇプロティン用の付加的プローブにはまた下記が包含される。

基１２現プｐテインプスニブ ５’　−ＣＴＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＣＡＴＣＡＡＡＣ人−３″（ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：１３９）５’　−ＴＣＡＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＡＡＴＧＧＴＧＣＴ−３ ’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４０）特異拍２１じ≦’ｌＬ’ｒ＝文グ之１五八 通ΣＧ１−へ　５’　−ＧＴＴＴｒＣＡＣＴＣＴＡＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＴ Ｃ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４１）Ｇｉ−２５“　−ＣＡＡＡＧＴＣＧ ＡＴＣＴＧＣＡＧＧＴＴＧＣ−３”　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４２）５゛−＾ ＴＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＧＧ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： １４３）Ｇｉ−３５°　−ＧＴＣＴｒＣＡＣＴＣＴＣＧＴＣＣＧＡＡＧＡ−３’ 　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４４）Ｇｓ　５°−ＧＣＣＴＴＧＧＣＡＴＧＣＴＣ ＡＴＡＧＡＡＴＴ−３°（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１４５）５°−ＴＴＣＡＴＣＣ ＴＣＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＴＧ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４６）Ｇｏ 　５’　−ＣＧＣＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＡＧ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：１４７）表７　Ｇプロティン共通プライマー（Ｇ２−３）ＡＧＣＡＣＣ ＡＴＴＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＧｅｎＢａｎｋ中の最高マツチ配列 □ 表８　Ｇプロティン共通プライマー（Ｇ４−＾５）Ｇ４−ＡＳ ＳＥＱＵＥＮＣＥより　Ｎｏ：　ＴＧＴＴｒＧＡＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＡＧＡ ＧＧｅｎＢａｎｋ中の最大マツチ配列 表９　Ｇ１−１プロテイン特異的、ヒト−ラット共通プライマー（Ｇｉ−１）表 ９Ａ　ヒト−げっ歯動物共通Ｇ１−１特異的プローブ本：　プライマーとしてＧ １１−７３５およびＧｌｌ−１１３１を使用するＰＣＲ産物のサイズ林：　Ｇｅ ｎＢａｎｋ中の最大マツチ配列（リリース６８．０）表１０　Ｇ１−２プロテイ ン特異的、ヒト−ラット共通プライマー（Ｇｉ−２）ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＩＤ　 Ｎｏ：　ＧＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＴＧＧｓ　ＨＬＩＭＧＮＰＡ Ｓ　１９０　ＡＧＴ：：：Ａ：：Ｔ：：：Ｔ：：：：Ｇ：：Ｇｏ　）ＩｔＪＭＧ ＯＡＱＯｌ　１９１　ＣＴＴＣＴ：：：：：：：Ｇ：ＴＧ：：：：ＣＧ１−３Ｒ ＡＴＢＰＧＴＰ１９４ＡＡ：：：Ｇ：二：：：Ｔ：Ｔ：ＴＴ：：：：Ｇｓ　ＲＡ ＴＢＰＧＴＰＤ　１９５　ＡＧＴ：：：Ａ：：Ｔ：：：：：：：：Ｇ：：Ｇｘ　 ＲＡＴＧＸＡ　１９７　：Ｔ：：：八：Ｃ：：：Ｔ：Ｔ：Ｔ：：：Ｃ：表１０Ａ 　ヒト−げっ歯動物共通Ｇ１−２特異的プローブＧ１２・７４２（５’−３’） Ｇｉ２−１１０２＋５”３’１ＳＥＯＩＤＮＯ５：Ｉｎｃｅｎａａｎｋｉａｃａ ＋ｃｒｙｔｃａ＋ｃｒｃｃｃｒｃｃ＋ｃ＾＾ＧＧＡＧＡｆＣＴＡＣＡ（ＧＣ＾（ ＴＴＣＡ（ｒｅｉｐｅｃ＋１ｖ■撃凵j 本：　プライマーとしてＧ１２−７４２およびＧ１２−１１０２を使用するＰＣ Ｒ産物のサイズ零＊：　ＧｅｎＢａｎｋ中の最大マツチ配列（リリース６８．０ ）表１１　Ｇ１−３プロテイン特異的、ヒト−ラット共通プライマー（Ｇｉ−３ ）表１１Ａ　ヒト−げっ歯動物共通Ｇ１−３特異的プローブ転　プライマーとし てＧ１３−４０７およびＧ１３−７３０を使用するＰＣＲ産物のサイズ＊＊：　 ＧｅｎＢａｎｋ中の最大マツチ配列（リリース６８．０）表１２　Ｇｓプロティ ン特異的、ヒト−ラット共通プライマー（Ｇｓ）Ｇｓ　ＨＵＭＧＮＰＡＳ　２１ ２　：：：：：：：：：：二：：：：：：：：：：：表１２Ａ　ヒト−げっ歯動 物共通Ｇｓ特異的プローブ転　プライマーとしてＧ５−２４６およびＧ５−８２ ４を使用するＰＣＲ産物のサイズ＄１：　ＧｅｎＢａｎｋ中の最大？−／チ致配 列配列リース６８．０）表１３　Ｇｏプロティン特異的、ヒト−ラット共通プラ イマー（ＧＯ）ＧＯ ５ＥＱＵＥＮＣＥより　Ｎｏ：　ＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧ ｏ　ＨＵＭＧＯＡＱ（１１２１７：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：ラ ット 表１３Ａ　ヒト−げっ歯動物共通ＧＯ特異的プローブネ・　プライマーとしてＧ Ｏ−１２２４およびＧｏ−１３９７を使用するＰＣＲ産物のサイズ＊＊：　Ｇｅ ｎＢａｎｋ中の最大マツチ一致配列（リリース６８．０）ユノ その他のｌ０ＲＮ＾の臨床上有用な測定例としては、サブスタンスＰのｍＲＮＡ に関してであろう。サブスタンスＰは神経伝達物質である。サブスタンスＰを発 現する神経は痛覚受容体経路に含まれるため、サブスタンスＰのｍＲＮＡ測定能 力は鎮痛剤開発に役立つであろう。

実施例６ サブヌタン７−綬容体Ｑ■移用本−５クタニニ形質転換刺胞曲幻】μ；□−Ｌ： ３？＝１ニシセ］＝？１≦２Ｓ工≦２４−；ビニ４≧Ｓ２脂繍ノ」！！（１）第 ニス欠ｕ、を九且ズ旦二ズ＠調展サブスタンスＰ　受容体−特異的ｍＲＮ＾の定 量に使われる第一ヌクレオチドプローブは５゛アミノ基を有するオリゴデオキシ リボヌクレオチドであった。このプローブはＤＮＡシンセサイザ（ｍｏｄｅｌ　 ３８０Ｂ、＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　ＣＡ）を使って調製され 、下の通りである： ５°−ＮＨ，−ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＡＴＧ　ＡＧＡ　ＡＡＧ　ＣＧＴ　ＡＣＣＡ− ３′（Ｓｅｑ　ＩＤ　ＮＯ：５）（２）第二ヌ　レオチ゛プローブのＸ　Ｌｌ− 少伺定第一ヌクレオチドプローブをＤＥＰＣ処理水にｌμｇ／μｌの濃度で溶解 し、次いで実施例１（２）に記載したＥＤＣ／スルホ−ＮＨ３溶液と１・２５（ Ｖｏｌ　：Ｖｏｌ）の比で混合する。上記混合溶液５０μｌを住人ベークライト 製のＳｕｍｉｌｏｎマイクロタイタープレート（ＭＳ−３７９６Ｆ）の各ウェル に加え、そのプレートを一晩室温でインキュベートした。インキュベーションに 続いて、反応液をアスピレーションにより取り除いた。

（３）標準式易の調製 ヒトのサブスタンスＰ受容体ｃＤＮＡを含有するプラスミドベクターｐＫＲ２（ Ｄｒ、　Ｓ。

Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、　Ｋｙｏｔｏ　Ｕｎｉｖ、Ｊａｐａｎより提供を受けた） をＳｍａ　Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ、　ＷＩ　）の消化によって直鎖状にした。サブ スタンスＰ受容体−特異的ｍＲＮ＾は実施例１（３）に記載の方法によりＴ７　 ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｇｅｇａ、　ＶＩ）を使って調製した。得られたｍ ＲＮＡの濃度は分光光度系により測定し、次いで、ＤＥＰＣ処理水で希釈して実 施例１（３）に記載したようにして標準ｍＲＮＡ溶液を調製した。

（４）縄胞溶鮮惣の１玉 サブスタンスＰ受容体ｃＤＮＡで形質転換されているヒトＴリンパ球に由来する Ｊｕｒｋａｔ細胞の１系統が、サブスタンスＰ受容体ｍＲＮＡ　（以後ＪＳＰと 呼ぶ、Ｄｒ、　Ｄ、Ｇ。

Ｐａｙａｎ、Ｕｎｉｖ、　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉ ｓｃｏ、　ＣＡより提供を受けた）の転写に関して検討された。サブスタンスＰ 受容体を発現しないベクターで形質転換されているＪｕｒｋａｔ細胞のもう一方 の系統（以後ＪＶｅｘと呼ぶ、Ｄｒ、　Ｄ、Ｇ、Ｐａｙａｎより提供を受けた） は、陰性コントロールとして用いられた。細胞は、実施例２に記載したようにし て遠心分離で集め、ＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液中に１　ｘ　ｌｏ’ｃｅ１．１ ｓ／ａ＋１となるように再懸濁した。細胞は２１ゲージニードルを繰り返し通過 させてせん断し、次いでゆっくり振盪する水槽で４５℃−１時間保温した。

（５）−１−ヌ　し　チ゛プローブのｍＲＮＡ　のノゾブ１　イゼーシ　之結合 された第一ヌクレオチドプローブを含むマイクロタイタープレートのウェルにお けるＲＮａｓｅ汚染の可能性を排除するため、実施例１に記載されたように溶解 緩衝液２５０μｌを加え、４５℃−１時間インキュベートした。緩衝液をアスピ レ−１・により除去し、０．５Ｍ　ＮａＣ１を含有する溶解緩衝液５０μｍ及び 種々の濃度の標準（コントロール）のヒトのサブスタンスＰ受容体特異的ｍＲＮ ＾を各ウェルに加え、５０℃−１時間インキュベートして、実施例１に記載のよ うにして、ハイブリダイゼーションｊ長へＵ妃１僚識第＝≧リリＣ（九下プロー ブの化学括ユ９側元上記（５）項に記載されたように第一ヌクレオチドプローブ の結合ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイゼーション 液を吸出し、各ウェルを１回溶解緩衝液２５０μｍで洗浄した。０．５Ｍ　Ｎａ Ｃ１を含有する溶解緩衝液５μｍ及びビオチン化第二ヌクレオチドプローブ溶液 （３５ｐｍｏｌ／μｌ）を各ウェルに加え、さらに室温で１時間インキュベート して、実施例１に記載のようにして、第二のハイブリダイゼーションを行った。

標識第二ヌクレオチドプローブの化学活性も実施例１に記載したようにして測定 した。

（７）検量線久作成 標準サブスタンスＰ受容体特異的ｍＲＮＡの検量線を図９に示す。

（８）再現性少評値 ＪＳＰ及びＪＶｅｃ細胞溶解物中のサブスタンスＰ受容体特異的ｍＲＮ＾の濃度 は２回測定された。表７は、上記（７）項に記載した検量線から得られたｍＲＮ Ａの濃度を示している。細胞数は位相血球計数器（Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅ ｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　ＩＬ）でカウントした。

表１４に示すように、サブスタンスＰ受容体特定ｍ２８人の濃度は、サブスタン スＰ受容体ｃＤＮ＾で形質転換されているＪＳＰ細胞中に見い出されたが、コン トロールベクターのみで形質転換されたバｅＣ細胞からは検出されなかった。こ のことは、この発明が、高い信頼性を有する特異的ｍＲＮＡに対する良好な定量 法を提供されることを示している。

表１４ アッセイＮｏ、　ｍＲＮＡ濃度 （形質転換体）（コントロール） この発明の局面の一つは、（例えば、ＰＣＲによる）３０口がん遺伝子検出用と してのＤＮＡのプライマー及びプローブに関する。ｊｕｎ遺伝子の発現は、細胞 成長に対する一つのマーカーとして役立てることができる。

ｊｕｎまたはｆｏｓのような、がん遺伝子のあるものは外部刺激で刺激されて増 殖する時最も急速に発現する。それ故、ｊｕｎまたはｆｏｓ遺伝子発現のレベル を検出または定量することは、細胞のマイトジェン（分裂促進）活性に対する良 好なマーカーとなろう。

Ｊｕｎがん遺伝子は、Ｍａｋｊ等（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳん８４：２８４８−９１５２）によって最初に報告されたかん遺伝子 の一つであり、現在の漸進的分子クローニングによってｊ聞がん遺伝子の少なく とも３つのサブタイプ：　ｊｕｎ−Ｂ、　ｃ−ｊｕｎ及びｊｕｎ−Ｄが同定され た。ヌクレオチド配列の比較から見れば、ヒト及びハッカネズミの両方にあるｊ ｕｎがん遺伝子の３つのサブタイプは異なっている（Ｒｙｄｅｒに、　Ｎａｔｈ ａｎｓ　Ｄ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５：８４６４−８４６７、　１９８８ ；　Ｒｙｄｅｒ　Ｋ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、`ｃａｄ。

Ｓｃｉ、、ＵＳＡ８５：１４８７−１４９１．１９８８；　ｈｔｔｏｒｉ　Ｋ、 　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　rｃｉ、　ＵＳＡ　 ８５　： ９１４８−９１５２．１９８８；　５Ｃｈｕｅｔｔｃ　ｌ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃ ｅ１１．５９＋９８７−９９７．　１９８９）。しかし、こ■ ら３つの異なったｊ叩かん遺伝子がどのように細胞成長に関与するかは今もハツ キリしていないため、細胞成長中３つの遺伝子すべてを分析する必要がある。

ノザンプロット分析は特異的遺伝子を検出するために広く受け入れられており（ Ｓａｒｎｂｒｏｏｋ　Ｊ、　ｅｔ　ａｔ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｅｌｏｎｉｎ ｇ、　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　２ｎп@ｅｄｓ、　ｐｐ ７．３９−７．５２）、ｊｕｎがん遺伝子の検出にこの方法を既に採用している 研究者もいる（Ｓｈｅｒｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８７：５６６３−５６６６、１９９０；　０ｕ窒唐撃 ■秩@ＭＪ ｅｔ、　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８８： ６６１３−６６１７．１９９１）、この方法では、ｍＲＮＡ■ 先ず研究者が興味を持つ組織／細胞から精製され、アガロスゲルミ気泳動で分離 される。電気泳動の後、ｍＲＮＡは股上に転写され、放射性プローブとハイブリ ダイズさせてオートラジオグラフィーにより同定する。しかし、この方法は感度 が低いので、材料が僅か小量の遺伝子しか持たない場合、特定信号を識別するの は困難である。代わりに、逆ＰＣＲ（ｒモレキュラー・クローニング」）もまた 異なった組Ｊ＠／細胞から多種類の遺伝子を検出するのに用いられるため、この 技法もまたｊｕｎがん遺伝子の検出に適用される。この方法では、ｍＲＮＡは先 ず逆転写によってｃＤＮ＾に変換され、次いで、特定遺伝子のフラグメントは一 組のプライマー（センス及びアンチセンス・プライマー）を使ってＰＣＲにより 増幅される。増幅された遺伝子は臭化エチジウム存在下のアガロースゲル電気泳 動で見ることができる。この方法は従来のノザンプロット分析よりはるかに感度 はよいが、ｊｕｎがん遺伝子の３つの異なったサブタイプを検出するために６つ のプライマーを調製しなければならない。また、ヒトとハツカネズミの間ではヌ クレオチド配列が異なっているため、ヒトとハツカネズミのプライマーを別々に 調製する必要がある。

本発明によって我々が到達したゴールの一つは、ｉｎ　ｖｉｖｏに見出される極 めて小量のｊｕｎ遺伝子検出に容易に用いることのできるセンス及びアンチセン スの両プライマーに関するオリゴヌクレオチド配列の構想であった。我々はまた これらのプライマーがヒト及びネズミの両ｊｕｎ配列を検出するのに役立つこと を願うものである。故に、我々は下記の条件を満たすプライマーを選択した（ａ ）３つのｊｌｌｎ遺伝子のサブタイプに共通のヌクレオチド配列であって、それ らの間のミスマツチは最高で４塩基のもの；（ｂ）ヒト及びネズミに共通のヌク レオチド配列であって、それらの間のミスマツチは最高で４塩基のもの： （ｃ）３°末端から少な（とも５塩基は、これらの３サブタイプの間で且つヒト とネズミの間で何のミスマツチもなく　１００％同一である。

（ｄ）センス及びアンチセンスの両プライマーでその長さが１７から５０のヌク レオチド配列； （ｅ）センスプライマーとアンチセンスプライマーとの間のＴｍの差が２℃以内 である； げ）センスプライマーかアンチセンスプライマーセンスのどちらかで４塩基を越 える長さをもつ相補的構造を持たない：（ｇ）センスプライマーとアンチセンス プライマーセンスとの間で４塩基を越える長さをもつ相補性構造を持たない：０ 】）センス及びアンチセンスの両プライマーがコーディング配列のエリアに存在 する： （ｉ）被増幅ＤＮＡの長さが２００塩基を越える。及び（」）３つのｊｕｎ遺伝 子のサブタイプの間での増幅遺伝子のヌクレオチド配列の相同性は８０％を上回 らず、且つＰＣＲによる増幅後は、サザンプロットによってｊ叩遺伝子の各サブ タイプを特徴化できる。

上に示した条件を満たすＤＮＡフラグメント（センス及びアンチセンスの両プラ イマー）が検討され、そして幾つかの候補オリゴヌクレオチドが合成された。そ の試験結果によって、センスプライマー５’−ＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣ ＣＧＣＡＧＡＣ−３’およびアンチセンスプライｖ　−５’−ＣＧＴＧＧＧＴＣ ＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＴＴＧＡＧＣＴＧ−３’が望マシイ候補テすることが示さ れた。

表１５は、ヒトとネズミの両方における好ましいセンスプライマーと３つのｊｕ ｎ遺伝子のサブタイプとの間でのヌクレオチド配列の相同性を示す。

表１５ ５’　−ＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＡＣ−３’　（ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：３１０）ネズミ　ｊｕｎ−Ｂ　−Ｔ−Ｔ−Ａ−−−−−−−−−−− −−−（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋３１１）ｃ−ｊｕｎ　−−−−−−−−−Ａ−− −−−−−−−−−（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１２）ヒト　ｊｕｎ−Ｂ　−Ｔ− Ｃ−−−−−−−−Ａ−−−−−−−−（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１３）ｃ−ｊ ｕｎ　−−−−−−−−−−−−−−千−−−−（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１４ ）−１はセンスプライマーと同一の塩基を示す。

加えて、表１６は、ヒトとネズミの両方におけるセンスプライマーと３つのｊｕ ｎ遺伝子のサブタイプとの間でのヌクレオチド配列の相同性を示す。

表１６ アンチセンスプライマー ３’　−ＧＴＣＧＡＧＴＴＣＧＴＣＴＴＴＣＡＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣ−５’　 （ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１５）ネズミｊｕｎ−Ｂ　−−−−−−−−−−−− Ｃ−−−−−−−Ａ−（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１［））’−−−−−−−−−−− −−−−−−Ｔ−−−一ぐ５ＥＱＩＤＮｏ・３１７）ｊｕｎ−Ｄ　−−一千一− −−−−Ｇ−Ｇ−Ｃ−−−−−（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１８）ヒｈ　ｊｕｎ− Ｂ　−一一千−（：−−−−−−−−−−−−（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１９） ｃ−ｊｕｎ　−−−千−−−−−−−−−−−−−−−−（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：３２０）また、表１７はｊｕｎ遺伝子の各サブタイプの間での増幅遺伝子のヌ クレオチド配列の相同性を示す。

表１７ サブタイプ　相同性（駕） ｊｕｎ−Ｂ　＆　ｃ−ｊｕｎ　７２．０ｊｕｎ−Ｂ　＆　ｊｕｎ−Ｄ　７３．６ ｃｍｊｕｎ　＆　ｊｕｎ−Ｄ　７５．３表１８ サブタイプ　しトとネズミ間の相同性（％）ｊｕｎ−Ｂ　９３．０ プライマーの配列は種々の方法で改良できる。例えば、第一級アミン残基、制限 酵素により認識されるヌクレオチド配列、またはＰＣＲ増幅後さらに改良を施す ためのＲＮＡプロモーター配列、をプライマーの５゛末端に付加することができ る。これらの改良をここでは”Ｘ”記号で表示する。故にく例えば、表１６に示 された改良プライマ−ハ５’　−ＸＣＧＴＧＧＧＴＣＡＡＧＡＣＴｒＣＴＧＣＴ ＴＧＡＧＣＴＧ−３’　と表示でき１．：、、でＸは、第一級アミン残基、制限 酵素により認識されるヌクレオチド配列、またはＰＣＲ増幅後さらに改良を施す ためのＲＮＡプロモーター配列を表す。

制限部位を５°末端（Ｘ）に付けるのは増幅遺伝子をクローニングする上で有用 である。ＲＮＡプロモーター配列を５゛末端（Ｘ）に付与することは、ＲＮＡ転 写及びＲＮＡ転写に基づく増幅に際して有用である。第一級アミンを５°末端に 付与することは、標識混合物または固形支持体との連結反応に有用であり、その 結果、増幅遺伝子を容易に定量することが可能となる。

制限酵素による切断を受ける上記ヌクレオチド配列に関しては、比較的高し１頻 度をもっＥｃｏ　Ｒ１またはＢａ＋ｍＨＩのようなヌクレオチド配列の代わりに 、次のヌクレオチド配列のような比較的低い頻度で出現する（例えば、８塩基の ）より長い認識配列を使うのが望ましいこともしばしばある。ｓｌ　−ＧＣＧＧ Ｃαｆ−３°　（Ｎｏｔｌにより認識）：または５’　−ＴｒＡＡＴＴＡ＾−３ ’　（Ｐａｃｌにより認識）。その理由は、ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩにより 認識される比較的普通のヌクレオチド配列は、好ましくないＤＮＡ配列にプライ マーを導くため、ＰＣＲ増幅中に偽の正反応になってしまうことがあり得るから である。

あるＲＮＡプロモーターを含む上記ヌクレオチド配列（Ｘ）は、種々のそうした 配列の何れか、例えば、Ｔ７．　ＳＦ３またはＴ３　ＲＮＡプロモーター配列、 でありうる。

上記の第一級アミン残基（Ｘ）は、オリゴヌクレオチドの合成中に５°末端に付 加することができる。

この発明においてセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとしてのＤＮＡ フラグメントは、市販のＤＮＡシンセサイザーで容易に合成できる。これらの合 成されたオリゴヌクレオチドは高速液体クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動 によって精製できる。

分析される試験材料は、通常、細胞または組織から得た全ＲＮＡまたは精製され たｍＲＮＡである。望むなら、細胞または組織は何等の前処理もしない自然な状 態で試験することが可能である。しかし、薬物試験の場合、これはその薬物を試 験管中で細胞または組織と反応させることによって達成でき、またはその薬物を 実験動物に投与（静脈注射、皮下注射、筋肉注射、経口投与、腹腔内注射）し、 一定の設定時間経過後、１ｆｆｌＡ／ｍＲＮ＾の精製のため細胞または組織を取 り除くことができる。

全ＲＮＡまたはｍＲＮＡの精製法は周知の技術である。そのような方法の例とし ては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等による＠Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　２ｎｄ　Ｅｄ、　、”bｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８９）に記載されている標準的プロトコール、及びＩｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ＜Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）から市販されているＦａｓｔ Ｔｒａｃｋのようなキットがある。何れの場合も、ＲＮａｓｅの侵入を防ぐため 、手は、好ましくはビニール手袋で防御し、実験に使用される器具類には素手で 触らないことが肝要である。また、実験に使用するガラスの容器類は全て、使う 前に、約２５０℃で少なくとも４時間加熱すること。更に、０．１％のジエチル ピロカルボネート（以後、ＤＲＰＣと省略）を使用する予定の水に加え、３７℃ で一晩インキユベートした後、処理された水をオートクレーブにかける。その他 の基礎的処置は、′モレキュラー・クローニングｐｐ、　７．３−７．５に概説 されているように実施する。バナジルリポヌクレオシドも上述のようにサンプル Ｊこ加えることができる。

逆転写を利用してｍＲＮＡの鋳型からｃＤＮＡを合成する方法は前出の”モレキ ュラー・クローニングｐｐ、　８．１１−８．１３に記載されている。

ＰＣＲ増幅のため、合成されたｃＤＮＡは、センスプライマー、アンチセンスプ ライマー、４種のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、　ｄｃＴＰ、　ｄＧＴＰお よびｄＴＴＰ）、Ｔａｑポリメラーゼ、無機塩、及びその他必要な材料と混合し 、そしてサーマルサイクル装置（Ｐｅｒｋｉｎ− Ｅｌｍａｒ　Ｃｅｔｕｓ）でＰＣＲ反応を行う。代表的ＰＣＲ法は”モレキュラ ー・クローニングｐｐ、　１４．２−１４．３３に記載されている。

増幅された遺伝子を分析するためには、電気泳動を用いるのが適当である。増幅 された遺伝子をアガロースゲル中で電気泳動に供し、その後、臭化エチジウムで 染色する。そうすれば、”モレキュラー・クローニングｐｐ、　Ｅ、　３−Ｅ、 　４に記載されているように、増幅されたＤＮＡバンドは蛍光の下で見えてくる 。ＤＮＡバンドの写真を撮った後、市販のシステム、例えば、Ｓｔｒａｔａｓｃ ａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）、により写真を走査し、走 査像を解析して各バンドの強度を定量化することも可能である。

更に、アガロースゲルでの電気泳動の後、増幅された遺伝子を膜上に転写でき、 サブタイプに特異的遺伝子は標識プローブとハイブリダイズさせ、続いて標識シ グナル、例えば３２Ｐまたは化学ルミネッセンスをポラロイドフィルムかＸ線フ ィルムに露光させることによって検出することができる（サザンプロット）。

実施例７ 欠２ス及びアンチセンスズ之（ヱニΩ介戒びマウスのｕｎ　−一」に＞（Ｄ増鵬 センスプライマーＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・９　（ｓ９４３−２）及びアンチセンス ・オリゴヌクレオチドｓＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌＯ（＾５１１３２−２）をシンセ サイザー３８０Ｂ型（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏ、　）を使 って合成した。５５℃で一晩、水酸化アンモニウム処理をした後、合成されたオ リゴヌクレオチドを５ｐｅｅｄ−Ｖａｃ　（Ｓａｖａｎｔ　Ｃｏ、　）内で乾燥 し、水でｌμｇ／ｍｌになるようその濃度を調節し、使用するまで一２０℃で保 管した。

３種のマウスｊｕｎクローンの内の１つを１μｍ、センスプライマー１μｍ、ア ンチセンスプライマー１μｌ、　ＰＣＲ用１０Ｘ緩衝液５μｍ、２５　ｍＭの塩 化マグネシウムｌμｌ、１０　ｌｎＭ　ｄＮＴＰ混合液４μｍ、及びＴａｑポリ メラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５　ｐ　１を混和し、合計容積が５０μｍにな るまで水を加えた。ミネラルオイルを２滴滴下後、サーマルサイクル装置、ｍｏ ｄｅｌ　４８０、を使ってＰＣＲを実施した。反応混合物を９５℃で１０分間加 熱後、次のサイクル３０回でＰＣＲを行った＝５５℃−１，５分間アニール、７ ２℃−４分間伸長、及び　９５℃−１，５分間変性。

ＰＣＲ後、サンプルｌＯμｍを、ＩＯＸローディング緩衝液（０，２５％ブロモ フェノールブルー、０．２５％キシレンシアツルＦＦ、及び１５％フィコール、 Ｔｙｐｅ　４００）　ｌμｌと混合し、臭化エチジウム５μｇ／ｍｌを含む１． ５％アガロースゲルで電気泳動を行った。電気泳動の後、増幅されたＤＮＡバン ドが紫外光によって可視化された。

結果としては、クローンｊｕｎ−Ｂ、　ｃ−ｊｕｎ、及びｊｕｎ−Ｄが使われた 各々の場合に増幅されたＤＮＡについて、単一バンドが約２７０　ｂｐの位置で 観察されることが見出された。

このことは、プライマーの上記組合せで、マウスのｊｕｎ遺伝遺伝子３全類全　 ｊｕｎ−Ｂ。

ｃ−ｊｕｎ、　ｊｕｎ−Ｄ、を認識、増幅できることを意味している。

（１）　ｊｕｎ’　”−ｔｈｎＲＮＡの　’ｕＰＣＲブー　マーの　−πなムｊ ｕｎｉ瘍遺伝子に特異的なセンス（ｊｕｎ−ｓ）及びアンチセンス（ｊｕｎ−ａ ｓ）オリゴデオキシリボヌクレオチドは上述のＩ）ＮＡシンセサイザーで合成し た。そのヌクレオチド配列は次の通りである： Ｊｕｎ−ｓ　５’−ＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＡＧＣＣＧＣＡＧＡＣ−３°　（ Ｓｅｑ　ＩＤ　ＮＯ：１１）ｊｕｎ−ａｓ　５’　−ＣＧＴＧＧＧＴＣＡＴＧＡ ＣＴＴＴＣＴＧＣＴＴＧＡＧＣＴＧ−３°　（Ｓｅｑ　ＩＤ　ＮＯ：１２）（２ ）　ｃＤＮＡのＰＣＲ増鵬 （ＩＶ）項で記載された５ｓ−ｃＤＮＡ　ｌμｌに、　ｊｕｎ−ｓ及びｊｕｎ− ａｓオリゴヌクレオチド各０、　Ｉμｇ（ｌμｌ）、１０ｘ　ＰＣＲ緩衝液（Ｐ ｒｏｍｅｇａ）５μｍ、　２５　ｍＭ　ＭｇＣｌｄμｍ、　１０　ｍＭ　ｄＮＴ Ｐ混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ）４μ１．　Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏａ＋ｅｇａ ）０．５１１１．およびＤＥＰＣ処理水３６．５μｌを混合した。２滴のミネラ ルオイルで反応混合物の上を覆い、蒸発を防いだ。反応混合物を先ず９５℃で１ ０分間加熱し、次いで、上述のようにサーマルサイクル装置（Ｍｏｄｅｌ　４８ ０．　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）により次の３０サイクルでＦ’ ＣＲを実施した：５５℃−１．５分間アニール、７２℃−４分間伸長、及び　９ ５℃−１，５分間変性。

その後、得られたＰＣＲ産物の１０μｍをＩＯＸローディング緩衝液１μｍと混 合し、それから臭化エチジウム５μｇ／ｍｌを含む１．５％アガロースゲル電気 泳動にかけた。電気泳動は、１ｘＴＢＥ緩衝液中、１００　Ｖ／６．５　ｃｍ幅 で約１時間行われた。電気泳動後、蛍光ＤＮＡバンドをポラロイドフィルム上に 記録した。図１７レーン１−８は白血球溶解物についてそれぞれ希釈１・１００ ０、最大限強度（血液１ｍｌと等価）、１：１０、及びｌ・１００希釈の二連実 験値を示す。図１７に示されるように、ｊｕｎ遺伝子はｌ：ＩＱ及びＩｇｌｏｏ 希釈から増幅され、推定サイズ３７０塩基対を示した。このサイズは、３７２ｂ ｐの理論値と類似している。

実施例８ ヒ　の　の“ｕｎ゛　−の　に　上月ｍ沖力果（１）　ＥＧＦに　ヒ　の１処理 リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をヘパリン処理したヒトの血液２０　ｍｌに加 える。このサンプル各１０　ｍｌをＩｓｏＬｙｍｐｈ　３　ｍｌに重層し、それ から４００　Ｘｇで３０分間遠心分離する。そのペレットをＰＢＳで３回洗浄し た後、ＰＢＳ　３　ａｌｌに再懸濁する。次いで、このサンプル各１ｍｌを３本 のチューブ（Ｎｏ、　１−Ｎｏ、　３）に入れる。ＰＢＳ　１　ｍｌをコントロ ールとして４番目の管に入れる。４本のチューブ全てを３７℃で１０分間保温し 、次いで、ＥＧＦ　（上皮成長因子−Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａ ｃｔｏｒ）を最終濃度が３０　ｎｇ／ｍｌになるようにＮｏ、　ｌのチューブに 入れる。１５分後、同じ方法でＥＧＦをＮＯ１２の管に入れ、さらに５分間保温 する０５分後、４本のチューブ全てからＲＮＡを同時に抽出する。このようにし て、ヒトの白血球のＥＧＦによる前処理時間経過がＮｏ、　ｌについて２０分、 ＮＯ１２について５分、Ｎ００３について０分となる。

（２）槻胞左→１床呂Ω追■ 上記の４本のチューブを取り出し、小型遠心機により１０秒間遠心分離する。上 清を捨て、下記の溶解緩衝液をペレットに加え、混合した後、これを４５℃−３ ０分間インキュベートする。

溶解緩衝液の内容・ １０　ＩｎＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，０ ０５％ＳＤＳ　（無菌フィルターによりバクテリア除去）０、２　Ｍ　ＮａＣＩ ＤＥＰＣ処理水 ＲＮ＾阻害剤５００　ｕｎｉｔｓ／ｍｌバナジル複合体１０　ｍＭ プロテイナーゼＫ　２００　μｇ／ｍ１（３）吐臥Φ精襄 ５　Ｍ　ＮａＣ１を上記細胞溶解物に加えて最終濃度を０．５Ｍにした後、オリ ゴ（ｄＴ）セルロース（Ｓｔ、ｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｏ、　）を加え、室温で３ ０分間反応させる。次いで、そのセルロースを結合緩衝液（２０ｍＭ　）−リス −ＨＣｌ、　ｐ）Ｉ　７．６．１　ｍ１ｌｌ　ＥＤＴＡ、　０．５　Ｍ　ＮａＣ １）７５回洗浄した後、ＤＥＰＣ処理水０．３５　ｍｌを加え、そしてｍＲＮＡ を固相がら溶離する。次ぎに、２Ｍの酢酸ナトリウム０．３５μｌおよびその容 積の２．５倍のエタノールを加え、ドライアイスで２０分間冷却した後、１５． ００Ｏｒｐｍで２０分間遠心分離する。ペレットを７５％エタノールで一度洗浄 した後、乾燥し、次いでＤＥＰＣ処理水１０μｌに溶解する。

（４）ψＭの合成 ５０ｍＭ１−リス−〇ＣＩ（ｐＨ８，３）、　７５　ｍＭ　ＫＣＩ、　３　ｍＭ 塩化マグネシウム、１０　ｍＭ　ＤＴＴ。

０．５　ｍＶ　ｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴｒＰ） 、　５０　μｇ／ｍ１オリゴ（ｄＴ）プライマー及び１０．０００　ｕｎｉｔｓ ／ｌ！ｌｌ逆転写酵素とを、上記で得られたｍＲＮＡ　１０μｌに加えて全容積 を２０μｍにし、これを３７℃で１時間反応させる。反応後、フェノール・クロ ロホルム、イソアミルアルコールの混合液２０μｌを加え、ドライアイスで２０ 分間冷却してｃＤＮＡを沈澱させる。１０．００Ｏｒｐｍで２０分間遠心分離後 、ペレットを７５％エタノールで一度洗浄する。次ぎに、乾燥後、これをオート クレーブにかけられた水２０μｍに溶解し、−２０℃で保管する。

ｊｕｎ遺伝子増幅のためのセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（１ｍ ｇ／＋ｎ１．）の各ＩμｌにｃＤＮＡ　２μ】を加える。これを５０　ｍＭ　Ｋ ＣＩと混合した後、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、　（ｐＨ８，４）、　２．０　ｄ 塩化マグネシウム、ゼラチ＞　１００　μｇ／ｍｌ、および０．２ｍＭｄＮＴＰ 、　Ｔａｑポリメラーゼ２．５　ｕｎｉｔｓを加える（最終容積：　５０　ｍｌ ）、反応混合物を９５℃で１０分間加熱後、次のサイクル３０回によってＰＣＲ を行う＝５５℃−１，５分間アニール、７２℃−４分間伸長、及び９５℃−１， ５分間変性。

（６）　ガロース゛ル ＰＣＲ完了後、反応溶液１０μｌを取り、実施例７に記載の方法で電気泳動を行 う。

その結果によれば、ＥＧＦ処理を受けなかった白血球（即ち、Ｎｏ、　３の管で 処理時間ゼロのサンプル）においては、約２７０　ｂｐサイズの位置で増幅ＤＮ Ａが最少バンドを有することが見出された。しかし、増幅ＤＮＡバンドは５分後 に増大し、その後、２０分以内に基底レベルに戻ったことが観察された。

実施例９ ヒトの　のｕｎ私子欠知ヰＵ」山川拮迩に拗釆ＥＧＦの代わりに、ＰＨＡ　（最 終濃度＝ｌＯμｇ）を利用し、前処理時間を０分、５分、１５分、及び３０分に 設定した。その他の手順は実施例８のそれらと同一とした。結果として、１５分 でなされたＰＨ人前処理により増幅ＤＮＡのバンドは約２７０　ｂｐの位置で最 大となるが、（時間経過）後にこのバンドは減少することが観察された。

この発明の方法に従って分析できる他のｍＲＮＡの場合と同様に、種々のｊｕｎ 配列は、ＰＣＲ法に対するセンスまたはアンチセンスプライマーとして、または ここに記載されたｍＲＮＡ検出用プローブとして役立たせることができた。種々 のｊｕｎ　ｍＲＮＡに共通か、または特殊な種に特異的な配列の同定法を以降に 提供する。同定についての本発明の好ましい実施態様では、コンピュータを使っ て配列を同定する。かかるプログラムの使用によって我々は多数の共通及び特異 的な両方のプライマー及びプローブを同定した。表１９−２４にそのようなプロ グラムを使って同定された種々のセンス配列を掲げる：これらはｊｕｎ遺伝子の プローブ及びプライマーとして有用である。

これらの表に掲げられた全ての配列は、この発明のＰＣＲ法に関連する範囲内で 有用である。相補的なアンチセンス配列もこの発明の一定の状況においては有用 である。当業者に明らかになるように、標的配列とは類似しているが全く同じで はない共通のプローブでは、そうしたプローブが特定標的配列とハイブリダイズ するかまたはハイブリダイズに失敗するよう厳しい条件を（例えば、温度及び塩 分の変化によって）変更することができる。また、この発明の範囲に含まれるも のとしては、掲げられたセンス配列かまたはそれらのアンチセンスの片方と同じ 配列の何れかとハイブリダイズできる配列である。ｊｕｎ遺伝子用の付加的プロ ーブには下記が包含される・ のｕｎ　−ローブ 特異的プ旦ニブ 表１９　Ｊｕｎ−共通センスプライマー（３９４３−２）表２０　Ｊｕｎ−共通 アンチセンスプライｖ−（ＡＳ１１３２−２）表２１　Ｊｕｎ−隅異的プローブ （Ｂ−１２５８）表２２　ｃ−ｊｕｎ特異的プローブ（ｃ２１４７）Ｈ＞−り１ ６９ｏｕｓＩｅＯｔ＃’ｔｃＰＩｌｆｉＣｅｄａｎ＆Ｎｗ＠ｐ＾Ｌｐ＾　ｌ　、 ｅｔｕ茜ｒｎｅ＋　−−−（１ニー　ＬＳＩ０１０　ＮＯ＋　０８１ｓＨｐａＵ （−１ｌｒｎｗｙｇｔｔ＋ｅ＜−−Ｃａ−ＬＳＥＱ＋ｏｍｏ：９９）表２３　ヒ ト（Ｄｊｕｎ−Ｄ特異的プローブ（ＢＵＭＤ９６５）表２４　マウスｊｕｎ−Ｄ ｅ異的フｆｆ１−フ（ＭＵＳＤ１０６３）表２５　ヒト〜げっ歯頚共通ｊｕｎ− ８特異的プローブｊｙｌ　５　咄Ｍ１龜　・　−−一・　（ホ）　−−−一−− ・−・−−ｉｌｌ　１１１０ＨｕＩＪｌｓＤ　Ｉ−Ｇ（４７−１１（（Ｎ？　Ａ ζＧ、、−１−ｅｃＧＡａ　１２３ｉｚ０１１１ＪＭＪｕＸ）Ｉ　Ｉ　ｃｃｃｌ −ＩＩ　Ｉｃ　ＭＷ　ＩＣ−−−マ仁（−ａｍ　＋２７訃　プライマーとしてＢ −５０４およびＢ−７３９を使用するＰＣＢ産物のサイズ＊＊：　ＧｅｎＢａｎ ｋ中の最大マツチ配列（リリース６８０）表２６　ヒト−げっ書類共通ｃ−ｊｕ ｎ特異的プローブ：に； 掌　プライマーとしてＣ−２１０１およびＣ−２２１９を使用するＰＣＲ産物の サイズ零零　ＧｅｎＢａｎｋ中の最大マンチ配列（リリースｆｉ８．０）表２７ 　ヒト−げっ歯頚共通３ｕローＤ特異的プローブネー　プライマーとしてＤ−９ １６およびＤ−１１５３を使用するＰＣＲ産物のサイズＨ：　ＧｅｎＢａｎｋ中 の最大マツチ配列（リリース６８．０）プローブ　ＰＣＲブー　マーのｐ この発明の方法に使用されるプローブ及びＰＣＲプライマーは関連技術で知られ ている何れの方法においても同定可能である。しかし、好ましくほそうしたプロ ーブ及びプライマーはコンピュータにより同定されることである。我々は、そう したプローブ及びプライマーに用いられる配列を同定するための新しいコンピュ ータシステムを開発した。このシステムは、極めて正確なオリゴヌクレオチドプ ローブ及びＰＣＲプライマーの計算・設計がユーザに可能となる自動システムで ある。

この発明のソフトウェアは、１８１１”互換パーソナルコンピュータでのマイク ロソフトウィンドウズ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　ｆｉ口ｄｏｔｓ＠）の下で実行さ れる。この発明により、リダイゼーション強度モデルを通して推定可能となる。

定量的には、ハイブリダイゼーション強度は融解温度（Ｔｍ）で与えられる。

ハイブリダイゼーション強度モデルを推定するための２つのモデルはこの発明に よって支援される：１）ミスマツチモデル（Ｍｉｓｍａｔｃｈモデル）及び２） 　Ｈサイトモデル（Ｈ−８ｉｔｅモデル）。何れの場合においても、ユーザは各 プローブに関する次の計算、それに続いて表示及び解析に利用される結果を選択 することができる＝１）配列、融解温度（Ｔｍ）及びヘアピン特性（ヘアピンは 、それ自体と相同なヌクレオチド配列であり同一プローブの他の部位とハイブリ ダイズするプローブの一部と「折り重ね」られる）；２）調製混合物の範囲内の 他の種とのハイブリダイゼーション：及び３）最強ハイブリダイゼーションの座 （部位）どＴｍ０次いで、発明の計算結果は、標的ｍＲＮ＾と作成しているプロ ーブ配列との間の可能な全てのハイブリダイゼーションを図示するミツハシ（Ｍ ｉｔｓｕｈａｓｈｉ）プローブ選択ダイアダラム（ＭＰＳＤ）上に表示される。

主要なオリゴプローブ設計ステーションのダイアログウィンドウ（対話ウィンド ウ）によってプログラムにおける全てのユーザ定義可能設定が制御される。ユー ザにはこのウィンドウで多くのオプションが提供される。ファイル−Ｆｉｌｅ− オプションによって、ユーザは、印刷、カラー印刷、選択プローブ保存及びプロ グラム終了を実行することが可能となる。プリバレージョン（Ｐｒｅｐａｒａｔ ｉｏｎ）　・オプションによって、ユーザは、プリバレージョン（ＰＲＰ）ファ イルの公開及び作成を実行することが可能となる。モデル（Ｍｏｄｅｌｓ）オプ ションによって、ユーザは、現在オリゴプローブ設計ステーションに支援されて いる２つのハイブリダイゼーションモデル：１）Ｈサイトモデル及び２）ミスマ ツチモデルから選択することができる。

もし、Ｈサイトモデルを選択すれば、各プローブに対する融解温度及び核形成し きい値を設定することができる。核形成しきい値は核形成サイト（正確に一致す るサブ配列）からなる塩基対の数である。もしユーザがミスマツチモデルオプシ ョンを選択すれば、プローブ長さ及びミスマツチ数（Ｎ）が設定される。

主スヱユ±天デル ミスマツチモデルは、ＧｅｎＢａｎｋのような情報源からの配列のデータベース 情報を利用してＤＮＡ及びｍＲＮＡを設計する際に用いられるものである。この モデルでは、ハイブリダイゼーション強度は、プローブとその標的との間の塩基 対ミスマツチ数にのみ関連する。一般的に、パラメータ設定時ユーザが許すミス マツチ数が多ければ多いほど、より多くのプローブが同定されることになる。ミ スマツチモデルは、候補プローブのＧＣ含量を考慮しないので、プローブの結合 強度についての計算は無い。

ミスマツチモデルに採用されている基本技術は、ハツシングと連続シードフィル トレージョン（濾過）法である。ハツシングには、記録の対称的グループ分けを するため一組のデータの記録に対しアルゴリズムを適用することが含まれる。

データベースのような指標付きデータセットを使う時は、ハツシングは記録キー を記録の保存・検索のための指標値に変換するプロセスとなる。ミスマツチモデ ルは、本質的にはＤＮＡ及びｍＲＮＡの配列間の正確な及び不正確なマツチング を決めるための高速プロセスであり、ミツハシプローブ選択ダイアグラム（ＭＰ ＳＤ）を支援する。

ミスマツチモデルに使用されるアルゴリズムは、Ｗａｔｅｒｍａｎ−Ｐｅｖｚｎ ｅｒのアルゴリズム（ＹＰＡＬＧ）を基礎にしており、これはコンピュータによ るプローブ選択プロセスである。Ｈｕｍｅ及び５ｕｎｄａｙ　（１９９１，Ｒｅ ｆ、４）、　Ｌａｎｄａｕ等（１９８６−１９９０，Ｒｅｆｓ、　６，７．８） 。

Ｇｒｏｓｓｉ及びＬｕｃｃｉｏ　（１９８９，Ｒｅｆ、３）参照。

この発明の実行においてミスマツチモデルを立上げる３つの主要なプログラムが ある。最初のものは、”ｋ−ｄｉｆｆ”と発明者が命名したものである。ＷＰＡ ＬＧはｋ　ｄｉｆｆを使って、２つの配列間でに以下かｋに等しい数のミスマツ チ数（ｋはユーザ指定）を有する１以上かまたは１に等しい長さく長さもユーザ 指定）を持つマツチの全位置を見つけている。もしも候補オリゴヌクレオチドプ ローブがこれによくマツチしなければ、それは固有であると考えられる。ｋ　ｄ ｉｆｆはハツシング及び連続シードろ過法を使用し、ＧｅｎＢａｎｋ及びその他 の同様のファイルフォーマットを有するデータベースを探索することによって相 同性が検索される。連続シードろ過法によって以前に行われていた技術よりはる かに効果的な探索が可能となる。

シードは、最悪ケースのシナリオにおいて最長の正確なマツチと等しい長さを持 つ部分配列であるとこの発明では定義される。例えば、ユーザが２以下のミスマ ツチ（ｋ）を以って１８というプローブ長（１）を選択すると想定しよう。もし ２つのミスマツチを有するマツチがあれば、６に等しい長さの完全にマツチング する部分配列が存在するはずである。シード長が決定されると、ミスマツチモデ ルによって、そのシード長（この例では、シード長は６になる）をもつ全ての部 分文字列が考察され、６と等しい長さをもつ完全にマツチした塩基対の配列が見 つけられ、次にこの部分配列がユーザ選択のプローブ長に等しい長さく即ち、こ の例では１８）の配列まで伸びるかどうかを調べることが考察される。もしそう なら、候補プローブはユーザの基準を満足していると見なされてきた。

シードサイズが大きい場合（即ち、特有のヌクレオチドの長鎖）、プログラムに よって、比較的大量のメモリがハツシュテーブルに割り当てられることになる。

この発明には、ＧｅｎＢａｎｋの各記入項目にメモリを割当て（アロケーション ）し直す代わりに、プログラムの始めに一度だけＧｅｎＢａｎｋの登録（ｅｎｔ ｒｙ）項目に対してメモリ割当ができるオプションがある。これによってＧｅｎ Ｂａｎｋに対する登録時間がファクター２と同じ大きさまで短縮されるが、しか し前もって最大のＧｅｎＢａｎｋ登録項目サイズをユーザが知っていなければな らない。

プローブは、もしそれがデータベースまたはファイルで探索された標的配列とに 以下のミスマツチならハイブリダイズすると見なされる。ミスマツチモデルの全 ての対応パラメータに対する的中拡張時間（ｈｉｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｔｉ ｍｅ）は、最小プローブ長（１）が２４にセットされ且つ最大ミスマツチ数が４ にセットされた一つの場合を除いては、３５秒より短いことが実験で確認されて いる。この状況は、ハイブリダイゼーション条件か弱すぎるため、実際の遺伝子 位置決定の実験にはほとんど使われないであろう。

■丈イ上天デル この発明の具体例では、第二のハイブリダイゼーション強度モデルは、Ｈサイト モデルと呼ばれる。Ｈサイトモデルの一つの局面では、ヌクレオチド結合強度を 解析するため実験式の一般化が行われている。このモデル状況が構築される基本 的式は次の通りである： Ｔｍ　・　８１．５　−　１６．６（ｌｏｇ　［Ｎａ］　−０，６３％（ホルム アミド）　＋　０．４１（％（Ｇ＋Ｃ））−６００／Ｎ。

ここで、ｌｏｇ　［Ｎａ］はナトリウム濃度を表す対数であり、％（Ｇ＋Ｃ）は Ｇ−Ｃ相補的なマツチ塩基対の比であり、Ｎはプローブ長である。この式は、融 解温度はプローブ長とパーセント表示のＧＣ含量の両方の関数であるという事実 に関連している。この基本式は、ミスマツチの存在を計数できるようこの発明で 改良された。ミスマツチについての各パーセントで融解温度が平均１．２５°（ ＡＴミスマツチについては２℃、■ミスマツチについては４℃）まで下げられた 。しかしこの式は近似である。実際の融解温度は、特に、短いプローブまたは比 較的多くのミスマツチがあるプローブに対しては、この近似とはもしかすると異 なるかも知れない。

Ｈサイトモデルにおけるハイブリダイゼーション強度は次のファクターのそれぞ れに関連する：ｌ）結合領域；２）ミスマツチの形式（ＧＣまたはＡＴ置換）： ３）プローブ長；４）結合領域のＧＣ含量：および５）”核形成部位”の存在（ 正確なマツチをもつ部分配列）。各配列でのミスマツチの形式及び結合部位のは 含量は、候補プローブの結合強度の一因となる。各プローブでの結合強度はそれ によって決められ、ユーザにとって最適プローブを選ぶことができるようになる 。

Ｈサイトモデルが根本的に仮定しているのは、結合領域と呼ばれるプローブと標 的が対になった部分配列によって結合強度はほとんど決められる、ということで ある。部分配列の結合領域にＡＴ対よりＧｅ対が多（含まれるなら、ＡとＴの塩 基（二重結合）に比較して、ＧとＣの塩基間の水素結合（三重結合）の数がより 多くなるため、結合強度はより高くなることになる。故に、ＧＣの多いプローブ はより高い融解温度を有し、またそれにともなって、より強力なハイブリダイゼ ーションを形成する。

Ｈサイトモデルにおいては、そのプログラムによって、標的遺伝子とのミスマツ チも無く理想的に最適プローブが決定される。しかしこのモデルでは、候補プロ ーブは、配列が印リッチの場合、より多くの＾Ｔミスマツチを有するはずである 。

特定の配列におけるへＴミスマツチの許容量は、この発明のプログラムにおいて は一致しないエリアに関してプローブにペナルティ−を科すことなしに一致する プローブと標的の部分配列部位を主として考察することにより決定される。もし ミスマツチが結合領域の一方か両方の端に存在する場合、塩基対を作ることにつ いての総合的安定度に関しては影響は少ない。結合領域の中心に位置するミスマ ツチは、プローブの結合強度を著しくて低下させるので有害である。

融解温度について上に引用された式は、結合領域の範囲内で適用される。プロ− ブ長はパーセンテージを計算するのに使われるが、この式のその他の全てのパラ メータは結合領域だけに適用される。Ｈサイトは更に核形成部位の存在を仮定し ている。この核形成部位の長さはユーザによって設定可能である。典型的には８ −１Ｏの塩基対の値が使われる。Ｈサイトモデルを完了するため、結合領域は、 一つは存在すると仮定される（さもなければＴｆｌＩ−Ｏ）核形成部位を包含す る全ての部位の中で融解温度を最高にするように選択される。

ハイブリダイゼーション強度は、一般には正の結合エネルギーを与えるマツチと 一般には負の結合エネルギーを与えるミスマツチとを有する多重部分配列寄与の 総和としてモデル化されるということにおいて、Ｈサイトモデルはミスマツチモ デルより複雑である。使用される正確な結合エネルギーは、マツチまたはミスマ ツチにのみ依存する。この発明の現行バージョンでは、これらの係数は明らかに ユーザ選択可能形式ではなく、むしろＩｔａｋｕｒａ等（１９８４，Ｒｅｆ、５ ）、　ＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ　（１９６２，Ｒｅｆ、２）、　Ｂ ｅｎｎｅｒ等（１９７３，Ｒｅｆ、ｌ）、及び５ｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５，Ｒ ｅｆ、@１３）に よって開発されたハイブリダイゼーション強度の式に最も適合するよう選択され るとはいえ、これらの係数はユーザによって規定することもできる。

■（サイトモデルの独特の局面は、ハイブリダイゼーション強度が候補プローブ と結合位置との間の最適結合領域で決まるということである。結合領域はハイブ リダイゼーション部位と呼ばれ、全体のハイブリダイゼーション強度が最高にな るよう選択され、その結果、結合領域外のミスマツチは推定ハイブリダイゼーシ ョン強度を減することはない。Ｈサイトモデルのその他いくつかの独特の特徴に は、それがＲＮＡの方に、特にＤＮＡというよりはｃＤＮＡの方により強く方向 付けられているという事実、及び作成（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）及び環境変数 全般について制御できるという事実が包含される。

ＲＮＡ及びｃＤＮＡに関して強調されるので、ユーザは、所望のプローブが得ら れるようゲノム配列全てを分類せざるを得ないというより、遺伝子のコード領域 に集中できることになる。環境及び作成変数全般にわたって強化されたユーザ制 御によって、彼または彼女が行っている如何なる実験とも対応する研究室の条件 をより精密にシミュレートすることがユーザに可能となる。更に、この発明の手 段によって、Ｇｃｎ＆＋ｎｋデータベースのいくつかの予備的前処理が行われｃ ＤＮＡを区分し選別する。これはキーワード（この場合はＣＢＳ）を各々の員□ Ｒａｎｋ記録で捜しだし、これによってイントロンを包含する配列はどれも排除 することによって行われる。

ミツハシプローブ選択ダイアグラム（ｋｌｓＰＤ）　（図２８）は、ミスマツチ およびＨサイトモデルによって設計されたプローブの結果を可視化する独特の方 法であり、この発明の主要な特徴である。それは候補オリゴヌクレオチドプロー ブ及び調製中の標的配列の全てとの全ハイブリダイゼーションの図式表示である 。遺伝子配列データベース及び標的ｍＲＮ＾の配列が与えられれば、ＭＰＳＤは 候補プローブおよびそれらのハイブリダイゼーション強度の全てをデータベース からの全ての配列とともに図式的に表示する。この手段では、各融解温度は赤（ Ｔｍ：最高）から青（ＴＩｌｌ：最低）までの別々のカラーで表示される。ＭＰ ＳＤによって、ユーザは、全ての候補プローブについて種々の温度における誤ハ イブリダイゼーションの数及びそれらの誤ハイブリダイゼーションの原因を（座 −１ｏｃｉ−及び配列の比較で）可視することができる。座は特定の部位（ｓｉ ｔｅ）または場所（ｐｌａｃｅ）でよく、遺伝子学的概念では、座は対立遺伝子 で占められているかも知れない一対の染色体の相同部分の何れかである。次いで 、これらのプローブは、生きた組織中の特定プロティンの前駆体の存在を調べる ために使うことができる。この発明で設計されたオリゴヌクレオチドプローブは 医学上の診断キットとして、ＤＮＡの同定、及びヒトの代謝経路の有望な連続モ ニタリングとして使用できる。このコンピユータ化設計ツールであるこの手段は 、Ｉ　ＢＭ”互換パーソナルコンピュータ（ＰＣ’ｓ）に関するＭｉｃｒｏｓｏ ｆｔ＠ｆｉｎｄｏｗｓ”　ｖ、　３．１　（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｃｏｒｐｏｒ ａｔｉｏｎ：ＲｅｄｍｏｎｄｌＷａｓｈｉｎ■狽盾獅■■ り製作）の下で実行される。

この発明のＨサイトモデルは、選択されたプローブ、及び可視化し解析し且つこ の発明で設計された候補プローブの中から選択する独創的且つ独特の手段につい て多くの情報を提供するということにおいて固有である。候補プローブは、Ｇｅ ｎＢａｎｋデータベースのようなデータベースに収集されたｍＲＮＡまたはＤＮ Ａ配列のいくつかの既知の組み合わせに関連したそれらの結合特性に関して■（ サイトモデルを使って解析される。第一段階には、与えられた標的の一部または 全部の座で候補プローブを選択することが含まれる。次ぎに、融解温度モデルが 選択され、そして各候補プローブが作り出すであろう誤ハイブリダイゼーション が幾つあり、それぞれの融解温度が何度になるかについて配慮が払われる。最後 に、可視化し、解析し且つ候補プローブの中から選択する独特のツールセットに よる結果が研究者に提示される。

この発明は、現在使われている方法より高速で且つはるかに精度が高い。それは 、最も特異的かつ特有の配列のみならず、共通の配列も見つけ得る唯一の方法で あるという理由から独特の方法である。さらにこれによって、ユーザは候補プロ ーブについて多種類の解析を実行でき、加えて、種々の方法でこれらのプローブ を標的配列と、及び相互に比較することができるようになる。

それ故、研究者が特異的及び共通の両オリゴヌクレオチドプローブを設計できる 実用的でユーザに優しいシステムを提供すること、且つこれを比較的短時間で現 行よりはるかに精密に達成することがこの発明の目的である。

本発明は、図２０に最もよく示された形態で使用される。ここでは、この発明の 組合せは、１８Ｍ互換パーソナルコンピュータからなり、この発明に特有のソフ トウェアを実行し、ＧｅｎＢａｎｋデータベース及びその他の関連データベース に見られるファイルフォーマットで配布されているデータベースにアクセスする 機能を有する。

限定されない限り、ここで用いられている全ての技術的及び科学的用語は、この 発明が属する分野における通常の技術を有する者に共通に理解されているものと 同じ意義を有する。ここに記載されている方法及び材料に類似または等価である ものの何れも実用上またはこの発明の試験に使用することができるが、好ましい 方法及び材料をここに示す。以下に述べるすべての出版物はここに参考として取 り入れる。

この発明を操作できる好ましいコンピュータソフトウェアは、少なくとも次の仕 様を有するシステムについて包含する（図２０）・ｌ）総合的に１人、ＩＢ、及 びＩｃと記号付けされたもので、コプロセッサ８０４８６付き、３３　Ｍｈｚ以 上の高速ランの１Ｂ「互換パーソナルコンピュータ（ＰＣ）　；　２）　８　！ ｉＢ以上のＲＡＭ、昆、３）少な（とも２００ＭＢ、好ましくはＩＧＢの記憶領 域を有するハードデスク、ＩＢ；４）読み取り可能フォマソトで本発明の出力を 表示するに十分なサイズのグラフィック機能を有し好ましくは解像度１０２４　 Ｘ　７６８を有するＶＧＡカラーモニタ：　５）　５８０　ＭＢ　ＣＤ　ＲＯＭ 　ｄｒｉｖｅ５（図２０のＩＢは、一般に、このにに包含された内部記憶システ ムと参照されるもので、左上から時計回りに、フロッピー装置２台、及びハード デスク）。この発明のソフトウェアは、好ましくはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ＠Ｗｉｎ ｄｏｗｓ”のインターフェースを有するため、ユーザもマウス２または他の形式 のボインティング・デバイスを必要とすることになる。

この発明の好ましい実施態様には、レーザプリンタ３および／またはカラープロ ッタ４も含まれる。この発明では、ユーザがＧｅｎＢａｎｋのデータベース８の （色々な数の遺伝子配列を含む’）　ＣＤ　ＲＯＭバージョンにアクセス手段を 持たないときは、（内部または外部式でもよい）モデムが必要である。モデムを 使えば、情報及び取扱い説明は、電話線を通してＧｅｎＢａｎｋデータベース８ とやりとりされる。もし、ＣＤ　ＲＯＭ　ｄｒｉｖｅ　５を使えば、ＧｅｎＢａ ｎｋデータベース（またはその特定部分）が多数のＣＤに記憶される。

コンピュータシステムは、好ましくは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ’　Ｗｉｎｄｏｗｓ ”バージョン３．１が動（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ＠の■シ（−ジョン５，０オペレ ーテイングシステムを少なくとも有すること。この発明における好ましい実施態 様では、そのプログラムは全てＢｏｒｌａｎｄ＠（Ｊ＋（Ｂｏｒｌａｎｄ　Ｉｎ ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｉｎｃ：　５ｃｏｔｔｓ　Ｖａｌｌｅｙ、　ＣＡ） のコンピュ[タ 言語で書かれた。銘記すべきは、その後続いて開発されたコンピュータ記憶シス テム及び言語は、この発明を利用するために応用することができること、及びそ の逆もあるということである。

この発明のコンピュータプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋかまたは同様のファイル フォーマットを有するデータベースに記憶されたＤＮＡ、　ｍＲＮＡおよびｃＤ ＮＡにユーザがアクセスできるよう設計されている。ＧｅｎＢａｎｋは、レコー ドで構成された分散型フラットファイルデータベースで、各レコードには種々の 分野がＡＳＣＩＩファイルフォーマットで包含されている。記憶されたデータベ ースそれ自体配布されており、その大多数のユーザにさえよく知られているよう にデータベース管理システム（ＤＢＭＳ）は一つもない。ライン形式フォーマッ トと呼ばれる一つの一般的フオーマットは、分散型データベース及びＧｅｎＢａ ｎｋの全内部保持記録の両方ともに使用される。全てのデータとシステムファイ ルおよびＧｃｎＢａｎｋ用索引は、ライン形式フォーマットでテキストファイル に保持される。主要なＧｅｎＢａｎｋデータベースは現在、多数のファイルまた は分割の形で分散されており、その各々は特殊な種の（または、少なくとも現に 知られており、順番に配列されて公に利用されている位の量の）ゲノムの典型を 示している。ＧｅｎＢａｎｋは核酸配列のコレクション並びに関連する書誌的及 び生物学上の注釈を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ　ＣＤ配布のうちのリリース７２ ．０（６／９２）は、合計で９千２百万を超えるヌクレオチドとともに７１．０ ００を超える座−１ｏｃｉ−を包含している。ＧｅｎＢａｎｋは、Ｂｅｔｈｅｓ ｄａ、　ＭＤのＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ　Ｉｎｆ盾■ ｍａｔｉｏｎ、　Ｍａｔｉｏｎａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｅｃｉｎｇ ｅと共同して、Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　ＣＡのＩｎｔｅｌ　１ｉＧｅｎ ｅｔｉｃｓにより配布されている。

ｌ・オニ１２１けタラシｋＣ６ｋか二Ｚ１２の概説ａ、一般理論 この発明の意図は、ＤＮＡの配列間の正確および不正確なマツチングを実行する ための１つ以上の高速プロセッサを提供して下に議論するミツハシプローブ選択 ダイアグラム（ｌＰｓＤ）、及び関連する図形解析ツールによる他の解析を支援 することにある。候補オリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ１ｍＲＮ＾またはｃ ＤＮＡの標的部分配列との間のハイブリダイゼーション強度は、ハイブリダイゼ ーション強度モデルによって見積もることができる。定量的には、ハイブリダイ ゼーション強度は融解温度（Ｔｍ）で与えられる。現在は、次の２つのハイブリ ダイゼーション強度がこの発明で支援されている： ｌ）ミスマツチモデル及び２）Ｉ］サイトモデル。

主要オリゴプローブ・デザインステーション・ダイアログウィンドウは、すべて のユーザ定義可能な設定を制御する。このウィンドウは５つのオプションを提供 するメニューバーを有する。ｌ）ファイル１．０　；　２）プリバレージョン８ ０　；　３）モデル、４）実験９０．及び５）ヘルプ。ファイル１０のオプショ ンによって、ユーザは、印刷、カラー印刷、選択プローブ保存及びプログラム終 了を実行することが可能となる。プリバレージョン−Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ− ・オプションによって、ユーザは、プリバレージョン（ＰＲＰ）ファイルのオー プン及び作成を実行することが可能となる。

モデル−Ｍｏｄｅｌ、ｓ−オプションによって、ユーザは、現在オリゴプローブ 設計ステーションに支援されている２つのハイブリダイゼーションモデル：１） Ｈサイトモデル７Ｉ及び２）ミスマツチモデル７５から選択することができる。

もしユーザがＨサイトモデル７１オプションを選択するなら、図２ＩＣの左側メ ニューが表示され、ユーザは次のモデルパラメータを設定する。ｌ）設計中のプ ローブに対する融解温度Ｔｍ　７２　（即ち、ユーザがシミュレートすることを 望んでいる特定の実験または条件に対応する融解温度）：及び２）核形成しきい 値７３（即ち、核形成部位を構成する塩基対の数）。もしユーザがＨサイトモデ ル７１オプションを選択するなら、図２ＩＣの右側メニューが表示され、ユーザ は次のモデルパラメータを設定する：ｌ）プローブ長７６（即ち、考慮されてい るプローブ中の塩基対の数）、及び２）ミスマツチＮ７７（即ち、ハイブリダイ ゼーションを構成するミスマツチの最大数）。ユーザが要求する計算は、Ｈサイ トモデルでは、もし、しきい値７３の設定が減らされれば比較的時間がかかるが 、もし、ミスマツチの数に７７が増やされれば、ミスマツチモデルの方がより時 間がかかる。

加えて、両モデルのオプションに関連して、ユーザは、それを対象にプローブが 設計されつつある標的種ＩＩのＤＮＡまたはｍＲＮ＾及びプリバレージョン１２ 、ハイブリダイゼーションの計算に使われる全配列のファイル、を選択する。標 的種ファイルの例を図４７　（ｈｕｍｂｊｕｎｘ、ｃｄｓ）に、一方、プリバレ ージョン・ファイルの例を図４８　（ｊｕｎｍｉｘ、　５ｅｑ）に示す。これら の入力の各々は標準ＤＯＳフォーマットでのファイル名と拡張子によって表示さ れる。標的種とプリバレージョンフィールドでは、ファイルフォーマットはＧｅ ｎＢａｎｋのフォーマットに従い、そのフィールドの各々はデフォルトファイル 拡張子を有する。”ＯＫ”ボタン９１　（図２１Ｃ）を押せば処理を開始し、一 方、”Ｃａｎｃｅｌ”ボタンによりその処理を停止する。

実験９０オプシヨン及びヘルプ５０オプシヨンは拡張オプションであるが発明の 現在の実行にはまだ利用できない。

Ｃ３処理 図２２はオリゴプローブ設計ステーションプログラム全体のフローチャートであ り、シーケンスと構造を説明している。一般的に、オリゴプローブ設計ステーシ ョンの主または”制御”プログラムは、全体の保守及び制御機能を実行するもの である。図２２に説明するように、このプログラムは入城変数を規定するなど総 合的ハウスキーピング（段取り）機能を履行する。ユーザに優しいインタフェー ス５３は、ユーザ入力手続き５５、ファイル５７またはデータベース５９へのア クセス手続き、ユーザ選択のモデルプログラム６２または６３の呼出し、および ユーザ選択の報告６５または表示６７．６９．７１及び７３の要点を実行する。

これらの各要点は、ユーザのセットアツプ及び制御入力の項目を包含する入力手 続きを除き、後節でより詳細に議論する。

Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉプローブ選択ダイアダラム・ウィンドウ（ＭＰＳＤ）図２ ３は、プログラム計算の結果を可視化する独特の方法であり、この発明の主要な 特徴である。それは候補オリゴヌクレオチドプローブ及び調製中の標識配列の全 てとの全１１イブリダイゼーシヨンの図式表示である。遺伝子配列データベース 及び標的ｍＲＮＡの配列が与えられれば、ＭＰＳＤは候補プローブおよびそれら のハイブリダイゼーション強度の全てをデータベースからの全ての配列とともに 図式的に表示する。ＭＰＳＤによって、ユーザは、全ての候補プローブについて 種々の温度での誤ハイブリダイゼーションの数及び誤ハイブリダイゼーションの 原因を（座と配列を比較して）可視することができるようになる。

選択された各融解温度について、各プローブに対するハイブリダイゼーションの 数を示すグラフが表示される。好ましい実施態様では、そのグラフはカラーコー ド化される。この発明の実行においては、赤色１２３は最高融解温度を、および 青色１２４は最低融解温度を識別する。各ミスマツチはＴｍ値の減少に帰着する 。融解温度はまた、プローブ長とパーセント表示のＧＣ含量の関数である。ユー ザが特定のプローブを選択すると、ウィンドウ内でカーソル１２５の形状がスク リーンを２分する垂直ラインから小方形に変化する。現プローブはＭＰＳＤウィ ンドウのカーソル位置（それがラインか方形であるかに関係なく）の下のそのプ ローブであると定義される。現プローブについてのより詳細な情報は、下で議論 されるＰｒｏｂｅ１口ｆｏおよびＭａｔｃｈｌｎｆｏウィンドウに与えられる。

マウスボタン２をカーソル１２５の所で１回クリックすれば現プローブが選択さ れ、マウスボタン２を２回クリックすれば現プローブが外される。スクリーンを 横切ってカーソルを移動させれば表示が変わり現在のカーソル位置の下では候補 プローブが表される。

ＭＰＳＤのＸ−軸１１０（図２３）は、与えられたｍＲＮ＾の配列に沿う候補プ ローブのスタート位置を示す。ユーザはその表示を左または右１ごスライドさせ て別のプローブのスタート位置を表示させることもできる。ＭＰＳＤのＹ−軸１ １５は、プログラムで計算されるプローブ特性を表示する。

メニューオプション１１６．１１７．１１８．１１９及び１２０は、ＭＰＳＤに セットされている間はユーザが利用でき、スクリーン最上部のメニューバーに沿 って表示される。ユーザは好ましいオプションにマウス２を合わせてオプション 選択を簡単に表示でき、且つマウスボタンを合わせ・保持してプローブを選択で きる。ユーザはまた、キー・ストロークの組み合わせをタイプしてよく知られた コンピュータのデスクトップインタフェースの操作に従ってオプションを表示す ることもできる。この組み合わせには、通常、所望のオプションの第一文字（即 ち、Ｆ、　Ｐ、　Ｍ、ＥまたはＨ）を表すキーを押しながらＡＬＴキーを押さえ つけることが含まれる。

Ｆｉ　ｌｅオプション１１６により、ユーザは入力ファイル及びデータベースを 特定することができる。Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎオプション１１７により、ユー ザは配列データベースを総括するプリバレージョンファイル（調製ファイル）を 作成することができる。

Ｍｏｄｅ　１オプシヨン１１８により、ユーザはハイブリダイゼーションモデル （即ち、Ｈサイトまたはミスマツチ）及びそのパラメータを特定することができ る。

ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔとＨｅ１ｐの両オプションはこの発明の現在の実施には利 用できない。これらのオプションは元の主オリゴプローブ設計ステーションダイ アログウィンドウ（図２１）の一部である。

最適プローブが表示されるＭＰＳＤ図形表示上（図２３）のエリアは、１２１に 示すように最も低く且つほとんど類似しており、表示された特定の配列は全ての 配列に共通であることを示している。最適プローブが表示されるＭＰＳＤ図形表 示上のエリアは、１２２に示すように最も高く且つほとんど類似しておらず、表 示された特定の配列は特定の遺伝子フラグメントに対し極端に特異性があること を示している。

ＭＰＳＤの高位点は候補プローブがハイブリダイズすることになるデータベース 上の座が多いこと（即ち、誤ハイブリダイゼーションが多いこと）を示す。低い 点は、少なくとも与えられたデータベースに関連したハイブリダイゼーションが 少ないことを示す。特に、１２１で示す配列は、試験された遺伝子フラグメント の全でと共通のプローブを反映しているだろうから、このプローブはこれらの遺 伝子の各々を検出するのに使用できよう。１２２で示す配列は、特定遺伝子フラ グメントに特異的なプローブを反映しているだろうから、このプローブはこの特 定遺伝子だけを検出するのに使用できよう。

ｉｉ、ヒ曲１肛朝９ば１担切山迂ｑグ不ン上ワＰｒｏｂｅｌｎｆｏ　（プローブ 情報）およびＭａｔｃｈｌｎｆｏ　（マツチ情報）ウィンドウ（図２４）によっ て、現在の候補プローブについての詳細な情報が表示される。ウィンドウの上方 部分はＰｒｏｂｅｌｎｆｏウィンドウであり、下方部分はＭａｔｃｈＩｎｆｏウ ィンドウである。Ｐｒｏｂｅｌｎｆｏウィンドウは次の形式の情報を表示する。

標的座−ｔａｒｇｅｔ　１ｏｃｕｓ−（即ち、ユーザがそれからプローブを捜し ているｍＲＮＡ、　ｃＤＮ＾またはＤＮＡ　）は１３１で表示され、一方、ハイ ブリダイゼーションに使われるプリバレージョンは１３２で表示される。図２４ に示す例では、標的座１３１は）ＩＵＭＢＪＵＮＸ、　ＣＤＳ、と命名されたフ ァイルであり、これはサブディレクトリＭＩＬＡＮのｄｒｉｖｅ　Ｆに位置して いるものとして示されている。プリバレージョン−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ−１ ３２はＪＵＮＭＩＸ、　ＰＲＰ、と命名されたファイルとして示されており、こ れもサブディレクトリＭ　Ｉ　ＬＡＮのｄｒｉｖｅ　Ｆにあるものとして示され ている。この実施例におけるＪＵＮＭ　ＩＸ、　ＰＲＰプリバレージョンはヒト とマウスのＪＵＮ遺伝子座の混合物である。

現在の且つ最適のプローブのスタート位置を１３５で示す。現在の候補オリゴヌ クレオチドプローブは１３６で定義され、２１塩基の長さを持つものとして１３ ７で掲げられている。標的とハイブリダイズさぜられたプローブ１３６について の融解温度を上欄１４０に示す。最適プローブについての融解温度は１３８で６ １．７℃として与えられる。

Ｐｒｏｂｅｌｎｆｏウィンドウ（図２４）には、１３９でプローブのヘアピン特 性も示されている。示された例では、Ｐｒｏｌｒｌｎｆｏウィンドウも最悪ヘア ピンに含まれた４塩基対が存在すること、及びその最悪ヘアピンの長さはｌであ ることを示している（図２４゜１３９参照）。Ｍａｔｃｈ１口ｆｏウィンドウの 一部は、プリバレージョンファイル内での現在のプローブと種とのハイブリダイ ゼーションのリストをハイブリダイゼーション座とハイブリダイゼーション温度 とを含めて表示する。ハイブリダイゼーションは融解温度に関して減少していく 順に記録される。表示は、それによってハイブリダイゼーションが生じる遺伝子 座、その庫内での位置、およびハイブリダイゼーションの配列を示す。

ＭａｔｃｈＩｎｆｏウィンドウの一部には、候補プローブが高い結合強度で完全 にハイブリダイズしているように１５０で示される。これは、標的ＤＮＡ自体が この場合データベースに表わされるので、標的プローブはそれ自体とハイブリダ イズする（完全ハイブリダイゼーション）と１５０で見られるからである。プリ バレージョン１３２からの各ハイブリダイゼーションの遺伝子座は上欄１４１に 表示され、一方、各ハイブリダイゼーションのスタート位置は上欄１４２に与え られる。計算されたハイブリダイゼーションは１４５で示される。

ｉｉｉ、ヒ伸競包ロフイ２下ワ ＰｒｏｂｅｓＥｄｉ　ｔ　（プローブ編集）ウィンドウ（図２５）は、オリゴプ ローブ設計ステーションのテキストファイル出力の便利な編集と注釈のために設 けられたテキスト編集ウィンドウである。それはまた、ＭＰＳＤ　（図２３）か ら選択されたプローブを、マウスボタン２のクリックによって累算するのに使わ れる。標準のテキスト編集機能はＰｒｏｂｅｓＥｄｉｔウィンドウの範囲内で利 用できる。ユーザはこのウィンドウで選択されたプローブを累算しく例えば、１ ５５参照）、続いてそれらをファイルに保存できる（そのファイルは”ｐｒｂ” １５６というファイル拡張子を伴うプリバレージョン配列の名称を持つか、また はユーザによって選ばれた別のファイル名になるかも知れない）。このファイル の例を図２６＾に示す。

ｉｖ、ｍ＊曳門力 この発明の本実施例においても、どちらのモデルをユーザが選択したかによって 一般１ごｔｅｓｔ、　ｏｕｔ”及び”ｔｅｓｔｌ、　ｏｕｔ”と命名された２つ の出力ファイルが創られる。

最初のファイル”ｔｅｓｔ、ｏｕじは、ミスマツチモデル及びＨサイトモデルの 両方で創られる。このファイルは、Ｍｉ　ｔｓｕｈａｓｈｉプローブ選択ダイア グラム（ＭＰＳＤ）のテクスヂュア表示である。それによって、プローブは位置 、長さ、デルタＴｍ、　５ｃｒｅｅｎｓＮ及び実際のプローブ配列（即ち、ヌク レオチド）にまで細分化される。ミスマツチモデルによって創られたこのファイ ルの例を図４０に、およびＦ（サイトモデルによって創られた例を図４４ａに示 す。第二のファイル”ｔｅｓｔＬ　ｏｕｔ″は、Ｈサイトモデルのみで創られる 。このファイルは、ＰｒｏｂｅＩｎｆｏ及びＭａｔｃＭｎｆｏウィンドウのテク スヂュア表示であって、全てのハイブリダイゼーションをそれらの遺伝子座、ス タート位置、融解温度、及び可能なその他のハイブリダイゼーションの形で表す 。

このファイルの一部分の例（Ｈサイトモデルによって創られた合計で１９０ペー ジの内から１０ページ分）を図４４ｂに示す。

２　えスズ１ナモデルプｐ−久之ムの説明ａ、　概説 この発明においては、ハイブリダイゼーション強度モデルの一つをミスマツチモ デルと呼ぶ。このモデルの基本的操作には、先に定義したが以下にさらに詳細に 記載するように、ハツシングと連続シードろ適法が包含される。ミスマツチモデ ルの要素は、ヌクレオチド配列間での正確な及び不正確なマツチングを行わせる ための高速処理であり、ミツハシプローブ選択ダイアグラム（ＭＰＳＤ）を支援 する。

この発明に含まれるミスマツチモデルの現在の実行には多くのモジュールがあり 、その内の最も重要なものを図２７のフローチャートに及びさらに詳細には図２ ８から３８に示す。図２７のフローチャートに示されている主要なｋ　ｄｉｆｆ モジュールは、ミスマンデモデルの包括的な制御を規定する構造プログラムであ り、異なった諸機能を実行する種々のサブモジュールが要求される。

ｂ６　人力 このモデルに対するユーザ選択入力変数は、最小プローブ長７６（一般には、１ ８から３０である）及びミスマツチの最大数７７（一般には、ｌから５である） である。

これらの入力は、主オリゴプローブ設計ステーション・ダイアログウィンドウで （図２ＩＣ）ユーザにより入力されるものである。

Ｃ処理（プロセシング） ｉ、　３ｄｉｆｆプログラム この方法により実施される処理の前に定義しなければならないいくつかの技術用 語を説明する。ハツシュテーブルは本質的にデータの配列即ちデータ表である。

関連リストは、関連したエントリ（登録）の鎖であり且つ他のエントリ構造に対 するポインタを包含する古典的データ構造である。関連リスト中のエントリは、 配列中に含まれる要素にあることだが、メモリに順番に記憶しなければならない ことはない。通常、そのリストと関連するリストに対するポインタがあり、これ は、しばしば最初に設定されてリストのスタート点を指示する。リストに対する ポインタは、リスト中のエントリを通して順番に配列するために有用である。空 白ポインタ（即ち、ゼロの値を持つポインタ）はリストの終了点を定めるの用い られる。

図２７および２８のフローチャートが示すように、一般プロセスの各ステップ及 びこのモデルの実行機能は次のように要約できるニステップｌ　先ず、ハツシュ 表及び照会（ｑｕｅｒｙ）　（図２７、ｌ＼ラッシングジュール２２２）の関連 リストを作る。

ステップ２：次に、検索に使えるＧｅｎＢａｎｋエントリ（図２７、アセンブリ モジュール２３０）のある間にニ ステップ２ａ：ユーザ指定の長さを持つ現在のＧｅｎＢａｎｋエントリ（登録） 配列（図２７．５ｅｑｌｏａｄモジユール　２３２）　、またはユーザによって 選ばれたリストから現在の配列（図２７、リードｌモジュール　２３４）を読み とる。

ステップ２ｂ：最初の位置（即ち、ヌクレオチド）から最後の位置（即ち、ヌク レオチド）までの配列の各位置に対する現在の配列に関して（ループ繰り返しで １回位置の数を増やすこと）（図２７、ｑ　ｃｏｌｏｕｒモジュール　２４２） 。

ステップ２Ｃ１変数ｄｎａ　ｈａｓｈを現在の配列の現在の位置の／１ツシュに 等しく設定する。（図２７、ｑ−ｃｏｌｏｕｒモジュール　２４２）。

ステップ２ｄ：　ｄｎａ　ｈａｓｈに関連したリストの終了点ではない間（図２ ７、（ＬＣＯＩｏｕｒモジュール　２４２）。

ステップ２ｅ：関連リストのｄｎａ　ｈａｓｈの現在の位置に等しく　ｑｕｅｒ ｙ　ＩＸ）Ｓを設定する（図２７、ｑ−ｃｏｌｏｕｒモジュール　２４２）そし てステップ２ｆ：座標（ｑｕｅｒｙ　ｐｏｓ、　ｄｎａ　ｐｏｓ）でヒツト（的 中）を拡張する（図２７、ｈｉｔ　ｅｘｔモジュール　２４４）。

ステップ２ｇ：拡張された現在のヒツトにｋ　ｍｉｓｍａｔｃｈが存在するなら （図２７、ｃｏｌ、ｏｕｒモジュール　２４６）　、それからステップ２ｈ、現 在のヒツトを印刷しく図２７、ｑ　ｃｏｌｏｕｒモジュール　２４２）、そして ステップ２から繰り返す。

説明されたように、３つの基本的ループ即ち繰り返し処理があり、諸機能は変数 、例えばＧｅｎＢａｎｋｎｏの区画側−５ｅｃｔｉｏｎ　ｅｎｄ−が到達したが どうか（第一”ＴＵＲＴＬＥ’ループ、ステップ２）、現在のＤＮＡエントリの 終端が到達したかどうか（”ＦＯＲ”ループ、ステップ２ｂ）、及びｄｎａ　ｈ ａｓｈ関連リストの終端が到達したかどうか（第二の“Ｖ’ＨＩＬＥ＃ループ、 ステップ２ｄ）に基づいて実行される。′ヒツト２は、現在の拡張ヒツトにｋ　 ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓがあれば印刷されるだけである。

図２８から３８では、この発明の現在の実施例の各々についての機能が説明され 、それらの全ては上記記述に一般化され且つ要約された。主要な”ｋ　ｄｉｆｆ ”モジュールの概略を説明する図２８により、このモジュールは、本来、プログ ラム編成と方向のモジュールであって、加えて、ルーチンの”ハウスキーピング 機能、例えば、変数及びハツシュテーブルを定義し、ユーザ選択の遺伝子ファイ ルがオープンがどうかをチェックし２５２、必要な識別情報をＧｅｎＢａｎｋか ら抽出し２５３、そしてユーザ入力の有効化２５４を実行する、ことが示されて いる。このモジュールはまた遺伝子配列に対してメモリの１回割当てを実行し、 ヒツト情報、ハツシング、ハイブリダイゼーション及び頻度長プロフィール（ｆ ｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ）に関してメモリを割当て 、そしてディスプレイに出力する２５５　＆　２５６゜”ｋ　ｄｉｆｆ”モジュ ールはまた、ハツシング機能の準備に当たり、ハツシュテーブル、それと関連し たハツシングリスト及び他の種々の変数２５７を初期化即ち“ゼロアウト“する 。加えて、このモジュールは、ハツシュ表２５８を作成し、配列を抽出しそして 配列長２５９を見つける。

“ｋ　ｄｉｆｆ”モジュールによって実行されるもっとも重要な機能の一つは、 シード（即ち、核（カーネル）　−ｋｅｒｎｅｌ−またはｋ　ｔｕｐｌｅ）サイ ズを決めることである。このことは、変数ｋ　ｔｕｐｌｅを（ｗｉｎ　ｐｒｏｂ ｅ　ｌｅｎｇｔ、ｈ　−ｍａｘ　１Ｉｌｉｓ＋＋＋ａｔｃｈ　＃）／（ｍａｘ　 ｍｉｓ高≠狽■ ｈ＋＃Ｎ、）に等しく設定することにより実行される（図２８．２６５）。次に 、もし上述の処理の剰余がゼロに等しくなければ２６６、変数ｋ　ｔｕｐｌｅの 値を１つだけ増やす２６７゜得られた値はシードのサイズである。次いで、その モジュールは照会２６８を読みとりそして同定の目的のためにＬＯＣＬＩＳ　（ 座）名２６９をコピーする（用語塵の定義は明細書中ですでに与えられている） 。

”３ｄｉｆｆ”モジュール（図２８）はまた、”アセンブリ”モジュール２６０ を呼出し結果をファイル２６１ａに書き込み、その結果２６１ｂを作図しく下に 議論）、ヘアピン特性（即ち、塩基対の数及び最悪ヘアピンの長さ）及び各候補 プローブ２６３に対する融解温度（Ｔｍ）を計算し、そしてその結果をファイル ２６４に保存する。

スクリーン図形は、その結果の値を画素に変換し、画素配列をファイルし、そし て画素配列にバイナリ検索を実行することによって作図される２６１ｂ、次ぎに 、プローブ位置当たりの画素数が与えられ且つユーザにとってどの機能（即ち、 ３つのミスマツチ・マツチ数−ｍｉｓ＆Ｉｔｃｈ　ａ＋ａｔｃｈ　ｎｕｍｂｅｒ ｓ）に興味があるがが与えられれば、そのプログラムによって（ｐｉｘｅｌｓＰ ｅｒＰｏｓｉｔｉｏｎＮ−１）の値でその値が補間され、そして図形描画のため 画素値の配列が計算される。これらの値は続いてＭＰＳＤで作図される。

”ハツシング（ｈａｓｈｉｎｇ）　”モジュール（図２９）は照会のハツシング を実行する。

換言すれば、それはハツシュテーブル及び同じハツシュと関連した照会位置のリ ストを作成する。変数ｈａｓｈ　ｔａｂｌｅ　［ｉ］は照会でのハツシュｌの最 初の発生位置と等しい。もしｉが照会に現れないなら、ｈａｓｈ　ｔａｂｌｅ　 ［ｉ］はゼロに設定される。

”ｔｒａｎ”モジュール（図３０）は”ｈａｓｈｉｎｇ”モジュール２７１に呼 び込まれ、ｋ　ｔｕｐｌｅ（核またはシード）サイズの配列のハツシングを実行 する。もし、ｋ　ｔｕｐｌｅが存在すれば（即ち、その長さがゼロより大きい） 、変数ｕｎｓはｕｎｓ”ＡＬＦ＋ｐ２９１に等しく設定される。変数ｐは、被検 ヌクレオチドを表す”ｌｅｊｄｉｇ”モジュール（図３１）によって戻された数 字を表す。ＡＬＦはこの実行においで設定される常数であり４に等しい。次いで 、照会ポインタは増やされ、一方、ｋ−ｔｕｐｌｅ　（そのシード）のサイズは 減らされる２９２゜続いてごｔｒａｎ”モジュールは変数ｃｕｒｒｅｎｔ　ｈａ ｓｈ　２９３を−ｓｈｉｎｇ”モジュールに戻す（図２９）。

”ｌｅｔ−ｄｉｇ”モジュール（図３１）は、”ｔｒａｎ”モジュール２９１に 呼ばれ、プログラム処理がより容易になるよう、ＧｅｎＢａｎｋでキャラクタ” ＾”、ゴ、”Ｕ”、Ｇ″及び”Ｃ”で表されるヌクレオチドとユーザ照会を数字 に変換する。このモジュールは、”ａ”と”＾”を０”に３０１、”ｔ”、ゴ、 ”Ｕ”及び”Ｕ”を“ドに３０２、”ｇ”と”Ｇ”を”２”に３０３及び”Ｃ” と”Ｃ”を”３”に変換する３０５゜もし変換されるキャラクタが上記で記録さ れたそれらの何れとも一致しなければ、モジュールは”−１”　３０５に戻る。

”ｈａｓｈｉｎｇ”モジュール（図２９）は、それから、移動ウィンドウでハツ シュを更新する”ｕｐｄａ　ｔｅ”モジュール２７２（図３２）を呼び込む（即 ち、それは旧ハツシュを”ｌ”だけシフトして新ハツシュを形成する）。ｐｏｗ ｅｒＪで分割されたｏｌｄ　ｈａｓｈが計算され３１１（モジュール操作）、剰 余にＡＬＦ３１２（即ち、４）を掛け、次いで、ヌクレオチドを表している数字 をその結果に加える３１３゜次いで、”ｕｐｄａｔｅ”モジュールはその結果３ １４を”ｈａｓｈｉｎｇ”モジュール（図２９）に戻す。

もし現在のハツシュが照会で既に発生しているなら、そのプログラムは現在のハ ツシュ２７３に関する関連リストの終端を探索し、現在のハツシュ２７３に関す る関連リストの終端を記録する。もし現在のハツシュが照会で未だ発生していな いなら、プログラムはそのハツシュをハツシュテーブルに入れる２７５゜得られ たハツシュテーブル及び関連リストは、次いで”３ｄｉｆｆ”モジュール（図２ ８）　２５６に戻される。

ａｓｓｅｍｂｌｙ”モジュール（図３３）はＧｅｎＢａｎｋから配列を抽出し、 ヒツト配置及び拡張機能を実行する。このモジュールは、もしユーザがマツチを 配置するためにデータベースを使えるよう既に選択しているなら、”３ｄｉｆｆ ’モジユール（図２８）２６０に呼ばれる。”ａｓｓｅｍｂｌｙ”モジュール（ 図３３）の出力によって、ユーザは、検索されたデータベースの区域にはヒツト 数Ｈ３２３で概略長さ５３２２のエントリ数Ｅ　３２１が含まれていることを知 らされる。さらにプログラムによってユーザは、考慮された１−ｔｕｐｌｅｓの 数はＴに等しいことを知る。エントリヘッドラインも印刷される３２６゜　”５ ｅｑｌｏａｄ”モジュール（図３４）は、照会ハツシュテーブル及び関連リスト が”ｈａｓｈｉｎｇ”モジュール（図２９）によって作成されてしまうと”ｋ　 ｄｉｆｆ’″モジュール（図２８）　２５９に呼ばれる。”５ｅｑｌｏａｄ”モ ジュール（図３４）は、ＧｅｎＢａｎｋファイルの終端が到達したかどうかを調 べるためにチェックし３２７、もしまだなら、ヘッドライン３２８におけるＬＯ ＣＵＳで記録が見つかるまで探索する。次に、同定の目的のためＬＯＣＵＳ名が 抽出され３２９、そしてプログラムは記録の中に０ＲＩＧＩＮフイールドを検索 する。次いで、プログラムはＧｅｎＢａｎｋから現在の配列３３３を抽出し、各 配列に関し２つのパスを実行する。第一は、配列の長さを決め３３２、そして各 配列にメモリを割当てることであり３３３、第二のパスは、割り当てられたメモ リにその配列を読取ることである３３４゜抽出されている配列は、ＤＮＡヌクレ オチドかプロティン・ヌクレオチドを含んでいるので、”５ｅｑｌｏａｄ″モジ ユールはキャラクタ”Ａ”、ゴ、”Ｕ゛、”Ｇ”及び”Ｃ”を認識することがで きる。塩基”Ａ”、”Ｔ”、”Ｇ”及び′Ｃ”はＤＮＡ配列に使われ、一方、塩 基１Ａ″、”Ｕ”、”Ｇ”及び”Ｃ”はＲＮＡおよび！ＤＲＮＡの配列に使用さ れる。抽出された配列は、次いでその配列に含まれるヌクレオチドの種類に応じ て配置され３３５、処理が繰り返される。配列の終端が到着すると、”５ｅｑｌ ｏａｄ“モジュールは配列の長さ３３６を”ｋ　ｄｉｆｆ”モジュール（図２８ ）に戻す。

もしユーザがマツチを配置するためにデータベースというよりはむしろ１つ以上 のファイルを使えるよう既に選択しているなら、”５ｅｑｌｏａｄ”モジュール （図３４）よりむしろ”ｒｅａｄ　ｌ”モジュール（図３５）がｋ　ｄｉｆｆ” モジュール（図２８）に呼ばれる。

”ｒｅａｄ　ｌ”モジュール（図３５）はユーザ指定の照会ファイル３４１から 配列を読取り、メモリを割り当てる３４２゜このモジュールはまた照会の長さを 決め３４３、配列同定情報を抽出し３４４、配列の長さを決め３４５、”ｌｅｔ −ｄｉｇ”モジュール（図３１）を呼び出すことにより各ヌクレオチドを数字に 変換し３４６、”ｄｉｇｊｅｔ”モジュール（図３６）を呼び出すことにより照 会ハツシュテーブルを作成し３４７、全てが読み込まれたらファイル３４８を閉 じる。

まず最初に、”ｒｅａｄ　ｌ”モジュール（図３５）は照会３４２にスペースを 割り当てる。

これを実行するため、”ｃｋａｌｌｏｃ”モジュール（図３５）が３４２で呼ば れる。このモジュールは、スペースを割当て、そしてこの割当が成功したかどう か（即ち、十分なメモリがあるか、またはプログラムがメモリを越えてランして いないか）をチェックする。スペース割当後、”ｒｅａｄ　１”モジュール（図 ３５）は、ユーザ指定のファイル３４９をオープンしく”ｃｋｏｐｅｎ”モジュ ール（図３５）は３４９で呼ばれ照会ファイルが首尾よくオープンできることを 保証する３４９）　、照会の長さを決め３４３、ヘッドラインのＬＯＣＵＳで記 録を位置指定し、同定の目的のためにＬＯＣＵＳ名３４４を抽出し、０ＲＩＧＩ Ｎフイールドを記録に位置指定し、それからファイル３４１から照会配列を読み とる。次ぎに、配列の長さが決められ３４５、メモリが配列に割り当てられ３４ ２、その配列が照会ファイル３５０に読み取られる。もし文字列が予め見つかっ ていれば、処理は３４４に戻る。そうでなければ、照会ファイルの各キャラクタ がメモリに読み取られる３５０゜ キャラクタは、ｌｅｔ　ｄｉｇ”モジュール（図３１）を使って、有効数字が見 つけられるまで数字３４６に変換され、続いて数字をキャラクタ”Ａ”３７１、 ゴ３７１、”Ｇ”３７３、”Ｃ”３７４及びデフォルトとしてＸ”３７５によっ て表されるヌクレオチドに変換する”ｄｉｇ、−１ｅｔ“モジュール（図３６） を使って、照会を包含するハツシュテーブルが設定される。もしファイルの終端 が到達していないなら、処理は３４４に戻る。もし、していれば、ファイルは閉 じられ３４８、照会は３４７で”ｒｅａｄ　ｌ”モジュール（図３５）に戻る。

’ｑ−ｃｏ１．ｏｕｒ”モジュール、図２７（図３３．３２５）は、現在の配列 がＧｅｎＢａｎｋから抽出されてしまった後ごａｓｓｅｍｂｌｙ”モジュール（ 図３３）に呼ばれる。”（Ｌｃｏｌｏｕｒ”モジュール（図３７）は、それが照 会とデータベースまたはファイル配列間の比較を行うということにおいて、ミス マツチモデルの中心的機能を果たしている。もしモジュールによって、長い（即 ち、ｌｌ１ｉｎ　ｂｉｔ−１ｅｎｇｔｈより大きい）拡張ヒツトの存在が見いだ されるなら、それは”ｌ“を”ａｓｓｅｍｂｌｙ”モジュール（図３４）に戻す 。さもなければ、”ｑ−ｃｏｌｏｕｒ”モジュール（図３７）は”０′に戻る。

”ｑ　ｃｏｌｏｕｒ”モジュール（図３７）では、全てのＤＮＡの位置は次の方 法で解析される。

先ず、全部のＤＮＡ配列は、各位置がゼロに等しいかどうか（即ち、それは空（ カラ）であるか、または配列が完成しているかどうか）を調査するため解析され る３９１０もしゼロに等しくなければ３９３、”（Ｌｃｏｌｏｕｒ”モジュール （図４０）は、ｋ　ｔｕｐｌｅｓのハツシングを実行する上述の”廿ａ口”モジ ュール（図３０）を呼ぶ。”　ｔｒａｎ”モジュール（図３０）は他のモジュー ルを呼ぶ：それらのモジュールは、プログラムによる処理がより容易になるよう 、キャラクタで表されているヌクレオチドを数字に変換し、続いて移動ウィンド ウによってそのハツシュを更新する。もしその位置がゼロなら、ｏｌｄ　ｈａｓ ｈ　３９０のｌシフトの後、”ｕｐｄａｔｅ”モジュール（図３２）を呼ぶこと によりｃｕｒｒｅｎｔ　−ｈａｓｈの位置をｎｅｗ　ｈａｓに設定する。

もしｃｕｒｒｅｎｔ　ｈａｓｈ位置でのヌクレオチドがゼロに等しいなら、処理 は３９１に戻る。

そうでないなら、照会位置は、現在のハツシュ位置−１でのヌクレオチドと等し くなるよう設定される。次に、”ｑ−ｃｏｌｏｕｒ”モジュール（図３７）は、 ハツシュテーブルの中にｃｕｒｒｅｎｔ　ｈａｓｈを捜す。もし現在の３ｔｕｐ ｌｅが照会３９５と一致しなければ、次の３ｔｕｐｌｃが考慮され３９５、処理 は３９１に戻る。もし現在のｋ　ｔｕｐｌｅが照会と一致すれば、プログラムは 、”１１ｉｔ　ｅｘｔ−モジュール（図３８）を呼んでヒツトの（即ち、マツチ の）近辺３９６をチェックしてヒツトが弱いかどうかを決める。発明者は次のこ とを発見している。即ち、もしモジュール”ｈｉｊｅｘｔ“に関するコードが、 ＣＰＵのパラメータ転送機構２５９を利用する別のモジュールであるよりむしろ モジュール”ｑ−ｃｏｌｏｕｒ”内に含まれるなら、時間が節約できる。

”ｈｉｊｅｘｔ”モジュール（図３８）は、ヒツト近傍の現在の照会位置を決め ４２１１ヒツト近傍にある現在のＤＮＡの位置を決め４２２、そして不一致位置 （即ち、ｃｉｓｍａｔｃｈｌｏｃａｔｉｏｎ　ａｈｅａｄ　４２３．　ｍｉｓｍ ａｔｃｈ　１ｏｃａｔｉｏｎ−ｂｅｈｉｎｄ　４２３及び核マツチ配置）のリス トを作成する。もしもヒツトが弱いなら４２４、”ｈｉｔ　ｅｘｔ”モジュール （図３８）は”０”から”（Ｌｃｏｌｏｕｒ”モジュール（図３７）に戻る。も しヒツトが４２５を包含する機会があれば、そのモジュールはｌ″から“ｑ　ｃ ｏｌｏｕｒ“モジュール（図３７）に戻る。もしｍｉｓｍａｔｃｈ−１ｏｃａｔ ｉｏｎ−ａｈｅａｄ　−ｍｉｓｍａｔｃｈ　１ｏｃａｔｉｏｎ　ｂｅｈｉｎｄが ｍ１ｎ−ｂｉｔ　ｌｅｎｇｔ■謔闡■ きいなら、ヒツトは包含する機会があり、それ故、弱いとは考えられない。もし そうでないなら、短いヒツトで弱すぎる。

もし”ｈｉｔ　ｅｘｔ”モジュール（図３８）が”（Ｌｃｏｌｏｕｒ”モジュー ル（図３７）にヒツトは弱くないと通知すれば、“ｑ　ｃｏｌｏｕｒ”モジュー ルは、現在のヒツトは十分長いかどうかを３９８、”ｃｏｌｏｕｒ”モジュール Ｃ図３９）を呼び出して決める。’ｃｏｌｏｕｒ’モジュール（図３９）は、ｐ ｏｓ−ｑｕｅｒｙで開始し且つｍｉｓｍａｔｃｈ　１ｏｃａｔｉｏｎ　ａｈｅａ ｄとｍｉｓｍａｔｃｈｌｏｃａｔｉｏｎ　ｂｅｈｉｎｄで記述されたヒツトのデ ータによるｑｕｅｒｙ　ｃｏｌｏｕｒの変更を実行する。このモジュールに使用 される変数が定義された後、変数ｉｓｗ−ｐｒｉｎｔ　（これはヒツト長を表示 するスイッチである）はゼロに初期化される４３０゜ｃｕｒｊｅｎｇｔｈは、次 いで拡張ヒツトの長さに等しく設定される４３１（ｍｉｓｍａｔｃｈ−１ｏｃａ ｔｉｏｎ　ｂｅｈｉｎｄ　［ｉ］＋　ｍｉｓｍａｔｃｈ　１ｏｃａｔｉｏｎ　ａ ｈｅａｄ　［ｊｌ　−１）。次ぎに、もしｃｕｒ−１ｅｎｇｔｈがｍｉｎ　ｈｉ ｔ−１ｅｎｇｈより大きいかまたは等しいなら４３２（即ち、最小と考えられる プローブサイズ）、ヒツトは長いと考えられ、そしてｉｓｖ　ｐｒｉｎｔは２に 等（バ設定される４３３゜ｉｓｖ　ｐｒｉｎｔの値は、次いで”ｑ　ｃｏｌｏｕ ｒ”モジュール（図３７）に戻される４３４゜もし拡張ヒツトの長さがｍｉｎ　 ｈｉｔ　ｌｅｎｇｔｈより長ければ、ヒツトは長いと考えられる３９９゜さもな くば、ヒツトは短いと考えられる。もしヒツトが短ければ、現在のヒツトに対し てはこれ以上何も実行されず、モジュールは再開する。一方、もしヒツトが長い と考えられれば３９９ごｑ−ｃｏｌｏｕｒ”モジュール（図３７）は現在の拡張 ヒツトを印刷する４００゜現在の拡張ヒツトはＡＳＣＩＩで印刷され、バイナリ ファイルで印刷され、またはメモリファイルに印刷される。次いで、“ｑ−ｃｏ ｌ、ｏｕｒ”モジュール（図３７）は、その関連リストの終端か到達するまで繰 り返す。

ｄ、　出力 ３ｄｉｆｆプログラムの出力は、拡張ヒツトの数とｋ　ｍｉｓｍａｔｃｈのヒツ ト位置（図４０参照）を包含するバイナリファイルであるか、または出力がファ イルに書き込まれないでメモリに保持されるかのどちらでもよい。より詳細には セクション１−（ｄ）（ｉｖ）参照。

３、　且ティ上土デ四りグ旦グヲムの脱灰ａ、概説 この発明では、第二のハイブリダイゼーション強度モデルはＨサイトモデルと呼 ばれる（このモデルのユーザ選択については図２１参照）。ト■サイトモデルに 用いられる式は、融解温度Ｔｍはプローブ長とパーセントで表したＧＣ含量の関 数であるという事実を表現している。この基本式は、ミスマツチの存在を説明で きるようこの発明で改善された。ミスマツチの各パーセントは、平均で１，２５ ℃だけ融解温度をドげる（ＡＴの不一致で２℃及びＧＣの不一致で４℃）。

加えて、この発明の実行は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに関していくつかの予 備的処理を履行してｃＤＮＡ配列を種類分けし選択する。これは各ＧｅｎＢａｎ ｋ記録にあるキーワード（この場合ＣＤ５）を置いて行われる。

この発明に包含されるＨサイトモデルの本実施態様には多くのモジュールがある 。Ｈサイトモデルに含まれる処理の各々のステップは以降により十分に説明され ており、詳細フローチャートが添付されている。

ｂ、　入力 １）Ｈサイトモデルについて２つの基本的ユーザ選択入力がある（図２ＩＣ参照 ）二設計中のプローブに対する融解温度Ｔｍ　２２　（即ち、ユーザがシミュレ ートすることを望んでいる特定の実験または条件に対応する融解温度）：及び２ ）核形成しきい値２３（即ち、核形成部位を構成する塩基対の数）。ユーザはま た下記項目を選択する必要がある　ｌ）プローブが設計されようとしている標的 種１１の遺伝子配列（ＤＮＡＳｍＲＮ＾またはｃＤＮＡ）　＋　２）それにより ハイブリダイゼーションが計算される全配列のプリバレージョン１２　；　３） プローブ出カフアイル１３゜下に述べるようにプリバレージョン・ファイルは最 も重要である。

ｃ、Ｈサイトモデルのプログラムの構成この発明のＨサイトモデルのプログラム の実行は、多数のモジュールを包含する５つのファイルに分類される。主要ファ イルは、そのフンパイル解除バージョンにおいて発明者により”ｄｓ、　（ｐｐ ”と指定されている。このファイルは、全オリゴプローブ設計ステーションの発 明に対して包括的υＩ御を提供するものである。それは６つのセクションに分割 されている。セクション０は全体の変数を定義し且つ取り扱う。セクションｌは 、全般的な変数の規定と初期化（配列及びメモリブロックを含む）を制御する。

それはまたユーザ入力選択のためのバッファを読取りおよび書込み、多重バッフ ァを構築する。

セクション２は、種々の”５ｎｉｐｐｅｔ”変数を設定・初期化しく用語５ｎｉ ｐｐｅｔの完全な定義については下のセクションを参照）、塩基対の特質を９６ 塩基対の長さの表現に且つＡＳＣＩＩ塩基対鎖に転変換し、そして５ｎｊｐｐｅ ｔを比較するといった配列ファイル処理を行う。このセクションはまた配列のフ ォーマットファイルを読取り、塩基対を読取り、配列の同定情報（例えば、０Ｒ ＩＧｉＮ及びＬＯＣＬＩＳ）をチェック・抽出し、そして数字から始まる配列を 取り除くこともする。

セクション３は、ブリバレージョンファイルの取扱いを含んでいる。このセクシ ョンは上述のＰＲＰに関する前処理を行う。また、５ｎｉｐｐｅｔフアイルを合 併・区分けし、ＰＲＰファイルを作り、それを種類別に分け、その分類された５ ｎｉｐｐｅｔを出力する。次に、このセクションはＰＲＰファイル全体を通して 流れる。

セクション４は、Ｈサイトモデルの処理に関する本質的コードを包含する（以降 で議論される、詳細については図４１−４３参照）。ストリーム（流れ）が設定 され、次いでＲＩＢＩの比較力かイブリダイゼーションについて実行される（Ｒ ＩＢＩの探索技術の定義についてはファイル″ｒｉｂｉ、　ＣＩ）Ｉ）”参照） 。次ぎに、プローブが生成され、結合強度が融解温度に変換され、そしてハイブ リダイゼーション（ハイブリダイゼーション強度を含む）が計算・記憶される。

最後に、その他のＨサイトの計算が実行される。

セクション５は、診断ファイル及びユーザ・ファイルの出力（ｔｅｓｔ、　ｏｕ ｔ、　ｔｅｓｔｌ。

ｏｕ　ｔ、及びｔｅｓｔ２．　ｏｕｔファイル）を書式化し且つ提供することに 関連している。このセクションはまた作図機能（特に、ＭＰＳＤダイアグラム） を扱う。加えて、このセクションはＨサイトモデルの候補プローブに関するヘア ピン特性を計算する。

”ｄｓ、　ｈ”と指定された第二のＨサイトモデルのファイルはデータ変数及び 構造を規定する。このファイルのセクションｌは遺伝子のデータ構造（メモリブ ロックと配列、およびファイル入出力を含む）に関連する。セクション２は、配 列、プローブ及びハイブリダイゼーションに関連して用いられる変数と構造を規 定する。セクション３は、プロトコル（すなわち、機能原型、作図等）に関連し た変数と構造を規定する。

ｆｕｎｃｄｏｃ、　ｔｘｔ’″と指定された三番目のＨサイトモデルのファイル は、このＨサイトモデルプログラムの実行に関する非常に詳細な文書を包含する 。多数の変数及び構造も規定される。プログラムの流れはこのファイルにはっき りと示される。

”ｒｉｂｉ浦”と指定された四番目のＨサイトモデルのファイルは配列の比較を 扱う。

’ｒｉｂｉ、　ｃｐｐ”と指定された四番目で且つ最後のＨサイトモデルのファ イルは、内部のＢ−Ｔｒｅｅの指標付けを実行する。赤−黒内部バイナリインデ ックス−Ｒｅｄ−ＢｌａｃｋＩｎｔｅｒｎａｌ　Ｂｉｎａｒｙ　Ｉｎｄｅｘ（Ｒ ＩＢＩ）−検索の定義は、この７フイルに見られる。定義には次の項目について も含まれる。概念適合セット、インデックス、バイナリ・ツリー、内部バイナリ インデックス、経路、及びレッド−ブラック・ツリー。実行ノートもこのファイ ルに含まれる。

比　処理 この発明のＨサイトモデルの実行は、３段階で行われる。先ず、発明では、配列 のデータベースから得られる全ての関連情報を包含するプリバレージョン（ＰＲ Ｐ）ファイルが作成される。これは上述の前処理段階である。次に、プログラム によって標的が準備される。最後に、発明によって、ＰＲＰファイルと標的配列 を利用してＭＰＳＤが計算されプローブが見つけ出される。

ｉ、　Ｍ　−プ１バレーシ　ンフ　イルの図４１、ステップ１．プログラムは、 先ず、メモリに読込むため配列のデータベースをオープンする４６１．４６２゜ ステップ２０次に、４６２で配列の塩基対が読込まれるにつれ、”５ｎｉｐｐｅ じが遺伝子座情報と共にディスクに記憶される４６３゜”５ｎｉｐｐｅｔ”はプ リバレージョン配列のうちの長さが固定された部分配列である。５ｎｉｐｐｅｔ の目的は、ユーザがプリバレージョン配列の小部分をその周辺の塩基対と共に検 討できるようにすることである。この発明の実行において５ｎｉｐｐｅｔは９６ 塩基対の長さである（配列の末端と先端近（にある５ｎｉｐｐｅｔを除く−ここ では塩基対が他の部分より少ないはずである）。５ｎｉｐｐｅｔの”起源”は４ ０の位置である。配列の先端近くでとられた５ｎｉｐｐｅｔについては、最初の ４０塩基対のいくつかは不確定である。配列の末端近くでとられた５ｎｉｐｐｅ ｔについては、最後の５５塩基対のいくつかは不確定である。

５ｎｉｐｐｅｔはプリバレージョンファイル（ＰＲＰ）に分類順に（４０位置で 始まる辞書式順序で）配列される。この発明では、用語”辞書式順序”は、アル ファベット、数字または英数字のような前もって選択された順序を意味する。空 間を保存するため、５ｎｉｐｐｅｔはプリバレージョン配列の４番目の位置毎に 取り出されるだけである。

ステップ３：　５ｎｉｐｐｅｔは、”スクリーン°を通過する配列について迅速 に検索できるよう合併分類されている４６４（以降で議論）。ステップ４：合併 されたファイルは５ｎｉｐｐｅｔの出所に関する識別名については決まっていな い４６５゜これはハイブリダイゼーションが起こる遺伝子座を同定するため行わ れる。

１１、標的の調製 図４２、ステップｌ：標的配列ファイルがオープンされ、メモリに読み込まれる ４７２゜標的ｍＲＮ＾の各位置に関しては、そのスタート位置で定義されたプロ ーブはその位置で始まる最も短い部分配列であって、そのハイブリダイゼーショ ン強度はユーザ指定の融解温度Ｔｍより大きい。代表的には、プローブは１８か ら５０の長さである。ステップ２：”スクリーン”について４つのファイルが作 成され４７３．４７４．４７５゜その各々はｌ塩基対づつシフトされるもので、 ５ｎｉｐ四ｔは４塩基対毎に取り出されるという事実に対応する。スクリーンは 、ユーザによって定義されたスクリーニングしきい値と等しい長さの標的ｍＲＮ Ａの部分配列である。次いで、スクリーンは索引が付けられ４７６、メモリに分 類される４７７゜ｆｉｔ、駅斗デニえ凶肚真 図４３、ステップ３．このステップはプロセスの心臓部である。ステップ３ａニ ブログラムは次の５項目を同期して流れ、それらを順番に検討する：　５ｎｉｐ ｐｅｔフアイル及びスクリーンの４リスト４８１−４８４゜ステップ３ｂ＝各５ ｎｉｐｐｅｔはスクリーンと比較される４８５゜ステップ３Ｃ：もし５ｎｉｐｐ ｅｔが一致しなければ、後のどちらかの流れが進められ４８６、そしてステップ ３ｂが繰り返される。もし５ｎｉｐｐｅｔが一致していれば、ステップ４が実行 される。

ステップ４：もし５ｎｉｐｐｅｔ及び一致スクリーンがステップ３ｂで見つかっ ていれば４８７．５ｎｉｐｐｅｔを含む配列とスクリーンを含む全てのプローブ との間の結合のハイブリダイゼーション強度は計算される（ステップ５参照）。

プローブを含む最初のマツチスクリーンに対してのみこれを行うことによって二 重計数は防がれる。各塩基対は検討され、数値による結合強度が指定される。Ａ Ｔ対は比較的低い融解温度Ｔｍを有するので、ＡＴ対はぼ対よりも低い結合強度 が指定されよう。この処理はさらに詳しく下のステップ５ｂで説明する。

ステップ５：　配列とそれを含む全てのプローブとの間のハイブリダイゼーショ ン強度は、ダイナミック・プログラミングプロセスを使って計算される。そのプ ロセスはつぎの通りである　ステップ５ａ：与えられたスクリーンを含むがその 他のスクリーンはどれも含まない第一プローブであって、より早い位置からスタ ートし、またその配列と一致する第一プローブの位置で始める。これは二重計数 は防ぐために行われる。２つの実行総和は維持される　ａ）結合強度（これは、 もし配列とプローブがすべての塩基対に対して現在の位置の右方向に正確に一致 するものとすれば生ずるであろうハイブリダイゼーション強度を表す）、及びｂ ）非結合強度（最大限に結合する領域の強度を表す）。ステップ５ｂ：各々の新 しい塩基対で、変数ｂｏｕｎｄＳｔｒｅｎｇｔｈは、もし配列とプローブが一致 し且つ一致した塩基対がＧＣなら７１だけ増やされ４８９、もしマツチした塩基 対がＡＴなら３０だけ増やし４９０（即ち、この数は最初の数７１の約４２．２ ５％である）、もしマツチがないなら７４．５だけ減らす４８８（即ち、この数 は最初の数７１より約５％大きい）。ステップ５Ｃ：　もし現在の結合強度（ｂ ｏｕｎｄＳｔｒｅｎｇｔｈ）が現在の非結合強度（ｕｎｂｏｕｎｄＳｔｒｅｎｇ ｔｈ）を越えるなら４９１（これは元はゼロに初期化された）、新しい結合領域 が見つかっており、ｕｎｂｏｕｎｄＳｔｒｅｎｇｔｈはｂｏｕｎｄＳｔｒｅｎｇ ｔｈに等しくなるよう設定される４９２゜ステップ５ｄ・もし現在のｂｏｕｎｄ ｓｔｒｅｎｇｔｈが負なら、ｂｏｕｎｄｓｔｒｅｎｇｔｈをゼロにリセットする 。ステップ５Ｃ０もし現在の位置がプローブの末端にあるなら、その結果（ハイ ブリダイゼーション強度）はそのプローブについて記録される。ステップ５ｆ： もし現在の位置がスクリーンを含む最後のプローブの末端にあるなら、プロセス は停止する。

ステップ６　記録は各候補プローブに関しマツチの数と融解温度、及び最良の２ ０候補の配置について優先順位付き待ち行列を使って保持される（ノゾブリダイ ゼーション強度の数値による順序の逆）４９４゜ステップ７、数値”スコア°は 、各プリバレージョン配列について、各一致に関する量のｅｘｐ（これはΣｅ− ７″Ｉ！：表現可能）を記録することにより保持され４９５、ここでＴｍは”完 全な”マツチ、プローブそれ自身に関する融解温度である。換言すれば、プロー ブはそれ自身の標的と”完全に”ハイブリダイズする。

ステップ８：ヘアピンは、先ず相補的なプローブを計算することにより計算され る。換言すれば、候補プローブにおける塩基の順序は逆にされ（ＣＴＡＴＡＧか らＧＡＴＡＴＣ）、モして相補的な塩基対は置換される（Ｔの代わりにＡ、Ａの 代わりにＴ、Ｃの代わりに０１及びＧの代わりに０１上記の例ではＧＡＴＡＴＣ からＣＴＡＴＡＧに変わる）。次ぎに、候補プローブに関する最大ヘアピン長を 表す変数は、その変数がヘアピンの距離を表すときは、ゼロに初期化される。各 オフセットにつき、元の候補プローブと今作成された相補性のプローブは互いに 整列させ、そして比較される。それから最長の一致を見つける。もしどれか２つ のマツチが等しい長さを有するなら、その時は最長のヘアピン距離（即ち一致し ているのを引き離す塩基対の数）をもつものを保存する。

ステップ９：プリバレージョン配列は次ぎに記憶され４９６、最高から最悪の等 級順に表示される４９７゜ステップ１０：次いで、結果として得られたｆｌの候 補プローブを含むＭＰＳＤがスクリーン上に表示される。ステップ１１：最良の ２０マツチもユーザの要望に応じ等級順に印刷または表示される４９７゜２５で 説明されている。Ｈサイトモデルによって作成された２つの出力ファイルの例を 図４４＾、４４Ｂに示す。

４、ミツハシプローブ　ラム　の１日 ミツハシプローブ選択ダイアグラム（ＭＰＳＤ）がＨサイトモデルプログラムに よって計算されると（上述の３項及び図４３参照）、このデータを画素フォーマ ットに変換し図形をプロットする必要がある。このプロセスの概要は図４５に示 されている。

先ず、プログラムは出力（ｘｙ）範囲を計算する５θ０゜次ぎに、対数目盛りに 変換される５０１０次いで、その値は補間され５０２、ビットマツプが作られる ５０３゜最後に、そのビットマツプはＭＰＳＤのフォーマットでスクリーン上に 表示される５０４（上記１（ｅ）（ｉ）にて議論）。ＭＰＳＤの例を図２３に示 す。

５、　Ｍａｔｃｈｌｎ垣グ不２五ケ処理の説明Ｐｒｏｂｅｌｎｆｏ　（プローブ 情報）およびＭａｔｃｈｌｎｆｏ　（７ッチ情報）ウィンドウは１（ｅ）（ｉｉ ）節においてきわめて詳細に議論されており、これらのウィンドウの例が図２４ に示されている。Ｍａｔｃｈｌｎｆｏのウィンドウ部分を作る際に含まれる処理 の概要は図４６のフローチャートに与えられている。先ず、ユーザがＭＰＳＤの カーソルを動かすと（ｋｌＰｓＤウィンドウを部分する垂直線のように見える） ５７０、プログラムはカーソル位置の下に示されている候補プローブを更新する ５２１゜次ぎに、候補プローブの位置に基づいて、そのプローブに関する配列５ ２２とヘアピン情報５２３を更新する。この更新された情報は、次いで、Ｍａｔ ｃｈＩｎｆｏウィンドウに示された更新−マツチリスト５２４上に表示される。

発明Φ効果 この発明の方法は、ｍＲＮＡの精製を必要とすることなく約５時間でｍＲＮＡの 特性を高速表示する方法を提供するものである。ｍＲＮＡ定量に関する従来法、 例えば、ノザンプロットでは、完了までに要する時間は７０時間を越えることか ら、本発明の方法はｍＲＮＡの分析時間を大幅に減少したものといえる。更に、 様々な種類の第一ヌクレオチド・プローブをマイクロタイタープレートの各ウェ ルに固定でき且つ単一種類の標識化第二ヌクレオチド・プローブを使用して同定 することが可能なため、好都合にも本発明によって多種多様のｍＲＮＡについて の同時定量法を提供することができる。

」二足実施例に示されているよ・うに、この発明の方法は高い信頼性と再現性を 備えている。それ故これらの方法は、ここに例示されたものに加え多くのｍＲＮ Ａの定量および分析に利用することができる。このように、この発明は種々の疾 病の病因を分析し、併せてその診断を支援する高速手段として用いることが可能 である。

そうした多くの方法は本発明のレビューによって当業者に明らかになろう。従っ て、この発明の範囲は添付の請求範囲を参照して決められるべきものであり、こ こに特に例示された方法に限定されるものではない。

配列表 （１）一般情報 （１）出願人・アキタヤ　タツオ（Ａｋｊｔａｙａ、　Ｔａｔｓｕｏ）ミツハシ 　マサト（Ｍｉｔ：５ｕｈａｓｈｉ、　Ｍａｓａｔｏ）クーパー　アラン（Ｃｏ ｏｐｅｒ、＾１ｌａｎ）（ｉｉ）発明の名称、メツセンジャーＲＮＡを測定する ための方法と試薬（ｉｉｉ）配列数ニア１１ （ｉｖ）連絡先： （＾）宛名：クノービ・マーチング・オルソン　アンド　ベアー（Ｂ）番地　、 ６２０　ニュ一本°−トヒ゛−チ　センタートライフ゛　１６階（Ｃ）市　：ニ ューポートビーチ （Ｄ）州　：カリフォルニア （Ｅ）国　；アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ　：　９２６６０ （ｖ）コンピュータ読取り可能形式 （Ａ）媒体：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣ互換（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−ＤＯ３ ／Ｉｔｓ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　 ＃１．　Ｏ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５（ｖｌ）現行出願データ （八）出願番号 （Ｂ）出願日 （Ｃ）分類 （ｖｉｉｉ）代理人７／事務所情報 （＾）名前：アルトマン、ダニエル　イー（Ｂ）登録番号：　３４．１１５ （Ｃ）整理番号：　）ＩＩＴＡｃＨｌ、　００６ＣＰ２（ｉｘ）通信情報 （＾）？１話番号：　７１４−７６０−０４０４（Ｂ）ファクシミリ番号：　７ １４−７６０−９５０２（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１に関する情報（ｉ）配 列の特徴 （Ａ）長さ：２２ （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数・一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子タイプ：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル ・Ｎｏ （ｉｖ）アンチ・センス、Ｎｏ （ｖｉ）オリジナル出所 （＾）組織：　Ｇｓ　ｍＲＮＡヌクレオチド・プローブ（ｘｉ）配列の説明：　 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ＩＴＴＣＡＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴ　ＴＧ　２ ２（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に関する情報（ｉ）配列の特徴 （＾）長さ：２２ （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数、一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （ｉｆ）分子タイプ：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル ：Ｎ０ （ｉｖ）アンチ・センス＝ＮＯ （ｖｉ）オリジナル出所 （Ａ）組織体：　Ｇ１−２　ｍＲＮＡヌクレオチド・プローブ（Ｘｌ）配列の説 明：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２＾ＴＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＧＧ 　２２（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・３に関する情報（１）配列の特徴 （Ａ）長さ＝２２ （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎮 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｆ）分子タイプ：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル ：Ｎ０ （ｉｖ）アンチ・センス：Ｎｏ （ｖｌ）オリジナル出所 （Ａ）組織体：ＧプロティンセンスＰＣＲプライマー（ｘｉ）配列の説明：　Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３ＡＧＣ＾ＣＣＡＴＴＧ　ＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴ　ＧＡ（２ ）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４に関する情報（ｉ）配列の特徴 （＾）長さ：°２２ （Ｂ）種類・核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎮 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子タイプ：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル ：Ｎ０ （ｉｖ）アンチ・センス：　ＹＥＳ （ｖｉ）オリジナル出所 （Ａ）組織体：ＧプロティンアンチセンスＰＣＲプライマー（ｘｌ）配列の説明 ：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４ＣＴＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＣＡＴＣＡＡＡ　Ｃ＾ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋５に関する情報（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２２ （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｆｉ）分子タイプ：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティヵル 二Ｎ。

（ｉｖ）アンチ・センス二Ｎ。

（ｖｉ）オリジナル出所 （Ａ）組織体：サブスタンスＰリセブターｍＲＮ＾プローブ（ｘｉ）　配列Ｑ） 説明：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５（ｉ）配列の特徴 ２２　（Ａ）長さ：２２ （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子タイプ：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（山）ハイポセティヵル：Ｎ 。

（ｉｖ）アンチ・センス・Ｎｏ （ｖｉ）オリジナル出所 （＾）組織体：ヒトＢ２リセプタ−ｒｎＲＮ＾プローブ（ｘｉ）　配列ノ説明： 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋６ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４Ａ ＦＩＧ、４Ｃ Ｌｏｇ（ｍＲＮＡ　２度［ｇ＃ａｌｌ］）Ｆｉｇ、５ Ｌｏｇ（ｍＲＮＡ　濃度［ｇ／ｗｅｌｌコ）Ｆｉｇ、６ プローブ ＝１度五−−−刀り徂Ｌｊ＋−利、ＬｊＭ九−Ｆ工Ｇ、８ Ｌｏｇ（ｍＲＮ＾濃度［ｇ／ｗｅｌｌｌ）Ｆｉｇ、９ ０９３７ＣＥＬＬＳ ｌ／ｌ＝八゛ナへジル＋ＰＡＲ １／２＝Ａ’ナジル＋Ｐ Ｒ＝　ＲＮａｓｉｎ Ｐ　＝７０Ｄテイナーセ゛Ｋ Ｆｒ　＝ＦａｓｔＴｒａｃｋ　（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）Ｆ工Ｇ、１０ ンーカー Ｇｏ　Ｇｓ　Ｇ１−３　Ｇ１−２　０ｉ−１（０，６に、ｂ）Ｇｊ−１＋＋　＋ 　＋＋　−＋　＋＋　＋　＋＋　＋　＋＋　＋＋＋Ｇ１−２　４　や　＋＋　＋ 　やや　、。　＋＋　。。や　や。や　ヤヤヤＧ１−３　＋＋や　や＋＋　や＋ ＋　や　、＋４　や　やや　ややや　や。や　やヤヤＧｓ　ややや　＋や＋　＋ ＋＋　＋　や。　。　やや　。やや　ややや　や。やＦ工Ｇ、　１２ Ｇｏ　Ｇｓ　Ｇ１−３　０ｉ−２Ｇｉ−ＩＰＫＩ　ＰＫＩ　ＰＫＩ　ＰＫＩ　Ｐ ＫＩＦＩＧ、１３ ＩＭ９　ＪｕｒｋａＬ ＦＩＧ、１４ ＦＩＧ、　１５ ＦＩＧ、１６ １０　”３ｘｌＯ−５１０−４３ｘｌＯ−４１０−３Ｙｏｙｏ−１希釈度 ＦＩＧ、１７ （ｎ＝６）　（ｎ＝６）　（ｎ＝６）　（ｎ＝６）　（ｎ＝６）５連の個別実験 Ｆ工Ｇ、１８ Ｆｉｇ、１９ Ｆ！ｌＧ、２０ Ｆｌ［；−２２Ａ ↓。

士 ＦＩＧ；、　２５ ＦＩＧ、２６Ｂ ＦＩＧ；、２’ 「ｌ（，２８八 ＦＩＧ；、２９ ＦＩＧ；、３０ ＦＩＧ、” Ｆｌ（、３２ Ｆｌ（、３３＾ Ｆｌに−３３Ｂ ＦｆＧ−３４Ａ ＦＩＧ；、３４Ｂ ＦＩＧ、３５＾ ＦＩ［；−３卸 ＦＩＧ、］６ ＦＩ（、］７Ａ Ｆ　Ｉ　Ｇ’−〕７Ｂ ＦＩＧ−３ａ ＦＩＧ；、３９ ミヌマ・ソチ・モデル、１−２１．に−４Ｆｌに、＝１ Ｆｌ（、、’２ ＦＩＧ、４：１Ａ ＦＩ［；−４］日 ＦＩＧ−，３Ｃ Ｆｌ’に−＜ｘＤ すりゴブローブ股部１ステーション ミスマｌチ・モデル、１−２１．に−４部分ファイル　１９０ページのうちのｌ Ｏベージ３リゴブロープ設置１スヂー７３ン ト衾ス位置釦　ローカ２、位Ｋ　ＴＩＮ　ＩＩ−倉ス位ＩＩ　ＴＩＮＦｌに−４ ５ Ｆｌ（，４６ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｑ　１／４２　６ ８０７−４Ｂ （３１）優先権主張番号　９７４，４０９（３２）優先日　１９９２年１１月１ ２日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） Ｉ （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、ＣＡ、ＪＰ、ＫＲ，ＵＳ（７２）発明者　三橋　狩人 アメリカ合衆国、　９２７１４．カルフォルニ乙アーバイン　ブルックモント　 ８番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞からｍＲＮＡを精製する必要無しに試料中のｍＲＮＡを検出及び定量す るための高感度、定量的かつ迅速な測定法であって、（ａ）ｍＲＮＡに特有であ るポリヌクレオチド配列を同定すること、（ｂ）前記ｍＲＮＡに特有の前記配列 と相補的な第一の配列を含む第一ポリヌクレオチドを不溶性支持体に固定するこ と、（ｃ）前記特有の配列が前記第一ポリヌクレオチドとハイブリダイズし、そ れによって前記試料中に存在するｍＲＮＡを前記不溶性支持体に固定化する条件 下で前記試料を前記不溶性支持体と共にインキュベートすること、（ｄ）前記試 料の非固定化成分を前記不溶性支持体から洗浄すること、（ｅ）前記支持体上の ｍＲＮＡの量に関連して標識を前記支持体上に取り込ませる方法により前記支持 体上のｍＲＮＡを標識すること、および（ｆ）前記支持体上で固定された標識量 を測定すること、を含むことを特徴とする方法。 ２．請求項１においてステップ（ｅ）が、ｉ．標識を有しており、第一プローブ と相補的なｍＲＮＡの部分以外のｍＲＮＡの部分と相補的な標識プローブと前記 不溶性支持体とを、前記標識プローブが前記支持体状の前記ｍＲＮＡとハイブリ ダイズする条件下でインキュベートし、それによって前記不溶性支持体に前記ｍ ＲＮＡとハイブリダイズしている前記標識プローブ上の標識を固定化すること、 および ｉｉ．前記標識プローブの非固定化成分を前記不溶性支持体から洗浄することと を含む請求項１記載の方法。 ３．前記標識プローブがポリ−ｄ（Ｔ）である請求項２記載の方法。 ４．請求項１においてステップ（ｅ）が、前記支持体上のオリゴヌクレオチドに 核酸の染色剤で標識することを含む請求項１記載の方法。 ５．請求項４において前記核酸の染色剤が、臭化エチジウム、ｙｏｙｏ−１およ びｔｏｔｏ−１からなる群から選択される請求項１記載の方法。 ６．請求項２において前記標識が放射性核種である請求項１記載の方法。 ７．請求項２において前記標識がビオチンである請求項１記載の方法。 ８．請求項７においてステップ（ｆ）が、酵素標識ストレプトアビジンとのイン キュベーションと、前記不溶性支持体と結合した酵素量の測定とを含む請求項１ 記載の方法。 ９．請求項１において、前記ｍＲＮＡがβ受容体をコードし、前記第一ポリヌク レオチドがＳＥＱＩＤＮＯ：６の配列を含むこととを特徴とする請求項１記載の 方法。 １０．請求項１において、前記ｍＲＮＡがＧｓプロテインのαサブユニツトをコ ードし、前記第一ポリヌクレオチドがＳＥＱＩＤＮＯ：１，１４５−１４６，２ ０９−２１２，２６８−２８７，７０５および７０８からなる群から選択される 配列と相補的な配列を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。 １１．請求項１において、前記ｍＲＮＡがＧｉ−２プロテインをコードし、前記 第一ポリヌクレオチドがＳＥＱＩＤＮＯ：７０３，８０６，１４２，１４３，１ ８７−１９７および２３８−２５３からなる群から選択される配列と相補的な配 列を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。 １２．請求項１において、前記ｍＲＮＡがサプスタンスＰをコードし、前記第一 ポリヌクレオチドがＳＥＱＩＤＮＯ：５の配列を含むことを特徴とする請求項１ 記載の方法。 １３．請求項１において、前記ｍＲＮＡがＧｉ−３プロテインをコードし、前記 第一ポリヌクレオチドがＳＥＱＩＤＮＯ：７０４，７０７，１４４，１９８−２ ０８および２５４−２６７からなる群から選択される配列と相補的な配列を含む ことを特徴とする請求項１記載の方法。 １４．請求項１において、前記ｍＲＮＡがＧｉ−１プロテインをコードし、前記 第一ポリヌクレオチドがＳＥＱＩＤＮＯ：７０２，８０５，１４１および２２４ −２３７からなる群から選択される配列と相補的な配列を含むことを特徴とする 請求項１記載の方法。 １５．請求項１において、前記ｍＲＮＡがＧプロテインをコードし、前記第一ポ リヌクレオチドがＳＥＱＩＤＮＯ：７００，７０１，１３９，１４０，１４８− １５９，１６２−１７２，１７６−１８６および３−４からなる群から選択され る配列と相補的な配列を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。 １６．請求項１において、前記第一配列が前記ｍＲＮＡの前記特有配列とハイブ リダイズし、前記試料に存在する他のポリヌクレオチドとはハイブリダイズしな いことを特徴とする請求項１記載の測定法。 １７．請求項１において、前記試料が細胞溶解物である請求項１記載の方法。 １８．請求項２において、前記標識がそれから放射される光によって測定される こと、及びステップ（ｆ）が前記標識によって放射される光量を測定することを 含む請求項１記載の方法。 １９．請求項１８において、前記標識がビオチンを含むこと、及びステップ（ｆ ）がさらにアルカリ性ホスファターゼに結合したストレプトアビジンを前記不溶 性支持体に加えることを含む請求項１記載の方法。 ２０．請求項１８において、光量を測定するステップが、フイルム上に光量を記 録することと前記フイルムの露光量をデンシトメータ（濃度計）を用いて測定す ることとを含む請求項１記載の方法。 ２１．請求項１８が、さらにＡＴＴＯＰＨＯＳを加えること及び放射される蛍光 を蛍光光度計を用いて測定することを含む請求項１記載の方法。 ２２．請求項２１において、光量を測定するステップが、蛍光光度計を使用する ことを含む請求項１記載の方法。 ２３．請求項１において、ステップ（ａ）が、コンピュータプログラムを使用す ることを含む請求項１記載の方法。 ２４．請求項２３において、ステップ（ａ）が、Ｈサイトモデルを使用すること を含む請求項１記載の方法。 ２５．請求項２４において、Ｈサイトモデルを使用するヌクレオチド配列の同定 ステップが、 第一ポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチド配列に関して最低融解温度を 規定すること、 任意の核形成部位での塩基対の数に関して最小値を決める核形成のしきい値を規 定すること、 第一ポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチド配列の融解温度（Ｔｍ）を可 能なあらゆるハイブリダイゼーション点で測定すること、及び最高のＴｍ値を有 するヌクレオチド配列を選択することとを含む請求項１記載の方法。 ２６．請求項２５において、前記融解温度が次式で決定されることを含む請求項 １記載の測定法： Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ］）−０．６３％（ホルムアミド）＋ ０．４１（％（Ｇ＋Ｃ））−６００／Ｎ、ここでｌｏｇ［Ｎａ］はナトリウム濃 度の対数関数であり、０．０６３％（ホルムアミド）はホルムアミドの濃度、％ （Ｇ＋Ｃ）はマッチするＧＣ塩基対のパーセント、Ｎはプローブの長さである。 ２７．請求項２において、Ｈサイトモデルを使用して標識プローブを同定するス テップが、 標識プローブおよび第一プローブと相補的なｍＲＮＡの部分以外の前記ｍＲＮＡ の部分と相補的な標識プローブに関して最小融解温度を規定すること、任意の核 形成部位での塩基対の数に関して最小値を決める核形成のしきい値を決定するこ と、 第一ヌクレオチドプローブおよび第一プローブと相補的なｍＲＮＡの部分以外の 前記ｍＲＮＡの部分と相補的な前記ｍＲＮＡの前記部分の融解温度（Ｔｍ）を可 能なあらゆるハイブリダイゼーション点で測定すること、及び及び最低のＴｍ値 を有する適当な長さのヌクレオチドプローブを選択することとを含む請求項１記 載の方法。 ２８．請求項２７において、前記融解温度が次式で決定されることを含む請求項 １記載の方法： Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ］）−０．６３％（ホルムアミド）＋ ０．４１（％（Ｇ＋Ｃ））−６００／Ｎ、ここでｌｏｇ［Ｎａ］はナトリウム濃 度の対数関数であり、０．０６％（ホルムアミド）はホルムアミドの濃度、％（ Ｇ＋Ｃ）はマッチするＧＣ塩基対のパーセント、Ｎはプローブの長さである。 ２９．試料にバナジルリボヌクレオチド複合体を加えることを特徴とするＳＤＳ とＥＤＴＡを含む、緩衝系にＲＮＡを含む前記試料中のＲＮａｓｅ活性を阻害す る方法。 ３０．請求項２９において、試料が試料中のＲＮＡの少なくとも５倍以上のモル 濃度のＥＤＴＡを含む請求項２９記載の方法。 ３１．請求項２９において、バナジルリボヌクレオチド複合体がプロテイナーゼ Ｘと組み合わせて加えられることを特徴とする請求項２９記載の方法。 ３２．請求項２９または３１において、バナジルリボヌクレオチド複合体がＲＮ ａｓｉｎと組み合わせて加えられることを特徴とする請求項２９記載の方法。 ３３．不溶性支持体と β受容体のｍＲＮＡに特有の配列に相補的な配列を含み、前記支持体に結合した 第一ポリヌクレオチドとを含む、 試料中のβ受容体のｍＲＮＡの量を検出定量する際に有用なポリヌクレオチド固 定化支持体。 ３４．請求項３３において、β受容体ｍＲＮＡに特有の前記配列がＳＥＱＩＤＮ Ｏ：６の配列を含むポリヌクレオチド固定化支持体。 ３５．不溶性支持体と ｊｕｎ遺伝子のｍＲＮＡに特有の配列に相補的な配列を含み、前記支持体に結合 した第一ポリヌクレオチドとを含む、 試料中のｊｕｎ遺伝子のｍＲＮＡの量を検出定量する際に有用なポリヌクレオチ ド固定化支持体。 ３６．請求項３５において、ｊｕｎ遺伝子ｍＲＮＡに特有の前記配列がＳＥＱＩ ＤＮＯ：１１−３５，３９−５３，６２−１３８，３１０−３４２，６００−６ ０６，６１４−６２０，および６２８−６３４からなる群から選択される配列に 相補的である請求項３５記載のポリヌクレオチド固定化支持体。 ３７．不溶性支持体と ＧプロテインのｍＲＮＡに特有の配列に相補的な配列を含み、前記支持体に結合 した第一ポリヌクレオチドとを含む、 試料中のＧプロテインのｍＲＮＡの量を検出定量する際に有用なポリヌクレオチ ド固定化支持体。 ３８．請求項３８において、ＧプロテインｍＲＮＡに特有の前記配列がＳＥＱＩ ＤＮＯ：１。 ２．７００−７０９，８０５，８０６，１３９−１５９，１６２−１７２および １７６−３０９の群から選択される配列に相補的な配列を含む請求項３５記載の ポリヌクレオチド固定化支持体。 ３９．不溶性支持体と サブスタンスＰ受容体のｍＲＮＡに特有の配列に相補的な配列を含み、前記支持 体に結合した第一ポリヌクレオチドとを含む、試料中のサプスタンスＰ受容体の ｍＲＮＡの量を検出定量する際に有用なポリヌクレオチド固定化支持体。 ４０．請求項３９においてサプスタンスＰ受容体ｍＲＮＡに特有の前記配列がＳ ＥＱＩＤＮＯ：５の配列を含む請求項３３記載のポリヌクレオチド固定化支持体 。