DE3855064T2

DE3855064T2 - Selektive Amplifikation von Oligonukleotiden-Zielsequenzen

Info

Publication number: DE3855064T2
Application number: DE3855064T
Authority: DE
Inventors: John Charles Boothroyd; Lawrence James Burg; Philippe Jacques Pouletty
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1987-07-31
Filing date: 1988-08-01
Publication date: 1996-08-29
Anticipated expiration: 2008-08-02
Also published as: KR890701764A; JPH02501532A; WO1989001050A1; US5437990A; EP0310229A1; IE72468B1; JP2774121B2; DE3856455T2; PT88168A; FI891436A; ES2086298T3; KR960013577B1; ATE135053T1; DE3856455D1; DK153289A; EP0682120A1; PT88168B; EP0310229B1; US6410276B1; EP0682120B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifif Diagnose-Assays, mit denen das Vorhandensein eines bestimmten Gens nachgewiesen wird, und zwar entweder zum Nachweis bzw. zur Bestimmung des Gens selbst oder des das Gen enthaltenden Organismus, und betrifft insbesondere Techniken, bei denen die Anzahl der Kopien des nachzuweisenden bzw. zu bestimmenden Gens vor dem Ermittlungsverfahren enzymatisch erhöht wird. Weiters betrifft sie jedes beliebige Verfahren, das die Erzeugung vieler Kopien einer spezifischen Polynukleotidsequenz erfordert.
Es ist eine Anzahl von Diagnose-Assays entwickelt worden, die auf dem Nachweis des Vorhandenseins einer bestimmten DNA- oder RNA-Sequenz als Indikator für das Vorhandensein eines Analyten, z.B. eines Bakteriums, Virus oder genetischen Defekts, in einer Probe basieren. In manchen Fällen ist das Diagnose-Gen in ausreichenden Mengen vorhanden, um es direkt, sei es durch Hybridisierung, Umsetzung mit einem spezifischen Antikörper oder durch ein anderes Verfahren zu ermitteln. Wenn das interessierende Gen jedoch in einer kleinen Menge vorhanden ist oder der durch in der Probe vorhandene ähnliche Sequenzen verursachte Hintergrund hoch genug ist, ist der zuverlässige und empfindliche Nachweis bzw. Bestimmung des Target-Gens schwierig. Ein nicht eindeutiges Ergebnis ist bei einem Diagnosetest nicht zufriedenstellend.
Es sind verschiedene Techniken zur Erhöhung der Empfindlichkeit und Spezifität solcher Diagnoseverfahren entwickelt worden. Die Verstärkung des Targets durch Zellkultur, eine effiziente, aber zeitaufwendige Technik, war lange Zeit über das einzige zuverlässige Verfahren. Andere Techniken erhöhen die Empfindlichkeit des Nachweisbzw. Bestimmungssystems unter Verwendung empfindlicher Reporter-Gruppen, die an der Sonde befestigt sind, die mit dem Target kombinieren wird. Beispiele für empfindliche Reporter-Gruppen sind radioaktive und fluoreszierende Moleküle. An die Sonde gekoppelte Enzyme, wie z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, verbessern die Empfindlichkeit durch ihre katalytische Wirkung auf Substratchromophore ebenfalls. Eine erhöhte Empfindlichkeit kann auch durch eine Verstärkung der Reporter-Gruppen erzielt werden. Eine solche Verstärkung ist durch Avidin-Biotin-Wechselwirkungen, Netzwerkbildung mit Nukleinsäuren oder die direkte enzymatische Replikation einer RNA-Reporter-Gruppe erreicht worden. Diese letztere Technik erzeugt bis zu 1.000.000 Kopien der RNA in etwa 12 Minuten. Bei einer weiteren Technik werden nicht die im Nachweis- bzw. Bestimmungssystem verwendeten Reporter-Gruppen, sondern die Target-Nukleinsäuresequenz verstärkt.
Ein Verfahren zur Verstärkung der Target-Nukleinsäure ist als Polymerase- Kettenreaktions- oder PCR-Technik bekannt und ist entwickelt worden, um die für genetische Defekte verantwortlichen Gene zu ermitteln. Bei diesem Verfahren werden spezifische Oligonukleotidprimer in wiederholten Zyklen von Target-DNA- Denaturierung, Primer-Annelierung und Extension mit einer DNA-Polymerase verwendet. Von einem Primer erzeugte Extensionsprodukte dienen als zusätzliche Targetsequenzen für den anderen Primer. Der Verstärkungsgrad einer Targetsequenz wird durch die Anzahl der durchgeführten Zyklen gesteuert und theoretisch durch die einfache Formel 2" berechnet, worin n die Anzahl der Zyklen ist. In Anbetracht der Tatsache, daß die durchschnittliche Effizienz pro Zyklus im Bereich von etwa 65% bis 85% liegt, sind 25 Zyklen erforderlich, um 0,3 bis 4,8 Millionen Kopien der Targetsequenz zu ergeben.
Die Polymerase-Kettenreaktion ist zwar ein sehr empfindliches und vielversprechendes Verfahren, diese Technik unterliegt aber einigen Einschränkungen und weist Nachteile aut. Beispielsweise liefert jeder Zyklus der Polymerase-Kettenreaktion bestenfalls nur eine 2-fache Verstärkung, und daher ist eine höhere Anzahl an Zyklen (zwischen 20 und 30) erforderlich, um wesentliche Verstärkung zu erreichen. Weiters inaktiviert die Hochtemperatur-Denaturierung, die bei jedem PCR-Zyklus stattfindet, typischerweise das verwendete Enzym. und macht daher die wiederholte Zugabe von teurem Enzym notwendig.
Demgemäß wären Techniken, die die Rate der Genverstärkung erhöhen (wodurch weniger Enzym und weniger Zyklen erforderlich sind) in hohem Maße vorteilhaft für alle Diagnosetechniken, die den Nachweis bzw. die Betimmung einer spezifischen Target-Nukleotidsequenz umfassen, und ledes beliebige andere Verfahren, bei dem eine erhöhte Anzahl spezifisch verstärkter Polynukleotide (RNA oder DNA) erforderlich ist.
Das PCR-Verfahren wird in einer Anzahl von Veröffentlichungen beschrieben, unter anderem Saiki et al, "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis of sickle cell anemia", Science (1985) 230:1350-1354; Saiki et al, "Analysis of enzymatically amplified beta-globin and HLA-DQ alpha DNA with aliele-specific oligonudeotide probes", Nature (1986) 324:163-166; und Scharf et al, "Direct doning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic sequences", Science (1986) 233:1076-1078. Siehe auch die am 10. Dezember 1986 veröffentlichte Europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 0,200,362 A2 (Anmeldung Nr. 86302298.4), die Priorität von drei US-Patentanmeldungen beansprucht: die am 28. März 1985 eingereichte Seriennummer 716,975, die am 10. Oktober 1985 eingereichte Seriennummer 791,308 und die am 7. Februar 1986 eingereichte Seriennummer 828,144.
Ein enzymatischer Zyklus zur Vervielfachung von Polynukleotiden wird in der WO-A- 8810315 geoffenbart, die Prioritäten von 19. juni1987 und 6. juni 1988 beansprucht. Jedoch wird in dieser Veröffentlichung keine Erhöhung der RNA-Kopienanzahl durch mehrfache Transkriptionsverstärkungszyklen geoffenbart.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Vervielfachung der Anzahl an Kopien einer Target-Folynukleotid-Sequenz in einem Reaktionsmedium zu Nachweis- bzw. Besti mmungszwecken bereit, welches folgende Schritte umfaßt:
(A) das Hybridisieren eines einstrangigen Target-Polynukleotidmoleküls mit einer ersten Primersequenz, gefolgt von der Extension der ersten Primersequenz, um ein Extensionsprodukt des ersten Primers zu bilden, und Zur-Verfügung-Stellen des Extensionsproduktes des ersten Primers zur Hybridisierung mit einem zweiten Primer, wobei zumindest einer von dem ersten und zweiten Primer eine Promotorsequenz enthält, sowie die Extension des zweiten Primers und, wenn notwendig, des Extensionsproduktes des ersten Primers, um ein erstes doppelstrangiges DNA- Zwischenprodukt zu erzeugen, das eine erste Promotorsequenz stromauf der Targetsequenz aufweist;
(B) das Züchten mehrfacher RNA-Kopien der Targetsequenz aus dem Zwischenprodukt unter Verwendung einer RNA-Polymerase, die zur Bindung des Promotors fähig ist;
(C) das Herstellen eines zweiten doppelstrangigen DNA-Zwischenprodukts, das das gleiche wie das erste doppelstrangige DNA-Zwischenprodukt oder davon verschieden sein kann und eine zweite Promotorsequenz stromauf der Targetsequenz aufweist, welche zweite Promotorsequenz die gleiche wie die des ersten doppelstrangigen DNA- Zwischenproduktes oder davon verschieden sein kann, aus den RNA-Kopien durch Hybridisieren der RNA-Kopien mit einer dritten Primersequenz, gefolgt von der Extension des dritten Primers, um ein Extensionsprodukt des dritten Primers zu bilden, und das Zur-Verfügung-Stellen des Extensionsproduktes des dritten Primers zur Hybridisierung mit einem vierten Primer, wobei zumindest einer von dem dritten und vierten Primer die zweite Promotorsequenz enthält, und worin der dritte und vierte Primer die gleichen wie die ersten und zweiten Primer oder davon verschieden sein können, und die Extension des vierten Primers und, falls erforderlich, des [xtensionsproduktes des dritten Primers, um das zweite doppelstrangige DNA- Zwischenprodukt zu erzeugen;
(D) das Züchten vielfacher RNA-Kopien aus dem zweiten doppelstrangigen DNA Zwischenprodukt unter Verwendung einer RNA-Polymerase, die zur Bindung des zweiten Promotors fähig ist;
(E) das Herstellen eines weiteren doppelstrangigen DNA-Zwischenprodukts, das eine weitere Promotorsequenz stromauf der Targetsequenz aufweist, welcher weitere Promotor der gleiche wie jener des ersten und des zweiten doppelstrangigen DNA- Zwischenprodukts oder davon verschieden sein kann, aus den RNA-Kopien von dem zweiten doppelstrangigen DNA-Zwischenprodukt durch Hybridisieren der RNA-Kopien mit einer weiteren Primersequenz, gefolgt von der Extension des weiteren Primers, um ein Extensionsprodukt des weiteren Primers zu bilden, und das Zur-Verfügung-Stellen des Extensionsproduktes des weiteren Primers zur Hybridisierung mit einem anderen Primer, wobei zumindest einer aus dem weiteren und dem anderen Primer eine Promotorsequenz enthält, und die Extension des anderen Primers und, wenn notwendig, des Extensionsproduktes des weiteren Primers, um das weitere doppelstrangige DNA-Zwischenprodukt zu bilden, worin der weitere und der andere Primer die gleichen wie der erste und der zweite sowie der dritte und der vierte Primer oder davon verschieden sein können.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt daher eine Technik bereit, die die Anzahl der Kopien einer in einer Probe vorhandenen Target-Polynukleotid-Sequenz viel rascher in vitro vervielfacht als Verfahren nach dem Stand der Technik. Das Verfahren wird in einer spezifischen Ausführungsform auf ein Diagnose-Assay für Toxoplasma gondii angewandt.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung besser verstanden werden, wenn diese in Kombination mit der Zeichnung betrachtet wird, die einen Teil der Patentschrift bildet, in der: die Fig. 1-9 ein schematisches Diagramm sind, das Polynukleotide zeigt, die in verschiedenen Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens vorhanden sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Vervielfachen der Kopienanzahl einer Target-Polynukleotid-Sequenz bereit und ist daher besonders nützlich bei Diagnoseassays, bei denen spezifische Polynukleotidsequenzen erkannt werden sollen, die in kleinen Mengen in einer Probe vorhanden sind. Sie ist auch bei jedem beliebigen Verfahren nützlich, das von der raschen Erzeugung von Polynukleotiden einer spezifischen Sequenz profitiert.
Die Target-Polynukleotid-Sequenz kann nur ein Bruchteil eines größeren Moleküls sein oder kann zu Beginn als diskretes Molekül vorhanden sein, sodaß die spezifische Sequenz die gesamte Nukleinsäure darstellt. Es ist nicht notwendig, daß die Targetsequenz, die zu verstärken ist, zu Beginn in einer reinen Form vorhanden ist. Sie kann ein kleiner Bruchteil eines komplexen Gemisches sein, wie z.B. ein Teil einer Nukleinsäuresequenz aufgrund eines bestimmten Mikroorganismus, der nur einen kleinen Bruchteil einer bestimmten biologischen Probe darstellt, die analysiert wird.
Das Polynukleotide enthaltende Ausgangs-Reaktionsgemisch kann mehr als eine Targetsequenz enthalten, wenn das gewünscht wird. Daher ist das vorliegende Verfahren nicht nur zur Herstellung großer Mengen einer spezifischen Target- Polynukleotid-Sequenz, sondern auch zur gleichzeitigen Verstärkung mehr als einer unterschiedlichen Targetsequenz nützlich, die sich am gleichen oder an anderen Polynukleotidmolekülen befindet. Wenn mehr als eine Targetsequenz vorhanden ist, besteht die einzige erforderliche Modifikation der vorliegenden Erfindung darin, (nachstehend erörtert) Primer für jede der gewünschten Targetsequenzen bereitzustellen.
Nach dem vorliegenden Verfahren kann jede beliebige spezifische Target- Polynukleotid-Sequenz verstärkt werden. Es ist nur notwendig, daß eine ausreichende Zahl von Nukleotiden an beiden Enden der Sequenz in ausreichendem Detail bekannt ist, sodaß zwei Oligonukleotidprimer hergestellt werden können, wie nachstehend beschrieben. Je größer das Wissen über die Basen an beiden Enden der Sequenz ist, desto größer kann die Spezifität der Primer für die Targetsequenz sein, und somit umso größer die Effizienz des Verfahrens. Es versteht sich, daß das Wort Primer, wie hierin verwendet, sich auf mehr als einen Primer beziehen kann, insbesondere in dem Fall, daß es eine gewisse Mehrdeutigkeit in der Information hinsichtlich der terminalen Sequenz oder Sequenzen des zu verstärkenden Targets gibt. Wenn beispielsweise eine Nukleinsäuresequenz aus einer bekannten Proteinsequenz gefolgert wird, wird für jeden Strang eine Sammlung von Primern verwendet, die Sequenzen enthalten, die alle möglichen Codonvariationen auf Basis der Degeneration des genetischen Codes darstellen. Ein Primer aus dieser Sammlung ist homolog mit dem Ende der Targetsequenz.
Bei dem Verfahren wird damit begonnen, ein doppelstrangiges Polynukleotid- Zwischenprodukt herzustellen, das die Targetsequenz enthält und zusätzlich einen stromauf von der Targetsequenz angeordneten Promotor enthält. Dieses doppelstrangige Zwischenprodukt wird mit einer Reihe von Schritten unter Einsatz kurzer Oligonukleotide als Primersequenzen und Extension der Primer hergestellt, wobei der längere Polynukleotidstrang, an den sich der Primer bindet, als Schablone verwendet wird. Der komplementäre Targetstrang wird in einem einstrangigen Zustand erhalten (wenn er nicht bereits in dieser Form vorliegt), und wird mit einer 0ligonukleotidsequenz hybridisiert, die eine Promotorsequenz stromauf von einer Bindungssequenz enthält, die zu einem Bereich im komplementären Strang beim oder nahe dem 3'-Ende des Targetbereichs im komplementären Strang komplementär ist. Die Bindungssequenz in diesem Primer ist im wesentlichen äquivalent einer Sequenz im Target-Polynukleotid-Molekül, das 5' zur spezifischen Targetsequenz, die kopiert wird oder am 5'-Ende der Targetsequenz zu finden ist. Dieser Primer wird verwendet, um die Synthese eines DNA-Moleküls zu initiieren, wobei eine DNA-Polymerase (wie z.B. Umkehrtranskriptase) im gleichen Sense wie der ursprüngliche Targetstrang verwendet wird.
Ein zweites Oligonukleotid wird dann mit diesem neu synthetisierten Strang hybridisiert. Dieser zweite Oligonukleotidprimer ist komplementär zu einem Bereich, der dem 3'-Ende des Targetmoleküls entspricht. Die Anzahl der Nukleotide zwischen den Primerbereichen ist vorzugsweise geringer als 300, mehr bevorzugt geringer als 200, aber größer als 10, mehr bevorzugt größer als 15. Wenn der zweite Primer verlängert wird, wird eine Kopie der Targetsequenz und des ersten Primers gebildet. Das resultierende Produkt enthält daher den Promotorbereich 5' zur Targetsequenz, der das Ziel dieses ersten Teils des erfindungsgemäßen Verfahrens ist.
Das Promotor enthaltende doppelstrangige Polynukleotid-Zwischenprodukt wird dann als Schablone für eine DNA-abhängige RNA-Polymerase verwendet, die fähig ist, sich an den Promotorbereich zu binden, der in dem Zwischenprodukt erzeugt worden ist. Das Polymeraseenzym kopiert die Targetsequenz, wodurch mehrfache RNA-Kopien der Targetsequenz stromab vom Promotor bereitgestellt werden. Die erzeugte Kopienanzahl hängt vom Promotor, der verwendeten RNA-Polymerase und den Reaktionsbedingungen ab, aber 10 Kopien lassen sich leicht herstellen und 100 oder mehr Kopien können hergestellt werden, indem man starke Promotoren, aktive RNA- Polymerasen und geeignete Reaktionsbedingungen auswählt.
Jede der RNA-Kopien kann als Schablone für die Herstellung zusätzlicher Kopien des spezifischen Targets verwendet werden. Umsetzung mit dem oben verwendeten zweiten Oligonukleotid, Extension des Primers, sodaß die komplementäre Sequenz entsteht, Umsetzung mit dem ersten Primer und Extension des resultierenden Hybrids in beide Richtungen (wobei der erste Primer als Primer für die Herstellung der Targetkopie agiert und der 3'-Terminus des komplementären Stranges als Primer agiert, sodaß eine Kopie des Promotorbereichs gemacht wird) erzeugt ein oben beschriebenes ähnliches doppelstrangiges Promotor enthaltendes Zwischenprodukt, das als Schablone zur Herstellung von RNA-Kopien verwendet wurde. RNA erzeugende Zyklen unter Einsatz der vom Promotor abhängigen RNA-Polymerase können dann wiederholt werden. Wenn nur 10 RNA-Kopien pro Zyklus erzeugt werden, erzeugen drei Zyklen eine 1000- fache Zunahme der Anzahl der im Reaktionsmedium vorhandenen Targetsequenzen. Wenn pro Schablone 100 RNA-Kopien erzeugt werden, werden durch drei Zyklen 1 Million Kopien der Targetsequenz erzeugt.
Das oben beschriebene Verfahren geht vom Vorhandensein entweder eines doppelstrangigen Target-Polynukleotids, das einen Targetstrang und einen zum Targetstrang komplementären Strang umfaßt, oder vom Vorhandensein eines komplementären Targetstranges aus, wenn das ursprüngliche Target ein einstrangiges Polynukleotid ist, wie z.B. RNA. Wenn das Target ursprünglich einstrangige RNA oder DNA ist, kann der komplementäre Targetstrang ähnlich dem oben beschriebenen unter Verwendung eines Oligonukleotidprimers hergestellt werden. Beispielsweise ist der oben beschriebene zweite Oligonukleotidprimer zu einem Bereich komplementär, der dem 3'-Ende des Targetmoleküls entspricht. Dieser zweite Oligonukleotidprimer oder ein anderer Primer, der zu einem anderen Bereich 3' zur Targetsequenz komplementär ist, kann verwendet werden, um den im ersten Schritt des Verfahrens verwendeten komplementären Strang herzustellen. Eine weitere Variation besteht darin, mit dem Oligonukleotidprimer zu beginnen, der zum Target- (und nicht zu seinem komplementären) Strang komplementär ist. Der die Promotorsequenz enthaltende Primer wird dann mit dem komplementären Strang hybridisiert, der sich vom ersten Primer erstreckt.
Die Oligonukleotidprimer sind so ausgewählt, daß sie "im wesentlichen" komplementär zu den verschiedenen Strängen einer jeden zu verstärkenden spezifischen Sequenz sind. Das bedeutet, daß die Primer ausreichend komplementär sein müssen, um mit ihren jeweiligen Strängen zu hybridisieren. Die Primersequenz muß daher nicht die exakte Sequenz der Schablone widerspiegeln, an die sie sich bindet. Beispielsweise kann ein nicht-komplementäres Nukleotidfragment am 5'-Ende des Primers befestigt sein, wobei der Rest der Primersequenz zum Schablonenstrang komplementär ist. Sel bstverständl ich ist, wie oben beschrieben, ein solches nicht-komplementäres Nukleotidfragment eine Promotorsequenz, wie sie die Erfindung erfordert. Aber auch wenn eine Promotorsequenz nicht vorhanden ist, können andere nicht-komplementäre Nukleotidfragmente angefügt werden. Beispielsweise kann eine Sequenz bereitgestellt werden, die eine Restriktionsendonuklease-Spaltungsstelle bereitstellt, um die Herstellung von verstärkten Targetsequenzen zuzulassen, die die zum Einfügen in ein Plasmid bereit sind. Alternativ dazu kann die Bindungssequenz des Primers mit nichtkomplementären Basen durchsetzt werden, vorausgesetzt, die Primersequenz weist ausreichende Komplementarität mit der Sequenz des zu verstärkenden Stranges (oder seinem komplementären Strang) auf, um damit zu hybridisieren und eine Schablone zur Synthese des Extensionsproduktes zu bilden. Beispielsweise kann ein einzelnes Nukleotid in einem Primer mit mäßiger Länge (z.B. etwa 15 Nukleotide) ersetzt werden, um eine spezifische Restriktionsendonuklease-Spaltungsstelle bereitzustellen.
Wenn gewünscht, können Promotorsequenzen in beide Primer aufgenommen werden, um die Anzahl der von einem vollständigen Zyklus erzeugten Kopien weiter zu vervielfachen.
Die Funktionsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens ist unter Bezugnahme auf die Figuren und die folgende ausführlichere Beschreibung leicht zu erkennen. Für die in der Figur und der nachstehenden Erörterung dargestellten schematischen ein- und doppelstrangigen Polynukleotide wird die Standard-Nomenklatur und Ausrichtung verwendet. Das linke Ende des oberen Stranges der doppelstrangigen Polynukleotide ist das 5'-Ende, wobei das rechte Ende des gleichen Stranges das 3'-Ende ist (wie durch Pfeispitzen angegeben). Da komplementäre Stränge entgegengesetzte Ausrichtungen haben, wird der untere Strang mit seinem 3'-Ende nach links und seinem 5'-Ende nach rechts gezeigt. Um Verwechslung zu vermeiden, wird der untere Strang auch dann in dieser Ausrichtung gezeigt, wenn er nicht als Teil eines doppelstrangigen Polynukleotids gezeigt wird. Dieselbe Vorgangsweise gilt auch für im Text (einschließlich der Ansprüche) dargelegte Sequenzen, bei denen die verschiedenen Sequenzen mit Buchstaben und Zahlen identifiziert sind. Es werden nicht alle Produkte einer jeden Stufe des Verfahrens gezeigt; nur die für die vorliegende Erfindung relevanten werden dargestellt.
In der ersten Figur ist ein doppelstrangiges Target-Polynukleotid-Molekül zu sehen, das eine Reihe von Bereichen umfaßt, die in Hinblick auf die Arbeitsvorgänge definiert sind, die an diesem Molekül in späteren Stufen vorgenommen werden. Wie bereits erörtert, wird ein doppelstrangiges Target für den ersten Schritt gemacht, wenn das ursprüngliche Target ein einstrangiges RNA- (oder DNA-) Molekül ist. Am 5'-Ende des Polynukleotids befindet sich ein als X1 identifiziertes Segment, das in späteren Arbeitsgängen nicht kopiert wird. Dem folgt ein Segment von Sequenz P1, das einen Teil der Sequenz eines in einer späteren Stufe verwendeten Primers umfaßt. Auf Sequenz P1 folgt eine Targetsequenz T, wobei es sich um die Sequenz handelt, die kopiert wird. Eine Sequenz P2, die sich mit einem anderen Primer verbindet, ist am 3'-Ende von T vorhanden. Zusätzliche Nukleotide können nach P2 vorhanden sein, werden aber nicht kopiert. Diese Nukleotide sind in der Figur mit X2 bezeichnet. Weder X1 noch X2 sind für die Arbeitsweise/Ablauf der vorliegenden Erfindung erforderlich, und sind daher wahlweise vorhanden, wobei die Anzahl von 0 bis zu vielen hunderten oder sogar tausenden Nukleotiden reicht. Die apostrophierte oder "primäre" Bezeichnung weist auf die auf dem gegenüberliegenden Strang vorhandene komplementäre Sequenz hin. Dieses doppel strangige Targetmolekül wird in Gegenwart eines Oligonukleotidprimers denaturiert und die Bedingungen dann geändert, um ein Annelieren des Oligonukleotids und Targetrs, wie in Zeile 2 gezeigt, zuzulassen.
Fig. 2 zeigt einen ersten Oligonukleotidprimer PR-P1 mit komplexer Struktur, der aber die Sequenz P1 an seinem 3'-Ende, an das P1'-Segment des denaturierten Targetmoleküls hybridisiert, umfaßt. Der 5'-Abschnitt dieses Oligonukleotidprimers, PR, enthält eine Sequenz, die in ihrer doppelstrangigen Form einen funktionalen Promotor für eine RNA-Polymerase enthalten könnte. Die Sequenz PR kann zusätzliche Nukleotide enthalten, ohne daß die Erfindung negativ beeinflußt wird. Der PR-P1- Primer wird durch ein geeignetes Enzym (entweder eine DNA-abhängige DNA- Polymerase für ein DNA-Target, oder eine RNA-abhängige DNA-Polymerase für ein RNA und/oder DNA-Target) um einen Strang PR-P1-T-P2-X2 bereitzustellen, wie in Fig. 3 gezeigt. Die einstrangige Beschaffenheit des Promotorbereichs ist in den Figuren durch das Fehlen von Kontakt zwischen den beiden Strängen in diesem Bereich und im Text auf die folgende Weise dargestellt:
Dieser (und andere) erfindungsgemäße Primer sind vorzugsweise relativ kurz, nämlich 50 oder weniger Nukleotide, um die rasche Hybridisierung (Annelierung) und Zyklisierung, insbesondere mit automatischer Ausrüstung, zu ermöglichen.
Nach dem Denaturieren des in Fig. 3 gezeigten doppelstrangigen Polynukleotids wird dem Gemisch unter Annelierungsbedingungen, wie in Fig. 4 gezeigt, ein zweiter Primer der Sequenz P2' zugegeben. Sequenz P2' ist zu der zuvor identifizierten Sequenz P2' äquivalent und ist selbst komplementär zum P2-Segment von PR-P1-T-P2-X2.
Fig. 5 zeigt das durch Extension der Primersequenz P2' auf der gezeigten Schablone erhaltene Produkt. Der Promotorbereich ist in dieser Stufe nun doppelstrangig, und kann daher zur Bindung an eine DNA-abhängige RNA-Polymerase verwendet werden. Im Text ist dieses doppelstrangige Zwischenprodukt wie folgt geschrieben:
PR-P1-T-P2-X2
PR'-P1'T'-P2'
Die von der RNA-Polymerase erzeugten Kopien werden in Fig. 6 gezeigt. Die kopierten Segmente, die sich alle stromab vom Promotorbereich befinden, sind mit P1R-TR-P2R (das hochgestellte R steht für eine RNA-Kopie) bezeichnet. Dieses RNA-Molekül kann das gleiche wie oder etwas länger oder kürzer als P1-T-P2 sein, da es die gesamte Sequenz PR-P1 am und nach dem anfänglichen Nukleotid enthält, das von der RNA- Polymerase kopiert wird. Wenn der ursprüngliche Targetstrang ein einstrangiges DNA- Target ist, ist P1R-TRP2R das RNA-Äquivalent der ursprünglichen DNA plus eines jeden beliebigen Abschnitts des von der RNA-Polymerase kopierten promotorhältigen Segments PR oder minus jeglicher nicht von der Polymerase kopierter Nukleotide.
Wenn die RNA-Kopien für zusätzliche Verstärkung zu recyclen sind, werden die zuvor erörterten Schritte zur Herstellung der promotorhältigen doppelstrangigen Zwischenprodukt-DNA wiederholt. Es ist nicht notwendig, die gleichen Primersegmente P1 und P2' oder das gleiche Promotorsegment PR zu verwenden, obwohl PR-P1 und P2' bereits zur Verfügung stehen und ohne Modifikation verwendet werden können. Wenn andere Primersequenzen verwendet werden, sind die resultierenden Kopien etwas kürzer oder größer als die ersten Kopien, aber das hat keinen negativen Einfluß auf die Erfindung, es sei denn, es gibt eine spezielle Notwendigkeit oder einen speziellen Wunsch, die ursprüngliche P1-T-P2-Sequenz beizubehalten. Das anfängliche Annelieren mit einem P2'-Primer, gefolgt von Extension des Primers, ergibt das in Fig. 7 gezeigte Produkt. Die Denaturierung des doppelstrangigen Zwischenprodukts und das Annelieren mit dem Primer PR-P1 ergibt das in Fig. 8 gezeigte Produkt. Dieses Zwischenprodukt kann in beide Richtungen verlängert werden, da die P1-Sequenz als ein Primer agiert, wobei der komplementäre Strang als Schablone verwendet wird, und der komplementäre Strang als ein Primer wirkt, wobei die Sequenz PR als Schablone verwendet wird.
Wenn in diesem Schritt die gleichen Primer verwendet werden, wie sie in den durch die Fig. 1 bis 5 gezeigten Schritten verwendet wurden, ist das Produkt dem in Fig. 5 gezeigten ähnlich und unterscheidet sich nur im Ausmaß des oberen Stranges. Das hat keinen Einfluß auf jegliche nachfolgende RNA-Polymerisationen, da nur der untere, der Schablonen-Strang von der RNA-Polymerase verwendet wird. Wenn andere Primersequenzen verwendet werden, kann der resultierende Schablonenstrang je nach den verwendeten Primern größer oder kürzer sein. Vorausgesetzt, daß zumindest einer der in diesem Schritt verwendeten Primer an seinem 5'-Ende eine Sequenz aufweist, die einen Promotor für eine RNA-Polymerase darstellt, ist das resultierende Material immer noch zur weiteren Verstärkung fähig. Demgemäß kann das Promotor enthaltende doppelstrangige DNA-Zwischenprodukt von Fig. 9 mit DNA-abhängiger RNA- Polymerase verwendet werden, um.wieder vielfache RNA-Kopien zu erzeugen.
Wenn die anfänglich verwendeten Primer mit unbeabsichtigten Sequenzen im das Targetmolekül enthaltenden DNA-Gemisch hybridisieren, können Vorteile erzielt werden, indem andere Primer verwendet werden, wenn der Zyklus wiederholt wird. Wenn beispielsweise ein bestimmtes Targetnukleotid in einem rohen Analyten nachgewiesen wird, der viele Polynukleotidsequenzen enthält, wie z.B. wenn eine bakterielle oder parasitäre Infektion in einem/einer menschlichen Fluid- oder Gewebeprobe bestimmt wird, kann die Hybridisierung der Primeroligonukleotide mit Wirts-DNA zur Verstärkung unbeabsichtigter Wirtsequenzen führen. Da eine Promotorsequenz im verstärkten Hintergrundmaterial vorhanden ist, ist gemeinsam mit der Zunahme der Targetsequenz eine signifikante Zunahme der Menge einer spezifischen Hintergrundsequenz zu erkennen. Um dieses Problem zu vermeiden, können während verschiedener Zyklen verschiedene Primer und/oder Promotoren verwendet werden, um die Verstärkung des Hintergrunds zu verhindern. Beispielsweise kann im zweiten Zyklus ein anderer Bindungsbereich (P1X und/oder P2'X) verwendet werden, der in die Targetsequenz nahe des Bindungsbereichs des ursprünglichen Primers oder diesen Bindungsbereich überlappend fällt. Es kann zwar Bindung mit anderen Hintergrund-Polynukleotidsequenzen geben, deren Verstärkung nicht erwünscht wird, aber es ist unwahrscheinlich, daß das gleiche Hintergrundmaterial verstärkt wird. Die in aufeinanderfolgenden Schritten verwendeten Primer können als geschachtelter Primersatz beschrieben werden, wenn man dieser Ausführungsform der Erfindung folgt, da aufeinanderfolgende Primerpaare auf den komplementären Strängen des Targetmoleküls näher beieinander gefunden werden. Beim zweiten (und den darauffolgenden) Zyklus/Zyklen kann auch ein anderer Promotorbereich (z.B. PRX) eingesetzt werden, der sich an eine andere RNA-Polymerase bindet. Der Abbau der ersten in Lösung verbleibenden RNA-Polymerase, gefolgt vom Einbringen der zweiten Polymerase, die sich an PRX bindet, vervielfacht die Targetkopien, aber nicht die Hintergrundkopien, obwohl eine zusätzliche Gruppe von Hintergrundkopien entstehen kann. Außerdem können Primer von früheren Zyklen, die im Überschuß vorhanden sein können, wenn gewünscht entfernt. werden. Geeignete Techniken zum Entfernen von Primern basieren auf Eigenschaften, die sie vom Target unterscheiden, wie z.B. der Größe oder dem Vorliegen der Primer als einstrangige DNA, wenn das Target als doppelstrangige DNA oder als RNA vorhanden ist. Beispielsweise werden durch Gelchromatographie kleine Primer von größeren Targets entfernt, während durch spezifische Nukleasen oder Antikörper Primer von doppelstrangigen Targets entfernt werden.
Als Beispiel zur Verwendung entweder des geschachtelten Primersatzes oder verschiedener Primer mit verschiedenen Promotoren sei angenommen, daß in einem ersten Verstärkungszyklus die gewünschte Targetsequenz mit dem Faktor 50 multipliziert wird. Gleichzeitig tritt Bindung der Primer an eine Hintergrundsequenz auf, sodaß die Hintergrundsequenz ebenfalls mit einem Faktor 50 multipliziert wird. Wenn beim zweiten Verstärkungszyklus verschachtelte Primer verwendet werden, und wieder eine 50-fache Vervielfachung auftritt, wird die Targetsequenz mit 2500 multipliziert, während (schlechtestenfalls) zwei Hintergrundsequenzen jeweils mit 50 multipliziert werden. Nach drei Zyklen mit verschachtelten Primern ist der Ylultiplikationsfaktor für das Target 125.000 bei (schlechtestenfalls) drei mit 50 multiplizierten Hintergrundsequenzen.
Die einzelnen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind alle herkömmlich und können unter Verwendung bekannter Reagenzien und Techniken durchgeführt werden. Die einzigen speziell konstruierten Reagenzien sind die Primer PR-P1 und P2'. Diese Segmente können jedoch entweder durch gänzliche Synthese oder Isolierung der gewünschten Sequenzen aus natürlichen Quellen leicht erhalten werden. Die gänzliche Synthese wird am leichtesten durchgeführt, wenn die Sequenzen P2 (und demgemäß ihre komplementäre Sequenz P2') und P1 im Targetmolekül bekannt sind. Die gänzliche Synthese von DNA-Segmenten, die Promotorsequenzen enthalten, wird am einfachsten erreicht, da Promotorsequenzen selbst veröffentlicht worden sind. Wenn die Sequenz des Targetmoleküls nicht bekannt ist, kann das Targetmolekül durch Restriktionsendonukleasen oder andere Verfahren und Segmente segmentiert werden, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung ausgewählt werden. Die RNA- Polymerase und die ihr zugeordnete Promotorsequenz können aus den zahlreichen verfügbaren Quellen dieser Komponenten ausgewählt werden. Beispielsweise ist T7 RNA-Polymerase vom T7-Bakteriophagen von New England Biolabs erhältlich. Andere RNA-Polymerasen sind z.B. SP6 vom Bakteriophagen SP6, das von New England Biolabs erhältlich ist, oder K-12 von E.coli-Stamm K-12, das von der Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri erhältlich ist. Die entsprechenden Promotoren können von dem Organismus isoliert werden, von dem die Polymerase erhalten wird, oder chemisch synthetisiert werden, wenn die Promotorsequenz bekannt ist.
Andere beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte biochemische Reagenzien sind z.B. ein Enzym, das fähig ist, Primersequenzen zu verlängern, um doppelstrangige Polynukleotide zu bilden. Solche Enzyme sind z.B. Umkehrtranskriptase und andere DNA-Polymerasen. Besonders bevorzugte Enzyme sind AMV-Umkehrtranskriptase von Lifescience Inc. oder Polymerase 1 (Klenow-Fragment) von Bethesda Research Laboratories, Pharmacia, U.S. Biochemicals or Biolabs.
Die einzelnen Schritte der vorliegenden Erfindung sind leicht der Automatisierung anpaßbar. Die Umsetzungen können in einem einzigen Behälter durchgeführt werden, indem der Reihe nach Reagenzien zugegeben und die Bedingungen je nach Notwendigkeit geändert werden. Denaturierungsbedingungen umfassen im allgemeinen erhöhte Temperaturen, insbesondere Temperaturen im Bereich von 95 bis 100ºC. Annelieren und Primer-Extension finden bei niedrigeren Temperaturen, typischerweise 35 bis 50ºC, statt. Da viele Proteine gemeinsam mit den Polynukleotiden bei den angegebenen höheren Temperaturen denaturiert werden, können zusätzliche Proteine zugegeben werden, wie erforderlich. Andere vorhandene Reagenzien können Puffer umtassen, um die Reaktion beim richtigen pH-Wert und den richtigen Ionenbedingungen zu halten, sowie Mononukleotidtriphosphate (eventuell markiert oder modifiziert, um ein nachweisbares Signal zu liefern) zur Verwendung bei den Extensionsreaktionen.
Wenn hohe Temperaturen eingesetzt werden, um doppelstrangige Polynukleotide zu denaturieren, ist es nicht notwendig, Reagenzien oder Lösungen zu trennen. Andere Denaturierungsbedingungen, wie z.B. die Verwendung von Lösungsmitteln, sind aufgrund der hinzugefügten Trennschritte beim Übergehen von Annelierungs- zu Denaturierungsbedingungen und zurück zu Annelierungsbedingungen weniger wünschenswert. Jedoch sind zahlreiche Denaturierungs-, Annelierungs- und Extensionsbedingungen bekannt, und können eingesetzt werden, wenn das gewünscht wird.
Die vielfachen Kopien der Targetsequenz können auf zahlreiche Arten verwendet werden. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden, um vielfache Kopien eines Gens zum Einfügen in ein Plasmid oder ein anderes Target eines Gen-Engineering-Verfahrens herzustellen. Wenn es in einem Diagnose-Assay für die Targetsequenz verwendet wird, kann der Nachweisschritt (Hybridisieren mit einer Sonde, Umsetzen mit einem Antikörper oder einem spezifischen Liganden) durchgeführt werden, ohne das verstärkte Target vom Reaktionsmedium zu isolieren, wenn die Target-Sonde, der Target-Antikörper oder der Target-Ligand innerhalb der Sequenz T liegt, d.h. keinen Teil der Primer- oder Promotorbereiche umfaßt. Eine Target-Sonde innerhalb der Bereiche P1 Lind P2 kann ausgewählt werden, aber die Abtrennung der Targetgenkopien (P1-T-P2 oder P1R-TR-P2R) wäre erforderlich, um die Bindung an oder Störung durch Primermoleküle zu vermeiden. Markierte Ribosidtriphosphate (z.B. radioaktive Markierungen, Biotin oder Avidin-Markierungen) können auch in Schritten verwendet werden, in denen RNA erzeugt wird. Zusätzliche Einsatzgebiete der durch die vorliegende Erfindung erzeugten Polynukleotidprodukte sind z.B. Mutagenese, Gen-Engineering und Klonieren, genetische Analyse, Therapie (sowohl Gen- als auch Chemotherapie), die Erzeugung von Protein (sowohl in vitro- Translation als auch Einfügen in Zellen) und jegliche andere Verfahren, die von vielfachen Kopien spezifischer Polynukleotidsequenzen profitieren. Beispielsweise können RNA-Regulierungsmoleküle in großen Mengen erzeugt werden.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben worden ist, sei zu ihrem besseren Verständnis auf die folgenden detaillierten Beispiele bezuggenommen, die nur dem Zweck der Veranschaulichung dienen und die Erfindung nicht einschränken sollen.

BEISPIEL

Die erfindungsgemäßen Techniken wurden unter Verwendung eines klonierten Gens von Toxoplasma gondii, insbesondere des als Gen B1 identifizierten 35-fachen repetitiven Antigen-Gens, bewertet. Das angegebene Gen wurde von einer rekombinanten DNA-Sammlung erhalten, die Einfügungen von genomischer DNA von T. gondii (RH-Stamm) enthält. Die Sammlung wurde im Expressionsvektor λ-gt11 konstruiert und wurde mit Antiseren von einem immunisierten Kaninchen gescreent. So identifizierte Rekombinanten wurden subkloniert und weiter charakterisiert. Es wurde herausgefunden, daß das bei diesen Untersuchungen verwendete Targetgen Teil einer 2,2 kb-Einheit ist, die im Genom von T.gondii in Tandemanordnung oft wiederholt ist. Die Identifikations- und Restriktionskarte dieses Gens sind veröffentlicht worden (Boothroyd et al, "Antigen and Tubulin Genes of Toxoplasma Gondii", in "Molecular Strategies of Parasitic Invasion", Hrsg. Ayabian et al., UCLA Symposia Band 42, S. 237- 250, Alan Liss, New York, 1987).Die Nukleotidsequenz einer kompletten Wiederholung ist ermittelt (aber nicht veröffentlicht) worden. Der für die vorliegende Arbeit relevante Teil der Sequenz ist nachstehend wiedergegeben. Das verwendete Numerierungssystem mißt von der die Wiederholung im Genom definierenden Ecorl-Stelle. Die Sequenz wird als doppelstrangiges Molekül gezeigt, wobei der obere Strang von links nach rechts in 5'-3'-Richtung verläuft. Die Oligonukleotidsegmente sind im Strang mit gleichem Sense und somit gleicher Sequenz unterstrichen.
Da das Endziel der Genverstärkung die potentielle Verwendung des Verfahrens bei einem Diagnose-Assay war, wurde das Targetgen geprüft, um festzustellen, ob es zu den verbleibenden Kriterien paßt, die bei einem Targetgen zur Diagnose notwendig sind. Diese sind, daß das Targetgen in den meisten oder allen Stämmen des Parasiten vorhanden ist, in den Genomen anderer Infektionserreger nicht vorhanden sind (insbesondere jenen, die bei der Diagnose verwechselt werden könnten) und im Genom des wirts nicht nachweisbar ist. Vorbereitende Untersuchungen zeigen, daß das Gen in alten Stämmen des geprüften Parasiten vorhanden ist und daß es keine Kreuzreaktivität mit den Genomen anderer geprüfter Organismen, einschließlich jener des menschlichen Wirts, gibt.
Eine Anzahl von Primern wurde hinsichtlich der Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren bewertet. Diese Primer sind durch Unterstreichen in der oben angeführten Sequenz identifiziert. Die Primer hatten eine Länge von 20-40 Nukleotiden (einschließlich der wahlweisen Promotorsequenz) und zeigen für effizientes Annelieren Homologie mit der Targetsequenz. Ein Guanosin- (G) oder Cytosin- (C) Rest war am 3'- Ende eines jeden Primers vorhanden, um effiziente Basenpaarung zu gewährleisten, von welchem aus Extension auftrat. Die Primer wurden mit nicht mehr als 150 Basenpaaren zwischen zu gegenüberliegenden Strängen komplementären Primern ausgewählt, sodaß die Extension effizient und rasch erfolgte. Die Primer wurden weiters so ausgewählt, daß ihnen die Fähigkeit fehlte, stabile Basenpaar-Strukturen mit anderen Primern oder innerhalb eines einzelnen Primers zu bilden, was verhindern würde, daß ein Primer an die Targetsequenz anneliert. Obwohl das für die Vervielfältigungsschritte nicht wesentlich ist, wurden die Primer so gewählt, daß sie passende Restriktionsstellen flankieren, um das Klonieren und die Konstruktion von Sonden für die "interne" verstärkte DNA (d.h. eine Sonde, die für das verstärkte Produkt spezifisch ist, aber nicht mit den Primern hybridisiert) zu erleichtern. Die "interne" verstärkte DNA ist äquivalent zu Abschnitt T in der allgemeinen Beschreibung und den Ansprüchen.
Die Reaktionsbedingungen, die für die Erzeugung des doppelstrangigen Fragments verwendet wurden, das den T7-RNA-Polymerase-Promotor umfaßte, waren den zuvor beschriebenen ähnlich (Saiki et al., "Nature" (1986) 324: 163-166). Das Reaktionsmedium enthielt in einem 100 µl-Volumen, 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MGCI&sub2;, 1,5 mM DNTPS, 1,5 µM Oligonukleotidprimer und je nach Versuch variable Mengen DNA enthaltendes Target (von 0,15 pg bis 1,0 µg). Jeder Zyklus bestand aus 2- minütigem Denaturieren bei 90ºC (mit Ausnahme des ersten Zyklus, bei dem die Denaturierung 10 Minuten dauerte), einem raschen Abschrecken auf Trockeneis für 5 s, Schleudern (um Kondensation an der Oberseite des Rohres auszuschließen), Annelieren von Primern bei 35ºC für 2 Minuten, Zugabe von zwei Einheiten Klenow-Fragmenten von E.coli-Polymerase I und Extension bei 35ºC für 2 Minuten.
Das ertindungsgemäße Verfahren wurde weiter durchgeführt, indem ein Promotor für die RNA-Polymerase von Bakteriophage T7 am 5'-Ende eines der Targetgen-spezifischen Oligonukleotide (oben identifiziertes Oligo Nr.1) aufgenommen wurde. Die T7- Promotorsequenz ist TAATACGACTCACTATAGGG. Diese zusätzlichen 20 Nukleotide wurden in die verstärkten doppelstrangigen DNA-Produkte der Anfangsschritte integriert, um Produkte bereitzustellen, die 20 bp größer sind als wenn Oligonukleotide verwendet wurden, denen diese Sequenz fehlt. Beispielsweise ist die verstärkte DNA, bei der die Oligos Nr.1 und 2 verwendet werden, 117 bp, 20 bp größer als die 97 bp des Targets, das Homologie mit den Oligonukleotiden umfaßt (und ähnlich war das Produkt bei den Oligos Nr. 1 und 3, das Produkt war 151 bp = 131 bp + 20 bp).
Die zugegebenen Sequenzen fungierten als effizienter Promotor für T7-RNA- Polymerase. Die T7-Transkriptionsreaktionen in vitro wurden nach den Anleitungen der Lieferfirma der T7-RNA-Polymerase durchgeführt. Die DNA-Schablone (die den Promotorbereich umfaßte) wurde ohne weitere Behandlung direkt von den oben beschriebenen Reaktionen genommen. Ein Autoradiogramm der in vitro erzeugten T7- RNA-Transkripte bestätigte, daß sie um T7 Nukleotide kürzer waren als die DNA- Schablone. Mit anderen Worten, das doppelstrangige DNA-Zwischenprodukt mit 151 Basenpaaren ergab eine 134 nt RNA, 131 nt von den Targetsequenzen und 3 nt (GGG) von der T7 Promotor-Sequenz. Durch Aufnahme von [32P]-UTP in das RNA-Transkript wurde im Vergleich zum Färben mit Ethidiumbromid eine in etwa 3000-fache Zunahme der Detektionsempfindlichkeit des verstärkten Produktes erzielt.
Das erfindungsgemäße Assay wurde spezifisch konstruiert, um RNA in hoher spezifischer Aktivität und geringer Ausbeute zu ergeben, und stellt daher keine maximale molare Zunahme der durch 17-Transkription erzeugten Targetseqenzen dar. Es ist jedoch bekannt, daß 17-RNA-Polymerase unter Bedingungen hoher Ausbeute zwischen 50 und 100 RNA-Moleküle pro DNA-Schlabonenmolekül erzeugt (Davanloo et al., "Cloning and expression of the gene for the bacteriophage T7-RNA-Polymerase", "Proc. Natl.Acad.Sci.USA" (1984) 81: 2035-2039).
Das Verfahren wurden unter Einsatz mehrerer Zyklen der in den Figuren gezeigten und oben beschriebenen T7RT-Verstärkung durchgeführt. Dieses Verfahren wird hier aus Gründen der Zweckmäßigkeit als T7RT-Technik bezeichnet. Dieses Verfahren weist gegenüber dem PCR-Verfahren nach dem Stand der Technik mehrere Vorteile auf. Zunächst kann die zu verstärkende Targetsequenz entweder RNA oder DNA sein, was wichtig ist, wenn das ausgewählte Gen stark exprimiert ist, da bei AMV- Umkehrtranskriptase entweder RNA oder einstrangige DNA als Schablone verwendet werden kann. Das ist auch für Anwendungen relevant, bei denen die Targetsequenzen ausschließlich RNA sind, wie bei der Retrovirus-Detektion. Zweitens sollte die Verstärkung von jedem vollen Zyklus, der beide Sequenzen einschließt, höher sein als bei der PCR-Technik (bis zu 100 pro Zyklus für T7RT im Vergleich zu einem Maximum von 2 pro Zyklus bei der PCR-Technik), sodaß eine verringerte Anzahl von Zyklen (3 Zyklen für 10&sup6;-fache Verstärkung von T7RT gegenüber zumindest 20-25 für PCR) und die entsprechende Verwendung einer kleineren Enzymmenge ermöglicht wird. Drittens können große RNA-Mengen für die Verwendung bei jedem beliebigen Verfahren hergestellt werden, wenn RNA gegenüber DNA vorzuziehen ist, wie z.B. die Translation in Protein, chemische Labilität usw.
Bei anfänglichen Untersuchungen des T7RT-Verfahrens wurden die gleichen Oligonukleotide und Targetsequenzen verwendet, wie in den vorhergehenden Abschnitten beschrieben. Wie in den Figuren angegeben, werden zwei Enzyme der Reihe nach für jeden Zyklus verwendet: AMV-Umkehrtranskriptase und T7 RNA- Polymerase. Wiederholte Denaturierungs-, Anneierungs- und Extensionsschritte werden durch Ändern der Probentemperatur (90-100ºC für die Denaturierung, 37-41ºC zum Ännelieren) und Zugabe von Enzym zu einer Probe, die zu verstärkende Nukleinsäure, adäquaten Puffer (durch Enzymzufuhren angezeigt), NTPs und DNTPs, einen molaren Überschuß an Oligonukleotidprimern und einen Hemmer von RNase enthielt, durchgeführt. In einem ersten Versuch wurde das Genfragment, das anfangs synthetisiert wurde, sodaß es eine Promotorsequenz (wie oben beschrieben) enthielt, verwendet, um die Durchführbarkeit des T7RT-Verfahrens zu demonstrieren. Zunächst wurde die Substrat- DNA durch T7-RNA-Polymerase transkribiert, wovon erwartet wurde, daß ein RNA- Produkt mit 134 nt entstand. Dieses Material wurde dann, wie beschrieben und in den Figuren gezeigt, unter Verwendung von AMV-Umkehrtranskriptase in Gegenwart radiomarkierter DNTPs in eine doppelstrangige DNA zurückverwandelt. Das erwartete (und erhaltene) Haupt-DNA-Produkt war ebenfalls 134 nt, wobei aufgrund des fortgesetzten Vorhandenseins der Input-Genfragmente eine kleine Menge an Material mit 151 nt vorhanden war. Eine Kontrollprobe wurde auf ähnliche Weise behandelt, mit der Ausnahme, daß 17-Polymerase weggelassen wurde. Nach diesem Umkehrtranskriptaseschritt wurde ein zweiter Zyklus der direkten Verstärkung durch AMV RT an jeder Probe vorgenommen. Das führte zur Synthese substantieller Mengen des 151 nt-Produktes durch Synthese des 134 nt-Produktes unter Verwendung von Oligo Nr. 1 (das die zusätzlichen T7 Nukleotide von T7-Promotor an seinem 5'-Ende hatte) als Primer. Da das Material mit 134 nt (nach einem T7RT-Zyklus) etwa 10-mal so ergiebig war als das Produkt mit 151 nt der kontrollierten Reaktion, entsprach die T7- Verstärkung derjenigen, die durch etwa 4,5 Zyklen des PCR-Verfahrens alleine erzielt wurde. Diese Verstärkung wurde ohne Optimierung des T7RT-Verfahrens erreicht, sodaß gegenüber dem PCR-Verfahren größere Verbesserungen hinsichtlich Effizienz und Kosten erwartet werden.

Claims

1. Verfahren zum Vervielfachen der Kopienanzahl einer Targetpolynukleotid-Sequenz in einem Reaktionsmedium für Nachweis- bzw. Bestimmungszwecke, welches folgende Schritte umfaßt:

(A) das Hybridisieren eines einstrangigen Targetpolynukleotidmoleküls mit einer ersten Primersequenz, gefolgt von der Extension der ersten Primersequenz, um ein Extensionsprodukt des ersten Primers zu bilden, und Zur-Verfügung-Stellen des Extensionsproduktes des ersten Primers zur Hybridisierung mit einem zweiten Primer, wobei zumindest einer von dem ersten und zweiten Primer eine Promotorsequenz enthält, sowie die Extension des zweiten Primers und, wenn notwendig, des Extensionsproduktes des ersten Primers, um ein erstes doppelstrangiges DNA- Zwischenprodukt zu erzeugen, das eine erste Promotorsequenz stromauf der Targetsequenz aufweist;

(B) das Züchten mehrfacher RNA-Kopien der Targetsequenz aus dem Zwischenprodukt unter Verwendung einer RNA-Polymerase, die zur Bindung des Promotors fähig ist;

(C) das Herstellen eines zweiten doppelstrangigen DNA-Zwischenproduktes, das das gleiche wie das erste doppelstrangige DNA-Zwischenprodukt oder verschieden davon sein kann und eine zweite Promotorsequenz stromauf der Targetsequenz aufweist, welche zweite Promotorsequenz die gleiche wie die des ersten doppelstrangigen DNA- Zwischenproduktes oder davon verschieden sein kann, aus den RNA-Kopien durch Hybridisieren der RNA-Kopien mit einer dritten Primersequenz, gefolgt von der Extension des dritten Primers, um ein Extensionsprodukt des dritten Primers zu bilden, und das Zur-Verfügung-Stellen des Extensionsproduktes des dritten Primers zur Hybridisierung mit einem vierten Primer, wobei zumindest einer von dem dritten und vierten Primer die zweite Promotorsequenz enthält, und worin der dritte und vierte Primer die gleichen wie die ersten und zweiten Primer oder davon verschieden sein können, und die Extension des vierten Primers und, falls erforderlich, des Extensionsproduktes des dritten Primers, um das zweite doppelstrangige DNA- Zwischenprodukt zu erzeugen;

(D) das Züchten vielfacher RNA-Kopien aus dem zweiten doppelstrangigen DNA- Zwischenprodukt unter Verwendung einer RNA-Polymerase, die zur Bindung des zweiten Promotors fähig ist;

(E) das Herstellen eines weiteren doppelstrangigen DNA-Zwischenproduktes, das eine weitere Promotorsequenz stromauf der Targetsequenz aufweist, welcher weitere Promotor der gleiche wie jener des ersten und des zweiten doppelstrangigen DNA- Zwischenprodukts oder davon verschieden sein kann, aus den RNA-Kopien von dem zweiten doppelstrangigen DNA-Zwischenprodukt durch Hybridisieren der RNA-Kopien mit einer weiteren Primersequenz, gefolgt von der Extension des weiteren Primers, um ein Extensionsprodukt des weiteren Primers zu bilden, und das Zur-Verfügung-Stellen des Extensionsproduktes des weiteren Primers zur Hybridisierung mit einem anderen Primer, wobei zumindest einer aus dem weiteren und dem anderen Primer eine Promotorsequenz enthält, und die Extension des anderen Primers und, wenn notwendig, des Extensionsproduktes des weiteren Primers, um das weitere doppelstrangige DNA-Zwischenprodukt zu bilden, worin der weitere und der andere Primer die gleichen wie der erste und der zweite sowie der dritte und der vierte Primer oder davon verschieden sein können.

2. Vertahren nach Anspruch 1, welches umfaßt:

(F) das Züchten vielfacher RNA-Kopien von der Targetsequenz aus dem weiteren doppelstrangigen DNA-Zwischenprodukt unter Verwendung einer RNA-Polymerase, die zur Bindung des weiteren Promotors fähig ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, welches einen oder mehrere Zyklen umfaßt, wobei jeder Zyklus eine Wiederholung der Schritte (E) und (F) umfaßt und worin der weitere und andere Primer eines Wiederholungszyklus mit den früher verwendeten Primern gleich oder davon verschieden sein können.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die RNA-Kopien von dem zweiten doppelstrangigen DNA-Zwischenprodukt zum einstrangigen Targetpolynukleotid-Molekül komplementär sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Sense der RNA-Kopien vom zweiten doppelstrangigen DNA-Zwischenprodukt mit dem des einstrangigen Targetpolynukleotid-Moleküls übereinstimmt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin nur zwei verschiedene Primer verwendet werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Primersequenzen in einem doppelstrangigen Zwischenprodukt durch weniger als 300 bp und mehr als 10 bp getrennt sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Primersequenzen in einem doppelstrangigen Zwischenprodukt durch weniger als 200 bp und mehr als 10 bp getrennt sind.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8 worin die Primersequenzen in einem doppel strangigen Zwischenprodukt durch mehr als 15 bp getrennt sind.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7, 8 oder 9, worin die Primersequenzen in einem doppelstrangigen Zwischenprodukt durch nicht mehr als 150 bp getrennt sind.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches das gleichzeitige Vervielfältigen der Kopienanzahl von mehr als einer der Targetpolynukleotid- Sequenzen, die sich voneinander unterscheiden, für Nachweis- bzw. Bestimmungszwecke umfaßt.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin eine Primersequenz eine Bindungssequenz umfaßt, die eine oder mehrere Basen enthält, die zu einem Hybridisierungstarget der Bindungssequenz nicht-komplementär ist bzw. sind.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin eine Primersequenz eine Bindungssequenz und eine am 5'-Ende der Bindungssequenz befestigte Sequenz nicht-komplementärer Basen umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 1 3, worin die nicht-komplementären Basen eine Restriktionsendonuklease-Spaltungsstelle bereitstellen.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin eine Primersequenz ein Mitglied einer Primersequenzsammlung ist, die eine Vielzahl von Nukleotidsequenzen umfaßt, die zu verschiedenen Nukleotidsequenzen komplementär sind, die für eine bestimmte Aminosäuresequenz kodieren.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin mehr als einer der Primer in irgendeinem der Schritte (A), (C) und (E) eine Promotorsequenz enthält.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin, bevor ein darauffolgender Schritt unter Verwendung eines Primers abläuft, eine Primersequenz aus einem vorhergehenden Schritt entfernt wird.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der erste Primer keine Promotorsequenz aufweist.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die in Schritt (A) verwendeten Primer sich von den in den Schritten (C) und (E) verwendeten Primern unterscheiden.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin die in den Schritten (C) und (E) verwendeten Primer einen Bindungsbereich der Targetsequenz hybridisieren, der sich zwischen den Bindungsbereichen der Primer in Schritt (A) befindet.

21. Verfahren nach Anspruch 19 und 20, worin die in Schritt (E) verwendeten Primer einen Bindungsbereich der Targetsequenz hybridisieren, der sich zwischen den Bindungsbereichen der Primer in Schritt (C) befindet.

22. Verfahren nach Anspruch 3, worin die in Schritt (A) verwendeten Primer sich von den in Schritt (E) eines Wiederholungszyklus verwendeten Primern unterscheiden.

23. Verfahren nach Anspruch 22, worin die in Schritt (E) eines Wiederholungszyklus verwendeten Primer einen Bindungsbereich der Targetsequenz hybridisieren, der sich zwischen den Bindungsbereichen der in Schritt (A) verwendeten Primer befindet.

24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Extension eines Primers entweder unter Verwendung einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase oder einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase erfolgt.

25. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Extension eines Primers unter Verwendung einer Umkehrtranskriptase erfolgt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, worin die Umkehrtranskriptase AMV- Umkehrtranskriptase ist.

27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin, bevor ein darauffolgender Schritt unter Verwendung eines Promotors abläuft, eine RNA- Polymerase abgebaut wird, die einen Promotor aus einem vorangehenden Schritt erkennt.

28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin sich die Promotorsequenz in Schritt (A) von der Promotorsequenz in Schritt (C) oder Schritt (E) unterscheidet.

29. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Promotorsequenz in Schritt (A) sich von der in Schritt (E) eines Wiederholungszyklus verwendeten Promotorsequenz unterscheidet.

30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin eine Promotorsequenz eine SP6-Promotorsequenz ist und das Züchten von RNA aus einem doppelstrangigen DNA-Zwischenprodukt, das eine SP6-Promotorsequenz umfaßt, durch SP6-RNA- Polymerase erfolgt.

31. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin eine Promotorsequenz eine T7-Promotorsequenz ist und das Züchten von RNA aus einem doppelstrangigen DNA-Zwischenprodukt, das eine T7-Promotorsequenz umfaßt, durch T7-RNA- Polymerase erfolgt.

32. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das einstrangige Targetpolynukleotid-Molekül erhalten wird durch:

(i) Trennen der Stränge eines Duplex-DNA-Moleküls; oder durch

(ii) Herstellen einer komplementären DNA-Kopie von einem einstrangigen DNA- Molekül; oder durch

(iii) Herstellen einer komplementären DNA-Kopie aus einem einstrangigen RNA- Molekül.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 31, worin die Targetpolynukleotid- Sequenz im Reaktionsmedium RNA ist.

34. Verfahren nach Anspruch 33, welches das Hybridisieren des einstrangigen Targetpolynukleotids zuerst mit einer Primersequenz stromab der Targetsequenz umfaßt, und worin der zweite Primer die Promotorsequenz umfaßt.

35. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Targetpolynukleotid-Sequenz ein diskretes Molekül oder eine Fraktion eines größeren Moleküls umfaßt.

36. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Primer 50 oder weniger Nukleotide umfassen.

37. Verfahren nach Anspruch 36, worin die Primer 20-40 Nukleotide umfassen.

38. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Diagnose des Vorhandenseins eines Organismus, welches umfaßt:

das Nachweisen bzw. Bestimmen einer Targetgensequenz, die im Organismus vorhanden ist, und worin dem Cenom eines Wirts für den Organismus eine Polynukleotidsequenz fehlt, die durch Nukleinsäurehybridisierung von der Targetgensequenz nicht unterscheidbar ist.

39. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Targetpolynukleotid-Sequenz anfänglich im Reaktionsmedium als geringer Anteil der Cesamt-Nukleinsäuresequenzen vorhanden ist.

40. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Zur-Verfügung- Stellen eines Primerextensionsproduktes zur Hybridisierung nach einem anderen Verfahren als der Anwendung von Wärme erfolgt.

41. Verfahren nach Anspruch 40, bei dem ein Lösungsmittel eingesetzt wird.

42. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Target ein Antigen-Gen von Toxoplasma gondii ist.

43. Verfahren nach Anspruch 42, worin die Primer zumindest eine der folgenden Sequenzen umfassen:

44. Verfahren zum Nachweisen bzw. Bestimmen einer Targetpolynukleotid-Sequenz in einer Probe, welches das Vervielfachen der Kopienzahl der Targetsequenz unter Einsatz eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche und das Nachweisen bzw. Bestimmen des Vorhandenseins der vervielfachten Kopien umfaßt.

45. Verfahren, bei dem die nach einem der vorhergehenden Ansprüche vervielfachte Targetpolynukleotid-Sequenz ohne Abtrennung aus dem Reaktionsmedium nachgewiesen bzw. bestimmt wird.

46. Verfahren zum Nachweisen bzw. Bestimmen eines Pathogens oder genetischen Defekts, das/der mit einer Erkrankung beim Menschen assoziiert ist, welches das Vervielfachen einer Targetpolynukleotid-Sequenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfaßt.

47. Lösung zum Verstärken eines Antigen-Gens von Toxoplasma gondii für Nachweisbzw. Bestimmungszwecke, zumindest einen Primer umtassend, der eine der folgenden Sequenzen umfaßt:

48. Set zum Verstärken eines Antigen-Gens für Toxoplasma gondii für Nachweis- bzw. Bestimmungszwecke, welches eine Lösung nach Anspruch 47 umfaßt.