KR101455589B1 - Ｍａｇｅ-ａ3-마커의 특이적 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 포함하는 암의 검출 및 진단을 위한 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 진단 키트 및 방법에 사용하기 위한 MAGE-A3 특이적 프라이머 및 프로브에 관한 것이다. 본 발명은 또한 MAGE-A3 발현 종양으로 고통받는 암 환자의 특정 집단의 면역요법적 치료에 관한 것이다.
Description
본 발명은 MAGE-A3의 검출을 위한 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 MAGE-A3를 발현하는 종양으로 고통받는 환자 집단의 면역요법 치료에 관한 것으로, 상기 MAGE-A3를 발현하는 종양 조직을 지닌 환자는 본원에 기재된 진단 방법을 이용하여 확인된다.
MAGE(흑색종 항원)족 유전자는 본래 암 환자의 혈액 림프구로부터 유래된 세포독성 림프구의 인지로 인해 확인되었다(Van der Bruggen et al 1991). MAGE 유전자족은 현재 20개가 넘는 일원을 포함하고, MAGE A, B, C 및 D 유전자로 구성된다(Scanlan et al., (2002) Immunol Rev. 188:22-32; Chomez et al., (2001) Cancer Res. 61(14):5544-51). 이들은 X 염색체에 밀집하여 있고(Lucas et al., 1998 Cancer Res. 58:743-752; Lucas et al., 1999 Cancer Res 59:4100-4103; Lucas et al., 2000 Int J Cancer 87:55-60; Lurquin et al., 1997 Genomics 46:397-408; Muscatelli et al., 1995 Proc Natl Acad Sci USA 92:4987-4991; Pold et al., 1999 Genomics 59: 161-167; Rogner et al 1995 Genomics 29:725-731), 아직 기능이 규정되어 있지 않다(Ohman et al. 2001 Exp Cell Res. 265(2): 185-94). MAGE 유전자는 매우 상동성이고, 특히 MAGE-A족의 일원은 60 내지 98%의 상동성을 지닌다. MAGE 유전자는 정조세포 및 태반에서의 발현을 제외하고는 모든 정상 세포에서 발현되지 않는다(Haas et al., 1988 Am J Reprod Immunol Microbiol 18:47-51; Takahashi et al., 1995 Cancer Res 55:3478-382).
암에서의 MAGE 유전자 발현의 재활성화는 프로모터의 비정상적인 탈메틸화로 인한 것이다(De Smeet et al. 1996 Proc Natl Acad Sci USA 93(14):7149-53; De Smeet et al. 1999 Mol Cell Biol. 19(11):7327-35). 12개의 MAGE-A 유전자는 하기의 암에서 다양하게 과발현된다: 이행세포 암종, 식도 암종, 흑색종, 방광 및 비소세포 폐 암종(NSCLC)(Scanlan et al. 2002 Immunol Rev. 188:22-32). 암성 조직에서의 MAGE 발현의 과발현 및 특이성은 MAGE-A3 단백질이 암 백신을 위한 항원으로 사용되도록 한다(Scanlan et al., 2002 Immunol Rev. 188:22-32). 그러나, 암 환자에서 발견되는 광범위한 발현으로 인해, MAGE-A3의 발현 수준은 상기 단백질을 발현하는 환자에 대한 예방접종을 위해 각각의 환자에서 정확하게 판단되어야 한다. MAGE-A3는 종종 MAGE-3와 상호교환적으로 언급되며; 둘 모두가 본원에서 사용된다.
흑색종
원격 전이의 악성 흑색종(미국 암 양원 협의회(American Joint Committee on Cancer, AJCC) 분류에 따른 단계 Ⅳ)을 나타내는 환자는 1년의 평균 생존 기간을 지니며, 단지 5%의 장기 생존 비율을 지닌다. 단계 Ⅳ 흑색종에 대한 표준 화학요법은 단지 8-25%의 치료 반응률을 지니며, 총 생존에는 효과가 없다. 국소적 전이(단계 Ⅲ)를 지니는 환자는 2 내지 3년의 평균 생존 기간을 지니며, 일차 및 국소적 전이의 적절한 외과적 억제 후에도 장기간 생존할 확률은 매우 적다(Balch et al., 1992 Semin Surg Oncol. 8(6):400-14). 단계 Ⅰ 내지 Ⅲ의 흑색종을 지닌 대부분의 환자는 외과적으로 종양이 제거되지만, 이러한 환자는 재발 위험이 크다. 따라서, 흑색종 진행을 예방하고, 전이성 흑색종에 대한 개선된 치료 요법, 및 일차적으로 종양이 제거된 환자에 대한 애쥬번트 치료법이 여전히 필요하다.
폐암
폐암에는 비소세포 폐암(NSCLC) 및 소세포 폐암(SCLC)의 두 유형의 폐암이 존재한다. 상기 명칭은 단순히 종양에서 발견되는 세포의 유형을 기재한 것이다. NSCLC는 편평세포 암종, 선암종 및 대세포 암종을 포함하고, 이는 폐암의 약 80%에 해당한다. NSCLC는 치료하기가 어렵고, 이러한 치료는 가능한한 생명을 연장시키고 질병의 증상을 경감시키는데 목적을 둔다. NSCLC는 가장 흔한 유형의 폐암이고, 불리한 결과와 관련되는 폐암이다. 모든 NSCLC 환자중, 약 25%가 진단 시점에 국소영역(loco-regional) 질병을 지니며, 외과적으로 적출할 수 있다(AJCC 분류에 따른 단계 ⅠB, ⅡA 또는 ⅡB). 그러나, 이러한 환자의 50% 이상이 완전한 외과적 절제술 후 2년 내에 재발을 한다. 따라서, 상기 환자에 대한 보다 나은 치료법을 제공하는 것이 필요하다.
MAGE-A3 발현
기존에, 세포주 및 종양 샘플 둘 모두에서 MAGE-A3 유전자의 발현을 측정하려는 다양한 방법이 시도되었다. 반-정량적 RT-PCR (De Plaen et al., 1994 Immunogenetics 40(5):360-9), 기타 PCR 기재 기술 및 저밀도 마이크로어레이가 모두 사용되었다 (Zammatteo et al., 2002 Clinical Chemistry 48(1) 25-34). 그러나, 많은 이러한 연구에서, MAGE족 일원 사이에 매우 높은 상동성이 존재하여 위(false) 양성을 야기시키는 주요 문제가 있었다. 다수의 Ⅱ상 및 Ⅲ상 시험에 대해, MAGE-A3를 발현하는 샘플을 특이적으로 확인할 수 있고, 샘플이 위-양성으로 시험될 가능성을 감소시킬 수 있는 정량적인 고 처리량의 분석법이 요망된다.
또 다른 난점은 임상 센터에서 종양 조직 보존의 통상적인 방법인 포르말린-고정되고, 파라핀-엠베딩(Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded, FFPE)된 종양 조직의 사용과 관련하여 발생한다. 포르말린에서의 고정은, 가교 및 부분적 분해를 야기시켜 조직 내의 RNA 분자의 구조가 변화된다. 상기 부분적인 분해는 100 내지 300개의 염기쌍의 보다 적은 단편의 RNA를 발생시킨다. 이러한 구조적인 변화는 통상적인 진단 기술에서 FFPE 조직으로부터 추출된 RNA의 사용을 어렵게 만든다.
도면의 간단한 설명
도 1: MAGE-A족 일원 내에서의 MAGE-A3 RT-PCR TaqMan 프라이머의 특이성.
도 2: MAGE-A3 발현에 대한 작은 홈 결합(Minor Groove Binding, MGB) 프로브 TaqMan RT-PCR의 특이성.
도 3: MAGE-A3 및 MAGE-6 플라스미드의 존재하에서의 MAGE-A3 프라이머의 특이성 시험.
도 4: 정량적 TaqMan PCR에 의해 측정된 MAGE-A3의 종양 발현.
도 5: MAGE-A3 발현의 시험.
도 6a: FFPE 조직 사용을 위해 고안된 MAGE-A3 프라이머의 특이성.
도 6b: 차별적인 양의 RNA에 대한 프라이머의 직선성 시험.
도 7: RNA 레이터(later) 동결 분석과 FFPE 조직 PCR 사이의 비교.
도 8: RNA 레이터 동결 분석과 FFPE 기재 MAGE-A3 분석의 상대 비교.
도 9: 지질단백질 D 단편, Mage3 단편, 및 히스티딘 꼬리의 융합 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열, 및 이의 각각의 아미노산 서열 (서열 목록 번호:35 및 서열 목록 번호:36).
도 10: NS1-MAGE3 및 히스티딘 꼬리의 융합 단백질 (서열 목록 번호:37).
도 11 : 융합 단백질 NS1-MAGE3-His를 코딩하는 DNA (서열 목록 번호:38).
도 12: CLYTA-MAGE3-히스티딘의 융합 단백질 (서열 목록 번호:39).
도 13: 융합 단백질 CLYTA-MAGE3-His에 대한 DNA (서열 목록 번호:40).
도 14: MAGE-A3에 대한 RT-PCR 프라이머 및 프로브의 고안을 위한 MAGE-A 유전자족 서열의 정렬.
도 15: 표적 서열을 함유하는 영역을 확인하기 위한 MAGE-A3 및 MAGE-A6 서열의 정렬 (테두리로 나타낸 인쇄면).
도 16: 반-정량적 MAGE-A3 RT-PCR에 대한 부류: 5개의 부류가 반-정량적 MAGE-A3 RT-PCR 분석에 할당될 수 있는 방법의 예.
도 17: 20, 2, 0.2 및 0.02 pg의 DNA를 이용한 MAGE-A 플라스미드로부터의 Ct 값의 도표적 비교.
도 18: 20, 2, 0.2 및 0.02 pg의 DNA를 이용한 다른 MAGE-A 플라스미드에 대한, MAGE-A3에 관한 델타 Ct 값의 도표적 비교.
도 19: FFPE 이종이식편 GERL RNA의 직선성 - 100으로부터 0.1 ng의 2배 연속 희석물의 RNA 투입량.
도 20: MAGE-A3와 β-액틴 사이의 RNA 투입량 대 델타 Ct의 로그(밑 2)를 이용한 도표를 도시.
표 및 서열의 기재
표 1: 반-정량적 MAGE RT-PCR에 사용된 올리고누클레오티드 프라이머.
표 2: TaqMan 정량적 RT-PCR에 사용된 올리고누클레오티드 프라이머.
표 3: MAGE-A3 반-정량적 PCR 대 정량적 TaqMan PCR의 비교.
표 4: PCR 믹스(mix) 1 및 PCR 믹스 2를 이용한 Ct 및 델타 Ct 값의 비교.
표 5: 동결 조직으로부터의 MGB TaqMan 정량적 RT-PCR에 사용된 올리고누클레오티드 프라이머.
표 6: 반-정량적 MAGE-A3 RT-PCR에 대한 부류: 5개의 부류가 반-정량적 MAGE-A3 RT-PCR 분석에 할당될 수 있는 방법의 예 (도 16 참조).
표 7: COBAS™ TaqMan MAGE-A3 프라이머 및 프로브 서열.
표 8: COBAS™ TaqMan 베타-액틴 프라이머 및 프로브 서열.
표 9: COBAS™ TaqMan 샘플 & 대조군 유효 CT 범위.
표 10: COBAS™ TaqMan 열 주기 프로파일 - MAGE-A3 배타성(exclusivity) 실험에 대한 PCR 열 프로파일.
표 11: 직선성 및 RT-PCR 효율, 분석 민감성(검출 한도), 방법 상관관계, 및 재현성 실험에 대한 RT-PCR 열 프로파일.
표 12: 20, 2, 0.2 및 0.02 pg의 DNA를 이용한 MAGE-A 플라스미드로부터의 Ct 값.
표 13: 20, 2, 0.2 및 0.02 pg의 DNA를 이용한 다른 MAGE-A 플라스미드에 대한, MAGE-A3에 관한 델타 Ct 값.
표 14: MAGE-A3 배타성 실험 유효성.
표 15 및 표 16: MAGE-A3 배타성 실험 세부.
표 17: 11개 수준의 10 레플리케이트(replicate)로부터의 MAGE-A3 및 β-액틴 Ct 및 델타 Ct의 직선성.
표 18: MAGE-A3 및 β-액틴의 RT-PCR 증폭 효율.
표 19: 직선성 / RT-PCR 효율 실험 유효성.
표 20, 21 및 22: 직선성 / RT-PCR 효율 실험 세부.
표 23: MAGE-A3 Ct 적중률(Hit Rate), N = 각 조건에 대해 24.
표 24: MAGE-A3 Ct 적중률 백분율, N = 각 조건에 대해 24.
표 25: β-액틴 Ct 적중률, N = 각 조건에 대해 24.
표 26: β-액틴 Ct 적중률 백분율, N = 각 조건에 대해 24.
표 27: MAGE 유전자 FAM 대조군 Ct.
표 28: β-액틴 HEX 대조군 Ct.
표 29; 표 30; 및 표 31: 검출 실험 세부 한도.
표 32: 샘플의 교차 유효성 요약.
표 33: 비교기(Comparator) 합치 백분율에 의한 COBAS 및 프로토타입(prototype) 시험의 양성 및 음성.
표 34: 불일치 결과를 해소하기 위한 동결 시험을 이용한 비교기 합치 백분율에 의한 COBAS 및 프로토타입 시험의 양성 및 음성.
표 35: 실험 대조군 MAGE 유전자 Ct.
표 36: 실험 대조군 β-액틴 유전자 Ct.
표 37, 38 및 39: 방법 상관관계 / 교차 유효성 실험 세부.
표 40: 수행 1 - GERL RNA 대조군으로부터의 MAGE-A3 발현 역치.
표 41: 수행 1 - 재현성 표본에 대한 MAGE-A3 발현 콜(Call).
표 42: 수행 2 - GERL RNA 대조군으로부터의 MAGE-A3 발현 역치.
표 43: 수행 2 - 재현성 표본에 대한 MAGE-A3 발현 콜.
표 44: 재현성 유효성.
표 45, 46 및 47: 재현성 실험 세부.
서열 목록 번호:1 - MAGE3-E2F (반-정량적 MAGE3 분석을 위한 프라이머)(표 1).
서열 목록 번호:2 - MAGE3-E3R (반-정량적 MAGE3 분석을 위한 프라이머)(표 1).
서열 목록 번호:3 - E3 MAGE3 TMF (엑손 3 MAGE-A3에 대한 정방향 프라이머)(표 2).
서열 목록 번호:4 - E3 MAGE3 TMR (엑손 3 MAGE-A3에 대한 역방향 프라이머; 이는 이러한 프라이머가 인지하는 MAGE-A3 엑손 서열의 역 상보체이다)(표 2).
서열 목록 번호:5 - I3 MAGE3 TMF (인트론 3 MAGE-A3에 대한 정방향 프라이머)(표 2).
서열 목록 번호:6 - I3 MAGE3 TMR (인트론 3 MAGE-A3에 대한 역방향 프라이머; 이는 이러한 프라이머가 인지하는 MAGE-A3 인트론 서열의 역 상보체이다)(표 2).
서열 목록 번호:7 - MAGEA3-775F (MAGE-A3에 대한 정방향 프라이머)(표 5).
서열 목록 번호:8 - MAGEA3-849R (MAGE-A3에 대한 역방향 프라이머; 이는 이러한 프라이머가 인지하는 MAGE-A3 서열의 역 상보체이다)(표 5).
서열 목록 번호:9 - MAGEA3e-950F (MAGE-A3에 대한 정방향 프라이머)(표 5).
서열 목록 번호:10 - MAGEA3e-1037R (MAGE-A3에 대한 역방향 프라이머; 이는 이러한 프라이머가 인지하는 MAGE-A3 서열의 역 상보체이다)(표 5).
서열 목록 번호:11 - MAGEA3f-623F (MAGE-A3에 대한 정방향 프라이머)(표 5).
서열 목록 번호:12 - MAGEA3f-697R (MAGE-A3에 대한 역방향 프라이머; 이는 이러한 프라이머가 인지하는 MAGE-A3 서열의 역 상보체이다)(표 5).
서열 목록 번호:13 - E3 MAGE3 TMP (엑손 3 MAGE3에 대한 프로브)(표 2).
서열 목록 번호:14 - I3 MAGE-A3 TMP (인트론 3 MAGE3에 대한 프로브)(표 2).
서열 목록 번호:15 - MAGEA3-801Tmc (MAGE3에 대한 프로브)(표 5).
서열 목록 번호:16 - MAGEA3e-1000Tmc (MAGE3에 대한 프로브)(표 5).
서열 목록 번호:17 - MAGEA3f-651Tm (MAGE3에 대한 프로브)(표 5).
서열 목록 번호:18 - B-액틴-E4F (B-액틴 프라이머)(표 1).
서열 목록 번호:19 - B-액틴-E6R (B-액틴 프라이머)(표 1).
서열 목록 번호:20 - B-액틴-TMF (B-액틴 프라이머)(표 2).
서열 목록 번호:21 - B-액틴-TMR (B-액틴 프라이머)(표 2).
서열 목록 번호:22 - B-액틴 TMP (B-액틴 프로브)(표 2).
서열 목록 번호:23 - 서열 목록 번호:29: MAGE3 면역 펩티드.
서열 목록 번호:30 - 서열 목록 번호:34: 애쥬번트 올리고누클레오티드.
서열 목록 번호:35 - 지질단백질 D 단편 - MAGE3 단편 - 히스티딘 꼬리의 융합 단백질의 누클레오티드 서열(도 9).
서열 목록 번호:36 - 서열 목록 번호:35의 아미노산 서열(도 9).
서열 목록 번호:37 - NS1 - MAGE3 - 히스티딘 꼬리의 융합 단백질의 아미노산 서열(도 10).
서열 목록 번호:38 - 서열 목록 번호:37을 엔코딩하는 누클레오티드 서열(도 11).
서열 목록 번호:39 - CLYTA - MAGE3 - 히스티딘의 융합 단백질의 아미노산 서열(도 12).
서열 목록 번호:40 - CLYTA - MAGE3 - 히스티딘 융합 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열(도 13).
서열 목록 번호:41 - MAGE 1 단편(도 14).
서열 목록 번호:42 - MAGE 2 단편(도 14).
서열 목록 번호:43 - MAGE 4a 단편(도 14).
서열 목록 번호:44 - MAGE 7 단편(도 14).
서열 목록 번호:45 - MAGE 8 단편(도 14).
서열 목록 번호:46 - MAGE 10 단편(도 14).
서열 목록 번호:47 - MAGE 11 단편(도 14).
서열 목록 번호:48 - MAGE 12 단편(도 14).
서열 목록 번호:49 - MAGE-A6 단편(도 14).
서열 목록 번호: 50 - MAGE-A3 단편(도 14).
서열 목록 번호:51 - MAGE-A3 단편(도 15).
서열 목록 번호:52 - MAGE-A6 단편(도 15).
서열 목록 번호:53 - MAGE-A3 합성 프로브 서열 MAGEA3F-646MOD(표 7).
서열 목록 번호:54 - 변형되지 않은 누클레오티드를 지니는 MAGEA3F-646MOD 프로브 서열.
서열 목록 번호:55 - β-액틴 프라이머 서열 RGI BACT F2(표 8).
서열 목록 번호:56 - β-액틴 프라이머 서열 RGI BACT R2(표 8).
서열 목록 번호:57 - β-액틴 프로브 서열 HW RGIBACT H(표 8).
발명의 개요
본 발명의 발명자는 MAGE-A3를 발현하는 종양 조직을 지녀 MAGE-A3 특이적 면역요법에 이로울 수 있는 환자를 확인하는 분석법을 개발하였다.
본 발명의 한 구체예에서, 서열 목록 번호:3 내지 서열 목록 번호:12중의 어느 한 누클레오티드 서열을 포함하는 프라이머가 제공된다. 한 추가 구체예에서, a) 서열 목록 번호:3 및 서열 목록 번호:4; b) 서열 목록 번호:5 및 서열 목록 번호:6; c) 서열 목록 번호:7 및 서열 목록 번호:8; d) 서열 목록 번호:9 및 서열 목록 번호:10; 및 e) 서열 목록 번호:11 및 서열 목록 번호:12의 프라이머쌍 중 하나 이상을 포함하는 프라이머쌍이 제공된다.
본 발명의 한 추가 양태에서, 서열 목록 번호:13 내지 서열 목록 번호:17, 5서열 목록 번호:53 또는 서열 목록 번호:54중의 어느 한 누클레오티드 서열을 포함하는 프로브가 제공된다.
한 추가 양태에서, (ⅰ) 정방향 프라이머; (ⅱ) 역방향 프라이머; 및 (ⅲ) 프로브를 포함하고, 상기 구성요소 (ⅰ), (ⅱ) 및 (ⅲ)가 엄격한 조건하에서 MAGE-A3의 표적 서열에 하이브리드될 수 있고, 상기 구성요소 (ⅰ), (ⅱ) 및 (ⅲ)의 표적 서열 중 하나 이상이 모든 다른 MAGE A 누클레오티드 서열의 동등한 영역과 비교하여 하나 이상의 누클레오티드가 상이하고, 상기 구성요소의 세트가 MAGE-A3와 MAGE-A6를 식별하는데 사용될 수 있는 키트가 제공된다.
또한, (ⅰ) 정방향 프라이머; (ⅱ) 역방향 프라이머; 및 (ⅲ) 프로브를 포함하고, 상기 구성요소 (ⅰ), (ⅱ) 및 (ⅲ)가 엄격한 조건하에서 MAGE-A3의 표적 서열에 하이브리드될 수 있고, 상기 구성요소 (ⅰ), (ⅱ) 및 (ⅲ)의 표적 서열 중 하나 이상이 MAGE-A6 누클레오티드 서열의 동등한 영역과 비교하여 하나 이상의 누클레오티드가 상이하고, 상기 구성요소의 세트가 MAGE-A3와 MAGE-A6를 식별하는데 사용될 수 있는 키트가 제공된다.
한 구체예에서, 본 발명의 키트는, (ⅰ) 본원에 기재된 하나 이상의 프라이머 또는 프라이머 세트; 및 (ⅲ) 본원에 기재된 하나 이상의 프로브를 구성요소로 포함할 수 있다. 한 예에서, 구성요소 (ⅰ)은 서열 목록 번호:3 및 서열 목록 번호:4의 서열을 포함하고, 구성요소 (ⅱ)는 서열 목록 번호:13의 서열을 포함하거나; 대안적으로, 구성요소 (ⅰ)은 서열 목록 번호:5 및 서열 목록 번호:6의 서열을 포함하고, 구성요소 (ⅱ)는 서열 목록 번호:14의 서열을 포함하거나; 구성요소 (ⅰ)은 서열 목록 번호:7 및 서열 목록 번호:8의 서열을 포함하고, 구성요소 (ⅱ)는 서열 목록 번호:15의 서열을 포함하거나; 구성요소 (ⅰ)은 서열 목록 번호:9 및 서열 목록 번호:10의 서열을 포함하고, 구성요소 (ⅱ)는 서열 목록 번호:16의 서열을 포함하거나; 구성요소 (ⅰ)은 서열 목록 번호:11 및 서열 목록 번호:12의 서열을 포함하고, 구성요소 (ⅱ)는 서열 목록 번호:17의 서열을 포함하거나; 구성요소 (ⅰ)은 서열 목록 번호:11 및 서열 목록 번호:12의 서열을 포함하고, 구성요소 (ⅱ)는 서열 목록 번호:53 또는 서열 목록 번호:54의 서열을 포함한다.
본 발명의 한 추가 구체예에서, 생물학적 샘플로부터 수득되거나 유래된 분리된 누클레오티드 서열을 본원에 기재된 하나 이상의 프라이머, 본원에 기재된 프라이머 세트, 본원에 기재된 프로브 또는 본원에 기재된 키트와 접촉시키는 단계를 포함하는, MAGE-A3 양성 종양 조직의 존재 또는 부재를 결정하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 프라이머, 프로브 또는 프라이머 세트를 이용하여 생물학적 샘플을 분석함으로써 MAGE-A3 양성 종양 조직의 존재 또는 부재를 결정하는 방법이 제공된다.
한 추가 양태에서, 생물학적 샘플로부터 수득되거나 유래된 분리된 누클레오티드 서열을 본원에 기재된 하나 이상의 프라이머, 본원에 기재된 프라이머 세트, 본원에 기재된 프로브 또는 본원에 기재된 키트와 접촉시키는 단계, 및 MAGE-A3가 샘플에서 발현되는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하는 환자 진단 방법이 제공된다.
상기 방법은 누클레오티드 서열을 증폭시키는 단계, 및 증폭된 누클레오티드 서열을 샘플 내에서 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
한 추가 양태에서, 생물학적 샘플로부터 수득되거나 유래된 분리된 누클레오티드 서열을 본원에 기재된 하나 이상의 프라이머 또는 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하는, MAGE-A3 양성 종양 조직의 존재 또는 부재를 결정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 상기 분리된 누클레오티드 서열이 엄격한 조건하에서 하나 이상의 프라이머 또는 프로브에 하이브리드되는지의 여부를 결정함으로써, 종양 조직이 MAGE-A3 양성인지 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 방법은 상기 누클레오티드 서열이 하나 이상의 프라이머 또는 프로브에 하이브리드되는지의 여부를 검출하기 위해 인 시츄 하이브리드화(in situ hybridisation)를 이용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 동결된 조직인 생물학적 샘플에 사용될 수 있고; 대안적으로 또는 추가로, 본원에 기재된 방법은 파라핀-보존된 조직, 예를들어 포르말린-고정되고, 파라핀-엠베딩된 (FFPE) 조직인 생물학적 샘플에서 수행될 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 방법을 이용하여 환자의 종양 조직이 MAGE-A3를 발현하는지의 여부를 결정한 후, 본원에 기재된 바와 같은 MAGE-A3 면역요법제 또는 면역치료제를 포함하는 조성물을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하여 환자를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
한 추가 구체예에서, 본원에 기재된 방법을 이용하여 MAGE-A3 발현 종양 조직을 제거/치료하기 위해 치료받은 적이 있는 MAGE-A3 발현 종양의 재발에 민감한 환자의 종양 조직이 MAGE-A3를 발현하는지의 여부를 결정한 후, 본원에 기재된 바와 같은 MAGE-A3 특이적 면역요법제 또는 면역치료제를 포함하는 조성물을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하는, MAGE-A3 발현 종양 조직을 제거/치료하기 위해 치료받은 적이 있는 MAGE-A3 발현 종양의 재발에 민감한 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 한 추가 구체예에서, 본원에 기재된 방법을 이용하여 MAGE-A3 발현 종양 조직을 지니는지 확인되는 MAGE-A3 발현 종양을 지닌 환자의 치료를 위한 약제의 제조에서 MAGE-A3 면역요법제 또는 면역치료제를 포함하는 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명의 한 추가 구체예에서, 본원에 기재된 방법을 이용하여 MAGE-A3 발현 종양 조직을 지니는지 확인되는 MAGE-A3 발현 종양의 재발에 민감한 환자의 치료를 위한 약제의 제조에서 MAGE-A3 면역요법제 또는 면역치료제를 포함하는 조성물의 용도가 제공된다.
한 구체예에서, MAGE-A3 면역요법제 또는 면역치료제를 포함하는 조성물이 MAGE-A3 항원 또는 이의 펩티드를 포함하는, 본원에 기재된 치료 방법 또는 용도가 제공된다. 한 구체예에서, MAGE-A3 항원 또는 이의 펩티드는 펩티드 EVDPIGHLY를 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명에 사용되는 MAGE-A3 항원 또는 이의 펩티드는 담체 단백질에 융합되거나 컨쥬게이션될 수 있다. 한 구체예에서, 담체 단백질은 단백질 D, NS1 또는 CLytA 또는 이의 단편으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, MAGE-A3 면역요법제 또는 면역치료제를 포함하는 조성물은 애쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 예를들어, 애쥬번트는 3D-MPL; 알루미늄염; CpG 함유 올리고누클레오티드; QS21 또는 ISCOM과 같은 사포닌 함유 애쥬번트; 수중유 에멀젼; 및 리포솜 중 하나 이상 또는 이들의 배합물을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 애쥬번트는 3D-MPL, CpG 함유 올리고누클레오티드 및 QS21을 포함할 수 있다.
상세한 설명
본원에서 사용되는 용어 '표적 서열'은 프로브 또는 프라이머의 서열이 부분적(즉, 일정한 정도의 미스매치를 지님) 또는 전체적으로 동일한 MAGE-A3 핵산 서열 (DNA 또는 RNA, 예를들어 유전체 DNA, 메신저 RNA, 또는 이들의 증폭된 형태)의 영역이며; 역방향 프라이머는 이러한 역방향 프라이머가 인지하는 서열의 역 상보체(또는 상기 기재된 바와 같이 일정한 정도의 미스매치를 가지는 역 상보체)이다. 표적 서열은 일반적으로 다른 MAGE-A 누클레오티드 서열, 또는 모든 다른 MAGE-A 누클레오티드 서열과 비교하여 하나 이상의 누클레오티드가 상이한 MAGE-A3 서열의 영역을 의미한다. 그러나, 본 발명의 몇몇 구체예에서, 표적 서열은, 하나 이상의 프라이머 및 프로브에 대해, MAGE-A 누클레오티드 서열 사이에서 동일할 수 있고, 단, 사용되는 하나 또는 두개 이상의 프라이머 및 프로브는 구별되어지는 유전자 사이에서 상이한 표적 서열을 인지한다.
따라서, 한 구체예에서, 특이적 프라이머 또는 프로브는 미스매치 없이 표적 MAGE-A3 서열에 결합하고, 하나 이상의 염기쌍의 미스매치를 지니면서 추가 MAGE-A 서열, 예를들어 MAGE-6의 서열의 동등한 영역에 결합할 것이다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브의 표적 서열은 매우 높은 특이성으로 MAGE-A3의 검출을 가능케 하는, 2개의 유전자 사이의 가장 차이(미스매치)를 지니는 서열일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 표적 서열은 도 15의 테두리로 확인되는 영역이다.
적절하게는, 프라이머 또는 프로브는 이러한 프라이머 또는 프로브의 전장에 걸쳐 표적 서열과 95% 이상 동일할 수 있고, 적절하게는 표적 MAGE-A3 서열에 대해 상기 프라이머 또는 프로브의 전장에 걸쳐 95% 초과, 예를들어 96%, 97%, 98%, 99%, 가장 바람직하게는 100% 동일할 수 있다. 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 이러한 프라이머 또는 프로브의 모든 누클레오티드 위치에서 표적 서열과 동일할 수 있거나, 예를들어 프로브의 길이, 온도, 반응 조건 및 분석의 필요조건에 따라 1 또는 2개 이상의 미스매치를 지닐 수 있다. 물론, 역방향 프라이머는 프라이머 서열의 역 상보체인 영역에 대해 상기 조건을 충족시킨다.
적절하게는, 프라이머 또는 프로브의 각각의 누클레오티드는 이의 대응부 표적 누클레오티드와 수소 결합을 형성할 수 있다.
바람직하게는, 프라이머 또는 프로브와 표적 서열의 상보성은 아데닌(A) 누클레오티드가 티민(T)과 쌍을 이루고, 구아닌(G) 누클레오티드가 시토신(C)과 쌍을 이루거나, 이의 반대도 또한 마찬가지인 A:T 및 C:G 염기쌍의 정도에 의해 평가된다. RNA 형태에서, T는 U(우라실)로 대체될 수 있다.
예를들어, 유니버셜(universal) 프로브에 이노신이 사용되는 경우, 상보성은 또한 이노신(프로브)-표적 누클레오티드 상호작용의 정도에 의해 평가될 수 있다.
따라서, 본 발명은 표 1 및 2에 나타낸 바와 같은 서열 목록 번호:1 내지 서열 목록 번호:12중의 어느 한 누클레오티드 서열을 포함하는 프라이머를 제공한다. 용어 "프라이머"는 본원에서 예를들어 PCR 기술에서 프라이머로 사용될 수 있는 임의의 단일 가닥 올리고누클레오티드 서열을 의미하는 것으로 사용된다. 따라서, 본 발명에 따른 '프라이머'는 복제되는 핵산 가닥에 대해 실질적으로 동일 (정방향 프라이머)하거나 실질적으로 역 상보체(역방향 프라이머)인 프라이머 신장 생성물의 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥 올리고누클레오티드 서열을 의미한다. 프라이머의 고안 (길이 및 특정 서열)은 DNA 및/또는 RNA 표적의 특성 및 프라이머가 사용되는 조건 (예를들어, 온도 및 이온 강도)에 좌우될 것이다.
프라이머는 서열 목록 번호:1 내지 서열 목록 번호:12에 나타낸 누클레오티드 서열로 구성될 수 있거나, 서열 목록 번호:1 내지 서열 목록 번호:12의 서열을 포함하거나 이에 해당되는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100개 또는 이 이상의 염기쌍일 수 있고, 단 이들은 엄격한 조건하에서 MAGE-A3 누클레오티드 서열 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하기에 적합해야 한다. 필요한 경우, 제공된 환경하에서 요구되는 특이성 및 민감성을 유지시키기 위해 길이 및 서열에서의 프라이머 또는 프로브의 약간의 변형이 수행될 수 있다. 본원에 나열된 프로브 및/또는 프라이머는 예를들어 어느 방향으로든 1, 2, 3, 4 또는 5개의 누클레오티드에 의해 길이가 연장되거나 감소될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "엄격한 조건"은 프라이머가 임의의 다른 MAGE 누클레오티드 서열에는 결합하지 않고, MAGE-A3 누클레오티드 서열 내의 누클레오티드 서열에 특이적으로 결합하도록 하는 임의의 하이브리드화 조건을 의미한다. MAGE-A3 누클레오티드 서열의 영역에 대한 프로브의 "특이적 결합" 또는 "특이적 하이브리드화"는 상기 프라이머 또는 프로브가 사용되는 실험 조건하에서 상기 MAGE-A3 누클레오티드 서열의 일부 또는 전체 영역과 듀플렉스(duplex)(이중 가닥 누클레오티드 서열)를 형성하고, 상기 조건하에서 프라이머 또는 프로브는 분석되는 샘플에 존재하는 누클레오티드 서열의 다른 영역과는 듀플렉스를 형성하지 않는 것을 의미한다. MAGE-A3 누클레오티드 서열의 영역 내에서의 특이적 하이브리드화를 위해 고안된 본 발명의 프라이머 및 프로브는 오로지 상기 영역 내에 해당될 수 있거나, 상기 영역과 상당한 범위로 중첩될 수 있다 (즉, 상기 영역 외 및 내의 누클레오티드와 듀플렉스를 형성함).
적절하게는, 핵산 표적 영역에 대한 프로브의 특이적 하이브리드화는 "엄격한" 하이브리드화 조건, 예를들어 3X SSC, 0.1% SDS 및 50℃ 하에서 발생한다. 당업자는 특이적 하이브리드화가 달성될 수 있도록 온도, 프로브 길이 및 염 농도의 파라미터를 다양화시키는 방법을 알고 있다. 하이브리드화 및 세척 조건은 널리 공지되어 있고, 예를들어 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]의 특히 11장에 예시되어 있다.
본 발명은 하기 프라이머쌍 중 하나 이상을 포함하는 프라이머 세트를 추가로 제공한다:
| 세트 1: 서열 목록 번호:3 및 서열 목록 번호:4 |
| 세트 2: 서열 목록 번호:5 및 서열 목록 번호:6 |
| 세트 3: 서열 목록 번호:7 및 서열 목록 번호:8 |
| 세트 4: 서열 목록 번호:9 및 서열 목록 번호:10 |
| 세트 5: 서열 목록 번호:11 및 서열 목록 번호:12 |
본 발명은 서열 목록 번호:13 내지 서열 목록 번호:17, 서열 목록 번호:53 또는 서열 목록 번호:54중의 어느 한 누클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가로 제공한다. 용어 "프로브"는 본원에서 핵산에 결합할 수 있고, 예를들어 PCR 기술에서 프로브로 사용될 수 있는 임의의 단일 가닥 올리고누클레오티드 서열을 의미하는 것으로 사용된다: 프로브는 서열 목록 번호:13 내지 서열 목록 번호:17, 서열 목록 번호:53 또는 서열 목록 번호:54에 나타낸 누클레오티드 서열로 구성될 수 있거나, 서열 목록 번호:13 내지 서열 목록 번호:17, 서열 목록 번호:53 또는 서열 목록 번호:54의 서열을 포함하거나 이에 해당되는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 또는 이 이상의 염기쌍일 수 있고, 단 이들은 MAGE-A3 누클레오티드 서열 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하기에 적합해야 한다.
프로브가 프라이머쌍과 배합되는 방법으로 사용되는 본 발명의 한 구체예에서, 상기 프라이머쌍은 MAGE-A3 폴리누클레오티드 단편의 일부 또는 전부의 증폭을 가능케 해야 하고, 여기서 프로브는 상기 MAGE-A3 폴리누클레오티드의 일부 또는 전부에 결합할 수 있거나, 고체 지지대 상에 고정된다.
프라이머 및/또는 프로브는 추가로 프로브가 검출되는 것을 가능케 하는 마커를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 마커의 예는 형광 마커, 예를들어 6-카르복시플루오레세인(6FAM™), NED™ (Applera Corporation), HEX™ 또는 VIC™ (Applied Biosystems); TAMRA™ 마커 (Applied Biosystems, CA, USA); 화학발광 마커, 예를들어 루테늄 프로브; 및 방사능 표지, 예를들어 삼중수소 티미딘 형태의 트리튬을 포함한다. 32인이 또한 방사능표지로 사용될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 프로브는 이의 5'-말단에 형광 리포터 염료 및 이의 3'-말단에 켄처(quencher) 염료를 포함할 수 있다. 형광 리포터 염료는 6-카르복시플루오레세인(6FAM)을 포함할 수 있고, 켄처 염료는 비-형광 켄처(NFQ)를 포함할 수 있다. 임의로, 작은 홈 결합체 단백질(Minor Groove Binder protein)(MGB™; Applied Biosystems, CA, USA)이 프로브, 예를들어 프로브의 3'-말단에 첨가될 수 있다.
한 구체예에서, MGB™ 이클립스(Eclipse) 프로브(Epoch Biosciences, WA, USA)가 사용될 수 있다. MGB™ 이클립스 프로브는 프로브의 5'-말단에 위치된 이클립스™ 다크(Dark) 켄처 및 MGB™ 부분을 지닌다. 형광 리포터 염료는 프로브의 3'-말단에 위치된다.
한 구체예에서, 본 발명의 프라이머 및 프로브 서열은 천연 발생 누클레오티드 구조 또는 염기, 예를들어 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T) 및 우라실(U)을 함유하거나 포함할 수 있다.
한 추가 구체예에서, 누클레오티드 구조 또는 염기의 합성 또는 변형 유사체가 프로브의 서열에 포함될 수 있다. 합성 또는 변형은 비-천연 발생 누클레오티드 구조 또는 염기를 의미한다. 이러한 합성 또는 변형 염기는 프로브 서열 내의 염기중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 전부를 대체할 수 있다. 한 구체예에서, 시토신은 5-메틸 dC로 대체될 수 있고, 티민은 5-프로피닐 dU로 대체될 수 있다. BHQ2 켄처가 또한 서열 내에 포함될 수 있다.
본 발명은 (ⅰ) 본원에 기재된 하나 이상의 프라이머 또는 프라이머 세트; 및 (ⅱ) 본원에 기재된 하나 이상의 프로브를 구성요소로 포함하는 키트를 추가로 제공한다. 한 구체예에서, 키트는 하나의 정방향 프라이머, 하나의 역방향 프라이머 및 정방향 및 역방향 프라이머에 의해 증폭되는 영역 내의 표적 서열을 지니는 프로브 서열을 포함한다. 이러한 구체예에서, 프라이머 세트는 MAGE-A3의 서열의 일부(앰플리콘)을 증폭시킬 수 있고, 프로브는 엄격한 조건하에서 앰플리콘에 하이브리드될 수 있다.
MAGE-A3 및 MAGE-A6의 서열은 이의 누클레오티드의 98% 정렬 및 이의 단백질 서열의 95% 정렬을 지니는 매우 상동적인 서열이다. MAGE-A3 서열을 특별히 확인하기 위해서는, MAGE-A3와 MAGE-A6를 구별할 수 있는 프라이머 및 프로브를 확인하는 것이 필요하다.
한 구체예에서, 본 발명은 엄격한 조건하에서 MAGE-A3의 표적 서열에 특이적으로 하이브리드되는 프라이머 및/또는 프로브 세트를 제공하고, 상기 프라이머 또는 프로브의 표적 서열 중 하나 이상은 모든 다른 MAGE A 누클레오티드 서열의 동등한 영역과 비교하여 하나 이상의 누클레오티드가 상이하고, 상기 세트는 MAGE-A3와 MAGE-A6를 식별할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 엄격한 조건하에서 MAGE-A3의 표적 서열에 특이적으로 하이브리드되는 프라이머 및/또는 프로브 세트를 제공하고, 상기 프라이머 또는 프로브의 표적 서열 중 하나 이상은 MAGE A6 누클레오티드 서열의 동등한 영역과 비교하여 하나 이상의 누클레오티드가 상이하고, 상기 세트는 MAGE-A3와 MAGE-A6를 식별할 수 있다.
한 구체예에서, 하나 이상의 프라이머 또는 프로브의 표적 서열은 MAGE-A6의 동등한 영역과 비교하여 MAGE-A3의 표적 서열 내에 하나의 누클레오티드가 상이할 수 있다. 한 추가 구체예에서, 하나 이상의 프라이머 또는 프로브의 표적 서열은 MAGE-A6의 동등한 영역과 비교하여 두개의 누클레오티드가 상이할 수 있다.
한 구체예에서, 두개의 프라이머 및 하나의 프로브를 포함하는 키트는 프라이머 및 프로브의 표적 서열 내에 하기의 차이를 지닐 수 있다:
(ⅰ) 두개의 프라이머중 하나 또는 프로브의 표적 서열이 MAGE-A3와 MAGE-A6 사이에서 하나의 누클레오티드가 상이함;
(ⅱ) 상기 (ⅰ)에서 언급되지 않은 프라이머 또는 프로브의 표적 서열이 MAGE-A3와 MAGE-A6 사이에서 하나의 누클레오티드가 상이함; 및
(ⅲ) 나머지 프라이머 또는 프로브의 표적 서열이 MAGE-A3 및 MAGE-A6 둘 모두에 대해 동일함.
예를들어, 한 구체예에서, 프라이머 A, 프라이머 B 및 프로브 C를 포함하는 키트는 표적 서열 내에 하기의 차이를 포함할 수 있다:
(ⅰ) 프라이머 A의 표적 서열이 MAGE-A3와 MAGE-A6 사이에서 하나의 누클레오티드가 상이함;
(ⅱ) 프라이머 B의 표적 서열이 MAGE-A3와 MAGE-A6 사이에서 두개의 누클레오티드가 상이함; 및
(ⅲ) 프로브 C의 표적 서열이 MAGE-A3 및 MAGE-A6 둘 모두에 대해 동일함.
예를들어, 한 구체예에서, 프라이머 A, 프라이머 B 및 프로브 C를 포함하는 키트는 표적 서열 내에서 하기의 차이를 포함할 수 있다:
(ⅰ) 프라이머 A의 표적 서열이 MAGE-A3와 MAGE-A6 사이에서 두개의 누클레오티드가 상이함;
(ⅱ) 프라이머 B의 표적 서열이 MAGE-A3 및 MAGE-A6 둘 모두에 대해 동일함; 및
(ⅲ) 프로브 C의 표적 서열이 MAGE-A3와 MAGE-A6 사이에서 하나의 누클레오티드가 상이함.
예를들어, 한 구체예에서, 프라이머 A, 프라이머 B 및 프로브 C를 포함하는 키트는 표적 서열 내에서 하기의 차이를 포함할 수 있다:
(ⅰ) 프라이머 A의 표적 서열이 MAGE-A3 및 MAGE-A6 둘 모두에 대해 동일함;
(ⅱ) 프라이머 B의 표적 서열이 MAGE-A3와 MAGE-A6 사이에서 하나의 누클레오티드가 상이함; 및
(ⅲ) 프로브 C의 표적 서열이 MAGE-A3와 MAGE-A6 상이에서 두개의 누클레오티드가 상이함.
한 구체예에서, 키트는 서열 목록 번호:3 및 서열 목록 번호:4의 프라이머쌍 또는 이의 서열을 포함하는 프라이머쌍 및 서열 목록 번호:13의 프로브 또는 이의 서열을 포함하는 프로브; 서열 목록 번호:5 및 서열 목록 번호:6의 프라이머쌍 또는 이의 서열을 포함하는 프라이머쌍 및 서열 목록 번호:14의 프로브 또는 이의 서열을 포함하는 프로브; 서열 목록 번호:7 및 서열 목록 번호:8의 프라이머쌍 또는 이의 서열을 포함하는 프라이머쌍 및 서열 목록 번호:15의 프로브 또는 이의 서열을 포함하는 프로브; 서열 목록 번호:9 및 서열 목록 번호:10의 프라이머쌍 또는 이의 서열을 포함하는 프라이머쌍 및 서열 목록 번호:16의 프로브 또는 이의 서열을 포함하는 프로브; 및/또는 서열 목록 번호:11 및 서열 목록 번호:12의 프라이머쌍 또는 이의 서열을 포함하는 프라이머쌍 및 서열 목록 번호:17의 프로브 또는 이의 서열을 포함하는 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 추가 구체예에서, 생물학적 샘플로부터 수득되거나 유래된 누클레오티드 서열을 본원에 기재된 하나 이상의 프라이머, 하나 이상의 프라이머 세트 또는 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하는, MAGE-A3 양성 종양 조직의 존재 또는 부재를 결정하는 방법이 제공된다. MAGE-A3 양성 종양 조직은 환자로부터 분리되는 MAGE-A3 항원을 발현하는 임의의 종양 또는 종양 세포를 의미한다. 본원에 기재된 방법은 생물학적 샘플이 MAGE-A3 양성 종양 조직을 포함하거나 이로 구성되는지의 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
생물학적 샘플은 환자로부터 제거되거나 분리된 환자의 조직 또는 세포 샘플을 의미한다.
생물학적 샘플로부터 수득되거나 유래된 누클레오티드 서열을 본원에 기재된 하나 이상의 프라이머, 하나 이상의 프라이머 세트 또는 프로브와 접촉시키는 단계, 및 MAGE-A3가 샘플에서 발현되는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 환자 진단 방법이 추가로 제공된다.
한 구체예에서, 누클레오티드 서열은 생물학적 샘플로부터 분리되거나 분리되었된 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "-로부터 수득되거나 유래된"은 총괄적으로 사용되는 것을 의미한다. 즉, 이는 종양 샘플로부터 직접 분리되는 임의의 누클레오티드 서열 또는 예를들어 mRNA 또는 cDNA를 생성하는 역전사의 이용에 의해 샘플로부터 유래되는 임의의 누클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 방법은 누클레오티드 서열을 증폭시키고, 샘플 내에서 증폭된 누클레오티드 서열을 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 방법은 분리되거나 증폭된 누클레오티드 서열과 본원에 기재된 하나 이상의 프로브를 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 누클레오티드 서열은 종양 샘플로부터 분리되거나 정제된다. RT-PCR에서, 유전체 DNA 오염은 위(false) 양성 결과를 발생시킬 수 있다. 한 구체예에서, 유전체 DNA는 시험되는 샘플로부터 제거되거나 실질적으로 제거되거나, 본 발명의 방법에 포함된다.
본 발명의 방법은 MAGE-A3 양성 종양 조직을 검출하는데 적합하다. 본 발명의 한 구체예에서, MAGE-A3 양성 조직은 인 시츄 하이브리드화(in situ hybridisation)를 이용하여 검출될 수 있다. 인 시츄 하이브리드화는 특정한 DNA 또는 RNA 서열의 형태적 부위의 직접적인 시각화를 위해 환자로부터 분리된 온전한 염색체, 세포 또는 조직에서의 본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브를 이용하여 수행되는 하이브리드화 반응을 의미한다.
폴리누클레오티드의 하이브리드화는 임의의 적절한 하이브리드화 방법 및 검출 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 하이브리드화 시스템의 예는 통상적인 도트 블롯(dot blot), 서던 블롯(Southern blot) 및 샌드위치 방법을 포함한다. 예를들어, 적절한 방법은 유형-특이적 프로브가 공지된 별개의 위치에서 고체 지지대 상에 고정(도트, 선 또는 기타 형태)되고, 증폭된 폴리핵산이 표지되어 하이브리드 형성이 검출되는 역 하이브리드화 방법을 포함할 수 있다. MAGE-A3 특이적 핵산 서열, 예를들어 본원에 기재된 프로브 또는 프라이머는 비오틴으로 표지될 수 있고, 하이브리드는 비오틴-스트렙타비딘과 비-방사능 색 발달 시스템의 커플링을 통해 검출될 수 있다. 그러나, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Gravitt et al., (Journal of Clinical Microbiology, 1998, 36(10): 3020-3027)]에 예시된 바와 같이 기타 역 하이브리드화 시스템이 또한 이용될 수 있다. 표준 하이브리드화 및 세척 조건은 문헌[Kleter et al., Journal of Clinical Microbiology, 1999, 37(8): 2508-2517]에 기재되어 있고, 프로브(들) 및 프라이머(들)의 길이 및 서열에 의해 요구되는 특이성 및 민감성을 유지시키기 위해 제공된 환경하에서 최적화될 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 방법은 a) 서열 목록 번호:3 및 서열 목록 번호:4의 서열을 포함하는 프라이머쌍, 및 서열 목록 번호:13의 서열을 포함하는 프로브; b) 서열 목록 번호:3 및 서열 목록 번호:4의 서열을 포함하는 프라이머쌍, 및 서열 목록 번호:17의 서열을 포함하는 프로브; c) 서열 목록 번호:3 및 서열 목록 번호:4의 서열을 포함하는 프라이머쌍, 및 서열 목록 번호:53의 서열을 포함하는 프로브; d) 서열 목록 번호:3 및 4의 서열을 포함하는 프라이머쌍, 및 서열 목록 번호:54의 서열을 포함하는 프로브; e) 서열 목록 번호:5 및 서열 목록 번호:6의 서열을 포함하는 프라이머쌍, 및 서열 목록 번호:14의 서열을 포함하는 프로브; f) 서열 목록 번호:7 및 서열 목록 번호:8의 서열을 포함하는 프라이머쌍, 및 서열 목록 번호:15의 서열을 포함하는 프로브; g) 서열 목록 번호:9 및 서열 목록 번호:10의 서열을 포함하는 프라이머쌍, 및 서열 목록 번호:16의 서열을 포함하는 프로브; h) 서열 목록 번호:11 및 서열 목록 번호:12의 서열을 포함하는 프라이머쌍, 및 서열 목록 번호:17의 서열을 포함하는 프로브; i) 서열 목록 번호:11 및 서열 목록 번호:12의 서열을 포함하는 프라이머쌍, 및 서열 목록 번호:53의 서열을 포함하는 프로브; 및/또는 j) 서열 목록 번호:11 및 서열 목록 번호:12의 서열을 포함하는 프라이머쌍, 및 서열 목록 번호:54의 서열을 포함하는 프로브의 사용을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 신선한 조직, 동결된 조직, 파라핀-보존된 조직 및/또는 에탄올 보존된 조직에 사용하기에 적합하다. 널리 공지된 추출 및 정제 방법이 샘플로부터의 RNA 또는 DNA의 분리에 이용가능하다(참조: Sambrook et al., 1989). RNA 또는 DNA는 샘플로부터의 추출 후, 더욱 바람직하게는 폴리누클레오티드 증폭 단계 (예를들어, PCR) 단계 후에 직접 사용될 수 있다. 역 하이브리드화 분석과 같은 특정 예에서, 증폭 전에 RNA를 cDNA로 역전사시키는 것이 필요할 수 있다. 상기의 경우에서, 증폭된 폴리누클레오티드는 샘플로부터 "유래"된다.
샘플이 파라핀-보존된 조직인 한 구체예에서, 하기의 프라이머 및 프로브 세트가 이용될 수 있다:
a) 서열 목록 번호:7 및 서열 목록 번호:8의 서열을 포함하는 프라이머쌍 및 서열 목록 번호:15의 서열을 포함하는 프로브; b) 서열 목록 번호:9 및 서열 목록 번호:10의 서열을 포함하는 프라이머쌍 및 서열 목록 번호:16의 서열을 포함하는 프로브; c) 서열 목록 번호:11 및 서열 목록 번호:12의 서열을 포함하는 프라이머쌍 및 서열 목록 번호:17의 서열을 포함하는 프로브; d) 서열 목록 번호:11 및 12의 서열을 포함하는 프라이머쌍 및 서열 목록 번호:53의 서열을 포함하는 프로브; 및/또는 e) 서열 목록 번호:11 및 12의 서열을 포함하는 프라이머쌍 및 서열 목록 번호:54의 서열을 포함하는 프로브.
본 발명은 본원에 기재된 방법을 이용하여 환자의 종양 조직이 MAGE-A3를 발현하는지의 여부를 결정하고, MAGE-A3 항원, 에피토프 또는 항원 유도체 또는 MAGE-A3 특이적 항체 또는 면역글로불린을 포함하는 조성물을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 환자는 MAGE-A3를 발현하는 종양 조직을 지닌 환자일 수 있거나(활성 질병 환경), MAGE-A3 발현 종양 조직을 제거/치료하기 위해 치료받은 적이 있는 MAGE-A3 발현 종양의 재발에 민감한 환자일 수 있다(애쥬번트 환경).
본 발명은 MAGE-A3 발현 종양으로 고통받거나, 본원에 기재된 진단 방법, 키트, 프라이머 또는 프로브를 이용하여 MAGE-A3 발현 종양 조직을 지니는 것으로 확인되거나 이를 지녔던 것으로 확인된 MAGE-A3 발현 종양의 재발에 민감한 환자의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, MAGE-A3 항원, 에피토프 또는 항원 유도체 또는 MAGE-A3 특이적 항체 또는 면역글로불린을 포함하는 조성물의 용도를 추가로 제공한다.
MAGE-A3 항원, 에피토프 또는 항원 유도체를 포함하는 조성물은 MAGE-A3 항원 또는 이의 펩티드를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, MAGE-A3 항원 또는 이의 펩티드는 펩티드 EVDPIGHLY를 포함하거나 이로 구성된다. MAGE-A3 항원 또는 펩티드는 단백질 D, NS1 또는 CLytA 또는 이들의 단편으로부터 선택될 수 있는 담체 단백질에 융합되거나 컨쥬게이션될 수 있다.
한 구체예에서, 조성물은 애쥬번트, 예를들어 3D-MPL; 알루미늄염; CpG 함유 올리고누클레오티드; QS21 또는 ISCOM과 같은 사포닌 함유 애쥬번트; 수중유 에멀젼; 및 리포솜 중 하나 이상 또는 이들의 배합물을 포함하는 애쥬번트를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 임상 적용에서 MAGE-A3의 발현의 존재 또는 부재에 대해 인간 환자로부터의 조직 샘플을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 샘플은 예를들어 바늘 생검 코어(needle biopsy core), 외과적 절제 샘플 또는 림프절 조직으로 구성될 수 있다. 예를들어, 이러한 방법은 생검을 수득하는 단계를 포함하며, 이러한 생검은 종양 세포가 전체 세포 집단의 약 80%가 되도록 농화시키는 크립스탯 절제(crypstat sectioning)에 의해 임의로 세분된다. 특정 구체예에서, 핵산은 당 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 상기 샘플로부터 추출될 수 있다. 기타 구체예에서, 조직 샘플로부터 추출된 핵산은 당 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 증폭될 수 있다. MAGE-A3 발현의 수준은 검출될 수 있고, 통계적으로 유효한 군 및/또는 MAGE-A3 음성 환자의 대조군과 비교될 수 있다.
한 구체예에서, 진단 방법은 예를들어 유전자 생성물의 해당 mRNA 및/또는 단백질 수준을 검출함으로써 피검체가 MAGE-A3 유전자 생성물을 발현하는지의 여부를 결정하는 것을 포함한다. 예를들어, 이는 노던 블롯 분석, 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 반-정량적 RT-PCR, 정량적 RT-PCR, TaqMan PCR, 인 시츄 하이브리드화, 면역침전법, 웨스턴 블롯 분석 또는 면역조직화학과 같은 기술을 이용하여 이루어진다. 이러한 방법에 따르면, 세포 또는 조직은 피검체로부터 수득될 수 있고, mRNA 및/또는 단백질의 수준은 MAGE-A3를 발현하지 않는 조직의 수준과 비교된다.
TaqMan PCR 기술
Taq DNA 중합효소는 5'-3' 엑소누클레아제 활성을 지닌다. Taqman PCR 분석은 이러한 엑소누클레아제 활성을 이용하여 PCR 증폭 동안 표적 서열로 어닐링되는 이중-표지된 프로브를 절단한다.
간단히, RNA는 샘플로부터 추출되고, cDNA는 합성(역전사)된다. cDNA는 이후 표준 PCR 구성요소 (예를들어, Taqman PCR에 대해 로슈(Roche)사(CA, USA)에 의해 공급되는 구성요소)를 함유하는 PCR 반응 혼합물에 첨가된다. 반응 혼합물은 두개의 프라이머 사이의 주형 누클레오티드 서열(즉, PCR 반응에 의해 증폭되는 서열 내, "앰플리콘")로 어닐링되는 프로브를 추가로 함유한다. 프로브는 5'-말단에 형광 리포터 염료를 포함하고, 3'-말단에 켄처 염료를 포함한다. 켄처는 리포터 형광을 켄치할 수 있으나, 이는 두개의 염료가 서로 근접한 경우에만 이루어지며; 이는 온전한 프로브에 대해 발생한다.
증폭 중 및 증폭 후, 프로브는 Taq DNA 중합효소에 의해 분해되고, 임의의 형광이 검출된다.
정량 측정에 있어서, 형광이 기준선 방출의 표준 편차의 10배의 역치 값에 도달하는 PCR 주기수가 이용된다. 주기 역치(Ct)로 언급되는 이러한 주기수는 표적 cDNA의 출발량에 역비례하고, cDNA의 양이 측정되도록 한다. 본질적으로, 보다 많은 표적 RNA가 샘플에 존재하면, 보다 적은 Ct 수가 수득된다.
Ct 값에 대해 수득된 측정치는 하우스키핑(housekeeping) 유전자에 대해 수득된 측정치와 비교된다. 이는 출발 물질을 측정하기 위한 신뢰성 있는 파라미터가 아닌 각각의 역전사 반응(파장 흡광도에 기초함) 및 이의 특성(즉, 분해)에 대한 첨가되는 전체 RNA의 양에 기초한 임의의 오류를 감안한다. 따라서, 하우스키핑 유전자의 전사는 내인성 대조군으로서 정량된다. 베타-액틴이 가장 널리 사용되는 비-특이적 하우스키핑 유전자중 하나이나, 다른 것도 사용될 수 있다.
본 발명의 한 추가 구체예에서, MAGE-A3 발현 종양으로 고통받는 환자를 치료하는 방법이 제공되고, 이러한 방법은 본 발명의 방법을 이용하여 환자가 MAGE-A3 단백질을 발현하는지의 여부를 결정한 후, 질병의 재발을 예방하거나 개선시키기 위해 MAGE-A3 항원, 에피토프 또는 항원 유도체 또는 MAGE-A3 특이적 항체 또는 면역글로불린을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 환자는 먼저 임의의 종양의 외과술에 의한 절제와 같은 치료 또는 기타 화학요법 또는 방사선요법 치료를 받을 수 있다.
따라서, 본 발명은 MAGE-A3 발현 종양으로 고통받는 환자, 또는 본 발명에 따른 진단 방법, 키트, 프라이머 또는 프로브를 사용하여 MAGE-A3-발현 종양 조직을 지니는 것으로 결정된, MAGE-A3 발현 종양을 제거하거나 치료하기 위해 치료(외과술, 화학요법 또는 방사선요법)를 받은 적이 있는 환자의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 MAGE-특이적 면역요법의 용도를 추가로 제공한다.
따라서, 본 발명은 MAGE-A3를 발현하는 암, 예를들어 흑색종, 유방암, 방광암, 예를들어 이행세포 암종, 폐암, 예를들어 비소세포 폐암종(NSCLC), 두경부암, 예를들어 식도암종, 편평세포 암종, 간암, 다발골수종 및 결장암종을 지니는 환자에 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 특히 폐암 및 흑색종과 같은 암에서 애쥬번트(수술후) 환경으로 환자의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 전이성 암의 치료에 이용된다.
면역요법
본 발명의 환자를 치료하는 방법에 사용하기에 적합한 조성물은 MAGE-A3 특이적 면역 반응을 발생시킬 수 있는 조성물이다. 조성물은 MAGE-A3 유전자 생성물로부터 하나 이상의 에피토프를 함유할 것이다. 이러한 에피토프는 임의로 담체에 공유적으로 연결된 펩티드 항원으로 존재할 수 있다. 대안적으로, 보다 큰 단백질 단편이 이용될 수 있다. 그러나, 사용을 위한 단편 및 펩티드는 적절하게 제시되는 경우 MAGE-A3에 대해 면역 반응, 예를들어 MAGE-A3-특이적 면역 반응을 발생시킬 수 있어야 한다.
본 발명에 사용될 수 있는 펩티드의 예는 하기 MAGE-A3 펩티드를 포함한다:
한 구체예에서, 항원은 면역학적 융합체 또는 발현 증강자(enhancer) 파트너에 연결된 MAGE 펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있다. MAGE 단백질은 전장의 MAGE-A3일 수 있거나, 이는 MAGE3의 단편, 예를들어 MAGE3의 아미노산 3-314 (전체 312개의 아미노산)를 포함할 수 있다.
항원 및 파트너는 화학적으로 컨쥬게이션될 수 있거나, 재조합 융합 단백질로 발현될 수 있다. 항원 및 파트너가 재조합 융합 단백질로 발현되는 한 구체예에서, 이는 비-융합 단백질과 비교하여 증가된 수준이 발현 시스템에서 생성되는 것을 가능케 할 수 있다. 따라서, 융합 파트너는 T 헬퍼(helper) 에피토프 (면역학적 융합 파트너), 바람직하게는 인간에 의해 인지되는 T 헬퍼 에피토프를 제공하는데 도움이 될 수 있고/있거나, 천연 재조합 단백질보다 높은 수율로 단백질 (발현 증강자)를 발현시키는데 도움이 될 수 있다. 한 구체예에서, 융합 파트너는 면역학적 융합 파트너 및 발현 증강 파트너 둘 모두일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 사용될 수 있는 면역학적 융합 파트너는 그람-네거티브 세균인 헤모필루스 인플루엔자 B (Haemophilus influenza B)의 표면 단백질인 단백질 D (WO91/18926) 또는 이의 유도체로부터 유래된다. 단백질 D 유도체는 단백질의 처음 1/3, 또는 단백질의 대략 처음 1/3을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 단백질 D의 처음 109개의 잔기는 추가 외인성 T-세포 에피토프를 지니는 MAGE-A3 항원을 제공하고 대장균(E. coli)에서 발현 수준을 증가(따라서, 발현 증강자로도 작용함)시키는 융합 파트너로서 이용될 수 있다. 한 대안적 구체예에서, 단백질 D 유도체는 N-말단의 처음 100-110개의 아미노산 또는 N-말단의 대략 처음 100-110개의 아미노산을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 단백질 D 또는 이의 유도체는 지질화(lipidate)될 수 있고, 지질단백질 D가 이용될 수 있다: 지질 꼬리는 항원 제시 세포로의 항원의 최적 제시를 보장할 수 있다.
한 구체예에서, MAGE-A3는 432-아미노산-잔기 융합 단백질인 단백질 D-MAGE-A3/His일 수 있다. 이러한 융합 단백질은 예를들어 하기와 같이, 그람-네거티브 세균 헤모필루스 인플루엔자 B의 표면에 존재하는 지질단백질인 단백질 D의 아미노산 1 내지 109, MAGE-A3 단백질로부터의 312개의 아미노산 (아미노산 3-314), 생성 과정 동안 융합 단백질의 정제를 촉진할 수 있는 스페이서 및 폴리히스티딘 꼬리 (His)를 포함한다:
ⅰ) 18개 잔기의 신호 서열 및 처음 109개 잔기의 가공된 단백질 D, 상기 신호 서열은 처음 109개의 잔기를 남기는 생성 동안 융합 단백질로부터 분리됨;
ⅱ) 2개의 관련되지 않는 잔기 (메티오닌 및 아스파르트산);
ⅲ) 천연 MAGE-3 단백질의 잔기 3-314;
ⅳ) 힌지(hinge) 영역으로 작용하는 2개의 글리신 잔기; 및
ⅴ) 7개의 히스티딘 잔기.
한 대안적 구체예에서, 상기 구성요소 (ⅰ)이 단백질 D의 N-말단의 처음 100-110의 아미노산 또는 N-말단의 대략 처음 100-110의 아미노산을 포함하는 서열로 대체될 수 있는 것을 제외하고 상기 작제물이 사용될 수 있다. MAGE-3는 N-말단에 단백질 D 및 C-말단에 7개의 히스티딘 잔기 (His 꼬리)의 서열을 지니는 융합 단백질로 발현될 수 있다. 단백질 D는 그람-네거티브 세균 헤모필루스 인플루엔자 B의 표면에 노출된 42-kDa의 면역글로불린-D 결합 단백질이다.
또 다른 구체예에서, 면역학적 융합 파트너 단백질 D는 LytA로 공지된 단백질로 대체될 수 있다. LytA는 펩티도글리칸 백본 내의 특정 결합을 특이적으로 분해하는 자가용해소인 N-아세틸-L-알라닌 아미다아제, 아미다아제 LytA (LytA 유전자에 의해 코딩됨 (Gene, 43 (1986) page 265-272))를 합성하는 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터 유래된다. LytA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 몇몇 콜린 유사체, 예를들어 DEAE에 대한 친화성을 담당한다. 이러한 특성은 융합 단백질의 발현에 유용한 대장균 C-LytA 발현 플라스미드의 개발에서 밝혀졌다. 아미노산 말단에 C-LytA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제는 문헌[Biotechnology: 10, (1992) page 795-798]에 기재되어 있다. 한 구체예에서, 분자의 C 말단 부분이 이용될 수 있다. 상기 구체예는 잔기 178에서 시작되는 C 말단에서 발견된 LytA 분자의 반복 부분을 이용할 수 있다. 한 구체예에서, LytA 부분은 잔기 188-305를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, MAGE-A3 단백질은 유도체화된 자유 티올을 포함할 수 있다. 이러한 항원은 WO99/40188에 기재되어 있다. 특히, 카르복시아미드화 또는 카르복시메틸화 유도체가 이용될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 종양 관련 항원은 MAGE-A3-단백질 D 분자를 포함한다. 이러한 분자에 대한 누클레오티드 및 아미노산 서열은 도 9(서열 목록 번호:35 및 서열 목록 번호:36)에 제시되어 있다. 이러한 항원 및 하기 요약된 항원들은 WO99/40188에 보다 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 추가 구체예에서, 종양 관련 항원은 하기 융합 단백질중 어느 하나를 포함할 수 있다:
예를들어 도 10 및 11에 제시되어 있는 NS1-MAGE3 및 히스티딘 꼬리의 융합 단백질(서열 목록 번호:37 및 서열 목록 번호:38); 예를들어 도 12 및 13에 제시되어 있는 CLYTA-MAGE3-히스티딘의 융합 단백질(서열 목록 번호:39 및 서열 목록 번호:40).
본 발명의 한 추가 구체예는 본원에 기재된 바와 같은 MAGE-A3 특이적 종양 관련 항원을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하는 핵산 면역요법제를 이용하는 것을 포함한다. 본 발명의 한 구체예에서, 서열은 적절한 발현 벡터에 삽입될 수 있고, DNA/RNA 예방접종에 사용될 수 있다. 핵산을 발현하는 미생물 벡터가 또한 벡터 전달되는 면역요법제로 사용될 수 있다.
적절한 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스를 포함하는 헤르페스 바이러스, 알파-바이러스, 폭스 바이러스, 예를들어 카나리폭스 및 백시니아-바이러스 기재 시스템을 포함한다. 상기 바이러스를 이용하는 유전자 전달 기술는 당업자에게 공지되어 있다. 예를들어, 레트로바이러스 벡터는 본 발명의 폴리누클레오티드를 숙주 유전체로 안정적으로 통합시키는데 사용될 수 있으나, 이러한 재조합은 바람직하지 않다. 대조적으로, 복제-결핍 아데노바이러스 벡터는 에피솜으로 존재하고, 따라서 일시적 발현을 가능케 한다. 곤충 세포 (예를들어, 바큘로바이러스 벡터), 인간 세포, 효모 또는 세균에서 발현을 가동시킬 수 있는 벡터가, 예를들어 소단위 백신 또는 면역분석에서 사용하기 위해 본 발명의 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 MAGE-A3 단백질의 다량을 생성시키기 위해 사용될 수 있다.
한 바람직한 구체예에서, 생(生) 벡터로 사용되는 아데노바이러스는 복제 결핍 원숭이 아데노바이러스이다. 통상적으로, 이러한 바이러스는 E1 결실을 함유하고, E1 유전자로 형질전환된 세포주에서 성장할 수 있다. 바람직한 원숭이 아데노바이러스는 침팬지로부터 분리된 바이러스이다. 특히, C68 (Pan 9로도 공지됨) (참조: 미국 특허 제 6 083 716호), 및 Pan 5, 6 및 Pan 7 (WO 03/046124)가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 따라서, 이러한 벡터는 본 발명의 이종유래 유전자를 삽입하여, 상기 유전자 생성물이 발현될 수 있도록 조작될 수 있다. 상기 재조합 아데노바이러스 벡터의 사용, 제형 및 제조는 WO 03/046142에 상세히 기재되어 있다.
핵산 서열을 수득하기 위한 통상적인 재조합 기술, 및 발현 벡터의 생성은 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989]에 기재되어 있다.
단백질 기재 면역요법제에 대해, 본 발명의 단백질은 액체에 가용되어 있는 형태 또는 동결건조된 형태로 제공된다.
각각의 인간 투여량은 1 내지 1000 μg의 단백질을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 투여량은 30 내지 300 μg의 단백질을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 면역요법제는 백신 애쥬번트, 및/또는 면역자극제인 사이토카인 또는 케모카인을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 백신 애쥬번트는 시판되며, 이는 예를들어 프로인트 불완전 애쥬번트(Freund's Incomplete Adjuvant) 및 완전 애쥬번트(Difco Laboratories, Detroit, MI); 머크(Merck) 애쥬번트 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); 알루미늄염, 예를들어 알루미늄 히드록시드 겔(명반) 또는 알루미늄 포스페이트; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화된 티로신의 불용성 현탁액; 아실화된 당; 양이온 또는 음이온적으로 유도체화된 다당류; 폴리포스파젠; 생분해성 미세구체; 모노포스포릴 지질 A 및 quil A가 있다. GM-CSF 또는 인터루킨-2, 인터루킨-7 또는 인터루킨-12와 같은 사이토카인, 및 케모카인이 또한 애쥬번트로 사용될 수 있다.
본 발명의 제형에서, 애쥬번트 조성물이 Th1 유형의 면역 반응을 우선적으로 유도하는 것이 요망될 수 있다. 높은 수준의 Th1-유형 사이토카인 (예를들어, IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대해 세포 매개 면역 반응의 유도를 선호하는 경향이 있다. 반응이 우선적으로 Th1-유형인 한 구체예에 따르면, Th1-유형 사이토카인의 수준은 Th2-유형 사이토카인의 수준보다 크게 증가할 것이다. 이러한 사이토카인의 수준은 표준 분석을 이용하여 용이하게 평가될 수 있다. 사이토카인 족의 개관을 위해서는 문헌[Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173, 1989]을 참조하라.
따라서, Th1-유형 반응을 우선적으로 유도하는데 사용될 수 있는 적절한 애쥬번트는 모노포스포릴 지질 A, 예를들어 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL)과 알루미늄염의 배합물을 포함한다. WO9850399, WO0134617 및 WO03065806에 기재되어 있는 바와 같은 3D-MPL 또는 기타 toll 유사 수용체 4 (TLR4 리간드), 예를들어 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트가 또한 Th1-유형 반응을 우선적으로 발생시키기 위해 단독으로 사용될 수 있다.
TH1 유형 면역 반응을 우선적으로 유도할 수 있는 기타 공지된 애쥬번트는 TLR9 길항제, 예를들어 메틸화되지 않은 CpG 함유 올리고누클레오티드를 포함한다. 올리고누클레오티드는 CpG 디누클레오티드가 메틸화되지 않은 것을 특징으로 한다. 이러한 올리고누클레오티드는 널리 공지되어 있고, 예를들어 WO 96/02555에 기재되어 있다.
적절한 올리고누클레오티드는 하기를 포함한다:
CpG-함유 올리고누클레오티드는 또한 단독으로 또는 기타 애쥬번트와 배합되어 사용될 수 있다 예를들어, 증강되는 시스템은 CpG-함유 올리고누클레오티드 및 사포닌 유도체의 배합물, 특히 WO00/09159 및 WO00/62800에 기재된 바와 같은 CpG 및 QS21의 배합물을 포함한다.
제형은 수중유 에멀젼 및/또는 토코페롤을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 적합한 애쥬번트는 단독으로 또는 다른 애쥬번트와 배합되어 사용될 수 있는 사포닌, 예를들어 QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA)이다. 예를들어, 증강되는 시스템은 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체의 배합물, 예를들어 WO 94/00153에 기재된 바와 같은 QS21과 3D-MPL의 배합물, 또는 WO 96/33739에 기재된 바와 같은 QS21가 콜레스테롤로 켄칭된 덜 반응성인 배합물을 포함한다. 기타 적절한 제형은 수중유 에멀젼 및 토코페롤을 포함한다. 수중유 에멀젼 중에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 특히 효능있는 애쥬번트 제형이 WO 95/17210에 기재되어 있다.
또 다른 구체예에서, 애쥬번트는 리포솜 조성물로 제형화될 수 있다. 사용되는 3D-MPL의 양은 일반적으로 소량이나, 면역요법 제형에 따라 투여량당 1-1000μg, 바람직하게는 투여량당 1-500μg, 더욱 바람직하게는 투여량당 1 내지 100μg의 범위일 수 있다.
한 구체예에서, 애쥬번트 시스템은 예를들어 WO 95/17210에 기재된 바와 같이 리포솜 제형 또는 수중유 에멀젼 중에 존재하는 CpG 올리고누클레오티드, 3D-MPL 및 QS21의 3개의 면역자극제를 포함한다.
본 발명의 애쥬번트 또는 면역요법제 중의 CpG 또는 면역자극 올리고누클레오티드의 양은 일반적으로 소량이나, 면역요법 제형에 따라 투여량당 1-1000μg, 바람직하게는 투여량당 1-500μg, 더욱 바람직하게는 투여량당 1 내지 1OOμg의 범위일 수 있다.
본 발명의 애쥬번트에 사용하기 위한 사포닌의 양은 투여량당 1-1000μg, 바람직하게는 투여량당 1-500μg, 더욱 바람직하게는 투여량당 1 내지 250μg, 가장 바람직하게는 투여량당 1 내지 100μg의 범위일 수 있다.
일반적으로, 각각의 인간 투여량은 0.1 내지 1000μg의 항원, 예를들어 0.1 내지 500μg, 0.1 내지 100μg 또는 0.1 내지 50μg의 항원을 포함할 수 있다. 특정 면역요법제에 대한 최적량은 예방접종되는 피검체에서 적절한 면역반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 최초 예방접종 후, 피검체는 적절한 간격으로 1회 또는 수회의 부스터(booster) 면역화될 수 있다.
기타 적절한 애쥬번트는 몬타니드(Montanide) ISA 720 (Seppic, France), SAF (Chiron, California, United States), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), Ribi Detox, RC-529 (GSK, Hamilton, MT) 및 기타 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트 (AGPs)를 포함한다.
따라서, 본원에 기재된 항원 및 애쥬번트를 포함하는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물이 제공되고, 상기 애쥬번트는 3D-MPL, QS21, CpG 올리고누클레오티드, 폴리에틸렌 에테르 또는 에스테르중 하나 이상 또는 이들 애쥬번트중 2개 이상의 배합물을 포함한다. 면역원성 조성물 내의 항원은 수중유 또는 유중수 에멀젼 비히클 또는 리포솜 제형으로 존재할 수 있다.
한 구체예에서, 애쥬번트는 3D-MPL, QS21 및 면역자극 CpG 올리고누클레오티드중 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 3개 모두의 면역자극제가 존재한다. 또 다른 구체예에서, 3D MPL 및 Qs21이 수중유 에멀젼에 존재하고, CpG 올리고누클레오티드의 부재하에 존재한다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제 중에 본원에 기재된 종양 관련 항원, 또는 융합 단백질을 포함하는 약제 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 명세서 및 후속하는 청구의 범위에 걸쳐서, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 용어 "포함하다" 및 이의 변형 "-들을 포함하다" 및 "포함하는"은 언급된 정수 또는 단계 또는 언급된 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하나, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹을 배제하지 않는 것을 의미하는 것이 이해될 것이다.
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예를 참조로 하여 추가로 기재될 것이며, 여기서 RT-PCR은 역전사 중합효소 연쇄반응을 의미한다:
실시예 1
반-정량적 PCR - 동결 조직 샘플
프라이머: 서열 목록 번호:1 및 서열 목록 번호:2
RNA 추출: 액체 질소 RNA 정제 방법
조직의 작은 단편을 액체 질소에 즉석 동결시킨 후, 막자에 의한 기계적 제분을 위해 막자사발에 두었다. 100 mg의 생성된 분말을 100 ul의 트리퓨어(TriPure) 분리 시약에 첨가하고, 제조업체(Qiagen, Venlo, Netherlands)의 설명서에 따라 RNA를 추출하였다. 260 nm에서의 광학 밀도로부터 RNA 농도를 결정하였다.
반-정량적 MAGE-A3 RT-PCR
문헌[De Plaen et al (Immunogenetics 40:360, 1994)]에 기재된 바와 같이 반-정량적 RT-PCR을 수행하였다. 2 μg의 전체 RNA로부터의 cDNA 합성을 42℃에서 1시간 30분 동안 1x 퍼스트 스트랜드(first strand) 완충제, 0.5 mM의 각각의 dNTP, 10 mM의 디티오트레이톨, 20U의 rRNase 억제제, 2 μM의 올리고(dT)15 및 200U의 M-MLV 역전사효소를 함유하는 20 μl의 혼합물에서 수행하였다. 50 ng의 cDNA를 MAGE-A3에 특이적인 프라이머 (서열 목록 번호:1 및 서열 목록 번호:2)를 함유하는 25 μl의 혼합물 중에서의 PCR에 의해 증폭시켰다. 각각의 혼합물의 10μl의 분취량을 1% 아가로오스 겔 전기영동으로 영동시키고, 에티디움 브로마이드 형광으로 시각화시켰다. mRNA 및 유전체 DNA (gDNA)가 각각 증폭되는 경우 앰플리콘의 크기는 725 bp 및 805 bp이다.
반-정량적 MAGE-A3 RT-PCR에 대한 양성 대조군:
본 실험을 위해 하기와 같은 3개의 양성 대조군을 도입시켰다:
(ⅰ) MAGE-A3 유전체 DNA의 클로닝된 단편을 각각의 PCR 반응 혼합물에 첨가하였다. 이는 805 bp (cDNA로부터 생성된 단편보다 80 bp 더 큼)의 단편을 생성시키고, 이는 항상 PCR 억제의 부재하에 존재한다. 이는 MAGE-A3 음성 샘플에서 PCR 효율을 조사하기 위한 양성 대조군으로 작용한다;
(ⅱ) 각각의 MAGE-A3 분석에 대해, cDNA 합성을 종양 세포 및 "Gerl" 흑색종 세포주 MZ-2-3.0로부터 추출된 RNA에서 동시에 수행하였다. "양성"으로 간주되기 위해서는, 종양 샘플은 1% 수준의 Gerl 세포주 MZ-2-3.0 cDNA의 신호를 발생시켜야 한다;
(ⅲ) 베타-액틴 PCR (표 1)을 각각의 샘플에서 수행하여 심하게 분해된 RNA를 지니는 샘플을 검출하였다. MAGE-A3 음성 종양 샘플로부터 발생된 베타-액틴 신호가 MZ-2-3.0으로부터 발생된 신호보다 약한 경우, 임상 샘플에 대한 주기수를 조정하여, 베타-액틴 앰플리콘의 강도를 요구되는 수준에 도달시켰다.
반-정량적 MAGE-A3 RT-PCR에 대한 음성 대조군:
본 실험을 위해 하기와 같은 3개의 음성 대조군을 도입시켰다:
(ⅰ) MAGE-A3 음성인 것으로 공지된 세포 배양물 LB 23-1/2로부터 추출된 RNA;
(ⅱ) RT-반응에서의 물 대조군; 및
(ⅲ) PCR 단계에서의 물 대조군.
데이터 해석
725 bp의 앰플리콘의 양이 Gerl 세포주 MZ-2-3.0 RNA로부터의 0.5 ng의 RNA를 이용하여 수득된 앰플리콘의 양과 동일하거나 더 큰 경우(즉, 0.1%의 Gerl RNA과 동등함; 양성 대조군 참조), 종양 샘플로부터의 mRNA의 50ng의 샘플을 MAGE-A3 양성으로 간주하였다. 에티디움 브로마이드 형광에 의해 양을 측정하였다. 양성 및 음성 대조군을 첨가하였다.
반-정량적 MAGE-A3 RT-PCR에 대한 부류: 반-정량적 MAGE-A3 RT-PCR 분석을 5개 표준 부류(De Plaen et al., 1994)로 할당하였다. 이들은 주관적인 측정치로, 가장 낮은 부류로부터 가장 높은 부류를 -, -/+, +, ++, +++로 나타내었다. 상기 부류를 할당하는 방법의 예는 도 16에 제시되어 있고, 이러한 도에서, 상기 부류는 하기 표 6에 제시된 바와 같은 양성 대조군에 의해 생성된 밴드에 따라 할당된다:
표 6
| RNA 양성 대조군 | ||||||
| 100 | 50 | 10 | 2 | 1 | 0.5 | |
| 부류 | +++ | ++ | + | +/- | ||
실시예 2: 실시간 Taqman 정량적 RT-PCR - 동결 조직 샘플
실시간 Taqman 정량적 RT-PCR:
프라이머: 서열 목록 번호:3 및 서열 목록 번호:4; 프로브: 서열 목록 번호:13 (엑손)
프라이머: 서열 목록 번호:5 및 서열 목록 번호:6; 프로브: 서열 목록 번호:14 (인트론)
반-정량적 PCR (비교 연구를 위한 것임):
프라이머: 서열 목록 번호:1 및 서열 목록 번호:2
재료 및 방법
환자 및 샘플 수집
단계 IB 및 단계 Ⅱ 비소세포 폐암종(NSCLC) 종양으로부터의 생검을 외과술에 의해 수득하였다. 환자는 GSK 249553/004 (MAGE3-AS02B-004) 및 Epidemio-MAGE3-153의 두 임상 시험에 등록시켰다; 환자는 고지에 입각한 동의서에 사인하였고, 환자에게 연구의 특성 및 가능한 결과를 설명하였다. 외과 절제후 생검을 RNA-안정화 용액 (RNA-later, Ambion, Cambridge, UK)에 직접 침지시키고, -20℃에서 보관하였다. RNA레이터(RNAlater)는 동결되지 않은 조직 샘플 내의 세포 RNA를 안정화시키고 온전하게 보호하는 조직 보관 시약이다. RNA레이터는 액체 질소로 샘플을 즉시 동결시킬 필요를 배제시킨다.
RNA 추출: 혼합 분쇄기 RNA 정제 방법
RNA레이터로부터 종양 조직을 분리시키고, TriPure 분리 시약 (Roche, Vilvoorde, Belgium)에 첨가하였다. 이후, 조직을 텅스텐 구를 함유하는 혼합 분쇄기(Mixer Mill)에 첨가하였다. 혼합 분쇄기에서의 분쇄 후, 전체 세포 RNA를 제조업체의 설명서(Qiagen, Venlo, Netherlands)에 따라 TriPure 시약을 이용하여 최대 100 mg의 조직으로부터 추출하였다. 260 nm의 최적 밀도 값으로부터 RNA 농도를 결정하였다.
MAGE-A3 TaqMan RT-PCR 분석-동결 조직.
50 ng의 전체 RNA에 해당하는 cDNA를 TaqMan 완충제, 5mM MgCl2, 0.4 mM dUTP, 0.2 mM의 각각의 누클레오티드, 0.625U의 Ampli Taq Gold DNA 중합효소, 0.05U의 UNG, 0.2μM의 각각의 올리고누클레오티드 프라이머 및 0.2μM의 TaqMan 프로브를 함유하는 25 μl의 혼합물에서의 PCR에 의해 증폭시켰다. 특정 올리고누클레오티드 프라이머 및 프로브를 사용하였다 (표 2; 서열 목록 번호:3, 4 및 13, 및 서열 목록 번호:5, 6 및 14). 프로브를 염료 FAM™, NED™ 및 VIC™ (Applied Biosystems, CA, USA)로 표지시켰고, 이는 작은 홈 결합 부분 (MGB™; Applied Biosystems, CA, USA)을 지닌다. MAGE 특이적 프로브에 대해 NED 대신 염료 FAM을 이용하여 추가 실험을 수행하였다.
MAGE-A3 엑손 및 베타-액틴 유전자를 7700 또는 7900 시스템 (PE Applied Biosystems, Warrington, UK)에서의 TaqMan 화학을 이용하는 정량적 PCR에 의해 증 폭시켰다. PCR 증폭을 또한 MAGE-A3 유전자의 인트론에서 수행하여, 유전체 DNA 오염이 없는 것을 확인하였다. 증폭 프로파일은 50℃에서 2분의 1 주기, 95℃에서 12분의 1주기, 및 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분의 35주기였다. TaqMan 프로브의 분해에 의해 성성된 형광 신호는 모든 신장 단계 동안 실시간으로 검출되었다.
MAGE-A3에 대한 특이성을 결정하기 위한 TaqMan RT-PCR 분석의 유효성
프라이머: 서열 목록 번호:3 및 서열 목록 번호:4; 프로브: 서열 목록 번호:13 (엑손) - Taqman RT-PCR
프라이머: 서열 목록 번호:1 및 서열 목록 번호:2 (반정량적 PCR - 비교 연구를 위한 것임)
플라스미드 및 세포주
사용된 플라스미드는 유전자 MAGE-A1 (MAGE-1; Genbank 등록 NM 004988), MAGE-A2 (MAGE-2; Genbank 등록 L18920), MAGE-A3 (MAGE-A3; Genbank 등록 NM 005362), MAGE-A4 (MAGE-4; Genbank 등록 002362), MAGE-A6 (MAGE-6; Genbank 등록 NM 005363), MAGE-A8 (MAGE-8; Genbank 등록 NM 005364), MAGE-A9 (MAGE-9; Genbank 등록 NM 005365), MAGE-A10 (MAGE-10; Genbank 등록 NM 021048), MAGE-A11 (MAGE-11; Genbank 등록 NM 005366) 및 MAGE-A12 (MAGE-12; Genbank 등록 NM 005367)의 전장 cDNA를 함유하였다. 세포주 MZ-2-3.0 (MAGE-A3 양성) 및 LB 23-1/2 (MAGE-A3 음성)는 티에리 분(Thierry Boon) 교수(Ludwig institute, Brussels, Belgium)가 제공해 주었다. MAGE-A3 TaqMan 방법의 특이성을 MAGE-A1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11 및 12 유전자의 전장 cDNA를 함유하는 1x104, 1x105 및 1x106 카피의 플라스미드를 이용하여 시험하였다.
고안된 MAGE-A3 PCR 프라이머 및 프로브의 영역에서의 MAGE A 유전자 (MAGE 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11 및 12)의 서열 비교를 도 14에 제시하였다. 정방향 및 역방향 MAGE-A3 프라이머의 서열을 밑줄로 나타내고; MAGE-A3 프로브의 서열을 테두리로 나타내었다. 역방향 프라이머는 이들이 인지하는 서열의 영역에 상보적, 즉 A는 T이고; G는 C이고; T는 A이고; C는 G이다.
MAGE-A3 TaqMan RT-PCR 양성 대조군: (ⅰ) MAGE-A3 유전체 DNA의 단편 및 (ⅱ) Gerl 세포주 MZ-2-3.0 (MAGE-A3에 대해 양성인 흑색종 세포주)으로부터 추출된 공지된 양의 RNA.
MAGE-A3 TaqMan RT-PCR 음성 대조군: (ⅰ) MAGE-A3에 대해 음성인 것으로 공지된 세포주 LB 23-1/2로부터 추출된 RNA, (ⅱ) RT 반응에서의 물 블랭크(blank), 및 (ⅲ) PCR 단계에서의 물 블랭크. 40주기의 RT-PCR을 수행하였다. 음성 대조군은 ≥ 35이어야 한다. TaqMan 실험의 결과중 일부는 1/Ct로 나타내었다.
통계: 2개의 PCR 기술의 비교
본원에 기재된 기술을 이용하여 반-정량적 RT-PCR (서열 목록 번호:1 및 서열 목록 번호:2의 프라이머) 및 실시간 정량적 Taqman PCR (프라이머: 서열 목록 번호:3 및 서열 목록 번호:4; 프로브: 서열 목록 번호:13)로부터의 결과를 비교하기 위해 2 x 2 분할표를 작성하였다(표 3). 명명 척도 변수를 양성 및 음성의 두 개의 값으로 특정지었다. 음성값은 0 및 경계 등급을 포함시켰다; 경계 등급은 반-정량적 RT-PCR로부터 0.8% 내지 1.2%의 Gerl 및 TaqMan 분석으로부터의 1% 미만의 모든 결과를 의미한다. 양성값은 반-정량적 RT-PCR 방법에 대한 베타-액틴 발현과 관련된 겔 밴드의 가시적인 스코어링을 기초로 하여 등급화시켰으며, TaqMan 분석으로부터 ≥ 1%인 모든 결과를 포함시켰다. 두 방법 사이의 합치를 (이중 음성 샘플 + 이중 양성 샘플의 수)/샘플의 전체수로 계산하였다. 불일치쌍(음성-양성)의 비율을 비교하기 위해 McNemar 시험을 이용하였다. 신뢰 구간(CI)을 계산하였다.
정량적 TaqMan RT-PCR의 최적화
Sybr 그린 (Sybr green)을 이용한 MAGE-A3에 대한 TaqMan RT-PCR.
Sybr 그린은 서열 특이적 프로브 없이 비선택적으로 앰플리콘에 결합하는 성분이다. MAGE-A 클론의 4개의 상이한 희석액(20 pg, 2 pg, 0.2 pg 및 0.02 pg)을 이용하여 MAGE-A족의 유전자 클론에 대해 실시간 RT-PCR을 수행하였다(도 1, 결과를 Y-축에 대한 1/CT로 나타내었다). 14 Ct에서 MAGE-A3에 대해 양성 결과를 수득하였고, MAGE-A6 (20 pg의 플라스미드)에 대해 16 Ct의 값을 수득하였다. MAGE A4, A8 및 A9는 30의 Ct 수준을 나타내었고, 다른 MAGE 유전자는 35 Ct 및 이 이상의 매우 한정된 발현을 나타내었다.
서열-특이적 프로브를 이용한 MAGE-A3에 대한 TaqMan RT-PCR.
프로브 (서열 목록 번호:13)와 함께 동일한 MAGE-A3 프라이머 (서열 목록 번호:3 및 4)를 이용하여, MAGE-A3와 A6를 구별하는 유효성을 MAGE-A족 일원의 관련 클론의 다양한 희석액을 이용하여 시험하였다(도 2). 첫째로, MAGE-A3 Ct는 각각 의 희석액에서 예상된 감소를 나타내었다. MAGE-A6 클론은 프로브가 사용되는 경우 높은 1/Ct를 나타내지 않았는데, 이는 교차 반응성이 없음을 나타낸다.
도 3에 나타낸 바와 같이 MAGE-A3 플라스미드 희석액에 대한 1 x 106 MAGE-A6 플라스미드의 스파이킹은 어떠한 효과도 나타내지 않았고, 상기 결과는 MAGE-A3 플라스미드 적정 결과를 반영한다. 이는 TaqMan PCR을 이용하여 MAGE-A3의 존재하에서 MAGE-A6의 비경쟁적 영향을 나타낸다.
결과
MAGE-A3의 종양 발현, 반-정량적 및 정량적 방법의 비교
TaqMan-특이적 정량 PCR을 MAGE-A3에 대한 표준 반-정량적 RT-PCR (서열 목록 번호:1 및 2의 프라이머를 이용함)에 의해 추가로 유효성을 확인하였다. NSCLC 환자로부터의 71개의 종양 샘플을 MAGE-A3 발현의 정량적 방법 (서열 목록 번호:3 및 서열 목록 번호:4의 프라이머 및 서열 목록 번호:13의 프로브를 이용함)과 반-정량적 방법 (서열 목록 번호:1 및 서열 목록 번호:2의 프라이머를 이용함)을 직접 비교하기 위해 사용하였다.
결과는 두 방법 사이에 68/71의 합치로 95.8% (표 3)의 우수한 일치를 나타낸다. 정량적 TaqMan RT-PCR 및 반-정량적 RT-PCR 분석에서 3개의 샘플이 불일치하였고, 반-정량적 RT-PCR 분석에서 결과의 확실성이 과평가되었다. 그러나, McNemar 시험은 상기 3개의 불일치 결과의 균형적인 재구분(symmetric repartition)을 나타내었고(p=0.25), 이는 상기 2개의 기술이 다른 기술과 비교하 여 보다 불일치하는 결과를 생성하는 경향이 없음을 나타낸다. 최종 연구에서, 상기 샘플에 대한 베타-액틴 발현의 다양한 수준은 반-정량적 RT-PCR 방법에 대해 위 양성을 발생시켰다.
반-정량적 RT-PCR에 대해 규정된 각각의 부류에 대한 TaqMan PCR 데이터의 분산도를 나타내기 위해 상자 도식(box plot)을 이용하였다 (도 4). 2 x 2 분할표에 기초하여 상기 두 방법 사이의 일치는 우수하였으나, 상자 도식은 다양한 부류 사이에 다소의 중첩을 나타내었고, 이는 반-정량적 등급화가 정량적 TaqMan RT-PCR 측정과 완전히 일치하지 않음을 나타낸다. 상기 중첩은 등급화가 변이성을 증가시킬 수 있는 다양한 시간에서 다양한 작업자에 의해 수행된다는 사실이 원인이 될 수 있다. 이러한 점에서, 정량적 TaqMan RT-PCR 분석이 상기 요인에 대해 훨씬 독립적이며, 따라서 더욱 재현성이 높다.
실시예 3: RT-PCR에 의한 파라핀-고정된 조직 (FFPE)의 분석
재료 및 방법
본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 US6,613,518; US6,610,488; US6,428,963; US6,248,535 (Response Genetics Inc.)에 기재된 전매 특허 방법을 이용하여 FFPE 샘플로부터 RNA를 추출하였다. 대안적으로, RNA는 공개된 임의의 적절한 방법에 따라 파라핀-고정된 조직으로부터 수득될 수 있다. 예를들어, 조직 섹션은 d-리모넨(limonene) 또는 또 다른 용해 완충제를 이용하여 파라핀으로부터 분리될 수 있고, 이후 이는 에탄올-기재 용액으로 세척될 수 있다. 이후, 섹션은 단백질분해효소 K로 밤새 처리된 후, 세척되고, 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 RNA가 정제될 수 있다. 서열 목록 번호:3 및 서열 목록 번호:4의 프라이머 및 서열 목록 번호:13의 프로브를 이용하여 샘플에 대해 실시간 Taqman RT-PCR을 수행하였다; 상기 프라이머 및 프로브는 동결 조직에 사용하도록 개발하였다 (실시예 2 참조, 상기).
결과: Mage A3 발현
표 4는 포르말린-고정되고, 파라핀 엠베딩된 (FFPE) 조직에 대해 Ct 값으로 나타낸 결과를 제시한다. Y-축의 수는 인간 종양 샘플 990118-990784를 나타낸다. 또한 상기 분석에 양성 대조군 TCl (Mage3); Gerl (MAGE-A3 흑색종 세포주); 및 CRL 1675 (흑색종 세포주)가 포함되었다. Ct 값은 동결 조직 기재 반-정량적 RT-PCR MAGE-A3 프라이머에 대해 예상된 값보다 높았다. 36-37 Ct의 수준을 본 실험의 목적상 민감도의 가장 높은 한도로 간주하였다. Gerl MAGE-A3 양성 대조군은 31 Ct였고, 이는 민감도 한도 내에 해당되나, 반정량적 RT-PCR 분석으로부터 크게 감소하였다. 이러한 수준에서, 동결 조직에서의 MAGE-A3 정량을 위한 프라이머 및 프로브(표 2, 서열 목록 번호:3 및 서열 목록 번호:4의 엑손 3 MAGE-A3 특이적 프라이머 및 서열 목록 번호:13의 프로브)는 FFPE-종양 샘플 내에서의 MAGE-A3 발현을 검출하기에 충분히 민감하지 않을 수 있다: MAGE-A3 양성이지만 MAGE-A3만을 적은 수준으로 발현하는 샘플은 검출될 수 없다.
FFPE 조직으로부터의 양성 대조군의 샘플을 실험에 포함시켰다: TCl (Mage3) 및 Gerl (MAGE-A3 양성 대조군) 및 CRL 1675. 파라핀 조직으로부터의 RNA를 이용하여 서열 목록 번호:3 및 서열 목록 번호:4의 동결 조직 프라이머 및 서열 목록 번호:13의 프로브를 이용하는 Taqman 정량적 RT-PCR에 의해 인간 종양 990118-990784를 분석하였다. 이러한 분석의 결과를 도 5에 제시하였다.
FFPE 조직에 사용하기 위한 MAGE-A3 TaqMan 프라이머의 재고안
동결 조직 RNA레이터 기재 MAGE-A3 분석(실시예 2에 기재됨)을 위한 앰플리콘의 크기는 100bp를 초과한다. FFPE 샘플에서 발견되는 분해된 RNA에 대한 보다 민감한 결과를 수득하기 위해, 앰플리콘의 크기를 감소시켜 MAGE-A3 분석의 민감성을 증가시키는 새로운 프라이머를 고안하였다 (표 5). 실시예 2 및 3에 기재된 둘 모두의 분석에 대해, 분석의 특이성을 증가시키기 위해 MGB™ (작은 홈 결합) 프로브를 이용하였다. MGB 프로브는 DNA의 작은 홈에 결합하여 극도로 안정적인 듀플렉스를 형성하여, 프라이머 특이성을 증가시킨다.
특이성 및 민감성에 대한 신규한 MAGE-A3 프라이머의 시험
새롭게 고안된 프라이머 세트(표 5)를 Mage-A 유전자족 일원의 cDNA에 대해 시험하였고(도 6a), 여기서 세트 1은 프라이머: 서열 목록 번호:7, 서열 목록 번호:8, 프로브: 서열 목록 번호:15이고; 세트 2는 프라이머: 서열 목록 번호:9, 서열 목록 번호:10, 프로브: 서열 목록 번호:16이고; 세트 3은 프라이머: 서열 목록 번호:11, 서열 목록 번호:12, 프로브: 서열 목록 번호:17이고; 세트 4는 프라이머: 서열 목록 번호:3, 서열 목록 번호:4, 프로브: 서열 목록 번호:13이다.
도 6a에 제시된 바와 같이, 서열 목록 번호:7 및 서열 목록 번호:8의 프라이머는 MAGE-A3 뿐만 아니라 Mage-2 및 Mage-12에 대해서도 높은 Ct 수준을 지닌다. 서열 목록 번호:9 및 서열 목록 번호:10의 프라이머는 MAGE-A3에 대해 높은 Ct 수 준을 지니고, MAGE-A6에 대해 약간의 Ct를 지니지만, 이는 MAGE-A3 발현의 정상 범위를 벗어난다. 서열 목록 번호:11 및 서열 목록 번호:12의 프라이머는 서열 목록 번호:9 및 서열 목록 번호:10 보다 약간 덜 민감하다. 따라서, 본 실험에서, FFPE 조직에서 추가로 시험하기 위해 서열 목록 번호:9 및 서열 목록 번호:10의 프라이머를 선택하였다. 이러한 서열 목록 번호:9 및 서열 목록 번호:10 프라이머를 RNA의 연속 희석액에서 추가로 시험하였고, 이는 보다 적은 희석액까지 우수한 직선 범위를 나타내었고, 이는 상기 프라이머가 우수한 민감성을 지니고 분석에 적합함을 암시한다(도 6b).
MAGE-A3에 대한 동결 분석 대 FFPE TaqMan 분석의 비교
서열 목록 번호:9 및 서열 목록 번호:10의 프라이머, 및 서열 목록 번호:16의 프로브를 이용한 42개의 FFPE 종양 샘플의 분석과 서열 목록 번호:3 및 서열 목록 번호:4의 프라이머, 및 서열 목록 번호:13의 프로브를 이용한 동결 조직에서 달성된 동일한 분석을 비교하였다(도 7). 분석 확실성 수준을 1% gerl (양성 대조군)으로 설정하고, 두개의 분석 사이에 어떠한 일치가 존재하는지 직접 비교하였다. MAGE-A3 동결 조직 분석에서 합치하지 않았던 몇몇 MAGE-A3 양성 환자 MAGE-A3가 있었고; 이는 MAGE-A3를 발현하는 종양 세포의 순도를 증가시키는 종양 영역의 대량 절개에 의해 설명될 수 있었다. 대부분의 희석 정상 세포의 제거는 양성 MAGE-A3 결과를 야기시켰다. FFPE 조직과 RNA 레이터 동결 조직 사이에 0.92의 R2 값(직선 상관관계에 대한 통계 시험)이 관찰되었고, 이는 두 방법 사이의 우수한 상관관계를 암시한다(도 8).
실시예 4 - COBAS™ Taqman MAGE-A3 시험
표 7
COBAS™ TaqMan MAGE-A3 프라이머 및 프로브 서열
E= FAM 리포터 염료, F= 5-메틸 dC, Q= BHQ2 켄처(Quencher), L= 5-프로피닐 dU, P= 포스페이트, I= HEX 리포터
MAGEA3F-646MOD 프로브 서열은 하기의 변형된 누클레오티드를 포함한다 (서열 목록 번호:54):
표 8
COBAS TaqMan 베타-액틴 프라이머 및 프로브 서열
E= FAM 리포터 염료, F= 5-메틸 dC, Q= BHQ2 켄처(Quencher), L= 5-프로피닐 dU, P= 포스페이트, I= HEX 리포터
표 9
샘플 & 대조군 유효 CT 범위
표 10
열 주기 프로파일
MAGE-A3 배타성 실험을 위한 PCR 열 프로파일
표 11
직선성 및 RT-PCR 효율, 분석 민감성 (검출 한도), 방법 상관관계, 및 재현성 실험에 대한 RT-PCR 열 프로파일
다른 MAGE-A족 일원에 비해 MAGE-A3 특이성을 개선시키기 위해 63℃의 상대적으로 높은 어닐링 온도로 수행하였다.
데이터 분석
MAGE-A3 및 β-액틴에 대한 Ct 값을 시험 규정 파일(Test Definition File)에 규정된 분석 파라미터에 기초하여 COBAS™ TaqMan 48 분석기 워크스테이션 (Roche, CA, USA)에서 AMPLILINK™ 3.1 소프트웨어 (Roche, CA, USA)를 이용하여 계산하였다. 유전자 발현에 대한 데이터 분석은 β-액틴 유전자에 비한 MAGE-A3 유전자 발현을 결정하기 위한 하류 계산을 위해 AMPLILINK™로부터 MAGE-A3 및 β-액틴에 대한 Ct 값을 도출함으로써 수행될 것이다. 각각의 수행에 대해, 샘플이 MAGE-A3 양성으로 언급되는 것이 충족되거나 이를 초과하기 위해 필요한 역치 MAGE-A3 발현 수준을 확립시키기 위해 대조군이 포함될 것이다. 양성 대조군으로서, 세포주 GERL로부터의 RNA가 사용된다. GERL RNA를 물중에 1:100 (1% GERL)으로 희석시키고, MAGE-A3 Ct를 결정하였다. 또한, 희석되지 않은 GERL RNA (100% GERL)를 β-액틴 Ct 측정을 위해 희석 없이 시험하였다. (100% GERL 대조군으로부터의 β-액틴 Ct - 1% GERL 대조군으로부터의 MAGE-A3 Ct)의 델타 Ct 값을 계산하 고, 하기의 계산에 기초하여 MAGE-A3의 상대 발현을 결정하였다:
MAGE-A3 역치 발현 = 2Λ(100% GERL로부터의 β-액틴 Ct - 1% GERL로부터의 MAGE-A3 Ct)
파라핀 엠베딩된 샘플에 대해, QIAGEN FFPE 방법을 이용하여 추출된 GERL FFPE 이종이식편으로부터의 RNA가 역치 발현의 확립을 위해 GERL 세포주 RNA로 대체될 것이라는 것을 제외하고는 동일한 대조군 방법이 이용될 것이다.
COBAS™ Taqman MAGE-A3 시험은 다중 반응이므로, MAGE-A3 및 β-액틴 Ct 값은 동일한 반응 튜브로부터 유래된다. 하기 식에 의해 각각의 시험 샘플에 대해 MAGE-A3 상대 발현이 계산된다:
시험 샘플에서의 MAGE-A3 발현 = 2Λ(샘플로부터의 β-액틴 Ct - 샘플로부터의 MAGE-A3 Ct)
시험 샘플에서의 MAGE-A3 발현이 GERL RNA 대조군으로부터 확립된 MAGE-A3 역치 수준의 발현과 동일하거나 이보다 큰 경우, 샘플은 MAGE-A3에 대해 양성으로 언급된다. 시험 샘플에서의 MAGE-A3 발현이 대조군으로부터 확립된 MAGE-A3 역치 수준의 발현보다 적은 경우, 샘플은 MAGE-A3에 대해 음성으로 언급된다.
델타 Ct (β-액틴 Ct - MAGE-A3 Ct)의 계산을 위해, 각각의 표본에 대한 레플리케이트(replicate)로부터의 MAGE-A3 Ct 및 β-액틴 Ct 값의 평균을 취함으로써 MAGE-A3 발현이 결정될 것이다. 하나의 레플리케이트가 시험의 Ct 컷오프보다 적은 MAGE-A3 Ct 또는 β-액틴 Ct를 지니고, 나머지 레플리케이트가 Ct 컷오프보다 큰 MAGE-A3 Ct 또는 β-액틴 Ct를 지니는 경우, 샘플은 재시험될 것이다. 둘 모두의 레플리케이트가 Ct 컷오프보다 큰 β-액틴 Ct를 지니는 경우, 샘플은 β-액틴 Ct 범위 외로 표시되고, 결과가 제공되지 않는다. 둘 모두의 레플리케이트가 MAGE-A3 Ct 컷오프 값보다 큰 MAGE-A3 Ct 값을 지니고, MAGE-A3 발현이 역치를 초과하는 경우, 샘플은 MAGE-A3 Ct 범위 외로 표지되고, 결과가 제공되지 않는다. 이러한 데이터 분석 방법은 하기의 섹션 "방법 상관관계"에 기재되어 있는 방법 상관관계에 대해 수행된 교차-유효성 연구와 일치된다.
COBAS™ Taqman MAGE-A3 시험에 대해, 스트라타진(Stratagene)사로부터의 인간 QPCR 인간 참조 전체 RNA (Human QPCR Human Reference Total RNA, UHR)을 양성 대조군으로 수행하였고, 이러한 널리 특성규명된 RNA에서의 MAGE-A3 발현에 기초하여 발현 역치를 설정하였다. UHR 대조군을 이용하여 적절한 발현 역치를 확립시키기 위해 GERL RNA 대조군과 함께 희석된 UHR이 매 수행시에 시험될 수 있다.
샘플 및 시약 보관 조건
플라스미드, P53 양성 대조군 DNA, 임상 FFPET RNA, UHR, GERL 및 STAC를 포함하는 모든 RNA 및 DNA는 -80℃에서 보관된다. 유니버셜 RNA 마스터 믹스 (Universal RNA Master Mix), 프라이머/프로브 믹스, 보조인자 블렌드 및 샘플 희석제/음성 대조군을 포함하는 모든 시험 시약은 2 내지 8℃에서 보관된다.
MAGE-A3 배타성
MAGE-A족 일원을 함유하는 DNA 플라스미드를 이용한 프라이머 및 프로브의 실험적 시험
목적: 기타 관련 유전자의 유의한 공동-증폭/검출을 배제하면서 MAGE-A3 유전자를 특이적으로 증폭시키기 위한 시험의 능력을 결정하기 위한 것이다.
샘플 재료: MAGE-A3 및 관련 MAGE-A족 일원을 함유하는 플라스미드 DNA가 시험될 것이다 (플라스미드의 세부에 대해서는 실시예 2 참조, 상기).
절차: 관련 유전자가 증폭되고 유의한 양으로 검출되는지 결정하기 위해, MAGE-A족 일원을 함유하는 DNA 플라스미드를 이용한 COBAS TaqMan MAGE-A3 시험의 실험적 시험.
각각의 플라스미드 DNA 샘플을 4개의 상이한 DNA 농도 (20, 2, 0.2 및 0.02 pg)로 삼중으로 시험하였다. 표 10에 나타낸 열 주기 프로파일을 변형시켜 20분 동안 60℃에서의 역전사 단계를 제거하였다. 플라스미드 DNA의 농도를 나노드롭(Nanodrop) 분석에 의해 결정하였다.
분석:
MAGE-A3 플라스미드에 대한 Ct 값을 결정하고, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 및 MAGE-A12 플라스미드로부터의 Ct 값과 비교하였다. MAGE-AX Ct (각각의 관련된 MAGE-A족 일원)에서 MAGE-A3 Ct를 감함으로써 델타 Ct를 계산하였다. 4개의 레플리케이트로부터의 Ct 평균 값을 Ct 및 델타 Ct의 계산을 위해 이용하였다.
허용 기준:
· 델타 Ct 값은 MAGE-A3와, MAGE-A6을 제외한 모든 다른 플라스미드 사이에서 10과 동등하거나 이 이상이어야 한다.
MAGE-A3 배타성 결과
본원의 표 및 도에서, 때에 따라 "MAGE" 대신에 용어 "퀴리(CURIE)"가 사용 되나; 이는 모든 경우에 용어 "MAGE"를 의미하는 것이다.
하기 나타낸 표 12 및 도 17에 시험된 모든 MAGE 플라스미드에 대한 Ct 값을 제시하였다. 증폭이 없는 플라스미드의 경우, 열 주기 프로파일에서 55주기가 존재하였으므로 55의 Ct 값을 할당하였다. 예상되는 바와 같이, 시험된 모든 수준에서 MAGE-A3 Ct가 가장 빨랐다 (표 12 및 도 17). 델타 Ct 값은 MAGE-A3와, MAGE-A6을 제외한 모든 다른 플라스미드 사이에서 10주기 보다 컸다 (표 13 및 도 18). MAGE-A6를 발현하는 환자의 95%가 또한 MAGE-A3를 발현하므로, MAGE-A3와 MAGE-A6 사이의 델타 Ct는 필요치 않았다.
20 pg, 2 pg, 0.2 pg 및 0.02 pg의 플라스미드 DNA 투입량에 대한 MAGE-A3와 MAGE-A6 사이의 델타 Ct는 각각 9.3, 8.4, 7.8 및 8.2였다. FFPE 샘플로부터의 RNA에 대한 대부분의 MAGE-A3 Ct 값이 시험된 FFPE 샘플에 대해 27.2보다 큰 것으로 나타났고, 8.2 주기의 지연이 분석 범위 밖의 Ct 값을 발생시키므로 MAGE-A6으로부터의 신호는 최소일 것이다.
배타성에 대한 허용 기준은 충족되었다.
표 14는 MAGE-A3 배타성 실험 유효성을 나타내고; 대조군 Ct는 유효성 범위에 해당하였다. 실험은 유효성을 통과하였다. 표 15 및 16은 MAGE-A3 배타성 실험 세부를 나타낸다.
직선성 및 RT-PCR 효율
목적: 시험의 직선성 및 역전사 효율을 결정하기 위한 것이다.
샘플 재료: 직선성 및 RT-PCR 효율 연구에 FFPE 이종이식편 GERL RNA의 연속 희석액을 사용하였다.
절차: FFPE 이종이식편 GERL RNA를 100 ng에서 0.1 ng까지 2배 연속 희석시키고, 분석의 직선 범위를 결정하기 위해 COBAS TaqMan MAGE-A3 시험을 이용하여 시험하였다. 10개의 레플리케이트를 각각의 농도 수준에서 시험하였다.
분석:
MAGE-A3 및 β-액틴에 대한 각각의 레플리케이트에 대한 Ct 값을 RNA의 투입 농도의 로그(밑 2)에 대해 작도하여, 선 기울기 및 RT-PCR의 효율을 계산하였다. RT-PCR 증폭 효율을 하기 식을 이용하여 계산하였다:
기울기 = -1/log (밑 2) * 증폭 효율 (AE).
2의 증폭 효율이 100%에 해당된다. 각각의 레플리케이트에 대한 델타 Ct 값 (MAGE-A3 Ct - β-액틴 Ct)을 RNA의 투입 농도의 로그(밑 2)에 대해 작도하여, 델타 Ct 기울기를 결정하였다. MAGE-A3 Ct, β-액틴 Ct 및 델타 Ct에 대한 평균, 표준 편차 및 변동계수% (%CV)를 10개 모두의 레플리케이트에 대해 계산하였다.
허용 기준 직선성:
분석의 직선 범위를 하기 기준을 기초로 하여 결정하였다:
MAGE-A3 Ct CV < 5%
β-액틴 Ct CV < 5%
델타 Ct CV < 20%
-0.10 < 델타 Ct 기울기 < 0.10
R2 > 0.95
허용 기준 RT-PCR 효율:
MAGE-A3 RT-PCR 증폭 효율 > 80 %
β-액틴 RT-PCR 증폭 효율 > 80 %
MAGE-A3와 β-액틴 사이의 RT-PCR 증폭 효율 차이는 10% 이내.
직선성 / RT-PCR 효율 결과
도 20은 MAGE-A3 및 β-액틴에 대한 RNA 투입량 대 Ct 값의 log (밑 2)를 지니는 그래프를 도시한다. COBAS TaqMan MAGE-A3 시험은 R2 값에 기초한 QIAGEN 방법을 이용하여 FFPE 이종이식편으로부터 추출된 100 - 0.1 ng의 GERL RNA의 투입값 사이에서 직선이었다. R2 값은 MAGE-A3에 대해 0.983이었고, β-액틴에 대해 0.998이었다. 이러한 값은 R2 > 0.95의 규격을 초과한다. 또한, 각각의 시험된 수준에서 10개 모두의 레플리케이트에 대한 MAGE-A3 및 β-액틴 Ct 둘 모두는 표 17에 나타낸 바와 같이 CV < 5%의 규격 아래였다.
MAGE-A3 및 β-액틴의 RT-PCR 증폭 효율을 도 19에 나타낸 바와 같이 MAGE-A3 및 β-액틴에 대한 RNA 투입량 대 Ct 값의 log (밑 2)를 작도함으로써 생성된 선의 기울기로부터 계산하였다. RT-PCR의 증폭 효율을 하기 식을 이용하여 계산하였다:
기울기 = -1/Log(밑 2) * 증폭 효율 (AE).
증폭 효율은 MAGE-A3 및 β-액틴 각각에 대해 2.14 (107%) 및 2.06 (103.1%)이었다. AE는 MAGE-A3 및 β-액틴에 대해 80%의 규격을 초과하였다. 두 유전자 사이의 AE의 차이는 3.9%였고, 이 또한 + 10 %의 규격 내에 해당하였다.
도 20은 MAGE-A3와 β-액틴 사이의 RNA 투입량 대 델타 Ct의 로그 (밑 2)를 지닌 그래프를 도시한다. 델타 Ct 기울기는 0.0474였고, 이는 -0.10 내지 0.10의 기울기 규격에 해당된다. 시험된 2개의 가장 낮은 수준의 RNA 투입량(0.2 & 0.1 ng)에서, 델타 Ct에 대한 %CV는 20%의 규격을 초과하였다. 그 결과로, 마지막 두개의 RNA 투입량 수준은 상기 분석의 직선 범위에 포함되지 않았다. GERL 이종이식편 RNA를 이용하는 분석의 직선 범위는 100 ng - 0.39 ng의 RNA이다.
이러한 데이터에 기초하여, 직선성 및 RT-PCR 효율에 대한 허용 기준이 충족되었다.
표 18은 MAGE-A3 및 β-액틴의 RT-PCR 증폭 효율을 나타내고; 표 19는 직선성 / RT-PCR 효율 실험 유효성을 나타낸다. 대조군 Ct는 유효 범위에 해당되었다. 실험은 유효성 통과되었다.
표 20, 21 및 22는 직선성 / RT-PCR 효율 실험 세부를 제공한다.
분석 민감성 (검출 한도)
목적: MAGE-A3 유전자 발현이 95% 이상의 시간에서 COBAS™ TaqMan MAGE-A3 시험에 의해 검출될 수 있는 가장 낮은 RNA 농도를 확립하기 위한 것이다.
샘플 재료: 추가의 DNase 단계를 지니는 QIAGEN RNeasy FFPE 키트를 이용하여 FFPE 이종이식편 조직으로부터 분리된 RNA를 이용한 분석 민감성을 평가하였다. 두개의 상이한 RNA 세포주로부터 분리된 두개의 FFPE 이종이식편으로부터 RNA를 추출하였다. 하나의 이종이식편을 MAGE-A3를 발현하는 GERL로 언급하였다. 나머지 이종이식편을 MAGE-A3를 발현하지 않는 STAC으로 언급하였다. 95% STAC RNA의 백 그라운드에서의 5% GERL RNA, 99% STAC RNA의 백그라운드에서의 1% GERL RNA, 및 99.5% STAC RNA의 백그라운드에서의 0.5% GERL RNA를 시험하기 위한 혼합 실험을 위해 상기 두 이종이식편으로부터의 RNA를 이용하였다. 상기 GERL 및 STAC RNA의 3개의 상이한 혼합물을 4개의 상이한 전체 RNA 수준으로 시험하였다.
절차: GERL 및 STAC RNA 혼합물의 4개의 독립적인 희석 시리즈로부터 24개의 시험 결과를 발생시켰다. 4개 수준의 RNA 투입량 (100, 50, 25 및 12.5 ng)을 시험하였다. 각각의 수준에 대해 6개의 레플리케이트를 시험하였다.
분석: 분석의 유효 범위에 해당되는 Ct 값에 기초하여 MAGE-A3에 대해 > 95%의 확실성이 수득되는 RNA의 수준을 결정하였다.
허용 기준: 1% GERL의 검출에 대해 LOD < 50 ng 투입 전체 RNA
검출 결과 한도
적중률 (Hit rate)을 본 발명에 기재된 직선성 실험을 기초로 한 분석의 직선 범위내의 Ct 값으로 정의하였다. Ct 범위의 한도를 결정하기 위해, 직선성 연구 (직선 범위의 한도)로부터의 0.39 ng의 RNA 투입 수준으로부터의 MAGE-A3 및 β-액틴 Ct의 평균을 구하고, MAGE-A3 및 β-액틴 Ct에 대해 95% 신뢰 구간을 계산하였다. 이러한 계산을 기초로 하여, 적중으로 간주되는 샘플에 대해서는 MAGE-A3 Ct는 35.2와 동일하거나 이보다 적어야 하고, β-액틴 Ct는 32.1보다 적어야 한다. MAGE-A3 및 β-액틴에 대한 적중률은 표 23 및 표 25에 제시되어 있다. MAGE-A3 및 β-액틴에 대한 적중률 백분율은 표 24 및 표 26에 제시되어 있다.
검출 한도는 99% STAC RNA에 희석된 1% GERL RNA가 분석의 유효 범위 내에 해당되는 MAGE-A3 Ct에 기초한 시간의 > 95%로 검출되는 50 ng의 투입 RNA이다. 분석 민감성 (검출 한도)에 대한 허용 기준이 충족되었다.
검출 실험 유효성의 한도. MAGE 유전자 FAM 대조군 Ct를 표 27에 나타내었고; β-액틴 HEX 대조군 Ct를 표 28에 나타내었다. 대조군 Ct는 유효 범위에 해당되었다. 실험은 유효성 통과되었다.
표 29; 표 30; 및 표 31은 검출 실험 세부의 한도를 나타낸다.
방법 상관관계
목적: 임상 FFPET 샘플에서의 COBAS™ TaqMan MAGE-A3 시험 및 프로토타입 분석의 상관관계 및 교차 유효성을 확인하기 위한 것이다.
샘플 재료: 적절한 품질의 약 120개의 임상 FFPET 샘플을 COBAS TaqMan MAGE-A3 시험 및 프로토타입 분석을 이용하여 분석하였다.
절차: 추가의 DNase 단계를 지니는 QIAGEN™ RNeasy FFPE 키트를 이용하여 RNA를 추출하였다. 각각의 FFPET 샘플에 대해 1회의 추출을 수행하고, 샘플을 나누고, 하나의 분취량을 COBAS TaqMan MAGE-A3 시험에 의해 시험하고, 하나의 분취량을 프로토타입 분석을 이용하여 시험하였다. MAGE-A3 발현 역치를 확립시키기 위해 두 분석에 대해 동일한 대조군을 수행하였다.
분석:
각각의 샘플에 대한 MAGE-A3 콜(call)을 GERL RNA 대조군에 의해 생성된 MAGE-A3 발현 역치를 기초로 하여 양성 또는 음성으로 보고하였다. RMS 시험의 비교기 백분율 합치 값에 의해 양성 및 음성을 확립하기 위해 두 분석 사이의 결과를 비교하였다.
백분율 합치 계산을 위해, 동결 조직에 대해 2 단계 RT-PCR 분석을 이용하여 기존에 수득된 결과를 불일치 결과를 해소하기 위해 사용하였다.
비교기 백분율 합치에 의한 양성 = MAGE-A3 발현자(expressor)로 정확히 언급된 샘플의 # / 시험된 샘플의 # 수 * 100
비교기 백분율 합치에 의한 음성 = MAGE-A3 비-발현자로 정확히 언급된 샘플의 # / 시험된 샘플의 # 수 * 100
허용 기준:
비교기 백분율 합치에 의한 양성 > 85%
비교기 백분율 합치에 의한 음성 > 85%
NSCLC 임상 시험으로부터의 임상 표본의 교차-유효성을 COBAS TaqMan MAGE-A3 시험의 비교기 백분율 합치에 의해 양성 및 음성을 평가하기 위해 수행하였다. 본 연구를 위한 비교기로서 MAGE-A3 프로토타입 RT-PCR 분석을 이용하였다. 결과 사이의 불일치의 경우, 수작업적으로 미세절제되지 않은 신선한 동결 조직으로서 동일한 샘플로부터 생성된 기존의 결과를 불일치 결과 해소를 위해 사용되었다.
DNase I 분해 단계를 지니는 QIAGEN RNeasy FFPE 방법을 이용하여, 131개의 수작업으로 미세절제된 임상 FFPE 표본으로부터 RNA를 추출하였다. 이후, 각각의 샘플을 RMS COBAS TaqMan MAGE-A3 시험 및 RGI 프로토타입 분석을 이용하는 시험을 위해 RMS와 RGI 사이에 동등하게 분배하였다. 데이터 분석을 섹션 3에 기재된 바와 같이 수행하였고, 이러한 보고에서 MAGE-A3 발현 역치가 1% GERL RNA 대조군에 기초하여 결정되었다.
방법 상관관계 / 교차 유효성 결과
131개의 NSCLC FFPE 임상 표본으로부터 RNA 샘플을 추출하였다. 7개의 샘플은 RGI의 RT 대조군 반응에 기초하여 25%를 초과하는 유전체 DNA 오염을 지녔었다. 이러한 샘플을 비교기 백분율 합치 계산에 의한 양성 및 음성으로부터 제외시켰다. 추가로, COBAS 분석으로부터 6개 및 프로토타입 분석으로부터 15개의 불확실한 결과가 존재하였고, 두 샘플중 어느 것도 분석의 직선 범위 외의 β-액틴 Ct에 기초하여 충분한 재료를 지니지 않았거나, 샘플에 대한 MAGE-A3 발현은 역치를 초과하였으나, MAGE-A3 Ct가 직선 범위 외였다. 결과로서, 두개의 상이한 시험을 비교하기 위한 교차-유효성에 사용될 수 있는 데이터를 지니는 COBAS 분석으로부터의 117개의 결과 및 프로토타입 분석으로부터의 108개의 결과가 존재하였다(표 32). COBAS 분석 및 프로토타입 분석 사이의 전체 일치는 98/107 또는 91.6%였다(표 33). "황금 기준(gold standard)"으로서 프로토타입 분석을 이용한 COBAS 시험의 비교기 백분율 합치에 의한 양성은 59/64 또는 92.2%인 반면, 비교기 백분율 합치에 의한 음성은 39/43 또는 90.7%였다(표 33). COBAS 분석 및 프로토타입 분석 사이의 불일치 결과의 경우, 불일치를 해소하기 위해 동결 조직 샘플 분석에 의해 생성된 결과를 사용하였다(표 34).
COBAS 분석과 프로토타입 분석 사이에 불일치 결과를 지니는 9개의 샘플 중, 7개가 COBAS 분석과 동결 분석 사이에 일치를 나타내었고, 2개가 프로토타입 분석과 동결 분석 사이에 일치를 나타내었다. 결과로서, 불일치를 해소하기 위해 동결 결과를 이용하는 경우, COBAS 분석의 비교기 백분율 합치에 의한 양성은 63/64 또는 98.4%로 증가하고, 비교기 백분율 합치에 의한 음성은 42/43 또는 97.7%로 증가한다(표 34).
COBAS TaqMan MAGE-A3 시험의 비교기 백분율 합치에 의한 양성 및 음성은 85%와 동일하거나 이를 초과한다. 비교기 백분율 합치에 의한 양성 및 음성에 대한 허용 기준이 충족되었다.
방법 상관관계 / 교차 유효성 대조군 유효성
실험 대조군 MAGE 유전자 Ct를 표 30에 제시하고; 실험 대조군 β-액틴 유전자 Ct를 표 31에 제시하였다. 대조군 Ct는 유효 범위에 속하였다. 실험은 유효성 통과되었다.
방법 상관관계 / 교차 유효성 실험 세부는 표 37, 38 및 39에 제시하였다.
재현성
목적: 다수의 시약 로트(lot) 및 다수의 기계를 이용하여 수일 동안에 다수의 작업자에 의해 생성된 시험 교차 데이터 세트의 재현성 및 견실성(robustness)을 입증하는 것이다.
샘플 재료:
수작업으로 미세절제된 NSCLC FFPE 임상 샘플로부터의 12개의 샘플을 DNase I 분해 단계를 지닌 QIAGEN RNeasy FFPE 키트를 이용하여 추출하고, COBAS TaqMan MAGE-A3 시험을 이용하여 증폭하고/검출하였다.
절차:
본 연구는 샘플당 두개의 레플리케이트로 구성되었다.
두개의 시약 로트를 QIAGEN 샘플 제조물 및 TaqMan 시약에 대해 시험하였다.
두개의 상이한 COBAS TaqMan 48 분석기를 이용하여 두 상이한 날에 두명의 상이한 작업자에 의해 실험을 수행하였다.
분석:
각각의 임상 표본에 대한 MAGE-A3 발현을 두개의 RT-PCR 레플리케이트의 평균으로부터 계산하였다. 또한, 각각의 샘플로부터 각각의 레플리케이트에 대한 MAGE-A3 콜을 평가하였다. 재현성은 또한 MAGE-A3와 β-액틴 유전자 사이의 델타 Ct 값으로부터 계산된 MAGE-A3 유전자 발현의 비교를 기초로 하였다. 상이한 시약 로트, 기계, 작업자 및 상이한 날짜에 시험된 샘플에 대한 MAGE-A3 발현 사이의 비교를 피어슨 상관관계(Pearson Correlation)를 이용하여 수행하였다.
허용 기준:
수행 사이 및 수행 레플리케이트 내에서 시험의 검출 한도가 적어도 3X(3% GERL)인 샘플 사이에 > 90%의 MAGE-A3 콜 일치.
샘플간 피어슨 상관관계 > 90%
재현성 결과
MAGE-A3 발현 역치는 환자가 MAGE-A3 특이적 요법제를 투여 받게되는 경우 결정되는 MAGE-A3 발현의 컷오프 수준이다. 역치와 동등하거나 이를 초과하는 MAGE-A3 발현을 지닌 환자는 MAGE-A3 양성 콜을 지니고, 치료를 받았다. 역치 미만의 MAGE-A3 발현을 지니는 환자는 MAGE-A3 음성 콜을 지니고, 치료를 받지 않았 다. 시험의 재현성 연구는 하기 식을 이용한 각각의 표본에 대한 MAGE-A3 발현 콜을 기초로 하였다:
MAGE-A3 발현 역치 = 2Λ(100% GERL 대조군의 β-액틴 Ct - 1% GERL 대조군의 MAGE-A3 Ct)
임상 표본에 대한 MAGE-A3 발현 = 2Λ(표본의 β-액틴 Ct - 표본의 MAGE-A3 Ct)
또한, 피어슨 적률 상관계수(Pearson Product-Moment Correlation Coefficient)(r)에 의해 두 수행 사이의 MAGE-A3 발현의 상관관계를 비교함으로써 분석 재현성을 평가하였다. 표 40 및 표 37은 β-액틴과 MAGE-A3 사이의 델타 Ct에 기초하여 수행 1 및 2로 시험된 GERL RNA 대조군으로부터 생성된 MAGE-A3 발현 역치를 나타낸다. 표 41 및 표 43은 수행 1 및 2로 시험된 12개의 표본 각각에 대한 MAGE-A3 콜을 나타낸다.
표 42는 수행 2 - GERL RNA 대조군으로부터의 MAGE-A3 발현 역치를 나타내고; 표 43은 수행 2 - 재현성 표본에 대한 MAGE-A3 발현 콜을 나타낸다.
시험된 모든 샘플에 대해, 두 수행 사이에 MAGE-A3 발현 콜에 대해 100% 상관관계가 존재하였다. 또한, 피어슨 적률 상관계수(r)에 의한 두 수행 사이의 MAGE-A3 발현의 상관관계를 비교함으로써 분석 재현성을 평가하였다. 두 상이한 수행 사이의 MAGE-A3 발현 비교시 피어슨 상관계수는 0.987이었다. 재현성에 대한 허용 기준이 충족되었다.
표 44는 재현성 유효성을 나타낸다; 대조군 Ct는 유효 범위에 속하였다. 실험은 유효성 통과되었다.
재현성 실험 세부를 표 45, 46 및 47에 제시하였다.
표 1
표 2
표 3
표 4
표 5
표 7
표 8
표 9
표 10
표 11
표 12
표 13
표 14
표 15 및 16
표 17
표 18
표 19
표 20, 21 및 22
표 23
표 24
표 25
표 26
표 27
표 28
표 29, 30 및 31
표 32
표 33
표 34
표 35
표 36
표 37, 38 및 39
표 40
표 41
표 42
표 43
표 44
표 45, 46 및 47
SEQUENCE LISTING
<110> GlaxoSmithKline Biologicals SA
COCHE, Thierry
GRUSELLE, Olivier
<120> Method
<130> VB62023 WO
<140> PCT/EP2007/056219
<141> 2007-06-21
<150> GB0612342.6
<151> 2006-06-21
<160> 57
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
tggaggacca gaggccccc 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MAGE-A3 reverse primer
<400> 2
ggacgattat caggaggcct gc 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gtcgtcggaa attggcagta t 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MAGE-A3 reverse primer
<400> 4
tggggtccac ttccatcag 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
taagcctttg ttagagcctc caa 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MAGE-A3 reverse primer
<400> 6
ggagagaggg agcatgtgag a 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
tgctgggtga caatcagatc at 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MAGE-A3 reverse primer
<400> 8
cgccctctct tgcgattatg 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
ccaacatttc gtgcaggaa 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MAGE-A3 reverse primer
<400> 10
ccttggaccc cacaggaa 18
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
tgtcgtcgga aattggcagt at 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MAGE-A3 reverse primer
<400> 12
caaagaccag ctgcaaggaa ct 22
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> MAGE-A3 reverse primer
<400> 13
aaagcttcca gttcctt 17
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
ttccattcag tactcag 17
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
caggaggcct gcctt 15
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
ttcataacat gcaggatcac 20
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
cctgtgatct tcagcaaa 18
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
ggcatcgtga tggactccg 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta actin reverse primer
<400> 19
gctggaaggt ggacagcga 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
ctggaacggt gaaggtgaca 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta actin reverse primer
<400> 21
cggccacatt gtgaactttg 20
<210> 22
<211> 14
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
tgctcgctcc aacc 14
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val
1 5
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala
1 5 10
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg
1 5 10
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr
1 5 10
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser
1 5 10 15
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr
1 5 10
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CpG 1826
<400> 30
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CpG 1758
<400> 31
tctcccagcg tgcgccat 18
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CpG oligonucleotide
<400> 32
accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CpG 2006, CpG 7909
<400> 33
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CpG 1668
<400> 34
tccatgacgt tcctgatgct 20
<210> 35
<211> 1353
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence encoding fusion protein of
Protein D fragment, Mage3 fragment, and histidine
tail
<400> 35
atggatccaa aaactttagc cctttcttta ttagcagctg gcgtactagc aggttgtagc 60
agccattcat caaatatggc gaatacccaa atgaaatcag acaaaatcat tattgctcac 120
cgtggtgcta gcggttattt accagagcat acgttagaat ctaaagcact tgcgtttgca 180
caacaggctg attatttaga gcaagattta gcaatgacta aggatggtcg tttagtggtt 240
attcacgatc actttttaga tggcttgact gatgttgcga aaaaattccc acatcgtcat 300
cgtaaagatg gccgttacta tgtcatcgac tttaccttaa aagaaattca aagtttagaa 360
atgacagaaa actttgaaac catggatctg gaacagcgta gtcagcactg caagcctgaa 420
gaaggccttg aggcccgagg agaggccctg ggcctggtgg gtgcgcaggc tcctgctact 480
gaggagcagg aggctgcctc ctcctcttct actctagttg aagtcaccct gggggaggtg 540
cctgctgccg agtcaccaga tcctccccag agtcctcagg gagcctccag cctccccact 600
accatgaact accctctctg gagccaatcc tatgaggact ccagcaacca agaagaggag 660
gggccaagca ccttccctga cctggagtcc gagttccaag cagcactcag taggaaggtg 720
gccgaattgg ttcattttct gctcctcaag tatcgagcca gggagccggt cacaaaggca 780
gaaatgctgg ggagtgtcgt cggaaattgg cagtatttct ttcctgtgat cttcagcaaa 840
gcttccagtt ccttgcagct ggtctttggc atcgagctga tggaagtgga ccccatcggc 900
cacttgtaca tctttgccac ctgcctgggc ctctcctacg atggcctgct gggtgacaat 960
cagatcatgc ccaaggcagg cctcctgata atcgtcctgg ccataatcgc aagagagggc 1020
gactgtgccc ctgaggagaa aatctgggag gagctgagtg tgttagaggt gtttgagggg 1080
agggaagaca gtatcttggg ggatcccaag aagctgctca cccaacattt cgtgcaggaa 1140
aactacctgg agtaccggca ggtccccggc agtgatcctg catgttatga attcctgtgg 1200
ggtccaaggg ccctcgttga aaccagctat gtgaaagtcc tgcaccatat ggtaaagatc 1260
agtggaggac ctcacatttc ctacccaccc ctgcatgagt gggttttgag agagggggaa 1320
gagggcggtc atcaccatca ccatcaccat taa 1353
<210> 36
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of fusion protein of Protein D
fragment, Mage3 fragment, and histidine tail
<400> 36
Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu
1 5 10 15
Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys
20 25 30
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro
35 40 45
Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp
50 55 60
Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val
65 70 75 80
Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe
85 90 95
Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr
100 105 110
Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met
115 120 125
Asp Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu Glu
130 135 140
Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala Thr
145 150 155 160
Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val Thr
165 170 175
Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser Pro
180 185 190
Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp Ser
195 200 205
Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr
210 215 220
Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys Val
225 230 235 240
Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro
245 250 255
Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln Tyr
260 265 270
Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu Val
275 280 285
Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr Ile
290 295 300
Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn
305 310 315 320
Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile
325 330 335
Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu Leu
340 345 350
Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly Asp
355 360 365
Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu
370 375 380
Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Trp
385 390 395 400
Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His His
405 410 415
Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu His
420 425 430
Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Gly Gly His His His His His
435 440 445
His His
450
<210> 37
<211> 403
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of fusion protein of NS1-Mage3
and histidine tail
<400> 37
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp
1 5 10 15
His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe
20 25 30
Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser
35 40 45
Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala Gly Lys Gln Ile
50 55 60
Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Met Asp Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu
85 90 95
Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala
100 105 110
Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val
115 120 125
Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser
130 135 140
Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp
145 150 155 160
Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser
165 170 175
Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys
180 185 190
Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln
210 215 220
Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu
225 230 235 240
Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr
245 250 255
Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp
260 265 270
Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile
275 280 285
Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu
290 295 300
Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly
305 310 315 320
Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu
325 330 335
Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu
340 345 350
Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His
355 360 365
His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu
370 375 380
His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Gly Gly His His His His
385 390 395 400
His His His
<210> 38
<211> 1212
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding fusion protein of
NS1-Mage3 and histidine tail
<400> 38
atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa 60
cgagttgcag accaagaact aggtgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag 120
aaatccctaa gaggaagggg cagcactctt ggtctggaca tcgagacagc cacacgtgct 180
ggaaagcaga tagtggagcg gattctgaaa gaagaatccg atgaggcact taaaatgacc 240
atggatctgg aacagcgtag tcagcactgc aagcctgaag aaggccttga ggcccgagga 300
gaggccctgg gcctggtggg tgcgcaggct cctgctactg aggagcagga ggctgcctcc 360
tcctcttcta ctctagttga agtcaccctg ggggaggtgc ctgctgccga gtcaccagat 420
cctccccaga gtcctcaggg agcctccagc ctccccacta ccatgaacta ccctctctgg 480
agccaatcct atgaggactc cagcaaccaa gaagaggagg ggccaagcac cttccctgac 540
ctggagtccg agttccaagc agcactcagt aggaaggtgg ccgaattggt tcattttctg 600
ctcctcaagt atcgagccag ggagccggtc acaaaggcag aaatgctggg gagtgtcgtc 660
ggaaattggc agtatttctt tcctgtgatc ttcagcaaag cttccagttc cttgcagctg 720
gtctttggca tcgagctgat ggaagtggac cccatcggcc acttgtacat ctttgccacc 780
tgcctgggcc tctcctacga tggcctgctg ggtgacaatc agatcatgcc caaggcaggc 840
ctcctgataa tcgtcctggc cataatcgca agagagggcg actgtgcccc tgaggagaaa 900
atctgggagg agctgagtgt gttagaggtg tttgagggga gggaagacag tatcttgggg 960
gatcccaaga agctgctcac ccaacatttc gtgcaggaaa actacctgga gtaccggcag 1020
gtccccggca gtgatcctgc atgttatgaa ttcctgtggg gtccaagggc cctcgttgaa 1080
accagctatg tgaaagtcct gcaccatatg gtaaagatca gtggaggacc tcacatttcc 1140
tacccacccc tgcatgagtg ggttttgaga gagggggaag agggcggtca tcaccatcac 1200
catcaccatt aa 1212
<210> 39
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of fusion protein of
CLytA-Mage3 and histidine tail
<400> 39
Met Lys Gly Gly Ile Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys
1 5 10 15
Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr
20 25 30
Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp
35 40 45
Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp
50 55 60
Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val
65 70 75 80
Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met
85 90 95
Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr
100 105 110
Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Leu Ala Ser Met
115 120 125
Leu Asp Met Asp Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu
130 135 140
Gly Leu Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala
145 150 155 160
Pro Ala Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val
165 170 175
Glu Val Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro
180 185 190
Gln Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro
195 200 205
Leu Trp Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly
210 215 220
Pro Ser Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser
225 230 235 240
Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala
245 250 255
Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn
260 265 270
Trp Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu
275 280 285
Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His
290 295 300
Leu Tyr Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu
305 310 315 320
Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu
325 330 335
Ala Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp
340 345 350
Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile
355 360 365
Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn
370 375 380
Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu
385 390 395 400
Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val
405 410 415
Leu His His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro
420 425 430
Pro Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Gly Gly His His
435 440 445
His His His His His
450
<210> 40
<211> 1362
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding fusion protein of
CLytA-Mage3 and histidine tail
<400> 40
atgaaagggg gaattgtaca ttcagacggc tcttatccaa aagacaagtt tgagaaaatc 60
aatggcactt ggtactactt tgacagttca ggctatatgc ttgcagaccg ctggaggaag 120
cacacagacg gcaactggta ctggttcgac aactcaggcg aaatggctac aggctggaag 180
aaaatcgctg ataagtggta ctatttcaac gaagaaggtg ccatgaagac aggctgggtc 240
aagtacaagg acacttggta ctacttagac gctaaagaag gcgccatggt atcaaatgcc 300
tttatccagt cagcggacgg aacaggctgg tactacctca aaccagacgg aacactggca 360
gacaggccag aattggccag catgctggac atggatctgg aacagcgtag tcagcactgc 420
aagcctgaag aaggccttga ggcccgagga gaggccctgg gcctggtggg tgcgcaggct 480
cctgctactg aggagcagga ggctgcctcc tcctcttcta ctctagttga agtcaccctg 540
ggggaggtgc ctgctgccga gtcaccagat cctccccaga gtcctcaggg agcctccagc 600
ctccccacta ccatgaacta ccctctctgg agccaatcct atgaggactc cagcaaccaa 660
gaagaggagg ggccaagcac cttccctgac ctggagtctg agttccaagc agcactcagt 720
aggaaggtgg ccaagttggt tcattttctg ctcctcaagt atcgagccag ggagccggtc 780
acaaaggcag aaatgctggg gagtgtcgtc ggaaattggc agtacttctt tcctgtgatc 840
ttcagcaaag cttccgattc cttgcagctg gtctttggca tcgagctgat ggaagtggac 900
cccatcggcc acgtgtacat ctttgccacc tgcctgggcc tctcctacga tggcctgctg 960
ggtgacaatc agatcatgcc caagacaggc ttcctgataa tcatcctggc cataatcgca 1020
aaagagggcg actgtgcccc tgaggagaaa atctgggagg agctgagtgt gttagaggtg 1080
tttgagggga gggaagacag tatcttcggg gatcccaaga agctgctcac ccaatatttc 1140
gtgcaggaaa actacctgga gtaccggcag gtccccggca gtgatcctgc atgctatgag 1200
ttcctgtggg gtccaagggc cctcattgaa accagctatg tgaaagtcct gcaccatatg 1260
gtaaagatca gtggaggacc tcgcatttcc tacccactcc tgcatgagtg ggctttgaga 1320
gagggggaag agggcggtca tcaccatcac catcaccatt aa 1362
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<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 41
gtcatcaaaa attacaagcg ctgctttcct gtgatcttcg gcaaagcctc cgagtccctg 60
aagatgatct ttggcattga cgtgaaggaa gtggacccca 100
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 42
gtcataaaaa attatgaaga ccacttccct ttgttgttta gtgaagcctc cgagtgcatg 60
ctgctggtct ttggcattga tgtaaaggaa gtggatccca 100
<210> 43
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 43
gtcatcaaaa attatgagga ctactttcct gagatattta gggaagcctc tgtatgcatg 60
caactgctct ttggcattga tgtgaaggaa gtggacccca 100
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<211> 101
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 44
gtcatcagaa attttccagg acttctttcc tgtgatcttc agcaaagcct ccgagtactt 60
gcagctggtc tttggcatcg aggtggtgga agtggtccgc a 101
<210> 45
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 45
gtcctcagaa attgccagga cttctttccc gtgatcttca gcaaagcctc cgagtacttg 60
cagctggtct ttggcatcga ggtggtggaa gtggtcccca 100
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 46
gtcatcaaaa attacaagcg ctgctttcct gtgatcttcg gcaaagcctc cgagtccctg 60
aagatgatct ttggcattga cgtgaaggaa gtggaccccg 100
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<211> 101
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gtcatcaaaa attacaagca ctagtttcct tgtgatctat ggcaaagcct cagagtgcat 60
gcaggtgatg tttggcattg acatgaagga agtggacccc g 101
<210> 48
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 48
gtcatcaaaa attacaagaa ccactttcct gatatcttca gcaaagcctc tgagtgcatg 60
caggtgatct ttggcattga tgtgaaggaa gtggaccctg 100
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 49
gtcgtcggaa attggcagta cttctttcct gtgatcttca gcaaagcttc cgattccttg 60
cagctggtct ttggcatcga gctgatggaa gtggacccca 100
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gtcgtcggaa attggcagta tttctttcct gtgatcttca gcaaagcttc cagttccttg 60
cagctggtct ttggcatcga gctgatggaa gtggacccca 100
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<213> Homo sapiens
<400> 51
ccaagcagca ctcagtagga aggtggccga gttggttcat tttctgctcc tcaagtatcg 60
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tttctttcct gtgatcttca gcaaagcttc cagttcctgc agctggtctt tggcatcgag 180
ctgatggaag tggaccccat cggccacttg tacatctttg ccacctgcct gggcctctcc 240
tacgatggcc tgctgggtga caatcagatc atgcccaagg caggcctcct gataatcgtc 300
ctggccataa tcgcaagaga gggcgactgt gcccctgagg agaaaatctg ggaggagctg 360
agtgtgttag aggtgtttga ggggagggaa gacagtatct tgggggatcc caagaagctg 420
ctcacccaac atttcgtgca ggaaaactac ctggagtacc ggcaggtccc cggcagtgat 480
cctgcatgtt atgaattcct gtggggtcca agggccctcg ttgaaaccag ctatgtgaaa 540
gtcctgcacc atatggtaaa gatcagtgga ggacctcaca tttcctaccc acccctgca 599
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 52
ccaagcagca ctcagtagga aggtggccaa gttggttcat tttctgctcc tcaagtatcg 60
agccagggag ccggtcacaa aggcagaaat gctggggagt gtcgtcggaa attggcagta 120
cttctttcct gtgatcttca gcaaagcttc cgattccttg cagctggtct ttggcatcga 180
gctgatggaa gtggacccca tcggccacgt gtacatcttt gccacctgcc tgggcctctc 240
ctacgatggc ctgctgggtg acaatcagat catgcccaag acaggcttcc tgataatcat 300
cctggccata atcgcaaaag agggcgactg tgcccctgag gagaaaatct gggaggagct 360
gagtgtgtta gaggtgtttg aggggaggga agacagtatc ttcggggatc ccaagaagct 420
gctcacccaa tatttcgtgc aggaaaacta cctggagtac cggcaggtcc ccggcagtga 480
tcctgcatgc tatgagttcc tgtggggtcc aagggccctc attgaaacca gctatgtgaa 540
agtcctgcac catatggtaa agatcagtgg aggacctcgc atttcctacc cactcctgca 600
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr
1 5
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> equivalent unmodified nucleotides to the modified
nucleotides contained in MAGEA3F-646MOD probe
sequence
<400> 54
tctttcctgt gatcttcagc aaagcttc 28
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 55
gagcgcggct acagctt 17
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence for Homo sapiens
beta-actin gene
<400> 56
tccttaatgt cacgcacgat tt 22
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe sequence for Homo sapiens beta-actin gene,
which the dyes have been removed
<400> 57
accaccacgg ccgagcgg 18
Claims (33)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열 목록 번호:11 및 서열 목록 번호:12의 프라이머쌍으로 구성된 프라이머 세트.
- (a) 5'-말단에 형광 리포터 염료 및 3'-말단에 비-형광 켄처(quencher)를 갖는, 서열 목록 번호:17의 누클레오티드 서열; 또는 (b) 서열 목록 번호:53으로 구성된 프로브.
- 삭제
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- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- (ⅰ) 서열 목록 번호:11로 구성된 프라이머; (ⅱ) 서열 목록 번호:12로 구성된 프라이머, 및 5'-말단에 6-카르복시플루오레세인 및 3'-말단에 비-형광 켄처를 갖는 서열 목록 번호:17로 구성된 프로브를 포함하는 키트.
- (ⅰ) 서열 목록 번호:11로 구성된 프라이머; (ⅱ) 서열 목록 번호:12로 구성된 프라이머, 및 서열 목록 번호:53으로 구성된 프로브를 포함하는 키트.
- 포르말린-고정되고, 파라핀-엠베딩(Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded, FFPE)된 종양 조직 샘플로부터 수득되거나 유래된 분리된 누클레오티드 서열을 서열 목록 번호:11 및 서열 목록 번호:12로 구성된 프라이머 세트, 및 제 5항에 따른 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 FFPE 종양 조직에서 MAGE-A3의 발현을 검출하는 방법.
- 제15항에 있어서, MAGE-A3가 상기 샘플에서 발현되는지 평가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 누클레오티드 서열을 증폭시키는 단계, 및 증폭된 누클레오티드 서열을 샘플 내에서 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 삭제
- 제 15항에 있어서, 상기 분리된 누클레오티드 서열이 엄격한 조건하에서 프라이머 또는 프로브에 하이브리드되는지의 여부를 결정함으로써 상기 종양 조직이 MAGE-A3 양성인지의 여부를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 19항에 있어서, 상기 누클레오티드 서열이 프라이머 또는 프로브에 하이브리드되는지의 여부를 검출하기 위해 인 시츄 하이브리드화(in situ hybridisation)를 이용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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| Mol Cell Biol. 19(11):7327-35 * |
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