JP5705191B2 - Mage−a3マーカーの特異的検出のためのプライマーおよびプローブを含む癌の検出および診断の方法 - Google Patents
Mage−a3マーカーの特異的検出のためのプライマーおよびプローブを含む癌の検出および診断の方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5705191B2 JP5705191B2 JP2012245934A JP2012245934A JP5705191B2 JP 5705191 B2 JP5705191 B2 JP 5705191B2 JP 2012245934 A JP2012245934 A JP 2012245934A JP 2012245934 A JP2012245934 A JP 2012245934A JP 5705191 B2 JP5705191 B2 JP 5705191B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mage
- seq
- primer
- probe
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
遠隔転移のある悪性メラノーマを示す患者(American Joint Committee on Cancer (AJCC)の分類でステージIV)では、生存期間の中央値は1年であり、長期生存率は5%にすぎない。ステージIVのメラノーマに対する標準的な治療を行ってもわずか8〜25%の治療応答率であり、全生存には効果がない。局所転移のある患者(ステージIII)では生存期間の中央値は2〜3年であり、原発性及び局所転移を外科的に十分に制御しても長期生存の可能性は低い(Balchら, 1992 Semin. Surg. Oncol. 8(6):400-14)。ステージI〜IIIのメラノーマ患者の多くは、外科的に腫瘍が除去されているが、それらの患者で再発する危険性がかなりある。従って、メラノーマの進行を防ぎ、転移性メラノーマに対する治療レジメンおよび原発性腫瘍が除去されている患者のためアジュバント療法を改善することが必要なままである。
肺癌には以下の2つのタイプがある:非小細胞肺癌(NSCLC)および小細胞肺癌(SCLC)。これらの名称は単純に腫瘍内に見出される細胞のタイプを述べたものである。NSCLCには扁平上皮癌、腺癌、および大細胞癌が含まれ、肺癌の約80%を占める。NSCLCは治癒が困難で現在行われている治療はできる限りの延命と疾患症状の軽減を目的とする傾向がある。NSCLCは最も一般的な肺癌であり、予後は不良を伴う。全てのNSCLC患者のうちで約25%が診断時に局所疾患を有するが、外科的切除はまだ行いうる状態である(AJCC分類でステージIB、IIA、またはIIB)。しかし、それらの患者の50%超は、外科的に完全に切除を行ってから2年以内に再発する。従って、これらの患者に対して、より良い治療を提供するニーズがある。
細胞株および腫瘍サンプル内でのMAGE-A3遺伝子の発現を測定しようとこれまでに多数の方法が試みられてきた。半定量的RT-PCR(De Plaenら, 1994 Immunogenetics 40(5):360-9)、その他のPCRをベースとした技法、および低密度マイクロアレイが全て用いられてきた(Zammatteoら, 2002 Clinical Chemistry 48(1):25-34)。しかし、それらの研究の多くで、主な問題点は、偽陽性の原因となるMAGEファミリーメンバー間の非常に高い相同性であった。大規模なフェーズIIおよびIII試験のために、MAGE-A3発現性サンプルを特異的に同定し、かつサンプルを陽性と誤って評価する可能性を低減できる、定量的な高スループットのアッセイ法が望まれる。
a) 配列番号3および4;
b) 配列番号5および6;
c) 配列番号7および8;
d) 配列番号9および10;ならびに
e) 配列番号11および12。
(i) 1種の正方向プライマー;
(ii) 1種の逆方向プライマー;および
(iii) 1種のプローブ、
を含み、要素(i)、(ii)、および(iii)は、ストリンジェントな条件下でMAGE-A3の標的配列とハイブリダイズすることができ、(i)、(ii)または(iii)の標的配列のうちの少なくとも1つは、他の全てのMAGE Aヌクレオチド配列の等価な領域と比較して少なくとも1つのヌクレオチドが異なっており、かつMAGE-A3とMAGE-A6とを区別するために用いることができるキットが提供される。
(i) 1種の正方向プライマー;
(ii) 1種の逆方向プライマー;および
(iii) 1種のプローブ、
を含み、要素(i)、(ii)、および(iii)は、ストリンジェントな条件下でMAGE-A3の標的配列とハイブリダイズすることができ、(i)、(ii)または(iii)の標的配列のうちの少なくとも1つは、MAGE-A6ヌクレオチド配列の等価の領域と比較して少なくとも1つのヌクレオチドが異なっており、かつMAGE-A3とMAGE-A6とを区別するために用いることができるキットが提供される。
表1:半定量的MAGE RT-PCRに使用されるオリゴヌクレオチドプライマー。
本明細書で用いている「標的配列」という用語は、MAGE-A3核酸配列(DNAまたはRNAのいずれか、例えばゲノムDNA、メッセンジャーRNA、またはそれらの増幅型)の1領域であって、これに対してプローブまたはプライマーの配列が部分的な(すなわちある程度のミスマッチがある)または完全な同一性を有している領域である。なお逆方向プライマーは、それが認識する配列の逆相補体(または、上記と同様に、ある程度のミスマッチがある)である。標的配列は通常は、もう一つ別のまたは他の全てのMAGE-Aヌクレオチド配列と比較して少なくとも1個のヌクレオチドが異なるMAGE-A3配列の1領域を指す。しかし、本発明のいくつかの実施形態において、1種以上のプライマーおよびプローブについて、使用される少なくとも1種または2種のプライマーおよびプローブが、区別されるべき遺伝子間で異なる標的配列を認識する場合には、標的配列がMAGE-Aヌクレオチド配列間で同一でもよい。
(i) 2種のプライマーのうちの1つまたはプローブの標的配列は、MAGE-A3およびMAGE-A6間で1個のヌクレオチドが異なる;
(ii) 上記(i)で言及していないプライマーまたはプローブの標的配列は、MAGE-A3およびMAGE-A6間で1個のヌクレオチドが異なる;
(iii) 残りのプライマーまたはプローブの標的配列は、MAGE-A3およびMAGE-A6の双方と同一である。
(i) プライマーAの標的配列は、MAGE-A3およびMAGE-A6間で1個のヌクレオチドが異なる;
(ii) プライマーBの標的配列は、MAGE-A3およびMAGE-A6間で2個のヌクレオチドが異なる;
(iii) プローブCの標的配列はMAGE-A3およびMAGE-A6の双方と同一である。
(i) プライマーAの標的配列は、MAGE-A3およびMAGE-A6間で2個のヌクレオチドが異なる;
(ii) プライマーBの標的配列は、MAGE-A3およびMAGE-A6の双方と同一である;
(iii) プローブCの標的配列は、MAGE-A3およびMAGE-A6間で1個のヌクレオチドが異なる。
(i) プライマーAの標的配列は、MAGE-A3およびMAGE-A6の双方と同一である;
(ii) プライマーBの標的配列は、MAGE-A3およびMAGE-A6間で1個のヌクレオチドが異なる;
(iii) プローブCの標的配列は、MAGE-A3およびMAGE-A6間で2個のヌクレオチドが異なる。
a) 配列番号3および4を含んでいるプライマーのペア;ならびに配列番号13を含んでいるプローブ;
b) 配列番号3および4を含んでいるプライマーのペア;ならびに配列番号17を含んでいるプローブ;
c) 配列番号3および4を含んでいるプライマーのペア;ならびに配列番号53を含んでいるプローブ;
d) 配列番号3および4を含んでいるプライマーのペア;ならびに配列番号54を含んでいるプローブ;
e) 配列番号5および6を含んでいるプライマーのペア;ならびに配列番号14を含んでいるプローブ;
f) 配列番号7および8を含んでいるプライマーのペア;ならびに配列番号15を含んでいるプローブ;
g) 配列番号9および10を含んでいるプライマーのペア;ならびに配列番号16を含んでいるプローブ;
h) 配列番号11および12を含んでいるプライマーのペア;ならびに配列番号17を含んでいるプローブ;
i) 配列番号11および12を含んでいるプライマーのペア;ならびに配列番号53を含んでいるプローブ;ならびに/または、
j) 配列番号11および12を含んでいるプライマーのペア;ならびに配列番号54を含んでいるプローブ。
a) 配列番号7および8を含んでいるプライマーのペア、ならびに配列番号15を含んでいるプローブ;
b) 配列番号9および10を含んでいるプライマーのペア、ならびに配列番号16を含んでいるプローブ;
c) 配列番号11および12を含んでいるプライマーのペア、ならびに配列番号17を含んでいるプローブ;
d) 配列番号11および12を含んでいるプライマーのペア、ならびに配列番号53を含んでいるプローブ;ならびに/または、
e) 配列番号11および12を含んでいるプライマーのペア、ならびに配列番号54を含んでいるプローブ。
本発明の患者を治療する方法における使用に適した組成物は、MAGE-A3特異的免疫応答を生じさせることのできるものである。この組成物は、MAGE-A3遺伝子産物由来の少なくとも1つのエピトープを含んでいる。そのようなエピトープは、任意に担体と共有結合で連結したペプチド抗原として存在することができる。あるいはまた、より大きなタンパク質断片を用いることができる。しかし、用いる断片およびペプチドは、適切に存在する際に、MAGE-A3に対する免疫応答、例えばMAGE-A3特異的免疫応答を生じさせることができるものとする。
i) 18残基のシグナル配列、および加工されたプロテインDの最初の109残基(このシグナル配列は製造の間に融合タンパク質から切断され、前記最初の109残基から離される);
ii) 2つの無関係の残基(メチオニンおよびアスパラギン酸);
iii) 天然のMAGE-3タンパク質の3〜314残基;
iv) ヒンジ領域として機能する2個のグリシン残基;
v) 7個のヒスチジン残基、
を含む。
NS1-MAGE3、およびヒスチジンテイルの融合タンパク質、例えば図10および11に示される(配列番号37および配列番号38);CLYTA-MAGE3-ヒスチジンの融合タンパク質、例えば図12および13に示される(配列番号39および配列番号40)。
プライマー:配列番号1および配列番号2
RNA抽出:液体窒素RNA精製法
組織の小片を液体窒素中で瞬間冷凍した後、乳鉢中に置き、乳棒で機械的に破砕した。得られた粉末100 mgを100μLのTriPure単離試薬に添加し、RNAを製品説明書(Qiagen, Venlo, Netherlands)に従って抽出した。RNA濃度は260 nmの光学密度値から決定した。
半定量的RT-PCRはDe Plaenら(Immunogenetics 40:360, 1994)が記載しているとおりに行った。cDNAの合成は、1x第1鎖バッファー、0.5 mMの各dNTP、10 mMのジチオトレイトール、20UのrRNase阻害剤、2μMのオリゴ(dT)15、および200 UのM-MLV逆転写酵素を含有する20μLの混合液中、42℃で1時間30分かけて、2μgの総RNAから行った。50 ngのcDNAを、MAGE-A3特異的プライマー(配列番号1および2)を含有している25μLの混合液中でPCRにより増幅した。各反応液の10μLのアリコートを1%アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド蛍光で可視化した。アンプリコンのサイズは、mRNAとゲノムDNA(gDNA)とをそれぞれ増幅した場合に、725 bpと805 bpであった。
これらの実験には3種類の陽性対照を導入した:
(i) MAGE-A3ゲノムDNAのクローニング断片を各PCR反応混液中に添加した。これによって805 bpの断片(cDNAから作製した断片よりも80 bp大きい)が作製され、PCR阻害の非存在下では常に存在する。これはMAGE-A3陰性サンプルでPCRの効率をチェックするための陽性対照となる;
(ii) 各MAGE-A3アッセイのために、腫瘍サンプル、および「Gerl」メラノーマ細胞株MZ-2-3.0から抽出したRNAについて、cDNA合成を並行して行った。「陽性」とみなされるためには、腫瘍サンプルがGerl細胞株MZ-2-3.0 cDNAのレベルの1%のシグナルを産出する必要がある;
(iii) 強く分解したRNAを含むサンプルを検出するために、各サンプルでβ-アクチンPCR(表1)を行った。MAGE-A3陰性腫瘍サンプルから生じたβ-アクチンシグナルがMZ-2-3.0から生じたシグナルよりも弱い場合には、サイクル数を臨床サンプルについて調整し、β-アクチンアンプリコンの強度が必要とするレベルに達するようにした。
これらの実験には3種類の陰性対照を導入した:
(i) MAGE-A3陰性であることが既知の細胞培養LB 23-1/2から抽出したRNA;
(ii) RT反応における水対照;および
(iii) PCRステップにおける水対照。
腫瘍サンプルからの50 ngのmRNAサンプルは、725bpのアンプリコンの量がGerl細胞株MZ-2-3.0からの0.5 ngのRNA(すなわち、0.1%のGerl RNAと等価;陽性対照を参照)を用いて得られたアンプリコンの量と等しいかまたはそれより多い場合に、MAGE-A3陽性とみなした。量はエチジウムブロマイドの蛍光で推定した。陽性対照と陰性対照を加えた。
リアルタイムTaqMan定量的RT-PCR
プライマー:配列番号3および配列番号4;プローブ:配列番号13(エクソン)
プライマー:配列番号5および配列番号6;プローブ:配列番号14(イントロン)
半定量的PCR(比較研究用)
プライマー:配列番号1および配列番号2
材料と方法
患者およびサンプルの採取
ステージIBおよびIIの非小細胞肺癌(NSCLC)からの生検材料は手術によって得た。患者は2種の臨床試験GSK 249553/004(MAGE3-AS02B-004)およびEpidemio-MAGE3-153に登録していた。患者はインフォームドコンセントに署名し、これらの研究の性質と起こりうる結果についての説明を受けた。生検材料は外科的切除直後にRNA安定化溶液(RNA-later, Ambion, Cambridge, UK)中に浸漬し、−20℃で保存した。RNAlaterは無傷の非凍結組織サンプル中の細胞RNAを安定化しかつ保護する組織保存用試薬である。RNAlaterにより、サンプルを液体窒素中で直ちに凍結する必要性が排除される。
腫瘍組織をRNALaterから取り出し、TriPure Isolation Reagent(Roche, Vilvoorde, Belgium)に添加する。次いで、この組織をタングステンボールの入っているミキサーミルに添加する。ミキサーミル中で破壊した後、最大で100 mgの組織から、TriPure試薬を製造者の使用説明書(Qiagen, Venlo, Netherlands)に従って用いて総細胞RNAを抽出した。RNA濃度は260 nmでの光学密度値から決定した。
総RNAの50 ngに相当するcDNAを、TaqMan バッファー、5 mM MgCl2、0.4 mM dUTP、0.2mMの各ヌクレオチド、0.625 UのAmpli Taq Cold DNAポリメラーゼ、0.05 UのUNG、0.2μMの各オリゴヌクレオチドプライマー、および0.2 μMのTaqManプローブを含有する25μLの混合液中、PCRで増幅した。特異的なオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを用いた(表2;配列番号3、4、および13、ならびに配列番号5、6、および14)。プローブはFAMTM、NEDTM、およびVICTM(Applied Biosystems, CA, USA)で標識されており、Minor Groove Binding Moiety(MGBTM;これもApplied Biosystems, CA, USAから入手)を有している。現在さらに、MAGE特異的プローブ用にNEDの替わりにFAM色素を用いて実験を行っているところである。
プライマー:配列番号3および配列番号4;プローブ:配列番号13(エクソン)−TaqMan RT-PCR。
プラスミドおよび細胞株
用いたプラスミドは、MAGE-A1(MAGE-1;GenbankアクセッションNM 004988)、MAGE-A2(MAGE-2;GenbankアクセッションL 18920)、MAGE-A3(MAGE-A3;GenbankアクセッションNM 005362)、MAGE-A4(MAGE-4;GenbankアクセッションNM 002362)、MAGE-A6(MAGE-6;GenbankアクセッションNM 005363)、MAGE-A8(MAGE-8;GenbankアクセッションNM 005364)、MAGE-A9(MAGE-9;GenbankアクセッションNM 005365)、MAGE-A10(MAGE-10;GenbankアクセッションNM 021048)、MAGE-A11(MAGE-11;GenbankアクセッションNM 005366)、およびMAGE-A12(MAGE-A12;GenbankアクセッションNM 005367)の遺伝子の完全長cDNAを含んだ。細胞株MZ-2-3.0(MAGE-A3陽性)およびLB 23-1/2(MAGE-A3陰性)はProfessor Thierry Boon(Ludwig institute、Brussels, Belgium)から好意により贈与されたものである。
2 x 2分割表を作って、半定量的RT-PCR(プライマーは配列番号1および配列番号2)およびリアルタイム定量的TaqMan PCR(プライマー:配列番号3および配列番号4;プローブ:配列番号13)からの結果を、本明細書に記載の技法を用いて比較した(表3)。名目尺度変数は2種の評価:陽性および陰性を特徴付けた。陰性値はゼロおよびボーダーライン評価を含んだ。なお、ボーダーライン評価は、半定量的RT-PCRでは0.8%〜1.2%のGerl、TaqManアッセイでは全ての結果が1%未満である評価を意味する。陽性値は、半定量的RT-PCR法については、β-アクチン発現との関連で視覚的にスコア付けしたゲルバンドに基づいて等級分けし、TaqManアッセイでは>1%の結果全てを含んだ。2つの方法間での一致度は、二重陰性+二重陽性サンプルの数をサンプルの総数で割って算出した。McNemar検定を用いて不一致ペア(陰性-陽性)の比率を比較した。信頼区間(CI)を算出した。
Sybr greenを用いたMAGE-A3のTaqMan RT-PCR
Sybr greenは、配列特異的なプローブなしでアンプリコンと非選択的に結合するコンポーネントである。リアルタイムRT-PCRはMAGE-Aファミリーの遺伝子クローンについて、4種類の異なるMAGE-Aクローンの希釈度(20 pg、2 pg、0.2 pg、および0.02 pg)を用いて行った(図1、結果はY軸上に1/Ctとして示している)。14CtでMAGE-A3について陽性の結果が得られ、MAGE-A6については(20 pgのプラスミドで)16Ctの値が得られた。MAGE A4、A8およびA9は30のCtレベルを示し、その他のMAGE遺伝子は35Ct以上で非常に制限された発現を示した。
同一のMAGE-A3プライマー(配列番号3および4)とプローブ(配列番号13)とを用い、MAGE-Aファミリーメンバーの関連クローンを種々の希釈度で用いて、MAGE-A3をMAGE-A6と区別する有効性を試験した(図2)。最初に、MAGE-A3のCtは各希釈度において予想したとおりの減少を示した。MAGE-A6クローンは、プローブを用いた際には高い1/Ctを示さず、これは交差反応性がないことを示している。
腫瘍のMAGE-A3発現、半定量的方法と定量的方法との比較
TaqMan特異的定量的PCRを、MAGE-A3についての標準的な半定量的RT-PCRに対して(プライマーとして配列番号1および2を用いて)さらに検証した。NSCLC患者からの71腫瘍サンプルを用いて、MAGE-A3発現について定量的方法(プライマーとして配列番号3および4、プローブとして配列番号13を用いた)と、半定量的方法(プライマーとして配列番号1および2を用いた)とを直接比較した。
材料と方法
RNAは、FFPEサンプルから、US 6,613,518、US 6,610,488、US 6,428,963、US 6,248,535(参照により本明細書に組入れる)に開示されるように、Response Genetics Inc.,独自の方法を用いて抽出した。あるいはRNAは、パラフィンで固定化した組織から、公表されている適切な方法のいずれかに従って得ることができる。例えば、d-リモネンまたは別の溶解バッファーを用いて組織切片をパラフィンから取り出した後、エタノールをベースとした溶液中で洗うことができる。次いで、その切片をプロテイナーゼKで一晩処理した後、洗浄し、RNAをカラムクロマトグラフィーで精製することができる。そのサンプルについて、プライマーとして配列番号3および配列番号4、プローブとして配列番号13(凍結組織での使用のために開発されたプライマーおよびプローブ、上述の実施例2参照)を用いて、リアルタイムTaqMan RT-PCRを行った。
表4はホルマリンで固定化し、パラフィン包埋した(FFPE)組織についての結果をCt値として表したものである。Y軸の数値はヒト腫瘍サンプル990118〜990784を示している。また、この分析には次の陽性対照も含まれている:TC1(Mage3);Gerl(MAGE-A3メラノーマ細胞株);およびCRL 1675(メラノーマ細胞株)。Ct値は凍結組織をベースとした半定量的RT-PCR MAGE-A3プライマーでの期待値よりも高い。36〜37 Ctのレベルは、これらの実験の目的では感度の上限値と考えられる。Gerl MAGE-A3陽性対照は31Ctの値であり、感度の境界内にあるが、半定量的RT-PCRアッセイの場合よりもはるかに低減している。これらのレベルでは、凍結組織でのMAGE-A3定量用のプライマーおよびプローブ(表2、エクソン3 MAGE-A3特異的プライマーである配列番号3および配列番号4;ならびにプローブの配列番号13)は、FFPE腫瘍サンプル内のMAGE-A3の発現を検出するのに十分な感度ではない可能性があり、MAGE-A3陽性であるがMAGE-A3を低いレベルでのみ発現するサンプルは、検出されない可能性がある。
凍結組織のRNALaterをベースとしたMAGE-A3アッセイ(実施例2で記載される)についてのアンプリコンの大きさは1000 bpを超える。FFPEサンプル中に見られる分解したRNAについてより感度の高い結果を得るために、アンプリコンのサイズを低減してMAGE-A3アッセイの感度を増加するための新しいプライマーを設計した(表5)。実施例2および3に記載した2つのアッセイの双方のために、MGBTM(Minor Groove Binding)プローブを用いてアッセイの特異性を増加させた。MGBプローブは、極めて安定な二本鎖を形成するDNAの副溝(minor groove)に結合してプライマー特異性の増加をもたらす。
新たに設計されたプライマーのセット(表5)をMAGE-A遺伝子ファミリーメンバーのcDNAで試験した(表6a)。ここで、セット1はプライマー:配列番号7、配列番号8、プローブ:配列番号15であり;セット2はプライマー:配列番号9、配列番号10、プローブ:配列番号16であり;セット3はプライマー:配列番号11、配列番号12、プローブ:配列番号17であり;そしてセット4はプライマー:配列番号3、配列番号4、プローブ:配列番号13である。
FFPEの腫瘍サンプル42検体を、プライマー配列番号9、配列番号10、およびプローブ配列番号16を用いて比較し、凍結組織では同一アッセイをプライマー配列番号3、配列番号、配列番号4、プローブ配列番号13を用いて行った(図7)。このアッセイで陽性とするレベルは1% Gerl(陽性対照)で設定し、直接的に比較すると2種類のアッセイ間にいくらかの一致があるようである。MAGE-A3凍結組織アッセイとは一致しなかったMAGE-A3陽性患者が数例あり、これは、MAGE-A3を発現する腫瘍細胞の純度の増加の原因となる腫瘍領域を大きく切除したことによって説明できた。陽性MAGE-A3結果である0.92のAn R2値(線形相関についての統計的検定)の原因となった希釈正常細胞の大部分の除去がFFPE組織とRNA later凍結組織間で示され、これは2種の方法間での相関が良好であることを示唆している(図8)。
MAGE-A3およびβ-アクチンのCt値はTest Definition File中に定義されているアッセイパラメーターに基づいて、COBASTM TaqMan 48 Analyzerワークステーション(Roche, CA, USA)で、AMPLILINKTM 3.1ソフトウェア(Roche, CA, USA)を用いて算出する。遺伝子発現についてのデータ分析は、AMPLILINKTMからMAGE-A3およびβ-アクチンのCt値を抽出した後、β-アクチン遺伝子発現に比較したMAGE-A3遺伝子発現を計算して求める。各Runに関し、サンプルがMAGE-A3陽性であるために合致または超えなければならないMAGE-A3発現の閾値を確立するために、対照を含める。陽性対照として細胞株GERLからのRNAを用いる。GERL RNAは水で1:100(1% GERL)に希釈し、MAGE-A3のCtを測定する。さらに、希釈していないGERL RNA(100% GERL)をβ-アクチンのCt測定のために未希釈で用いる。100% GERL(対照)からのβ-アクチンのCtの値と、1% GERL(対照)からのMAGE-A3のCtの値との差から、ΔCt値を計算し、下記の式に基づいてMAGE-A3の相対的発現を測定する:
プラスミド、p53陽性対照DNA、臨床FFPET RNA、UHR、GERL、およびSTACを含むRNAおよびDNAは全て−80℃で保存する。Universal RNA Master Mix、プライマー/プローブミックス、補因子ブレンド、およびサンプル希釈/陰性対照を含む全試験試薬は、2〜8℃で保存する。
MAGE-Aファミリーメンバーを含んでいるDNAプラスミドを用いたプライマーおよびプローブの実験
目的:他の関連遺伝子の顕著な同時増幅/検出を排除しながらMAGE-A3遺伝子を特異的に増殖する試験の能力を判定すること。
本明細書の表および図では、数箇所で「CURIE」という用語が「MAGE」の代わりに用いられているが、全ての場合において「MAGE」を意図している。
目的:試験の線形性および逆転写効率を判定すること。
アッセイの線形範囲は下記の基準に基づいて決定した:
MAGE-A3 Ct CV<5%
β-アクチンCt CV<5%
ΔCt CV<20%
-0.10<ΔCtの傾き<0.10
R2>0.95
RT-PCR効率の判定基準:
MAGE-A3 RT-PCR増幅効率>80%
β-アクチン RT-PCR増幅効率>80%
MAGE-A3とβ-アクチンとの間のRT-PCR増幅効率の差は10%以内
線形性/RT-PCR効率の結果
図20はRNAインプットの対数(2を底とする)vs MAGE-A3およびβ-アクチンのCt値のグラフを示している。COBAS TaqMan MAGE-A3試験は、R2値に基づくQIAGEN法を用いてFFPE異種移植片から抽出した100〜0.1 ngのGERL RNAのインプット値間で線形である。R2値はMAGE-A3については0.983、β-アクチンについては0.998であった。これらの値はR2>0.95の基準を超えている。さらに、表17に示すとおり、各レベルで試験した10回の反復実施全てについて、MAGE-A3 Ctおよびβ-アクチン Ctは両者ともにCV<5%の基準を下回った。
目的:MAGE-A3遺伝子発現がCOBASTM TaqMan MAGE-A3試験によってその時点の少なくとも95%で検出できる最低濃度のRNAを確立すること。
ヒット率は、本実施例に記載した線形性実験に基づいて、このアッセイの線形範囲内のCt値として定義する。Ct範囲の末端を求めるために、線形性の研究からの0.39ngのRNAインプットレベル(線形範囲の末端)から、MAGE-A3およびβ-アクチンのCtの平均をとり、MAGE-A3およびβ-アクチンのCtについて95%信頼限界を計算した。これらの計算に基づけば、ヒットとみなすサンプルについては、MAGE-A3 Ctは35.2以下でなければならず、β-アクチン Ctは32.1未満でなければならない。MAGE-A3およびβ-アクチンのヒット率を表23および表25に示している。MAGE-A3およびβ-アクチンについてのヒット率%は表24および表26に示している。
目的:COBASTM TaqMan MAGE-A3試験および臨床FFPETサンプルについてのプロトタイプアッセイ(Prototype Assay)を相関させ、クロスバリデートすること。
比較一致度による陰性=正確にMAGE-A3非発現体であるサンプル数/試験サンプル数*100
判定基準:
比較一致度による陽性>85%
比較一致度による陰性>85%
NSCLC臨床試験からの臨床検体のクロスバリデーションを行って、COBAS TaqMan MAGE-A3試験の比較一致%による陽性および陰性を評価した。これらの研究では、比較としてMAGE-A3プロトタイプRT-PCRアッセイを用いた。結果に不一致が見られた場合には、新鮮な凍結組織(手動で微細切断していない)として同一サンプルから得た以前の結果を、不一致の結果の解消のために用いることとしていた。
RNAサンプルは131のNSCLC FFPE臨床検体から抽出した。RGIのRT対照反応に基づいて、7サンプルが25%を超えるゲノムDNAの夾雑が認められた。これらのサンプルは比較一致度の算出による陽性および陰性から除外した。さらに、COBASアッセイからは6件の不確定結果、プロトタイプアッセイからは15件の不確定結果があり、その際、サンプルはこのアッセイの線形範囲外のβ-アクチンCtに基づいて十分な材料を有していなかったか、またはサンプルのMAGE-A3発現が閾値を超えていたが、MAGE-A3のCt値は線形範囲外であった。その結果、COBASアッセイからは117件の結果、およびプロトタイプアッセイからは108件の結果が、2つの異なる試験を比較するためのクロスバリデーションに用いうるデータと共に得られた(表32)。COBASアッセイとプロトタイプアッセイとの間の総合的な一致は98/107、すなわち91.6%であった(表33)。プロトタイプアッセイを「ゴールドスタンダード」として用いたCOBAS試験の比較一致度による陽性は59/64または92.2%であり、比較一致度による陰性は39/43または90.7%であった(表33)。COBASアッセイとプロトタイプアッセイの結果が不一致であった場合には、凍結組織サンプルによって得られた結果を不一致の解消に用いた(表34)。
実験対照のMAGE遺伝子Ctは表30に示している。実験対照のβ-アクチン遺伝子Ctは表31に示している。対照のCtは有効範囲内である。実験はバリデーションを通過した。
目的:複数の試薬ロットおよび複数の装置を用いて複数日間、複数のオペレーターにより作成されたデータセットにわたる試験の再現性および頑健性を立証する。
MAGE-A3発現閾値は、ある患者がMAGE-A3特異的免疫療法を受けるか否かを決定する、MAGE-A3発現のカットオフレベルである。その閾値以上のMAGE-A3発現のある患者は、MAGE-A3陽性コールであり、治療を受けることとなる。その閾値未満のMAGE-A3発現のある患者は、MAGE-A3陰性コールであり、治療は受けないこととなる。試験の再現性の研究は、各検体について下記の式を用いたMAGE-A3発現コールに基づいたものである:
Claims (7)
- 次のペアのプライマー、すなわち配列番号11の配列からなるプライマーおよび配列番号12の配列からなるプライマーのセット。
- (i) 配列番号11の配列からなるプライマー;
(ii) 配列番号12の配列からなるプライマー;および
(iii) 5'末端に6-カルボキシフルオレセインを有し、3'末端に非蛍光性のクエンチャーを有する配列番号17の配列からなるプローブ、
を含むキット。 - (i) 配列番号11の配列からなるプライマー、
(ii) 配列番号12の配列からなるプライマー、および
(iii) 次の配列 5'-ELFLLLFFLQGLGALFLLFAGFAAAGFLLFP-3' からなるプローブ、
[配列中、E= FAMレポーター色素、F= 5-メチルdC, Q = BHQ2クエンチャー, L = 5-プロピニルdU, P= リン酸, I = HEXレポーターである]
を含むキット。 - ホルマリンで固定化し、パラフィン包埋した(FFPE)腫瘍組織サンプルから得られたまたは該サンプルに由来する単離されたヌクレオチド配列と、配列番号11の配列からなるプライマー及び配列番号12の配列からなるプライマーのセット並びに
(a) 5'末端に蛍光レポーター色素を有し、3'末端に非蛍光性のクエンチャーを有する配列番号17のヌクレオチド配列、または
(b) 次の配列、すなわち5'-ELFLLLFFLQGLGALFLLFAGFAAAGFLLFP-3'
[配列中、E= FAMレポーター色素、F= 5-メチルdC, Q = BHQ2クエンチャー, L = 5-プロピニルdU, P= リン酸, I = HEXレポーターである]
からなるプローブとを接触させるステップを含む、ホルマリンで固定化し、パラフィン包埋した(FFPE)MAGE-A3腫瘍組織の存在または不在を決定する方法。 - ヌクレオチド配列を増幅するステップ、および前記サンプル中の増幅されたヌクレオチド配列を検出するステップをさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 前記単離されたヌクレオチド配列が、ストリンジェントな条件下で少なくとも1種のプライマーまたはプローブとハイブリダイズし、それによって腫瘍組織がMAGE-A3陽性であるかを検出するステップをさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列が少なくとも1種のプライマーまたはプローブとハイブリダイズするかを検出するために、in situハイブリダイゼーションを用いるステップをさらに含む、請求項6に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0612342.6A GB0612342D0 (en) | 2006-06-21 | 2006-06-21 | Method |
GB0612342.6 | 2006-06-21 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009515886A Division JP2009540812A (ja) | 2006-06-21 | 2007-06-21 | Mage−a3マーカーの特異的検出のためのプライマーおよびプローブを含む癌の検出および診断の方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013046630A JP2013046630A (ja) | 2013-03-07 |
JP5705191B2 true JP5705191B2 (ja) | 2015-04-22 |
Family
ID=36803668
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009515886A Pending JP2009540812A (ja) | 2006-06-21 | 2007-06-21 | Mage−a3マーカーの特異的検出のためのプライマーおよびプローブを含む癌の検出および診断の方法 |
JP2012245934A Expired - Fee Related JP5705191B2 (ja) | 2006-06-21 | 2012-11-08 | Mage−a3マーカーの特異的検出のためのプライマーおよびプローブを含む癌の検出および診断の方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009515886A Pending JP2009540812A (ja) | 2006-06-21 | 2007-06-21 | Mage−a3マーカーの特異的検出のためのプライマーおよびプローブを含む癌の検出および診断の方法 |
Country Status (28)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8936919B2 (ja) |
EP (1) | EP2041308B1 (ja) |
JP (2) | JP2009540812A (ja) |
KR (1) | KR101455589B1 (ja) |
CN (1) | CN101506383B (ja) |
AU (1) | AU2007263019B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0713599A2 (ja) |
CA (1) | CA2656909A1 (ja) |
CO (1) | CO6140072A2 (ja) |
CY (1) | CY1113290T1 (ja) |
DK (1) | DK2041308T3 (ja) |
EA (1) | EA016347B1 (ja) |
ES (1) | ES2389513T3 (ja) |
GB (1) | GB0612342D0 (ja) |
HK (1) | HK1127627A1 (ja) |
HR (1) | HRP20120761T1 (ja) |
IL (1) | IL195975A (ja) |
MA (1) | MA30565B1 (ja) |
MX (1) | MX2008016493A (ja) |
MY (1) | MY147511A (ja) |
NO (1) | NO20085290L (ja) |
NZ (1) | NZ573809A (ja) |
PL (1) | PL2041308T3 (ja) |
PT (1) | PT2041308E (ja) |
SI (1) | SI2041308T1 (ja) |
UA (1) | UA95956C2 (ja) |
WO (1) | WO2007147876A2 (ja) |
ZA (1) | ZA200810695B (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101932723B (zh) | 2007-09-17 | 2014-09-10 | 肿瘤甲基化科学公司 | 改进的对mage-a表达的检测 |
JP5883443B2 (ja) * | 2010-07-22 | 2016-03-15 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 新規の抗原結合タンパク質 |
CN102251033B (zh) * | 2011-07-05 | 2013-03-20 | 北京大学人民医院 | 基于mage-a3基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试剂盒 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5612201A (en) * | 1991-05-23 | 1997-03-18 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules useful in determining expression of a tumor rejection antigen precursor |
EP0656788B1 (en) * | 1992-08-07 | 2006-10-18 | Pharmexa Inc. | Hla binding peptides and their uses |
CA2184482A1 (en) * | 1994-03-01 | 1995-09-08 | Etienne De Plaen | Determination of cancerous conditions by mage gene expression |
US5985571A (en) * | 1998-02-04 | 1999-11-16 | Ludwig Institute For Cancer Research | Method for determining multiple myeloma by assaying for expression of mage genes |
DK1659179T3 (da) * | 1998-02-05 | 2011-10-10 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Tumor-associerede antigenderivater fra MAGE-familien og nucleinsyresekvenser kodende for dem anvendt til fremstilling af fusionsproteiner og sammensætninger til vaccination |
AU5992999A (en) | 1998-10-02 | 2000-04-26 | Ludwig Institute For Cancer Research | Tumor antigens and ctl clones isolated by a novel procedure |
JP3603138B2 (ja) * | 2000-02-18 | 2004-12-22 | 独立行政法人理化学研究所 | 細胞死抑制タンパク質 |
US6358679B1 (en) * | 2000-08-24 | 2002-03-19 | Pe Corporation (Ny) | Methods for external controls for nucleic acid amplification |
US6635425B2 (en) * | 2001-01-05 | 2003-10-21 | Molecular Staging, Inc. | 5′-thio phosphate directed ligation of oligonucleotides and use in detection of single nucleotide polymorphisms |
JP2005515192A (ja) * | 2001-11-29 | 2005-05-26 | ダンドリット バイオテック アクティーゼルスカブ | ヒト又は動物において免疫応答を誘導するための医薬組成物 |
EP1560931B1 (en) | 2002-11-14 | 2011-07-27 | Dharmacon, Inc. | Functional and hyperfunctional sirna |
DK1572105T3 (da) * | 2002-11-14 | 2011-10-17 | Wayne John Cancer Inst | Detektion af mikrometastase af melamoner og brystcancer i paraffinindlejret tumor drænende lymfeknuder ved hjælp af kvantitativ multimaker RT-PCR |
GB0409940D0 (en) * | 2004-05-04 | 2004-06-09 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
US20070231822A1 (en) * | 2006-02-28 | 2007-10-04 | Michael Mitas | Methods for the detection and treatment of cancer |
-
2006
- 2006-06-21 GB GBGB0612342.6A patent/GB0612342D0/en not_active Ceased
-
2007
- 2007-06-21 CA CA002656909A patent/CA2656909A1/en not_active Abandoned
- 2007-06-21 EP EP07786793A patent/EP2041308B1/en active Active
- 2007-06-21 PT PT07786793T patent/PT2041308E/pt unknown
- 2007-06-21 UA UAA200814634A patent/UA95956C2/uk unknown
- 2007-06-21 DK DK07786793.5T patent/DK2041308T3/da active
- 2007-06-21 SI SI200731011T patent/SI2041308T1/sl unknown
- 2007-06-21 EA EA200802356A patent/EA016347B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2007-06-21 ES ES07786793T patent/ES2389513T3/es active Active
- 2007-06-21 BR BRPI0713599-8A patent/BRPI0713599A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-06-21 JP JP2009515886A patent/JP2009540812A/ja active Pending
- 2007-06-21 US US12/305,742 patent/US8936919B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-06-21 MY MYPI20085210A patent/MY147511A/en unknown
- 2007-06-21 WO PCT/EP2007/056219 patent/WO2007147876A2/en active Application Filing
- 2007-06-21 CN CN2007800309371A patent/CN101506383B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2007-06-21 AU AU2007263019A patent/AU2007263019B2/en not_active Ceased
- 2007-06-21 KR KR1020097001326A patent/KR101455589B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2007-06-21 PL PL07786793T patent/PL2041308T3/pl unknown
- 2007-06-21 NZ NZ573809A patent/NZ573809A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-06-21 MX MX2008016493A patent/MX2008016493A/es active IP Right Grant
-
2008
- 2008-12-16 IL IL195975A patent/IL195975A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-12-18 NO NO20085290A patent/NO20085290L/no not_active Application Discontinuation
- 2008-12-18 ZA ZA2008/10695A patent/ZA200810695B/en unknown
- 2008-12-19 MA MA31490A patent/MA30565B1/fr unknown
- 2008-12-24 CO CO08136749A patent/CO6140072A2/es unknown
-
2009
- 2009-07-20 HK HK09106609.1A patent/HK1127627A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-09-26 HR HRP20120761TT patent/HRP20120761T1/hr unknown
- 2012-10-02 CY CY20121100908T patent/CY1113290T1/el unknown
- 2012-11-08 JP JP2012245934A patent/JP5705191B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2019229353B2 (en) | Mutant calreticulin for the diagnosis of myeloid malignancies | |
CN101932723B (zh) | 改进的对mage-a表达的检测 | |
KR20120002534A (ko) | 유전자 발현의 향상된 검출 | |
JP5705191B2 (ja) | Mage−a3マーカーの特異的検出のためのプライマーおよびプローブを含む癌の検出および診断の方法 | |
JP2004532629A (ja) | 癌・精巣抗原 | |
JP2014527411A (ja) | 癌におけるprame遺伝子発現の検出 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140422 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140722 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150203 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150224 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5705191 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |