EA016347B1 - Способ выявления и диагностики злокачественного новообразования, включающий праймеры и зонды для специфичного выявления маркера mage-a3 - Google Patents
Способ выявления и диагностики злокачественного новообразования, включающий праймеры и зонды для специфичного выявления маркера mage-a3 Download PDFInfo
- Publication number
- EA016347B1 EA016347B1 EA200802356A EA200802356A EA016347B1 EA 016347 B1 EA016347 B1 EA 016347B1 EA 200802356 A EA200802356 A EA 200802356A EA 200802356 A EA200802356 A EA 200802356A EA 016347 B1 EA016347 B1 EA 016347B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- mace
- probe
- primers
- rna
- primer
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к праймерам и зондам, специфичным в отношении MAGE-A3, для применения в новых диагностических наборах и способах. Изобретение также относится к иммунотерапевтическому лечению определенных популяций пациентов со злокачественными новообразованиями, страдающих от MAGE-A3-экспрессирующих опухолей.
Description
Изобретение относится к диагностическому способу выявления МАСЕ-А3. Изобретение также относится к иммунотерапевтическому лечению популяций пациентов, страдающих от МАСЕ-А3экспрессирующих опухолей, при котором пациенты, имеющие МАСЕ-А3-экспрессирующую опухолевую ткань, идентифицированы с применением диагностического способа, описанного здесь.
Предшествующий уровень техники
Семейство генов МАСЕ (антигена меланомы) было изначально идентифицировано благодаря обнаружению в цитотоксических лимфоцитах, имеющих происхождение от лимфоцитов крови пациентов со злокачественными новообразованиями (Уап бег Вгиддеп е! а1 1991). В настоящее время семейство генов МАСЕ включает более 20 членов и состоит из генов МАСЕ А, В, С и Э (8сап1ап е! а1., (2002) 1ттипо1 Неу. 188:22-32; Сйотех е! а1., (2001) Сапсег Вез. 61(14):5544-51). Они сгруппированы на Х-хромосоме (Ьисаз е! а1., 1998 Сапсег Вез. 15 58:743-752; Ьисаз е! а1, 1999 Сапсег Вез 59:4100-4103; Ьисаз е! а1, 2000 1п! 1 Сапсег 87:55-60; Ьищит е! а1, 1997 Сепотюз 46:397-408; Мизса!еШ е! а1, 1995 Ргос №111 Асаб 8а И8А 92:4987-4991; Ро1б е! а1, 1999 Сепотюз 59:161-167; Водпег е! а1 1995 Сепотюз 29:725-731), и их функция до сих пор не установлена (Ойтап е! а1. 2001 Ехр Се11 Вез. 265(2): 185-94). Гены МАСЕ высоко гомологичны, и, в особенности, члены семейства МАСЕ-А обладают 60-98% гомологией. Гены МАСЕ не экспрессированы во всех нормальных клетках, за исключением экспрессии в сперматогониях и плаценте (Нааз е! а1. 1988 Ат 1 Вергоб 1ттипо1 МюгоЬю1 18:47-51; Такайазй1 е! а1. 1995 Сапсег Вез 55:3478382).
Реактивация экспрессии генов МАСЕ при злокачественном новообразовании обусловлена аномальным деметилированием промотора (Эе 8тее! е! а1. 1996 Ргос №111 Асаб 8а И8А 93(14):7149-53; Эе 8тее! е! а1. 1999 Мо1 Се11 Вю1. 19(11):7327-35). 12 генов МАСЕ-А аберрантно сверхэкспрессированы при следующих злокачественных новообразованиях: переходноклеточном раке, раке пищевода, меланоме, раке мочевого пузыря и немелкоклеточном раке легкого (Ν8ί.ΈΟ) (8сап1ап е! а1. 2002 1ттипо1 Веу. 188:22-32). Сверхэкспрессия и специфичность экспрессии МАСЕ в тканях злокачественных новообразований привели к тому, что белок МАСЕ-А3 используют в качестве антигена для вакцин от злокачественных новообразований (8сап1ап е! а1. 2002 1ттипо1 Веу. 188:22-32). Тем не менее, ввиду широкого диапазона экспрессии, обнаруживаемой у пациентов со злокачественными новообразованиями, следует точно оценивать уровень экспрессии МАСЕ-А3 у каждого пациента для того, чтобы направлять вакцинацию на пациентов, экспрессирующих белок. МАСЕ-А3 часто взаимозаменяемо называют МАСЕ-3; здесь использованы оба названия.
Меланома
У пациентов со злокачественной меланомой с отдаленными метастазами (IV стадия в соответствии с классификацией Американского объединенного комитета по злокачественным новообразованиям (Атепсап 1от! Сотт1!!ее оп Сапсег (А1СС)) среднее время выживания составляет один год, а показатель длительного выживания лишь 5%. Даже при стандартной химиотерапии для IV стадии меланомы уровни терапевтического ответа составляют лишь 8-25%, но без эффекта на общую выживаемость. У пациентов с регионарными метастазами (III стадия) среднее время выживания составляет от двух до трех лет с очень малой вероятностью длительного выживания, даже после адекватного хирургического лечения первичной опухоли и регионарных метастазов (Ва1сй е! а1, 1992 8етш 8игд Опсо1. 8(6):400-14). У большинства пациентов с стадией меланомы опухоль удаляют хирургически, но у этих пациентов сохраняется существенный риск рецидива. Таким образом, сохраняется потребность в предотвращении прогрессирования меланомы и потребность в улучшенных схемах лечения метастатической меланомы и способах адъювантной терапии для пациентов, у которых была удалена первичная опухоль.
Рак легкого
Существует два типа рака легкого: немелкоклеточный рак легкого (Ν8ί.Έί.') и мелкоклеточный рак легкого (8СЬС). Названия просто описывают тип клеток, обнаруживаемых в опухолях. Ν8ί.Τ·ί.' включает плоскоклеточный рак, аденокарциному и крупноклеточный рак и составляет приблизительно 80% раков легкого. Ν8ί.Έί.' труден в лечении, и доступные способы лечения направлены, согласно тенденции, на продление жизни настолько, на сколько возможно, и на облегчение симптомов заболевания. Ν8ί.Έί.' является наиболее распространенным типом рака легкого и связан с неблагоприятными исходами. Из всех пациентов с Х8СЬС приблизительно 25% имеют локальнорегионарное заболевание, на момент постановки диагноза еще поддающееся хирургическому удалению (стадии ГВ, ПА и ПВ в соответствии с классификацией А1СС). Тем не менее, у более чем 50% этих пациентов в течение двух лет после полного хирургического удаления разовьется рецидив. Таким образом, существует потребность в обеспечении лучшего лечения для этих пациентов.
Экспрессия МАСЕ-А3
Ранее несколько способов были направлены на измерение экспрессии генов МАСЕ-А3 как в клеточных линиях, так и в образцах опухолей. Применяли полуколичественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ВТ-РСВ) (Эе Р1аеп е! а1. 1994 [тишподепеЦсз 40(5):360-9), другие основанные на полимеразной цепной реакции (РСВ) методики и также микропанели низкой плотности (2атта!!ео е! а1. 2002 Сйшса1 Сйет1з!гу 48(1) 25-34). Тем не менее, во многих из этих исследований основной проблемой была очень высокая гомология между членами семейства МАСЕ, приводящая к лож- 1 016347 ноположительным результатам. Для крупных исследований II и III фазы желательно количественное исследование с высокой производительностью, позволяющее специфично идентифицировать МАСЕ-АЗэкспрессирующие образцы и снижающее вероятность возникновения ложноположительных результатов.
Другое затруднение возникает при использовании зафиксированной в формалине заключенной в парафин (ЕЕРЕ) опухолевой ткани, что является обычным способом фиксации опухолевой ткани в клинических центрах. Фиксация в формалине изменяет структуру молекул РНК в ткани, вызывая образование перекрестных сшивок и также частичную деградацию. Частичная деградация приводит к появлению меньших фрагментов РНК, протяженностью 100-300 пар оснований. Эти структурные изменения РНК затрудняют использование РНК, выделенной из ЕЕРЕ-ткани, в обычных диагностических методиках.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 - специфичность МАСЕ-АЗ КТ-РСК Тас.|Мап праймеров среди членов семейства МАСЕ-А;
фиг. 2 - специфичность зонда ТацМап КТ-РСК, связывающего малую бороздку, (МСВ-зонда) в отношении экспрессии МАСЕ-А3;
фиг. 3 - специфичность тестирования праймеров МАСЕ-А3 в присутствии плазмид МАСЕ-А3 и МАСЕ-6;
фиг. 4 - опухолевая экспрессия МАСЕ-АЗ, как измерено количественной ТацМап РСК (ТацМап полимеразной цепной реакцией);
фиг. 5 - тест на экспрессию МАСЕ-АЗ;
фиг. 6а - специфичность МАСЕ-АЗ праймеров, разработанных для использования с ЕЕРЕ-тканью;
фиг. 6б - тестирование линейности праймеров с использованием дифференциальных количеств РНК;
фиг. 7 - сравнение исследования с использованием КИАЕНег и замораживания и РСК с использованием ЕЕРЕ-ткан;
фиг. 8 - относительное сравнение МАСЕ-АЗ исследования с использованием КИАШег и замораживания и МАСЕ-АЗ исследования на основе ЕЕРЕ;
фиг. 9 - нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, содержащий фрагмент липопротеина Ό, фрагмент МадеЗ и гистидиновый хвост, и соответствующая ей аминокислотная последовательность (8ЕС ГО ИО:З5 и З6);
фиг. 10 - слитый белок ИК1-МАСЕЗ и гистидиновый хвост (8ЕС ГО ИО:З7);
фиг. 11 - ДНК, кодирующая слитый белок И§1-МАСЕЗ-Н18 (8ЕС ГО ИО:З8);
фиг. 12 - слитый белок СЬУТА-МАСЕЗ-гистидин (8ЕС ГО ИО:З9);
фиг. 1З - ДНК, кодирующая слитый белок СЬУТА-МАСЕЗ-НЦ (8ЕС ГО ИО:40);
фиг. 14 - выравнивание последовательностей семейства генов МАСЕ-А для разработки КТ-РСК праймеров и зондов для МАСЕ-АЗ;
фиг. 15 - выравнивание последовательностей МАСЕ-АЗ и МАСЕ-А6 для идентификации областей, содержащих целевые последовательности (заключённый в рамку шрифт);
фиг. 16 - классы полуколичественной МАСЕ-АЗ КТ-РСК: пример того, как пять классов могут быть присвоены полуколичественному МАСЕ-АЗ КТ-РСК исследованию;
фиг. 17 - графическое сравнение значений С1 от плазмид МАСЕ-А с использованием 20, 2, 0,2, 0,02 пг ДНК;
фиг. 18 - графическое сравнение значений разности С1 относительно МАСЕ-АЗ для других плазмид МАСЕ-А с использованием 20, 2, 0,2, 0,02 пг ДНК;
фиг. 19 - линейность ЕЕРЕ Хеподгай СЕКЬ РНК - 2-кратные серийные разведения от 100-0,1 нг внесенной РНК.
На фиг. 20 показан график зависимости значения разности С1 между МАСЕ-АЗ и β-актина от логарифма (по основанию 2) внесенного количества РНК.
Описание таблиц и последовательностей
Табл. 1. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для полуколичественной МАСЕ КТ-РСК.
Табл. 2. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для Тас.|Мап количественной КТ-РСК.
Табл. З. Сравнение МАСЕ-АЗ полуколичественной ПЦР и количественной Тас.|Мап РСК.
Табл. 4. Сравнение значений С1 и разности С1 с использованием ПЦР-смеси 1 и ПЦР-смеси 2.
Табл. 5. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для МСВ Тас.|Мап количественной КТ-РСК с использованием замороженной ткани.
Табл. 6. Классы полуколичественной МАСЕ-АЗ КТ-РСК: пример того, как пять классов могут быть присвоены полуколичественному МАСЕ-АЗ КТ-РСК исследованию (относится к фиг. 16).
Табл. 7. Последовательности СОВАК™ ТацМап МАСЕ-АЗ праймеров и зондов.
Табл. 8. Последовательности СОВАК™ ТацМап праймеров и зондов для бета-актина.
Табл. 9. Действительный диапазон СТ для образцов и контролей СОВАК™ ТацМап.
Табл. 10. СОВАК™ ТацМап температурный профиль циклов -температурный профиль ПЦР для эксперимента исключительности МАСЕ-АЗ.
Табл. 11. Температурный профиль КТ-РСК для экспериментов линейности и эффективности КТ- 2 016347
РСК, расчетной чувствительности (предела выявления), корреляции способов и воспроизвоимости.
Табл. 12. Значения С’1 от МЛСЕ-Л плазмид с использованием 20, 2, 0,2, 0,02 пг ДНК.
Табл. 13. Значения разности С'Ч относительно МЛСЕ-А3 для других МАСЕ-А плазмид с использованием 20, 2, 0,2, 0,02 пг ДНК.
Табл. 14. Проверка достоверности эксперимента исключительности МАСЕ-А3.
Табл. 15 и 16. Подробности эксперимента исключительности МАСЕ-А3.
Табл. 17. Линейность С1 и разности С1 МАСЕ-А3 и β-актина от 10 репликатов на 11 уровнях.
Табл. 18. Эффективность КТ-РСК-амплификации МАСЕ-А3 и β-актина.
Табл. 19. Проверка достоверности эксперимента линейности/эффективности КТ-РСК.
Табл. 20, 21 и 22. Подробности эксперимента линейности/эффективности КТ-РСК.
Табл. 23. Число положительных результатов по С1 МАСЕ-А3, N = 24 для каждого условия.
Табл. 24. Процент положительных результатов по С1 МАСЕ-А3, N = 24 для каждого условия.
Табл. 25. Число положительных результатов по С1 β-актина, N = 24 для каждого условия.
Табл. 26. Процент положительных результатов по С1 β-актина, N = 24 для каждого условия.
Табл. 27. Значения С1 для РАМ контролей гена МАСЕ.
Табл. 28. Значения С1 для НЕХ контролей β-актина.
Табл. 29, 30 и 31. Подробности эксперимента предела выявления.
Табл. 32. Краткое изложение образцов при перекрестной проверке достоверности.
Табл. 33. Число положительных и отрицательных результатов согласно проценту совпадения с исследованием сравнения в тесте С0ВАЗ и прототипном тесте.
Табл. 34. Число положительных и отрицательных результатов в тесте С0ВАЗ и прототипном тесте согласно проценту совпадения с исследованием сравнения, с тестом замороженных образцов, для принятия решения по дискордантным результатам.
Табл. 35. Значения С1 экспериментальных контролей гена МАСЕ.
Табл. 36. Значения С1 экспериментальных контролей гена β-актина.
Табл. 37, 38 и 39. Подробности эксперимента корреляции способов/перекрестной проверки достоверности.
Табл. 40. Опыт 1 - пороговая экспрессия МАСЕ-А3 от СЕКЬ РНК контролей.
Табл. 41. Опыт 1 - сигнал экспрессии МАСЕ-А3 для образцов, использованных в эксперименте воспроизводимости.
Табл. 42. Опыт 2 - пороговая экспрессия МАСЕ-А3 от СЕКЬ РНК контролей.
Табл. 43. Опыт 2 - сигнал экспрессии МАСЕ-А3 для образцов, использованных в эксперименте воспроизводимости.
Табл. 44. Проверка достоверности воспроизводимости.
Табл. 45, 46 и 47. Подробности эксперимента воспроизводимости.
ЗЕф ΙΌ N0:1 - МАСЕ3-Е2Р (праймер для полуколичественного исследования МАСЕ3) (табл. 1).
ЗЕф ΙΌ N0:2 - МАСЕ3-Е3К (праймер для полуколичественного исследования МАСЕ3) (табл. 1).
ЗЕф ΙΌ N0:3 - Е3 МАСЕ3 ТМР (прямой праймер для 3 экзона МАСЕ-А3) (табл. 2).
ЗЕф ΙΌ N0:4 - Е3 МАСЕ3 ТМК (обратный праймер для 3 экзона МАСЕ-А3; этот праймер представляет собой обратный комплемент последовательности того экзона МАСЕ-А3, который он распознает) (табл. 2).
ЗЕф ΙΌ N0:5 - Ι3 МАСЕ3 ТМР (прямой праймер для 3 интрона МАСЕ-А3) (табл. 2).
ЗЕф ΙΌ N0:6 - Ι3 МАСЕ3 ТМК (обратный праймер для 3 интрона МАСЕ-А3; этот праймер представляет собой обратный комплемент последовательности того интрона МАСЕ-А3, который он распознает) (табл. 2).
ЗЕф ΙΌ N0:7 - МАСЕА3-775Р (прямой праймер для МАСЕ-А3) (табл. 5).
ЗЕф ΙΌ N0:8 - МАСЕА3-849К (обратный праймер для МАСЕ-А3; этот праймер представляет собой обратный комплемент той последовательности МАСЕ-А3, которую он распознает) (табл. 5).
ЗЕф ΙΌ N0:9 - МАСЕА3е-950Р (прямой праймер для МАСЕ-А3) (табл. 5).
ЗЕф ΙΌ N0:10 - МАСЕА3е-1037К (обратный праймер для МАСЕ-А3; этот праймер представляет собой обратный комплемент той последовательности МАСЕ-А3, которую он распознает) (табл. 5).
ЗЕф ΙΌ N0:11 - МАСЕА3Е-623Р (прямой праймер для МАСЕ-А3) (табл. 5).
ЗЕф ΙΌ N0:12 - МАСЕА3Е-697К (обратный праймер для МАСЕ-А3; этот праймер представляет собой обратный комплемент той последовательности МАСЕ-А3, которую он распознает) (табл. 5).
ЗЕф ΙΌ N0:13 - Е3 МАСЕ3 ТМР (зонд для 3 экзона МАСЕ3) (табл. 2).
ЗЕО ΙΌ N0:14 - Ι3 МАСЕ-А3 ТМР (зонд для 3 интрона МАСЕ3) (табл. 2).
ЗЕф ΙΌ N0:15 - МАСЕА3-801Ттс (зонд для МАСЕ3) (табл. 5).
ЗЕО ΙΌ N0:16 - МАСЕА3е-1000Ттс (зонд для МАСЕ3) (табл. 5).
ЗЕф ΙΌ N0:17 - МАСЕА3Е-651Тт (зонд для МАСЕ3) (табл. 5).
ЗЕф ΙΌ N0:18 - В-ас11и-Е4Р (праймер для β-актина) (табл. 1).
ЗЕф ΙΌ N0:19 - В-ас11и-Е6К (праймер для β-актина) (табл. 1).
- 3 016347
8ЕО ΙΌ N0:20 - В-асДп-ТМЕ (праймер для β-актина) (табл. 2).
8Е0 ΙΌ N0:21 - В-асйп-ТМК. (праймер для β-актина) (табл. 2).
8Е0 ΙΌ N0:22 - В-асйп ТМР (зонд для β-актина) (табл. 2).
8Е0 ΙΩ N0:23 - 8Е0 ΙΌ N0:29: иммуногенные пептиды МЛОЕ3.
8Е0 ΙΌ N0:30 - 8Е0 ΙΌ N0:34: адъювантные олигонуклеотиды.
8Е0 ΙΌ N0:35 - нуклеотидная последовательность слитого белка фрагмент липопротеина Όфрангмент МАСЕ3-гистидиновый хвост (фиг. 9).
8Е0 ΙΌ N0:36 - аминокислотная последовательность 8Е0 ΙΌ N0:35 (фиг. 9).
8Е0 ΙΌ N0:37 - аминокислотная последовательность слитого белка N81-МАСЕ3-гистидиновый хвост (фиг. 10).
8Е0 ΙΌ N0:38 - нуклеотидная последовательность, кодирующая 8Е0 ΙΌ N0:37 (фиг. 11).
8Е0 ΙΌ N0:39 - аминокислотная последовательность слитого белка СЬУТА-МАСЕ3-гистидин (фиг. 12).
8Е0 ΙΌ N0:40 - нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок СЬУТА-МАСЕ3гистидин (фиг. 13).
8Е0 ΙΌ N0:41 - фрагмент МАСЕ 1 (фиг. 14).
8ЕО ΙΌ N0:42 - фрагмент МАСЕ 2 (фиг. 14).
8Е0 ΙΌ N0:43 - фрагмент МАСЕ 4а (фиг. 14).
8Е0 ΙΌ N0:44 - фрагмент МАСЕ 7 (фиг. 14).
8Е0 ΙΌ N0:45 - фрагмент МАСЕ 8 (фиг. 14).
8Е0 ΙΌ N0:46 - фрагмент МАСЕ 10 (фиг. 14).
8ЕО ΙΌ N0:47 - фрагмент МАСЕ 11 (фиг. 14).
8ЕО ΙΌ N0:48 - фрагмент МАСЕ 12 (фиг. 14).
8Е0 ΙΌ N0:49 - фрагмент МАСЕ-А6 (фиг. 14).
8Е0 ΙΌ N0:50 - фрагмент МАСЕ-А3 (фиг. 14).
8Е0 ΙΌ N0:51 - фрагмент МАСЕ-А3 (фиг. 15).
8Е0 ΙΌ N0:52 - фрагмент МАСЕ-А6 (фиг. 15).
8Е0 ΙΌ N0:53 - последовательность синтетического МАСЕ-А3-зонда МАСЕА3Е-646М0О (табл. 7).
8Е0 ΙΌ N0:54 - последовательность зонда МАСЕА3Е-646М0О с ^модифицированными нуклеотидами.
8Е0 ΙΌ N0:55 - последовательность праймера ΒΟΙ ВАСТ Е2 для β-актина (табл. 8).
8Е0 ΙΌ N0:56 - последовательность праймера ΒΟΙ ВАСТ К.2 для β-актина (табл. 8).
8Е0 ΙΌ N0:57 - последовательность зонда НА ВСШАСТ Н для β-актина (табл. 8).
Краткое изложение сущности изобретения
Авторы настоящего изобретения разработали исследование для идентификации пациентов, имеющих МАСЕ-А3-экспрессирующую опухолевую ткань, которые могут, таким образом, извлечь пользу из МАСЕ-А3-специфичной иммунотерапии.
В одном воплощении настоящего изобретения предложен праймер, содержащий любую из нуклеотидных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0:3-12. В другом воплощении предложен набор праймеров, содержащий одну или более из следующих пар праймеров:
а) 8ЕО ΙΌ N0:3 и 4;
б) 8ЕО ΙΌ N0:5 и 6;
в) 8ЕО ΙΌ N0:7 и 8;
г) 8ЕО ΙΌ N0:9 и 10; и
д) 8ЕО ΙΌ N0:11 и 12.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен зонд, содержащий любую из нуклеотидных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0:13-17, 53 или 54. В другом воплощении предложен набор, содержащий:
(1) прямой праймер;
(2) обратный праймер и (3) зонд, где компоненты (1), (2) и (3) способны к гибридизации с целевой последовательностью МАСЕ-А3 в строгих условиях, и где по меньшей мере одна из целевых последовательностей для (1), (2) или (3) отличается по меньшей мере одним нуклеотидом по сравнению с эквивалентной областью всех других нуклеотидных последовательностей МАСЕ А, и где набор может быть применен для различения МАСЕ-А3 и МАСЕ-А6.
Дополнительно предложен набор, содержащий:
(1) прямой праймер;
(2) обратный праймер и (3) зонд, где компоненты (1), (2) и (3) способны к гибридизации с целевой последовательностью МАСЕ-А3 в
- 4 016347 строгих условиях, и где по меньшей мере одна из целевых последовательностей для (1), (2) или (3) отличается по меньшей мере одним нуклеотидом по сравнению с эквивалентной областью нуклеотидной последовательности МЛСЕ-Лб, и где набор может быть применен для различения МАСЕ-А3 и МАСЕ-А6.
В одном воплощении набор по настоящему изобретению может содержать следующие компоненты:
(1) по меньшей мере один праймер или набор праймеров, как описано здесь; и (3) по меньшей мере один зонд, как описано здесь. В одном примере компонент (1) содержит 8ЕО ΙΌ N0:3 и 4; и компонент (2) содержит 8Е0 ΙΌ N0:13; альтернативно, компонент (1) содержит 8Е0 ΙΌ N0:5 и 6; и компонент (2) содержит 8Е0 ΙΌ N0:14; или компонент (1) содержит 8Е0 ΙΌ N0:7 и 8; и компонент (2) содержит 8Е0 ΙΌ N0:15; или компонент (1) содержит 8Е0 ΙΌ N0:9 и 10; и компонент (2) содержит 8Е0 ΙΌ N0:16; или компонент (1) содержит 8Е0 ΙΌ N0:11 и 12; и компонент (2) содержит 8Е0 ΙΌ N0:17; или компонент (1) содержит 8Е0 ΙΌ N0:11 и 12; и компонент (2) содержит 8Е0 ΙΌ N0:53 или 8Е0 ΙΌ N0:54.
В другом воплощении настоящего изобретения предложен способ определения присутствия или отсутствия МА0Е-А3-положительной опухолевой ткани, включающий стадию приведения в контакт выделенной нуклеотидной последовательности, полученной или имеющей происхождение из биологического образца, по меньшей мере с одним праймером, как описано здесь, набором праймеров, как описано здесь, зондом, как описано здесь, или набором, как описано здесь.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ определения присутствия или отсутствия МА0Е-А3-положительной опухолевой ткани посредством исследования биологического образца с использованием праймера, зонда или набора праймеров, как описано здесь.
В другом аспекте предложен способ диагностирования пациента, включающий стадию приведения в контакт выделенной нуклеотидной последовательности, полученной или имеющей происхождение из биологического образца, по меньшей мере с одним праймером, как описано здесь, набором праймеров, как описано здесь, зондом, как описано здесь, или набором, как описано здесь, и оценки того, экспрессирован ли МА0Е-А3 в образце.
Способ может дополнительно включать стадию амплификации нуклеотидной последовательности и выявления в образце амплифицированной нуклеотидной последовательности.
В еще одном аспекте предложен способ определения присутствия или отсутствия МАСЕ-А3положительной опухолевой ткани, включающий приведение в контакт выделенной нуклеотидной последовательности, полученной или имеющей происхождение из биологического образца, по меньшей мере с одним праймером или зондом, как описано здесь. Способ может дополнительно включать стадию определения того, гибридизуется ли выделенная нуклеотидная последовательность по меньшей мере с одним праймером или зондом в строгих условиях, выявляя таким образом, является ли опухолевая ткань МАСЕ-А3-положительной. В одном воплощении способ может дополнительно включать стадию применения гибридизации ίη δίΐιι для выявления того, гибридизуется ли выделенная нуклеотидная последовательность по меньшей мере с одним праймером или зондом.
Способы, как описано здесь, могут быть применены на биологическом образце, представляющем собой замороженную ткань; альтернативно или дополнительно, способы, описанные здесь, могут быть осуществлены на биологическом образце, представляющем собой ткань, зафиксированную в парафине, например, зафиксированную в формалине заключенную в парафин (ЕЕРЕ) ткань.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения пациента, включающий: определение того, экспрессирует ли опухолевая ткань пациента МАСЕ-А3, с применением способа, как описано здесь, и затем введение пациенту композиции, содержащей МАСЕ-А3-иммунотерапию или иммунотерапевтическое средство, как описано здесь.
В другом воплощении предложен способ лечения пациента, предрасположенного к рецидиву МАСЕ-А3-экспрессирующей опухоли, прошедшего лечение для удаления/излечения МАСЕ-А3экспрессирующей опухолевой ткани, включающий: определение того, экспрессирует ли опухолевая ткань пациента МАСЕ-А3, с применением способа, как описано здесь, и затем введение указанному пациенту композиции, содержащей МАСЕ-А3-иммунотерапию или иммунотерапевтическое средство, как описано здесь.
В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение композиции, содержащей МАСЕ-А3-иммунотерапию или иммунотерапевтическое средство, в изготовлении лекарственного средства для лечения пациента, страдающего от МАСЕ-А3-экспрессирующей опухоли, где у пациента установлено наличие МАСЕ-А3-экспрессирующей опухолевой ткани с применением способа, как описано здесь.
В еще одном воплощении предложено применение композиции, содержащей МАСЕ-А3иммунотерапию или иммунотерапевтическое средство, в изготовлении лекарственного средства для лечения пациента, предрасположенного к рецидиву МАСЕ-А3-экспрессирующей опухоли, где у пациента установлено наличие МАСЕ-А3-экспрессирующей опухолевой ткани с применением способа, как описано здесь.
В одном воплощении предложен способ лечения или применение, как описано здесь, где композиция, содержащая МА СЕ-А3-иммунотерапию или иммунотерапевтическое средство, содержит антиген МАСЕ-А3 или его пептид. В одном воплощении антиген МАСЕ-А3 или его пептид содержит или состо- 5 016347 ит из пептида ЕУОРЮНЬУ.
Антиген или пептид МАСЕ-А3 для применения в настоящем изобретении может быть слит или конъюгирован с белком-носителем. В одном воплощении белок-носитель может быть выбран из белка Ό,
N81 или СЬу1А, или их фрагментов.
В одном воплощении настоящего изобретения композиция, содержащая МАСЕ-А3-иммунотерапию или иммунотерапевтическое средство, может дополнительно содержать адъювант. Например, адъювант может содержать одну или более комбинации из: 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида Α (3ΌМРЬ); солей алюминия; СрС-содержащих олигонуклеотидов; сапонин-содержащих адъювантов, таких как 0821 или иммуностимулирующие комплексы (18СОМ); эмульсий типа масло в воде; и липосом. В одном воплощении адъювант может содержать 3Ό-ΜΡΕ, СрС-содержащие олигонуклеотиды и 0821.
Подробное описание изобретения
При использовании здесь термин целевая последовательность представляет собой область последовательности нуклеиновой кислоты МАСЕ-А3 (или ДНК, или РНК, например, геномной ДНК, информационной РНК, или их амплифицированных форм), которой частично (то есть, с некоторой степенью несоответствия) или полностью идентична последовательность зонда или праймера; хотя обратный праймер является обратным комплементом (или, как указано выше, имеет некоторую степень несоответствия) распознаваемой им последовательности. Целевая последовательность в большинстве случаев относится к области последовательности МАСЕ-А3, отличающейся по меньшей мере одним нуклеотидом при сравнении с другой или со всеми другими нуклеотидными последовательностями МЛСЕ-Л. Тем не менее, в некоторых воплощениях настоящего изобретения целевая последовательность может, для одного или нескольких праймеров и зонда, быть идентичной у нуклеотидных последовательностей МЛСЕ-Л. при условии, что по меньшей мере один или два используемых праймера и зонд распознают целевую последовательность, отличающуюся у дифференцируемых генов.
Таким образом, в одном воплощении определенный праймер или зонд может связывать целевую последовательность МАСЕ-А3 без несоответствий и связывать эквивалентную область другой последовательности МАСЕ-А, например, последовательности МАСЕ-А6, с несоответствиями одной или более пар оснований.
Целевая последовательность для праймеров или зонда по настоящему изобретению может представлять собой последовательность, обладающую большинством различий (несоответствий) между двумя генами, чтобы сделать возможным выявление МАСЕ-А3 с очень высокой специфичностью.
В одном воплощении настоящего изобретения целевые последовательности расположены в областях, обозначенных текстом в рамке на фиг. 15.
Подходяще, праймер или зонд может быть по меньшей мере на 95% идентичен целевой последовательности на всем протяжении длины праймера или зонда, подходяще, более чем на 95% идентичен, как например на 96, 97, 98, 99%, и наиболее предпочтительно обладает 100% идентичностью целевой последовательности МАСЕ-А3 на протяжении всей своей длины. Праймеры или зонды по изобретению могут быть идентичны целевой последовательности во всех нуклеотидных положениях праймера или зонда или могут обладать 1, 2 или более несоответствиями в зависимости, например, от длины зонда, температуры, условий реакции и условий исследования. Конечно, при условии, что обратный праймер удовлетворяет этим условиям в отношении области, представляющей собой обратный комплемент последовательности праймера.
Подходяще, каждый нуклеотид праймера или зонда может образовывать водородную связь с эквивалентным ему целевым нуклеотидом.
Предпочтительно, комплементарность праймера или зонда целевой последовательности оценивают по степени спаривания оснований А:Т и С:С так, что адениновый (А) нуклеотид образует пару с тимином (Т), и так, что гуаниновый (С) нуклеотид образует пару с цитозином (С), или наоборот. В форме РНК Т может быть заменен на и (урацил).
Там, где в универсальных зондах используют, например, инозин, комплементарность также может быть оценена по степени взаимодействий инозин (зонда) - целевой нуклеотид.
Соответственно, согласно настоящему изобретению предложен праймер, содержащий любую из нуклеотидных последовательностей 8Е0 ГО N0:1-12, как показано в табл. 1 и 2. Термин праймер использован здесь для обозначения любой одноцепочечной олигонуклеотидной последовательности, которая может быть использована в качестве праймера, например, в методике ПЦР. Таким образом, праймер по изобретению относится к одноцепочечной олигонуклеотидной последовательности, способной действовать в качестве точки инициации для синтеза продукта удлинения праймера, по существу идентичного (для прямого праймера) или по существу представляющего собой обратный комплемент (для обратного праймера) копируемой цепи нуклеиновой кислоты. Конструкция (длина и конкретная последовательность) праймера будут зависеть от природы ДНК и/или РНК мишеней и от условий, в которых используют праймер (таких как температура и ионная сила).
Праймеры могут состоять из нуклеотидных последовательностей, показанных в 8Е0 ГО N0:1-12, или могут представлять собой 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 или более пар оснований, включающих или находящихся в пределах последовательностей 8Е0 ГО N0:1-12, при условии, что они явля- 6 016347 ются подходящими для специфичного связывания целевой последовательности в пределах нуклеотидной последовательности МАСЕ-А3 в строгих условиях. Если необходимо, для поддержания специфичности и чувствительности, необходимых в данных обстоятельствах, могут быть произведены незначительные модификации праймеров или зондов в отношении длины или последовательности. Зонды и/или праймеры, перечисленные здесь, могут быть увеличены или уменьшены по длине, например, на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов в любом направлении.
При использовании здесь термин строгие условия обозначает любые условия гибридизации, позволяющие праймерам специфично связываться с нуклеотидной последовательностью в пределах нуклеотидной последовательности МЛСЕ-Л3. но не с какими-либо другими нуклеотидными последовательностями МАСЕ. Специфичное связывание или специфичная гибридизация зонда с областью нуклеотидной последовательности МАСЕ-А3 обозначает то, что праймер или зонд образует дуплекс (двухцепочечную нуклеотидную последовательность) с частью этой области или со всей областью в используемых экспериментальных условиях и что в этих условиях праймер или зонд не образует дуплекс с другими областями нуклеотидной последовательности, присутствующей в анализируемом образце. Следует понимать, что праймеры и зонды по настоящему изобретению, разработанные для специфичной гибридизации в области нуклеотидной последовательности МАСЕ-А3, могут полностью находиться в пределах указанной области или могут в значительной степени перекрываться с указанной областью (то есть образовывать дуплекс с нуклеотидами как за пределами, так и в пределах указанной области).
Подходяще, специфичная гибридизация зонда и целевой области нуклеиновой кислоты происходит в строгих условиях гибридизации, таких как трехкратный (3Х) раствор цитрата и хлорида натрия (88С), 0,1 % додецилсульфат натрия (8Ό8) при 50°С. Специалисту в данной области техники известно, как изменить параметры температуры, длины зонда и концентрации солей, таким образом, чтобы сделать возможным выполнение специфичной гибридизации. Условия гибридизации и отмывания хорошо известны и проиллюстрированы, например, в 8ашЬгоок, с1 а1., Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 8есоиб Ебйюи, Со1б 8рпид НагЬог, Ν.Υ., (1989), в частности, в его 11 главе.
Согласно настоящему изобретению также предложен набор праймеров, включающий одну или более из следующих пар праймеров.
Набор 1:ЗЕО Ю N0:3 и 4
Набор 2: ЗЕО Ю N0:5 и 6 Набор 3: ЗЕО Ю N0:7 и 8 Набор 4: ЗЕО Ю N0:9 и 10 Набор 5: ЗЕО Ю N0:11 и 12
Согласно настоящему изобретению также предложен зонд, содержащий любую из нуклеотидных последовательностей 8Е0 Ш N0:13-17, 53 или 54. Термин зонд использован здесь для обозначения любой одноцепочечной олигонуклеотидной последовательности, которая может связывать нуклеиновую кислоту и может быть использована в качестве зонда, например, в методике ПЦР. Зонды могут состоять из нуклеотидных последовательностей, показанных в 8ЕЦ Ш N0:13-17, 53 или 54, или могут представлять собой 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20, 25, 30, 35,40, 45, 50, 75, 100 или более пар оснований, включающих или находящихся в пределах последовательностей 8ЕЦ Ш N0:13-17, 53 или 54, при условии, что они являются подходящими для специфичного связывания целевой последовательности в пределах нуклеотидной последовательности МАСЕ-А3.
В одном воплощении изобретения, в котором зонд следует применять в способе в комбинации с парой праймеров, пара праймеров должна делать возможной амплификацию части или всего полинуклеотидного фрагмента МАСЕ-А3, который могут связывать зонды или с которым зонды иммобилизуют на твердой подложке.
Праймер и/или зонд может дополнительно содержать маркер, позволяющий выявлять зонд. Примеры маркеров, которые могут быть использованы, включают:
флуоресцентные маркеры, например, 6-карбоксифлуоресцеин (6ЕАМ™), ΝΒΌ™ (Арр1ега Согрога1юи), НЕХ™ или У1С™ (Аррйеб ВюзуЧетз): маркеры ТАМИЛ™ (Аррйеб ВюзуЧетз, СА, И8А);
хемилюминесцентные маркеры, например зонды с рутением; и радиоактивные метки, например тритий в форме меченного тритием тимидина. 32Фосфор также может быть использован в качестве радиоактивной метки.
В одном воплощении настоящего изобретения зонд может содержать флуоресцентный репортерный краситель на своем 5'-конце и гасящий краситель на своем 3'-конце. Флуоресцентный репортерный краситель может содержать 6-карбоксифлуоресцеин (6ЕАМ), и гасящий краситель может содержать нефлуоресцентный гаситель (ΝΕΟ). Возможно, к зонду, например к 3'-концу зонда, может быть присоединен белок, связывающий малую бороздку, (Мшог Сгооуе Вшбег рго!еш (МСВ™; Аррйеб ВюзуЧетз, СА, И8А)).
В одном воплощении может быть использован зонд МСВ™ ЕсНрзе РгоЬе (Еросй Вюзшеисез, ^А, И8А). Зонды МСВ™ ЕсНрзе снабжены гасителем ЕсНрзе™ Эагк Циеисйег и группировкой МСВ™, рас- 7 016347 положенной на 5'-конце зонда. Флуоресцентный репортерный краситель расположен на З'-конце зонда.
В одном воплощении последовательности праймера и зонда по настоящему изобретению могут включать или содержать встречающиеся в природе нуклеотидные структуры или основания, например, аденин (А), цитозин (С), гуанин (С), тимин (Т) и урацил (И).
В другом воплощении в последовательность зонда могут быть включены синтетические или модифицированные аналоги нуклеотидных структур или оснований. Под синтетической или модифицированной подразумевают не встречающуюся в природе нуклеотидную структуру или основание. Такие синтетические или модифицированные основания могут замещать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или все основания последовательности зонда. В одном воплощении цитозин может быть заменен на 5-метил 6С и тимин может быть заменен на 5-пропинил 6И. В последовательность может также быть включен гаситель ВНО2 Онспейсг.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен набор, содержащий следующие компоненты: (1) по меньшей мере один праймер или набор праймеров, как описано здесь; и (2) по меньшей мере один зонд, как описано здесь. В одном воплощении набор содержит один прямой праймер, один обратный праймер и последовательность зонда, целевая последовательность которой расположена в области, амплифицируемой прямым и обратным праймерами. В этом воплощении набор праймеров способен амплифицировать часть (ампликон) последовательности МАСЕ-АЗ, и зонд способен гибридизоваться в строгих условиях с ампликоном.
Последовательности МАСЕ-АЗ и МАСЕ-А6 высоко гомологичны и обладают 98% выравниванием их нуклеотидных и 95% выравниванием их белковых последовательностей. С целью специфичного распознавания последовательностей МАСЕ-АЗ необходимо установить праймеры и зонды, способные различать МАСЕ-АЗ и МАСЕ-А6.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен набор праймеров и/или зондов, специфично гибридизующихся с целевой последовательностью МАСЕ-АЗ в строгих условиях, где по меньшей мере одна из целевых последовательностей праймера или зонда отличается по меньшей мере одним нуклеотидом по сравнению с эквивалентной областью всех других нуклеотидных последовательностей МАСЕ А и где набор позволяет различать МАСЕ-АЗ и МАСЕ-А6.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен набор праймеров и/или зондов, специфично гибридизующихся с целевой последовательностью МАСЕ-АЗ в строгих условиях, где по меньшей мере одна из целевых последовательностей праймера или зонда отличается по меньшей мере одним нуклеотидом по сравнению с эквивалентной областью нуклеотидной последовательности МАСЕ А6, и где набор позволяет различать МАСЕ-АЗ и МАСЕ-А6.
В одном воплощении целевая последовательность по меньшей мере одного праймера или зонда может отличаться одним нуклеотидом в целевой последовательности МАСЕ-АЗ по сравнению с эквивалентной областью МАСЕ-А6. В другом воплощении целевая последовательность по меньшей мере одного праймера или зонда может отличаться двумя нуклеотидами по сравнению с эквивалентной областью МАСЕ-А6.
В одном воплощении набор, содержащий два праймера и один зонд, может иметь следующие отличия в целевых последовательностях праймера и зонда:
(1) целевая последовательность одного из двух праймеров или зонда отличается у МАСЕ-АЗ и МАСЕ-А6 на один нуклеотид;
(2) целевая последовательность праймеров или зонда, не названных в части (1), отличается у МАСЕ-АЗ и МАСЕ-А6 на один нуклеотид; и (3) целевая последовательность оставшегося праймера или зонда идентична как для МАСЕ-АЗ, так и для МАСЕ-А6.
Например, в одном воплощении набор, содержащий праймер А, праймер Б и зонд В, может включать следующие различия в целевых последовательностях:
(1) целевая последовательность праймера А отличается у МАСЕ-АЗ и МАСЕ-А6 на один нуклеотид;
(2) целевая последовательность праймера Б отличается у МАСЕ-АЗ и МАСЕ-А6 на два нуклеотида; и (3) целевая последовательность зонда В идентична как для МАСЕ-АЗ, так и для МАСЕ-А6.
Например, в одном воплощении набор, содержащий праймер А, праймер Б и зонд В, может включать следующие различия в целевых последовательностях:
(1) целевая последовательность праймера А отличается у МАСЕ-АЗ и МАСЕ-А6 на два нуклеотида;
(2) целевая последовательность праймера Б идентична как у МАСЕ-АЗ, так и у МАСЕ-А6; и (3) целевая последовательность зонда В отличается у МАСЕ-АЗ и МАСЕ-А6 на один нуклеотид.
Например, в одном воплощении набор, содержащий праймер А, праймер Б и зонд В, может включать следующие различия в целевых последовательностях:
(1) целевая последовательность праймера А идентична как у МАСЕ-АЗ, так и у МАСЕ-А6;
(2) целевая последовательность праймера Б отличается у МАСЕ-АЗ и МАСЕ-А6 на один нуклео- 8 016347 тид; и (3) целевая последовательность зонда В отличается у МЛСЕ-Л3 и МЛСЕ-Л6 на два нуклеотида.
В одном воплощении набор может содержать: пару праймеров с последовательностями 8ЕО Ш N0:3 и 4, или содержащих эти последовательности, и зонд с последовательностью 8Е0 Ш N0:13, или содержащий эту последовательность; пару праймеров с последовательностями 8Е0 Ш N0:5 и 6, или содержащих эти последовательности, и зонд с последовательностью 8Е0 Ш N0:14, или содержащий эту последовательность; пару праймеров с последовательностями 8Е0 Ш N0:7 и 8, или содержащих эти последовательности, и зонд с последовательностью 8Е0 Ш N0:15, или содержащий эту последовательность; пару праймеров с последовательностями 8Е0 Ш N0:9 и 10, или содержащих эти последовательности, и зонд с последовательностью 8Е0 Ш N0:16, или содержащий эту последовательность; и/или пару праймеров с последовательностями 8Е0 Ш N0:11 и 12, или содержащих эти последовательности, и зонд с последовательностью 8Е0 Ш N0:17, или содержащий эту последовательность.
В другом воплощении настоящего изобретения предложен способ определения присутствия или отсутствия МЛ0Е-Л3-положительной опухолевой ткани, включающий стадию контакта нуклеотидной последовательности, полученной или имеющей происхождение из биологического образца, по меньшей мере с одним праймером или по меньшей мере одним набором праймеров, или зондом, как описано здесь. Под МЛ0Е-Л3-положительной опухолевой тканью подразумевают любые опухоли или опухолевые клетки, экспрессирующие антиген МЛ0Е-Л3, которые были выделены от пациента. Способ, как описано здесь, может быть использован для определения того, содержит ли или состоит ли биологический образец из МЛ0Е-Л3-положительной опухолевой ткани.
Под биологическим образцом подразумевают образец ткани или клеток от пациента, который был удален или выделен от пациента.
Дополнительно предложен способ диагностирования пациента, включающий стадию контакта нуклеотидной последовательности, полученной или имеющей происхождение из биологического образца, с по меньшей мере одним праймером или по меньшей мере одним набором праймеров, или зондом, как описано здесь, и оценки того, экспрессирован ли МЛ0Е-Л3 в образце.
В одном воплощении нуклеотидную последовательность выделяют или она была выделена из биологического образца.
При использовании здесь, подразумевают, что термин полученный или имеющий происхождение из/от используют включительно. Таким образом, подразумевают, что он включает любую нуклеотидную последовательность, непосредственно выделенную из опухолевого образца, или любую нуклеотидную последовательность, имеющую происхождение из образца, например с применением обратной транскрипции для образования информационной РНК (иРНК) или комплементарной ДНК (кДНК).
Способ по настоящему изобретению может дополнительно включать амплификацию нуклеотидной последовательности и выявление в образце амплифицированной нуклеотидной последовательности. Лльтернативно или дополнительно, способ по настоящему изобретению может дополнительно включать приведение в контакт выделенной или амплифицированной нуклеотидной последовательности с одним или более зондами, как описано здесь.
В одном воплощении нуклеотидная последовательность выделена или очищена из образца опухоли. При КТ-РСК контаминация геномной ДНК может привести к ложноположительным результатам. В одном воплощении геномную ДНК удаляют или в значительной степени удаляют из тестируемого образца или образца, включенного в способы по настоящему изобретению.
Способы по настоящему изобретению являются подходящими для выявления МЛ0Е-Л3положительной опухолевой ткани. В одном воплощении настоящего изобретения МЛ0Е-Л3положительная ткань может быть выявлена с применением гибридизации ίη ίάιι. Под гибридизацией ίη Щи подразумевают реакцию гибридизации, проводимую с использованием праймера или зонда по настоящему изобретению на интактных хромосомах, клетках или тканях, выделенных от пациента, для непосредственной визуализации морфологического расположения определенных последовательностей ДНК или РНК.
Гибридизация полинуклеотидов может быть проведена с применением любых подходящих способов гибридизации и системы выявления. Примеры систем гибридизации включают обычные способы дот-блоттинга, саузерн-блоттинга и сендвич-анализа. Например, подходящий способ может включать способ обратной гибридизации, где типоспецифичные зонды фиксируют на твердой подложке в определенных известных местах (точках, линиях или других фигурах) и амплифицированные полинуклеиновые кислоты помечают с целью выявления гибридообразования. Определенные последовательности нуклеиновых кислот МЛ0Е-Л3, например, зонд или праймер, как описано здесь, могут быть помечены биотином, и гибрид может быть выявлен посредством сочетания биотин-стрептавидин с нерадиоактивной системой развития окраски. Тем не менее, также могут быть применены другие системы обратной гибридизации, например, как показано в Огауй! е1 а1. (1оита1 οί Сйшса1 МюгоЬю1оду, 1998, 36(10): 3020-3027), содержание чего полностью включено посредством ссылки. Стандартная гибридизация и условия отмывания описаны в К1е1ег е1 а1., 1оита1 οί Сйшса1 М1сгоЬю1оду, 1999, 37(8): 2508-2517 и будут оптимизированы в данных условиях для поддержания необходимых специфичности и чувствительности посредст
- 9 016347 вом длины и последовательности зонда (зондов) и праймера (праймеров).
В одном воплощении способ по настоящему изобретению может включать применение:
а) пары праймеров, содержащей 8ЕО ΙΌ N0:3 и 4; и зонда, содержащего 8Е0 ΙΌ N0:13;
б) пары праймеров, содержащей 8Е0 ΙΌ N0:3 и 4; и зонда, содержащего 8Е0 ΙΌ N0:17;
в) пары праймеров, содержащей 8Е0 ΙΌ N0:3 и 4; и зонда, содержащего 8Е0 ΙΌ N0:53;
г) пары праймеров, содержащей 8Е0 ΙΌ N0:3 и 4; и зонда, содержащего 8Е0 ΙΌ N0:54;
д) пары праймеров, содержащей 8Е0 ΙΌ N0:5 и 6, и зонда, содержащего 8Е0 ΙΌ N0:14;
е) пары праймеров, содержащей 8Е0 ΙΌ N0:7 и 8, и зонда, содержащего 8Е0 ΙΌ N0:15;
ж) пары праймеров, содержащей 8Е0 ΙΌ N0:9 и 10, и зонда, содержащего 8Е0 ΙΌ N0:16;
з) пары праймеров, содержащей 8Е0 ΙΌ N0:11 и 12, и зонда, содержащего 8Е0 ΙΌ N0:17;
и) пары праймеров, содержащей 8Е0 ΙΌ N0:11 и 12, и зонда, содержащего 8Е0 ΙΌ N0:53; и/или
к) пары праймеров, содержащей 8Е0 ΙΌ N0:11 и 12, и зонда, содержащего 8Е0 ΙΌ N0:54.
Способы, описанные здесь, являются подходящими для применения со свежей тканью, замороженной тканью, тканью, зафиксированной в парафине, и/или тканью, зафиксированной в этаноле. Для выделения РНК или ДНК из образца доступны хорошо известные методики выделения и очистки (например, в 8атЬгоок с1 а1., 1989). РНК или ДНК могут быть использованы непосредственно после выделения из образца или, более предпочтительно, после стадии амплификации полинуклеотида (например, ПЦР). В определенных случаях, как например для исследований с обратной гибридизацией, может быть необходима обратная транскрипция РНК в кДНК перед амплификацией. В обоих последних случаях амплифицированный полинуклеотид имеет происхождение из образца.
В одном воплощении, где образец представляет собой ткань, зафиксированную в парафине, могут быть использованы следующие наборы праймеров и зондов:
а) пара праймеров, содержащая 8Е0 ΙΌ N0:7 и 8, и зонд, содержащий 8Е0 ΙΌ N0:15;
б) пара праймеров, содержащая 8Е0 ΙΌ N0:9 и 10, и зонд, содержащий 8Е0 ΙΌ N0:16;
в) пара праймеров, содержащая 8Е0 ΙΌ N0:11 и 12, и зонд, содержащий 8Е0 ΙΌ N0:17;
г) пара праймеров, содержащая 8Е0 ΙΌ N0:11 и 12, и зонд, содержащий 8Е0 ΙΌ N0:53; и/или
д) пара праймеров, содержащая 8Е0 ΙΌ N0:11 и 12, и зонд, содержащий 8Е0 ΙΌ N0:54.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен способ лечения пациента, включающий: определение того, экспрессирует ли опухолевая ткань пациента МА0Е-Л3, с применением способа, как описано здесь, и введение указанному пациенту композиции, содержащей антиген, эпитоп или производное антигена МА0Е-А3 или МА0Е-А3-специфиченое антитело или иммуноглобулин. Пациент может иметь опухолевую ткань, экспрессирующую МА0Е-А3, (терапия активного заболевания) или может представлять собой пациента, прошедшего лечение для удаления/излечения МА0Е-А3экспрессирующей опухолевой ткани, предрасположенного к рецидиву МА0Е-А3-экспрессирующей опухоли (адъювантная терапия).
Согласно настоящему изобретению также предложено применение композиции, содержащей антиген, эпитоп или производное антигена МА0Е-А3 или МА0Е-А3-специфиченое антитело или иммуноглобулин, в изготовлении лекарственного средства для лечения пациента, страдающего от МА0Е-А3экспрессирующей опухоли или предрасположенного к рецидиву МА0Е-А3-экспрессирующей опухоли, где у пациента, с применением диагностического способа, набора, праймера или зонда, как описано здесь, установлено наличие МА0Е-А3-экспрессирующей опухолевой ткани, или установлено, что у пациента была МА0Е-А3-экспрессирующая опухолевая ткань.
Композиция, содержащая антиген, эпитоп или производное антигена МА0Е-А3, может содержать антиген МА0Е-А3 или его пептид. В одном воплощении антиген МА0Е-А3 или его пептид содержит или состоит из пептида ЕУЭРЮНЬУ. Антиген или пептид МА0Е-А3 может быть слит или конъюгирован с белком-носителем, который может быть выбран из белка Ό, N81 или СЬу1А или их фрагментов.
В одном воплощении композиция может дополнительно содержать адъювант; например, адъювант, содержащий одно или более, или комбинацию из: 3-де-О-ацилированного монофосфорил липида А (3ΌМРЬ); солей алюминия; СрО-содержащих олигонуклеотидов; сапонин-содержащих адъювантов, таких как 0821 или иммуностимлуирующие комплексы Д8С0М); эмульсий типа масло в воде; и липосом.
Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен способ скрининга, в клинических применениях, образцов тканей от пациента-человека на присутствие или отсутствие экспрессии МАОЕА3. Такие образцы могут состоять, например, из материалов пункционных биопсий, образцов после хирургического удаления или ткани лимфатических узлов. Например, эти способы включают получение биопсийного материала, возможно, фракционированного изготовлением срезов в криостате для обогащения опухолевыми клетками до приблизительно 80% от всей популяции клеток. В определенных воплощениях, нуклеиновые кислоты могут быть выделены из этих образцов с применением методик, хорошо известных в данной области техники. В других воплощениях нуклеиновые кислоты, выделенные из образца ткани, могут быть амплифицированы с применением методик, хорошо известных в данной области техники. Уровень экспрессии МА0Е-А3 может быть выявлен и может быть сопоставлен со статистически достоверными группами и/или контролями от МА0Е-А3-отрицательных пациентов.
В одном воплощении диагностический способ включает определение того, экспрессирует ли субъ
- 10 016347 ект продукт гена МАСЕ-АЗ, например, выявлением соответствующей иРНК и/или уровня белка продукта гена. Например, с применением методик, таких как нозерн-блот анализ, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (КТ-РСК), полуколичественная КТ-РСК, количественная КТ-РСК, Тас.|Мап РСК (Тас.|Мап полимеразная цепная реакция), гибридизация ίη 8Йи, иммунопреципитация, вестерн-блот анализ и иммуногистохимия. В соответствии с таким способом, от пациента могут быть получены клетки или ткань, и уровень иРНК и/или белка может быть сопоставлен с таковыми ткани, не экспрессирующей МАСЕ-АЗ.
Методика ТацМап РСК
Тас.|-ДНК-полимераза обладает 6'-3'-экзонуклеазной активностью. В анализе ТацМап РСК эту экзонуклеазную активность используют для расщепления зондов с двойными метками, ренатурированных с целевыми последовательностями в течение ПЦР-амплификации.
Кратко, из образца выделяют РНК и синтезируют кДНК (обратная транскрипция). кДНК затем добавляют к ПЦР-реакционной смеси, содержащей стандартные ПЦР-компоненты (см., например, компоненты, поставляемые Косйе (СА, И8А) для Тацтап РСК). Реакционная смесь дополнительно содержит зонд, ренатурирующий с матричной нуклеотидной последовательностью между двумя праймерами (то есть, в пределах ампликона, последовательности, амплифицируемой посредством ПЦР-реакции). Зонд содержит флуоресцентный репортерный краситель на 5'-конце и гасящий краситель на З'-конце. Гаситель способен гасить флуоресценцию репортера, но только если два красителя расположены близко друг к другу: это происходит для интактных зондов.
В течение и после амплификации зонд деградирует под действием Тас.|-ДНК-полимеразы, и любая флуоресценция становится выявляемой.
Для количественных измерений используют число циклов ПЦР, при котором флуоресценция достигает порогового уровня, в 10 раз превышающего стандартное отклонение исходной эмиссии. Это число циклов, называемое пороговым числом циклов (С!), обратно пропорционально исходному количеству целевой кДНК и позволяет измерить количество кДНК. По существу, чем большее количество РНК присутствует в образце, тем меньше получаемое число СР
Измерения, получаемые для значения С!, сравнивают с таковыми, получаемыми для конститутивного гена. Это допускает любые ошибки, основанные на количестве всей РНК, добавляемой к каждой реакции обратной транскрипции, (на основании поглощения при длине волны) и ее качестве (то есть, деградации): ничто из этого не является надежным параметром для измерения исходного материала. Таким образом, транскрипты обязательного гена оценивают количественно в качестве эндогенного контроля. Бета-актин является одним из наиболее часто используемых неспецифических конститутивных генов, хотя могут быть использованы и другие.
В еще одном воплощении изобретения предложен способ лечения пациента, страдающего от МАСЕ-АЗ-экспрессирующей опухоли, включающий: определение, посредством применения способа по настоящему изобретению, того, экспрессирует ли пациент белок МАСЕ-АЗ; и последующее введение композиции, содержащей антиген, эпитоп или производное антигена МАСЕ-А3 или МАСЕ-А3специфиченое антитело или иммуноглобулин, для предотвращения или облегчения рецидива заболевания. Пациент может сначала получить лечение, такое как хирургическое удаление любой опухоли или другое лечение химиотерапией или лучевой терапией.
Таким образом, согласно настоящему изобретению также предложено применение МАСЕ-А3специфичной иммунотерапии в изготовлении лекарственного средства для лечения пациентов, страдающих от МАСЕ-АЗ-экспрессирующей опухоли, или пациентов, получающих лечение (хирургическое, химиотерапию или лучевую терапию) для удаления или излечения МАСЕ-А3-экспрессирующей опухоли, где, посредством применения диагностического способа, набора, праймера или зонда по настоящему изобретению, у указанного пациента установлено наличие МАСЕ-АЗ-экспрессирующей опухолевой ткани.
Таким образом, настоящее изобретение может быть применено для пациентов с МАСЕ-АЗэкспрессирующими злокачественными новообразованиями, такими как меланома; рак молочной железы; рак мочевого пузыря, включая переходно-клеточный рак; рак легкого, включая немелкоклеточный рак легкого (И8СЬС); рак головы и шеи, включая рак пищевода; плоскоклеточный рак; рак печени; множественная миелома; и рак ободочной кишки. В одном воплощении, изобретение может быть применено в лечении пациентов в адъювантной (послеоперационной) терапии при таких раках, в частности, при раке легкого и меланоме. Изобретение также находит применение в лечении метастатических видов рака.
Иммунотерапия
Композиции, подходящие для использования в способах лечения пациентов по настоящему изобретению, представляют собой таковые, способные увеличивать МАСЕ-АЗ-специфичный иммунный ответ. Композиция будет содержать по меньшей мере один эпитоп из продукта гена МАСЕ-АЗ. Такой эпитоп может быть представлен как пептидный антиген, возможно, ковалентно связанный с носителем. Альтернативно, могут быть использованы большие белковые фрагменты. Фрагменты и пептиды для использования должны, тем не менее, при подходящем представлении, быть способны вызывать иммунный ответ против МАСЕ-АЗ, например МАСЕ-АЗ-специфичный иммунный ответ.
- 11 016347
Примеры пептидов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают следующие пептиды МАСЕ-А3.
ЗЕО ГО ΝΟ | Пептидная последовательность |
ЗЕО ГО N0:23 | Е1АЛ/6РКА1Д/ |
ЗЕО ГО N0:24 | ΜΕνϋΡΙΟΗΙ-Υ |
ЗЕО ГО N0:25 | νΗΡΙΛΙ-ΚΥΚΑ |
ЗЕО ГО N0:26 | Ι_νΗΕΙ_ί.Ι_ΚΥΚ |
ЗЕО ГО N0:27 | ίΚΥΕ3ΑΚΕΡνΤ |
ЗЕО ГО N0:28 | АСУЕЕ1ДЛ/6РКА1Л/ЕТЗ |
ЗЕО ГО N0:29 | ΤΟΗΕνΟΕΝΥίΕΥ |
В одном воплощении антиген может содержать пептид или белок МАСЕ, связанный с иммунным слитым фрагментом или партнером-энхансером экспрессии. Белок МАСЕ может представлять собой белок МАСЕ-А3 полной длины или может содержать фрагмент МАСЕ3, например аминокислоты 3-314 МАСЕ3 (в общей сложности 312 аминокислот).
Антиген и партнер могут быть химически конъюгированы или могут быть экспрессированы в виде рекомбинантного слитого белка. В одном воплощении, где антиген и партнер экспрессированы в виде рекомбинантного слитого белка, это может делать возможной выработку в системе экспрессии на более высоких уровнях по сравнению с неслитым белком. Таким образом, партнер по слиянию может способствовать обеспечению Т-хелперных эпитопов (иммунный партнер по слиянию), предпочтительно Тхелперных эпитопов, распознаваемых людьми, и/или способствовать экспрессии белка (энхансер экспрессии) с большим выходом, чем нативный рекомбинантный белок. В одном воплощении, партнер по слиянию может являться как иммунным партнером по слиянию, так и энхансером экспрессии.
В одном воплощении изобретения иммунный партнер по слиянию, который может быть использован, имеет происхождение от белка Ό, поверхностного белка грамотрицательной бактерии НаеторЫ1и8 тПиепха В (\УО 91/18926), или его производного. Производное белка Ό может содержать первую 1/3 белка, или приближенно первую 1/3 белка. В одном воплощении первые 109 остатков белка Ό могут быть использованы в качестве партнера по слиянию для снабжения антигена МАСЕ-А3 дополнительными экзогенными Т-клеточными эпитопами и повышения уровня экспрессии в Е. Со11 (действуя, таким образом, также в качестве энхансера экспрессии). В альтернативном воплощении производное белка Ό может содержать первые Ν-концевые 100-110 аминокислот или приближенно первые Ν-концевые 100110 аминокислот. В одном воплощении белок Ό или его производное могут быть липидированы, и может быть использован липопротеин Ό: липидный хвост может обеспечить оптимальное представление антигена антиген-представляющим клеткам.
В одном воплощении МАСЕ-А3 может представлять собой белок П-МАСЕ-А3/Н1з, слитый белок из 432 аминокислотных остатков. Этот слитый белок содержит аминокислоты с 1 по 109 белка Ό, липопротеин, присутствующий на поверхности грамотрицательной бактерии НаеторЫ1из тПиепха В, 312 аминокислот из белка МАСЕ-А3 (аминокислоты 3-314), спейсер и полигистидиновый хвост, который может облегчать очистку слитого белка в течение процесса изготовления, например:
(1) сигнальную последовательность из 18 остатков и первые 109 остатков процессированного белка Ό, причем сигнальную последовательность отщепляют от слитого белка в процессе изготовления, оставляя первые 109 остатков;
(2) два неродственных остатка (метионин и аспарагиновую кислоту);
(3) остатки 3-314 нативного белка МАСЕ-А3;
(4) два глициновых остатка, функционирующих как шарнирная область;
(5) семь гистидиновых остатков.
В альтернативном воплощении может быть использована описанная выше конструкция, за исключением того, что (1) может быть заменен последовательностью, содержащей первые Ν-концевые 100-110 аминокислот или приближенно первые Ν-концевые 100-110 аминокислот белка Ό.
МАСЕ-А3 может быть экспрессирован в виде слитого белка с белком Ό на Ν-конце и последовательностью из семи гистидиновых остатков (гистидиновым хвостом) на С-конце. Белок Ό представляет собой белок массой 42 кДа, связывающий иммуноглобулины Ό, экспонированный на поверхности грамотрицательной бактерии НаеторЫ1из тПиепха В.
В другом воплощении иммунный партнер по слиянию, белок Ό, может быть заменен на белок, известный как Ьу1А. Ьу1А имеет происхождение от МгерЮсосеиз рпеитоша, синтезирующего Ν-ацетил-Ьаланинамидазу, амидазу Ьу1А (кодируемую геном Ьу1А (Сепе, 43 (1986) раде 265-272)), аутолизин, специфично разрушающий определенные связи в основе пептидогликанов. С-концевой домен белка Ьу1А обеспечивает аффинность к холину или некоторым аналогам холина, таким как ЭЕАЕ. Это свойство было использовано для разработки С-Ьу1А-экспрессирующих плазмид у Е. Со11, применимых для экспрессии слитых белков. Была описана очистка гибридных белков, содержащих фрагмент С-Ьу1А на их Νконце (Вю1есйпо1оду: 10, (1992) раде 795-798). В одном воплощении может быть использована С
- 12 016347 концевая часть молекулы. В воплощении может быть использована повторяющаяся часть молекулы Ьу1А, обнаруженная на С-конце, начиная с остатка 178. В одном воплощении часть Ьу1Л может включать остатки 188-305.
В одном воплощении настоящего изобретения белок МАОЕ-А3 может содержать дериватизированный свободный тиол. Такие антигены были описаны в А0 99/40188. В частности, могут быть использованы карбоксиамидированные или карбоксиметилированные производные.
В одном воплощении настоящего изобретения опухоль-ассоциированный антиген включает молекулу МАОЕ-А3-белок Ό. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности этой молекулы показаны на фиг. 9 (8ЕО ΙΌ N0:35 и 8Е0 ГО N0:36). Этот и приведенные ниже антигены описаны более подробно в А0 99/40188.
В другом воплощении настоящего изобретения опухоль-ассоциированный антиген может содержать любой из следующих слитых белков:
слитый белок Ν81-ΜΑΟΕ3 и гистидиновый хвост, например, как показано на фиг. 10 и 11 (8Е0 ГО N0:37 и 8Е0 ГО N0:38); слитый белок СЬ¥ТА-МАОЕ3-гистидин, например, как показано на фиг. 12 и 13 (8ЕО ГО N0:39 и 8Е0 ГО N0:40).
Другое воплощение настоящего изобретения включает применение иммунотерапевтического средства из нуклеиновой кислоты, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую МАОЕ-А3специфичный опухоль-ассоциированный антиген, как описано здесь. В одном воплощении настоящего изобретения последовательности могут быть введены в подходящий вектор экспрессии и использованы для ДНК/РНК-вакцинации. Микробные векторы, эспрессирующие данную нуклеиновую кислоту, могут также быть использованы в качестве векторно доставляемых иммунотерапевтических средств.
Примеры подходящих вирусных векторов включают ретровирусные, лентивирусные, аденовирусные, аденовирус-ассоциированные, герпесвирусные, включая векторы вируса простого герпеса, альфавирусные, поксвирусные, такие как Сапагурох (вирус оспы канареек), и системы на основе вирусов коровьей оспы. Методики переноса генов с использованием этих вирусов известны специалистам в данной области техники. Ретровирусные векторы, например, могут быть использованы для стабильной интеграции полинуклеотида по изобретению в геном хозяина, хотя такая рекомбинация не является предпочтительной. Дефектные по репликации аденовирусные векторы, напротив, остаются эписомными и, таким образом, делают возможной транзиторную экспрессию. Могут быть использованы векторы, способные стимулировать экспрессию в клетках насекомых (например, бакуловирусные векторы), в клетках человека, дрожжей или в бактериях, с целью изготовления больших количеств белка МАОЕ-А3, кодируемого полинуклеотидами по настоящему изобретению, например, для применения в качестве субъединичных вакцин или в иммунологических исследованиях.
В предпочтительном воплощении аденовирус, используемый в качестве живого вектора, представляет собой дефектный по репликации аденовирус обезьян. Обычно эти вирусы содержат делецию Е1 и могут быть выращены на клеточных линиях, трансформированных с использованием гена Е1. Предпочтительные аденовирусы обезьян представляют собой вирусы, выделенные от шимпанзе. В частности, С68 (также известный как Рап 9) (см. патент США № 6083716) и Рап 5, 6, и Рап 7 (А0 03/046124) предпочтительны для использования в настоящем изобретении. Таким образом, эти векторы могут быть использованы для введения гетерологичного гена по изобретению таким образом, продукт гена может быть экспрессирован. Применение, приготовление и изготовление таких рекомбинантных аденовирусных векторов подробно изложено в А0 03/046142.
Обычные рекомбинантные методики получения последовательностей нуклеиновых кислот и изготовление векторов экспрессии описаны в МашаШ с1 а1, Мо1еси1аг С1ошпд-А ЬаЬога1огу Мапиа1; Со1б 8ртшд НагЬог, 1982-1989.
Для иммунотерапевтических средств на основе белков предложены белки по настоящему изобретению либо растворимые в жидкой форме, либо в лиофилизированной форме.
Каждая человеческая доза может содержать от 1 до 1000 мкг белка. В одном воплощении доза может содержать 30-300 мкг белка.
Иммунотерапевтическое средство, как описано здесь, может дополнительно содержать вакцинный адъювант и/или иммуностимулирующий цитокин или хемокин.
В продаже имеются подходящие вакцинные адъюванты для использования в настоящем изобретении, такие как, например, неполный адъювант Фрейнда (Егеипб'к 1псошр1е1е АбщмапГ') и полный адъювант (Сошр1е1е АбщмапГ') (Э|Гсо ЕаЬогакпек, Ое1гоП. М1); Мегск АбщмагИ 65 (Мегск апб Сотрапу, 1пс., Ра11\уау. N1); А8-2 (8тййК1ше Веесйат, 5 РЫ1абе1рЫа, РА); соли алюминия, такие как гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина; ацилированные сахара; катионно или анионно дериватизированные полисахариды; полифосфазены; биодеградируемые микросферы; монофосфориллипид А и липид А (с.|ш1 А). Цитокины, такие как гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Е) или интерлейкин-2, -7 или -12, и хемокины могут также быть использованы в качестве адъювантов.
В композициях по изобретению может быть желательным, чтобы адъювантная композиция вызывала иммунный ответ преимущественно Тй1-типа. Высокие уровни цитокинов Тй1-типа (например, ин- 13 016347 терферона-γ (ΙΡΝ-γ), фактора некроза опухоли α (ΤΝΕα), интерлейкина-2 (1Ь-2) и интерлейкина-12 (1Ь12)) имеют тенденцию способствовать индукции клеточно-опосредованных иммунных ответов на введенный антиген. В одном воплощении с ответом преимущественно Тй1-типа уровень цитокинов Тй1типа будет повышаться в большей степени, чем уровень цитокинов Тй2-типа. Уровни этих цитокинов могут легко быть оценены с применением стандартных исследований. Для обзора семейств цитокинов см. Моктапп апб СоГГтап, Апп. Вег. 1ттипо1. 7:145-17З, 1989.
Соответственно, подходящие адъюванты, которые могут быть использованы для стимуляции ответа преимущественно Тй1-типа, включают, например, комбинацию монофосфориллипида А, такого как З-деО-ацилированный монофосфориллипид А (ЗП-МРЬ), вместе с солью алюминия. ЗО-МРЬ или другие лиганды толл-подобных рецепторов 4 (ТЬК4), такие как аминоалкил-глюкозаминид фосфаты, как раскрыто в \νϋ 9850З99, XVО 01З4617 и XVО 0З065806, могут также быть использованы сами по себе для вызова ответа преимущественно Тй1-типа
Другие известные адъюванты, способные вызывать иммунный ответ преимущественно Тй1-типа, включают антагонисты ТЬК9, такие как неметилированные СрС-содержащие олигонуклеотиды. Данные олигонуклеотиды характеризуются тем, что СрС-динуклеотид неметилирован. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны в, например, νθ 96/02555.
Подходящие олигонуклеотиды включают:
ЗЕО Ю N0:30 | ТСС АТС АСО ТТС СТО АСС ТТ | СрО 1826 |
ЗЕО Ю N0:31 | ТСТ ССС АСС ОТО СОС САТ | СрО 1758 |
ЗЕО Ю N0:32 | АСС ОАТ ОАС СТС ОСС СОТ ОАС ООС АСС АСО | |
ЗЕО Ю N0:33 | ТСО ТСО ТТТ ТОТ СОТ ТТТ ОТС ОТТ | СрО 2006, СрО 7909 |
ЗЕО Ю N0:34 | ТСС ΑΤΘ АСО ТТС СТО АТС СТ | СрО1668 |
СрС-содержащие олигонуклеотиды могут также быть использованы сами по себе или в комбинации с другими адъювантами. Например, усиленная система включает комбинацию СрС-содержащего олигонуклеотида и производного сапонина, в частности, комбинацию СрС и 0821. как раскрыто в νθ 00/09159 и νθ 00/62800.
Композиция может дополнительно содержать эмульсию типа масло в воде и/или токоферол.
Другой подходящий адъювант представляет собой сапонин, например, 0821 (Λςυίΐα Вюрйагтасеибсак 1пс., Ргаттдйат, МА), который может быть использован сами по себе или в комбинации с другими адъювантами. Например, усиленная система включает комбинацию монофосфорил липида А и производного сапонина, как например комбинация 0821 и ЗП-МРЬ, как описано в νθ 94/0015З, или менее реактогенную композицию, где 0821 нейтрализован холестерином, как описано в νθ 96/ЗЗ7З9. Другие подходящие композиции включают эмульсию типа масло в воде и токоферол. Особенно эффективная адъювантная композиция, включающая 0821, ЗО-МРЬ и токоферол в эмульсии типа масло в воде, описана в νθ 95/17210.
В другом воплощении адъюванты могут быть изготовлены в липосомной композиции. Используемое количество ЗИ-МРЬ в большинстве случаев невелико, но, в зависимости от иммунотерапевтической композиции, может составлять 1-1000 мкг на дозу, предпочтительно 1-500 мкг на дозу и более предпочтительно от 1 до 100 мкг на дозу.
В одном воплощении адъювантная система содержит три иммуностимулятора: СрСолигонуклеотид, ЗИ-МРЬ и 0821, представленные или в липосомной композиции, или в эмульсии типа масло в воде, как описано в νθ 95/17210.
Количество СрС или иммуностимулирующих олигонуклеотидов в адъювантах или иммунотерапевтических средствах по настоящему изобретению в большинстве случаев невелико, но, в зависимости от иммунотерапевтической композиции, может составлять 1-1000 мкг на дозу, предпочтительно 1-500 мкг на дозу и более предпочтительно от 1 до 100 мкг на дозу.
Количество сапонина для использования в адъювантах по настоящему изобретению может составлять 1-1000 мкг на дозу, предпочтительно 1-500 мкг на дозу, более предпочтительно от 1 до 250 мкг на дозу и наиболее предпочтительно от 1 до 100 мкг на дозу.
В большинстве случаев, каждая человеческая доза может содержать 0,1-1000 мкг антигена, например 0,1-500 мкг, 0,1-100 мкг или от 0,1 до 50 мкг. Оптимальное количество для конкретного иммунотерапевтического средства может быть установлено стандартными исследованиями, включая наблюдение соответствующих иммунных ответов у вакцинированных субъектов. После первичной вакцинации субъекты могут пройти одну или несколько вторичных иммунизаций через соответствующие интервалы времени.
Другие подходящие адъюванты включают Моп!ашбе 18А 720 (8еррю, Ргапсе), 8АР (СЫгоп, СайГогша, Ипйеб 81а1е5), 18СОМ (С8Ь), МР-59 (СЫгоп), КлЫ Ие1ох, ВС-529 (С8К, НатШоп, МТ) и другие аминоалкил-глюкозаминид 4-фосфаты (АСР).
Соответственно, предложена иммуногенная композиция для применения в способе по настоящему
- 14 016347 изобретению, содержащая антиген, как раскрыто здесь, и адъювант, где адъювант содержит одно или более из 3П-МРЬ, 0821, СрС-олигонуклеотида, простого или сложного эфира полиэтилена, или комбинацию двух или более из этих адъювантов. Антиген в иммуногенной композиции может быть представлен в эмульсионном наполнителе типа масло в воде или типа вода в масле или в липосомной композиции.
В одном воплощении адъювант может содержать одно или более из 3П-МРЬ, 0821 и иммуностимулирующего СрС-олигонуклеотида. В одном воплощении присутствуют все три иммуностимулятора. В другом воплощении 3П-МРЬ и 0821 представлены в эмульсии типа масло в воде, и в отсутствии СрСолигонуклеотида.
Композиция для использования в способе по настоящему изобретению может содержать фармацевтическую композицию, содержащую опухоль-ассоциированный антиген, как описано здесь, или слитый белок в фармацевтически приемлемом эксципиенте.
На всем протяжении данного описания и последующей формулы изобретения, если контекст не требует иного, под словом содержать и вариациями, такими как содержит или содержащий, будут понимать включение установленного целого или стадии, или группы установленных целых или стадий, но не исключение какого-либо другого целого или стадии, или группы целых или стадий.
Изобретение будет в дальнейшем описано посредством ссылки на следующие неограничивающие примеры, в которых ЯТ-РСЯ относится к полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.
Примеры
Пример 1. Полуколичественная ПЦР - замороженные образцы ткани.
Праймеры: 8Е0 ΙΌ N0:1 и 8Е0 ΙΌ N0:2.
Выделение РНК: способ очистки РНК жидким азотом
Маленький кусочек ткани быстро замораживали в жидком азоте и затем помещали в ступку для механического измельчения толкушкой. 100 мг полученного порошка добавляли к 100 мкл ТпРиге реагента для выделения и РНК выделяли в соответствии с инструкциями изготовителя (01адеп, Уеп1о, №ГЪег1аиЙ8). Концентрацию РНК определяли по значению оптической плотности при 260 нм.
Полуколичественная МАСЕ-А3 ЯТ-РСЯ
Полуколичественную ЯТ-РСЯ проводили, как описано Эе Р1аеп е1 а1 (1ттиподепеЕс8 40:360, 1994). Синтез кДНК из 2 мкг всей РНК проводили в 20 мкл смеси, содержащей 1х первый стандартный буфер, 0,5 мМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата (6№ТР), 10 мМ дитиотриетола, 20 ЕД ингибитора РНКаз, 2 мМ олиго(ДГ)15 и 200 ЕД обратной транскриптазы М-МЬУ, в течение 1 ч 30 мин при 42°С. 50 нг кДНК амплифицировали посредством ПЦР в 25 мкл смеси, содержащей праймеры, специфичные в отношении МАСЕ-А3 (8Е0 ΙΌ N0:1 и 2). 10 мкл аликвоту каждой реакции использовали для электрофореза на 1% агарозном геле и визуализировали флуоресценцией с бромидом этидия. Размеры ампликонов составляют 725 пар оснований (Ьр) и 805 Ьр при амплификации иРНК и геномной ДНК (гДНК) соответственно.
Положительные контроли для полуколичественной МАСЕ-А3 ЯТ-РСЯ
Для этих экспериментов были введены три положительных контроля.
(1) К каждой ПЦР-реакционной смеси добавляли клонированный фрагмент геномной ДНК МАСЕА3. Это приводит к образованию фрагмента 805 Ьр (на 80 Ьр больше фрагмента, образуемого из кДНК), всегда присутствующего при отсутствии ингибирования ПЦР. Это действует в качестве положительного контроля для проверки эффективности ПЦР в МАСЕ-А3-отрицательных образцах.
(2) Для каждого МАСЕ-А3-исследования синтез кДНК проводили параллельно на опухолевых образцах и на РНК, выделенной из Сег1 меланомной клеточной линии МХ-2-3.0. Для признания положительными опухолевые образцы должны давать сигнал, составляющий 1% от уровня кДНК Сег1 клеточной линии МХ-2-3.0.
(3) ПЦР на бета-актин (табл. 1) проводили на каждом образце с целью выявления образцов со значительно деградированной РНК. Если сигнал бета-актина, получаемый от МАСЕ-А3-отрицательного опухолевого образца, был слабее сигнала, получаемого от МХ-2-3.0, то число циклов корректировали для клинического образца таким образом, чтобы интенсивность ампликона бета-актина достигала необходимого уровня.
Отрицательные контроли для полуколичественной МАСЕ-А3 ЯТ-РСЯ
Для этих экспериментов были введены три отрицательных контроля:
(1) РНК, выделенная из клеточной культуры ЬВ 23-1/2, которая, как известно, МАСЕ-А3отрицательна;
(2) контроль водой в реакции обратной транскрипции (ЯТ-реакции); и (3) контроль водой на стадиях ПЦР.
Интерпретация данных нг образец иРНК из опухолевого образца признавали МАСЕ-А3-положительным, если количество ампликона 725 Ьр было равным или превышало количество ампликона, полученного с использованием 0,5 нг РНК от Сег1 клеточной линии М2-2-3.0 РНК (то есть, эквивалентно 0,1% Сег1 РНК; см. положительные контроли). Количества оценивали флуоресценцией с бромидом этидия. Добавляли положитель
- 15 016347 ные и отрицательные контроли.
Классы полуколичественной МАСЕ-АЗ КТ-РСК: пять стандартных классов (Эе Р1аеп е1 а1., 1994) присваивали полуколичественному МАСЕ-АЗ КТ-РСК исследованию. Они являются субъективной оценкой и представляли собой, от наименьшей экспрессии к наибольшей, -, -/+, +, ++, +++. Пример того, как могут быть присвоены эти классы, показан на фиг. 16: на этой фиг. классы присвоены в соответствии с полоской, образуемой положительным контролем, как показано в табл. 6 ниже.
Таблица 6
РНК положительный контроль | ||||
100 | 50 | 10 | 2 | 1 | 0,5 |
Класс | +++ | ++ | + | +/- |
Пример 2. Количественная Тадтап КТ-РСК в реальном времени - замороженные образцы ткани. Количественная Тадтап КТ-РСК в реальном времени
Праймеры: КЕО ГО ИО:З и КЕО ГО ИО:4; зонд: КЕО ГО ИО:1З (экзон). Праймеры: КЕО ГО ИО:5 и КЕО ГО ИО:6; зонд: КЕО ГО ИО:14 (интрон). Полуколичественная ПЦР (для сравнительных исследований). Праймеры: КЕО ГО ИО:1 и КЕО ГО ИО:2.
Материалы и методы. Пациенты и сбор образцов
Биопсийный материал от ГБ и II стадий немелкоклеточных раков легкого (ИКСЬС) получали хирургически. Пациенты были включены в два клинических исследования, СКК 24955З/004 (МАСЕЗ-АК02В004) и ЕрИетю-М АСЕЗ-15З; пациенты пописывали информированное согласие и им объясняли суть и возможные последствия исследований. Биопсийный материал погружали в РНК-стабилизирующий раствор (КИА-1а1ег, АтЫоп, СатЬпбде, ИК) непосредственно после хирургического удаления и хранили при -20°С.
КИАЫГег представляет собой реагент для хранения тканей, стабилизирующий и защищающий клеточную РНК в интактных, незамороженных образцах ткани. КИАЫег устраняет необходимость немедленно замораживать образцы в жидком азоте.
Выделение РНК: способ очистки РНК с использованием шаровой мельницы (М1хег МШ)
Образец ткани удаляют из КИАЬаГег и добавляют к ТпРиге [8о1аНоп КеадепГ (КосНе, У1коогбе, Ве1дшт). Ткань затем добавляют в шаровую мельницу, содержащую вольфрамовые шарики. После разрушения в шаровой мельнице всю клеточную РНК выделяли из максимум 100 мг ткани с использованием реагента ТпРиге в соответствии с инструкциями изготовителя (О1адеп, Уеп1о, Ие1йег1апбк). Концентрацию РНК определяли по значению оптической плотности при 260 нм.
Исследование МАСЕ-АЗ ТадМап КТ-РСК - замороженная ткань кДНК, соответствующую 50 нг всей РНК, амплифицировали посредством ПЦР в 25 мкл смеси, содержащей буфер ТадМап, 5 мМ МдС12, 0,4 мМ дезоксиуридинтрифосфата (бИТР), 0,2 мМ каждого нуклеотида, 0,625 ЕД ДНК-полимеразы АшрН Тад Со1б, 0,05 ЕД урацил-ДНК-гликозилазы (ИИС), 0,2 мкМ каждого олигонуклеотидного праймера и 0.2 мкМ зонда ТадМап. Использовали специфичные олигонуклеотидные праймеры и зонды (табл. 2; КЕО ГО ИО:З, 4 и 1З и КЕО ГО ИО:5, 6 и 14). Зонды мечены красителями ЕАМ™, ИЕЭ™ и УТС™ (Аррйеб Вюку81ет8, СА, ИКА) и обладают группировкой, связывающей малую бороздку, (МСВ™; также от Аррйеб Вюку81ет8, СА, ИКА). Дополнительные эксперименты в настоящее время проводят с использованием красителя ЕАМ вместо ИЕЭ для МАСЕ-специфичных зондов.
Экзон МАСЕ-АЗ и ген бета-актина амплифицировали количественной ПЦР с использованием химии ТадМаи на системе 7700 или 7900 (РЕ АррНеб Вюку81ет8, ^агг1идГои, ИК). ПЦР-амплификацию также проводили в интроне гена МАСЕ-АЗ для проверки отсутствия контаминации геномной ДНК. Профиль амплификации представлял собой 1 цикл в течение 2 мин при 50°С, 1 цикл в течение 12 мин при 95°С и З5 циклов, включающих 15 с при 95°С и 1 мин при 60°С. Флуоресцентный сигнал, генерируемый деградацией зонда ТадМап, выявляли в реальном времени в течение всех стадий элонгации.
Проверка достоверности исследования ТадМап КТ-РСК для определения специфичности в отношении МАСЕ-АЗ
Праймеры: КЕО ГО ИО:З и КЕО ГО ИО:4; зонд: КЕО ГО ИО:1З (экзон) -ТадМап КТ-РСК.
Праймеры: КЕО ГО ИО:1 и КЕО ГО ИО:2 (полуколичественная ПЦР - для сравнительных исследований).
Плазмиды и клеточные линии
Используемые плазмиды содержали полной длины кДНК генов МАСЕ-А1 (МАСЕ-1; СепЬапк ассеккюп ИМ 004988), МАСЕ-А2 (МАСЕ-2; СепЬапк ассеккюп Ь18920), МАСЕ-АЗ (МАСЕ-АЗ; СепЬапк ассеккюп ИМ 005З62), МАСЕ-А4 (МАСЕ-4; СепЬапк ассеккюп 002З62). МАСЕ-А6 (МАСЕ-6; СепЬапк ассеккюп ИМ 005З6З), МАСЕ-А8 (МАСЕ-8; СепЬапк ассезвюп ИМ 005З64), МАСЕ-А9 (МАСЕ-9; СепЬапк ассезвюп ИМ 005З65), МАСЕ-А10 (МАСЕ-10; СепЬапк ассеккюп ИМ 021048). МАСЕ-А11 (МАСЕ11; СепЬапк ассеккюп ИМ 005З66) и МАСЕ-А12 (МАСЕ-12; СепЬапк ассеккюп ИМ 005З67). Клеточные линии М2-2-З.0 (МАСЕ-АЗ-положительная) и ЬВ 2З-1/2 (МАСЕ-АЗ-отрицательная) были любезно предоставлены РгоГекког ТЫепу Вооп, Ьибтад тййиГе, Вгиккек, Ве1дшт.
- 16 016347
Специфичность способа МАСЕ-А3 Тас.|Мап тестировали с использованием 1х104, 1х105 и 1х106 копий плазмид, содержащих полной длины кДНК генов МАСЕ-А1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11 и 12.
Сравнение последовательностей генов МАСЕ-А (МАСЕ-А1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11 и 12) в области разработанных МАСЕ-А3 ПЦР-праймеров и зондов показано на фиг. 14. Последовательности прямого и обратного МАСЕ-А3 праймеров подчеркнуты; последовательность МАСЕ-А3 зонда заключена в рамку. Обратные праймеры комплементарны области последовательности, которую они распознают, то есть А означает Т, С означает С, Т означает А, и С означает С.
Положительные контроли МАСЕ-А3 Тас.|Мап КТ-РСК: (1) фрагмент геномной ДНК МАСЕ-А3, и (2) известные количества РНК, выделенные из Сег1 клеточной линии М2-2-3.0 (МАСЕ-А3положительной меланомной клеточной линии).
Отрицательные контроли МАСЕ-А3 Тас.|Мап КТ-РСК: (1) РНК, выделенная из клеточной культуры ЬВ 23-1/2, которая, как известно, МАСЕ-А3-отрицательна, (2) контроль водой в КТ-реакции, и (3) контроль водой на стадиях ПЦР. Проводили 40 циклов КТ-РСК. Отрицательный контроль должен быть >35. Некоторые из результатов экспериментов ТацМап были представлены как 1/С1.
Статистика: сравнение двух методик ПЦР
Для сравнения результатов полуколичественной КТ-РСК (праймеры 8ЕО ΙΌ N0:1 и 8Е0 ΙΌ N0:2) и количественной Тас.|Мап РСК в реальном времени (праймеры: 8Е0 ΙΌ N0:3 и 8Е0 ΙΌ N0:4; зонд: 8Е0 ΙΌ N0:13), с использованием методик, описанных здесь, была создана 2х2 таблица сопряжённости признаков (табл. 3). Переменная номинальной шкалы принимала два значения: положительное и отрицательное. Отрицательные значения включали ноль и пограничные значения; под пограничным значением подразумевают значение от 0,8% до 1,2% Сег1 при полуколичественной КТ-РСК и результаты менее 1% при исследовании Тас.|Мап. Положительные значения сортировали на основании визуальной оценки полосок на геле относительно экспрессии бета-актина для способа полуколичественной КТ-РСК, и положительные значения включали все результаты >1% при исследовании ТацМап. Совпадение по обоим способам вычисляли как отношение суммы числа двойных положительных и двойных отрицательных образцов к общему числу образцов. Для сравнения соотношений дискордантных пар (отрицательныеположительные) применяли тест Мс№тат. Вычисляли доверительные интервалы (СГ).
Оптимизация количественной Тас.|Мап КТ-РСК
Тас.|Мап КТ-РСК на МАСЕ-А3 с использованием 8уЬт дгееп
8уЬт дгееп является компонентом, связывающим ампликоны неселективно, без специфичного в отношении последовательности зонда. КТ-РСК в реальном времени проводили на генных клонах семейства МАСЕ-А с использованием четырех различных разведений клонов МАСЕ-А (20 пг, 2 пг, 0,2 пг и 0,02 пг) (фиг. 1, где результаты показаны как 1/СЧ по оси Υ). Положительный результат был получен для МАСЕА3 при СЧ 14, и для МАСЕ-А6 было получено значение СЧ 16 (с 20 пг плазмид). Для МАСЕ-А4, А8 и А9 был показан уровень СЧ 30, и для других генов МАСЕ была показана очень слабая экспрессия с СЧ 35 и выше.
Тас.|Мап КТ-РСК на МАСЕ-А3 с использованием специфичного в отношении последовательности зонда
С использованием тех же МАСЕ-А3 праймеров (8Е0 ΙΌ N0:3 и 4), но с зондом (8Е0 ΙΌ N0:13), тестировали эффективность различения МАСЕ-А3 и А6, используя различные разведения соответствующих колонов членов семейства МАСЕ-А (фиг. 2). Во-первых, в каждом из разведений было установлено ожидаемое снижение МАСЕ-А3 СЧ. Клон МАСЕ-А6 не демонстрирует высокого 1/СЧ при использовании зонда, что указывает на отсутствие перекрестной реактивности.
Введение 1 х 106 МАСЕ-А6 плазмиды в раствор МАСЕ-А3 плазмиды, как показано на фиг. 3, не оказывает никакого эффекта, и результат повторяет результат титрования МАСЕ-А3 плазмиды. Это указывает на отсутствие конкурентного эффекта МАСЕ-А6 в присутствии МАСЕ-А3 с применением Тас.|Мап РСК.
Результаты
Опухолевая экспрессия МАСЕ-А3, сравнение полуколичественного и количественного способов
Достоверность Тас.|Мап-специфичной количественной ПЦР дополнительно проверяли в сравнении со стандартной полуколичественной КТ-РСК на МАСЕ-А3 (с использованием праймеров 8Е0 ΙΌ N0:1 и 2). 71 образец опухоли от пациентов с №СЬС использовали для непосредственного сравнения количественного (с использованием праймеров 8Е0 ΙΌ N0:3 и 4 и зонда 8Е0 ΙΌ N0:13) и полуколичественного способов оценки экспрессии МАСЕ-А3 (с использованием праймеров 8Е0 ΙΌ N0:1 и 2).
Результаты указывают на хорошую конкордантность двух способов на уровне 95,8% (табл. 3) при совпадении 68/71. Количественное Тас.|Мап КТ-РСК и полуколичественное КТ-РСК исследование были дискордантны для трех образцов, с завышением положительности результатов при полуколичественной КТ-РСК. Тем не менее, при тесте Мс№тат было выявлено симметричное перераспределение этих трех дискордантных результатов (р=0,25), указывая на то, что ни одна из методик не имела тенденции приводить к более дискордантным результатам по сравнению с другой методикой. При более подробном исследовании непостоянный уровень экспрессии бета-актина в этих образах приводил к ложноположительным результатам в способе полуколичественной КТ-РСК.
- 17 016347
Для представления распределения данных Тас.|Мап РСК для каждого класса, определенного полуколичественной КТ-РСК была использована ящичковая диаграмма (Ьох ρΐοΐ, фиг. 4). Хотя конкордантность обоих способов, на основании 2x2 таблицы сопряжённости признаков, была отличной, по ящичковым диаграммам было выявлено некоторое перекрывание различных классов, указывая, что полуколичественная оценка не совпадала полностью с количественным измерением Тас.|Мап КТ-РСК. Перекрывание может быть обусловлено тем фактом, что оценку проводили разные операторы при разных обстоятельствах, что может увеличивать вариабельность. В этом смысле, количественное исследование Тас.|Мап КТРСК является значительно более независимым от этих факторов и, следовательно, является более воспроизводимым.
Пример З. Анализ ткани, зафиксированной в парафине, (ЕЕРЕ) посредством КТ-РСК
Материалы и методы
РНК выделяли из ЕЕРЕ-образцов с применением патентованного способа Кекропке Сепейск 1пс., как раскрыто в патентах США И8 661З518; И8 6610488; И8 642896З; И8 62485З5, включенных сюда посредством ссылки. Альтернативно, РНК может быть получена из ткани, зафиксированной в парафине, в соответствии с любым опубликованным способом. Например, срезы тканей могут быть удалены из парафина с использованием ά-лимонена или другого лизирующего буфера и затем отмыты в растворе на основе этанола. Срезы могут затем быть обработаны протеиназой К в течение ночи и затем отмыты, и РНК может быть очищена колоночной хроматографией. Тас.|Мап КТ-РСК в реальном времени проводили на образцах с использованием праймеров 8ЕО ΙΌ ЫО:З и 8ЕО ΙΌ N0:4 и зонда 8Е0 ΙΌ Ы0:1З; праймеры и зонды разработаны для использования в замороженной ткани (см. пример 2 выше).
Результаты: экспрессия Маде АЗ
В табл. 4 показаны результаты, выраженные как значения С!, для зафиксированной в формалине заключенной в парафин (ЕЕРЕ) ткани. Числа по оси Υ обозначают образцы человеческих опухолей 990118990784. В анализ были также включены положительные контроли: ТС1 (МадеЗ); Сег1 (МАСЕ-АЗ меланомная клеточная линия); и СКЕ 1675 (меланомная клеточная линия). Значения С! превышают те, которые можно было ожидать для МАСЕ-АЗ праймеров для полуколичественной КТ-РСК замороженной ткани. Для целей этих экспериментов верхним пределом чувствительности признают уровень С! З6-З7. Положительный контроль Сег1 МАСЕ-АЗ имеет С! З1 в рамках предела чувствительности, но значительно ниже, чем в полуколичественном КТ-РСК исследовании. С этими уровнями праймеры и зонд для количественной оценки МАСЕ-АЗ в замороженной ткани (табл. 2, праймеры 8Е0 ΙΌ N03 и 8Е0 ΙΌ N0:4 и зонд 8Е0 ΙΌ N0:^, специфичные в отношении З экзона МАСЕ-АЗ) не могут быть достаточно чувствительными для выявления экспрессии МАСЕ-АЗ в ЕЕРЕ-образцах опухолей: образцы, являющиеся МАСЕ-АЗ-положительными, но экспрессирующие МАСЕ-АЗ лишь в небольшой степени, не могут быть выявлены.
В эксперимент были включены образцы положительных контролей из ЕЕРЕ-ткани: ТС1 (МадеЗ) и Сег1 (МАСЕ-АЗ-положительный контроль), и СКЬ 1675. Человеческие опухоли 990118-990784 анализировали количественной Тасрпап КТ-РСК с использованием праймеров для замороженной ткани 8Е0 ΙΌ N03 и 8Е0 ΙΌ N0:4 и зонда 8Е0 ΙΌ N0:^, с использованием РНК из ткани, зафиксированной в парафине. Результат этого анализа показан на фиг. 5.
Доработка праймеров МАСЕ-АЗ Тас.|Мап для использования в ЕЕРЕ-ткани
Размер ампликона для основанного на КХАБаЮг МАСЕ-АЗ исследования замороженной ткани (описанного в примере 2) превышает 100Ьр. С целью получения более чувствительных результатов для деградированной РНК, обнаруженной в ЕЕРЕ-образцах, были разработаны новые праймеры для уменьшения размера ампликона с целью повышения чувствительности МАСЕ-АЗ исследования (табл. 5). Для обоих исследований, описанных в Примерах 2 и З, использовали зонд МСВ™ (Мтог Сгооуе Втбтд) для увеличения специфичности исследований. Зонд МСВ связывает малую бороздку ДНК, образуя чрезвычайно стабильный дуплекс, что приводит к повышению специфичности праймера.
Тестирование новых МАСЕ-АЗ праймеров на специфичность и чувствительность
Наборы заново разработанных праймеров (табл. 5) тестировали на кДНК членов семейства генов Маде-А (фиг. 6а), где набор 1 представляет собой праймеры 8Е0 ΙΌ N0:7, 8Е0 ΙΌ N0:8, зонд 8Е0 ΙΌ N0:15; Набор 2 представляет собой праймеры 8Е0 ΙΌ N0:9, 8Е0 ΙΌ N0:10, зонд 8Е0 ΙΌ N0:16; набор З представляет собой праймеры 8Е0 ΙΌ N0:11, 8Е0 ΙΌ N0:12, зонд 8Е0 ΙΌ N0:17; и набор 4 представляет собой праймеры 8Е0 ΙΌ N03, 8Е0 ΙΌ N0:4, зонд 8Е0 ΙΌ N0:^.
Как показано на фиг. 6а, праймеры 8Е0 ΙΌ N0:7 и 8 имеют высокие уровни С! в отношении МАСЕАЗ, но также в отношении Маде-2 и Маде-12. Праймеры 8Е0 ΙΌ N0:9 и 10 имеют высокие уровни С! в отношении МАСЕ-АЗ и незначительное С! в отношении МАСЕ-А6, но это выходит за нормальные рамки экспрессии МАСЕ-АЗ. Праймеры 8Е0 ΙΌ N0:11 и 12 незначительно менее чувствительны, чем 8Е0 ΙΌ N0:9 и 10. Таким образом, в настоящих экспериментах праймеры 8Е0 ΙΌ N0:9 и 10 были выбраны для дальнейшего тестирования в ЕЕРЕ-ткани. Эти праймеры 8Е0 ΙΌ N0:9 и 10 в дальнейшем тестировали в серии разведений РНК и для них была показана хорошая линейная область вплоть до более низких разведений, указывая на то, что праймеры должны иметь хорошую чувствительность и являются подхо
- 18 016347 дящими для исследования (фиг. 6б).
Сравнение ТадМап исследований на МАСЕ-А3 с использованием замороженной и РРРЕ-ткани
Сорок два РРРЕ опухолевых образца сравнивали с использованием праймеров ЗЕф ΙΌ N0:9, ЗЕф ΙΌ N0:10 и зонда ЗЕф ΙΌ N0:16, выполняя то же исследование с замороженной тканью с использованием праймеров ЗЕф ΙΌ N0:3, ЗЕф ΙΌ N0:4 и зонда ЗЕф ΙΌ N0:13 (фиг. 7). Уровень положительности исследования установлен на 1% дег1 (положительный контроль) и, при непосредственном сравнении, повидимому, между двумя исследованиями существует некоторая конкордантность. Есть несколько МАСЕ-А3-положительных пациентов МАСЕ-А3, результаты которых не совпали с МАСЕ-А3 исследованием замороженной ткани; это может быть объяснено макроскопическим удалением опухолевых областей, приводящим к увеличению чистоты опухолевых клеток, экспрессирующих МАСЕ-А3. Удаление большей части разбавляющих нормальных клеток приводило к МАСЕ-А3-положительному результату. Было продемонстрировано значение К2 (статистический тест линейной корреляции) 0,92 между РРРЕтканью и КУЛЕиег-замороженной тканью, указывая на хорошую корреляцию двух способов (фиг. 8).
Пример 4. Тест С0ВАЗ™ Тадтап МАСЕ-А3 Тек!.
Таблица 7. Последовательности МАСЕ-А3 праймеров и зонда для С0ВАЗ™ Тадтап
Последовательности МА6Е-АЗ праймеров для СОВАЗ™ Тадтап | |
ΜΑΘΕΑ3ί-623Ε: (Н\Л/_МАСЕАЗ_Е; ЗЕО Ю N0:11) | 5' ТСТСОТССОАААТТСССАСТАТ 3' |
МА6ЕАЗТ- 697Р:(НУУ_МАСЕАЗ_Н; ЗЕО Ю N0:12) | 5' САААСАССАССТССААСОААСТ 3' |
Последовательность ΜΑΘΕ-Α3 зонда для СОВАЗ™ Тадтап | |
ΜΑΘΕΑ3Ε-646ΜΟϋ I 5’ - ΕίΡίίίΡΕίΟΘΙΟΑΙΡίΙΡΑΘΡΑΑΑΘΕΙΙΡΡ - 3' ЗЕО Ю N0:53 |
Е=репортерный краситель РАМ, Р=5-метил 6С, О = гаситель ВНС2. Ь = 5-пропинил 6И, Р = фосфат, Ι = репортер НЕХ.
Последовательность зонда МАСЕА3Р-646М0П содержит следующие модфицированные нуклеотиды (ЗЕО ΙΌ N0:54): 5' - ТСТТТССТСТСАТСТТСАССАААССТТС-3'.
Таблица 8. Последовательности праймеров и зонда С0ВАЗ Тадтап для бета-актина
Последовательности праймеров Тадтап для бета-актина | |
КС1„ВАСТ_Е2: (ЗЕО Ю N0:55) | 5'-САССОССССТАСА6СТТ-3' |
Н01_ВАСТ„Н2: (ЗЕО Ю N0:56) | б’-ТССТТААТОТСАСССАССАТТТ-З' |
Последовательность зонда Тадтап для бета-актина | |
Н\Л/_Ж31ВАСТДН: (ЗЕО Ю N0:57) | 5'-1АССАССАОС<3<ЗССОАОСеОР-3' |
Е = репортерный краситель РАМ, Р= 5-метил 6С, О = гаситель ВНС2, Ь = 5-пропинил 6И, Р = фосфат, Ι = репортер НЕХ.
Таблица 9. Действительный диапазон С! для образцов и контролей
Контролю | Действительный диапазон С1 |
РРРЕТ-образец (образец РРРЕ-ткани) ген Маде 50 нг РАМ | <35,2 |
РРРЕТ-образец ген бета-актина 50 нг НЕХ | <32,1 |
100% Сег! ген Маде 50 нг РАМ | 26,0-29,5 |
100% ΘθγΙ ген бета-актина 50 нг НЕХ | 24,0-27,0 |
1% <3ег1 ген Маде 0,5 нг РАМ | 33,0-35,5 |
1 % Оег! ген бета-актина 0,5 нг НЕХ | 29,0-32,5 |
100% иНР ген Маде 50 нг РАМ | 25,0-28,0 |
100% инн ген бета-актина 50 нг НЕХ | 22,0-25,0 |
1 % инн ген Маде 0,5 нг РАМ | 31,0-33,0 |
1% иНН ген бета-актина 0,5 нг НЕХ | 27,0-29,0 |
Р53 положительный контроль ДНК 20 нг РАМ | 26,5-29,0 |
Отрицательный контроль (N0) | >38,0 |
- 19 016347
Таблица 10. Температурный профиль циклов.
Температурный профиль ПЦР для эксперимента исключительности МАСЕ-А3
Стадии | Описание | Температура | Время | Число циклов |
1 | Очистка от ΙΙΝΘ | 50°С | 5 минут | 1Х |
2 | Денатурация | 95°С | 15 секунд | 2Х |
Отжиг | 63°С | 25 секунд | I | |
3 | Денатурация | 92°С | 15 секунд | 53Х |
Отжиг | 63°С | 50 секунд | ||
4 | После циклов | 40°С | 2 минуты | 1Х |
Таблица 11. Температурный профиль КТ-РСК. для экспериментов линейности и эффективности КТ-РСК, расчетной чувствительности (предела выявления), корреляции способов и воспроизводимости
Стадии | Описание | Температура | Время | Число циклов |
1 | Очистка от υΝΟ | 50°С | 5 минут | 1Х |
2 | Денатурация | 95°С | 1 минута | 1Х |
3 | Обратная транскрипция | 60°С | 20 минут | 1Х |
4 | Денатурация | 95°С | 15 секунд | 2Х |
Отжиг | 63°С | 25 секунд | ||
6 | Денатурация | 92°С | 15 секунд | 53Х |
Отжиг | 63°С | 50 секунд | ||
7 | После циклов | 40°С | 2 минуты | 1Х |
Относительно высокую температуру отжига в 63°С использовали для улучшения МАСЕ-А3 специфичности относительно других членов семейства МАСЕ-А.
Анализ данных
Значения С! для МАСЕ-А3 и β-актина вычисляют с использованием программного обеспечения АМРЫЬГПК 3.1 (Коске, СА, И8А) на рабочей станции С0ВА8ТМ Тас.|Мап 48 Апа1у/сг (КосЕе, СА, И8А), на основании параметров исследования, определенных в Тез! ЭеПпЦюп Е11е. Анализ данных для экспрессии генов будут проводить, получая значения С! для МАСЕ-А3 и (3-актина из АМРЫЕЕПК™ для последующих вычислений для определения экспрессии гена МАСЕ-А3 относительно гена β-актина. Для каждого опыта будут включены контроли для установления пороговой экспрессии МАСЕ-А3, которая должна быть достигнута или превышена для того, чтобы назвать образец МАСЕ-А3-положительным. В качестве положительного контроля используют РНК из клеточной линии СЕКТ. СЕКТ РНК разводят в воде 1:100 (1% СЕКЬ) и определяли С! МАСЕ-А3. В дополнение, неразведенную СЕКЬ РНК (100% СЕКТ) тестируют без разведения для измерения С! β-актина. Вычисляют значение разности С! между С! β-актина от 100% СЕКЬ контроля и С! МАСЕ-А3 от 1% СЕКЬ контроля и определяют относительную экспрессию МАСЕ-А3 на основании следующего вычисления:
пороговая экспрессия МАОЕ-АЗ = 2п(С'01100% 0ΕΗι'α МАСЕ'АЗ от 1% СЕК1>
Для заключенных в парафин образцов будет использована та же контрольная стратегия, за исключением того, что для установления пороговой экспрессии РНК от клеточной линии СЕКЬ будет заменена на РНК от СЕКЬ ЕЕРЕ Хеподгай, выделенную с применением способа О1АСЕХ ЕЕРЕ.
Поскольку тест С0ВА8™ Тасрпап МАСЕ-А3 представляет собой сложную реакцию, значения С! для МАСЕ-А3 и β-актина получают из одной реакционной пробирки. Для каждого тестируемого образца относительную экспрессию МАСЕ-А3 вычисляют по следующему уравнению:
экспрессия ΜΑΘΕ-Α3 в тестируемом образце = = 2^° ₽_актина от образца - С1 МА6Е-АЗ от образца)
Если экспрессия МАСЕ-А3 в тестируемом образце больше или равна пороговому уровню экспрессии МАСЕ-А3, установленному на основании СЕКЬ РНК контролей, то образец называют положительным в отношении МАСЕ-А3. Если экспрессия МАСЕ-А3 в тестируемом образце меньше порогового уровня экспрессии МАСЕ-А3, установленного на основании контролей, то образец называют отрицательным в отношении МАСЕ-А3.
Экспрессию МАСЕ-А3 будут определять, устанавливая средние значения С! МАСЕ-А3 и С! βактина от репликатов для каждого образца для вычисления разности С! (С! β-актина - С! МАСЕ-А3). Если для репликата С! МАСЕ-А3 или С! β-актина ниже С! отсечки данного теста, но для другого репликата С! МАСЕ-А3 или С! β-актина выше С! отсечки, образец будут тестировать заново. Если для обоих реп
- 20 016347 ликатов значения С! β-актина выше С! отсечки, то образец маркируют как образец с С! β-актина, выходящим за пределы, и результат не устанавливают. Если для обоих репликатов значения С! МАСЕ-А3 выше значения С! МАСЕ-А3 отсечки, но экспрессия МАСЕ-А3 превышает пороговую, то образец помечают как образец с С! МАСЕ-А3, выходящим за пределы, и результат не устанавливают. Эта стратегия анализа данных согласуется с исследованиями по перекрестной проверке достоверности для корреляции способов, описанными в разделе Корреляция способов ниже.
Для теста СОВА8™ Тас.|тап МАСЕ-А3, Нитап ОРСВ Нитап ВеГегепсе То!а1 ΒΝΛ (ИНВ) от 81га1адепе может быть использована в качестве положительного контроля и для установления пороговой экспрессии на основании экспрессии МАСЕ-А3 в этой хорошо охарактеризованной РНК. Разведенную ИНВ можно тестировать в каждом опыте совместно с СЕРЕ РНК контролями для установления подходящего порога экспрессии с контролем ИНВ.
Условия хранения образцов и реагентов
Все РНК и ДНК, включая плазмиды, Р53-положительную контрольную ДНК, клиническую РНК из ЕЕРЕ-ткани (ЕЕРЕТ РНК), ИНВ, СЕВЬ и 8ТАС хранят при -80°С. Все реагенты для теста, включая Ишуегза1 ВЫА Маз!ег М1х, смесь праймеров/зонда, смесь ко-факторов и разбавитель для образцов/отрицательный контроль хранят при 2-8°С.
Исключительность МАСЕ-А3.
Экспериментальное тестирование праймеров и зондов с использованием ДНК плазмид, содержащих членов семейства МАСЕ-А
Цель. Определение способности теста специфично амплифицировать ген МАСЕ-А3 при исключении значимой ко-амплификации/выявления других родственных генов.
Материал образцов. Будут тестировать плазмидную ДНК, содержащую МАСЕ-А3 и родственные члены семейства (более подробно о плазмидах см. Пример 2 выше).
Методика. Экспериментальная оценка теста СОВА8 Тас.|Мап МАСЕ-А3 Тез! с использованием ДНК плазмид, содержащих членов семейства МАСЕ-А, для определения того, происходит ли амплификация родственных генов и их выявление в значимых количествах.
Каждый образец плазмидной ДНК тестировали трижды при четырех различных концентрациях ДНК (20, 2, 0,2, 0,02 пг). Температурный профиль проведения циклов, показанный в табл. 10, был модифицирован для удаления стадии обратной транскрипции при 60°С в течение 20 минут. Концентрацию плазмидной ДНК определяли посредством анализа Ыаиобгор.
Анализ
Для МАСЕ-А3 плазмиды определяли значения С! и сравнивали со значениями С! от плазмид МАСЕ-А1, МАСЕ-А2, МАСЕ-А4, МАСЕ-А6, МАСЕ-А8, МАСЕ-А9, МАСЕ-А 10, МАСЕ-А11 и МАСЕА12. Разность С! вычисляли вычитанием из С! МАСЕ-АХ (каждого родственного члена семейства) С! МАСЕ-А3. Для вычисления С! и разности С! использовали средние значения С! от четырех репликатов.
Критерии приемлемости
Значения разности С! между МАСЕ-А3 и всеми другими плазмидами, за исключением МАСЕ-А6, должны быть больше или равны 10.
Результаты исключительности МАСЕ-А3
В табл. и графических материалах, приведенных здесь, в некоторых случаях термин СиВРЕ используют вместо МАСЕ; тем не менее, во всех случаях подразумевают термин МАСЕ.
Значения С! для всех тестированных МАСЕ плазмид показаны в табл. 12 и фиг. 17, показанных ниже. Тем плазмидам, с которыми не было амплификации, было присвоено значение С! 55, поскольку температурный профиль циклов состоит из 55 циклов. Как и ожидали, значения С! МАСЕ-А3 являются наименьшими для всех тестируемых уровней (табл. 12 и фиг. 17). Значения разности С! превышали 10 циклов для МАСЕ-А3 и всех других плазмид, за исключением МАСЕ-А6 (табл. 13 и фиг. 18). В значении разности С! между МАСЕ-А3 и МАСЕ-А6 не было необходимости, поскольку 95% пациентов, экспрессирующих МАСЕ-А6, также экспрессируют МАСЕ-А3.
Значение разности С! между МАСЕ-А3 и МАСЕ-А6 для 20 пг, 2 пг, 0,2 пг и 0,02 пг внесенной плазмидной ДНК составляло 9,3, 8,4, 7,8, и 8,2 циклов, соответственно. Поскольку было показано, что большинство значений С! МАСЕ-А3 для РНК от ЕЕРЕ-образцов превышало 27,2, для тестированных ЕЕРЕ-образцов сигнал от МАСЕ-А6 будет минимальным, так как задержка в 8,2 цикла будет приводить к значению С!, выходящему за пределы исследования.
Критерии приемлемости для исключительности были соблюдены.
В табл. 14 показана проверка достоверности эксперимента исключительности МАСЕ-А3; контрольные значения С! находились в пределах достоверного диапазона. Эксперимент прошел проверку достоверности. На табл. 15 и 16 показаны подробности эксперимента исключительности МАСЕ-А3.
Линейность и эффективность КТ-РСК
Цель. Определение линейности и эффективности обратной транскрипции теста.
Материал образцов. Для исследований линейности и эффективностей ВТ-РСВ использовали серийные разведения ЕЕРЕ ХеподгаГ! СЕВЬ РНК.
- 21 016347
Методика: ЕЕРЕ Хеиодгай СЕКЬ РНК разводили 2-кратными серийными разведениями от 100 нг до 0,1 нг и тестировали с использованием теста С0ВА8 ТадМаи МАСЕ-А3 Тез! для определения линейной области исследования. Тестировали десять репликатов при каждом уровне концентрации.
Анализ
Значения С! для каждого репликата, как для МАСЕ-А3, так и для β-актина, наносили на график против логарифма (по основанию 2) внесенной концентрации РНК для вычисления углового коэффициента линии и эффективностей КТ-РСК, Эффективность КТ-РСК-амплификации вычисляли с использованием уравнения:
угловой коэффициент = -1/логарифм (по снованию 2) * эффективность амплификации (АЕ).
Эффективность амплификации 2 эквивалентна 100%. Значения разности С! (С! МАСЕ-А3 - С! βактина) для каждого репликата наносили на график против логарифма (по основанию 2) внесенной концентрации РНК для определения углового коэффициента разности С!. От всех десяти репликатов для С! МАСЕ-А3, С! β-актина и разности С! вычисляли средние величины, стандартное отклонение и процентный коэффициент вариации (%СУ).
Критерии приемлемости для линейности
Линейную область исследования определяли на основании следующих критериев:
СУ для Οί МАСЕ-АЗ < 5%;
СУ для Οί β-актина < 5%;
СУ для разности Οί < 20%;
-0,10 < угловой коэффициент разности С1 < 0,10;
К2 > 0,95.
Критерии приемлемости для эффективности КТ-РСК
Эффективность амплификации МАСЕ-А3 КТ-РСК > 80%.
Эффективность амплификации КТ-РСК на β-актин > 80%.
Разность эффективности КТ-РСК-амплификации между МАСЕ-А3 и β-актином в пределах 10%.
Результаты линейности/эффективности КТ-РСК
На фиг. 20 показан график логарифма (по основанию 2) внесенного количества РНК против значений С! для МАСЕ-А3 и β-актина. Тест С0ВА8 ТадМаи МАСЕ-А3 Тез! линеен при внесенных значениях 100-0,1 нг СЕКЬ РНК, выделенной из ЕЕРЕ Хеиодгай с использованием способа О1АСЕН на основании значений К2. Значения К2 составляли 0,983 для МАСЕ-А3 и 0,998 для β-актина. Эти значения превосходят требуемое значение К2 > 0,95. В дополнение как С! МАСЕ-А3, так и С! β-актина для всех 10 репликатов на каждом тестируемом уровне меньше требуемого значения СУ < 5%, как показано в табл. 17.
Эффективность КТ-РСК-амплификации МАСЕ-А3 и β-актина вычисляли на основании углового коэффициента линии, образованной нанесением на график логарифма (по основанию 2) внесенной РНК против значений С! для МАСЕ-А3 и β-актина, показанных на фиг. 19. Эффективность амплификации при КТ-РСК может быть вычислена с использованием следующего уравнения:
угловой коэффициент = -1/логарифм (по снованию 2) * эффективность амплификации (АЕ).
Эффективность амплификации составляла 2,14 (107%) и 2,06 (103,1 для МАСЕ-А3 и β-актина, соответственно. АЕ превышала требуемое значение 80% для МАСЕ-А3 и β-актина. Разность АЕ между двумя генами составляла 3,9%, что также было в пределах требуемого значения +10%.
На фиг. 20 показан график логарифма (по основанию 2) внесенного количества РНК против разности С! между МАСЕ-А3 и β-актином. Угловой коэффициент разности С! составляет 0,0474, находясь в пределах требуемого значения углового коэффициента от -0,10 до 0,10. При двух наиболее низких тестированных уровнях внесенной РНК (0,2 и 0,1 нг) %СУ для разности С! был выше требуемого значения 20%. В результате, последние два уровня внесенной РНК не были включены в линейную область исследования.
Линейная область исследования с использованием СЕКЬ Хеиодгай РНК составляет 100 нг- 0,39 нг РНК.
На основании этих данных, критерии приемлемости для линейности и эффективности КТ-РСК были соблюдены.
В табл. 18 показана эффективность КТ-РСК-амплификации МАСЕ-А3 и β-актина; Табл. 19 представляет собой проверку достоверности эксперимента линейности/эффективности КТ-РСК.
Контрольные значения С! находились внутри достоверного диапазона. Эксперимент прошел проверку достоверности.
На табл. 20, 21 и 22 представлены подробности эксперимента линейности/эффективности КТ-РСК.
Расчетная чувствительность (предел выявления)
Цель. Установление наименьшей концентрации РНК, при которой экспрессия гена МАСЕ-А3 мо
- 22 016347 жет быть выявлена тестом С0ВА8™ ТадМап МАСЕ-А3 Тек! в по меньшей мере 95% случаев.
Материал образцов. Расчетную чувствительность оценивали с использованием РНК, выделенной из ткани ЕЕРЕ Хеподгай с использованием набора О1АСЕН В№аку ЕЕРЕ Κί! с дополнительной ДНКазной стадией. РНК выделяли из двух ЕЕРЕ-ксенотрансплантатов (ЕЕРЕ хеподгайк), имеющих происхождение от двух различных РНК клеточных линий. Один ксенотрансплантат, называемый СЕВЕ, экспрессирует МЛСЕ-Л3. Другой ксенотрансплантат, называемый 8ТЛС, не экспрессирует МАСЕ-А3. РНК от этих двух ксенотрансплантатов, использовали в смешанных экспериментах для тестирования 5% СЕВЬ РНК в 95% 8ТАС РНК, 1 % СЕВЕ РНК в 99% 8ТАС РНК и 0,5% СЕВЕ РНК в 99,5% 8ТАС РНК. Эти три различные смеси СЕВЕ и 8ТАС РНК тестировали при четырех различных уровнях общей РНК.
Метод. Результаты двадцати четырех тестов получали от 4 независимых разведений серий смесей СЕВЬ и 8ТАС РНК. Тестировали четыре уровня внесенной РНК (100, 50, 25 и 12,5 нг). Для каждого уровня тестировали шесть репликатов.
Лнализ. Определение уровня РНК, при котором частота положительных результатов для МАСЕА3, основанных на значении С! в пределах достоверного диапазона данного исследования, превышает 95%.
Критерии приемлемости. Ь0Э < 50 нг всей внесенной РНК для выявления 1%СЕВЬ
Результаты для предела выявления
Частоту положительных результатов определяют как значение С'1 в пределах достоверного диапазона данного исследования на основании экспериментов линейности, описанных в этом сообщении. Для определения границы диапазона С'1 усредняли значения С'1 МАСЕ-А3 и β-актина от уровня внесенной РНК из исследования линейности 0,39 нг (граница линейной области) и вычисляли 95% доверительные интервалы для значений С'1 МАСЕ-А3 и β-актина. На основании этих вычислений для образца, признаваемого положительным, С'1 МАСЕ-А3 должно быть меньше или равно 35,2 и С'1 β-актина должно быть меньше 32,1. Частота положительных результатов для МАСЕ-А3 и β-актина показана в табл. 23 и табл. 25. Процент положительных результатов для МАСЕ-А3 и β-актина показан в табл. 24 и табл. 26.
Там, где 1% СЕВЬ РНК, разведенную в 99% 8ТАС РНК, выявляют в > 95 % случаев на основании С'1 МАСЕ-А3, предел выявления составляет 50 нг внесенной РНК, что входит в достоверный диапазон данного исследования. Критерии приемлемости для расчетной чувствительности (предела выявления) соблюдены.
Проверка достоверности эксперимента предела выявления. Значения С'1 для ЕАМ-контролей генов МАСЕ показаны в табл. 27; значения С'1 для НЕХ-контролей β-актина показаны в табл. 28. Контрольные значения С'1 входят в достоверный диапазон. Эксперимент прошел проверку достоверности.
В табл. 29; табл. 30; и табл. 31 показаны подробности эксперимента предела выявления.
Корреляция способов
Цель. Сопоставить и провести перекрестную проверку достоверности теста С0ВА8™ ТадМап МАСЕ-А3 Тей и прототипного исследования Рго!о!уре Аккау на клинических ЕЕРЕТ-образцах.
Материал образцов. Приблизительно 120 клинических ЕЕРЕТ образцов соответствующего качества были проанализированы с использованием теста С0ВА8 ТадМап МАСЕ-А3 Тек! и с использованием прототипного исследования.
Методика. РНК выделяли с использованием набора О1АСЕК™ ВЫеаку ЕЕРЕ Κίΐ с дополнительной ДНКазной стадией. Для каждого ЕЕРЕТ-образца проводили одно выделение, образец делили на части и одну аликвоту оценивали с использованием теста С0ВА8 ТадМап МАСЕ-А3 Тек!, и одну аликвоту тестировали с использованием прототипного исследования. Для обоих исследований использовали идентичные контроли для установления пороговой экспрессии МАСЕ-А3.
Анализ
Сигнал МАСЕ-А3 для каждого образца записывали как положительный или отрицательный на основании пороговой экспрессии МАСЕ-А3, полученной от СЕВЬ РНК контролей. Результаты двух исследований сравнивали для установления положительного или отрицательного согласно значениям процента совпадения с исследованием сравнения в тесте ВМ8.
Для вычисления процента совпадения для принятия решения по дискордантным результатам использовали результаты, полученные с использованием двустадийного ВТ-РСВ исследования для замороженной ткани.
Положительные согласно проценту совпадения с исследованием сравнения = число образцов, правильно названных экспрессорами МАСЕ-А3/ число тестированных образцов * 100.
Отрицательные согласно проценту совпадения с исследованием сравнения = число образцов, правильно названных не экспрессирующими МАСЕ-А3 / число тестированных образцов * 100.
Критерии приемлемости
Положительные согласно проценту совпадения с исследованием сравнения > 85%.
Отрицательные согласно проценту совпадения с исследованием сравнения > 85%.
Для оценки положительных и отрицательных согласно проценту совпадения с исследованием сравнения в тесте С0ВА8 ТадМап МАСЕ-А3 Тек! проводили перекрестную оценку достоверности клиниче
- 23 016347 ских образцов из клинического исследования ^СЬС. МАСЕ-А3 прототипное КТ-РСК исследование использовали в качестве исследования сравнения для этих исследований. В случае дискордантности результатов для принятия решения по дискордантным результатам использовали предшествовавшие результаты, полученные для того же образца в виде свежезамороженной ткани, не подвергнутой ручной микродиссекции.
Из 131 клинического РРРЕ-образца, подвергнутого ручной микродиссекции, выделяли РНК с применением способа О^СЕН КЫеаку РРРЕ со стадией расщепления ДНКазой Ι. Каждый образец затем разделяли на равные части для КМ8 и ΚΟΙ для тестирования с использованием теста КМ8 С0ВА8 Тас.|Мап МАСЕ-А3 Тек! и ΚΟΙ прототипного исследования. Анализ данных проводили, как описано в Разделе 3 данного сообщения, где пороговую экспрессию МАСЕ-А3 определяли на основании контроля 1% СЕКТ РНК.
Результаты корреляции способов/перекрестной проверки достоверности
Образцы РНК выделяли из 131 ЖСБС РРРЕ клинического образца. В семи образцах контаминация геномной ДНК превышала 25% на основании ΚΟΙ контроля КТ-реакции. Эти образцы были исключены из положительных и отрицательных согласно вычислениям процента совпадения с исследованием сравнения. В дополнение, в исследовании С0ВА8 было 6 промежуточных результатов, и в прототипном исследовании было 15 промежуточных результатов, где для каждого образца не было достаточного данных, поскольку С! для β-актина выходило за пределы линейной области исследования, или экспрессия МАСЕ-А3 для образца превышала пороговое значение, но С! МАСЕ-А3 выходило за пределы линейной области. В результате было получено 117 результатов в исследовании С0ВА8 и 108 результатов в прототипном исследовании с данными, которые могли быть использованы для перекрестной проверки достоверности для сравнения двух различных тестов (табл. 32). Общая конкордантность исследования С0ВА8 и прототипного исследования составляла 98/107 или 91,6% (табл. 33). Число положительных результатов согласно проценту совпадения с исследованием сравнения в тесте С0ВА8 с использованием прототипного исследования в качестве золотого стандарта составляло 59/64 или 92,2%, в то время как число отрицательных результатов согласно проценту совпадения с исследованием сравнения составляло 39/43 или 90,7% (табл. 33). В случае дискордантных результатов исследования С0ВА8 и прототипного исследования, разрешения дискордантности использовали результаты, полученные посредством анализа замороженных образцов ткани (табл. 34).
Из 9 образцов с дискордантными результатами исследования С0ВА8 и прототипного исследования 7 продемонстрировали конкордантность исследования С0ВА8 и исследования замороженных образцов, и 2 продемонстрировали конкордантность прототипного исследования и исследования замороженных образцов. В результате, при использовании результатов исследования замороженных образцов для разрешения дискордантности, число положительных результатов согласно проценту совпадения с исследованием сравнения в исследованиях С0ВА8 увеличивается до 63/64 или 98,42%, и число отрицательных результатов согласно проценту совпадения с исследованием сравнения увеличивается до 42/43 или 97,7% (табл. 34).
Число положительных и число отрицательных результатов согласно проценту совпадения с исследованием сравнения в тесте С0ВА8 Тас.|Мап МАСЕ-А3 Тек! были выше требуемых значения, превышавших или равных 85%. Критерии приемлемости для числа положительных и числа отрицательных результатов согласно проценту совпадения с исследованием сравнения были соблюдены.
Контрольная проверка достоверности корреляции способов/перекрестной проверки достоверности
Полученные в эксперименте контрольные значения С! для гена МАСЕ показаны в табл. 30; полученные в эксперименте контрольные значения С! для гена β-актина показаны в табл. 31. Контрольные значения С! входят в достоверный диапазон. Эксперимент прошел проверку достоверности.
Подробности эксперимента корреляции способов/перекрестной проверки достоверности показаны в табл. 37, 38 и 39.
Воспроизводимость
Цель. Продемонстрировать воспроизводимость и надежность теста в наборах данных, полученных разными операторами в разные дни разными партиями реагентов и разными инструментами.
Материал образцов образцов от ^СЬС РРРЕ клинических образцов, подвергнутых ручной микродиссекции, выделяли с применением набора ОМСЕХ КЫеаку РРРЕ Κι! со стадией расщепления ДНКазой Ι и амплифицировали/выявляли с использованием теста С0ВА8 ТацМап МАСЕ-А3 Тек!.
Методика
Исследование состояло из двух репликатов на образец.
Две партии реагентов тестировали для приготовления образцов ОМСЕк и реагентов ТацМап.
Эксперимент проводили два разных оператора в два разных дня на двух разных анализаторах С0ВА8 Тас.|Мап 48 Апа1ухег.
Анализ
Экспрессию МАСЕ-А3 для каждого клинического образца вычисляли на основании среднего от
- 24 016347 двух КТ-РСК-репликатов. В дополнение сигнал МАСЕ-А3 оценивали для каждого репликата от каждого образца. Воспроизводимость также была основана на сравнении экспрессии гена МАСЕ-А3, вычисленной по значению разности С'З между МАСЕ-А3 и геном β-актина. Сравнение экспрессии МАСЕ-А3 для образцов, тестированных разными партиями реагентов, инструментами, операторами и в разные дни проводили с использованием коэффициента корреляции Пирсона.
Критерии приемлемости > 90% конкордантность сигнала МАСЕ-А3 между образцами, по меньшей мере в 3 раза превышающими предел выявления теста (3% СЕКТ), от опыта к опыту и в пределах используемых репликатов.
Коэффициент корреляции Пирсона > 90% между образцами.
Результаты воспроизводимости
Пороговая экспрессия МАСЕ-А3 представляет собой уровень отсечки для экспрессии МАСЕ-А3, определяющий то, будет ли пациент получать МАСЕ-А3-специфичную иммунотерапию. Пациенты с экспрессией МАСЕ-А3, равной или превышающей пороговое значение, будут иметь положительный сигнал МАСЕ-А3 и получать лечение. Пациенты с экспрессией МАСЕ-А3, ниже порогового значения, будут иметь отрицательный сигнал МАСЕ-А3 и не будут получать лечение. Исследования воспроизводимости теста были основаны на сигнале экспрессии МАСЕ-А3 для каждого образца с использованием следующих уравнений:
пороговая экспрессия МАСЕ-А3=2Л (С β-актина контроля 100% СЕРЕ -С МАСЕ-А3 контроля 1% СЕРЕ);
экспрессия МАСЕ-А3 для клинического образца = 2Л (С'З β-актина образца - С'З МАСЕ-А3 образца).
В дополнение, воспроизводимость исследования оценивали сравнением корреляции экспрессии МАСЕ-А3 от двух опытов по коэффициенту корреляции Пирсона по смешанным моментам (г). В табл. 40 и табл. 37 показана пороговая экспрессия МАСЕ-А3, полученная от СЕРЬ РНК контролей, тестированных в 1 и 2 опытах, на основании разности С'З β-актина и МАСЕ-А3. В табл. 41 и табл. 43 показан сигнал МАСЕ-А3 для каждого из 12 образцов, тестированных в 1 и 2 опытах.
В табл. 42 показан 2 опыт - пороговая экспрессия МАСЕ-А3 от СЕРЬ РНК контролей; в табл. 43 показан 2 опыт - сигнал экспрессии МАСЕ-А3 для образцов, использованных в эксперименте воспроизводимости.
У всех тестированных образцов была 100% корреляция сигнала экспрессии МАСЕ-А3 в двух опытах. В дополнение, воспроизводимость исследования оценивали сравнением корреляции экспрессии МАСЕ-А3 в двух опытах по коэффициенту корреляции Пирсона по смешанным моментам (г). Коэффициент корреляции Пирсона составлял 0,987 при сравнении экспрессии МАСЕ-А3 в двух разных опытах. Критерии приемлемости для воспроизводимости были соблюдены.
В табл. 44 показана проверка достоверности воспроизводимости; контрольные значения С'З входят в доверительный диапазон. Эксперимент прошел проверку достоверности.
Подробности эксперимента воспроизводимости показаны в табл. 45, 46 и 47.
Claims (8)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Набор праймеров для определения МАСЕ-А3, содержащий праймер, состоящий из 8ЕО ΙΌ N0:11, и праймер, состоящий из 8ЕО ΙΌ N0:12.
- 2. Набор, включающий набор праймеров по п.1 и по меньшей мере один зонд, выбранный из зонда, состоящего из 8Е0 ΙΌ N0:53 или состоящего из 8Е0 ΙΌ N0:17 с флуоресцентным репортерным красителем на 5'-конце и нефлуоресцентным гасителем на 3'-конце.
- 3. Набор по п.2, где указанный зонд состоит из 8Е0 ΙΌ N0:17 с 6-карбоксифлуоресцеином на 5'конце и нефлуоресцентным гасителем на 3'-конце.
- 4. Способ определения МАСЕ-А3-положительной опухолевой ткани, включающий стадию приведения в контакт выделенной нуклеотидной последовательности, полученной или происходящей из опухолевого образца, с набором праймеров по п.1.
- 5. Способ по п.4, где указанный опухолевый образец представляет собой зафиксированную в формалине заключенную в парафин (ЕЕРЕ) опухолевую ткань.
- 6. Способ по п.4 или 5, дополнительно включающий стадию амплификации нуклеотидной последовательности и выявления в образце амплифицированной нуклеотидной последовательности.
- 7. Способ лечения пациента, включающий определение того, экспрессирует ли опухолевая ткань пациента МАСЕ-А3, с применением способа по любому из пп.4-6, и затем введение пациенту композиции, содержащей МАСЕ-А3-специфичное иммунотерапевтическое средство.
- 8. Способ лечения пациента, предрасположенного к рецидиву МАСЕ-А3-экспрессирующей опухоли, прошедшего лечение для удаления/лечения МАСЕ-А3-экспрессирующей опухолевой ткани, включающий определение того, экспрессирует ли опухолевая ткань пациента МАСЕ-А3, с применением способа по любому из пп.4-6, и затем введение указанному пациенту композиции, содержащей МАСЕ-А3специфичное иммунотерапевтическое средство.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0612342.6A GB0612342D0 (en) | 2006-06-21 | 2006-06-21 | Method |
PCT/EP2007/056219 WO2007147876A2 (en) | 2006-06-21 | 2007-06-21 | Method for the detection and diagnosis of cancer involving primers and probes for the specific detection of the mage- a3 -marker |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200802356A1 EA200802356A1 (ru) | 2009-06-30 |
EA016347B1 true EA016347B1 (ru) | 2012-04-30 |
Family
ID=36803668
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200802356A EA016347B1 (ru) | 2006-06-21 | 2007-06-21 | Способ выявления и диагностики злокачественного новообразования, включающий праймеры и зонды для специфичного выявления маркера mage-a3 |
Country Status (28)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8936919B2 (ru) |
EP (1) | EP2041308B1 (ru) |
JP (2) | JP2009540812A (ru) |
KR (1) | KR101455589B1 (ru) |
CN (1) | CN101506383B (ru) |
AU (1) | AU2007263019B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0713599A2 (ru) |
CA (1) | CA2656909A1 (ru) |
CO (1) | CO6140072A2 (ru) |
CY (1) | CY1113290T1 (ru) |
DK (1) | DK2041308T3 (ru) |
EA (1) | EA016347B1 (ru) |
ES (1) | ES2389513T3 (ru) |
GB (1) | GB0612342D0 (ru) |
HK (1) | HK1127627A1 (ru) |
HR (1) | HRP20120761T1 (ru) |
IL (1) | IL195975A (ru) |
MA (1) | MA30565B1 (ru) |
MX (1) | MX2008016493A (ru) |
MY (1) | MY147511A (ru) |
NO (1) | NO20085290L (ru) |
NZ (1) | NZ573809A (ru) |
PL (1) | PL2041308T3 (ru) |
PT (1) | PT2041308E (ru) |
SI (1) | SI2041308T1 (ru) |
UA (1) | UA95956C2 (ru) |
WO (1) | WO2007147876A2 (ru) |
ZA (1) | ZA200810695B (ru) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ583796A (en) | 2007-09-17 | 2011-12-22 | Oncomethylome Sciences Sa | Improved detection of mage-a expression |
BR112013001637A2 (pt) * | 2010-07-22 | 2016-05-24 | Glaxosmithkline Biolog Sa | proteína ligadora de antígeno, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, métodos para produção de proteína ligadora de antígeno, e para detectar mage-a3 e/ou mage-a6 em tecido de humano fixado com formalina e infiltrado em parafina. |
CN102251033B (zh) * | 2011-07-05 | 2013-03-20 | 北京大学人民医院 | 基于mage-a3基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试剂盒 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5612201A (en) * | 1991-05-23 | 1997-03-18 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules useful in determining expression of a tumor rejection antigen precursor |
US5985571A (en) * | 1998-02-04 | 1999-11-16 | Ludwig Institute For Cancer Research | Method for determining multiple myeloma by assaying for expression of mage genes |
WO2000020445A2 (en) * | 1998-10-02 | 2000-04-13 | Ludwig Institute For Cancer Research | Tumor antigens and ctl clones isolated by a novel procedure |
WO2003045427A2 (en) * | 2001-11-29 | 2003-06-05 | Dandrit Biotech A/S | Pharmaceutical composition for inducing an immune response in a human or animal |
US6811986B2 (en) * | 2001-01-05 | 2004-11-02 | Molecular Staging, Inc. | 5′-thio phosphate directed ligation of oligonucleotides and use in detection of single nucleotide polymorphisms |
WO2005105139A2 (en) * | 2004-05-04 | 2005-11-10 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Mage-3 and ny-eso-1 based polyvalent vaccine for cancer immunotherapy |
EP1659178A2 (en) * | 1998-02-05 | 2006-05-24 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccination |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL106610A0 (en) * | 1992-08-07 | 1993-12-08 | Cytel Corp | Hla binding peptides and their uses |
CA2184482A1 (en) * | 1994-03-01 | 1995-09-08 | Etienne De Plaen | Determination of cancerous conditions by mage gene expression |
JP3603138B2 (ja) * | 2000-02-18 | 2004-12-22 | 独立行政法人理化学研究所 | 細胞死抑制タンパク質 |
US6358679B1 (en) * | 2000-08-24 | 2002-03-19 | Pe Corporation (Ny) | Methods for external controls for nucleic acid amplification |
DK2284266T3 (da) | 2002-11-14 | 2014-01-13 | Thermo Fisher Scient Biosciences Inc | sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53 |
AU2003290925A1 (en) * | 2002-11-14 | 2004-06-15 | John Wayne Cancer Institute | Detection of micro metastasis of melanoma and breast cancer in paraffin-embedded tumor draining lymph nodes by multimaker quantitative rt-pcr |
US20070231822A1 (en) * | 2006-02-28 | 2007-10-04 | Michael Mitas | Methods for the detection and treatment of cancer |
-
2006
- 2006-06-21 GB GBGB0612342.6A patent/GB0612342D0/en not_active Ceased
-
2007
- 2007-06-21 AU AU2007263019A patent/AU2007263019B2/en not_active Ceased
- 2007-06-21 NZ NZ573809A patent/NZ573809A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-06-21 CN CN2007800309371A patent/CN101506383B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2007-06-21 BR BRPI0713599-8A patent/BRPI0713599A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-06-21 UA UAA200814634A patent/UA95956C2/ru unknown
- 2007-06-21 WO PCT/EP2007/056219 patent/WO2007147876A2/en active Application Filing
- 2007-06-21 MY MYPI20085210A patent/MY147511A/en unknown
- 2007-06-21 EA EA200802356A patent/EA016347B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2007-06-21 DK DK07786793.5T patent/DK2041308T3/da active
- 2007-06-21 SI SI200731011T patent/SI2041308T1/sl unknown
- 2007-06-21 PL PL07786793T patent/PL2041308T3/pl unknown
- 2007-06-21 ES ES07786793T patent/ES2389513T3/es active Active
- 2007-06-21 US US12/305,742 patent/US8936919B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-06-21 CA CA002656909A patent/CA2656909A1/en not_active Abandoned
- 2007-06-21 KR KR1020097001326A patent/KR101455589B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2007-06-21 MX MX2008016493A patent/MX2008016493A/es active IP Right Grant
- 2007-06-21 JP JP2009515886A patent/JP2009540812A/ja active Pending
- 2007-06-21 PT PT07786793T patent/PT2041308E/pt unknown
- 2007-06-21 EP EP07786793A patent/EP2041308B1/en active Active
-
2008
- 2008-12-16 IL IL195975A patent/IL195975A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-12-18 ZA ZA2008/10695A patent/ZA200810695B/en unknown
- 2008-12-18 NO NO20085290A patent/NO20085290L/no not_active Application Discontinuation
- 2008-12-19 MA MA31490A patent/MA30565B1/fr unknown
- 2008-12-24 CO CO08136749A patent/CO6140072A2/es unknown
-
2009
- 2009-07-20 HK HK09106609.1A patent/HK1127627A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-09-26 HR HRP20120761TT patent/HRP20120761T1/hr unknown
- 2012-10-02 CY CY20121100908T patent/CY1113290T1/el unknown
- 2012-11-08 JP JP2012245934A patent/JP5705191B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5612201A (en) * | 1991-05-23 | 1997-03-18 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules useful in determining expression of a tumor rejection antigen precursor |
US5985571A (en) * | 1998-02-04 | 1999-11-16 | Ludwig Institute For Cancer Research | Method for determining multiple myeloma by assaying for expression of mage genes |
EP1659178A2 (en) * | 1998-02-05 | 2006-05-24 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccination |
WO2000020445A2 (en) * | 1998-10-02 | 2000-04-13 | Ludwig Institute For Cancer Research | Tumor antigens and ctl clones isolated by a novel procedure |
US6811986B2 (en) * | 2001-01-05 | 2004-11-02 | Molecular Staging, Inc. | 5′-thio phosphate directed ligation of oligonucleotides and use in detection of single nucleotide polymorphisms |
WO2003045427A2 (en) * | 2001-11-29 | 2003-06-05 | Dandrit Biotech A/S | Pharmaceutical composition for inducing an immune response in a human or animal |
WO2005105139A2 (en) * | 2004-05-04 | 2005-11-10 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Mage-3 and ny-eso-1 based polyvalent vaccine for cancer immunotherapy |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
DALERBA PIERO ET AL.: "MAGE, BAGE and GAGE gene expression in human rhabdomyosarcomas" INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, vol. 93, no. 1, 1 July 2001 (2001-07-01), pages 85-90, XP002460253 ISSN: 0020-7136 page 86, "RT-PCR assay"; page 88, table II; page 89, table VI * |
DATABASE REGISTRY [Online] STN; 4 August 2004 (2004-08-04), XP002460254 Database accession no. RN 722217-76-7 abstract * |
PARK J.-W. ET AL.: "A new strategy for the diagnosis of MAGE-expressing cancers" JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 266, no. 1-2, 1 August 2002 (2002-08-01), pages 79-86, XP004372273 ISSN: 0022-1759 page 80, paragraph 2.3; page 82, "Results" * |
ZAMMATTEO N. ET AL.: "DNA microarray to monitor the expression of MAGE-A genes" CLINICAL CHEMISTRY, vol. 48, no. 1, January 2002 (2002-01), pages 25-34, XP002305438 ISSN: 0009-9147 cited in the application abstract; page 33, last paragraph * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2586410T3 (es) | Procedimientos y composiciones de detección de un mutante de EGFR resistente a fármacos | |
US20030050470A1 (en) | Biomarkers and targets for diagnosis, prognosis and management of prostate disease, bladder and breast cancer | |
EP1876241A2 (en) | Compositions and methods for the treatment and diagnosis of breast cancer | |
EA017879B1 (ru) | Улучшенное определение экспрессии mage-a | |
US10175244B2 (en) | Dominant negative HSP110 mutant and its use in prognosing and treating cancers | |
EA021100B1 (ru) | Усовершенствованное определение экспрессии генов | |
JP5769952B2 (ja) | Eml4−alk融合遺伝子の高感度検出方法 | |
EP1127893A2 (en) | Compositions and methods for the treatment and diagnosis of breast cancer | |
JP2009542201A (ja) | メチル移行領域のメチル化を測定してがんの有無を判別する方法 | |
EA016347B1 (ru) | Способ выявления и диагностики злокачественного новообразования, включающий праймеры и зонды для специфичного выявления маркера mage-a3 | |
JP4400934B2 (ja) | 胸部の疾患の検出に有用な試薬及び方法 | |
US20100330554A1 (en) | Diagnostic kit for solid cancer and medicament for solid cancer therapy | |
JP4576168B2 (ja) | 膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎の検査方法 | |
JP5316749B2 (ja) | シスプラチン耐性遺伝子診断方法及びシスプラチン治療効果遺伝子診断キット | |
US20070286862A1 (en) | Cancer Associated Antigens | |
US20240158864A1 (en) | Methods and compositions for identifying neuroendocrine prostate cancer | |
JP2007139656A (ja) | 食道癌診断キット | |
JP5622156B2 (ja) | シスプラチン耐性遺伝子診断方法及びシスプラチン治療効果遺伝子診断キット | |
JP4922613B2 (ja) | モノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法 | |
JP2002514907A (ja) | マンマグロビン、その抗体、および胸部疾患を検出するためのそれらの使用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |