DE60109002T2

DE60109002T2 - Methode zum Nachweis von transkribierten genomischen DNA-Sequenzen

Info

Publication number: DE60109002T2
Application number: DE60109002T
Authority: DE
Inventors: Takahiko Yokohama-shi Ishiguro; Kiyoshi Kawasaki-shi Yasukawa
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2000-07-14
Filing date: 2001-07-16
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2021-07-17
Also published as: US20050064486A1; EP1174521A2; US20030027142A1; EP1174521A3; EP1174521B1; JP2002142765A; DE60109002D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer Genexpressionsregion für eine DNA-Sequenz, deren Nucleotidsequenz bereits bekannt ist und ein Verfahren zur Bestimmung einer Genexpressionsregion in einer beliebigen Region des Genoms oder des gesamten Genoms durch wiederholte Ausführung des vorstehend erwähnten Verfahrens. Die Erfindung betrifft auch ein genomisches Gen, das durch dieses Verfahren als eine Genexpressionsregion bestimmt wurde, und ein von diesem Gen codiertes Protein.
Während die Nucleotidsequenzen der Genome in verschiedensten biologischen Arten, einschließlich des menschlichen Genoms, das aus drei Milliarden Basen besteht, entschlüsselt werden, ist die Entwicklung des so genannten 'Post-Genoms' jetzt im Gange. Demgemäß beschreibt Hochgeschwender (1992), TIGS, 41–44, Verfahren zur Identifizierung insbesondere transkribierter Gene innerhalb des menschlichen Genoms. Außerdem beschreibt Datson (1996), Nucl. Acids Res. 24, 1105–1111, Verfahren um Genfragmente zu screenen, die zum Nachweis der Anwesenheit einer genomischen Sequenz in einer RNA-Probe verwendet werden können. Weiterhin beschreibt Holzinger (1995), in Immunogenetics 42, 315–322, ein Verfahren zum Screenen von Genfragmenten. Im Besonderen beschreibt Holzinger (a. a. O.) die Bestimmung, ob LST1, eine DNA-Sequenz, die nachweislich im menschlichen Genom enthalten ist, exprimiert wird. Es ist das Ziel von 'Post-Genom', die Arten und Aktivitäten aller Proteine zu verstehen, die von einem lebenden Organismus während seines gesamten Lebens produziert werden. Ferner ist ein Hauptziel des menschlichen 'Post-Genom'-Projekts die Entwicklung neuer Medikamente auf der Basis von Gen-Funktionsanalysen (Herstellung von genomischen Arzneistoffen) und die Gründung einer Basis für maßgeschneiderte medizinische Behandlungen (vgl. DeRisi et al., Science, Bd. 278, S. 680, 1997).
Im 'Post-Genom' wird insbesondere der Expressions-Modus von RNA als 'Transkriptom' bezeichnet. In der Transkriptom-Analyse ist die Identifizierung aller Gene des Genoms ein wichtiges Thema. In diesem Zusammenhang offenbart EP-A1 0 969 101 Verfahren zur Prüfung von Ziel-Nucleinsäuren, die für die Untersuchung unbekannter Gene nützlich sind. Auch wenn die Sequenz einer genomischen DNA entschlüsselt wird, ist damit noch nicht jedes Gen identifiziert.
Die Anzahl der Gene auf dem menschlichen Genom wird auf hunderttausend geschätzt, aber nur sechstausend sind bis jetzt entschlüsselt worden. Selbst wenn einige der verbleibenden Gene wichtige Funktionen haben, ist es schwierig, sie zu identifizieren.

(1) In einer zweidimensionalen Elektrophorese sind zum Beispiel seltenere Proteine einfach zwischen 'Housekeeping-Proteinen', die in großen Mengen vorkommen, verborgen, sodass deren Unterscheidung praktisch unmöglich ist. Auch eine Analyse von cDNA-Banken hat das gleiche Problem, nämlich, dass die Wahrscheinlichkeit, eine seltene cDNA zu selektieren und sie einer Nucleotidsequenz-Bestimmung zu unterwerfen, extrem klein ist. Außerdem kann zurzeit, wenn das Ziel die Identifizierung aller Gene ist, der Grad der Durchführung mit diesen Verfahren nicht erfasst werden.
(2) Zum Beispiel ist ein Mikro-Array eine Technik, um mehrere tausend Arten von cDNA unter Verwendung von Sonden (tips), an welche die cDNAs gebunden werden, zu identifizieren. Aber nachdem die gebunden cDNAs Moleküle bereits identifiziert sind, werden so üblicher Weise keine unbekannten neuen Gene identifiziert.
(3) Auch wurde beispielsweise über einen Versuch berichtet (vgl., Bork et al., Nature Genet., vol. 18, S. 313, 1998), Gene unter Verwendung eines Computers neu zu identifizieren. Programme wie GRAIL, HEXON und GENSCAN werden zur Ausführung dieses Verfahrens zur Verfügung gestellt. Aber es versteht sich von selbst, dass in der Transkriptom-Analyse die Identifizierung von Genen durch experimentelle Daten, und nicht durch Annahmen, fest erwartet wird.

Demnach ist es Aufgabe dieser Erfindung, ein neues Transkriptom-Analyseverfahren bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine erste Ausführungsform der Erfindung, die gemacht wurde, um das vorstehend erwähnte Ziel zu erreichen, ist ein Verfahren zum Feststellen, ob eine durchgehende beliebige DNA-Sequenz, die im Genom einer beliebigen biologischen Art vorliegt, eine Genexpressionsregion ist oder nicht, welches den Nachweis umfasst, ob eine Nucleotidsequenz, die der Nucleotidsequenz der Region entspricht, in der RNA der biologischen Art vorhanden ist oder nicht, wobei der Nachweis das Feststellen umfasst, ob DNA oder RNA amplifiziert wird oder nicht, indem DNA oder RNA, die auf der RNA der biologischen Art basiert, unter Verwendung eines Oligonucleotids amplifiziert wird, das homolog ist zu einer Sequenz, die mindesten zehn oder mehr durchgehende Basen umfasst und im 5'-Ende der Genexpressionsregion liegt, und eines weiteren Oligonucleotids, das komplementär ist zu einer Sequenz, die mindestens zehn oder mehr durchgehende Basen umfasst und im 3'-Ende der Genexpressionsregion liegt und wobei der Nachweis, ob die DNA oder RNA amplifiziert wird oder nicht, durch ein Verfahren durchgeführt wird, in welchem die Amplifikation in Gegenwart einer Oligonucleotidsonde durchgeführt wird, die spezifisch an die DNA oder RNA binden kann, die durch die Amplifikation gebildet wird, und mit einem intercalierenden Fluoreszenzfarbstoff markiert ist (mit der Maßgabe, dass das Oligonucleotid eine Sequenz ist, die kein komplementäres Binden mit einem der vorstehend genannten Oligonucleotide zeigt), und Veränderungen in einem Fluoreszenzmerkmal der Reaktionslösung gemessen werden.
Eine zweite Ausführungsform der Erfindung betrifft die erste Erfindung, bei der die DNA-Sequenz eine DNA-Region von 100 bis 200 Basen ist.
Eine dritte Ausführungsform der Erfindung betrifft die vorhergehende Ausführungsform, wobei die Amplifikation eine RNA Amplifikation ist, bei welcher unter Verwendung von Oligonucleotiden, von denen eines eine RNA-transkribierbare Promotorsequenz in seinem 5'-Ende hat, (1) ein DNA-Fragment, das komplementär zu einem Teil der RNA der biologischen Art ist, mittels RNA-abhängiger DNA-Polymerase von einem der beiden Oligonucleotide unter Verwendung der von der biologischen Art abgeleiteten RNA als Matrize synthetisiert wird, wodurch die Bildung eines RNA-DNA-Hybrides bewirkt wird, (2) ein einzelsträngiges DNA-Fragment durch Hydrolysieren der von der biologischen Art abgeleiteten RNA des RNA-DNA-Hybrids mit Ribonuclease H gebildet wird, (3) ein DNA- Fragment, das komplementär zu dem einzelsträngigen DNA-Fragment ist, mittels DNA-abhängiger DNA-Polymerase vom anderen Oligonucleotid unter Verwendung des einzelsträngigen DNA-Fragments als Matrize synthetisiert wird, wodurch die Bildung eines doppelsträngigen DNA-Fragments bewirkt wird, das eine Promotorsequenz hat, die in der Lage ist, Transkription von RNA als Teil der RNA der biologischen Art oder von RNA, die komplementär zu einem Teil davon ist, durchzuführen, (4) ein RNA-Transkriptionsprodukt aus der doppelsträngigen DNA unter Verwendung von RNA-Polymerase gebildet wird, und dann (5) die Schritte von (1) bis (4) unter Verwendung des RNA-Transkriptionsprodukts als Matrize wiederholt werden.
Eine vierte Ausführungsform der Erfindung betrifft die vorhergehenden Ausführungsformen, wobei die Sonde eine komplementäre Bindung mit zumindest einem Teil der Sequenz des DNA-Transkriptionsprodukts oder RNA-Transkriptionsprodukts eingehen kann, das durch die Amplifikation gebildet wurde und sich das Fluoreszenzmerkmal im Vergleich mit dem Fall, in dem der Komplex nicht gebildet wird, verändert.
Eine fünfte Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Feststellen der Genexpressionsregion in einer beliebigen Region des Genoms oder des gesamten Genoms, das das wiederholte Ausführen des Verfahrens nach der ersten bis vierten Ausführungsform der Erfindung umfasst.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
1 zeigt eine Beziehung zwischen den Nucleotidsequenzen jeder einzelnen der Genexpressionsregionen 1 bis 5 und den komplementären Bindungspositionen jedes einzelnen der Primer 1F, 1R, 1S, 2F, 2R, 2S, 3F, 3R, 3S, 4F, 4R, 4S, 5F, 5R, und 5S.
2 zeigt die Nicht-Transkriptions-Region und die Transkriptions-Region der Genexpressionsregionen 1 bis 5.
3 zeigt ein Elektrophoresemuster, wenn 30 Zyklen von RT-PCR für 200 ng mRNA unter Verwendung von Primern für die Genexpressionsregionen 1 bis 5 mittels des in Beispiel 3 gezeigten Verfahrens durchgeführt wurden.
4A, 4B, 4C zeigen die entsprechenden Elektrophoresemuster, wenn 10, 20 und 30 Minuten von TRC für 200 ng mRNA unter Verwendung von Primern für die Genexpressionsregionen von 1 bis 5 mittels des in Beispiel 4 gezeigten Verfahrens durchgeführt wurden.
5 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Reaktionszeit und dem Fluoreszenzintensitäts-Verhältnis zeigt, die mit der Bildung von RNA ansteigt, wenn TRC für 200 ng mRNA mittels des in Beispiel 5 gezeigten Verfahrens unter Verwendung von Primern für die Genexpressionsregion 3 durchgeführt wurde.
6A und 6B zeigen entsprechende Elektrophoresemuster, wenn 30 Zyklen von RT-PCR oder 30 Minuten von TRC für 200 ng mRNA mittels des in Beispiel 6 gezeigten Verfahrens unter Verwendung von Primern für die Genexpressionsregion 3 durchgeführt wurden.
7A und 7B zeigen entsprechende Elektrophoresemuster, wenn 30 Zyklen von RT-PCR oder 30 Minuten von TRC für 0 oder 2 ng mRNA oder 0 bis 200 ng genomischer DNA mittels des in Beispiel 7 gezeigten Verfahrens unter Verwendung von Primern für die Genexpressionsregion 3 durchgeführt wurden.
8 ist eine graphische Darstellung die die Beziehung zwischen der Reaktionszeit und dem Fluoreszenzintensitäts-Verhältnis zeigt, die mit der Bildung von RNA ansteigt, wenn TRC für 200 ng genomischer DNA mittels des in Beispiel 7 gezeigten Verfahrens unter Verwendung von Primern für eine Region bestehend aus den Genexpressionsregionen 1, 2 und 3 durchgeführt wurde.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Im Folgenden wird die Erfindung im Detail beschrieben.
Das Verfahren der Erfindung wird auf eine durchgehende beliebige DNA-Sequenz angewandt, die im Genom einer beliebigen biologischen Art vorliegt. Eine solche DNA-Sequenz, deren Länge nicht besonders limitiert ist, aber 200 oder weniger Basen, vorzugsweise im Bereich von 100 bis 200 Basen ist, kann durch Auswahl von publizierten genomischer DNA-Sequenzen festgelegt werden. Gemäß dem Verfahren der Erfindung kann eine Möglichkeit, dass die DNA-Sequenz eine Genexpressionsregion ist, nur in dem Fall bestimmt werden, in dem der gesamte Anteil einer beliebigen bestimmten DNA-Sequenz in einem Exon enthalten ist. Obwohl die Anzahl der Exons in einem Gen und die Länge jedes Exons, abhängig von der Art des Gens, stark variiert, ist in jedem Gen ein Exon vorhanden, das ein Terminationscodon und ein Poly-A-Verbindungssignal hat und das länger als die anderen Exons ist und mehr als 400 Basenpaare hat. Wenn daher eine beliebige genomische Region in eine DNA-Sequenz von 200 Basenpaaren oder weniger fragmentiert wird, ist zumindest eines der Fragmente in einem Exon enthalten und wird daher nicht übersehen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der folgende Nachweis unter Verwendung einer durchgehenden beliebigen, im Genom vorliegenden DNA-Sequenz durchgeführt. Die Genexpressionsregion kann auf einer beliebigen Region im Genom oder im gesamten Genom, bestimmt werden, indem die beliebige Region oder das gesamte Genom in Fragmente zerlegt wird und der Nachweis unter Verwendung jedes einzelnen Fragments wiederholt wird.
Die Erfindung bestimmt, ob eine DNA-Sequenz eine Genexpressionsregion ist oder nicht, indem die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Nucleotidsequenz, die der Nucleotidsequenz der Genexpressionsregion der RNA derselben biologischen Art entspricht, nachgewiesen wird. Die RNA, die bei der Erfindung zum Einsatz kommt, ist mRNA, die aus derselben biologischen Art hergestellt wird, in der das Genom enthalten ist, in dem eine Genexpressionsregion nachgewiesen werden soll. Besonders wenn das Genom das Genom eines höheren Organismus ist, ist es erstrebenswert, verschiedene Arten von mRNA, vorzugsweise aus allen Geweben hergestellte, zu verwenden. In diesem Fall kann die mRNA jedes Gewebes getrennt oder gemischt verwendet werden. Wenn im letzteren Fall die Anwesenheit einer Genexpressionsregion gefunden wird, macht die nachfolgende getrennte Verwendung von mRNA aus jedem Gewebe die Auffindung des Gewebes möglich, welches das Gen des Genoms exprimiert, das als Genexpressionsregion bestimmt wurde. Der Grund, warum mRNA-Arten gemischt werden können, ist folgender. In der Annahme, dass das durchschnittliche Molekulargewicht von mRNA 300,000 ist, wird 1 ng mRNA 2 × 10⁹ mRNA-Moleküle enthalten. Folglich sind sogar im Fall eines Gens, das nur in einem von 1000 Geweben exprimiert wird, und dessen Expressions-Höhe einen Anteil von 1/100,000 der mRNA im Gewebe ausmacht, 2 × 10⁴ Kopien in 1 μg derselben Menge eines mRNA-Gemischs vorhanden, die jeweils aus 1,000 Geweben einschließlich dieses Gewebes gewonnen wurde. Wie später noch in den Beispielen beschrieben wird, ist diese Kopienzahl ausreichend nachweisbar.
Verschiedene Verfahren können für den vorstehend erwähnten Nachweis angewendet werden. Beispielsweise kann die Anwendung eines Hybidisierungsverfahrens und eines Nucleinsäure-Amplifikationsverfahrens als Beispiel dienen. Wenn ein Amplifikationsverfahren verwendet wird, werden zumindest zwei Oligonucleotide (Primer), die basierend auf der Genexpressionsregion entworfen wurden, in sowohl DNA-Amplifikation als auch RNA-Amplifikation verwendet, wobei eines von ihnen ein Oligonucleotid ist, das homolog ist zu einer Sequenz, die mindestens 10 oder mehr durchgehende Basen umfasst und im 5'-Ende der Genexpressionsregion liegt, und das andere ein Oligonucleotid ist, das komplementär ist zu einer Sequenz, die mindestens 10 oder mehr durchgehende Basen umfasst und im 3'-Ende der Genexpressionsregion liegt. Oligonucleotide von zumindest 10 oder mehr Basen werden verwendet, um eine Spezifität hinsichtlich der Bindung der Oligonucleotide an die Genexpressionsregion zu bewahren.
Beispiele des Nucleinsäure-Amplifikationsverfahrens beinhalten ein DNA-Amplifikationsverfahren, verkörpert durch eine RT-PCR, in welchem cDNA von der mRNA unter Verwendung von Primern und einer Reversen Transkriptase synthetisiert wird und dann DNA (DNA, die aus der Genexpressionsregion besteht) mittels einer Primer-Elongations-Reaktion unter Verwendung von Primern und einer DNA-Polymerase und der DNA als Matrize amplifiziert wird, sowie ein RNA-Amplifikationsverfahren, in welchem zu der RNA komplementäre cDNA unter Verwendung von Primern und einer Reversen Transkriptase und der mRNA als Matrize synthetisiert wird, eine Elongationsreaktion der DNA durchgeführt wird, indem sie an einen Promotor-Primer gebunden wird, der eine Einheit enthält, die komplementär zu der DNA ist, und dann RNA (RNA, die aus der Genexpressionsregion besteht) in großer Menge synthetisiert wird, indem einer RNA-Polymerase gestattet wird, mit der auf diese Weise synthetisierten doppelsträngigen DNA zu reagieren.
Der erste Fall ist ein bereits weit und allgemein bekanntes Verfahren und Beispiele für den letzteren Fall beinhalten NASBA (nucleic acid sequence based amplification)-Verfahren, 3SR-Verfahren und das Verfahren, das später in den Beispielen beschrieben werden wird.
Beschreibt man das NASBA-Verfahren und das in den Beispielen beschriebene Verfahren skizzenhaft, so sind sie RNA-Amplifikationen, in denen unter Verwendung von Oligonucleotiden, von denen eines der beiden eine RNA-transkribierbare Promotor-Sequenz im 5'-Ende hat, (1) ein DNA-Fragment, das komplementär zu einem Teil der RNA der biologischen Art ist, mittels RNA-abhängiger DNA-Polymerase von einer der beiden Oligonucleotide unter Verwendung der von der biologischen Art abgeleiteten RNA als Matrize synthetisiert wird, wodurch die Bildung eines RNA-DNA-Hybrids bewirkt wird, (2) durch Hydrolysieren der von der biologischen Art abgeleiteten RNA des RNA-DNA-Hybrids mit Ribonuclease H, ein einzelsträngiges DNA-Fragment gebildet wird, (3) ein DNA-Fragment, das komplementär zum einzelsträngigen DNA-Fragment ist, mittels DNA-abhängiger DNA-Polymerase vom anderen Oligonucleotid unter Verwendung des einzelsträngigen DNA-Fragments als Matrize synthetisiert wird, wodurch die Bildung eines doppelsträngigen DNA-Fragments bewirkt wird, das eine Promotorsequenz hat, die in der Lage ist, Transkription von RNA als Teil der RNA der biologischen Art oder von RNA, die komplementär zu einem Teil davon ist, durchzuführen, (4) ein RNA-Transkriptionsprodukt von der doppelsträngigen DNA unter Verwendung von RNA-Polymerase gebildet wird und dann (5) die Schritte von (1) bis (4) unter Verwendung des RNA-Transkriptionsprodukts als Matrize wiederholt werden.
Das Verfahren, das in den Beispielen beschrieben wird, kann von den Gesichtspunkten aus als Beispiel eines besonders wünschenswerten Nachweisverfahrens beschrieben werden, dass die Bestimmung der Erfindung innerhalb einer kurzen Zeitperiode erfolgen kann, da die Amplifikation innerhalb einer ausgesprochen kurzen Zeit von 10 Minuten beendet ist, dass es eine hohe Sensitivität hat, die die Amplifikation von sogar einigen pg RNA, die die Genexpressionsregion beinhaltet, ermöglicht, und dass der Einfluss von DNA, die die Möglichkeit hat, RNA zu kontaminieren, ausgeschlossen werden kann.
Die DNA und RNA, die durch die vorstehende Amplifikation gebildet werden, können durch ein bereits bekanntes Nachweisverfahren, wie eine Elektrophorese, nachgewiesen werden, aber im Besonderen bevorzugt ist ein Verfahren, in dem die Amplifikation in Gegenwart einer Oligonucleotidsonde, die spezifisch an die DNA oder RNA, die durch die Amplifikation gebildet wird und mit einem intercalierenden Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, durchgeführt wird, und Veränderungen in einem Fluoreszenzmerkmal der Reaktionslösung gemessen werden. Selbstverständlich hat diese Sonde eine Sequenz, die keine komplementären Bindungen mit den Oligonucleotiden, die für die Amplifikation verwendet werden, bilden kann. Beispiele dieser Oligonucleotidsonde beinhalten jene, in welchen ein intercalierender Fluoreszenzfarbstoff über einen Linker an den Phosphor eines Oligonucleotids gebunden ist. Im Falle einer solchen geeigneten Sonde, wenn die gebildete DNA oder RNA durch komplementäre Bindung an eine Genexpressionsregion (oder eine Sequenz komplementär zu der Genexpressionsregion) einen Doppelstrang bildet, intercaliert der intercalierende Fluoreszenzfarbstoff in die doppelsträngige Einheit und verändert sein Fluoreszenzmerkmal, sodass es nicht notwendig ist, die Sonde, die keine komplementäre Bindung eingegangen ist, abzutrennen (Ishiguro, T. et. al., (1996), Nucleic Acids Res., 24 (24), 4992–4997).
Die Nucleotidsequenz der Oligonucleotidsonde ist, mit der Maßgabe, dass sie eine Sequenz hat, die mit der gebildeten DNA oder RNA eine komplementäre Bindung eingehen kann, nicht besonders eingeschränkt, aber um die Spezifität in Bezug auf die Bindung an die gebildete DNA oder RNA zu erhalten, ist es wünschenswert, dass sie etwa zehn Basen hat, die komplementär zu mindestens zehn durchgehenden Basen sind, die in der DNA oder RNA vorhanden sind. In diesem Zusammenhang ist es wünschenswert, die Hydroxylgruppe des 3'-Endes der Sonde chemisch zu verändern (z. B. Zugabe von Glykolsäure), wenn die Amplifikation in Gegenwart der Oligonucleotidsonde durchgeführt wird, um so die Elongationsreaktion, in der die Sonde als Primer verwendet wird, zu unterdrücken.
Wenn die Amplifikation, wie vorstehend beschrieben, in Gegenwart einer Oligonucleotidsonde durchgeführt wird, kann das Nachweisverfahren der Erfindung in einem Reaktionsgefäß bei einer konstanten Temperatur und in einem Schritt durchgeführt werden, sodass sein Einsatz im automatischen Betrieb leicht gemacht werden kann.
Die Einzelheiten des Genomanalyse-Verfahrens der Erfindung, das durch Wiederholung des Genexpressionsregion-Bestimmungsverfahrens durchgeführt wird, sind wie folgt. Das Verfahren kann in jeder biologischen Art zum Einsatz gelangen, sofern die genomische Sequenz bestimmt ist. Das Genom der besagten biologischen Art ist zum Beispiel in DNA-Sequenzen von jeweils 200 Basenpaaren geteilt. Wenn eine Nucleinsäure-Amplifikation als Nachweisverfahren verwendet wird, wird ein Primer-Satz angefertigt, der zwei Oligonucleotide enthält, die für die Amplifikation jeder Genexpressionsregion erforderlich sind. In diesem Zusammenhang variiert die Anzahl der erforderlichen Primer und ihrer Sequenz, je nach dem zum Einsatz kommenden Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren. Ferner ist es zur Verbesserung der Arbeitseffizienz wirkungsvoll, eine DNA-Sequenz von den Untersuchungen auszuschließen, die in einer Region vorliegt, die durch frühere Studien schon als Genexpressionsregion bekannt ist, sowie eine DNA-Sequenz, die in einer Region vorliegt, die aufgrund ihrer DNA-Sequenz offensichtlich keine Genexpressionsregion ist. Daraufhin wird die RNA unter Verwendung eines Primer-Satzes für jede DNA-Sequenz nachgewiesen.
Wenn ein Genom mittels des Verfahrens der Erfindung analysiert wird, können alle Gene einer biologischen Art identifiziert werden. Darüber hinaus wird es möglich, ein Protein zu bestimmen, das durch ein Gen, das von Interesse ist, codiert wird, indem das Gen, das als Genexpressionsregion bestimmt wurde, isoliert wird und das Protein unter Zuhilfenahme der isolierten DNA hergestellt wird. Zum Beispiel kann eine Nucleotidsequenz ermittelt werden, indem eine cDNA mit vollständinger Länge auf dem üblichen Weg unter Verwendung einer Nucleinsäure als Sonde, die mittels des Verfahrens der Erfindung amplifiziert wurde, isoliert wird. Auf diese Weise wird die genomische Struktur einschließlich des Verhältnisses zwischen Intron und Exon in der Genomexpressions-Region aufgedeckt. Ferner kann ein Protein, das durch das Gen codiert ist, bekannt werden, indem die cDNA mittels Screenen einer cDNA-Bank auf dem üblichen Weg unter Verwendung der amplifizierten Nucleinsäure als Sonde isoliert wird. Darüber hinaus kann dieses Protein, falls es exprimiert ist, durch Erzeugung einer Rekombinanten unter Verwendung der cDNA sowie unter Verwendung einer mikrobischen oder tierischen Wirtszelle auf dem üblichen Weg exprimiert werden.
Beispiele der Erfindung werden nachstehend als Erläuterung und nicht als Einschränkung gegeben.
BEISPIEL 1
Bestimmung der Regionen
Um die Umsetzungsmöglichkeit des Bestimmungsverfahrens für Genexpressionsregion, das durch die Erfindung bereitgestellt wird, zu zeigen, wurde der folgende Modellversuch durchgeführt.
Als die genomische Region wurde eine Region ausgewählt, die aus 900 Basenpaaren besteht und aus einem G1-Stamm hergestellt wurde, der ein genetisch veränderter, transformierter Methanol-assimilierender Hefestamm ist und der mittels des, von den vorliegenden Erfindern in der Japanischen Patentanmeldung Nummer 11-188650 beschriebenen Verfahrens, erzeugt wurde. Wenn der G1-Stamm durch Methanol induziert wird, exprimiert er ein menschliches Fusionsprotein, IL-6R-IL-6, das aus einer Polypeptidkette von 397 Aminosäureresten besteht (vgl., Japanische Patentveröffentlichung Nummer P2001-8690A).
Wie in 1 gezeigt wird, wurde die Region, die aus 900 Basenpaaren besteht, in fünf DNA-Sequenzen von je 180 Basenpaaren geteilt. Außerdem wird der mRNA-Expressions-Modus der Region, der schon aus der Japanischen Patentveröffentlichung Nummer P2001-8690A bekannt ist, in 2 gezeigt. Wie aus 1 und 2 offensichtlich ist, enthält die Genexpression-Region 1 (Basennummern 1 bis 180) 159 Basenpaare einer Nicht-Transkriptions-Region sowie 21 Basenpaare einer Transkriptions-Region. Jede einzelne der Genexpressionsregion 2 (Basennummern 181 bis 360), Genexpressionsregion 3 (Basennummern 361 bis 540), Genexpressionsregion 4 (Basennummern 541 bis 720) und Genexpressionsregion 5 (Basennummern 721 bis 900) enthält nur eine Transkriptions-Region.
Die Oligonucleotid-(Primer)-Sätze (Vorwärts-Primer; F, Rückwärts-Primer; R, Schneide-Sonde (scissor-probe); S, die in 1 gezeigt werden, und die SEQ ID NO 1 bis 15, wurden für jede der fünf vorstehenden erwähnten Genexpressionsregionen synthetisiert. Wenn eine DNA-Amplifikation (RT-PCR) durchgeführt wurde, wurden der Vorwärts-Primer und der Rückwärts-Primer unter ihnen benützt. Wenn eine RNA-Amplifikation (TRC; transcription reverse transcription concerting amplification) durchgeführt wurde, wurden der Vorwärts-Primer, der Rückwärts-Primer und die Schneide-Sonde benützt. In der TRC kann eine Genexpressionsregion nicht amplifiziert werden, wenn sie nicht am 5'-Terminus der mRNA liegt. Die Schneide-Sonde ist ein Oligonucleotid (DNA), das in diesem Fall dazu benützt wird, um die Genexpressionsregion an der 5'-Seite der mRNA zu lokalisieren, indem sie komplementär an die 5'-Seite der Genexpressionsregion gebunden wird und die komplementär-gebundene Region durch die Einwirkung einer Ribonuclease geschnitten wird.
BEISPIEL 2
Erzeugung von mRNA
Eine mRNA-Probe wurde mittels des folgenden Verfahrens aus dem G1-Stamm erzeugt.
Der G1-Stamm wurde in 3 ml BMGY (Bacto Yeast Extrakt 10 g/l, Bacto Peptone 20 g/l, Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren 1,34 g/l, 100 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 6,0, Glycerin 10 g/l und Biotin 0,4 mg/ml)-Medium inokuliert und bei 28°C für 24 Stunden auf einem Schüttler, gezüchtet.
Ein 100 μl-Anteil der Kulturbrühe wurde in 3 ml BMGY (Bacto Yeast Extract 15 g/l, Bacto Peptone 30 g/l und den anderen Bestandteilen, die die gleiche Zusammensetzung wie im vorstehend erwähnten BMGY haben)-Medium inokuliert und bei 28°C für 16 Stunden gezüchtet.
Nach Bestätigung des Aufbrauchens von Methanol wurden 100 μl Methanol zum Medium zugefügt, um die Expression des menschlichen IL-6R-IL-6 Fusions-Proteins zu induzieren. Zwei Stunden nach der Zugabe von Methanol wurden die Zellen geerntet und 5 × 10⁷ Zellen wurden sofort mit flüssigem Stickstoff eingefroren.
Sie wurden unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (Yeast cell lysis preparation kit, hergestellt von BIO 01 Inc.) einer Zellwand-Lyse unterworfen. Als Nächstes wurde mRNA unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (QuickPrep mRNA Purification Kit, hergestellt von Amersham Pharmacia) erzeugt.
BEISPIEL 3
Bestimmung der Genexpression-Region durch DNA-Amplifikation
Unter Verwendung der in Beispiel 2 erhaltenen mRNA wurde untersucht, ob die DNA-Amplifikation für einen Primer, der aus einer Region abgeleitet wurde, die ausschließlich aus einer Genexpressionsregion besteht, spezifisch ist oder nicht.
Ein handelsüblicher Kit (RT-PCR beads, hergestellt von Amersham Pharmacia) wurde in der RT-PCR verwendet.
Das heißt, cDNA wurde von 200 ng mRNA unter Verwendung von Oligo(dT) als Primer durch eine 15 minütige Reaktion bei 42°C synthetisiert. Als Nächstes wurde eine PCR-Reaktion unter Verwendung des Vorwärts-Primers und des Rückwärts-Primers, durchgeführt. Unter Verwendung eines PCR-Geräts wurden 30 Zyklen für die Dauer von ungefähr 3 Stunden durchgeführt. Ein Zyklus bestand aus 95°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten. Sofort nach der Reaktion wurde eine Elektrophorese unter Verwendung von 4% Agarose, die danach mit SYBR-Grün gefärbt wurde, durchgeführt. Wie aus 3 offensichtlich ist, wurde keine Amplifikation durch den aus der Genexpressionsregion 1 stammenden Primer gefunden, aber eine Amplifikation mittels der aus den Genexpressionsregionen 2 bis 5 stammenden Primern wurde gefunden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die DNA-Amplifikation spezifisch für einen Primer ist, der von einer Region abgeleitet ist, die ausschließlich aus einer Genexpressionsregion besteht. Das heißt, ob eine durchgehende beliebige DNA-Sequenz, die im Genom einer beliebigen, biologischen Art vorliegt, eine Genexpressionsregion ist oder nicht, kann durch den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Nucleotidsequenz, die einer Nucleotidsequenz der Region in der RNA der biologischen Art entspricht, und durch eine DNA-Amplifikation, die durch eine RT-PCR verkörpert wird, festgestellt werden.
BEISPIEL 4
Bestimmung der Genexpressionsregion durch RNA-Amplifikation
Unter Verwendung der in Beispiel 2 erhaltenen mRNA wurde untersucht, ob die RNA-Amplifikation für einen Primer, der aus einer Region abgeleitet wurde, die ausschließlich aus einer Genexpressionsregion besteht, spezifisch ist oder nicht.

(1) Unter Verwendung einer RNA-Verdünnungslösung (10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA) wurde die Probe auf 200 ng/5 μl verdünnt.
(2) Ein 20,8 μl-Anteil einer Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung wurde in Röhrchen mit 0,5 ml Fassungsvermögen verteilt und 5 μl der vorstehend erwähnten RNA-Probe wurden beigemengt. Zusammensetzung der Reaktionslösung (jede Konzentration entspricht einer Konzentration in 30 μl der endgültigen Reaktionslösung) 60 mM Tris-HCl (pH 8,6), 13 nM MgCl₂, 90 mM KCl, 39 Einheiten Rnase-Inhibitor, 1 mM DTT, 0,25 mM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP 3,6 mM ITP, 3,0 mM jeweils von ATP, CTP, GTP und TTP 0,16 μM Schneide-Sonde, 1 μM Vorwärts-Primer, 1 μM Rückwärts-Primer, 13% DMSO und destilliertes Wasser zur Einstellung des Volumens.
(3) Diese Reaktionslösung wurde bei 65°C für 15 Minuten und dann bei 4l°C für 5 Minuten inkubiert und dann wurden 4,2 μl einer Enzymlösung mit der folgenden Zusammensetzung beigemengt. Zusammensetzung der Enzymlösung (jede Konzentration entspricht einer Konzentration in 30 μl der endgültigen Reaktionslösung). 1,7% Sorbit, 3 μg Rinderserumalbumin, 142 Einheiten T7 RNA-Polymerase (hergestellt von Gibco), 8 Einheiten AMV-Reverse Transkriptase (hergestellt von Takara Shuzo), destilliertes Wasser, verwendet zur Einstellung des Volumens.
(4) Anschließend wurden die Röhrchen für 10, 20 oder 30 Minuten bei 41°C gehalten. Sofort nach der Reaktion wurde eine Elektrophorese unter Verwendung von 4% Agarose, die danach mit SYBR Grün gefärbt wurde, durchgeführt.

Wie aus den 4A, 4B und 4C offensichtlich ist, wurde keine Amplifikation nachgewiesen, wenn der Primer für die Genexpressionsregion 1, jeweils im Falle der 10 minütigen Reaktion (4A), 20 minütigen Reaktion (4B) und 30 minütigen Reaktion (4C), verwendet wurde, sie wurde aber gefunden, wenn die Primer für die Genexpressionsregionen 2 bis 5 verwendet wurden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass eine RNA-Amplifikation spezifisch für einen Primer ist, der von einer Region abgeleitet wird, die ausschließlich aus einer Genexpressionsregion besteht, das heißt, ob eine durchgehende beliebige DNA-Sequenz, die im Genom einer beliebigen, biologischen Art vorliegt, eine Genexpressionsregion ist oder nicht, kann durch den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Nucleotidsequenz, die einer Nucleotidsequenz der Region in der RNA der biologischen Art entspricht, und durch eine RNA-Amplifikation, die durch eine TRC verkörpert wird, festgestellt werden.
Ferner, während die in Beispiel 3 gezeigte RT-PCR Amplifikation sogar mit Hilfe eine PCR-Geräts 3 Stunden benötigte, waren 10 Minuten für die Amplifikation durch TRC ausreichend.
BEISPIEL 5
Messung unter Verwendung einer Oligonucleotidsonde die mit intercalierendem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist
Unter Verwendung der in Beispiel 2 erhaltenen mRNA, wurde die Messung unter Verwendung einer Oligonucleotidsonde, die mit einem intercalierendem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, durchgeführt.

(1) Unter Verwendung einer RNA-Verdünnungslösung (10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA) wurde die Probe auf 200 ng/5 μl verdünnt.
(2) Ein 20,8 μl-Anteil einer Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung wurde in Röhrchen mit 0,5 ml Fassungsvermögen verteilt und 5 μl der vorstehend erwähnten RNA-Probe wurden beigemengt. Zusammensetzung der Reaktionslösung (jede Konzentration entspricht einer Konzentration in 30 μl der endgültigen Reaktionslösung) 60 mM Tris-HCl (pH 8,6), 13 mM MgCl₂, 90 mM KCl, 39 Einheiten Rnase-Inhibitor, 1 mM DTT, 0,25 mM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP 3,6 mM ITP, 3,0 mM jeweils von ATP, CTP, GTP und TTP 0,16 μM Schneide-Sonde (3S, SEQ ID NO: 9, die 3'-terminale Hydroxyl-Gruppe ist aminiert), 1 μM Vorwärts-Primer (3F, SEQ ID NO: 7), 1 μM Rückwärts-Primer (3R, SEQ ID NO: 8), 25 nM eines Oligonucleotids, das mit einem intercalierendem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist (YO-3, SEQ ID NO: 16, der intercalierende Fluoreszenzfarbstoff ist am Phosphor, zwischen dem „T" in sechster Position und dem „T" in siebenter Position, gezählt vom 5'-Ende, markiert und die 3'-terminale Hydroxylgruppe ist mit einer Glycol-Gruppe modifiziert), 13% DMSO und destilliertes Wasser zur Einstellung des Volumens.
(3) Diese Reaktionslösung wurde bei 65°C für 15 Minuten und dann bei 41°C für 5 Minuten inkubiert und dann wurden 4,2 μl einer Enzymlösung mit der folgenden Zusammensetzung hinzugefügt. Zusammensetzung der Enzymlösung (jede Konzentration entspricht einer Konzentration in 30 μl der endgültigen Reaktionslösung). 1,7% Sorbit, 3 μg Rinderserumalbumin, 142 Einheiten T7 RNA-Polymerase (hergestellt von Gibco), 8 Einheiten AMV-Reverse Transkriptase (hergestellt von Takara Shuzo), destilliertes Wasser, verwendet zur Volumen-Einstellung.
(4) Anschließend wurden die Röhrchen bei 41°C gehalten und die Reaktionslösung wurde periodisch bei einer Anregungs-Wellenlänge von 470 nm und einer Fluoreszenz-Wellenlänge von 510 nm unter Verwendung eines direkt messenden Fluoreszenz-Spektrophotometers, das mit einer Temperaturkontrollfunktion ausgestattet ist, gemessen.

Periodische Vernderungen im Fluoreszenzintensitäts-Verhältnis der Probe (Fluoreszenzintensitäts-Wert zu einer vorgegeben Zeit/Hintergrundsfluoreszenz-Intensität-Wert), berechnet durch Festlegung der Zeit der Enzymzugabe als Minute 0, sind in 5 gezeigt.
Wie in 5 gezeigt, wurde die Ziel-RNA, die in 200 ng mRNA enthalten ist, innerhalb von 6 Minuten nachgewiesen. Darüber hinaus wurde die Ziel-RNA innerhalb von 11 Minuten nachgewiesen, selbst wenn die Menge an mRNA auf 0,02 ng reduziert wurde. Demnach wurde gezeigt, dass schnelle und hoch sensitive Messungen unter Verwendung einer Oligonucleotidsonde, die mit einem intercalierenden Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, gemacht werden können.
BEISPIEL 6
Sensitivität
Sensitivitäten von RT-PCR und TRC werden verglichen.
Unter Verwendung von 0 bis 200 ng der in Beispiel 2 erhaltenen mRNA wurde die Amplifikation von DNA oder RNA durch 30 Zyklen von RT-PCR durch das in Beispiel 3 gezeigte Verfahren oder durch 30 Minuten von TRC durch das in Beispiel 4 gezeigte Verfahren durchgeführt.
Wie aus den 6A und 6B offensichtlich ist, wurde die Amplifikation von 0,002 ng der mRNA nicht über RT-PCR, sondern über TRC nachgewiesen. Folglich wurde gezeigt, dass TRC eine zehnmal höhere Sensitivität als RT-PCR erzielen kann.
BEISPIEL 7
Auswirkung von DNA-Kontamination
Die Auswirkungen der Kontamination von mRNA mit DNA in RT-PCR und TRC wurden untersucht.
Zunächst wurde genomische DNA, die aus dem Zellwand-lysierten G1 Zell-Stamm durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren erhalten wurde, unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (G Nome, hergestellt von BIO 101 Inc.) erzeugt. Unter Verwendung von 0 bis 200 ng der DNA oder 0 bis 200 ng der in Beispiel 2 erhaltenen mRNA wurden 30 Zyklen RT-PCR gemäß dem in Beispiel 3 gezeigten Verfahren durchgeführt und 30 Minuten TRC gemäß dem in Beispiel 4 gezeigten Verfahren. Wie aus den 7A und 7B offensichtlich ist, wurde Amplifikation durch RT-PCR sogar in der Abwesenheit von mRNA beobachtet, wenn von 2 bis 200 ng der genomischen DNA vorhanden waren. Andererseits fand die Amplifikation durch TRC in der Abwesenheit von mRNA nicht statt, auch wenn von 2 bis 200 ng der genomischen DNA vorhanden waren.
Weiterhin wurde das Verhältnis zwischen Denaturierungsbedingungen und Amplifikation von genomischer DNA in der TRC untersucht. Unter Verwendung von 200 ng der genomischen DNA, wurde die Messung mit einer Oligonucleotidsonde (YO-3, SEQ ID NO: 16), die mit einem intercalierendem Fluoreszenzfarbstoff markiert war, durch das in Beispiel 5 gezeigte Verfahren durchgeführt. In diesem Fall wurde 1S (SEQ ID NO: 3) statt 3S (SEQ ID NO: 9) als die Schneide-Sonde verwendet und 1F (SEQ ID NO: 1) wurde statt 3F (SEQ ID NO: 7) als der Vorwärts-Primer verwendet. Der Grund für die Änderung der Schneide-Sonde und des Vorwärts-Primers ist, die Bildung von Amplifikation von RNA durch die Änderung der Amplifikations-Region zu einer Region von 540 Basenpaaren, bestehend aus den Genexpressionsregionen 1, 2 und 3, die die 159 Basenpaare der nicht transkribierten Region enthalten, zu verhindern. Weiterhin wurde die konstante Verfahrensbedingung der Reaktionslösung vor der Zugabe der Enzym-Lösung (Inkubation bei 65°C für 15 Minuten und dann bei 41°C für 5 Minuten) in die folgenden drei Bedingungen, geändert.

(1) Inkubation bei 95°C für 15 Minuten und dann bei 41°C für 5 Minuten
(2) Inkubation bei 65°C für 15 Minuten und dann bei 41°C für 5 Minuten
(3) Inkubation bei 41°C für 5 Minuten

Wie aus der 8 offensichtlich ist, dauerte es unter Bedingung (1) ungefähr 28 Minuten, bis das Fluoreszenzintensitäts-Verhältnis 1,2 überschritten hatte, und ungefähr 40 Minuten unter Bedingung (2), unter Bedingung (3) wurde aber keine Zunahme gefunden.
Dieses Ergebnis zeigt, dass Amplifikation auch von DNA erfolgen kann, indem die Denaturierungsbedingungen verstärkt werden. In diesem Fall ist eine Änderung der Verfahrensbedingung der Reaktionslösung vor der Zugabe der Enzymlösung zu der Bedingung (3) zweckmäßig, um die Amplifikation von DNA zu hemmen. Es wird jedoch erwartet, dass die Amplifikation von RNA aufgrund der Bildung der Sekundärstuktur der RNA gehemmt wird. Da die periodischen Änderungen des Fluoreszenzintensitäts-Verhältnisses zwischen der Amplifikation von RNA und der Amplifikation von DNA sehr unterschiedlich sind, ist es außerdem ausgesprochen einfach, zwischen beiden Fällen durch Vergleich von 5 mit 8 zu unterscheiden.
In Zusammenfassung der vorstehend erwähnten Ergebnisse, wird eine Inkubationsbedingung bei 65°C für 15 Minuten und dann bei 41°C für 5 Minuten als die angemessene Verfahrensbedingung der Reaktionslösung vor Zugabe der Enzymlösung angesehen, um die Erfindung ausführen zu können.
Nachdem die Verwendung des bereitgestellten Verfahrens die Entschlüsselung von Genexpressionsregionen im gesamten Genom und auch der Genom-Struktur, einschließlich des Intron-Exon-Verhältnisses, möglich macht, können Sequenzen aller Proteine, die in der Lage sind, in einer beliebigen biologischen Art exprimiert zu werden, leicht nachgewiesen werden.
Infolgedessen, wird gemäß der vorliegenden Erfindung angenommen, dass das Verstehen aller grundlegenden Phänomene möglich wird, indem schnelle Erfolge im 'Post-Genom' erzielt werden. Außerdem wird erwartet, dass das menschliche 'Post-Genom' zu einer Entwicklung von neuen, therapeutischen und diagnostischen Arzneistoffen führen wird und dass es auch sehr zum Fortschritt von medizinischen Behandlungen beitragen wird. Es wird auch sehr zur Identifizierung von industriell nutzbaren Proteinen aus Mikroorganismen, die unter extremen Umweltbedingungen leben, sowie zu deren Anwendung beitragen.
Während die Erfindung eingehend und mit Verweisen auf spezifische Ausführungsformen davon beschrieben wurde, wird es für einen Fachmann offensichtlich sein, dass verschiedene Änderungen und Modifikationen darin gemacht werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Feststellen, ob eine durchgehende, beliebige, bekannte DNA-Sequenz, die im Genom einer beliebigen biologischen Art vorliegt, eine Genexpressionsregion ist oder nicht, wobei das Verfahren umfasst: (a) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Nucleotidsequenz, die der DNA-Sequenz der Genexpressionsregion entspricht, in der RNA der biologischen Art, wobei der Nachweis das Feststellen umfasst, ob DNA oder RNA amplifiziert wird oder nicht, indem Amplifikation von DNA oder RNA, die auf der RNA der biologischen Art basiert, durchgeführt wird unter Verwendung eines Oligonucleotids, das homolog ist zu einer Sequenz, die mindestens zehn durchgehende Basen umfasst und im 5'-Ende der Genexpressionsregion liegt, und eines weiteren Oligonucleotids, das komplementär ist zu einer Sequenz, die mindestens zehn durchgehende Basen umfasst und im 3'-Ende der Genexpressionsregion liegt; (b) Durchführen der Amplifikation in Gegenwart einer Oligonucleotidsonde, die spezifisch an die DNA oder RNA binden kann, die durch die Amplifikation gebildet wird und mit einem intercalierenden Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, mit der Maßgabe, dass das Oligonucleotid eine Sequenz ist, die kein komplementäres Binden mit einem der vorstehend genannten Oligonucleotide zeigt; und (c) Messen der Veränderung eines Fluoreszenzmerkmals der Reaktionslösung.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Genexpressionsregion eine DNA-Region von 100 bis 200 Basen ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens eines der Oligonucleotide eine RNA-transkribierbare Promotorsequenz in seinem 5'-Ende hat und die Amplifikation eine RNA-Amplifikation ist, umfassend: (a) Synthetisieren eines DNA-Fragments, das komplementär ist zu einem Teil der RNA der biologischen Art mittels RNA-abhängiger DNA-Polymerase von einem der beiden Oligonucleotide unter Verwendung der von der biologischen Art abgeleiteten RNA als Matrize, wodurch die Bildung eines RNA-DNA-Hybrides bewirkt wird; (b) Bilden eines einzelsträngigen DNA-Fragments durch Hydrolysieren der von der biologischen Art abgeleiteten RNA des RNA-DNA-Hybrids mit Ribonuclease H; (c) Synthetisieren eines DNA-Fragments, das komplementär zum einzelsträngigen DNA-Fragment ist, mittels DNA-abhängiger DNA-Polymerase vom anderen Oligonucleotid unter Verwendung des einzelsträngigen DNA-Fragments als Matrize, wodurch die Bildung eines doppelsträngigen DNA-Fragments bewirkt wird, das eine Promotorsequenz hat, die in der Lage ist, Transkription von RNA als Teil der RNA der biologischen Art oder von RNA, die komplementär zu einem Teil davon ist, durchzuführen; (d) Bilden eines RNA-Transkriptionsprodukts von der doppelsträngigen DNA unter Verwendung von RNA-Polymerase; und (e) Wiederholen der Schritte von (a) bis (d) unter Verwendung des RNA-Transkriptionsprodukts als Matrize.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Sonde in der Lage ist, komplementäres Binden mit zumindest einem Teil der Sequenz des DNA-Transkriptionsprodukts oder RNA-Transkriptionsprodukts durchzuführen, das durch die Amplifikation gebildet wurde, um das Fluoreszenzmerkmal im Vergleich mit dem Fall, in dem der Komplex nicht gebildet wird, zu verändern.
Verfahren zum Feststellen der Genexpressionsregion in einer beliebigen Region eines Genoms oder des gesamten Genoms, das das wiederholte Ausführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.