KR20120002534A - 유전자 발현의 향상된 검출 - Google Patents

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Abstract

올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브(probe)는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 또는 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 유전자의 메틸화 상태의 검출에 유용하다. 올리고뉴클레오티드는 암의 진단 및 치료에서의 적용을 제공한다.

Description

유전자 발현의 향상된 검출 {IMPROVED DETECTION OF GENE EXPRESSION}
본 발명은 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자 발현의 검출에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3의 메틸화된 또는 비메틸화된 형태를 검출하는 방법 및 관련된 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브, 프라이머쌍 및 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 특히, 형광 기반 실시간 PCR 및 종말점 PCR(end-point PCR) 방법과 같은 증폭 기술을 수반하며, 진단, 예후 및 치료에 유용하다.
고환암 ( Cancer testis ; CT ) 항원
고환암(CT) 항원은 일반적으로 고환, 난소 또는 영양막 세포(trophoblast cells) 내의 생식 세포에 제한된 발현을 가지는 종양과 관련된 항원의 종류이다. 이러한 항원들은 일반적으로 성체 조직에서는 발현되지 않는다(Simpson, et al., Nat. Rev. Cancer, 5(8):615-625 (2005); Scanlan, et al., Immunol. Reviews, 188:22- 32 (2002); Scanlan, et al., Cane. Immun., 4:1 -15 (2004)).
암 환자에서 CT 항원의 유전자 조절은 붕괴되며, 범위가 넓고도 다양한 종양에서 이러한 항원들의 비정상적인 발현을 유도한다. 확인된 첫 번째 CT 항원인 MAGE-1은 1990년대 초에 T-세포 에피토프 클로닝에 의해 확인되었다(van der Bruggen et al, 1991 Science 13;254(5038):1643-7; van der Bruggen et al, 1999 Science 254:1643-1647; Traversah, et al, 1992 Immunogenetics, 35(3):145-152; and U.S. Patent No. 5,342,774, incorporated by reference). 그 이후, 혈청학적 발현 클로닝 기술(SEREX)(Sahin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(25):11810-11813 (1995) and U.S. Patent No. 5,698,396), 이스트 표면 상 재조합 항원 발현(RAYS)(Mischo, et al., Cane. Immun., 3:5-16 (2003)) 및 차별 mRNA 발현 분석(differential mRNA expression analysis)(Gure, et al., Int. J. Cane, 85(5):726-732 (2000))이 더 많은 CT 항원들의 동정을 유도하였다. 암 환자에서 몇몇 CT 항원들의 면역원성이 이들을 종양 백신의 개발을 위한 이상적인 표적으로 만들었다. 면역 시스템의 세포성 또는 체액성 이펙터(effector)에 의해 인지된 종양-관련된 항원들의 동정은 암 면역치료에 대한 새로운 관점을 열었다. 면역치료의 개념은 종양에서 발현되는 항원 단백질은 자가 면역체계를 이용하는 치료학적 접근에서 표적으로 사용될 수 있다는 가정에 기초한다. 항원 특이적 암 면역치료제(ASCI)는 표적화된 치료를 허용한다. ASCI는 두 가지 주요한 구성요소를 가진다: 특히 암에 대한 면역반응을 이끌기 위한“종양 항원(tumor antigens)”및 항-종양 면역 반응을 증가시키기 위하여 선택된 면역-자극 물질을 포함하는“보조제 시스템(adjuvant systems)”
CTAG1B . 암의 면역치료에 있어 현재 관심의 대상인 고환암 항원은 CTAG1B 유전자(또한 유전자 통칭 NY-ESO-1이라고도 알려짐)에 의해 인코딩되는 암/고환 항원 1B이다. 이 항원은 90년대 후반에 암 연구를 위한 루드윅 협회(Ludwig Institute for Cancer Research) 뉴욕 지사에서 식도구 편평상피암(oesophageal squamous cell carcinoma)에서 SEREX에 의해 최초로 확인되었다(Chen, et al., PNAS USA, 94(5):1914-1918 (1997); 및 본 발명에서 참조로 포함되는 미국특허 No. 5,804,381). CTAG1B 단백질은 180 아미노산 길이이며, 난소암, 폐암, 유방암, 전립선암, 식도암, 방광암 및 흑색종(melanoma)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 범위가 넓고도 다양한 종양에서 발견되었다(Konishi J et al. Oncol Rep. 2004 May;11(5):1063-7; Nicholaou T et al, Immunol Cell Biol. 2006 Jun;84(3):303-17; Sugita Y et al. Cancer Res. 2004 Mar 15;64(6):2199-204; Velazquez EF et al. Cancer Immun. 2007 Jul 12;7:11 and Jungbluth et al. 2001, Int. J. Cane, 92(6):856-860). 이 항원에 대한 자발적인 체액성 및 세포성 면역 반응은 CTAG1B-양성 종양을 가지는 환자에서 나타났으며, 다수의 HLA(인간 백혈구 항원; Human Leukocyte Antigen) 클래스 I-및 II-제한된 펩타이드가 확인되었다(Jager, et al., 1998 J. Exp. Med., 187(2):265-270; Yamaguchi, et al., 2004 Clin. Cane. Res., 10(3):890-961 ; and Davis, et al., 2004 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101 (29):10697- 10702). 본 발명에서 참조로 포함되는 예시적인 특허 문헌들은 미국특허 No. 6,140,050; 6,251 ,603; 6,242,052; 6,274,145; 6,338,947; 6,417,165; 6,525,177; 6,605,711; 6,689,742; 6,723,832; 6,756,044; 및 6,800,730이다.
임상시험에서, 3개의 부분적으로 중복되는 HLA-A2(157-167, 157-165 및 155-163) 결합부위를 가지는 CTAG1B 유래 펩타이드가 전이성 NY-ESO-1 발현 종양을 가지는 12명의 환자를 치료하기 위한 백신에 사용되었다. 이 연구는 합성 NY-ESO-1 펩타이드가 안전하게 투여될 수 있으며, 잠재적으로 유익한 T 세포 반응을 일으킬 수 있다는 것을 설명하였다(Jager, et al., 2000 PNAS USA, 97(22):12198-12203).
단백질에서 다수의 MHC(주조직적합성 복합체; major histocompatibility complex) 클래스 I 및 II 에피토프가 다른 그룹들에 의해 확인되었다. N-말단의 콜라겐 유사 영역은 적어도 하나의 여기에서 A31로 언급되는 MHC 클래스 I 에피토프를 포함한다. 중심 영역은 여러 개의 여기에서 DR1, DR2, DR4, DR7 및 DP4로 언급되는 MHC 클래스 2 에피토프를 포함한다. 이 영역은 또한 여러 개의 여기에서 B35, B51, Cw3 및 Cw6로 언급되는 MHC 클래스 I 에피토프를 포함한다. C-말단은 적어도 두 개의 클래스 II 에피토프(DR4 및 DP4) 및 하나의 클래스 I 에피토프(A2)를 포함하는 것으로 여겨진다.
CTAG2 . CTAG1과의 높은 서열 유사상으로 인해. 면역치료를 위한 관심의 대상이 되는 다른 고환암 항원은 CTAG2이다(유전자 통칭 LAGE-1이라고도 알려짐). 두 개의 CTAG2 전사물(transcripts) LAGE-I a 및 LAGE-I b이 기술되었다. LAGE-I b는 불완전하게 스플라이싱되며, 추정되는 단백질에 대한 유전암호는 대략 210 아미노산 잔기인 반면, LAGE-I a 유전자 산물은 180 아미노산 잔기를 포함한다(Sun et al. Cancer Immunol Immunother 2006: 55: 644-652).
LAGE-1 및 NY-ESO-1 단백질의 N-말단 영역들은 매우 잘 보존되어 있으며, 97%를 초과하는 동일성을 가지고 있는 것으로 생각된다. 하지만, LAGE-1은 NY-ESO-1과 중심 영역에서 단 62%만 동일하여 다르다. NY-ESO-1 및 LAGE-Ia의 C-말단은 매우 잘 보존되어 있다(97%를 초과하는 동일성). 하지만 LAGE-I b의 C-말단이 더 길며, LAGE-1 a/NY-ESO-1의 동일한 영역과 50% 미만의 동일성을 가지는 것으로 생각된다.
이러한 두 개의 단백질에 관한 일반적인 정보는 LICR 웹사이트에서 이용 가능하다(see www.cancerimmunity.org/CTdatabase).
PRAME . 우선적으로 발현되는 흑색종의 항원인 PRAME은 흑색종 반응성 세포독성 T-세포(CTL)에 의해 인식되는 인간 흑색종 항원을 인코딩하는 유전자로 처음 분리되었다. PRAME은 자궁 내막 및 부신을 포함하는 일부 정상 성인의 조직에서 흔적 수준의 발현으로 인해 CT 유전자로 지정되지 않았었다. 하지만, PRAME은 CT 유전자의 다른 주요 특징, 즉 고환에서의 강한 발현 및 흑색종(97%), 육종(80%), 소세포폐암(70%), 신장암(40%), 및 두경부암(29%)을 포함하는 다양한 종양에서의 상향-조절을 나타내지 않는다. 이 유전자에 대해 동일한 단백질을 인코딩하는 다섯 개의 선택적으로 스플라이스된 전사물 변이체가 관찰되었다. 509 아미노산의 추정되는 단백질은 HLA_A24 및 HLA-A2 분자 상에 나타나는 잘 특성화된 에피토프들을 가진다.
MageA3 . MAGE 유전자는 암/고환 항원 과(family)에 속해 있다. MAGE 과의 유전자들은 20개 이상의 구성원들을 포함하며, MAGE A, B, C 및 D 유전자들로 만들어진다(Scanlan et al, (2002) Immunol Rev. 188:22-32; Chomez et al, (2001) Cancer Res. 61(14):5544-51). 이들은 X 염색체 상에 무리를 이루며(Lucas et al., 1998 Cancer Res. 58.743-752; Lucas et al., 1999 Cancer Res 59:4100-4103; Lucas et al., 2000 Int J Cancer 87:55-60; Lurquin et al., 1997 Genomics 46:397-408; Muscatelli et al., 1995 Proc Natl Acad Sci USA 92:4987-4991; PoId et al., 1999 Genomics 59:161-167; Rogner et al 1995 Genomics 29:725-731), 아직까지 밝혀지지 않은 기능을 가지고 있다(Ohman et al 2001 Exp Cell Res. 265(2): 185-94). MAGE 유전자들은 매우 높게 상응하며, MAGE-A과의 구성원들은 특히, 60-98% 사이의 상동성을 가진다. 인간 MAGE-A3 유전자는 흑색종(Furuta et al. 2004 Cancer Sci. 95, 962-968.), 방광암, 간암(Qiu et al. 2006. Clinical Biochemistry 39, 259-266), 위암(Honda et al. 2004 British Journal of Cancer 90, 838-843), 대장암(Kim et al. 2006 World Journal of Gastroenterology 12, 5651-5657) 및 폐암(NSCLC)(Scanlan et al 2002 Immunol Rev. 188:22-32; Jang et al 2001 Cancer Res. 61, 21: 7959-7963)을 포함하는 다양한 종양 타입에서 발현된다. 고환의 생식 세포 또는 태반을 제외한 어떠한 정상 성인 조직에서도 발현이 관찰되지 않았다(Haas et al. 1988 Am J Reprod Immunol Microbiol 18:47-51; Takahashi et al. 1995 Cancer Res 55:3478-382).
면역치료로부터 이익을 받는 CTAG1B-, CTAG2- 및/또는 PRAME-발현 환자들을 구체적으로 확인할 수 있고, 복용량을 위한 CTAG1B-, CTAG2- 및/또는 PRAME-발현을 모니터링할 수 있고, 임상시험에서 CTAG1B-, CTAG2- 및/또는 PRAME-발현 샘플의 확인할 수 있는, 양적으로 높은 처리량 분석을 가지거나 또는 초기 단계 암환자를 간단하게 확인하는 것이 중요하다. 여러 적용 가능한 진단 방법들이 기술되어 있으며, RNA 추출 및 RT-PCR에 적용한다(예를 들어: Odunsi et al., Cancer Research 63, 6076-6083, 2003; Sharma et al., Cancer Immunity, Vol. 3, p.19, 2003).
존재하는 분석들의 큰 약점은 이들이 CTAG1B, CTAG2 및/또는 PRAME 발현을 평가하기 위해 RNA 분리를 필요로 한다는 점이다. 임상 센터에서 포르말린-고정되고, 파라핀에-묻힌(FFPE) 종양 조직은 일반적인 종양 조직의 보존 방법이다. 포르말린에 고정하는 것은 조직 내에서 RNA 분자의 구조를 변화시키고, 교차 결합 및 또한 부분적인 분해를 일으킨다. 부분적인 분해는 100-300 염기쌍 사이의 작은 조각 RNA를 만든다. RNA에 대한 이러한 구조적인 변화는 CTAG1B-, CTAG2- 및/또는 PRAME 발현 수준을 측정하기 위해 FFPE 조직으로부터 추출된 RNA의 용도를 제한한다.
유전자 메틸화
유전자 메틸화는 유전자 발현의 중요한 조절자(regulator)이다. 특히, 특정 유전자의 프로모터 영역 내의 CpG 디-뉴클레오티드쌍에서 발견되는 시토신 잔기에서의 메틸화는 유전자 발현의 하향 조절을 통해 여러 질병 상태에 기여할 수 있다. 예를 들어, 종양 억제 유전자의 비정상적인 메틸화는 이러한 유전자들의 상향 또는 하향 조절을 유도할 수 있고, 따라서 여러 암들의 존재 및 발달과 연관될 수 있다(Hoffmann et al. 2005 Biochem Cell Biol 83: 296-321). 비정상적인 유전자 메틸화의 패턴은 종종 기원 조직에 특이적이다. 따라서, 특정 유전자의 메틸화 상태의 검출은 예후 및 진단에 유용할 수 있으며, 질병의 상대적인 단계 결정 및 또한 치료의 특정 타입에 대한 반응 예측에 모두 사용될 수 있다(Laird. 2003 Nat Rev Cancer 3: 253-266).
CTAG1B-, CTAG2- 및/또는 PRAME의 메틸화 상태는 암 조직에서 어느 정도 연구되었다. 만성 골수성 백혈병(CLM)에서 PRAME 유전자의 높은 발현을 위한 분자 메커니즘에 직접적으로 원인이 되는 것이 DNA 메틸화라는 것이 제안되었다. PRAME 프로모터인 exon1 및 exon2의 분석은 PRAME이 세 개의 CpG 섬(islands)을 가지고 있는 것을 밝혔다: 프로모터 내에 위치한 201 bp 섬, exon1 내의 204 bp 섬 및 exon2 내의 310 bp 섬, 그 중 오직 exon2 내의 CpG 섬들만이 후생유전자 조절(epigenetic regulation)을 나타낸다(Gomez-Roman et al. Leukemia Research 31 (2007) 1521-1528). DNA 메틸화에 관한 DNA-절단/형질주입 실험과 결합하여, PRAME 조절 영역의 정의된 부분에서의 메틸화 패턴의 변화는 일반적으로 유전자를 발현하지 않는 세포에서 이의 상향조절을 위해 충분하다는 것을 또한 보여준다.
LAGE-1의 메틸화 상태 또한 연구되었다(De Smet et al. (1999) Molecular and Cellular Biology:7327-7335). LAGE-1 및 LAGE-2/NY-ESO-1의 높은 서열 유사성으로 인해, 이들 두 유전자의 프로모터 서열들 사이의 메틸화-상태를 구별하는 것이 어려웠다.
비록 다른 기술들을 사용하는 정량법이 개발되었지만(Laird PW., Nat Rev Cancer 2003;3:253-66; Ea®ds et al. Nucleic Acids Res 2000;28:E32; Mikeska T, et al. J Mol Diagn 2007), 겔 상에 결과의 시각화와 함께 사용되는 메틸화-특이적 PCR(MSP)(겔-기반 MSP 분석)은 유전자의 후생적인 침묵(silencing)을 결정하기 위해 널리 사용된다(Esteller M et al. Cancer Res 2001;61:3225-9.).
다수의 형광 기반 기술들이 핵산 증폭 반응의 실시간 모니터링을 위해 이용가능하다. 이들 중 하나의 기술은 US 6,090,552 및 EP 0912597에 기술되어 있으며, 상업적으로는 Amplifluor®로 알려져 있다. 이 방법은 또한 핵산 증폭 반응의 종말점 모니터링에 적합하다. Vlassenbroeck 등은 Amplifluor®기술의 사용과 함께 표준화된 직접, 실시간 MSP 분석을 기술한다(Vlassenbroeck et al.,2008. Journal of Molec. Diagn., V10, No. 4).
본 발명의 목적은 존재하는 분석들의 약점을 제거하는 향상된 분석을 제공하는 것이다.
본 발명은 발현을 측정하는 향상된 방법 및/또는 분석에 관한 것이다. 본 발명은 더 나아가 여기에 서술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브, 프라이머쌍, 키트 및/또는 방법 사용을 통한 특정 타입의 치료, 특히 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3을 발현하는 것으로 확인된 환자의 항원-특이적 암 면역치료제(ASCI) 기반의 치료에 관한 것이다. CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 (단백질) 발현은 유전자 그 자체의 발현 수준의 측정보다는 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태 결정에 의해 검출된다. 본 발명자들은 본 발명자들의 메틸화 테스트를 통한 메틸화 상태 결과와 NSCLC, 흑색종 및 유방암 샘플에서 CTAG1B, CTAG2 및/또는 PRAME 발현에 대한 RT-PCR 분석을 통해 얻어진 결과가 매우 일치하는 것을 보여준다. 샘플들의 경우, 예를 들어 qRT-PCR 증명이 어려운, 비소 폐암(non-Small Lung Cancer)으로부터의 미세바늘 생검(biopsies) 샘플의 경우, MageA3 유전자의 메틸화 상태 결정에 의해 검출되는 단백질 발현은 귀중한 대안을 제공한다. 상기 분석들은 따라서 치료를 위한 (적합한) 환자들을 선택하는데, 환자의 성공적인 치료의 가능성을 예측하는데 유용하며, 환자의 치료 선택을 돕는데 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 또는 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 유전자의 메틸화 상태 검출에 유용한 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 제공한다.
올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 바람직하게 다음의 5' 부터 3' 순서의 연속적인 서열을 포함하거나 또는 이들로 필수적으로 구성되거나 또는 이들로 구성된다:
(a) 대략 6 내지 30 뉴클레오티드 사이의 제 1 뉴클레오티드 서열(여기서 상기 제 1 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드는 분자에너지 전달쌍(molecular energy transfer pair)의 도너 모이어티 및 억셉터 모이어티로부터 선택된 제 1 모이어티로 표지화되며, 도너 모이어티는 여기(excited)되었을 때 하나 이상의 특정 파장에서 형광을 방출하고, 억셉터 모이어티는 상기 도너 모이어티로부터 방출된 상기 형광을 흡수 및/또는 소광시킨다);
(b) 대략 3 내지 20 뉴클레오티드 사이를 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 제 2 단일-가닥 뉴클레오티드 서열;
(c) 대략 6 내지 30 뉴클레오티드 사이를 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 제 3 뉴클레오티드 서열(여기서 상기 제 3 뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드는 상기 도너 모이어티 및 상기 억셉터 모이어티로부터 선택된 제 2 모이어티로 표지화되고, 상기 제 2 모이어티는 상기 제 1 뉴클레오티드 서열을 표지화하지 않는 상기 그룹의 일원(member)이며, 여기서 상기 제 3 뉴클레오티드 서열은 상기 제 1 뉴클레오티드 서열에 역순으로 상보적인 결과 듀플렉스(duplex)가 상기 제 1 뉴클레오티드 서열 및 상기 제 3 뉴클레오티드 서열 사이에 형성될 수 있으며, 그 결과 상기 제 1 모이어티 및 제 2 모이어티는 근접하게 되며, 그 결과 도너 모이어티가 여기되고 형광을 방출할 때 억셉터 모이어티는 상기 도너 모이어티에 의해 방출된 상기 형광을 흡수하고 소광시킨다); 및
(d) 제 4 단일-가닥 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 62 및 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 대략 8 내지 40 뉴클레오티드 사이를 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성되는 프라이머의 3' 말단에서의 제 4 단일-가닥 뉴클레오티드 서열;
여기서, 상기 듀플렉스가 형성되지 않을 때, 상기 제 1 모이어티 및 상기 제 2 모이어티는 상기 제 1 및 제 2 모이어티 사이의 분자에너지 전달을 방해하는 거리에 의해 분리된다.
3' 말단에서의 특정한 뉴클레오티드 서열이 결정될 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태를 가능하게 한다. 이러한 프라이머들은 (여기에서 논의된) 적절한 시약 처리 이후 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 비메틸화된 형태에 우선적으로 결합한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 특성들은 여기에서 논의되고, 이는 필요한 변경을 가하여 적용된다. 특정한 뉴클레오티드 서열은 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 과(family) 유전자의 메틸화된 또는 비메틸화된 DNA 부분을 포함하는 핵산 가닥에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 핵산 중합효소에 의해 최초 합성(prime synthesis)을 할 수 있다.
가장 바람직하게, 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 또는 61의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 관심 유전자의 일부를 증폭하기 위하여 사용된다.
서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 또는 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 프라이머를 포함하는 프라이머쌍이 또한 제공된다. 적합한 프라이머쌍은 (여기에서 논의된) 관련된 유전자의 적절한 부분의 증폭을 지시하는 센스 및 안티센스 프라이머에 기초하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 본 발명의 프라이머쌍들의 예들은 표 1 에 명시되어 있다. 청구항 6 역시 적합한 프라이머쌍을 인용한다.
다른 양태에서, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 또는 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 적어도 하나의 프라이머, 프라이머쌍 또는 프라이머 세트를 포함하는 키트가 제공된다. 키트는 유전자, 특히 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3와 같은 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은:
(a) DNA-함유 샘플을, DNA에서 검출 가능한 변형된 잔기를 제공하기 위해 비메틸화된 시토신 잔기를 선택적으로 변형시키지만 메틸화된 시토신 잔기는 변형시키지 않는 시약과 접촉/처리하고,
(b) 적어도 하나의 프라이머가 시약 처리 이후 오직 메틸화된 또는 비메틸화된 DNA 서열에만 각각 결합하도록 디자인된 적어도 하나의 프라이머쌍을 사용하여 관심의 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 적어도 일부를 증폭하며, 프라이머쌍에서 적어도 하나의 프라이머는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 또는 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 (적절하게) 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성되는 것을 포함하는 DNA-함유 샘플에서, CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 여기에 기술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용하여 샘플에서 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하여, 샘플에서 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3의 존재는 암 또는 암에 대한 소인의 지표인 암 또는 암에 대한 소인을 진단하는 방법이 제공된다.
다른 양태에서, 여기에서 기술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용하여 샘플의 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자에서 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3의 존재는 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 양성 종양 존재의 지표인 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 양성 종양의 존재를 결정하는 방법이 제공된다. "CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 양성 종양" 은 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 항원을 발현하는 어떠한 (환자로부터 분리된) 종양 또는 종양 세포를 의미한다.
본 발명은 또한 여기에 기술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용하여 환자의 샘플에서 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 만약 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자가 비메틸화되었을 때 대상은 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료제를 이용한 치료를 위해 (바람직하게) 확인되고 및/또는 선택되는 것을 포함하는 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료제를 이용한 치료에 적합한 환자를 확인 및/또는 선택하는 방법을 제공한다. 따라서 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3을 가지는 환자가 유전자가 메틸화된 환자보다 더 선호된다.
선택적으로, 만약 유전자가 비메틸화되지 않았을 때, 대상은 바람직하게는 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료제를 이용한 치료를 위해 확인되지 않고 및/또는 선택되지 않는다.
관련된 양태에서, 본 발명은 여기에 기술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용하여 환자의 샘플에서 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 만약 유전자가 비메틸화되었을 때 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료제를 이용한 성공적인 치료의 가능성이 만약 유전자가 메틸화되었을 경우 보다 더 높은 암의 성공적인 치료의 가능성을 예측하는 방법을 제공한다.
선택적으로, 샘플에서 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3의 부존재는 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료제를 이용한 치료에 대한 저항의 가능성이 유전자가 메틸화 되었을 경우보다 더 높은 것을 나타낸다. 따라서, 메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 검출은 면역치료제를 이용한 성공적인 치료의 개연성이 낮은 것을 나타낸다.
다른 관련된 양태에서, 본 발명은 여기에 기술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용하여 환자의 샘플에서 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 만약 유전자가 비메틸화되었을 때 치료를 위해 면역치료제가 선택되는 암에 대한 적합한 치료 식이요법(regimen)을 선택하는 방법을 제공한다.
선택적으로, 만약 유전자가 비메틸화되지 않은 경우, 면역치료제를 이용한 치료는 금기이다.
또한 면역치료제의 투여를 포함하며, 대상은 본 발명의 임의의 방법에 따라서 또는 여기에 기술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용하여 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태 측정을 기초로 하여 치료를 위해 선택되는 대상에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
바람직하게는 여기에 기술된 모든 다른 양태에 있어서, 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 검출은 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 단백질의 증가된 수준에 대응한다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 방법에 따라서 및/또는 여기에 기술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용하여 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태를 측정하고, 이후 환자에게 여기에 기술된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 조성물은 바람직하게 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자가 비메틸화된 상태로 발견되는 경우 투여된다.
다른 양태에서, 본 발명의 임의의 방법에 따라서 또는 여기에 기술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용하여 종양 조직에서 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태를 측정하고, 이후 여기에 기술된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 종양 조직 제거 치료를 받은 환자의 CCTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 발현 종양의 재발에 민감한 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 조성물은 바람직하게 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자가 비메틸화된 상태로 발견되는 경우 투여된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 환자는 치료를 위해 본 발명의 임의의 방법에 따라서 또는 여기에 기술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용한 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태 측정을 기초로 하여 선택되는 종양으로 고통 받는 환자를 치료하기 위한 약의 제조에서 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다. 또한 환자는 치료를 위해 본 발명의 임의의 방법에 따라서 또는 여기에 기술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용한 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태 측정을 기초로 하여 선택되는 종양으로 고통받는 환자의 치료에 사용하기 위한 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3을 포함하는 조성물이 제공된다.
또 다른 실시태양에서, 환자는 치료를 위해 본 발명의 임의의 방법에 따라서 또는 여기에 기술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용한 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태 측정을 기초로 하여 선택되는 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 발현 종양의 재발에 민감한 환자를 치료하기 위한 약의 제조에서 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 또한 환자는 치료를 위해 본 발명의 임의의 방법에 따라서 또는 여기에 기술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용한 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태 측정을 기초로 하여 선택되는 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 발현 종양의 재발에 민감한 환자의 치료에 사용하기 위한 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3을 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있음
도 1: 염색체 상에 CTAG1B 분석의 로컬리제이션(Localization). 하나의 잠재적인(potential) 전사 개시 위치(transcription start site; TSS)가 기술되어 있다. 유전자 구조의 시작은 다음과 같이 표현된다: 속이 비어있는 박스들은 300bp 프로모터 영역을 나타내며, 이후 수직선은 잠재적인 TSS를 나타내고, 속이 차있는 박스들은 제 1 엑손들을 나타낸다. 분석 위치들은 속이 비어있는 박스들로 나타나 있으며, 이들에 대응하는 이름인 "(U)"는 비메틸화 특이적 분석(Unmethylation specific assay)(즉, 저메틸화에 대한 특이적 분석)을 나타낸다. 다수의 CpG 수(count)는 20kb 영역에 걸쳐 발견된다.
도 2: 염색체 상에 CTAG2 분석의 로컬리제이션(Localization). 하나의 잠재적인 전사 개시 위치(transcription start site; TSS)가 기술되어 있다. 유전자 구조의 시작은 다음과 같이 표현된다: 속이 비어있는 박스들은 300bp 프로모터 영역을 나타내며, 이후 수직선은 잠재적인 TSS를 나타내고, 속이 차있는 박스들은 제 1 엑손들을 나타낸다. 분석 위치들은 속이 비어있는 박스들로 나타나 있으며, 이들에 대응하는 이름인 "(U)"는 비메틸화 특이적 분석(Unmethylation specific assay)(즉, 저메틸화에 대한 특이적 분석)을 나타낸다. 다수의 CpG 수(count)는 20kb 영역에 걸쳐 발견된다. CTAG2는 또한 CTAG2_1로도 명명된다,
도 3: 염색체 상에 PRAME 분석의 로컬리제이션(Localization). 하나의 잠재적인 전사 개시 위치(transcription start site; TSS)가 기술되어 있다. 유전자 구조의 시작은 다음과 같이 표현된다: 속이 비어있는 박스들은 300bp 프로모터 영역을 나타내며, 이후 수직선은 잠재적인 TSS를 나타내고, 속이 차있는 박스들은 제 1 엑손들을 나타낸다. 분석 위치들은 속이 비어있는 박스들로 나타나 있으며, 이들에 대응하는 이름인 "(U)"는 비메틸화 특이적 분석(Unmethylation specific assay)(즉, 저메틸화에 대한 특이적 분석)을 나타낸다. 다수의 CpG 수(count)는 20kb 영역에 걸쳐 발견된다.
도 4: 염색체 상에 하나의 MAGE-A3 분석(MAGE-A3 GO_2 U 분석)의 로컬리제이션(Localization). 하나의 잠재적인 전사 개시 위치(transcription start site; TSS)가 기술되어 있다. 유전자 구조의 시작은 다음과 같이 표현된다: 속이 비어있는 박스들은 300bp 프로모터 영역을 나타내며, 이후 수직선은 잠재적인 TSS를 나타내고, 속이 차있는 박스들은 제 1 엑손들을 나타낸다. 분석 위치는 이들의 대응하는 이름인, 비메틸화 특이적 분석을 가리키는 "(U)"와 연관된 속이 빈 박스들로 나타나 있다(즉, 저메틸화에 대한 특이적 분석). 다수의 CpG 수(count)는 20kb 영역에 걸쳐 발견된다.
도 5: Amplifluor®기술의 개략적인 개관
프라이머쌍에서 적어도 하나의 프라이머(정방향 프라이머)는 분자에너지 전달쌍(molecular energy transfer pair)의 도너(FAM) 및 억셉터 모이어티(DABCYL)를 운반하는 "헤어핀" 구조를 포함한다. 본 도면은 (프라이머에 대한) 헤어핀 표지화된 구조에 연결된 정방향 프라이머로도 불리는 센스 프라이머의 경우를 설명한다. 증폭이 없을 때에, 도너 모이어티에 의해 방출되는 형광은 억셉터 모이어티에 의해 효과적으로 받아들여지며, 형광의 소광을 유도한다. 증폭 동안, 프라이머는 증폭 산물에 통합된다. 두 번째의 증폭 동안 스템 루프 또는 헤어핀 구조는 붕괴된다. 억셉터 모이어티는 더 이상 효과적으로 도너 모이어티에 의해 방출되는 형광을 소광시킬 수 없다. 따라서, 도너 모이어티는 검출 가능한 형광 신호를 생성한다.
도 6: CTAG1B_1S 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 48개의 비소세포폐암(NSCLC) 샘플에 대한 CTAG1B(유전자 통칭 NY-ESO-1) 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.35
도 7: CTAG2_1_AS 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 48개의 비소세포폐암(NSCLC) 샘플에 대한 CTAG2(유전자 통칭 LAGE-1) 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.86; 두 기술들 사이의 일치는 87.5%이다.
도 8: CTAG2_1_S 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 48개의 비소세포폐암(NSCLC) 샘플에 대한 CTAG2(유전자 통칭 LAGE-1) 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.88; 두 기술들 사이의 일치는 87.5%이다.
도 9: CTAG2_2_S 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 48개의 비소세포폐암(NSCLC) 샘플에 대한 CTAG2(유전자 통칭 LAGE-1) 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.47; 두 기술들 사이의 일치는 68.8%이다.
도 10: CTAG2_3_S 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 48개의 비소세포폐암(NSCLC) 샘플에 대한 CTAG2(유전자 통칭 LAGE-1) 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.55; 두 기술들 사이의 일치는 66.7%이다.
도 11: PRAME_7_S 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 48개의 비소세포폐암(NSCLC) 샘플에 대한 PRAME 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.62; 두 기술들 사이의 일치는 83.3%이다.
도 12: PRAME_1_AS 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 48개의 비소세포폐암(NSCLC) 샘플에 대한 PRAME 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.39; 두 기술들 사이의 일치는 66.7%이다.
도 13: PRAME_2_S 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 48개의 비소세포폐암(NSCLC) 샘플에 대한 PRAME 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.64; 두 기술들 사이의 일치는 79.2%이다.
도 14: PRAME_3_AS 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 48개의 비소세포폐암(NSCLC) 샘플에 대한 PRAME 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.73; 두 기술들 사이의 일치는 85.4%이다.
도 15: PRAME_6_AS 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 48개의 비소세포폐암(NSCLC) 샘플에 대한 PRAME 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.24; 두 기술들 사이의 일치는 66.7%이다.
도 16: CTAG1B_1_S 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 31개의 흑색종 샘플에 대한 CTAG1B(유전자 통칭 NY-ESO-1) 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치; 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다.
도 17: CTAG2_1_AS 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 31개의 흑색종 샘플에 대한 CTAG2(유전자 통칭 LAGE-1) 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.63; 두 기술들 사이의 일치는 74.2%이다.
도 18: CTAG2_1_S 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 31개의 흑색종 샘플에 대한 CTAG2(유전자 통칭 LAGE-1) 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.62; 두 기술들 사이의 일치는 74.2%이다.
도 19: CTAG2_2_S 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 31개의 흑색종 샘플에 대한 CTAG2(유전자 통칭 LAGE-1) 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.34; 두 기술들 사이의 일치는 51.6%이다.
도 20: CTAG2_3_S 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 31개의 흑색종 샘플에 대한 CTAG2(유전자 통칭 LAGE-1) 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.58; 두 기술들 사이의 일치는 74.2%이다.
도 21: PRAME_7_S 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 31개의 흑색종 샘플에 대한 PRAME 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.70; 두 기술들 사이의 일치는 90.3%이다.
도 22: PRAME_1_AS 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 31개의 흑색종 샘플에 대한 PRAME 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.26; 두 기술들 사이의 일치는 93.5%이다.
도 23: PRAME_2_S 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 31개의 흑색종 샘플에 대한 PRAME 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.29; 두 기술들 사이의 일치는 90.3%이다.
도 24: PRAME_3_AS 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 31개의 흑색종 샘플에 대한 PRAME 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.48; 두 기술들 사이의 일치는 90.3%이다.
도 25: PRAME_6_AS 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 31개의 흑색종 샘플에 대한 PRAME 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.51; 두 기술들 사이의 일치는 90.3%이다.
도 26: CTAG2_1_AS 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 28개의 유방암 샘플에 대한 CTAG2 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.56; 두 기술들 사이의 일치는 71.4%이다.
도 27: CTAG2_3_S 탈메틸화 분석으로 얻은 실시간 MS-PCR의 결과 및 28개의 유방암 샘플에 대한 CTAG2 실시간 RT-PCR 발현 데이터 사이의 일치. 수직으로 연속된 두꺼운 선은 탈메틸화 분석에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타내고, 수평으로 두꺼운 선은 발현 컷-오프를 나타낸다. 선형 회귀(linear regression)는 검은 선에 의해 표시된다; R=0.34; 두 기술들 사이의 일치는 78.6%이다.
본 발명은 DNA-함유 샘플에서 메틸화된 또는 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 존재 및/또는 양 검출을 위한 분석을 제공한다. 이 분석을 개발하기 위하여, CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자에서 메틸화되기 쉬운 영역을 확인하는 것이 필요하며, CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화된 형태와 비메틸화된 형태를 구별할 수 있는 특정 올리고뉴클레오티드를 개발하는 것이 필요하다.
따라서, 제 1 양태에서, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 또는 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 제공한다.
이러한 올리고뉴클레오티드들은 관심 유전자의 메틸화 상태 검출에 유용하다. 올리고뉴클레오티드는 프라이머 및/또는 프로브로 역할을 할 수 있다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 비메틸화된 형태의 유전자를 검출한다. 특정 실시태양에서, 이러한 올리고뉴클레오티드는 여기에 기술되고, 서열번호 43으로 나타나는 헤어핀 구조를 포함한다. 이와 같은 선호되는 올리고뉴클레오티드들은 비메틸화된 형태의 유전자를 검출하기 위해 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 또는 61에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나 또는 이들로 구성된다.
본 발명의 "유전자" 또는 "관심 유전자" 는 바람직하게 CTAG1B 및/또는 CTAG2 및/또는 PRAME 및/또는 MageA3 유전자이다.
"CTAG1B"는 HUGO 유전자 명명 위원회(HUGO Gene Nomenclature Committee)에 의해 승인되는 유전자 부호이다. 상기 유전자는 X염색체 상에 위치하며(위치: Xq28); 유전자 서열은 접근번호(accession number) U87459 및 NM 001327로 표시된다. 총체 유전자 ID(ensemble gene ID)는 ENSG00000184033이다. 유전자는 암/고환 항원 1B [호모 사피엔스]를 인코딩한다. CTAG1B는 종종 "CTAG1B" 또는 "CTAG" 또는 "CTAG1" 또는 "NY-ESO-1" 또는 "ESO1" 또는 "LAGE-2" 또는 "LAGE2B"로도 교체되어 언급되며, 모두는 여기서 사용된다. 이 유전자의 저메틸화(Hypomethylation)는 예를 들어, 흑색종, 폐암(NSCLC 포함), 전립선암 또는 난소암과 같은 암의 발생률과 연관된다.
"CTAG2"는 HUGO 유전자 명명 위원회(HUGO Gene Nomenclature Committee)에 의해 승인되는 유전자 부호이다. 상기 유전자는 X염색체 상에 위치하며(위치: Xq28); 유전자 서열은 접근번호(accession number) AJ012833로 표시된다. 총체 유전자 ID(ensemble gene ID)는 ENSG00000126890이다. 유전자는 암/고환 항원 2 [호모 사피엔스]를 인코딩한다. CTAG2는 종종 "CTAG2" 또는 "CAMEL" 또는 "ESO2" LAGE-1 또는 "LAGE-2b" 또는 "MGC3803" 또는 "MGC138724"로도 교체되어 언급되며, 모두는 여기서 사용된다. 이 유전자의 저메틸화(Hypomethylation)는 예를 들어, 흑색종, 폐암(NSCLC 포함), 방광암, 전립선암, 두경부암, 난소암, 자궁경부암, 대장암, 식도암 또는 간암과 같은 암의 발생률과 연관된다.
"PRAME"은 HUGO 유전자 명명 위원회(HUGO Gene Nomenclature Committee)에 의해 승인되는 유전자 부호이다. 상기 유전자는 22번 염색체 상에 위치하며(위치: 22q11.22); 유전자 서열은 접근번호(accession number) U65011 및 NM 206953로 표시된다. 총체 유전자 ID(ensemble gene ID)는 ENSG00000185686이다. 유전자는 우선적으로 흑색종에서 발현된 항원[호모 사피엔스]을 인코딩한다. PRAME는 종종 "MAPE" 또는 "OIP4"로도 교체되어 언급되며; 모두는 여기서 사용된다. 이 유전자의 저메틸화(Hypomethylation)는 예를 들어, 자궁경부암, 전립선암, 폐암, 난소암, 유방암 또는 두경부 편평세포암과 같은 암의 발생률과 연관된다.
MAGEA3 및 MAGEA6은 HUGO 유전자 명명 위원회(HUGO Gene Nomenclature Committee)에 의해 승인되는 유전자 부호이다. MAGEA3 유전자는 X염색체 상에 위치하며(위치 q28), 유전자 서열은 접근번호(accession number) NM 005362 및 ENSG00000197172로 표시된다. MAGE-A3 유전자는 흑색종 항원 A과, 3(family A, 3)을 인코딩한다. MAGEA6 유전자는 X염색체 상에 위치한다(위치 q28). MAGE-A3은 종종 MAGE-3 또는 MAGEA3으로도 교체되어 언급된다. 이와 유사하게 MAGE-A6은 종종 MAGE-6 또는 MAGEA6으로도 교체되어 언급되며; 모두는 여기서 사용된다. 이들 유전자의 저메틸화(Hypomethylation)는 예를 들어, 흑색종 또는 폐암(NSCLC 포함)과 같은 암의 발생률과 연관된다.
메틸화되기 쉬운 CpG 디뉴클레오티드들은 전형적으로 인간 유전자의 프로모터 및/또는 엑손 및/또는 인트론 영역에 집중된다. 특정 실시태양에서, 유전자의 메틸화 상태는 유전자의 프로모터, 인트론, 엑손1 및/또는 엑손2 영역에서 메틸화의 측정 수준에 의해 평가된다. "프로모터"는 전사 개시 위치(TSS)로부터 업스트림 영역으로, TSS로부터 대략 10 Kb, 4 Kb, 3Kb, 1 Kb, 500 bp 또는 150 내지 300 bp 사이에 걸쳐져 있다. 프로모터 영역의 CpG 분포가 다소 부족할 때 인트론 및/또는 엑손 영역에서 메틸화 수준이 평가될 수 있다. 평가를 위한 영역은 인트론 및 엑손 서열을 모두 포함하는 영역일 수 있으며, 따라서 양 영역들을 중첩한다.
용어 "메틸화 상황" 또는 "메틸화 상태"는 DNA 서열 내의 하나 또는 복수의 CpG 디뉴클레오티드에서 5-메틸시토신("5-mCyt")의 존재 또는 부존재를 말한다. "과메틸화"는 정상 수준 이상으로 메틸화 수준이 증가하는 것으로 정의된다. 따라서, 이는 주로 프로모터 영역 내의 유전자의 특정 CpG 위치에서 시토신(5-mCyt)의 비정상적인 메틸화와 관련된다. 정상 수준의 메틸화는 예를 들어, 비-암성 세포(non-cancerous cell) 내의 메틸화 수준의 결정에 의해 정의될 수 있다.
"저메틸화"는 (적절한 컨트롤 샘플에서 발견되는) "정상" DNA 서열 내의 CpG 디뉴클레오티드에서 발견되는 5-mCyt의 양과 비교하여, (테스트 DNA 샘플의) DNA 서열 내의 하나 또는 복수의 CpG 디뉴클레오티드에서 5-mCyt의 감소된 존재를 말한다. 다시, 메틸화의 "정상" 수준은 예를 들어, 비-암성 세포(non-cancerous cell) 내의 메틸화 수준의 결정에 의해 정의될 수 있다. 본 발명에서, CTAG1B, CTAG2 및/또는 PRAME 유전자(또는 특정 태양에서의 MageA3)의 저메틸화는 신뢰성 있는 암의 지표를 제공하는 이 종양 관련 항원 유전자(tumour associated antigen gene)의 증가된 발현의 지표이다.
제 2 양태에서 본 발명은 DNA-함유 샘플을 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 또는 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 DNA-함유 샘플에서 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 존재 및/또는 양을 검출하는 방법을 제공한다. 방법은 바람직하게는 유전자가 메틸화되었는지 또는 비메틸화되었는지 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 이는 여기에서 논의된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드가 DNA-함유 샘플에서 DNA에 안정되게 결합되어 있는지에 의존할 수 있다. 메틸화 상태를 평가하는 기술들은 각각 다른 접근법에 기초한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 적용하는 임의의 적합한 기술이 사용될 수 있다. 일 실시태양에서, 메틸화된 CpG 디뉴클레오티드 모티프(motifs)를 검출하기 위한 접근법은 검출 가능한 변형된 잔기를 제공하기 위해 DNA에서 비메틸화된 시토신 잔기를 선택적으로 변형시키는 시약을 사용한다. 시약은 메틸화된 시토신 잔기를 변형시키지 않으며, 따라서 바람직하게는 핵산 증폭을 수반하는 다운스트림 과정에서 비메틸화된 핵산 분자와 메틸화된 핵산 분자 사이의 구별을 가능하게 해준다. 일 실시태양에서, 시약은 비메틸화된 시토신 잔기를 선택적으로 탈아미노화(deaminate)하는 역할을 할 수 있다. 따라서, 시약에 노출시킨 후 비메틸화된 DNA는 대응하는 메틸화된 DNA와는 다른 핵산 서열을 포함한다. 시토신의 탈아미노화는 티민(thymine)과 동일한 염기 짝지음(base pairing) 특성을 가지는 우라실 잔기의 존재를 초래하며, 따라서 시토신의 염기 짝지음 행동과는 다르다. 이는 메틸화된 시토신과 비-메틸화된 시토신 사이의 구별을 가능하게 해준다.
서열 차이를 평가를 위한 유용한 통상적인 기술들은 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 것이다. 프라이머 디자인에 대한 두 가지 접근법이 가능하다. 첫째로, 프라이머들은 그들 자신이 DNA 메틸화가 가능한 어떠한 위치도 커버하지 않도록 디자인될 수 있다. 차이를 나타내는 메틸화의 위치에서의 서열 변화는 두 프라이머 결합 위치들 사이에 위치하고, 서열 변화의 시각화는 추가적인 분석 단계를 필요로 한다. 두 번째로, 프라이머들은 초기 처리된 서열의 메틸화된 또는 비메틸화된 변형 중 하나와 특이적으로 혼성화하도록 디자인될 수 있다. 혼성화 이후, 증폭 반응이 수행될 수 있으며, 증폭 산물들은 당업계에 알려진 임의의 검출 시스템을 사용하여 분석된다. 증폭된 산물의 존재는 프라이머가 DNA에 혼성화된 것을 나타낸다. 프라이머의 특이성은 DNA가 변형되었는지 아닌지를 나타내며, 차례로 DNA가 메틸화되었는지 아닌지를 나타낸다. 만약 표적에 대해 충분한 상보성 영역(region of complementarity)(예를 들어 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 뉴클레오티드)이 있다면, 프라이머는 혼성화를 방해하지 않지만 다른 조작에 유용할 수 있는 추가적인 뉴클레오티드 잔기를 또한 포함할 수 있다. 이러한 다른 잔기들의 예는 제한효소 갈라짐(cleavage)을 위한 위치, 리간드 결합을 위한 또는 인자(factor) 결합을 위한 위치 또는 링커 또는 반복(repeats), 또는 시각화의 목적을 위한 잔기일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 변형된 메틸화된 잔기들에 대해 특이하거나 또는 특이하지 않을 수 있다. 프라이머로 사용하기 위해 선호되는 올리고뉴클레오티드들은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 또는 61 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이들로 필수적으로 구성되거나 또는 이들로 구성된다.
변형된 핵산과 변형되지 않은 핵산을 구별하기 위한 더 나아간 종종 사용되는 보충적인 방법은 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것이다. 이와 같은 프로브는 변형된 핵산 또는 증폭에 의해 얻어지는 산물과 같은 변형된 핵산의 이후 산물에 바로 혼성화할 수 있다. 프로브-기반 분석은 특정 서열에 대한 올리고뉴클레오티드 혼성화 및 이후 혼성화의 검출을 이용한다. 증폭 산물이 검출되기 전에 예를 들어, 침전 단계와 같은 추가적인 정제 단계가 있을 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 당업계에 알려진 임의의 검출 시스템을 사용하여 표지화될 수 있다. 이는 형광 모이어티, 방사성 동위원소 표지화된 모이어티, 생물발광성 모이어티, 발광성 모이어티, 화학발광성 모이어티, 효소, 기질, 리셉터, 또는 리간드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 프로브로 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 또는 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나 또는 이들로 구성될 수 있다. 바람직하게 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 및 61로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 바람직하게 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나 또는 이들로 구성될 수 있다.
여기서 "올리고뉴클레오티드 프라이머" 는 "프라이머"로 상호교환적으로 언급된다.
마찬가지로, 여기서 "올리고뉴클레오티드 프로브"는 "프로브"와 상호교환적으로 언급된다.
바람직한 실시태양에서, 유전자(또는 이의 부분, 특히 CpG 섬(islands))의 메틸화 상태는 메틸화 특이적 PCR(MSP)을 사용하여 결정된다.
MSP 기법은 당업자에게 친숙할 것이다. MSP 접근에서, DNA는 아황산 수소나트륨(sodium-bisulfite) 처리의 결과로 나타난 서열 차이를 이용하여 메틸화된 DNA로부터 비메틸화된 형태를 구별하기 위해 디자인된 프라이머쌍을 사용하여 증폭될 수 있다(Herman JG et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Sep 3;93(18):9821-6 and WO 97/46705). MSP 기법의 구체적인 예는, 실시간으로 메틸화된 DNA의 신뢰성 있는 정량화를 가능하게 하는 실시간 정량 MSP(QMSP)로 나타난다.
실시간 방법들은 일반적으로 증폭 절차의 연속적인 광학 모니터링 및 산물에 혼합 시 수량화될 수 있고, 수량화는 주형(template) 서열의 복제수의 지표가 되는 형광 표지화된 시약 활용에 기반을 둔다. 이와 같은 표지화된 시약은 2중 가닥 DNA에 우선적으로 결합하며, 2중 가닥 DNA의 결합에 의해 형광이 크게 증진되는 형광 염료일 수 있다. 선택적으로 표지화된 프라이머 및/또는 표지화된 프라이머가 사용될 수 있다. 이들은 잘 알려진 상업적으로 입수 가능한 TAQMAN®, MOLECULAR BEACONS®, AMPLIFLUOR® 및 SCORPION® DzyNA® 등과 같은 실시간 증폭 기술의 특정 응용을 대표한다. 종종, 이들 실시간 방법들은 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 함께 사용된다.
TaqMan 기술은 선형의, 형광 염료 및 소광 염료(quenching dye)를 포함하는 가수분해 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한다. 조사되는 경우, 여기 형광 염료는 에너지를 형광 발광(fluoresencing)하기 보다는 근처의 소광 염료 분자로 전달한다(FRET 원리). TaqMan 프로브는 PCR 산물의 내부 영역에 어닐링하고, 주형을 복제할 때 중합효소의 핵산말단 분해효소 작용에 의해 쪼개어 진다. 이는 소광제(quencher)의 작용을 중단시키고, 보고자 염료(reporter dye)는 각 사이클에서 프로브 쪼개짐(cleavage) 속도에 비례적으로 증가하는 형광을 방출하기 시작한다.
분자 비콘들(Molecular beacons)은 또한 형광 및 소광 염료를 포함하나, 이들은 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence Resonance Energy Transfer; FRET)이 일어나도록 두 염료들을 근접하게 하기 위하여 용액에서 자유로운 동안 헤어핀 구조를 채용하도록 디자인되었다. 비콘이 어닐링 단계 동안 표적에 혼성화할 때 헤어핀은 선형으로 만들어지고, 두 염료들은(도너 및 억셉터/소광제) 분리된다. 도너로부터 검출되는 형광의 증가는 이용할 수 있는 PCR 산물의 양과 관련된다.
스콜피온 프로브와 함께, 서열-특이적 프라이밍 및 PCR 산물 검출은 단일 올리고뉴클레오티드를 사용하여 달성된다. 스콜피온 프로브는 비혼성화된 상태에서 스템-루프(stem-loop) 형태를 유지하고, FRET는 형광단(fluorophore) 및 소광제(quencher) 사이에서 일어난다. 스템의 3' 부분은 또한 프라이머의 신장(extension) 산물에 상보적인 서열을 포함한다. 이 서열은 증폭이 불가능한(non-amplifiable) 모노머를 통해 특정 프라이머의 5' 말단에 연결된다. 스콜피온 프라이머의 신장 이후 특정 프로브 서열은 확장된 앰플리콘(amplicon) 내의 이의 보체(complement)와 결합할 수 있으며, 따라서 헤어핀 루프를 개방시켜 형광단(fluorophore) 및 소광제(quencher)를 분리시키고, 형광 신호를 제공한다.
중메틸(heavymethyl)에서, 프라이밍은 메틸화 특이적이나, 확장 불가능한 올리고뉴클레오티드 차단제(non-extendable oligonucleotide blockers)는 프라이머들 대신에 자신들에게 이러한 특이성을 제공한다. 차단제는 메틸화-특이적 방법으로 아황산수소-처리된 DNA에 결합되고, 그들 결합 부위는 프라이머 결합 부위와 중첩된다. 차단제가 결합되었을 때, 프라이머는 결합할 수 없고, 그러므로 앰플리콘은 형성되지 않는다. 중메틸은 실시간 검출과 함께 결합하여 사용될 수 있다.
PlexorTM qPCR 및 qRT-PCR 시스템은 정량적인 PCR 분석(quantitative PCR analysis)을 달성하기 위해 두 변형된 뉴클레오티드 사이의 특이적 상호작용을 이용한다. PCR 프라이머들 중 하나는 5′말단에서 iso-dC 잔기에 인접한 형광 표지를 포함한다. 두 번째 PCR 프라이머는 표지화되지 않는다. 반응 혼합물은 디옥시뉴클레오티드 및 dabcyl 소광제로 변형된 iso-dGTP를 포함한다. Dabcyl-iso-dGTP는 우선적으로 iso-dC 잔기에 상보적인 위치에서 결합된다. 이 위치에서 dabcyl-iso-dGTP의 결합은 상보적인 가닥에서 형광 염료의 소광 및 형광의 감소를 초래하며, 이는 증폭 동안 정량을 가능하게 한다. 이러한 다양한 반응들에서, 프라이머쌍이 다른 형광단과 함께 각각의 표적 서열에 대해 사용된다.
따라서 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 또는 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진 올리고뉴클레오티드는 앞에 서술한 관심 유전자의 메틸화 상태의 검출을 위한 방법에서 프라이머 또는 프로브로 쓰여질 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명은:
(a) DNA-함유 샘플을, DNA에서 검출 가능한 변형된 잔기를 제공하기 위해 비메틸화된 시토신 잔기를 선택적으로 변형시키지만 메틸화된 시토신 잔기는 변형시키지 않는 시약과 접촉/처리하고,
(b) 적어도 하나의 프라이머가 시약 처리 이후 오직 메틸화된 또는 비메틸화된 DNA 서열 각각에만 결합하도록 디자인된 적어도 하나의 프라이머쌍을 사용하여 관심의 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 적어도 일부를 증폭하는 것을 포함하며, 프라이머쌍에서 적어도 하나의 프라이머는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 또는 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어지는 것을 포함하는 DNA-함유 샘플에서 관심의 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 존재 및/또는 양을 검출하는 실시간 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서 관심의 유전자는 바람직하게는 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자이다. 바람직하게, 프라이머쌍에서 적어도 하나의 프라이머는 조정된 분자 에너지 전달쌍의 도너 및 억셉터 모이어티를 운반하는 스템 루프 구조를 포함하여 증폭 부재 시, 억셉터 모이어티는 (여기에 의해) 도너 모이어티에 의해 방출된 형광을 소광하며, 증폭 동안 스템 루프 구조는 붕괴되며, 이를 통해 도너 및 억셉터 모이어티는 충분히 분리되어 검출 가능한 형광 신호를 제공한다. 이는 실시간으로 검출될 수 있어 관심의 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 존재의 증거를 제공할 수 있다. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 또는 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진 프라이머쌍에서 프라이머는 바람직하게는 스템 루프 구조를 가진다.
특정 실시태양에서, 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 유전자 복제수(copy number)가 결정된다. 여기에서 서술된 방법은 바람직하게,
(c) 유전자 복제수의 산출을 제공하기 위해, 관심의 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 표준곡선에 대한 실시간 검출의 결과를 정량화하는 단계를 추가적으로 포함한다.
바람직하게 (c) 단계에서 증폭은 사이클 문턱값(threshold value)이 40 이하인 경우 유효한 것으로 여겨지는 것을 또 다른 특징으로 한다.
CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자와 같은 유전자에 있어서, 유전자의 비메틸화된 변형(version)의 검출은 주요한 관련이 있을 수 있다.
본 발명의 방법은 샘플에서 관심의 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자 존재를 실시간으로 검출할 수 있게 한다. 본 발명의 방법들이 정량법들이기 때문에 관심 유전자의 메틸화된 또는 비메틸화된 형태의 (상대적인)양은 또한 반응 결과로 결정될 수 있다.
하지만, 실시간 방법은 활용될 필요가 없다. 분석들은 오직 샘플에 표적 DNA가 존재하는지 아닌지를 발견하기 위해 수행될 수 있다.
종말점 증폭 탐지 기술들(End-point amplification detection techniques)은 실시간 PCR을 위해 널리 사용되는 동일한 접근을 활용한다. 따라서, 본 발명의 방법은 DNA-함유 샘플에서 관심의 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 존재 및/또는 양을 탐지하는 종말점 방법을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은:
(a) DNA-함유 샘플을, DNA에서 검출 가능한 변형된 잔기를 제공하기 위해 비메틸화된 시토신 잔기를 선택적으로 변형시키지만 메틸화된 시토신 잔기는 변형시키지 않는 시약과 접촉/처리하고,
(b) 적어도 하나의 프라이머가 시약 처리 이후 오직 메틸화된 또는 비메틸화된 DNA 서열 각각에만 결합하도록 디자인된 적어도 하나의 프라이머쌍을 사용하여 관심의 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 적어도 일부를 증폭하는 것을 포함하며, 프라이머쌍에서 적어도 하나의 프라이머는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 또는 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어지는 것을 포함하는 DNA-함유 샘플에서 관심의 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 존재 및/또는 양을 검출하는 (종말점) 방법을 제공한다.
상기한대로 본 발명의 방법에서 관심의 유전자는 바람직하게는 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME이다. 바람직하게, 프라이머쌍에서 적어도 하나의 프라이머는 상기에서 서술한 특징을 가지는 분자 에너지 전달쌍의 도너 및 억셉터 모이어티를 운반하는 스템 루프 구조를 포함한다. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 또는 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진 프라이머쌍에서 프라이머는 바람직하게는 스템 루프 구조를 가진다.
CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자에 있어서, 유전자의 비메틸화된 변형(version)의 검출은 주요한 관련이 있을 수 있다. 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 또는 61 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진 프라이머들은 시약으로 처리한 이후 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2 및/또는 PRAME DNA를 검출하기 위한 목적을 위해 디자인되었다.
비메틸화된 유전자의 부재는 메틸화된 유전자 존재의 지표이다.
메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 유전자 복제수가 요구되는 경우, 방법은:
(c) 유전자 복제수의 산출을 제공하기 위해, 관심의 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 표준곡선에 대한 검출의 결과를 정량화하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 모든 실시태양은 본 발명의 종말점 양태에 적용 가능하며, 따라서 필요한 변경을 가하여 적용할 수 있다. 종말점 분석은 증폭의 마지막에서 형광을 결정하기 위해 형광 플레이트 인식기(fluorescent plate reader) 또는 적절한 기계사용을 할 수 있다.
본 발명의 방법은 가장 바람직하게는 임의의 적절한 (DNA 함유) 테스트 샘플 상에서 수행되는 생체 밖(ex vivo) 또는 생체 외(in vitro) 방법이다. 하지만 일 실시태양에서, 방법은 또한 샘플을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 테스트 샘플은 DNA-함유 샘플이며, 특히 관심 유전자를 포함하는 DNA-함유 샘플이다. 본 발명의 방법은 질병의 진단에 사용될 수 있으며, 이는 특히 관심 유전자의 메틸화가 질병의 발병과 연결되었을 (것으로 알려진) 경우이다.
DNA-함유 샘플은 임의의 적절한 조직 샘플 또는 체액(body fluid)을 포함할 수 있다. 바람직하게, 테스트 샘플은 피험자(human subject)로부터 얻어진다. 암 적용에 있어서, 샘플은 암성으로 의심되는 조직 또는 대표적인 체액으로부터 얻어진 조직 샘플을 포함할 수 있다.
CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자의 저메틸화는 폐암과 연관되어 있으며, 따라서 본 발명은 폐암에 적용될 수 있다. 따라서 일 실시태양에서, CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자를 포함하는 본 발명의 방법에 사용되는 테스트 샘플은 바람직하게는 폐 세포 또는 폐 세포로부터의 핵산(분자)를 포함한다. 가장 바람직하게 샘플은 포르말린-고정되고 파라핀에-묻힌(FFPE) 조직이다. 폐암의 두 종류가 있다: 비소세포폐암(NSCLC) 및 소세포폐암(SCLC)이다. 상기 명칭들은 종양에서 발견되는 세포의 종류를 간단하게 설명한다. 테스트 샘플은 바람직하게 비소세포폐암(NSCLC)으부터의 세포 또는 핵산을 포함한다. NSCLC는 편평상피암, 선암종, 및 대세포암을 포함하며, 폐암의 약 80%를 차지한다. 바람직한 실시태양에서, 암이 NSCLC일 때 샘플은 폐 조직 샘플 또는 타액 샘플 또는 혈청 샘플이다. NSCLC는 치료하기 어려우며, 이용 가능한 치료법들은 가능한 한 오랫동안 생명을 연장하며 질병의 증상을 경감하는 목표를 가지는 경향이 있다. NSCLC는 가장 흔한 종류의 폐암이며, 안 좋은 결과와 연관되어 있다.
CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자의 저메틸화는 또한 흑색종과 연관되어 있으며, 따라서 본 발명은 흑색종에 적용될 수 있다. 흑색종은 조직병리학적 용어에서 잘 정의된 색소가 있는, 쉽게 접근 가능한 외상(eadily accessible lesion)이다. 초기 방사상 성장 단계(radial growth phase; RGP) 흑색종은 표피 및 유두진피 내부로 침입할 수 있지만 전이 능력은 가지고 있지 않다; 이 단계에서의 절제는 대체로 완벽하게 치료된다. 이후 일어나는 수직 성장 단계(vertical growth phase; VGP)는 전이가 가능한 보다 침략적인 단계로의 변이를 나타낸다. 따라서 RGP/VGP 변이에서 나타나는 유전자 발현에서의 변화는 관심의 대상이다. 따라서 추가적인 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 사용되기 위한 보다 바람직한 테스트 샘플은 흑색종 세포 또는 흑색종 세포로 부터의 핵산을 포함한다. 바람직하게, 테스트 샘플은 피부 외상으로부터 얻어진다.
CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자의 저메틸화는 또한 유방암과 연관되어 있으며, 따라서 본 발명은 유방암에 적용될 수 있다. 유방암에는 두 개의 큰 그룹이 있다: 비침습성 암 및 침습성 암. 비침습성 암은 소엽상피내암(lobular carcinoma in situ) 및 유관상피내암(ductal carcinoma in situ)을 포함한다. 불행하게도, 유방암은 종종 기저막(basement membrane)을 통해 자라고, 대략 95%의 모든 유방암들은 침윤성 또는 침습성 암이다. 가장 흔한 형태의 침습성 유방암(약 75%)은 수유관에서 발생하고 관벽을 통해 퍼지는 침습성 유관암이다. 침습성 소엽암(lobular carcinoma)은 젖샘에서 기원하며, 침습성 유방암의 10 내지 15%를 차지한다. 보다 덜 일반적인 형태의 침습성 유방암은 다음을 포함한다: 염증성 유방암(inflammatory breast cancer), 유두의 파제트병(Paget's disease of the nipple), 수양암(medullary carcinoma), 점액암(mucinous carcinoma), 엽상종양(phyllodes tumor), 및 관상암(tubular carcinoma). 드물게 (약 1%), 육종(sarcomas)(연결조직의 암)이 유방에서 발생한다. 개인은 침습성 및 비침습성 유방암의 하나, 다른 것, 또는 조합을 발달시킬 수 있다. 따라서, 추가적인 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 사용되기 위한 보다 바람직한 테스트 샘플은 유방암 세포 또는 유방암 세포로 부터의 핵산 분자를 포함한다. 가장 바람직하게, 테스트 샘플은 유방암 조직으로부터 얻어진다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 다른 DNA-함유 샘플들은 진단, 예후, 또는 개인 특유의 의약 용도를 위한 샘플들을 포함한다. 이 샘플들은 예를 들어, 파라핀 고정된 조직으로부터, 동결된 종양 조직 샘플로부터, 신선한 종양 조직 샘플로부터, 또는 신선한 동결 체액으로부터 생검법(biopsies) 또는 미세바늘 흡출(fine needle aspirate)과 같은 외과적인 샘플들로부터 얻어질 수 있다. 비제한적인 예들은 전혈(whole blood), 골수(bone marrow), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 복강액(peritoneal fluid), 흉수(pleural fluid), 림프액(lymph fluid), 혈청(serum), 혈장(plasma), 오줌(urine), 유미(chyle), 대변(stool), 정액(ejaculate), 객담(sputum), 유두 흡입물(nipple aspirate), 타액(saliva), 면봉 표본(swabs specimens), 장청소 표본(colon wash specimens) 및 솔 표본(brush specimens)을 포함한다. 조직 및 체액은 당업계에 잘 알려진 많은 임의의 적절한 방법을 사용하여 수집될 수 있다. 파라핀 고정된 표본의 평가는 직접 또는 조직 단면 상에서 수행될 수 있다.
용어 "샘플", "환자 샘플" 및 "환자의 샘플"들은 상호 교환적으로 사용되며, 상기한대로 환자로부터의 DNA-함유 샘플을 의미하는 것으로 의도된다.
본 발명의 방법은 정제된 또는 정제되지 않은 DNA-함유 샘플들 상에서 수행될 수 있다. 하지만, 바람직한 실시태양에서, (a) 단계(시약 처리 단계) 전에 또는 예비적인 단계로써, DNA는 DNA-함유 샘플로부터 분리되고/추출되고/정제된다. 임의의 적절한 DNA 분리 기술이 활용될 수 있다. 정제 기술들의 예는 Molecular Cloning) - A Laboratory Manual (Third Edition), Sambrook and Russell(특히 부록 8 및 챕터 5의 내용 참조)과 같은 표준 문서에서 발견할 수 있다. 바람직한 일 실시태양에서, 정제는 DNA의 알코올 침전을 수반한다. 바람직한 알코올은 에탄올 및 이소프로판올을 포함한다. 적절한 정제 기술은 또한 염-기반 침전(salt-based precipitation) 방법을 포함한다. 따라서, 일 구체적인 실시태양에서, DNA 정제 기술은 오염물질을 침전시키기 위한 고농도 염의 사용을 포함한다. 염은 예를 들어, 초산칼륨(potassium acetate) 및/또는 아세트산암모늄(ammonium acetate)을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어질 수 있다. 방법은 침전된 오염물질의 제거, 뒤이어 알코올 침전을 통한 DNA의 복구 단계를 추가로 포함할 수 있다.
선택적인 실시태양에서, DNA 정제 기술은 오염물질을 세포 용해물(cell lysates)로부터 추출하기 위한 유기 용매 사용에 기초한다. 따라서, 일 실시태양에서, 방법은 DNA를 추출하기 위한 페놀, 클로로폼 및 이소아밀 알코올의 사용을 포함한다. 오염물질들이 유기상으로 분리되고, DNA가 수상에 남아있는 것을 확실하게 하기 위해 적절한 환경이 사용된다. 더 나아가 키트는 자기 비드(magnetic beads)인 실리카-막 등을 사용한다. 이와 같은 키트는 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 입수 가능하다. 본 발명의 방법은 PUREGENE® DNA 검출 키트를 사용할 수 있다.
이러한 정제 기술들의 바람직한 실시태양에서, 추출된 DNA는 에탄올 또는 이소프로판올 침지와 같은 알코올 침지를 통해 복구된다.
임상 센터에서 포르말린-고정되고, 파라핀에-묻힌(FFPE) 종양 조직은 일반적인 종양 조직의 보존 방법이다. 이와 같은 FFPE 묻힌 샘플들은 DNA 추출 전에 탈랍(dewaxing) 단계를 필요로 한다. 바람직한 실시태양에서, FFPE 조직 샘플 또는 슬라이드 상에 고정된 샘플 물질들이 먼저 자일렌(xylene) 처리에 의해 탈랍된다. 자일렌과의 접촉 기간은 자일렌이 샘플과 접촉하고 상호작용하기에 충분해야 한다. 보다 바람직한 실시태양에서, FFPE 샘플들은 100% 자일렌에서 약 2시간 동안 탈파라핀화된다. 이 단계는 완벽한 탈파라핀화를 확실하게 하기 위해 한번 더 반복될 수 있다. 자일렌 처리 이후 샘플들은 70% 에탄올을 사용하여 재수화된다.
본 발명의 방법은 또한 적절하게 샘플에서 분리되고/추출되고/정제된 DNA의 정량화를 (또한 (a) 단계 전에 또는 예비 단계로) 포함할 수 있다. 샘플에서 DNA의 정량화는 임의의 적절한 수단을 사용하여 달성될 수 있다. 핵산 양의 측정은 예를 들어, 분광 광도계(spectrophotometer), 형광 강도 측정기(fluorometer) 또는 자외선 발산기(UV transilluminator)의 사용에 기반할 수 있다. 적절한 기술들의 예는 Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Third Edition), Sambrook and Russell (특히, 부록 8의 내용 참조)과 같은 표준 문서에 기술되어 있다. 바람직한 실시태양에서, 분자 프로브(Molecular Probes)사의 Picogreen® dsDNA 정량 키트, 인비트로젠(Invitrogen)과 같은 키트가 DNA를 정량화하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 검출 가능한 변형된 잔기를 제공하기 위해 DNA에서 비메틸화된 시토신 잔기를 선택적으로 변형시키는 시약을 필요로 할 수 있다.
시약의 작용 양식은 이미 설명된 바 있다. 바람직한 실시태양에서, 시약은 검출 가능한 변형된 잔기를 제공하기 위해 DNA에서 비메틸화된 시토신 잔기를 선택적으로 변형시키지만 메틸화된 시토신 잔기는 변형시키지 않는 아황산수소염 시약(bisulphite reagent)을 포함하는, 이로 필수적으로 이루어진, 또는 이로 이루어진다(Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992 89:1827-1831,). 다수의 아황산수소염 함유 시약들은 당업계에 알려졌으며, 탈아미노화 반응을 수행하기에 적절한 (Zymo Research사의 EZ DNA 메틸화 키트와 같은) 키트가 상업적으로 입수 가능하다. 본 발명의 방법에 사용을 위한 특히 바람직한 시약은 아황산수소나트륨(sodium bisulphite)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
일단 샘플의 DNA가 시약으로 처리되고 나면, 이후 시약에 의해 유발되는 뉴클레오티드 서열의 차이를 검출하는 것이 필요하다. 이는 핵산 증폭 기술을 사용하여 완료된다. 이미 언급한 바와 같이, 기능적으로 관련된 메틸화는 가장 일반적으로 프로모터 영역과 연관되어 있다. 특히, 소위 "CpG 섬(CpG islands)"은 비교적 높은 빈도의 CpG 잔기들을 포함하며, 종종 유전자의 전사 개시 위치 근처에서 발견된다. 예를 들어 MAGE-3과 같은 몇몇 유전자의 경우, 프로모터 영역에서 CpG 분포는 다소 부족하다. 이와 같은 경우에 메틸화를 위한 유전자의 인트론 및 엑손 영역을 평가하는 것이 적절할 수 있다. 관심 유전자의 CpG 섬 확인을 가능하게 해주는 다양한 소프트웨어 프로그램들이 존재한다. 따라서, 본 발명의 방법은 적어도 하나의 프라이머쌍을 사용하여 적어도 메틸화된 또는 비메틸화된 관심 유전자의 일부분을 증폭하는 것을 포함할 수 있다. 상기에서 기술한 바와 같이, 메틸화 상태가 조사된 관심 잔기들이 일반적으로 관심 유전자의 정의된 CpG 섬 및/또는 프로모터 영역 및/또는 인트론 영역 및/또는 엑손 영역에서 발견되기 때문에 프라이머쌍은 일반적으로 전체 보다는 오직 유전자의 (이 영역 내에서) 일부만을 증폭시킬 것이다. 증폭 산물이 관심 유전자의 존재의 신뢰성 있는 지표로써 검출 가능하다면, 유전자의 임의의 적절한 일부분은 본 발명의 방법에 따라서 증폭될 수 있다. 특히, 쉽게 검출 가능한 증폭 산물은 대략 50 내지 250bp 사이이다. 보다 더 바람직하게, 메틸화된 또는 비메틸화된 관심 유전자의 증폭을 위해 적어도 하나의 프라이머쌍을 사용하는 증폭은 대략 100 내지 200bp 사이 또는 50 내지 100bp 사이의 증폭 산물을 제공한다. 이는 특히 일반적으로 제한된 DNA 품질(quality)이 얻어지며, 작은 앰플리콘이 요구되는 조직 샘플 특히, 파라핀 묻힌 샘플에 대해 적절하다. 바람직한 실시태양에서, 검출 가능한 증폭 산물은 적어도 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 62 및 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직하게, (대략) 50bp, 51bp, 52 bp, 53 bp, 54 bp, 55 bp, 56 bp, 57 bp, 58 bp, 59bp,60 bp, 61 bp, 62 bp, 63 bp, 64 bp, 65 bp, 66 bp, 67 bp, 68 bp, 69 bp, 70 bp, 71 bp, 72 bp, 73 bp, 74 bp, 75 bp, 76 bp, 77 bp, 78 bp, 79 bp, 80 bp, 81 bp, 82 bp, 83 bp, 84 bp, 85 bp, 86 bp, 87 bp, 88 bp, 89 bp, 90 bp, 91 bp, 92 bp, 93 bp, 94 bp, 95 bp, 96 bp, 97 bp, 98bp,99 bp, 100 bp,101 bp, 102 bp, 103 bp, 104 bp, 105 bp, 106 bp, 107 bp, 108 bp, 109 bp, 110 bp, 111 bp, 112 bp, 113 bp, 114 bp, 115 bp, 116 bp, 117 bp, 118 bp, 119 bp, 120 bp, 121 bp, 122 bp, 123 bp, 124 bp, 125 bp, 126 bp, 127 bp, 128 bp, 129 bp, 130 bp, 131 bp, 132 bp, 133 bp, 134 bp, 135 bp, 136 bp, 137 bp, 138 bp, 139 bp, 140bp, 141 bp, 142 bp 143 bp, 144 bp, 145 bp, 146 bp, 147 bp, 148 bp, 149 bp, 또는 150 bp의 증폭 산물이 생산된다.
프라이머쌍에서 적어도 하나의 프라이머, 및 바람직하게 모든 프라이머는 시약 처리 이후 오직 메틸화된 또는 비메틸화된 DNA 서열에만 결합하도록 디자인된다. 따라서, 프라이머는 방법의 적용에 따라서 (시약 처리 이후 변형되지 않은 채로 남아있는) 유전자의 메틸화된 형태 또는 (시약에 의해 변형되는) 비메틸화된 형태 중 하나에만 염기 짝지음을 이룸으로써 메틸화된 유전자와 비메틸화된 유전자를 구별하는 역할을 한다. 따라서, 프라이머는 관심 유전자의 적어도 하나의 메틸화 위치를 덮어야만(cover) 한다. 바람직하게, 프라이머는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 메틸화 위치를 포함하는 유전자의 영역에 결합한다. 가장 바람직하게 프라이머는 프라이머 결합 위치 내의 CpG 쌍에서 모든 시토신 잔기가 메틸화된 또는 비메틸화된 서열(즉, "완전히 메틸화된" 또는 "완전히 비메틸화된" 서열)에 결합하도록 디자인된다. 하지만, 만약 단지 하나의 또는 극히 소수의 메틸화 위치들이 기능적으로 적절한 경우, 프라이머는 효과적인 결합이 일어나게 하기 위해 오직 이들 잔기들이 반드시 메틸화되거나(시토신으로 남아있는) 또는 비메틸화된(우라실로 전향된) 표적 서열에 결합하도록 디자인될 수 있다. 다른 (기능적으로 적절하지 않은) 잠재적인 메틸화 위치들은 적절한 프라이머 디자인을 통해 완전히 피해질 수 있거나 또는 프라이머들은 이들 관련이 적은 위치의 메틸화 상태에 독립적으로 결합하도록 디자인될 수 있다(예를 들어, 프라이머 서열 내의 적절한 위치에서 G 및 A 잔기의 혼합을 포함함으로써). 따라서, 관심 유전자의 메틸화된 또는 비메틸화된 형태가 최초 DNA-함유 샘플에 존재하는 경우에만 증폭 산물이 기대된다. 추가적으로 또는 선택적으로, 프라이머쌍에서 적어도 하나의 프라이머는 시약으로 처리한 이후 오직 비메틸화된 DNA 서열에만 결합하며, 다른 프라이머는 시약으로 처리한 이후 오직 메틸화된 DNA에만 결합하는 것이 적절할 수 있다(예를 들어, 유전자가 기능적으로 중요한 메틸화된 위치 및 이와 분리된 기능적으로 중요한 비메틸화된 위치를 포함할 때).
바람직하게, 프라이머쌍에서 적어도 하나의 프라이머는 분자에너지 전달쌍의 도너 및 억셉터 모이어티를 운반하는 스템-루프 또는 "헤어핀" 구조를 포함하는 프라이머이다. 이 프라이머는 요구되는 메틸화된 DNA 및 비메틸화된 DNA를 구별하는 프라이머이거나 아닐 수 있다. 프라이머는 준비되고, 증폭이 없는 경우, 억셉터 모이어티는 여기에 의해 도너 모이어티에서 방출된 형광을 소광한다. 따라서, 프라이머에 의해 유도된 증폭 전에, 또는 부재 시에, 스템 루프 또는 "헤어핀" 구조는 본래대로 유지된다. 도너 모이어티에 의해 방출된 형광은 억셉터 모이어티에 의해 효과적으로 받아들여지며 형광의 소광을 야기한다.
증폭 동안 프라이머의 스템 루프 구조 또는 헤어핀 구조는 변형된다. 특히, 일단 프라이머가 증폭 산물에 합체되고, 특히, (특히 제 2 증폭 동안) 이중 가닥 DNA에 합체되고, 스템 루프 또는 헤어핀 구조는 붕괴된다. 이러한 구조에서의 변형은 도너 및 억셉터 모이어티를 충분히 분리하여, 억셉터 모이어티는 더 이상 효과적으로 도너 모이어티로부터 방출되는 형광을 소광시킬 수 없다. 따라서, 도너 모이어티는 검출 가능한 형광 신호를 만든다. 이 신호는 관심의 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 유전자 복제수의 정보를 제공하기 위해 실시간으로 검출된다.
따라서, 본 발명의 방법은 분자에너지 전달(molecular energy transfer; MET) 표지로 탐지 가능하게 표지화되는 핵산의 증폭을 위한 올리고뉴클레오티를 활용할 수 있다. 프라이머들은 MET쌍(pair)의 도너 및/또는 억셉터 모이어티를 포함하며, 증폭 반응의 증폭 산물에 합체되고, 증폭 산물은 MET쌍의 도너 및 억셉터 모이어티를 모두 포함한다.
증폭 산물이 이중 가닥인 경우, 증폭된 산물에 합체된 MET쌍은 동일한 가닥 상이거나 또는, 증폭이 3중 증폭(triamplification)인 경우. 서로 마주보는 가닥 상일 수 있다. 특정 예들에서 증폭에서 사용되는 중합효소는 5' - 3' 핵산말단분해효소(exonuclease) 활성을 가져, MET쌍 모이어티들 중 하나는 이 핵산말단분해효소 활성에 의해 증폭된 산물의 집단 중 적어도 일부로부터 절단될 수 있다. 이와 같은 핵산말단분해효소 활성은 본 발명의 증폭 방법에 있어 유해하지 않다.
여기에서 이야기된 본 발명의 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 3중 증폭(triamplification), 및 다른 증폭 시스템을 포함하는 핵산 서열의 여러 증폭을 위한 방법에 적용 가능하다.
바람직한 실시태양에서, MET는 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer; FRET)이며, 올리고뉴클레오티드는 도너 및 억셉터 모이어티로 표지화되고, 도너 모이어티는 형광단(fluorophore)이며, 억셉터 모이어티는 형광단일 수 있고, 도너 모이어티에 의해 방출된 형광 에너지는 억셉터 모이어티에 의해 흡수된다. 억셉터 모이어티는 소광제일 수 있다. 따라서, 증폭 프라이머는 도너 및 억셉터 모이어티를 모두 포함하는 헤어핀 프라이머이며, 억셉터 모이어티가 도너의 형광을 소광하도록 구성된다. 프라이머가 증폭 산물과 합체될 때 구조가 변화되며, 소광이 제거되고, 도너 모이어티의 형광이 검출될 수 있다.
본 발명의 방법은 합체되지 않은 올리고뉴클레오티드들의 사전 분리 없이도 증폭 산물의 검출을 가능하게 한다. 게다가, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 산물에 합체시킴으로써, 증폭 산물의 검출을 바로 할 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 또한 참조 유전자(reference gene)의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 참조 유전자는 서로 다른 샘플들간의 비교를 가능하게 하는데 중요하다. 비교되는 샘플들 사이에서 안정되고 믿음직한 방식으로 발현되는 것으로 믿어지는 적절한 유전자를 선택함으로써, 관심 유전자와 함께 참조 유전자의 증폭을 투입 물질의 양, 효소 효율, 샘플 분해 등과 같은 샘플들 간의 가변성을 고려하여 검출한다. 신뢰성 있는 주입 DNA 양의 존재 하에서, 참조 유전자는 이상적으로 테스트 중인 샘플들 사이에서 끊임없이 발현되는 것이어야 한다. 따라서 관심 유전자의 결과는 참조 유전자의 상응하는 복제수에 대비하여 표준화될 수 있다. 본 발명에 대한 적절한 참조 유전자는 베타-액틴, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH), 18S 리보솜 RNA 및 RNA 중합효소 II 유전자와 같은 리보솜 RNA 유전자를 포함한다(Radonic A. et al., Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jan 23;313(4):856-62). 특히 바람직한 실시태양에서, 참조 유전자는 베타-액틴이다.
따라서, 본 발명의 방법은 적어도 하나의 프라이머쌍을 사용하여 참조 유전자의 적어도 일부를 증폭하며, 프라이머쌍에서 적어도 하나의 프라이머는 앞에서 언급한 특징을 가지는 스템 루프 구조를 포함하는 프라이머인 것을 추가적인 특징으로 할 수 있다.
증폭 산물이 참조 유전자 존재의 신뢰성 있는 지시자로서 검출 가능하다면, 참조 유전자의 임의의 적절한 일부가 본 발명의 방법에 따라 증폭될 수 있다. 특히 쉽게 검출 가능한 증폭 산물들은 대략 50 내지 250bp 사이이다. 보다 더욱 바람직하게, 참조 유전자의 증폭을 위한 적어도 하나의 프라이머쌍을 사용하는 증폭은 대략 50bp 내지 150bp 사이의 증폭 산물을 제공한다. 이는 특히 조직 샘플, 특히 한정된 DNA 특성이 일반적으로 얻어지는 파라핀 묻힌 샘플의 경우 적절하다.
실시태양에서, 참조 유전자는 본 발명의 방법에 포함되며, 관심의 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 표준곡선에 대한 (실시간) 검출의 결과를 정량화하는 것을 포함하는 방법의 단계가 또한 각각의 경우에서 유전자 복제수의 산출(output)을 제공하기 위해 참조 유전자의 표준곡선에 대한 참조 유전자의 실시간 검출 결과를 정량화하는 것을 포함하고, 선택적으로 추가로 관심의 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 유전자 복제수를 참조 유전자의 유전자 복제수로 나눔으로써 결과를 표준화하는 것을 포함하는 것을 추가적인 특징으로 한다.
또한, 본 방법에서 증폭은 사이클 문턱값(threshold value)이 40 이하인 경우 유효한 것으로 여겨지는 것을 특징으로 할 수 있다.
참조 유전자의 적어도 일부의 증폭은 일반적으로 적어도 하나의 프라이머쌍을 활용한다. 바람직하게, 관심 유전자에 대해서 말하자면, 프라이머쌍에서 적어도 하나의 프라이머는 분자에너지 전달쌍의 도너 및 억셉터 모이어티를 운반하는 스템 루프 구조를 포함하는 프라이머이다. 증폭 동안 이와 같은 구조의 작용 양식은 이미 여기에서 설명되었다.
본 발명의 방법의 용도를 위한 "헤어핀" 프라이머는 가장 바람직하게, 본 발명에 전체로써 참조로 포함되는 US 6,090,552 및 EP 0912597에 설명되어 있다. 프라이머들은 Amplifluor® 프라이머로 상업적으로 알려져 있다. 따라서 특히 바람직한 실시태양에서, 관심 유전자 및/또는 참조 유전자의 일부를 증폭하기 위해 사용되는 스템 루프 구조를 포함하는 프라이머는 다음의 5' 부터 3' 순서의 연속적인 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진다:
(a) 대략 6 내지 30 뉴클레오티드 사이의 제 1 뉴클레오티드 서열(여기서 상기 제 1 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드는 분자에너지 전달쌍(molecular energy transfer pair)의 도너 모이어티 및 억셉터 모이어티로부터 선택된 제 1 모이어티로 표지화되며, 도너 모이어티는 여기(excited)되었을 때 하나 이상의 특정 파장에서 형광을 방출하고, 억셉터 모이어티는 상기 도너 모이어티로부터 방출된 상기 형광을 흡수 및/또는 소광시킨다);
(b) 대략 3 내지 20 뉴클레오티드 사이를 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 제 2 단일-가닥 뉴클레오티드 서열;
(c) 대략 6 내지 30 뉴클레오티드 사이를 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 제 3 뉴클레오티드 서열(여기서 상기 제 3 뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드는 상기 도너 모이어티 및 상기 억셉터 모이어티로부터 선택된 제 2 모이어티로 표지화되고, 상기 제 2 모이어티는 상기 제 1 뉴클레오티드 서열을 표지화하지 않는 상기 그룹의 일원(member)이며, 여기서 상기 제 3 뉴클레오티드 서열은 상기 제 1 뉴클레오티드 서열에 역순으로 상보적인 결과 듀플렉스(duplex)가 상기 제 1 뉴클레오티드 서열 및 상기 제 3 뉴클레오티드 서열 사이에 형성될 수 있으며, 그 결과 상기 제 1 모이어티 및 제 2 모이어티는 근접하게 되며, 그 결과 도너 모이어티가 여기되고 형광을 방출할 때 억셉터 모이어티는 상기 도너 모이어티에 의해 방출된 상기 형광을 흡수하고 소광시킨다); 및
(d) 제 4 단일-가닥 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 62 및 63 중 임의의 서열을 포함하는 대략 8 내지 40 뉴클레오티드 사이를 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성되고(및 따라서 유전자의 메틸화된 또는 비메틸화된 DNA 부분을 포함하는 핵산 가닥에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 핵산 중합효소에 의해 최초 합성(prime synthesis)을 할 수 있는) 프라이머의 3' 말단에서의 제 4 단일-가닥 뉴클레오티드 서열; 여기서, 상기 듀플렉스가 형성되지 않을 때, 상기 제 1 모이어티 및 상기 제 2 모이어티는 상기 제 1 및 제 2 모이어티 사이의 분자에너지 전달을 방해하는 거리에 의해 분리된다.
특히 바람직한 실시태양에서, 도너 모이어티 및 억셉터 모이어티는 형광 공명 에너지 전달(FRET)쌍을 형성한다. 분자에너지 전달(MET)은 에너지가 도너 분자 와 억셉터 분자 사이를 비-방사성으로 통과하는 과정이다. 형광 공명 에너지 전달(FRET)은 MET의 한 형태이다. FRET는 특정 화학 화합물들의 특성들로부터 야기된다; 특정 파장의 빛에 노출되어 여기되었을 때, 그들은 다른 파장에서 빛을 방출한다(즉 그들은 형광을 방출한다). 이와 같은 화합물들은 형광단(fluorophore)으로 명명된다. FRET에서, 에너지는 형광단인 도너 분자 및 억셉터 분자 사이의 긴 거리(10-100Å)를 비-방사성으로 통과한다. 도너는 광자(photon)를 흡수하며, 이 에너지를 비방사성으로 억셉터에 전달한다(Forster, 1949, Z. Naturforsch. A4: 321-327; Clegg, 1992, Methods Enzymol. 211: 353-388). 여기 및 방출 스펙트럼이 중첩되는 두 형광단들이 아주 근접할 때, 하나의 형광단의 여기는 그 형광단이 흡수되는 파장에서 빛을 방출하게 할 것이며, 이는 두 번째 형광단을 자극하여 차례로 형광을 방출하게 한다. 다시 말해서, 제 1 (도너) 형광단의 여기-상태 에너지는 공명 유도 쌍극자-쌍극자 상호작용에 의해 이웃한 (억셉터) 형광단으로 전달된다. 그 결과, 도너 분자의 수명은 감소되고, 이의 형광은 소광되는 반면, 억셉터 분자의 형광 강도는 증가되고 감극된다. 도너의 여기-상태 에너지가 비-형광단 억셉터로 전달될 때, 도너의 형광은 억셉터에 의한 형광의 차후 방출 없이 소광된다. 이 경우에 있어서, 억셉터는 소광제로써 기능한다. 소광제 및 억셉터들은 모두 본 발명에서 활용될 수 있다. 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 관여할 수 있는 분자쌍들은 FRET 쌍으로 명명된다. 에너지 전달이 일어나게 하기 위하여, 도너 및 억셉터 분자들은 일반적으로 매우 근접해야만 한다(70 내지 100Å 까지)(Clegg, 1992, Methods Enzymol. 211: 353-388; Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246: 300-334). 에너지 전달의 효율은 도너 및 억셉터 분자 사이의 거리에 따라서 빠르게 떨어진다. Forster(1949, Z. Naturforsch. A4:321-327)에 따르면 에너지 전달의 효율은 D x 10-6(여기서 D는 도너 및 억셉터 사이의 거리이다)에 비례한다. 효율적으로, 이는 FRET이 약 70Å의 거리까지 가장 효율적으로 일어날 수 있다는 것을 의미한다. FRET에서 일반적으로 사용되는 분자들은 독립된 섹션에서 논의된다. 형광단이 도너인지 또는 억셉터인지는 이의 여기 및 방출 스펙트럼, 및 짝을 이루는 형광단에 의해 정의된다. 예를 들어, FAM은 488 nm 파장의 빛에 의해 가장 효율적으로 여기되고, 500 내지 650 nm 스펙트럼의 빛을 방출하며, 525 nm의 최대방출을 가진다. FAM은 JOE, TAMRA, 및 ROX(이들 모두는 514 nm에서 그들의 최대 여기를 가진다)와 함께 사용하기에 적합한 도너 형광단이다.
일 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 도너 모이어티는 플루오레세인(fluorescein) 또는 이들의 유도체이며, 상기 억셉터 모이어티는 DABCYL이다. 바람직하게, 플루오레세인 유도체는 6-카복시 플루오레세인(6-carboxy fluorescein)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 구성된다.
MET 표지는 프라이머들의 임의의 적절한 지점에 부착될 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 도너 및 억셉터 모이어티들은 스템 루프 구조 내의 상보적인 뉴클레오티드들 상에 위치하고, 스템 루프는 본래대로인 반면, 모이어티들은 서로에 대해 물리적으로 매우 근접한다. 하지만, 본 발명의 프라이머들은 일단 프라이머가 증폭 산물에 결합되고 나면, 도너 및 억셉터의 증폭 및 분리가 없을 때에 각각의 도너 및 억셉터 사이의 MET/FRET를 효율적으로 허용하기 위해, 임의의 위치에서 모이어티들로 표지화될 수 있다.
스템 루프 또는 헤어핀 구조 서열은 목표 유전자(관심 유전자 또는 참조 유전자)의 뉴클레오티드 서열에 결합하지 않기 때문에 이에 의존하지 않는다. 따라서, "보편적인" 스템 루프 또는 헤어핀 서열들이 디자인될 수 있으며, 관심 서열의 실시간 검출을 용이하게 하기 위해 서열 특이적 프라이머와 결합할 수 있다. 주요 서열의 필요조건은 증폭이 없는 경우 서열이 안정한(따라서 효율적인 소광을 보장하는) 스템 루프/헤어핀 구조를 형성하는 것이다. 따라서 프라이머의 서열 특이적 부분은 주형 가닥에 결합하고, 상보적인 가닥의 합성을 지시한다. 프라이머는 따라서 증폭의 제 1 순환에서 증폭 산물의 일부가 된다. 상보적인 가닥이 합성될 때, 증폭은 스템 루프/헤어핀 구조를 통해 일어난다. 이는 형광단 및 소광제 분자를 분리시키며, 따라서 증폭이 진행됨에 따라 형광의 발생을 유도한다. 스템 루프 구조는 바람직하게는 증폭에서 사용되는 프라이머의 서열 특이적 부분의 5'말단에서 발견된다.
상기에서 언급한 바와 같이, 검출기(detector) 서열은 일반적으로 FRET쌍으로 표지화된다. 바람직하게, FRET쌍에서 하나의 모이어티는 서열의 5' 말단, 근처 또는 가까이에서 발견되고, 다른 모이어티는 서열의 3' 말단, 근처 또는 가까이에서 발견되며, 스템 루프 또는 헤어핀 구조가 온전하게 유지될 때 FRET이 두 모이어티들 사이에서 효과적이다.
실험 섹션에서 상세하게 설명된 바와 같이, 프라이머들은 본 발명 방법의 민감성 및 특이성을 보증하기 위해 신중하게 선택되어야 한다. 따라서, 유전자의 메틸화 상태 검출에 사용하기에 특히 바람직한 프라이머들은 다음에 명시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이들로 필수적으로 이루어진, 또는 이들로 이루어진 프라이머를 포함한다:
5' - AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUGGAAGGTGGGGGAGAGTG - 3'(서열번호:1)
5' - AAAACAACACAACCCCAAAAA - 3' (서열번호. 2)
및/또는,
5' - AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUAAAACAACACAACCCCAAAAA- 3'(서열번호.3)
및/또는,
5' - GGAAGGTGGGGGAGAGTG - 3' (서열번호. 4)
및/또는,
5' - AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUGGGTTGGAGAGTTGTTTGTTTG - 3'(서열번호.5)
및/또는,
5' - CACATCTCCCCCACCTCCT - 3' (서열번호. 6)
및/또는,
5' - AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUCACATCTCCCCCACCTCCT- 3'(서열번호.7)
및/또는,
5' - GGGTTGGAGAGTTGTTTGTTTG - 3'(서열번호. 8)
및/또는,
5' - AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTGGTGGTGTTGTTTTTGTGT- 3'(서열번호.9)
및/또는,
5' - CTTAACCCTATTATCTCCATCTC - 3'(서열번호. 10)
및/또는,
5' -AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUCTTAACCCTATTATCTCCATCTC- 3'(서열번호.11)
및/또는,
5' - TGGTGGTGTTGTTTTTGTGT - 3'(서열번호. 12)
및/또는,
5' - AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUGGTGGTTTTGAAGGATTTTATTG- 3'(서열번호.13)
및/또는,
5' - ACCCAACACCTTCCCTATCCT - 3' (서열번호. 14)
및/또는,
5' - AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUACCCAACACCTTCCCTATCCT- 3'(서열번호.15)
및/또는,
5' - GGTGGTTTTGAAGGATTTTATTG - 3' (서열번호. 16)
및/또는,
5' - AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTTTTGTTTTGGGATGTTGTATTTT- 3'(서열번호.17)
및/또는,
5' - CCTCATCCACCCAACACCTT - 3'(서열번호. 18)
및/또는,
5' -AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUCCTCATCCACCCAACACCTT- 3'(서열번호.19)
및/또는,
5' -TTTTGTTTTGGGATGTTGTATTTT- 3'(서열번호.20)
및/또는,
5' -AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTGGGTTTGTAGTGTTTTAGTATTGTTT- 3'(서열번호.21)
및/또는,
5' -TCCACCCTACTTTCCCTACATTC- 3'(서열번호.22)
및/또는,
5' -AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTCCACCCTACTTTCCCTACATTC- 3'(서열번호.23)
및/또는,
5' -TGGGTTTGTAGTGTTTTAGTATTGTTT- 3'(서열번호.24)
및/또는,
5' -AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTTGTTTTGGGATATTTTATTTGTTTT- 3'(서열번호.25)
및/또는,
5' -AAAAACTCCACCCTACTTTCC- 3'(서열번호.26)
및/또는,
5' -AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUAAAAACTCCACCCTACTTTCC- 3'(서열번호.27)
및/또는,
5' -TTGTTTTGGGATATTTTATTTGTTTT- 3'(서열번호.28)
및/또는,
5' -AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUGAGGGGAGGGGTGTGAATGTG- 3'(서열번호.29)
및/또는,
5' -CATTCCTCCCTACTCCCAAAAA- 3'(서열번호.30)
및/또는,
5' -AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUCATTCCTCCCTACTCCCAAAAA- 3'(서열번호.31)
및/또는,
5' -GAGGGGAGGGGTGTGAATGTG- 3'(서열번호.32)
및/또는,
5' -AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTGGTGGATGTTTTGGGATTT- 3'(서열번호.33)
및/또는,
5' -CAACATTTCTACCTCTACTCCCACCTT- 3'(서열번호.34)
및/또는,
5' -AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUCAACATTTCTACCTCTACTCCCACCTT- 3'(서열번호.35)
및/또는,
5' -TGGTGGATGTTTTGGGATTT- 3'(서열번호.36)
및/또는,
5' -AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUGTTTTGGAAGGATTGAGAAATGG- 3'(서열번호.37)
및/또는,
5' -CACCCTAACCACTACATAAAACAAA- 3'(서열번호.38)
및/또는,
5' -AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUCACCCTAACCACTACATAAAACAAA- 3'(서열번호.39)
및/또는,
5' -GTTTTGGAAGGATTGAGAAATGG- 3'(서열번호.40)
및/또는,
5' -AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTAGGGAGTATATAGGTTGGGGAAGTT- 3'(서열번호.41)
및/또는,
5' -AACACACAATAACAAACACAAATTCAC- 3'(서열번호.42)
및/또는,
5' -AGGGAGTATATAGGTTGGGGAAGTT - 3'(서열번호. 44)
및/또는,
5 '- AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTGGAATTTAGGGTAGTATTGT- 3' (서열번호. 61)
및/또는,
5' - CCCTCCACCAACATCAAA - 3' (서열번호. 62)
5' - TGGAATTTAGGGTAGTATTGT - 3' (서열번호. 63)
서열번호 4 및 8은 중아황산염(bisulfite)으로 변형된 CTAG1B의 비메틸화된 서열에 상보적인 정방향 프라이머(센스 프라이머) 서열을 나타낸다.
서열번호 12, 16 및 20은 중아황산염(bisulfite)으로 변형된 CTAG2의 비메틸화된 서열에 상보적인 정방향 프라이머(센스 프라이머) 서열을 나타낸다.
서열번호 24, 28, 32, 36 및 40은 중아황산염(bisulfite)으로 변형된 PRAME의 비메틸화된 서열에 상보적인 정방향 프라이머(센스 프라이머) 서열을 나타낸다.
서열번호 43은 헤어핀 구조 서열을 나타낸다.
서열번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 및 37은 헤어핀 구조 서열 및 서열번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36 및 40의 서열을 각각 포함한다.
서열번호. 2 및 6은 중아황산염(bisulfite)으로 변형된 CTAG1B 프로모터의 비메틸화된 서열에 상보적인 역방향 프라이머(안티센스 프라이머) 서열을 나타낸다.
서열번호. 10, 14 및 18은 중아황산염(bisulfite)으로 변형된 CTAG2 프로모터의 비메틸화된 서열에 상보적인 역방향 프라이머 서열을 나타낸다.
서열번호. 22, 26, 30, 34 및 38은 중아황산염(bisulfite)으로 변형된 PRAME 프로모터의 비메틸화된 서열에 상보적인 역방향 프라이머 서열을 나타낸다.
서열번호. 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35 및 39는 헤어핀 구조 서열 및 서열번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34 및 38의 서열을 포함한다.
서열번호 42 및 44은 중아황산염(bisulfite)으로 변형된 액틴 베타 유전자의 메틸화된 서열에 상보적인 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸다; 서열번호. 41은 헤어핀 구조 서열 및 서열번호 44의 서열을 포함한다.
서열번호 63은 중아황산염(bisulfite)으로 변형된 MageA3의 비메틸화된 서열에 상보적인 정방향 프라이머(센스 프라이머) 서열을 나타낸다.
서열번호 61은 헤어핀 구조 서열 및 서열번호 63의 서열을 포함한다.
서열번호. 62는 중아황산염(bisulfite)으로 변형된 MageA3의 비메틸화된 서열에 상보적인 역방향 프라이머 서열을 나타낸다.
실험 섹션에서 상세하게 설명된 바와 같이, CTAG2의 발현 및 메틸화 수준은 서열번호 9 내지 12 및 서열번호 21 내지 20 중 임의의 프라이머를 결합시킨 분석에서 가장 좋은 일치를 나타내었다. 실험 섹션에서 상세하게 설명된 바와 같이, PRAME의 발현 및 메틸화 수준은 서열번호 21 내지 40 중 임의의 프라이머를 결합시킨 분석에서 가장 좋은 일치를 나타내었다.
따라서 다른 실시태양에서, CTAG2 영역에 결합하는 바람직한 프라이머는 서열번호 9 내지 12 및 서열번호 21 내지 20 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나 또는 이들로 이루어진다. PRAME 영역에 결합하는 바람직한 프라이머는 서열번호 21 내지 40 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나 또는 이들로 이루어진다.
다른 저메틸화 분석들을 이용하여 발생된 증폭 산물들은 다음 서열들을 가진다:
CTAG1B _1 (129 bp )
GGAAGGTGGGGGAGAGTGGTTTGGATTTTAGTATTTTTTTTTTTTTTAGGGTTAGGTTTTGTTTGGTTATTTTTTGTTGTTATAGGTGTGTTTGGTATAGATATTTAGTTTTTGGGGTTGTGTTGTTTT (서열번호. 45)
CTAG1B_2 (130 bp)
GGGTTGGAGAGTTGTTTGTTTGAGTTGTATTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGATAGTTTTGGTGGTGAGGTGGGGGTTGGGAGATGGGGAGGGTAGGGTTAGGTGGGGGAGGAGGTGGGGGAGATG(서열번호. 46)
CTAG2 (150 bp )
TGGTGGTGTTGTTTTTGTGTAGGATGGAAGGTGTTTTTGTGGGGTTAGGAGGTTGGATAGTTGTTTGTTTTAGTTGTATTTTGTTTTGTTTTGTTTTAGGAGGTTTTGGTGGTGAGGTGGGGGTTGTGAGATGGAGATAATAGGGTTAAG (서열번호. 47)
CTAG2 _2 (80 bp )
GGTGGTTTTGAAGGATTTTATTGTGTTTGGTAATTTATTGTTTATGTTAGTTTGGGATTAGGATAGGGAAGGTGTTGGGT(서열번호. 48)
CTAG2 _3 (125 bp )
TTTTGTTTTGGGATGTTGTATTTTTTTTTTGATTAGGGGTGGTTTTGAAGGATTTTATTGTGTTTGGTAATTTATTGTTTATGTTAGTTTGGGATTAGGATAGGGAAGGTGTTGGGTGGATGAGG (서열번호. 49)
PRAME _1: 129 bp
TGGGTTTGTAGTGTTTTAGTATTGTTTTGGGATATTTTATTTGTTTTTTAGGTGTGATTTGTTAATAGGTTTGTATTGGTGATAAAAGGAGTAGTTTTGAATGTAGGGAAAGTAGGGTGGAGTTTTTTG (서열번호. 50)
PRAME _2: 106 bp
TTGTTTTGGGATATTTTATTTGTTTTTTAGGTGTGATTTGTTAATAGGTTTGTATTGGTGATAAAAGGAGTAGTTTTGAATGTAGGGAAAGTAGGGTGGAGTTTTT (서열번호. 51)
PRAME _3: 120 bp
GAGGGGAGGGGTGTGAATGTGTGGATTTTTGTGGAGAGTGGAAATATGGGGAGTTGAGGGGAGTATGTGTGGGTTTTAGAAAGTTTTGGGAAATTGATTTTTGGGAGTAGGGAGGAATG (서열번호. 52)
PRAME_4: 59bp
AGTGTTGGAGGTTTTGAGGTTAGTTTAAGTTGTTTTAAAATGGAATGAAGGTGTTTGTG (서열번호. 53)
PRAME_6: 50bp
TGGTGGATGTTTTGGGATTTGGTTTTTTTGAAGGTGTTGGGGGTTGGGGATGGTTTAGGTAGTGGTGTAGGTGTTTTAGGAAGGTGGGAGTAGAGGTAGAAATGTTG (서열번호. 54)
PRAME_7: 98 bp
GTTTTGGAAGGATTGAGAAATGGGGATTGGTTAGATTAGGTTGTTTAGTTTTTTGGTTTTTATTGTTGTTTTTTTTGTTTTATGTAGTGGTTAGGGTG (서열번호. 55)
이들 서열들은 각 유전자의 CpG-리치 섬(CpG-rich islands)에 위치한다. 따라서, 본 발명은 추가로 중아황산염으로 변형된 서열번호: 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55로 명시되는 뉴클레오티드 서열의 일부로 이루어진 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 프라이머 및/또는 프로브에 관한 것이다.
CTAG1B, CTAG2 및/또는 PRAME 유전자의 중아황산염으로 변형된 서열의 일부로 이루어진 또는 이에 상보적인 프라이머의 일부는 바람직하게는 30bp 미만이다; 바람직하게는 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18 또는 17 bp 길이이다. 따라서 이와 같은 바람직한 프라이머의 CTAG1B, CTAG2 및/또는 PRAME 특이 부분은 바람직하게 길이로 28 내지 16 bp 사이, 또는 27 내지 17 bp 사이이다. 따라서 프라이머는 중아황산염으로 변형된 서열들로 이루어지는 또는 이에 상보적인 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18 또는 17 연속적인 염기들의 임의의 서열을 포함할 수 있다.
프라이머 하나 또는 (프라이머쌍에서) 둘 다는 상기에서 상세하게 언급한 도너 및 억셉터 모이어티를 바람직하게는 5' 말단에서 운반하는 적절한 스템 루프 또는 헤어핀 구조로 표지화되거나 또는 이를 결합하기 위해 합성될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 프라이머(들)의 하나 또는 둘 다는 바람직하게는 5' 말단에서 다음의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이로 필수적으로 이루어진 또는 이로 이루어진 스템 루프 구조로 표지화되거나 또는 결합하기 위해 합성될 수 있다.
5' - AGCGATGCGTTCGAGCATCGCU - 3' (서열번호: 43).
이 검출기 서열은 일반적으로 FRET쌍으로 표지화된다. 바람직하게, FRET쌍에서 하나의 모이어티는 서열의 5' 말단, 근처 또는 가까이에서 발견되고, 다른 모이어티는 서열의 3' 말단, 근처 또는 가까이에서 발견되며, 스템 루프 또는 헤어핀 구조가 온전하게 유지될 때 FRET이 두 모이어티들 사이에서 효과적이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 서열번호: 1로 명시된 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 스템 루프 또는 헤어핀 구조, 특히 핵산은 5'말단에서 FAM으로, 3'말단에서 DABCYL로 표지화된다. 다른 바람직한 조합들은 여기에서 논의되었으며, 필요한 변경을 가하여 적용한다.
이들 프라이머들은 본 발명의 독립된 양태들을 형성한다. 이들 프라이머들의 다른 특징들은 아래 (실험 부분) 상세한 설명에서 요약된다. 올리고뉴클레오티드, 프라이머 및 프로브(서열)의 변형들이 본 발명에서 활용될 수 있다는 것이 주목되어야 한다. 특히, 필요한 경우, 부가적인 측면 서열들이 예를 들어, 결합 특이성 또는 스템 루프의 형성을 향상시키기 위해 추가될 수 있다.
변형 서열들은 서열번호:1 내지 42 및 서열번호: 44, 60, 61 및 62에 나열된 프라이머 및/또는 프로브의 뉴클레오티드 서열과 바람직하게 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 뉴클레오티드 동일성을 가진다. 프라이머 및 헤어핀 구조는 합성 뉴클레오티드 유사체(analogues) 적절히 포함하거나, 또는 예를 들어, DNA, RNA 또는 PNA 기반, 또는 이들의 혼합물 일 수 있다. 마찬가지로 선택적인 형광 도너 및 억셉터 모이어티/FRET쌍이 적절히 활용될 수 있다. 형광 도너 및 억셉터 모이어티로 표지화될 뿐만 아니라, 본 발명의 방법에서 프라이머 및/또는 스템 루프 구조로서 기능성이 손상되지 않는다면 프라이머는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 다른 첨부된 그룹 및 라벨을 포함할 수 있다.
각 프라이머쌍에서, 적어도 하나의 프라이머는 조절된 분자에너지 전달쌍의 도너 및 억셉터 모이어티로 표지화되며, 증폭이 없는 경우, 억셉터 모이어티는 (여기에 의해) 도너 모이어티에 의해 방출된 형광을 소광시키고, 증폭 동안 스템 루프 구조는 붕괴되며, 이를 통해 도너 및 억셉터 모이어티는 충분히 분리되어, 실시간으로 검출되는 유전자의 유전자 복제수 지표를 제공하는 검출 가능한 형광 신호를 제공한다. 바람직하게, 상기 도너 모이어티 및 상기 억셉터 모이어티는 FRET쌍이다. 일 실시태양에서, 상기 도너 모이어티 및 상기 억셉터 모이어티는 5-카복시플루오레세인 또는 6-카복시플루오레세인(FAM), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카복시플루오레세인(JOE), 로다민, 6-카목시로다민(R6G), N,N,N'-테트라메틸-6-카복시로다민(TAMRA), 6-카복시-X-로다민(ROX), 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS), 안트라닐아마이드, 쿠마린, 테르븀 킬레이트 유도체들, 말라카이트 그린, 리액티브 레드 4, DABCYL, 테트라메틸 로다민, 피렌 낙산염(pyrene butyrate), 에오신 니트로티로신, 에티디움, 및 텍사스 레드로부터 선택된다. 다른 실시태양에서, 상기 도너 모이어티는 플루오레세인, 5-카복시플루오레세인 또는 6-카복시플루오레세인(FAM), 로다민, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS), 안트라닐아마이드, 쿠마린, 테르븀 킬레이트 유도체들, 말라카이트 그린, 및 리액티브 레드 4, 및 상기 억셉터 모이어티는 DABCYL, 로다민, 테트라메틸 로다민, 피렌 낙산염(pyrene butyrate), 에오신 니트로티로신, 에티디움, 및 텍사스 레드로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 도너 모이어티는 플루오레세인 또는 이의 유도체이며, 상기 억셉터 모이어티는 DABCYL이고, 가장 바람직하게 도너 모이어티는 6-카복시플루오레세인이다. 특히 다중화 관점에서, 다른 바람직한 조합은 여기에서 논의되었으며, 이러한 조합들은 또한 본 발명의 이러한 양태들을 위해 고찰된다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 키트는 여기에서 서술된 본 발명의 다양한 방법(및 용도)과 관련되어 언급된 임의의 바람직한 특색들을 포함할 수 있다. 따라서 본 발명은 DNA-함유 샘플에서 관심의 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 존재 및/또는 양을 검출하기 위한 본 발명의 적어도 하나의 프라이머쌍을 포함하는 키트를 제공한다. 바람직하게 키트는 비메틸화된 및/또는 메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 존재 및/또는 양을 검출하기 위해 본 발명의 프라이머쌍 및 참조 유전자, 특히 베타-액틴의 존재 및/또는 양을 검출하기 위한 프라이머쌍을 포함한다. 따라서 키트는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 60, 61 또는 62에 나열된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이들로 필수적으로 이루어진, 또는 이들로 이루어진 프라이머를 포함하는 프라이머쌍을 포함할 수 있다. 바람직하게, 각 프라이머쌍에서 적어도 하나의 프라이머는 앞에서 이야기한 바와 같이(이는 여기에서 필요한 변경을 가하여 적용된다) 실시간 검출을 용이하게 하기 위하여 적절한 스템 루프 또는 헤어핀 구조로 표지화된다. 가장 바람직하게 각 프라이머쌍에서 적어도 하나의 프라이머는 서열번호:43으로 명시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이들로 필수적으로 이루어진, 또는 이들로 이루어진 스템 루프 또는 헤어핀 구조를 포함한다. 스템 루프 구조는 여기에서 이야기한(이는 여기에서 필요한 변경을 가하여 적용된다) 적절한 도너 및 억셉터 모이어티로 표지화된다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 프라이머의 또 다른 특징은 아래 상세한 설명(실험 부분)에 요약된다. 이들 서열들의 변형들은 여기에서 설명한 바대로 본 발명에서 활용될 수 있다. 선택적인 형광 도너 및 억셉터 모이어티/FRET쌍은 여기에서 설명한 바대로 적절히 활용될 수 있다.
일 실시태양에서, 본 발명의 키트는 여기에서 설명된 (보호되는 메틸화된 시토신 잔기보다 우선적으로) 비메틸화된 시토신을 변형시키는 시약을 추가로 포함한다. 이와 같은 시약은 비메틸화된 시토신 잔기로부터 메틸화된 시토신 잔기를 구별하는데 유용하다. 바람직한 실시태양에서, 시약은 중아황산염(bisulphite), 바람직하게는 아황산수소나트륨(sodium bisulphite)을 포함한다. 이 시약은 비메틸화된 시토신 잔기를 우라실로 전환시킬 수 있는 반면, 메틸화된 시토신은 전환되지 않은 채로 유지된다. 잔기의 이러한 차이는 시토신과 우라실을 구별(시토신은 구아닌과 쌍을 이루는 반면 우라실은 아데닌과 쌍을 이룬다)하는 프라이머를 사용하는 PCR과 같은 다운스트림 과정에서 메틸화된 핵산과 비메틸화된 핵산을 구별하는데 활용될 수 있다.
여기서 본 발명의 방법에 대하여 논의된 바와 같이, 방법들에서 적절한 컨트롤들이 품질을 조절하는 역할을 하기 위해 활용될 수 있다. 따라서, 일 실시태양에서, 본 발명의 키트는 추가로 하나 이상의 메틸화 상태가 알려진 컨트롤 핵산 분자를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어질 수 있다. 이들 (하나 이상) 컨트롤 핵산 분자들은 메틸화된 것으로 알려진, 또는 메틸화되기 위하여 처리될 핵산들 및/또는 비메틸화된 것으로 알려진, 또는 비메틸화되기 위하여 처리될 핵산 분자를 모두 포함할 수 있다. 일반적으로 비메틸화되었지만 메틸화되기 위하여 처리될 수 있는 적절한 내부 참조 유전자의 하나의 예는 베타-액틴이다.
본 발명의 키트는 본 발명의 요구되는 방법을 수행하기 위한 적절한 완충액 및 다른 시약들을 추가적으로 포함할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법에 대한 논의는 여기에서 필요한 변경을 가하여 적용되며, 간결성을 이유로 반복되지 않는다. 일 실시태양에서, 본 발명의 키트는 추가로 핵산 증폭 완충액을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어질 수 있다.
키트는 또한 추가적으로 핵산 증폭을 촉매하기 위한 효소를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어질 수 있다. 따라서 키트는 또한 추가적으로 적절한 핵산 증폭을 위한 중합효소를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어질 수 있다. 예들로 Taq, Pfu, Vent 등과 같은 패밀리 A형(family A type) 및 패밀리 B형(family B type) 중합효소로부터 나온 것들을 포함한다.
키트의 다양한 구성요소들은 각각의 구획으로 분리되어 패키지화될 수 있거나, 또는 예를 들어, 함께 적절히 보관될 수 있다.
키트는 또한 적절한 사용하기 위한 독립된 종이에 프린트된 또는 예를 들어 키트의 패키징 내부에 통합된 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 다수의 상업적으로 구입할 수 있는 적절한 실시간 증폭 장치 또는 종말점 검출 장치와 함께 본 발명의 키트의 사용을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 실시간 방법의 마지막 단계는 관심의 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자 및 선택적으로 (포함되는) 참조 유전자의 표준곡선에 대한 실시간 검출 결과의 정량화(quantifying)를 포함한다. 표준곡선은 일련의 기준들을 사용하여 만들어질 수 있다. 각 기준은 적절한 관심 유전자 및/또는 참조 유전자의 알려진 복제수, 또는 농도를 포함한다. 일반적으로 형광의 기준선 값(baseline value)은 백그라운드 형광을 설명하도록 설정될 수 있다. 예를 들어, 일 실시태양에서, 서열 검출 시스템(Sequence Detection System; SDS) 소프트웨어가 활용된다. 이 소프트웨어는 증폭 산물이 검출되기 전에 증폭 반응의 디폴트 기준선 사이클의 범위를 3 내지 15로 설정한다. 형광의 문턱값(threshold value)은 이 기준선 위쪽의 통계적인 중요한 값에서 정의된다. 일반적으로, 문턱값은 기준선 형광 위쪽의 표준편차 10으로 설정된다. 적절한 소프트웨어가 실시간 증폭 반응을 수행하기 위한 장치와 함께 제공된다. 소프트웨어는 자동적으로 반응을 위한 기준선값 및 문턱값을 계산한다. 문턱 사이클 값(threshold cycle value; Ct)은 각각의 기준에 대해 결정될 수 있다. 이는 문턱값 증폭 수준을 달성하기 위해 필요로 하는 시이클의 수이다. 따라서 반응 혼합물에서 유전자 표준의 초기 농도가 더 클수록, 증폭된 산물의 특정 산출(yield)을 달성하기 위해 필요로 하는 사이클의 수는 더 적다. 표준 DNA 세트의 알려진 최초 복제수의 log10에 대한 Ct의 그래프는 일직선을 나타낸다. 이것이 표준곡선이다. 따라서 관심 유전자 및 참조 유전자의 증폭을 위한 활용되는 Ct값은 DNA-함유 샘플에서 복제수를 결정하기 위하여 각각의 표준곡선에 대해 각각 삽입될(interpolated) 수 있다. 따라서 본 방법의 산출은 관심 유전자 및 참조 유전자 각각에 대한 유전자 복제수이다. 결과들은 관심의 메틸화된 또는 비메틸화된 유전자의 유전자 복제수를 참조 유전자의 유전자 복제수로 나눔으로써 표준화될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, Applied Biosystems 7900 HT fast real-time PCR 시스템이 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용된다. 바람직하게 SDS 소프트웨어가 활용되고, 바람직하게는 개개의 검출기를 위한 기준선값 및 문턱값을 자동적으로 생성하기 위한 오토 CT 알고리즘(Auto CT algorithm)과 같은 적절한 알고리즘을 포함한다.
본 발명의 방법은 임의의 적절한 증폭 기술과 함께 활용될 수 있지만, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 증폭을 수행하는 것이 가장 바람직하다. 따라서 네스티드 PCR(nested PCR)과 같은 기본 기술에 대한 변종을 포함하는 PCR이 선호되는 증폭 방법이지만, 등가물 또한 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 예들은 NASBA, 3SR, TMA 및 3중 증폭(triamplification)과 같은 등온 증폭 기술(isothermal amplification techniques)을 제한 없이 포함하며, 이들 모두는 당업계에 잘 알려져 있고, 적절한 시약들이 상업적으로 입수 가능하다. 다른 적절한 증폭 방법은 리가아제 연쇄 반응(LCR)(Barringer et al, 1990), MLPA, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 선택적 증폭(미국특허 No. 6,410,276), 공통서열 준비 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction)(미국특허 No 4,437,975), 인베이더 기술(invader technology)(Third Wave Technologies, Madison, WI), 가닥 변위 기술(strand displacement technology), 임의의 준비된 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction)(WO90/06995) 및 닉 변위 증폭(nick displacement amplification)(WO2004/067726)을 제한 없이 포함한다.
본 발명의 실시간 PCR 방법 일반적으로 프라이머 어닐링을 위해 온도를 낮추는 단계, 프라이머 신장을 위해 온도를 올리는 단계, 변성을 위해 온도를 올리는 단계 및 데이터 수집을 위해 온도를 낮추는 단계를 포함한다. 일 특정 실시태양에서, 데이터 수집 단계는 대략 56℃ 내지 63℃ 사이의 온도, 가장 바람직하게 대략 57℃ 또는 62℃에서 수행되며, 이는 이 온도에서 실시예 부분에 설명된 바와 같이 최대로 민감하고 구체적인 결과들을 보여주는 것으로 나타났기 때문이다.
특정 실시태양에서, 중합효소 연쇄 반응의 열적 프로파일(thermal profiling)은 40 내지 50 사이의 반복, 바람직하게 대략 사이클의 45 반복을 포함한다:
(a) 대략 50℃에서 대략 2분 동안
(b) 대략 95℃에서 대략 10분 동안
(c) 대략 95℃에서 대략 15분 동안
(d) 대략 57℃에서 대략 1분 동안
본 발명의 방법에서 구체적이며 민감한 결과를 생산하는 것으로 나타나는 바람직한 반응 계획(reaction scheme)은 단계1: 50℃에서 2분 동안, 단계2: 95℃에서 10분 동안, 단계3: 95℃에서 15초 동안, 57℃에서 30초 동안, 57℃에서 30초 동안(= 고원 데이터 수집(plateau-data collection)) 45회 반복이다.
본 발명의 방법이 동일한 반응에서 하나 이상의 관심 유전자를 검출하기 위해 사용되는 것이 가능하다. 여러 특정 세트의 프라이머 사용을 통해, 여러 핵산 표적의 증폭이 동일한 반응 혼합물에서 수행될 수 있다. 이는 "다중화(multiplexing)"로 명명될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 각 표적에 대한 프라이머 하나 또는 둘 다는 형광 모이어티 및 FRET쌍으로부터의 소광 모이어티로 표지화된 헤어핀 프라이머일 수 있다. 여러 핵산 표적들의 증폭은 서로 다른 방출 파장에서 각 프라이머 세트를 표지화하는데 사용되는 서로 다른 형광 도너 및/또는 억셉터 모이어티를 필요로 한다. 증폭 이후 검출 및 분석 동안 반응 혼합물은 반응에서 사용된 각 프라이머 세트에 대해 특색을 이루는 각 특정 파장들에서 비추어지고 읽어진다. 따라서 혼합물에서 특정한 표적 DNAs가 증폭되고 표지화되었는지 결정될 수 있다. 구체적인 실시태양에서, 다른 각각의 표적 서열의 증폭을 위한 두 개 이상의 프라이머쌍이 사용된다. 따라서 관심의 메틸화된/비메틸화된 유전자의 패널(panel)의 존재 및/또는 양은 단일 DNA-함유 샘플에서 검출될 수 있다.
다중화는 또한 동일한 반응에서 관심 유전자 및 참조 유전자 모두의 검출 관점에서 활용될 수 있다. 다시, 구별 가능한 적합한 도너 및/또는 억셉터 모이어티로 표지화된 프라이머는 관심 유전자 및 참조 유전자 각각의 증폭에 의해 생성된 신호를 현저하게 한다.
일 실시태양에서, 보편적인 소광제는 각각 구별 가능한 최대 방출파장을 가지는 적절한 형광단 도너와 함께 활용된다. 특히 바람직한 소광제는 DABCYL이다. 소광제인 DABCYL과 함께 , 다음 형광단이 각각 다중화를 위해 활용될 수 있다: 쿠마린(475nm의 최대방출), EDANS(491nm), 플루오레세인(515nm), 루시퍼 옐로우(523nm), BODIPY(525nm), 에오신(543nm), 테트라메틸로다민(575nm) 및 텍사스 레드(615nm)(Tyagi et al., Nature Biotechnology, Vol. 16, Jan 1998; 49-53). 다른 바람직한 조합들이 여기에서 논의된다.
선택적인 실시태양에서, DNA-함유 샘플은 분리될 수 있으며, 본 발명의 방법은 직접적으로 비교될 수 있는 결과들을 얻기 위해 샘플의 적당한 일부분에서 수행될 수 있다. 따라서 관심 유전자 및 참조 유전자 모두가 검출될 때, 하나의 일부 샘플에서 관심 유전자의 증폭을 실시간으로 검출하고, 다른 일부 샘플에서 참조 유전자의 증폭을 실시간으로 검출하기 위하여 샘플은 두 개로 분리될 수 있다. 샘플은 필요한 경우, 적절한 컨트롤 반응 수행을 위해 추가로 분리될 수 있다. 이 계획(scheme)의 이점은 각 프라이머쌍을 표지화하고, 파장들의 범위에서 방출을 탐지하기 위한 필요조건을 제거하기 위해, 보편적인 FRET쌍이 사용될 수 있다는 것이다. 하지만, 이 방법은 샘플을 분리할 수 있도록 적합한 초기 샘플을 얻는 것에 의존한다. 일 구체적인 실시태양에서, 임의의 적절한 반응 부피가 활용될 수 있으며, 증폭 단계를 위한 전체 반응 부피는 대략 10 내지 40 ㎕ 사이, 보다 바람직하게 대략 10 내지 30 ㎕ 사이, 및 가장 바람직하게 12 ㎕ 부근이다.
일 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법은 암 또는 암의 소인 진단에 사용되며, 샘플에서 비메틸화된(또는 저메틸화된) CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3의 존재는 암 또는 암에 대한 소인의 지표이다. 따라서 본 발명은 암 또는 암에 대한 소인을 진단하기 위한 키트, 방법 및 프라이머를 제공한다.
여기에서 "진단"은 질병 또는 질병의 사전-시거(pre-stadia)에 대한 선별 검사(screening), 질병의 사전-시거(pre-stadia)에 대한 확인, 모니터링 스테이징 및 상태 및 질병의 진행, 치료 이후 질병 재발에 대한 검사 및 특정 치료 성공에 대한 모니터링을 포함하는 것으로 정의된다. 테스트는 또한 예후값(prognostic value)를 가질 수 있으며, 이는 "진단"의 정의 내에 포함된다. 테스트의 예후값은 암에 대한 잠재적인 민감성의 표지 또는 암의 진행에 대한 표지로서 사용될 수 있다. 따라서 위험이 있는 환자들은 환자에게서 알아볼 수 있는 증상 면에서 질병이 나타나기 전에 확인될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 암은 폐암, 흑색종 또는 유방암으로부터 선택된다. 바람직한 실시태양에서, 진단을 위한 방법 및 분석은 CTAG1B 마커를 위한 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이들로 필수적으로 이루어진 또는 이들로 이루어진 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 진단을 위한 방법 및 분석은 CTAG2 마커를 위한 서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이들로 필수적으로 이루어진 또는 이들로 이루어진 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 진단을 위한 방법 및 분석은 PRAME 마커를 위한 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이들로 필수적으로 이루어진 또는 이들로 이루어진 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 바람직한 실시태양에서, 암 또는 암에 대한 소인의 진단은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및 40 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이들로 필수적으로 이루어진 또는 이들로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 사용하며, 유전자의 비메틸화된 형태를 검출한다.
테스트는 진찰에 의해서 또는 치료 식이요법과 함께 수행될 수 있다. NSCLC, 유방암 또는 흑색종에서 CTAG1B, CTAG2 및/또는 PRAME 발현의 예측값을 확립하는 RT-PCR 분석은 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료제를 사용하여 치료하기에 적합한 환자의 선택하는데 활용될 수 있다. 발명자들은 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 검출을 위해 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍 또는 키트를 사용하도록 디자인된 분석이 샘플을 신뢰성 있게 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 발현으로 분류할 수 있다는 것을 보여주었다. 저메틸화 테스트에 의해 얻어지는 메틸화 상태 결과는 RNA 샘플들 상에서 사용되는 CTAG1B, CTAG2 및/또는 PRAME 검출을 위한 현존하는 RT-PCR 테스트에 의해 얻어진 결과와 매우 일치한다.
샘플들, 예를 들어, 비소 폐암으로부터의 미세 바늘 생검은 qRT-PCR 증명이 어려울 때 활용되며, MageA3 유전자의 메틸화 상태 결정에 의해 검출되는 단백질 발현은 귀중한 대안을 제공한다. 그러므로 메틸화 테스트는 임상적 적용을 가진다. 따라서 본 발명의 모든 방법들은 미세 바늘 생검 샘플에 적용될 수 있다. 구체적인 실시태양에서, MAGE-A3 유전자의 메틸화 상태가 결정된다. 상기에서 지시된 이와 같은 샘플들은 대안적인 (MAGE-A3) 발현 검출 방법을 수행하기에 부적당하다. 이들 샘플들은 단지 적은 수의 세포만을 포함할 수 있으며, 결과적으로 낮은 수준의 DNA를 포함한다. 예를 들어, 이와 같은 예들은 단지 대략 70 내지 150 ㎍ 사이의 투입 DNA가 각 분석에 사용되는 것을 허용할 수 있다. 실시예 4에 나타나듯이 미세 바늘 생검 샘플을 사용한 본 발명의 방법은 효과적이다.
다른 양태에서, 본 발명은:
(a) 대상으로부터 얻어진 DNA-함유 테스트 샘플을, DNA에서 검출 가능한 변형된 잔기를 제공하기 위해 비메틸화된 시토신 잔기를 선택적으로 변형시키지만 메틸화된 시토신 잔기는 변형시키지 않는 시약과 접촉/처리하고,
(b) 적어도 하나의 프라이머가 시약 처리 이후 각각 오직 비메틸화된 DNA 서열에만 결합하도록 디자인된 적어도 하나의 프라이머쌍을 사용하여 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2 및/또는 PRAME 유전자의 적어도 일부를 증폭하는 것을 포함하며, 프라이머쌍에서 적어도 하나의 프라이머는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 60 및 61 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어지고,
(c) CTAG1B, CTAG2, PRAME and/or MageA3 유전자의 메틸화 상태를 결정하며; 샘플에서 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3의 존재는 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료제를 이용한 성공적인 치료의 가능성이 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자가 없거나 또는 낮은 수준으로 검출되는 경우보다 높은 것을 나타내는 것을 포함하는 대상에서 암의 성공적인 치료의 가능성을 예측하는 방법을 제공한다.
(c) 단계는 증폭 산물이 형성되었는지 아닌지에 대한 확인을 포함한다. (여기서 논의된 임의의 적절한 기술을 사용한) 증폭 산물의 확인은 샘플에서 비메틸화된 또는 저메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3의 존재를 나타낸다.
물론 반대의 상황 역시 적용가능하며, 따라서 본 발명의 방법은 마찬가지로 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료제 약물에 대해 저항성이 있을지 없을지, 또는 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료 약물을 사용하는 치료가 성공적이지 못할 것 같은지를 결정하기 위해 활용될 수 있다 - 샘플에서 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3의 부재는 치료에 대해 저항성이 있을 수 있음을 및/또는 치료가 성공적이지 못할 것 같음을 나타낸다. 특정 실시태양들에서, 메틸화된 DNA에 특이한 프라이머들은 또한 보충적인 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 환자를 위한 치료의 적합한 경로를 선택하기 위해 활용될 수 있다 - 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3의 존재는 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료제 약물들이 유리하게 투여될 수 있는 것을 나타내는 반면, 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3의 부재 또는 낮은 수준은 면역치료제 약물들이 금기인 것을 나타낸다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법에 대한 논의는 현재 양태에 필요한 변경을 가하여 적용되고, 모든 실시태양은 따라서, 본 발명의 양태를 위해 적절하게 고찰된다.
"성공적인 치료의 가능성"은 기재된 치료 약물들, 바람직하게는 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료제 또는 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3를 포함하는 조성물 중 어느 하나 이상을 사용하는 암의 치료가 성공적일 확률을 의미한다.
"저항"은 명시된 면역치료제 약물 중 어느 하나를 사용하는 암의 치료가 성공적일 것이라는 것의 감소된 확률 및/또는 치료 효과를 달성하기 위하여 더 높은 투여량이 필요할 것이라는 것으로 정의된다.
CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3의 저메틸화는 특정 암의 형태와 연결될 수 있다. 따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용한 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 샘플에서 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3의 검출은 암 및 특히 흑색종; 비소세포폐암(NSCLC)을 포함하는 폐암; 또는 유방암에 대한 소인 또는 발생률의 지표인 샘플에서 유방암, NSCLC를 포함한 폐암 또는 흑색종에 대한 소인 또는 발생률을 검출하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 종양 또는 암은 전립선암, 난소암, 유방암, 방광암; 식도암을 포함하는 두경부암; 자궁경부암, 대장암, 편평세포암; 간암; 다발성 골수종 및 대장암으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 여기에서 서술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용하여 샘플에서 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3의 존재는 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 양성 종양 존재의 지표인 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 양성 종양의 존재를 결정하는 방법이 제공된다.
테스트는 진찰에 의해서 또는 치료 식이요법과 함께 수행될 수 있다. 테스트는 또한 환자에게 사용할 어떤 치료적 또는 예방적 식이요법을 결정하는데 사용될 수 있으며, 치료 식이요법의 효력을 모니터하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 여기에 서술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용하여 환자의 샘플에서 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 만약 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자가 비메틸화되었을 때 대상은 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료제를 이용한 치료를 위해 확인되고 및/또는 선택되는 것을 포함하는 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료제를 이용한 치료에 적합한 환자를 확인 및/또는 선택하는 방법을 제공한다.
선택적으로, 만약 유전자가 비메틸화되지 않았을 때 대상은 바람직하게 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료제를 이용한 치료를 위해 선택되지 않는다.
관련된 양태에서, 본 발명은 여기에 서술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용하여 환자의 샘플에서 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 만약 유전자가 비메틸화되었을 때 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료제를 이용한 성공적인 치료의 가능성이 만약 유전자가 메틸화되었을 경우 보다 더 높은 암의 성공적인 치료의 가능성을 예측하는 방법을 제공한다.
선택적으로, 샘플에서 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3의 부재는 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료제를 이용한 치료에 대한 저항 가능성이 유전자가 비메틸화되었을 경우 보다 높다는 것을 나타낸다. 따라서 메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자(또는 저메틸화된 유전자의 미검출)의 검출은 면역치료제를 이용한 성공적인 치료의 확률이 낮음을 나타낸다.
따라서, CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자에 대한 메틸화 상태에 기초하여 치료를 위해 환자 집단이 선택될 수 있다. 이는 훨씬 더 초점이 맞춰지고 개인화된 약물 형태를 유도하며, 따라서 환자들이 가장 효과를 나타낼 것으로 예상되는 약으로 치료받을 것이기 때문에 향상된 성공률을 유도한다.
다른 관련된 양태에서, 본 발명은 여기에 서술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용하여 환자의 샘플에서 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 만약 유전자가 비메틸화되었을 때 치료를 위해 면역치료제(특히, CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 면역치료제)가 선택되는 암에 대한 적합한 치료 식이요법(regimen)을 선택하는 방법을 제공한다.
선택적으로, 만약 유전자가 비메틸화되지 않았을 경우, 면역치료제를 이용한 치료는 금기이다.
또한 면역치료제의 투여를 포함하며, 대상은 치료를 위해 본 발명의 임의의 방법에 따라서 또는 여기에 서술된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브, 프라이머쌍, 키트 또는 방법을 사용한 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 메틸화 상태 측정을 기초로 하여 선택되는 대상에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 바람직하게 여기에 서술된 모든 다른 양태에 대하여, 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 유전자의 검출은 CTAG1B, CTAG2, PRAME 및/또는 MageA3 단백질의 증가된 수준에 상응한다.
본 발명에서 유용한 CTAG1B, CTAG2, MAGE-A3 및/또는 PRAME 면역치료제는 CTAG1B, CTAG2, MAGE-A3 및/또는 PRAME 기반 조성물을 포함한다. 조성물의 예는 CTAG1B, CTAG2, MAGE-A3 및/또는 PRAME 포함한다. CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME를 포함하는 조성물의 예는 CTAG1B, CTAG2, MageA3 또는 PRAME의 전장(full length), CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME의 실질적인 전장 및 CTAG1B, CTAG2, MageA3 또는 PRAME의 단편, 예를 들어, CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME의 펩타이드를 포함한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 펩타이드의 예는 다음의 MAGE-A3 펩타이드를 포함한다:
Figure pct00001
MAGE 단백질은 MAGE-A3 전장(full-length)일 수 있거나 또는 MAGE3 단편의 실질적인 전장, 예를 들어, MAGE3의 아미노산 3-314(총 312 아미노산), 또는 MAGE-A3 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단으로부터 결실된 1 내지 10 아미노산의 다른 MAGE-A3 단편을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, CTAG1B, CTAG2, MAGE-A3 및/또는 PRAME 단백질, 단편 또는 펩타이드는 융합 파트너 단백질(fusion partner protein)에 연결될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 항원의 예는 다음 CTAG1B, CTAG2 및/또는 PRAME 항원을 포함한다:
한 예를 들면, CTAG1B의 적합한 펩타이드는 HLA-A2에 대한 결합 부위를 가진 펩타이드 157-167, 157-165 및 155-163과 같은 Jager, et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 97(22):12198-12203 (2000)에 개시된 펩타이드를 포함한다. CTAG1B의 펩타이드는 예를 들어 A31, DR1, DR2, DR4, DR7, DP4, B35, B51, Cw3, Cw6 및 A2 (WO2008/089074 참조)로 알려진 하나 이상의 MHC 클래스 1 또는 클래스 2 에피토프를 포함할 수 있다.
한 예를 들면, PRAME의 펩타이드는 LYVDSLFFL, ALYVDSLFFL, VLDGLDVLL, SLYSFPEA 및 SLLQHILGL (Quintarelli et al, Blood, 1 September 2008, Vol. 112, No. 5, pp. 1876-1885 참조) 펩타이드와 같은 HLA-A2에 대한 결합 부위를 가지는 펩타이드를 포함한다. PRAME의 펩타이드는 하나 이상의 MHC 클래스 1 또는 클래스 2 에피토프를 포함할 수 있다.
한 예를 들면, CTAG2의 펩타이드는 Sun et al Cancer Immunology, Immunotherapy Volume 55, Number 6 / June, 2006에 개시된 ELVRRILSR, MLMAQEALAFL, SLLMWITQC, LAAQERRVPR를 포함할 수 있다.
CTAG1B, CTAG2, MAGE-A3 및/또는 PRAME 단백질, 단편 또는 펩타이드 및 융합 파트너 단백질은 화학적으로 결합될 수 있거나, 또는 재조합 융합 단백질로 발현될 수 있다. 항원 및 파트너가 재조합 융합 단백질로 발현되는 실시태양에서, 이는 비 융합된 단백질과 비교하여 증가된 수준이 발현 시스템에서 제공될 수 있도록 한다. 따라서 융합 파트너 단백질은 T 보조 에피토프(T helper epitopes)(면역학적 융합 파트너 단백질), 바람직하게는 인간에 의해 인지되는 T 보조 에피토프를 제공하는 것을 도와줄 수 있으며, 및/또는 단백질(발현 증진 단백질; expression enhancer protein)을 네이티브(native) 재조합 단백질 보다 높은 수율(yield)로 발현하는 것을 도와줄 수 있다. 일 실시태양에서, 융합 파트너 단백질은 면역학적 융합 파트너 단백질 및 발현 증진 파트너 단백질 둘 다 일 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에서, 사용될 수 있는 면역학적 융합 파트너 단백질은 그람-음성 박테리아인 헤모필루스 인플루엔자 B(Haemophilus influenza B)(WO 91/18926)의 표면 단백질인 단백질 D 또는 이의 유도체로부터 유래한다. 단백질 D 유도체는 단백질의 첫 번째 1/3, 또는 단백질의 대략 첫 번째 1/3을 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 단백질 D의 제 1 N-말단 109 잔기는 추가적인 외인성(exogenous) T-세포 에피토프와 함께 CTAG1B, CTAG2, MAGE-A3 및/또는 PRAME 항원을 제공하기 위해 융합 파트너로 사용될 수 있으며, 대장균(E. coli)에서 발현 수준을 증가시킨다(따라서 또한 발현 증폭자(enhancer)로 역할한다). 다른 실시태양에서, 단백질 D 유도체는 제 1 N-말단 100-110 아미노산 또는 대략 제 1 N-말단 100-110 아미노산을 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 단백질 D 또는 이의 유도체는 지질화되고, 리포단백질 D가 사용될 수 있다: 지질 꼬리(lipid tail)는 항원 제시 세포(antigen presenting cell)에 대한 항원의 최적의 표출을 보장할 수 있다. 다른 실시태양에서, 단백질 D 또는 이의 유도체는 지질화되지 않는다.
단백질 D의 "분비 서열(secretion sequence)" 또는 "신호 서열(signal sequence)"은 자연적으로 발생하는 단백질의 대략 1 내지 16, 17, 18 또는 19 아미노산을 말한다. 일 실시태양에서, 단백질 D의 분비 또는 신호 서열은 단백질 D의 N-말단 19 아미노산을 말한다. 일 실시태양에서, 분비 또는 신호 서열은 단백질 D 융합 파트너의 N-말단에서 포함된다. 여기에서 사용된, "제 1 3분의1(1/3)", "제 1 109 아미노산" 및 "제 1 N-말단 100-110 아미노산"은 분비 또는 신호 서열에 바로 뒤따르는 단백질 D 서열의 아미노산을 말한다. 신호 서열의 아미노산 2-K 및 3-L은 아미노산 2-M 및 3-D로 선택적으로 치환될 수 있다.
일 실시태양에서, 면역치료를 위한 항원은 컨스트럭트 형태로 단백질 D와 융합된 다음과 같은 형태일 수 있다: 단백질 D- CTAG1B - His, 또는 단백질 D- CTAG2 -His, 또는 단백질 D- PRAME- His, 또는 단백질 D- MAGE-A3 - His. 이 융합 단백질은 단백질 D의 신호 서열, 단백질 D의 아미노산 1 내지 109, (전장이거나 또는 부분적인 단백질 서열인) 면역치료를 위한 항원, 스페이서 및 생산 과정 동안 융합 단백질의 정제를 용이하게 하는 폴리히스티딘 꼬리(His)을 포함할 수 있다. 예를 들어:
i) 18-잔기 신호 서열 및 단백질 D의 제 1 N-말단 109 잔기;
ii) 두 개의 관련되지 않은 잔기(메티오닌 및 아스파르트산);
iii) 면역치료를 위한 항원;
iv) 경첩 지역(hinge region)으로 기능하는 두 개의 글리신 잔기; 및
v) 일곱 개의 히스티딘 잔기.
바람직하게 사용되는 단백질 D의 부분은 분비 서열 또는 신호 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시태양에서, 융합 파트너 단백질은 융합 단백질 서열의 N-말단 위치 또는 내부에서 Met-Asp-Pro 아미노산을 포함하고, 단백질 D의 분비 서열을 또는 신호 서열을 포함하지 않는다. 예를 들어, 융합 파트너 단백질은 대략 또는 정확히 단백질 D의 아미노산 17 내지 127, 18 내지 127, 19 내지 127 또는 20 내지 127을 포함할 수 있거나 또는 이들로 이루어질 수 있다.
한 예를 들면, 단백질 D와의 융합 단백질에 기반한 적절한 PRAME 항원이 본 발명에 전체로써 참조로 포함되는 WO2008/087102에 개시되어 있다.
다른 실시태양에서, 면역학적 융합 파트너 단백질은 LytA 또는 이로부터 유래한 단백질로 알려진 단백질일 수 있다. LytA는 펩티도글리칸 골격 내의 특정 결합을 특이적으로 분해하는 자가분해효소(autolysin)인 N-아세틸-L-알라닌 아미다아제인 (LytA 유전자에 의해 코딩되는(Gene, 43 (1986) page 265-272)) 아미다아제 LytA를 합성하는 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae)으로부터 유래한다. LytA 단백질의 C-말단 영역은 콜린(choline) 또는 DEAE와 같은 일부 콜린 유사체에 대한 친화도에 책임이 있다. 이 특성은 융합 단백질의 발현에 유용한 대장균 C-LytA 발현 플라스미드 개발에 활용되어 왔다. 아미노 말단에 C-LytA 단편을 포함하는 혼성 단백질들의 정제가 기술되었다(Biotechnology: 10, (1992) page 795-798). 일 실시태양에서, 분자의 C 말단 부분이 사용될 수 있다. 178 잔기에서 시작하는 C 말단에서 발견된 LytA 분자의 반복 부위가 활용될 수 있다. 일 실시태양에서, LytA 부분은 188 - 305 잔기를 포함할 수 있다.
다른 융합 파트너는 인플루엔자 바이러스인 NS1로부터의 비-구조적 단백질을 포함한다(혈구응집소; hemagglutinin). 만약 단편이 T 보조 에피토프를 포함하는 경우 비록 다른 단편들이 사용될 수 있지만, 일 실시태양에서, NS1의 N 말단 81개 아미노산들이 활용된다.
본 발명의 일 실시태양에서, 면역치료에 사용하기 위한 항원은 파생된 자유 티올(derivatised free thiol)을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시태양에서, MAGE-A3 단백질은 파생된 자유 티올(derivatised free thiol)을 포함할 수 있다. 이들 항원들은 WO99/40188에 개시되어 있다. 특히, 카복시아마이드화된(carboxyamidated) 또는 카복시메틸화된(carboxymethylated) 유도체들이 사용될 수 있다.
면역치료를 위한 항원들이 융합 또는 혼합물 형태의 다른 면역치료제 항원들과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, CTAG1B가 CTAG2, 또는 이의 단편과 융합하여 사용될 수 있다(본 발명에 전체로써 참조로 포함되는 WO2008/089074 참조).
융합 단백질로서의 또는 혼합물로서의, 면역치료제 약물의 조합은 예를 들어, CTAG1B, CTAG2, PRAME 또는 MAGE3의 2개 이상의 임의의 조합을 포함하지만 본 발명은 이들 특정 항원들에 제한되지 않으며, 임의의 면역치료제 항원이 사용될 수 있다. 한 예를 들면, MAGE-3 항원은 NY-ESO-1와 결합하여 제형화되기 적합한 것으로 서술된다; 본 발명에 전체로써 참조로 포함되는 WO2005/105139 참조.
다른 실시태양에서, 본 발명에 사용하기 위한 면역치료제는 여기에 서술된 면역치료제 단백질, 단편 또는 펩타이드 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시태양에서, 서열은 적절한 발현 벡터 내에 삽입될 수 있으며, DNA/RNA 백신 접종(vaccination)에 사용될 수 있다. 핵산을 발현하는 미생물 벡터는 또한 벡터-운반된 면역치료제(vector-delivered immunotherapeutics)로써 사용될 수 있다.
적절한 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스(retroviral), 렌티바이러스(lentiviral), 아데노바이러스(adenoviral), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated viral), 헤르페스 단순 바이러스를 포함하는 헤르페스 바이러스(herpes viral including herpes simplex viral), 알파-바이러스(alpha-viral), 카나리아두바이러스 및 백시니아-바이러스 기반 계통과 같은 폭스바이러스(pox viral such as Canarypox and vaccinia-viral based systems)를 포함한다. 이러한 바이러스를 사용하는 유전자 전달 기술은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어 레트로 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 숙주의 게놈 안으로 안정적으로 통합시키기 위해 사용될 수 있다(비록 이런 재조합이 선호되지 않지만). 대조적으로 복제-결함 아데노바이러스 벡터(Replication-defective adenovirus vectors)는 에피솜에 남아있고, 따라서 일시적인 발현을 허용한다. 예를 들어, 서브유닛 백신으로의 또는 면역분석에서의 사용을 위해, 곤충 세포(예를 들어, 바큐로바이러스 벡터), 인간 세포, 이스트 또는 박테리아에서 발현을 유도할 수 있는 벡터들이 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 많은 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 살아있는 벡터(live vector)로 사용되는 아데노바이러스는 복제 결함 유인원 아데노바이러스(replication defective simian adenovirus)이다. 일반적으로 이들 바이러스들은 E1 결실(deletion)을 포함하며, E1 유전자로 형질전환된 세포주(cell lines) 상에서 자랄 수 있다. 바람직한 유인원 아데노바이러스는 침팬지로부터 분리된 바이러스이다. 특히, C68(또한 Pan 9로도 알려짐)(미국특허 No 6083 716 참조) 및 Pan 5, 6 및 Pan 7(W0 03/046124)이 본 발명의 용도를 위해 선호된다. 이들 벡터들은 본 발명의 비상동(heterologous) 유전자를 삽입하기 위해 조작될 수 있으며, 이에 따라 유전자 산물이 발현될 수 있다. 이와 같은 재조합 아데노바이러스 벡터의 용도, 제형화 및 제조는 WO 03/046142에 상세하게 명시되어 있다.
핵산 서열을 얻기 위한 및 발현 벡터의 생산을 위한 일반적인 재조합 기술들은 Maniatis et al ., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989에 기술되어 있다.
단백질 기반 조성물에 있어서, 본 발명의 단백질은 액체에 용해된 형태 또는 동결건조된 형태로 제공될 수 있다.
각 사람에서, 1회 복용량은 1 내지 1000 ㎍의 단백질을 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 1회 복용량은 30-300 ㎍의 단백질을 포함할 수 있다.
여기에 서술된 면역치료를 위한 조성물은 백신 보조제(vaccine adjuvant), 및/또는 면역자극 사이토카인 및 케모카인을 추가로 포함할 수 있다. 따라서 여기에서 적용되는 용어 "면역치료제"는 적합한 보조제를 포함한 여기에서 서술된 면역치료를 위한 모든 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 용도를 위한 적합한 백신 보조제는 예를 들어, 프로인트 불완전 보조제 및 완전 보조제(Freund's Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant)(Difco Laboratories, Detroit, MI); 머크 보조제 65(Merck Adjuvant 65)(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2(SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); 수산화 알루미늄겔과 같은 알루미늄염(alum) 또는 인산 알루미늄; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화된 티로신의 불용성 현탁액; 아실화된 당; 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도된 다당류; 폴리포스파젠(polyphosphazenes); 생분해성 마이크로스피어(biodegradable microspheres); 모노포스포릴 지질 A 및 quil A와 같이 상업적으로 입수 가능하다. GM-CSF 또는 인터루킨-2, -7, 또는 -12, 및 케모카인과 같은 사이토카인들이 또한 보조제로 사용될 수 있다.
일 실시태양에서, 보조제는 3-de-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)와 같은 모노포스포릴 지질 A와 알루미늄염과의 조합을 포함할 수 있다. 선택적으로, 보조제는 WO 98/50399, WO 01/34617 및 WO 03/065806에 개시된 3D-MPL 또는 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트(aminoalkyl glucosaminide phosphates)와 같은 다른 톨 유사 수용체 4(TLR4) 리간드를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 보조제는 사포닌이며, 예를 들어, QS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA)은 단독으로 사용되거나 또는 보조제와 결합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 일 실시태양에서, WO 94/00153에 기술된 QS21 및 3D-MPL의 조합과 같은 모노포스포릴 지질 A 및 사포닌 유도체의 조합 또는 WO 96/33739에 개시된 QS21 콜레스테롤로 소광되는 조성물이 제공된다. 다른 적절한 제형은 수중유(oil-in-water) 에멀젼 및 토코페롤을 포함한다. 일 실시태양에서, 보조제는 WO 95/17210에 개시된 수중유(oil-in-water) 에멀젼 내의 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함한다.
본 발명의 용도를 위한 다른 보조제는 CpG 디뉴클레오티드가 비메틸화된 비메틸화된 CpG 포함 올리고뉴클레오티드와 같은 TLR9 길항제(antagonist)를 포함할 수 있다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 잘 알려져 있으며, 예를 들어, WO 96/02555에 기술되어 있다.
본 발명의 용도에 적합한 올리고뉴클레오티드는 (이와 관련해서) 다음을 포함할 수 있다:
Figure pct00002
CpG-함유 올리고뉴클레오티드는 또한 단독으로 또는 다른 보조제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 일 실시태양에서, 보조제는 CpG-함유 올리고뉴클레오티드 및 사포닌 유도체, 특히 WO 00/09159 및 WO 00/62800에 개시된 CpG 및 QS21의 조합을 포함한다.
따라서, 여기에서 서술된 면역치료제를 포함하는 조성물이 제공되며, 보조제는 3D-MPL, QS21, CpG 올리고뉴클레오티드, 폴리에틸렌 에테르 또는 에스터 중 하나 이상, 또는 이들 보조제의 둘 이상의 조합을 포함한다. 특정 실시태양에서, 조성물 내의 면역치료제 구성 성분은 수중유(oil in water) 또는 유중수(water in oil) 에멀젼 부형제 내에 또는 리포좀 제형 내에 존재할 수 있다.
일 실시태양에서, 보조제는 하나 이상의 3D-MPL, QS21 및 면역자극 CpG 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 세 가지 모든 보조제 구성 성분들이 존재한다. 구성 성분은 WO 95/17210에 기술된 바와 같이 리포좀 제형 내에 존재하거나 또는 수중유(oil in water) 에멀젼 내에 존재할 수 있다.
다른 실시태양에서, CpG 올리고뉴클레오티드가 없을 때에 3D MPL-및 Qs21는 수중유(oil in water) 에멀젼 내에 존재한다.
사용되는 3D-MPL의 양은 일반적으로 적지만 제형에 의존하며, 복용량 당 1-1000㎍ 범위, 바람직하게 복용량 당 1-500㎍, 및 보다 바람직하게 복용량 당 1 내지 100㎍ 사이일 수 있다.
본 발명의 보조제에서 CpG 또는 면역자극 올리고뉴클레오티드의 양은 일반적으로 적지만 제형에 의존하며, 복용량 당 1-1000㎍ 범위, 바람직하게 복용량 당 1-500㎍, 및 보다 바람직하게 복용량 당 1 내지 100㎍ 사이일 수 있다.
본 발명의 보조제의 용도를 위한 사포닌의 양은 복용량 당 1-1000㎍ 범위, 바람직하게 복용량 당 1-500㎍, 보다 바람직하게 복용량 당 1-250㎍, 및 가장 바람직하게 복용량 당 1 내지 100㎍ 사이일 수 있다.
여기에서 서술된 보조제 제형은 추가적으로 수중유(oil in water) 에멀젼 및/또는 토코페롤을 포함하거나 또는 리포솜 조성물로 제형화될 수 있다.
다른 적절한 보조제는 몬타나이드(Montanide) ISA 720(Seppic, France), SAF(Chiron, California, United States), ISCOMS(CSL), MF-59(Chiron), 리비 디톡스(Ribi Detox), RC-529(GSK, Hamilton, MT) 및 다른 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트(aminoalkyl glucosaminide 4-phosphates)(AGPs)를 포함한다.
일반적으로, 각 인간 1회 복용량은 0.1-1000 ㎍의 항원, 예를 들어 0.1-500 ㎍, 0.1-100 ㎍, 또는 0.1 내지 50 ㎍을 포함할 수 있다. 특정 면역치료제에 대한 최적의 양은 백신 주사를 맞은 대상에서의 적절한 면역 반응 관찰을 포함하는 일반적인 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신 주사 이후에, 대상은 한번 또는 여러 번의 적절하게 간격을 둔 면역화 촉진제(booster immunisation)를 수여 받을 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 방법의 용도를 위한 조성물은, 약학적으로 허용 가능한 부형제와 결합한 여기에서 기술된 면역치료제를 포함하는 약학적 조성물을 포함할 수 있다.
이제 본 발명은 다음 비제한적인 실시예들에 관하여 서술할 것이다:
실험 섹션
우리는 질병의 스크리닝, 검출, 스테이징, 예후, 예측 및 모니터링, (백신 옵션을 포함한) 치료의 예측 및 모니터링과 같은 각각 다른 목적을 위한 비메틸화 분석(unmethylated assays)을 이용하여 비소세포폐암(NSCLC), 흑색종 및 유방암에서 각각 다른 CT 유전자의 메틸화 상태를 연구하였다.
실시예 1: CT -항원 분석: 인- 실리코 ( in - silico ) 프라이머 디자인
유전자 서열의 비메틸화된 변형을 표적으로 하도록 디자인된 CT-항원 CTAG1B (=NY-ESO-1), CTAG2 (=LAGE-1) 및 PRAME에 대한 여러 저메틸화 분석들이 개발되었다.
MSP 필요 조건에 알맞은 프라이머3 소프트웨어
(http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm)가 CTAG1B, CTAG2 및 PRAME의 비메틸화된 형태를 검출하기 위한 정방향(F) 및 역방향(R) 프라이머들의 인 실리코 디자인을 위해 사용되었다. 조건들은 다음과 같다: 앰플리콘(amplicon) 크기: 50-120; 프라이머 크기 : 19-27; 녹는점 : 55-65; 최대(max) 3' 자기 상보성(self complementarity) = 0; TSS 주위 4000 bp의 창(window)(회귀 계수(number to return) = 2000).
전사 개시 위치(TSS)에 대한 CTAG1B, CTAG2 및 PRAME U-프라이머들의 위치는 도 1, 도 2 및 도 3에 각각 나타나있다. 조사된 영역은 프로모터 지역을 포함하며, 제 1 엑손들로 확장된다.
정방향 또는 역방향 프라이머들 중 하나는 서열:5' GCGATGCGTTCGAGCATCGCU 3' (서열번호 43.)을 운반하는 5' 말단에서 도너 및 억셉터 모이어티를 운반하는 적절한 스템 루프 또는 헤어핀 구조를 포함하도록 합성된다.
테스트된 다른 프라이머 조합들은 하기 표 1에 나타나있다. amplifluor 프라이머를 사용한 PCR 기술의 원리는 도 5에 서술되어 있다.
프라이머 및 amplifluor 검출기 서열들 CTAG1B, CTAG2, PRAME, MageA3 및 ACTB. Amplifluor 모이어티는 밑줄로 표시되어 있다.
분석 명칭
앰플리콘 길이 		프라이머 명칭 프라이머 의 형태 5' 부터 3' 서열
검출기 변형( Detector Modifications): 5' FAM 및 내부( internal) dUdabcyl
CTAG1B_1_S_AMP
151bp		 CTAG1B_1_S_AMP Amplifluor 센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUGGAAGGTGGGGGAGAGTG (서열번호1)
CTAG1B_1_AS 안티센스 프라이머 AAAACAACACAACCCCAAAAA (서열번호 2)
CTAG1B_1_AS_AMP
151bp		 CTAG1B_1_AS_AMP Amplifluor 안티센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUAAAACAACACAACCCCAAAAA (서열번호 3)
CTAG1B_1_S 센스 프라이머 GGAAGGTGGGGGAGAGTG (서열번호 4)
CTAG1B_2_S_AMP
152bp		 CTAG1B_2_S_AMP Amplifluor 센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUGGGTTGGAGAGTTGTTTGTTTG (서열번호 5)
CTAG1B_2_AS 안티센스 프라이머 CACATCTCCCCCACCTCCT (서열번호 6)
CTAG1B_2_AS_AMP
152bp		 CTAG1B_2_AS_AMP Amplifluor 안티센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUCACATCTCCCCCACCTCCT (서열번호7)
CTAG1B_2_S 센스 프라이머 GGGTTGGAGAGTTGTTTGTTTG (서열번호 8)
CTAG2_1_S_AMP
172bp		 CTAG2_1_S_AMP Amplifluor 센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTGGTGGTGTTGTTTTTGTGT (서열번호 9)
CTAG2_1_AS 안티센스 프라이머 CTTAACCCTATTATCTCCATCTC (서열번호 10)
CTAG2_1_AS_AMP
172bp		 CTAG2_1_AS_AMP Amplifluor 안티센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUCTTAACCCTATTATCTCCATCTC (서열번호 11)
CTAG2_1_S 센스 프라이머 TGGTGGTGTTGTTTTTGTGT (서열번호 12)
CTAG2_2_S_AMP
102bp		 CTAG2_2_S_AMP Amplifluor 센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUGGTGGTTTTGAAGGATTTTATTG (서열번호 13)
CTAG2_2_AS 안티센스 프라이머 ACCCAACACCTTCCCTATCCT (서열번호 14)
CTAG2_2_AS_AMP
102bp		 CTAG2_2_AS_AMP Amplifluor 안티센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUACCCAACACCTTCCCTATCCT (서열번호 15)
CTAG2_2_S 센스 프라이머 GGTGGTTTTGAAGGATTTTATTG (서열번호 16)
CTAG2_3_S_AMP
147bp		 CTAG2_3_S_AMP Amplifluor 센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTTTTGTTTTGGGATGTTGTATTTT (서열번호 17)
CTAG2_3_AS 안티센스 프라이머 CCTCATCCACCCAACACCTT (서열번호 18)
CTAG2_3_AS_AMP
147bp		 CTAG2_3_AS_AMP Amplifluor 안티센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUCCTCATCCACCCAACACCTT (서열번호 19)
CTAG2_3_S 센스 프라이머 TTTTGTTTTGGGATGTTGTATTTT (서열번호 20)
PRAME_1_S_AMP
143bp		 PRAME_1_S_AMP Amplifluor 센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTGGGTTTGTAGTGTTTTAGTATTGTTT (서열번호 21)
PRAME_1_AS anti센스 프라이머 TCCACCCTACTTTCCCTACATTC (서열번호 22)
PRAME_1_AS_AMP
143bp		 PRAME_1_AS_AMP Amplifluor 안티센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTCCACCCTACTTTCCCTACATTC (서열번호 23)
PRAME_1_S 센스 프라이머 TGGGTTTGTAGTGTTTTAGTATTGTTT (서열번호 24)
PRAME_2_S_AMP
128bp		 PRAME_2_S_AMP Amplifluor 센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTTGTTTTGGGATATTTTATTTGTTTT (서열번호 25)
PRAME_2_AS 안티센스 프라이머 AAAAACTCCACCCTACTTTCC (서열번호 26)
PRAME_2_AS_AMP
128bp		 PRAME_2_AS_AMP Amplifluor 안티센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUAAAAACTCCACCCTACTTTCC (서열번호 27)
PRAME_2_S 센스 프라이머 TTGTTTTGGGATATTTTATTTGTTTT (서열번호 28)
PRAME_3_S_AMP
141bp		 PRAME_3_S_AMP Amplifluor 센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUGAGGGGAGGGGTGTGAATGTG (서열번호 29)
PRAME_3_AS 안티센스 프라이머 CATTCCTCCCTACTCCCAAAAA (서열번호 30)
PRAME_3_AS_AMP
141bp		 PRAME_3_AS_AMP Amplifluor 안티센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUCATTCCTCCCTACTCCCAAAAA (서열번호 31)
PRAME_3_S 센스 프라이머 GAGGGGAGGGGTGTGAATGTG (서열번호 32)
PRAME_6_S_AMP
129bp		 PRAME_6_S_AMP Amplifluor 센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTGGTGGATGTTTTGGGATTT (서열번호 33)
PRAME_6_AS anti센스 프라이머 CAACATTTCTACCTCTACTCCCACCTT (서열번호 34)
PRAME_6_AS_AMP
129bp		 PRAME_6_AS_AMP Amplifluor 안티센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUCAACATTTCTACCTCTACTCCCACCTT (서열번호 35)
PRAME_6_S 센스 프라이머 TGGTGGATGTTTTGGGATTT (서열번호 36)
PRAME_7_S_AMP
120bp		 PRAME_7_S_AMP Amplifluor 센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUGTTTTGGAAGGATTGAGAAATGG (서열번호 37)
PRAME_7_AS 안티센스 프라이머 CACCCTAACCACTACATAAAACAAA (서열번호 38)
PRAME_7_AS_AMP
120bp		 PRAME_7_AS_AMP Amplifluor 안티센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUCACCCTAACCACTACATAAAACAAA (서열번호 39)
PRAME_7_S 센스 프라이머 GTTTTGGAAGGATTGAGAAATGG (서열번호 40)
ACTB_S_AMP
125bp
 ACTB_S_AMP Amplifluor 센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTAGGGAGTATATAGGTTGGGGAAGTT (서열번호 41)
ACTB_AS 안티센스 프라이머 AACACACAATAACAAACACAAATTCAC (서열번호 42)
MAGE-A3 GO_2 U
140　bp		 MAGEA3_GO_2_U_F_AMP Amplifluor 센스 프라이머 AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTGGAATTTAGGGTAGTATTGT (서열번호61)
MAGEA3_GO_2_U_AS 안티센스 프라이머 CCCTCCACCAACATCAAA (서열번호62)
실시예 2　: 온도 구배 & 분석 선택
물질 및 방법
표준 물질 준비(preparation)에 대한 온도 구배: PCR이 MJ 리서치 PTC-200 써모사이클러(thermocycler)를 사용하여 수행되었다. 사이클 조건은 다음과 같다: 단계　1, 95℃에서 5분; 95℃에서 30초 동안 단계　2를 35회 반복, 어닐링 온도에서 30초, 72℃에서 30초; 단계　3, 72℃에서 30분, 4℃에서 유지. 어닐링 온도는 기기의 히팅 블록에서 57℃ 부터 62℃까지의 구배로 설정되었다.
클로닝: PCR 산물들은 TOPO®TA 벡터(TOPO®클로닝 키트, Invitrogen®) 내로 결찰되고, One Shot®Competent E. coli가 형질전환되었다. 플라스미드가 Qiagen GmbH사의 QIAprep®spin midiprep 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 분리되었다. 클론된 PCR 산물들이 시퀀싱에 의해 확인되고, 발표된 프로모터 서열들과 비교되었다.
표준 곡선 물질 준비: 플라미스드는 제한효소 BamHI(Roche)를 이용한 소화(digestion)에 의해 선형화되고, 이후 QIAquick®PCR 정제 키트(Qiagen GmbH; 제조사의 프로토콜에 따라)를 사용하여 정제되었다. PCR 또는 플라스미드 제제의 농도는 UV 분광광도법을 이용하여 결정되었다. 2x107 copies/5ul의 스톡 용액이 준비되고 사용 전까지 -80℃에서 보관되었다. 표준곡선의 희석물들(2x106-2x101 copies/5ul)은 각 실험을 위해 바로바로 준비되었다.
실시간 MS-PCR: CTAG1B, CTAG2, PRAME 및 □-액틴 정량화는 실시간 MSP 분석에 의해 수행되었다.
이들은 ABI Prism®7900HT 기기(Applied Biosystems) 또는 i-사이클러(BioRad) 중 하나를 사용하는 각 Amplifluor®분석형에 대한 특정 프라이머 조합을 사용하는 유사한 증폭/정량화 과정으로 이루어져 있다. 사이클 조건은 다음과 같다: 단계1: 50℃에서 2분, 단계2: 95℃에서 15분, 단계3: 95℃에서 15초, 57℃에서 30초, 57℃에서 30초(고원-데이터 수집(plateau-data collection))를 45회 반복. 결과들은 Applied Biosystems사의 SDS 2.2.2 소프트웨어 또는 BioRad사의 iCycler iQ version 3.1 소프트웨어 중 하나를 사용하여 생성되고, Ct값으로 보내졌다(증폭 곡선이 문턱값을 넘는 사이클수는 소프트웨어에 의해 자동적으로 설정된다).
결과:
표 1에 기재된 프라이머쌍에 상응하는 프라이머들이 각 분석을 위한 PCR 산물을 준비하기 위해 사용되었다. 이를 위해, 도 1, 도 2 및 도 3에 나타난 CTAG1B_1, CTAG2_1 and PRAME_7에 대한 짧은 영역(short region)이 주형(template) 물질로 중아황산염(bisulphite) 처리된 CpGenomeTM 유니버셜 비메틸화된 DNA를 사용하여 증폭되었다. 각 프라이머쌍에 대해 단일 PCR 산물을 얻기 위해 여러 어닐링 온도가 테스트되었다(57℃ 내지 62℃). 이들 PCR 산물들은 정제되고, 정량된 후 각 분석을 위한 표준물질로 제조하기 위해 희석되었다. 초기 실시간 MS-PCR은 주형으로 (각 분석에 대해 특이한) 정제된 PCR 산물을 사용하여 준비되었고, 각각 다른 프라이머쌍의 조합들은 표 1에 나타나있다. 마지막으로 다음의 분석들이 추가적인 조사를 위해 보류되었다: CTAG1B_1_S_AMP, CTAG1B_2_AS_AMP, CTAG2_1_S_AMP, CTAG2_1_AS_AMP, CTAG2_3_S_AMP, PRAME_1_AS_AMP, PRAME_2_S_AMP, PRAME_3_AS_AMP, PRAME_6_AS_AMP 및 PRAME_7_S_AMP. 각각의 (모든 6개의 측정점(data points)을 포함하는) 성능에 대한 예는 표 2에 나타나있다.
슬로프 및 PCR 효율 CT 분석의 요약 (*:　단지 4개의 측정점만이 포함됨)
분석 명칭 슬로프 R 2 효율
CTAG1B_1_S_AMP -3.5841 0.9999 90.11%
CTAG1B_2_AS_AMP * -3.5044 0.9919 92.91%
CTAG2_1_AS_AMP -3.2955 0.9998 101.11%
CTAG2_1_S_AMP -3.5534 0.9980 91.17%
CTAG2_3_S_AMP -3.5971 1.0000 89.67%
PRAME_1_AS_AMP -3.4750 0.9960 100.86%
PRAME_2_S_AMP -3.5334 0.9993 91.87%
PRAME_3_AS_AMP -3.7041 0.9990 86.20%
PRAME_6_AS_AMP -3.5841 0.9999 90.11%
PRAME_7_S_AMP -3.8679 0.9994 81.36%
일부 분석에서, PCR 산물은 플라스미드에서 복제되고, 컨스트럭트는 PCR 산물 대신에 표준곡선 준비를 위한 물질로 사용된다.
실시예 3: CTAG1B , CTAG2 및 PRAME 유전자에 대한 실시간 MS - PCR 분석 및 정량화 실시간 RT - PCR 결과의 일치
물질 및 방법:
세포주, 폐 샘플, 흑색종 샘플 및 유방 샘플로부터의 RNA는 Tripure 시약(Roche, Vilvoorde, Belgium)을 사용하여, 이소프로판올 침지가 RNeasy 정제 단계(Qiagen, Venlo, Netherlands)로 교체된 것을 제외하고는 제조사의 지시에 따라 추출되었다. RNA 농도는 260 nm에서 광학 밀도값으로부터 결정되었다. 세포주 DNA는 "Puregene 세포 및 조직 키트"(Qiagen # 158767) 또는 "QIAamp DNA 미니 키트(Qiagen #51304)" 중 하나를 사용하여 추출되었다.
RNA later®solution의 GSKBio에 의해 제공된 폐 생검 샘플이 게놈 DNA를 추출하기 위해 사용되었다. 약 10mg의 폐 조직들은 면도날을 사용하여 매우 작은 조각들로 슬라이스되고, 페놀 추출방법에 의해 추출이 수행되었다. 포르말린-고정되고, 파라핀에-묻힌(FFPE) 유방 조직으로부터의 DNA는 자일렌 처리 이후 동일한 페놀/클로로폼 방법에 따라 추출되었다.
흑색종 생검 샘플로부터의 DNA는 "QIAamp DNA 미니 키트"(Qiagen #51304) 또는 "맥스웰 16 조직 DBA 정제 키트"(Promege AS1030) 중 하나를 사용하여 추출되었다.
자일렌 처리: FFPE 조직을 함유한 각 튜브는 RT에서 2시간 동안 750　ul의 자일렌(Merck #1.08681.1000)과 함께 파라핀을 용해시키기 위해 배양되었다. 파라핀이 완전히 용해되었을 때, 250　ul의 70　% 에탄올이 첨가되고, 혼합된 후에, 튜브는 15분간 최대 속도에서 원심분리되었다. 상층액이 제거되고, 샘플은 상온에서 기건(air dried)되었다.
DNA는 페놀/클로로폼을 사용하여 샘플로부터 추출되었다: 간단히, 샘플은 48℃에서 50 내지 100　ug/ml의 프로테이나아제 K(proteinase　K)(Roche) 및 최종 농도 1　%　SDS로 하룻밤 동안 1100 rpm으로 흔들어 주면서 제 1 배양되었다. Invitrogen사의 페놀:클로로폼:이소아밀알코올(25:24:1) 1 부피가 1 부피의 샘플에 첨가되고, 혼합물은 Phase Lock 겔 튜브(Eppendorf)로 이동되었다. 혼합 이후에, 튜브는 상을 분리하기 위해 원심분리되고, 핵산을 함유한 수성 상부(aqueous upper one)를 회복하였다. Phase Lock 겔 튜브를 사용한 추출이 한번 더 이루어졌다. DNA는 750　ul의 EtOH/NH4Ac 용액 및 2　ul의 글라이코겐(Roche) 첨가에 의해 침전되었다. 이는 이후 50ul의 LoTE (3mM TRIS, 0.2mM EDTA, pH 8.0)에 용해되었다.
DNA는 Picogreen®dsDNA 정량화 키트(Molecular Probes, #P7589)를 사용하여 제조사의 권고에 따라 정량화되었다. 키트와 함께 제공되는 λDNA가 표준곡선을 제조하기 위해 사용된다. 데이터는 FluoStar Galaxy 플레이트 인식기(BMG Lab technologies, Germany)를 사용하여 수집되었다.
중아황산염(Bisulfite) 처리: LoTE에서 1.5　ug까지의 DNA가 Zymo Research사의 EZ DNA 메틸화 키트(#D5002)를 사용하여 처리되었다, 간단히, 45　ul의 분취량(aliquots)이 5ul의 M-Dilution 완충액과 혼합되고, 37℃에서 15분간 1100rpm으로 흔들어주면서 배양되었다. 이후 100　ul의 희석된 CT 전환 시약이 첨가되고, 샘플들은 암조건에서 1100rpm으로 흔들어주면서 70℃에서 3시간 동안 배양되었다. 전환 이후, 샘플들은 제조사의 지시에 따라 추가로 탈염되고, 탈술폰화되었으며, 용출은 50　ul의 Tris-HCl 1　mM Ph　8.0에서 이루어졌다.
2.4　ul의 중아황산염 처리된 DNA가 100　nM의 최종 농도의 각 프라미어들(표 1에 따른 특정 조합) 및 Quantitect 프로브 PCR 키트(Qiagen #204345)부터의 2x 혼합을 포함한 12　ul의 마지막 반응액에서 사용된다. CpGenomeTM 유니버셜 메틸화된 및 비메틸화된 DNA(Chemicon International, CA, USA; Cat.#S7821 및 Cat.# S7822)가 각각의 수행에서 음성 및 양성 컨트롤로서 포함된다. 반응액들은 384 웰 플레이트에 로딩되었다. 분석들은 Applied Biosystem 7900HT 기기 상에서 수행되었다. 사이클 조건은 다음과 같다:
단계 1: 50℃에서 2분, 단계 2: 95℃에서 10분, 고원-데이터 수집(plateau-data collection)에 상응하는 단계 3(45회 반복): 95℃에서 15초, 57℃에서 30초(또는 □-액틴에 대해서는 62℃), 57℃에서 30초(또는 □-액틴에 대해서는 62℃). 결과들은 Applied Biosystems사의 SDS 2.2.2 소프트웨어 중 하나를 사용하여 생성되고, Ct값으로 보내졌다(증폭 곡선이 문턱값을 넘는 사이클수는 소프트웨어에 의해 자동적으로 설정된다). Ct값은 20 - 2 x 10^6 유전자 복제 등가물(equivalents)의 표준 곡선 상에 구분되는(plotted) 값의 선형 회귀(linear regression)에 기초한 복제수를 계산하는데 사용된다. 관심 유전자 및 b-액틴 사이의 비율은 계산되어 테스트 결과를 산출한다.
2 ug의 총 RNA로부터의 cDNA 합성이 1x 제 1 가닥 완충액, 0.5 mM의 각 dNTP, 10 mM의 디티오트레이톨(dithiothreitol), 20 U의 rRNase 억제제(Promega cat.N2511), 2uM의 올리고(dT)15 및 200 U의 M-MLV 역전사효소(Life Technologies cat. 28025-013)을 포함하는 20 ul 혼합물에서 42℃로 1시간30분 동안 수행되었다. 50 ng의 총 RNA에 상응하는 cDNA가 TaqMan 완충액, 5mM의 MgCl2, 0.4 mM의 dUTP, 0.2 mM의 각 뉴클레오티드, 0.625 U의 Ampli Taq Gold DNA 중합효소, 0.05 U의 UNG, 0.2 uM의 각 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 0.2 uM의 TaqMan MGB 프로브를 포함하는 25 ul의 혼합물에서 PCR에 의해 증폭되었다. 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 MGB 프로브가 사용되었다. 표적 유전자 및 베타-액틴 유전자는 TaqMan 화학 7900 시스템(PE Applied Biosystems)을 사용하는 정량적인 PCR에 의해 증폭되었다. 증폭 프로파일은 50℃에서 2분 동안 1사이클, 95℃에서 12분 동안 1사이클 및 95℃에서 15초 동안 40 사이클 및 60℃에서 1분이었다. TaqMan 프로브의 분해에 의해 생성되는 형광 신호는 60℃에서의 모든 신장 단계(elongation steps) 동안 실시간으로 검출된다. 미가공 데이터(Raw data)는 실시간 서열 검출 소프트어웨(Applied Biosystems, Warrington, UK)를 사용하여 분석되었다. 표적 유전자 및 b-액틴 사이의 비율은 결과를 생성하기 위하여 계산되었다.
구체적 사항:
실시간 MS-PCR을 위해 다음 구체적 사항들이 표준 곡선에 적용된다: 복제물에서 적어도 4 포인트들; □Ct (복제물들 간에) < 1.5; PCR 효율 > 80%; R2 > 0.99; 양성 컨트롤들은 양성이어야 한다; 음성 컨트롤들은 음성이어야 한다.
결과 해석의 기준은 관심 유전자의 표준 등가 복제들(standard equivalent copies) 및 b-액틴 복제들: 비율 = (관심 유전자의 복제들　/　β-액틴 복제들) X 1000으로 계산된 비율값(Ratio values)에 기초한다.
유전자 발현에서, NTC는 35 보다 큰 CT를 가지며, 양성 컨트롤은 표적 유전자 및 베타-액틴 <2에 대한 △Ct 복제물들(duplicates)을 가지는 양성이다.
유전자 발현 결과는 액틴 발현에 대하여 상대적으로 계산된다. PRAME 발현에 대한 컷-오프는 1E-04 복제/액틴 복제에서 설정되고, CTAG1B 및 CTAG2에 대한 컷-오프는 1E-05 복제/액틴 복제에서 설정된다. 만약 베타-액틴 Ct가 23 보다 낮고, △Ct 복제물들 <2이며, 만약 표적 유전자 △Ct 복제물들 <2인 경우 샘플들은 유효하다.
실시간 MS-PCR 결과 해석의 기준. *컷-오프 값(cut-off value)은 각각의 분석에 대해 구체적으로 설정된다.
결과 메틸화/비멜틸화 상태
β-액틴 < 2.00 복제들 결과 무효(INVALID)
2.00 <β-액틴 < 200.00 복제들 및 CT 유전자 < 2.00 복제들 결과 무효(INVALID)
β-액틴 ≥ 200.00 복제들 및
CT 유전자 < 2.00 복제들		 결과 메틸화(METHYLATED)
(비율 없음)
β- 액틴 ≥ 2.00 복제들 및
CT 유전자 ≥ 2.00 복제들 		비율: CT 유전자 /β-액틴 x 1000 ≥ 컷-오프 값* 결과 비메틸화(UNMETHYLATED)
β- 액틴 ≥ 2.00 복제들 및 CT 유전자 ≥ 2.00 복제들 비율: CT 유전자 /β-액틴 x 1000 < 컷-오프 값* 결과 메틸화(METHYLATED)
결과들
세포주
선택적인 표준 곡선 물질을 사용한 가장 최적의 실시간 MS-PCR 조건 선택 이후, CTAG1B, CTAG2 및 PRAME 탈메틸화 분석을 위해 다양한 세포주들이 분석되었다. 결과들은 실시간 RT-PCR을 사용하여 얻어진 것들과 비교되었다. 각각의 연구된 유전자(CTAG1B, CTAG2, PRAME)에 대한 분석이 나타나있다. 표 4, 표 5 및 표 6 참조.
20개의 세포주에 대한 CTAG1B_1_S 분석 대 실시간 RT-PCR 데이터(발현)를 사용하여 얻어진 실시간 MS-PCR 결과의 요약; 결과는 비율값으로 정렬되어 나타나있다. 발현 데이터 N/A: 해당없음(not applicable); 음성(Negative): 발현하지 않는 샘플(Not expressing samples); 발현 샘플들은 해당하는 값으로 표시되어 있다.
세포주 비율 CTAG1B_1_S/ b-액틴
(복제들) X 1000 		발현 데이터 CTAG1B
HL-60 0 NA
SW-480 0 음성
LNCap 1.81 음성
LS-174T 28.17 음성
SW620 73.75 음성
HT29 74.07 음성
MCF7 81.95 음성
KG1 85.54 음성
NCI-H460 93.52 음성
Staq 94.33 음성
Gerl 99.43 음성
T-47D 116.29 음성
UACC3199 120.74 NA
PC3 140.68 음성
SK-MEL-5 165.07 음성
CRL5815 180.51 음성
SKOV3 196.44 음성
K562 204.86 음성
CRL2505 297.39 2.03E-02
CRL5803 390.78 1.71E-02
20개의 세포주에 대한 CTAG1B_1_AS 분석 대 실시간 RT-PCR 데이터(발현)를 사용하여 얻어진 실시간 MS-PCR 결과의 요약; 결과는 비율값으로 정렬되어 나타나있다. 발현 데이터 N/A: 해당없음(not applicable); 음성(Negative): 발현하지 않는 샘플(Not expressing samples); 발현 샘플들은 해당하는 값으로 표시되어 있다; 경계 샘플들은 괄호 안에 있음.
세포주 비율
CTAG2 _1_ AS / b-액틴
(복제들) X 1000 		발현 데이터 CTAG2
CRL5803 0 음성
Gerl 0 음성
KG1 0 음성
Staq 0 음성
SK-MEL-5 0 [4.75E-05]
HL-60 0 NA
T-47D 0 음성
PC3 0 음성
UACC3199 1.11 NA
NCI-H460 1.36 음성
SW-480 1.77 음성
SW620 1.94 음성
MCF7 5.8 음성
LNCap 8.96 [2.23E-05]
HT29 10.15 음성
K562 23.4 3.93E-03
SKOV3 28.73 음성
CRL5815 52.52 2.53E-03
CRL2505 153.86 3.63E-02
LS-174T 169,91 2.13E-03
20개의 세포주에 대한 PRAME_3_AS 분석 대 실시간 RT-PCR 데이터(발현)를 사용하여 얻어진 실시간 MS-PCR 결과의 요약; 결과는 비율값으로 정렬되어 나타나있다. 발현 데이터 N/A: 해당없음(not applicable); 음성(Negative): 발현하지 않는 샘플(Not expressing samples); 발현 샘플들은 해당하는 값으로 표시되어 있다.
세포주 비율
PRAME _3_ AS / b-액틴
(복제들) X 1000 		발현 데이터 PRAME
KG1 1.79 2.75E-05
HT29 9.07 음성
MCF7 9.2 음성
SW-480_G1 24.65 음성
SW620 99.84 1.44E-05
NCI-H460 116.05 2.65E-03
UACC3199 120.77 NA
CRL2505 150.82 1.97E-03
T-47D 167.05 1.83E-03
LS-174T_G1 187.35 음성
PC3 190.74 3.48E-03
CRL5815 233.9 8.38E-05
CRL5803 251.42 2.99E-02
SK-MEL-5 271.66 1.11E-01
Staq 292.37 양성
Gerl 461.68 양성
LNCap 487.28 2.36E-02
HL-60_G1 588.05 NA
SKOV3 659.56 9.69E-03
K562 922.78 2.71E-01
본 실험의 하나의 목적은 암 샘플 상에서 진행되는 분석을 위한 적절한 양성 및 음성 세포주를 찾는 것이다. 실시간 MS-PCR 데이터와 발현 데이터를 비교할 때, CRL2505 및 CRL5803가 가장 높은 CTAG1B_1_S/b-액틴 비율을 나타내는 것이 관찰되고(표 4), 따라서 CTAG1B_1_S 분석을 사용할 때 CTAG1B 탈메틸화(demethylation)를 위한 양성 세포주로 사용될 수 있다. SW-480 및 HL-60 세포주는 이 분석을 위한 음성 세포주로 사용될 수 있다.
또한 CTAG2 및 PRAME 테스트된 분석을 위한 최적의 양성 및 음성 세포주를 정의하는 것 또한 가능하였다(표 7 및 표 8).
CTAG2 탈메틸화 분석을 위한 최적의 양성 세포주(들) 및 음성 세포주(들)
분석 최적의 양성 세포주(들) 음성 세포주(들)
CTAG2_1_S CRL2505 CRL5803 / GERL
CTAG2_1_AS CRL2505 / LS-174-T CRL5803 / GERL
CTAG2_2_S CRL5815 / K562 CRL5803
CTAG2_3_S K562 CRL5803 / GERL
PRAME 탈메틸화 분석을 위한 최적의 양성 세포주(들) 및 음성 세포주(들)
분석 최적의 양성 세포주(들) 음성 세포주(들)
PRAME_1_AS HL60/LnCap MCF7
PRAME_2_S K562 MCF7 / HT29
PRAME_3_AS K562 KG1 / MCF7
PRAME_6_AS K562 KG1 / MCF7
PRAME_7_S GERL MCF7 / HT29
비소세포폐암( NSCLC )
51개의 NSCLC 샘플들이 실시간 RT-PCR에 의한 CTAG1B, CTAG2 및 PRAME 발현 연구뿐만 아니라 실시간 MS-PCR에 의한 이들의 메틸화 상태 연구를 위해 사용되었다. 적어도 하나의 기술에 대해 3개의 샘플들이 무효(invalid)인 것으로 발견되었으며, 따라서 48개의 NSCLC에 대해 얻어진 결과들이 비교되었다. 결과 비교는 그래프로 표현되었다. CTAG1B_1_S 분석을 사용한 CTAG1B에 대한 우수한 일치는 관찰되지 않았다(도 6). CTAG2 발현을 4개의 탈메틸화 분석을 통해 얻어진 결과와 비교할 때, 최고의 일치는 CTAG2_1S(도 8) 및 CTAG2_1AS 분석(도 7)에서 얻어졌으며, 두 기술들 간에 87.5　%의 일치를 보인다. CTAG2_2_S (도 9) 및 CTAG2_3_S (도 10)은 각각 68.8% 및 66.7%의 낮은 일치를 보인다. PRAME 발현에 대하여, 일치(concordance)의 범위는 분석에 따라 66.7% 내지 85.4%에서 관찰된다(도 11, 도 12, 도 13, 도 14 및 도 15). 발현 데이터와의 최상의 일치는 PRAME_3_AS 탈메틸화 분석에서 관찰되며(도 14), 85.4　%의 일치를 보여준다. 표 9는 NSCLC 샘플에서 유전자 발현 및 유전자 메틸화를 비교할 때 얻어진 모든 결과의 요약을 나타낸다.
피어슨 상관계수(R)를 보여주는 결과 요약 및 비소세포폐암(NSCLC) 샘플에 대한 일치 결과. *: PRAME_2_S 표준 곡선은 세부 사항(specifications)을 만족하지 않는다.
분석 R 일치
CTAG1B_1_S 0.35 /
CTAG2_1_S 0.88 87.5%
CTAG2_1_AS 0.86 87.5%
CTAG2_2_S 0.47 68.8%
CTAG2_3_S 0.55 66.7%
PRAME_1_AS 0.39 66.7%
PRAME_2_S * 0.64 79.2%
PRAME_3_AS 0.73 85.4%
PRAME_6_AS 0.24 66.7%
PRAME_7_S 0.62 83.3%
흑색종 샘플
RNA later®용액에서 31개의 흑색종 샘플로부터 DNA 및 RNA가 추출되었다.
NSCLC를 연구할 때 이루어진 것과 유사하게, 이들 흑색종 샘플들이 실시간 RT-PCR에 의한 CTAG1B, CTAG2 및 PRAME 발현 연구뿐만 아니라 실시간 MS-PCR에 의한 이들의 메틸화 상태 연구를 위해 사용되었다. NSCLC의 경우와 유사하게, CTAG1B_1_S 탈메틸화 분석을 사용할 때 발현 데이터에서 우수한 일치는 관찰되지 않았다. CTAG2 유전자의 경우, 최적의 일치는 3개의 분석에서 관찰되었다: CTAG2_1_S(도 18), CTAG2_1_AS(도 17) 및 CTAG2_3S(도 20) 분석, 기술들간에 모두 74.2　%의 일치를 보여준다. PRAME 유전자의 경우, 모든 PRAME 분석(도 21, 도 22, 도 23, 도 24 및 도 25)은 우수한 일치를 보여준다(90.3　% 및 93.5　%). 하지만, 오직 PRAME_7_S (표 9)만이 허용 가능한 피어슨상관계수(R)를 나타내었으며, 이는 아마도 그 집합의 음성 샘플(2)의 낮은 수 때문일 수 있다. 흑색종 샘플 상에서 얻어진 일치 및 상관의 결과는 표 10에 요약되었다.
피어슨상관계수(R) 및 흑색종 샘플에 대한 일치 결과를 보여주는 결과 요약
분석 R 일치
CTAG1B_1_S 0 /
CTAG2_1_S 0.62 74.2%
CTAG2_1_AS 0.63 74.2%
CTAG2_2_S 0.34 51.6%
CTAG2_3_S 0.58 74.2%
PRAME_1_AS 0.26 93.5%
PRAME_2_S 0.29 90.3%
PRAME_3_AS 0.48 90.3%
PRAME_6_AS 0.51 90.3%
PRAME_7_S 0.70 90.3%
유방암 샘플
29개의 유방암 샘플들이 실시간 RT-PCR에 의한 CTAG2 발현 연구뿐만 아니라 실시간 MS-PCR에 의한 이의 메틸화 상태 연구를 위해 사용되었다. 적어도 하나의 기술에 대해 1개의 샘플들이 무효(invalid)인 것으로 발견되었으며, 따라서 28개의 유방암 샘플에 대해 얻어진 결과들이 비교되었다. CTAG2_1_AS 및 CTAG2_3_S 분석에 대해 얻어진 결과는 각각, 71.4%(도 26)와 78.6　%(도 27) 일치하였다.
결론
거의 대부분 정상 조직의 고환에서만 발현되는 암/고환(CT) 항원들이 고환보다 암 조직에서 발현되는 것으로 발견되었다. CT 유전자의 발현은 본 연구에서 보여준 것과 같이 실시간 RT-PCR 뿐만 아니라 간접적으로 유전자 프로모터(또는 영역 가까이에서)의 메틸화 상태 조사에 의해 연구될 수 있다. 실제로 비정상적인 발현은 저메틸화와 연관될 수 있다. 세포주에 대한 연구는 CTAG1B 탈메틸화 분석을 포함한 모든 분석을 위한 양성 및 음성 컨트롤 세포주를 제공하였다. NSCLC, 흑색종 및 유방암 조직에서, CTAG1B 분석을 제외하고, 유전자 발현 및 유전자 저메틸화 상태 간의 일부 일치를 보여주는 것이 가능하였다. CTAG2 발현에 대한 최상의 일치는 CTAG2_1_S 및 CTAG2_1_AS 탈메틸화 분석을 사용하여 얻어졌으며, 이들은 모두 NSCLC 샘플에서 87.5　%의 일치 및 흑색종 샘플에서 74.2 %의 일치를 보였다. 반면 CTAG2_3_S 분석은 유방암 샘플들 사이에서 78.6 %를 보였다. PRAME의 경우, 최상의 일치는 NSCLC에서 PRAME_3_AS 탈메틸화 분석(85.4　%) 및 흑색종에서 PRAME_1_AS 분석(93.5　%)을 사용하여 얻어졌다. 두 분석들은 유방암 조직상에서 수행되었다: CTAG2_1_AS 및 CTAG2_3_S는 각각 71.4% 및 78.6　%의 일치를 보인다.
실시예 4: MAGE -A3 저메틸화 분석을 이용한 비소세포폐암(NSCLC)의 진단
물질 및 방법:
미세바늘 생검으로부터의 DNA(FNB)가 추출되었다.
실시예 3과 유사하게, 각 샘플 및 세포주 DNA의 DNA 양이 Picogreen®dsDNA 정량화 키트(Molecular Probes, #P7589)를 제조사의 권고에 따라 사용하여 분석되었다. 데이터가 수집되고 FluoStar Galaxy 플레이트 인식기(BMG Lab technologies, Germany)를 이용하여 분석되었다. 상기에서 서술한 바대로, 1.5　ug까지의 DNA가 Zymo Research사의 EZ DNA 메틸화 키트(상세 설명은 실시예 2 참조)를 사용하여 처리되었다. 용출은 25　ul에서 이루어졌다. 이후 2.4 ul의 중아황산염(Bisulfite)으로 처리된 DNA가, 100　nM 최종 농도의 각 프라이머를 포함하는 12 ul의 총 반응 부피에서, β-액틴(실시예 3과 동일) 및 MAGE-A3(MAGE-A3 GO_2 U) 실시간 MSP 분석을 통해 처리되었다(표 1). Bio-Rad사의 Rox(#172-5855)와 함께 사용된 PCR 혼합은 "iTaq supermix"이다. 플라스미드 컨스트럭트(Invitrogen life technologies사의 TOPO®클로닝 벡터에 복제된 PCR 산물)는 기준(standards)을 준비하기 위해 사용되었다. 반응액들은 384 웰 플레이트에 로딩되었다. 분석은 Applied Biosystem 7900HT 기기 상에서 수행되었다. β-액틴 분석에 대한 사이클 조건은 다음과 같다: 단계 1, 50℃에서 2분; 단계 2, 95℃에서 10분; 단계 3, 95℃에서 15초 이후 62℃에서 1 분(고원-데이터 수집)을 45회 반복. MAGE-A3 GO_2 U 분석에 대한 사이클 조건은 다음과 같다: 단계 1, 50℃에서 2분; 단계 2, 95℃에서 10분; 단계 3, 95℃에서 15초 이후 59℃에서 1분(고원-데이터 수집) 45회 반복.
결과들은 Applied Biosystems사의 SDS 2.2.2 소프트웨어를 사용하여 생성되고, Ct값으로 보내졌다(증폭 곡선이 문턱값을 넘는 사이클수는 소프트웨어에 의해 자동적으로 설정된다). Ct값은 20 - 2 x 10^6 유전자 복제 등가물(equivalents)의 표준 곡선 상에 구분되는(plotted) 값의 선형 회귀(linear regression)에 기초한 복제수를 계산하는데 사용된다. 관심 유전자 및 β-액틴 사이의 비율은 계산되어 테스트 결과를 산출한다.
결과
이에 종양을 절제를 받지 않고, 어떠한 발현 데이터도 얻어질 수 없는 진전된 질병을 가지는 비소세포폐암(NSCLC) 환자로부터 미세바늘생검(FNB)을 사용하여 얻어진 결과가 설명된다.
DNA 추출 및 전환 이후(중아황산염 처리), 35개의 FNB가 MAGE-A3 GO_2 U 저메틸화 분석을 통해 처리된다(표 1). 결과 해석에 대한 동일한 기준 실시예 3에도 적용된다(표 3). qRT-PCR에 대한 저메틸화 테스트를 비교하는 것이 가능하지 않았던 것처럼, 저메틸화 테스트에 대한 컷-오프도 간접적으로 확립되어야 하였다. 포르말린 고정되고 파라핀 묻힌(FFPE) 폐 조직 및 단계 IB 및 II NSCLC 환자들로부터의 RNA later 용액 내 조직에 대한 동일한 분석을 사용하여 얻어진 결과에 기반하여, 선택된 컷-오프는 112이다. 대응하는 결과들은 표 11에 나타나있다. 컷-오프 값이 발현 데이터에 더 잘 대응되도록 조절될 수 있다는 것이 주목되어야 한다.
비소세포폐암(NSCLC) 환자로부터의 35개 미세바늘생검(FNB)의 메틸화 상태. Lncap은 저메틸화 테스트에 대한 양성 컨트롤로 사용된 세포주인 반면, DU145는 이 분석에 대한 음성 컨트롤로 사용된 세포주이다. 분석은 계산된 비율에 대한 112의 컷-오프를 사용하여 이루어졌다.
검출기
( Detector ) 		샘플 Ct
(MAGE-A3 GO_2 U 분석)		 MAGE -A3 복제들 비율 유전자/b- 액 틴 (복제들) X 1000 메틸화 상태
MAGEA3 233057_G1 33.75 68.85 37.19 메틸화
MAGEA3 233058_G1 31.05 359.64 262.90 비메틸화
MAGEA3 233059_G1 36.79 10.71 5.91 메틸화
MAGEA3 233060_G1 34.22 51.78 24.29 메틸화
MAGEA3 233061_G1 34.07 56.49 255.84 비메틸화
MAGEA3 233062_G1 30.70 444.05 215.36 비메틸화
MAGEA3 233063_G1 34.70 38.49 30.64 메틸화
MAGEA3 233064_G1 26.07 7549.74 442.02 비메틸화
MAGEA3 233065_G1 34.54 42.55 70.62 메틸화
MAGEA3 233066_G1 36.12 16.10 2.62 메틸화
MAGEA3 233067_G1 36.73 11.10 12.36 메틸화
MAGEA3 233068_G1 39.29 2.32 0.84 메틸화
MAGEA3 233069_G1 Undetermined 0.00 0.00 메틸화
MAGEA3 233070_G1 33.99 59.43 16.77 메틸화
MAGEA3 233071_G1 Undetermined 0.00 0.00 메틸화
MAGEA3 233072_G1 Undetermined 0.00 0.00 메틸화
MAGEA3 233073_G1 30.79 422.20 561.79 비메틸화
MAGEA3 233074_G1 33.74 69.27 47.80 메틸화
MAGEA3 233075_G1 29.59 879.02 554.36 비메틸화
MAGEA3 233076_G1 Undetermined 0.00 0.00 메틸화
MAGEA3 233077_G1 29.41 980.70 186.65 비메틸화
MAGEA3 233078_G1 28.64 1567.01 609.72 비메틸화
MAGEA3 233079_G1 36.24 15.04 0.96 메틸화
MAGEA3 233080_G1 31.40 290.03 245.69 비메틸화
MAGEA3 233081_G1 29.53 908.41 230.92 비메틸화
MAGEA3 233082_G1 32.43 154.15 45.57 메틸화
MAGEA3 233083_G1 31.76 233.19 162.65 비메틸화
MAGEA3 233084_G1 36.01 17.32 145.84 비메틸화
MAGEA3 233085_G1 36.22 15.15 61.27 메틸화
MAGEA3 233086_G1 31.28 311.56 213.53 비메틸화
MAGEA3 233087_G1 26.57 5583.40 338.05 비메틸화
MAGEA3 233088_G1 32.09 190.33 124.20 비메틸화
MAGEA3 233089_G1 34.18 52.80 25.14 메틸화
MAGEA3 233090_G1 36.18 15.57 1.50 메틸화
MAGEA3 233091_G1 34.78 36.55 269.73 비메틸화
MAGEA3 Lncap_a_G1 30.23 592.88 1995.86 비메틸화
MAGEA3 Lncap_b_G1 29.93 714.43 2616.01 비메틸화
MAGEA3 DU145_a_G1 Undetermined 0.00 0.00 메틸화
MAGEA3 DU145_b_G1 41.93 0.00 0.00 메틸화
컷-오프값을 112에서 설정함으로써, MAGE-A3 저메틸화를 가진 환자들의 백분율은 45.7 %이다. 이 환자들은 잠재적으로 MAGE-A3를 발현한다.
결론
탈메틸화/저메틸화 분석은 qRT-PCR 증명이 어려운 샘플 형태일 경우에 특히 관심의 대상이다. 이는 미세바늘생검(FNB)의 경우이다. 이 기술은 비침습성이므로, 추후 다른 NSCLC 환자들에게 확장될 수 있을 것이다.
본 발명은 여기에 기술된 구체적인 실시태양의 범위에 제한되지 않는다. 실제로, 여기에 서술된 것 뿐만 아니라, 본 발명의 다양한 변형들이 앞에 서술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 보다 명백해질 것이다. 이러한 변형들은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 또한, 여기에 기술된 모든 실시태양들은 광범위하게 적용가능하며, 임의의 모든 다른 일치하는 실시태양들과 적절하게 결합 가능한 것으로 사료된다.
다양한 문헌들이 여기에서 인용되었으며, 개시된 내용들은 본 발명에 전체로써 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> OncoMethylome Sciences SA GlaxoSmithKline Biologicals SA <120> IMPROVED DETECTION OF GENE EXPRESSION <130> P105750WO00 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 agcgatgcgt tcgagcatcg cuggaaggtg ggggagagtg 40 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 aaaacaacac aaccccaaaa a 21 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 agcgatgcgt tcgagcatcg cuaaaacaac acaaccccaa aaa 43 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 ggaaggtggg ggagagtg 18 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 agcgatgcgt tcgagcatcg cugggttgga gagttgtttg tttg 44 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 cacatctccc ccacctcct 19 <210> 7 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 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gtgtttgtg 59 <210> 54 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 54 tggtggatgt tttgggattt ggtttttttg aaggtgttgg gggttgggga tggtttaggt 60 agtggtgtag gtgttttagg aaggtgggag tagaggtaga aatgttg 107 <210> 55 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 55 gttttggaag gattgagaaa tggggattgg ttagattagg ttgtttagtt ttttggtttt 60 tattgttgtt ttttttgttt tatgtagtgg ttagggtg 98 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 56 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 57 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 58 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 59 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 60 tccatgacgt tcctgatgct 20 <210> 61 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 61 agcgatgcgt tcgagcatcg cutggaattt agggtagtat tgt 43 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 62 ccctccacca acatcaaa 18 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 63 tggaatttag ggtagtattg t 21 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 64 Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 65 Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr 1 5 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 66 Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr 1 5 10 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 67 Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala 1 5 10 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 68 Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg 1 5 10 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 69 Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr 1 5 10 <210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 70 Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser 1 5 10 15 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 71 Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr 1 5 10

Claims (33)

  1. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 또는 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 유전자의 메틸화 상태 검출에 유용한 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브.
  2. 제 1 항에 있어서,
    서열번호 9 내지 12 및 서열번호 21 내지 40 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 유전자의 메틸화 상태 검출에 유용한 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브.
  3. 제 1 항에 있어서,
    다음의 5' 부터 3' 순서의 연속적인 서열을 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브로서,
    (a) 대략 6 내지 30 뉴클레오티드 사이의 제 1 뉴클레오티드 서열(여기서 상기 제 1 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드는 분자에너지 전달쌍(molecular energy transfer pair)의 도너 모이어티 및 억셉터 모이어티로부터 선택된 제 1 모이어티로 표지화되며, 도너 모이어티는 여기(excited)되었을 때 하나 이상의 특정 파장에서 형광을 방출하고, 억셉터 모이어티는 상기 도너 모이어티로부터 방출된 상기 형광을 흡수 및/또는 소광시킨다);
    (b) 대략 3 내지 20 뉴클레오티드 사이를 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 제 2 단일-가닥 뉴클레오티드 서열;
    (c) 대략 6 내지 30 뉴클레오티드 사이를 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 제 3 뉴클레오티드 서열(여기서 상기 제 3 뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드는 상기 도너 모이어티 및 상기 억셉터 모이어티로부터 선택된 제 2 모이어티로 표지화되고, 상기 제 2 모이어티는 상기 제 1 뉴클레오티드 서열을 표지화하지 않는 상기 그룹의 일원(member)이며, 여기서 상기 제 3 뉴클레오티드 서열은 상기 제 1 뉴클레오티드 서열에 역순으로 상보적인 결과 듀플렉스(duplex)가 상기 제 1 뉴클레오티드 서열 및 상기 제 3 뉴클레오티드 서열 사이에 형성될 수 있으며, 그 결과 상기 제 1 모이어티 및 제 2 모이어티는 근접하게 되며, 그 결과 도너 모이어티가 여기되고 형광을 방출할 때 억셉터 모이어티는 상기 도너 모이어티에 의해 방출된 상기 형광을 흡수하고 소광시킨다); 및
    (d) 제 4 단일-가닥 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 61 또는 63 중 임의의 서열을 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 대략 8 내지 40 뉴클레오티드 사이를 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성되고(및 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자의 비메틸화된 DNA 부분을 포함하는 핵산 가닥에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 핵산 중합효소에 의해 최초 합성(prime synthesis)을 할 수 있는) 프라이머의 3' 말단에서의 제 4 단일-가닥 뉴클레오티드 서열;
    여기서, 상기 듀플렉스가 형성되지 않을 때, 상기 제 1 모이어티 및 상기 제 2 모이어티는 상기 제 1 및 제 2 모이어티 사이의 분자에너지 전달을 방해하는 거리에 의해 분리되는 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머를 포함하는 프라이머쌍.
  5. 제 4 항에 있어서,
    제 3 항에 따른 프라이머를 포함하는 프라이머쌍.
  6. 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 21 및 서열번호 22; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 25 및 서열번호 26; 서열번호 27 및 서열번호 28; 서열번호 29 및 서열번호 30; 서열번호 31 및 서열번호 32; 서열번호 33 및 서열번호 34; 서열번호 35 및 서열번호 36; 서열번호 37 및 서열번호 38; 서열번호 39 및 서열번호 40; 또는 서열번호 61 및 62의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 프라이머쌍.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 정의된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 또는 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 정의된 프라이머쌍을 포함하는 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 키트.
  8. 상기 유전자는 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자인, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 정의된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 또는 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 정의된 프라이머쌍 또는 제 7 항에 정의된 키트.
  9. (a) DNA-함유 샘플을, DNA에서 검출 가능한 변형된 잔기를 제공하기 위해 비메틸화된 시토신 잔기를 선택적으로 변형시키지만 메틸화된 시토신 잔기는 변형시키지 않는 시약과 접촉/처리하고,
    (b) 적어도 하나의 프라이머가 시약 처리 이후 오직 비메틸화된 DNA 서열에만 결합하도록 디자인된 적어도 하나의 프라이머쌍을 사용하여 관심의 비메틸화된 유전자의 적어도 일부를 증폭하는 것을 포함하여, DNA-함유 샘플에서 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자의 존재 및/또는 양을 검출하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    프라이머쌍에서 적어도 하나의 프라이머는 서열번호 1 내지 40 또는 서열번호 61 내지 63 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 또는 이들로 필수적으로 구성된 또는 이들로 구성된 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 3 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 또는 제 4 항 내지 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 프라이머쌍 또는 제 7 항 또는 제 8 항에 정의된 키트 또는 제 9 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 샘플에서 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자 중 적어도 하나의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하여, 샘플에서 비메틸화된 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME의 존재는 암 또는 암에 대한 소인의 지표인 암 또는 암에 대한 소인을 진단하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 또는 제 4 항 내지 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 프라이머쌍 또는 제 7 항 또는 제 8 항에 정의된 키트 또는 제 9 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 환자의 샘플에서 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 만약 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자가 비메틸화되었을 때 대상은 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 면역치료제를 이용한 치료를 위해 확인되고 및/또는 선택되는 것을 포함하는 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 면역치료제를 이용한 치료에 적합한 환자를 확인 및/또는 선택하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 3 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 또는 제 4 항 내지 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 프라이머쌍 또는 제 7 항 또는 제 8 항에 정의된 키트 또는 제 9 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 환자의 샘플에서 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 만약 유전자가 비메틸화되었을 때 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 면역치료제를 이용한 성공적인 치료의 가능성이 만약 유전자가 메틸화되었을 경우 보다 더 높은 암의 성공적인 치료의 가능성을 예측하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 3 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 또는 제 4 항 내지 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 프라이머쌍 또는 제 7 항 또는 제 8 항에 정의된 키트 또는 제 9 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 환자의 샘플에서 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 만약 유전자가 비메틸화되었을 때 치료를 위해 면역치료제가 선택되는 암에 대한 적합한 치료 식이요법(regimen)을 선택하는 방법.
  15. CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME을 포함하는 또는 인코딩하는 조성물의 투여를 포함하며, 대상은 치료를 위해 제 1 항 내지 제 3 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 또는 제 4 항 내지 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 프라이머쌍 또는 제 7 항 또는 제 8 항에 정의된 키트 또는 제 9 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용한 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자의 메틸화 상태 측정을 기초로 하여 선택되는 대상에서 암을 치료하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 3 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 또는 제 4 항 내지 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 프라이머쌍 또는 제 7 항 또는 제 8 항에 정의된 키트 또는 제 9 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자의 메틸화 상태를 측정하고, 이후 환자에게 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME를 포함하는 또는 인코딩하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 환자를 치료하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 3 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 또는 제 4 항 내지 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 프라이머쌍 또는 제 7 항 또는 제 8 항에 정의된 키트 또는 제 9 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 종양 조직에서 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자의 메틸화 상태를 측정하고, 이후 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME을 포함하는 또는 인코딩하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 종양 조직 제거 치료를 받은 환자의 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 발현 종양의 재발에 민감한 환자를 치료하는 방법.
  18. 환자는 치료를 위해 제 1 항 내지 제 3 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 또는 제 4 항 내지 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 프라이머쌍 또는 제 7 항 또는 제 8 항에 정의된 키트 또는 제 9 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용한 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자의 메틸화 상태 측정을 기초로 하여 선택되는 종양으로 고통 받는 환자를 치료하기 위한 약의 제조에서 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME을 포함하는 또는 인코딩하는 조성물의 용도.
  19. 환자는 치료를 위해 제 1 항 내지 제 3 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 또는 제 4 항 내지 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 프라이머쌍 또는 제 7 항 또는 제 8 항에 정의된 키트 또는 제 9 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용한 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 유전자의 메틸화 상태 측정을 기초로 하여 선택되는 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME 발현 종양의 재발에 민감한 환자를 치료하기 위한 약의 제조에서 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME을 포함하는 또는 인코딩하는 조성물의 용도.
  20. 제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME를 포함하는 조성물은 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME의 전장(full length), CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME의 실질적인 전장 또는 CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME의 단편, 예를 들어, CTAG1B, CTAG2, MageA3 및/또는 PRAME의 펩타이드를 포함하는 방법 또는 용도.
  21. 제 20 항에 있어서,
    CTAG1B는 157-167, 157-165 및 155-163 펩타이드로부터 선택되는 HLA-A2에 대한 결합부위를 포함하는 CTAG1B 전장의 단편인 방법 또는 용도.
  22. 제 20 항에 있어서,
    CTAG1B는 WO2008/089074에 개시된 A31, DR1, DR2, DR4, DR7, DP4, B35, B51, Cw3, Cw6 및 A2로부터 선택된 하나 이상의 MHC 클래스 1 또는 클래스 2 에피토프를 포함하는 CTAG1B 전장의 단편인 방법 또는 용도.
  23. 제 15 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTAG1B, CTAG2 및/또는 PRAME 단백질, 단편 또는 펩타이드는 융합 파트너 단백질(fusion partner protein)에 결합된 방법 또는 용도.
  24. 제 23 항에 있어서,
    융합 파트너 단백질은 그람-음성 박테리아인 헤모필루스 인플루엔자 B(Haemophilus influenza B)의 표면 단백질인 단백질 D 또는 이의 유도체인 방법 또는 용도.
  25. 제 23 항에 있어서, 융합 파트너 단백질은 178 잔기에서 시작하는 C 말단에서 발견된 또는 188-305 잔기를 포함하는 LytA 분자의 반복 부위를 포함하는 또는 이로 구성되는 LytA 또는 이의 유도체인 방법 또는 용도.
  26. 제 23항에 있어서,
    융합 파트너 단백질은 NS1(혈구응집소), 또는 NS1의 N 말단 81 아미노산을 포함하는 이들의 유도체인 방법 또는 용도.
  27. 제 15 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 CTAG1B, CTAG2 및/또는 PRAME 단백질, 단편 또는 펩타이드 또는 이들의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 방법 또는 용도.
  28. 제 27 항에 있어서,
    핵산 분자는 발현 벡터 내에 제공되는 방법 또는 용도.
  29. 제 15 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTAG1B, CTAG2 및/또는 PRAME 단백질, 단편 또는 펩타이드를 포함하는 조성물, 또는 핵산을 포함하는 조성물은 하나 이상의 보조제(adjuvant), 면역자극 사이토카인 및 케모카인을 추가로 포함하는 방법 또는 용도.
  30. 제 29 항에 있어서,
    보조제는 하나 이상의 모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A) 또는 이의 유도체, 사포닌 또는 이의 유도체 및 TLR9 길항제(antagonist)를 포함하는 방법 또는 용도.
  31. 제 30 항에 있어서,
    TLR9 효현제(agonist)는 CpG-함유 올리고뉴클레오티드인 방법 또는 용도.
  32. 제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    보조제는 콜레스테롤 및/또는 토코페롤을 선택적으로 포함하는 물-내-오일 에멀젼 또는 오일 내 물 에멀젼으로 제형화되거나 또는 리포좀 조성물로 제형화되는 방법 또는 용도.
  33. 제 9 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자는 MageA3 유전자이며, 샘플 또는 종양 조직은 미세바늘생검에 의해 채취되는 방법.
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