BRPI0713599A2 - iniciador, conjunto de iniciadores, sonda, kit, métodos para determinar a presença ou ausência de tecido de tumor positivo para mage-a3, de diagnose de paciente e para tratar um paciente, e, uso de uma composição - Google Patents

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Abstract

INICIADOR, CONJUNTO DE INICIADORES, SONDA, KIT, MéTODOS PARA DETERMINAR A PRESENçA OU AUSêNCIA DE TECIDO DE TUMOR POSITIVO PARA MAGE-A3, DE DIAGNOSE DE PACIENTE E PARA TRATAR UM PACIENTE, E, USO DE UMA COMPOSIçãO. A presente invenção refere-se às sondas e aos iniciadores específicos para MAGE-A3 para uso em novos métodos e kits de diagnóstico. A invenção adicionalmente se refere ao tratamento imunoterapêutico de populações específicas de pacientes cancerosos, sofrendo de tumores expressando MAGE-A3.

Description

"INICIADOR, CONJUNTO DE INICIADORES, SONDA, KIT, MÉTODOS PARA DETERMINAR A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE TECIDO DE TUMOR POSITIVO PARA MAGE-A3, DE DIAGNOSE DE PACIENTE E PARA TRATAR UM PACIENTE, E, USO DE UMA COMPOSIÇÃO"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um método diagnóstico para a detecção de MAGE-A3. A invenção adicionalmente se refere ao tratamento imunoterapêutico de populações de pacientes sofrendo de tumores expressando MAGE-A3, nos quais pacientes tendo tecido de tumor expressando MAGE-A3 têm sido identificados usando o método diagnóstico aqui descrito.
FUNDAMENTOS
A família MAGE (antígeno de melanoma) de genes foi originalmente identificada devido ao reconhecimento de linfócitos citolíticos derivados de linfócitos do sangue de pacientes cancerosos (Van der Bruggen et al 1991). A família MAGE de genes agora compreende mais de 20 membros e é composta de genes MAGE A, B, C e D (Scanlan et al., (2002) Immunol Rev. 188:22-32; Chomez et al., (2001) Câncer Res. 61(14):5544- 51). Estão agrupados no cromossomo X (Lucas et al., 1998 Câncer Res. 58:743-752; Lucas et al., 1999 Câncer Res 59:4100-4103; Lucas et al., 2000 Int J Câncer 87:55-60; Lurquin et al., 1997 Genomics 46:397-408; Muscatelli et al., 1995 Proc Natl Acad Sci USA 92:4987-4991; Pold et al., 1999 Genomics 59:161-167; Rogner et al 1995 Genomics 29:725-731), e ainda têm uma função não identificada (Ohman et al. 2001 Exp Cell Res. 265(2): 185- 94). Os genes MAGE são elevadamente homólogos e os membros da família MAGE-A, especialmente, têm homologia entre 60 e 98%. Genes MAGE não são expressados em todas as células normais com exceção da expressão em espermatogônia e placenta (Haas et al. 1988 Am J Reprod Immunol Microbiol 18:47-51; Takahashi et al. 1995 Câncer Res 55:3478-382). A re-ativação de expressão de gene MAGE em câncer é devido à desmetilação anormal do promotor (De Smeet et al. 1996 Proc Natl Acad Sci USA 93(14):7149-53; De Smeet et al. 1999 Mol Cell Biol. 19(ll):7327-35). Os 12 genes MAGE-A são variavelmente sobre-expressados nos seguintes cânceres: carcinoma de célula-transcricional, carcinoma esofágico, melanoma, carcinoma de bexiga e carcinoma de pulmão de célula não-pequena (NSCLC) (Scanlan et al. 2002 Immunol Rev. 188:22-32). A sobre-expressão e a especificidade de expressão de MAGE em tecidos cancerosos tem feito com que a proteína MAGE-A3 seja usada como um antígeno para vacinas contra câncer (Scanlan et al. 2002 Immunol Rev.188:22-32). Contudo, devido à ampla faixa de expressão encontrada em pacientes cancerosos, o nível de expressão de MAGE-A3 precisa ser acuradamente estimado em cada paciente para dirigir a vacinação para pacientes expressando a proteína. MAGE-A3 é muitas vezes chamado intercambiavelmente de MAGE-3; ambos são aqui usados. Melanoma
Pacientes apresentando melanoma maligno em metástase distante (estágio IV de acordo com a classificação de American Joint Committee on Câncer (AJCC)) têm um tempo de sobrevivência médio de um ano, com uma taxa de sobrevivência de duração longa de apenas 5%. Até mesmo a quimioterapia padrão para melanoma de estágio IV tem taxas de resposta terapêutica de apenas 8-25%, mas sem efeito sobre sobrevivência total. Pacientes com metástase regional (estágio III) têm uma sobrevivência média de dois a três anos com chance muito baixa de sobrevivência de duração longa, até mesmo após um controle de cirurgia adequado das metástases primária e regional (Balch et al., 1992 Semin Surg Oncol. 8(6):400-14). Os pacientes com melanoma de estágios I a III têm em sua maioria seus tumores cirurgicamente removidos, mas estes pacientes mantêm um risco substancial de reincidência. Assim permanece uma necessidade de prevenir progressão de melanoma, e de se terem regimes de tratamento melhorados para melanoma metastático e tratamentos adjuvantes para pacientes tendo tido um tumor primário removido. Câncer de pulmão
Há dois tipos de câncer de pulmão: câncer de pulmão de célula não-pequena (NSCLC) e câncer de pulmão de célula pequena (SCLC). Os nomes simplesmente descrevem o tipo de célula encontrada nos tumores. NSCLC inclui carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma, e carcinoma de célula grande e totaliza cerca de 80% dos cânceres de pulmão. NSCLC é difícil de curar e tratamentos disponíveis tendem a ter o objetivo de prolongar a vida o máximo possível e aliviar os sintomas da doença. NSCLC é o tipo mais comum de câncer de pulmão e está associado com resultados insatisfatórios. De todos os pacientes com NSCLC, cerca de 25% têm doença locorregional no momento da diagnose e ainda são tratáveis por excisão cirúrgica (estágios IB, IIA ou IIB de acordo com a classificação de AJCC). Contudo, mais de 50% de testes pacientes reincidirá dentro de dois anos após a ressecção cirúrgica completa. Portanto há uma necessidade para providenciar tratamento melhor para estes pacientes. Expressão de MAGE-A3
Previamente numerosos métodos têm tentado medir a expressão de genes MAGE-A3 dentro de ambas linhagens de célula e amostras de tumor. RT-PCR semi-quantitativa (De Plaen et al. 1994 Immunogenetics 40(5):360-9), outras técnicas baseadas em PCR e também microarranjo de densidade baixa têm sido todas usadas (Zammatteo et al. 2002 Clinicai Chemistry 48(1) 25-34). Contudo, em muitos destes estudos um problema maior tem sido a homologia muito alta entre os membros da família MAGE causando falsos positivos. Para testes de Fases II e III grandes é desejável um ensaio quantitativo de produtividade alta, capaz de especificamente identificar amostras expressando MAGE-A3 e de reduzir a possibilidade de as amostras falsamente testarem positivo.
Outra dificuldade provém do uso de tecido de tumor Fixado em Formalina, Embebido em Parafina (FFPE), que é o método normal de conservação de tecido de tumor dentro de centros clínicos. A fixação em formalina muda a estrutura de moléculas de RNA dentro do tecido, causando reticulação e também degradação parcial. A degradação parcial leva à criação de pedaços menores de RNA e entre 100 e 300 pares de base. Estas mudanças estruturais no RNA torna difícil o uso de RNA extraído do tecido FFPE em técnicas diagnosticas convencionais. Breve descrição das figuras
Figura 1: Especificidade de iniciadores para MAGE-A3 RT- PCR TaqMan dentro dos membros da família MAGE-A.
Figura 2: Especificidade de sonda de Ligação de Sulco Menor (Minor Groove Binding, MGB) para expressão de MAGE-A3 em TaqMan RT-PCR.
Figura 3: Teste de especificidade de iniciadores MAGE-A3 na presença de plasmídeos MAGE-A3 e MAGE-6.
Figura 4:. Expressão de tumor de MAGE-A3 conforme medida por TaqMan PCR quantitativa. Figura 5: Teste de expressão de MAGE-A3.
Figura 6a: Especificidade dos iniciadores MAGE-A3 planejados para uso em tecido FFPE.
Figura 6b: Teste de linearidade dos iniciadores sobre quantidades diferenciais de RNA.
Figura 7: Comparação entre ensaio de congelamento em RNA- later e a PCR de tecido FFPE.
Figura 8: Comparação relativa do congelamento em RNA-Iater e os ensaios de MAGE-A3 baseados em FFPE.
Figura 9: Seqüência de nucleotídeos codificadora de proteína de fusão de fragmento de lipoproteína D, fragmento Mage3, e cauda histidina, e sua respectiva seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 35 e 36).
Figura 10: Proteína de fusão de NSl -MAGE3, e cauda histidina (SEQ ID NO:37)
Figura 11: DNA codificador de proteína de fusão NSl- MAGE3-His (SEQ ID NO:38)
Figura 12: Proteína de fusão de CLYTA-MAGE3-Histidina (SEQ ID NO:39)
Figura 13: DNA para proteína de fusão CLYTA-MAGE3-His (SEQ ID N0:40)
Figura 14: Alinhamento de seqüências de família de gene MAGE-A para o planejamento de sondas e iniciadores de RT-PCR para MAGE-A3
Figura 15: Alinhamento de seqüências MAGE-A3 e MAGE- A6 para identificar regiões contendo seqüências alvo (face de tipo dentro de retângulo).
Figura 16: Classes para MAGE-A3 RT-PCR semi- quantitativa: um exemplo de como cinco classes podem ser designadas para o ensaio de MAGE-A3 RT-PCR semi-quantitativa.
Figura 17: Comparação gráfica de valores de Ct de plasmídeos MAGE-A usando 20, 2, 0,2, 0,02 pg de DNA.
Figura 18: Comparação gráfica de valores de Delta Ct para MAGE-A3 para outros plasmídeos MAGE-A usando 20, 2, 0,2, 0,02 pg de DNA.
Figura 19: Linearidade de FFPE Xenoenxerto GERL RNA - diluições seriais duplas de 100 a 0,1 ng de entrada de RNA.
Figura 20: Mostra um gráfico com Iog (base 2) de entrada de RNA versus Delta Ct entre MAGE-A3 e β-actina. Descrição de tabelas e seqüências Tabela 1: Iniciadores oligonucleotídeos usados para MAGE RT-PCR semi-quantitativa.
Tabela 2: Iniciadores oligonucleotídeos usados para TaqMan RT-PCR quantitativa.
Tabela 3: Comparação de MAGE-A3 PCR semi-quantitativa vs TaqMan PCR quantitativa. Tabela 4: Comparação de valores de Ct e Delta Ct usando mistura 1 de PCR e mistura 2 de PCR.
Tabela 5: Iniciadores oligonucleotídeos usados para MGB TaqMan RT-PCR quantitativa de tecido congelado.
Tabela 6: Classes para MAGE-A3 RT-PCR semi-quantitativa: um exemplo de como cinco classes podem ser designadas para o ensaio de MAGE-A3 RT-PCR semi-quantitativa (refere-se à Figura 16).
Tabela 7: Seqüências de sonda e de iniciador COBAS™ TaqMan MAGE-A3.
Tabela 8: Seqüências de sonda e de iniciador COBAS™ TaqMan beta-actina.
Tabela 9: Amostra COBAS™ TaqMan & faixa de CT válido de controle.
Tabela 10: Perfil de ciclo térmico COBAS™ TaqMan - Perfil térmico de PCR para experimento de exclusividade para MAGE-A3.
Tabela 11: Perfil térmico de RT-PCR para linearidade e eficiência de RT-PCR, sensibilidade analítica (limite de detecção), correlação de método, experimentos de reprodutibilidade.
Tabela 12: Valores de Ct de plasmídeos MAGE-A usando 20, 2, 0,2, 0,02 pg de DNA.
Tabela 13: Valores de Delta de Ct relativo a MAGE-A3 para outros plasmídeos MAGE-A usando 20, 2, 0,2, 0,02 pg de DNA.
Tabela 14: Validação de experimento de exclusividade para MAGE-A3. Tabela 15 e Tabela 16: Detalhes de experimento de exclusividade para MAGE-A3.
Tabela 17: Linearidade de Ct de MAGE-A3 e de β-actina e Delta Ct de 10 repetições em 11 níveis.
Tabela 18: Eficiência de amplificação por RT-PCR de MAGE- A3 e β-actina.
Tabela 19: Validação de experimento de eficiência de RT-PCR / Linearidade.
Tabelas 20, 21 e 22: Detalhes de experimento de eficiência de RT-PCR / Linearidade.
Tabela 23: Taxa de sucesso de MAGE-A3 Ct, N = 24 para cada condição.
Tabela 24: Percentagem de taxa de sucesso de MAGE-A3 Ct, N = 24 para cada condição.
Tabela 25: Taxa de sucesso de Ct de β-actina, N = 24 para cada condição.
Tabela 26: Percentagem de taxa de sucesso de Ct de β-actina, N = 24 para cada condição.
Tabela 27: Cts de controle de FAM de gene MAGE.
Tabela 28: Cts de controle de β-actina HEX.
Tabela 29; Tabela 30; e Tabela 31: Detalhes de experimento de limite de detecção.
Tabela 32: Sumário de validação cruzada de amostras. Tabela 33: testes COBAS e protótipo positivo e negativo pela concordância percentual de comparador.
Tabela 34: testes COBAS e protótipo positivo e negativo pela concordância percentual de comparador com teste de congelado para solucionar resultados discordantes.
Tabela 35: Experimento de controle de Cts de gene MAGE. Tabela 36: Experimento de controle de Cts de gene β-actina. Tabelas 37, 38 e 39: Detalhes de experimento de validação cruzada / correlação de método
Tabela 40: Corrida 1 - Limite de expressão de MAGE-A3 dos controles de GERL RNA.
Tabela 41: Corrida 1 - Chamada de expressão de MAGE-A3 para espécimes de reprodutibilidade.
Tabela 42: Corrida 2 - limite de expressão de MAGE-A3 dos controles de GERL RNA
Tabela 43: Corrida 2 - Chamada de expressão de MAGE-A3 para espécimes de reprodutibilidade.
Tabela 44: Validação de reprodutibilidade. Tabelas 45, 46 e 47: Detalhes de experimento de reprodutibilidade.
SEQ ID NO:l - MAGE3-E2F (iniciador para ensaio semi- quantitativo de MAGE3) (Tabela 1)
SEQ ID NO:2 - MAGE3-E3R (iniciador para ensaio semi- quantitativo de MAGE3) (Tabela 1)
SEQ ID NO:3 - E3 MAGE3 TMF (iniciador direto parra exon 3 MAGE-A3) (Tabela 2)
SEQ ID NO:4 - E3 MAGE3 TMR (iniciador inverso para exon 3 MAGE-A3; este iniciador é complemento inverso da seqüência de MAGE- A3 que ele reconhece) (Tabela 2)
SEQ ID NO:5 - 13 MAGE3 TMF (iniciador direto para íntron 3 MAGE-A3) (Tabela 2)
SEQ ID NO:6 - 13 MAGE3 TMR (iniciador inverso para íntron 3 MAGE-A3; este iniciador é o complemento inverso da seqüência de íntron MAGE-A3 que ele reconhece) (Tabela 2)
SEQ ID NO:7 - MAGEA3-775F (iniciador direto para MAGE- Α3) (Tabela 5)
SEQ ID N0:8 - MAGEA3-849R (iniciador inverso para MAGE-A3; este iniciador é o complemento inverso da seqüência MAGE-A3 que ele reconhece) (Tabela 5) 5 SEQ ID NO:9 - MAGEA3e-95OF (iniciador direto para
MAGE-A3) (Tabela 5)
SEQ ID NO: 10 - MAGEA3e-1037R (iniciador inverso para MAGE-A3; este iniciador é o complemento inverso da seqüência MAGE-A3 que ele reconhece) (Tabela 5) 10 SEQ ID NO: 11 - MAGEA3f-623F (iniciador direto para
MAGE-A3) (Tabela 5)
SEQ ID NO: 12 - MAGEA3f-697R (iniciador inverso para MAGE-A3; este iniciador é o complemento inverso da seqüência MAGE-A3 que ele reconhece) (Tabela 5) 15 SEQ ID NO: 13 - E3 MAGE3 TMP (sonda para exon 3
MAGE3) (Tabela 2)
SEQ ID NO: 14 - 13 MAGE-A3 TMP (sonda para íntron 3 MAGE3) (Tabela 2)
SEQ ID NO: 15 - MAGEA3-801Tmc (sonda para MAGE3)
20 (Tabela 5)
SEQ ID NO: 16 - MAGEA3e-IOOOTmc (sonda para MAGE3)
(Tabela 5)
SEQ ID NO: 17 - MAGEA3f-651 Tm (sonda para MAGE3)
(Tabela 5)
25 SEQ ID NO: 18 - B-actina-E4F (iniciador B-actina) (Tabela 1)
SEQ ID NO: 19 - B-actina-E6R (iniciador B-actina) (Tabela 1) SEQ ID N0:20 - B-actina-TMF (iniciador B-actina) (Tabela 2) SEQ ID NO:21 - B-actina-TMR (iniciador B-actina) (Tabela
2) SEQ ID NO:22 - B-actina TMP (sonda B-actina) (Tabela 2) SEQ ID NO 23 - SEQ ID NO:29: imunopeptídeos MAGE3 SEQ ID N0:30 -SEQ ID NO:34: oligonucleotídeos adjuvantes SEQ ID NO:35 - seqüência de nucleotídeos de proteína de fusão de fragmento de lipoproteína D - fragmento MAGE3 - cauda histidina (Figura 9)
SEQ ID NO:36 - seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:35 (Figura 9)
SEQ ID NO:37 - seqüência de aminoácidos de proteína de fusão de NS1 - MAGE3 - cauda histidina (Figura 10)
SEQ ID NO:38 - seqüência de nucleotídeos codificadora de SEQ ID NO:37 (Figura 11)
SEQ ID NO:39 - seqüência de aminoácidos de proteína de fusão de CLYTA-MAGE3-Histidina (Figura 12) 15 SEQ ID N0:40 - seqüência de nucleotídeos codificadora de
CLYTA-MAGE3-histidina proteína de fusão (Figura 13)
SEQ ID NO:41 - fragmento MAGE 1 (Figura 14) SEQ ID NO:42 - fragmento MAGE 2 (Figura 14) SEQ ID NO:43 - fragmento MAGE 4a (Figura 14) 20 SEQ ID NO:44 - fragmento MAGE 7 (Figura 14)
SEQ ID NO:45 - fragmento MAGE 8 (Figura 14) SEQ ID NO:46 - fragmento MAGE 10 (Figura 14) SEQ ID NO:47 - fragmento MAGE 11 (Figura 14) SEQ ID NO:48 - fragmento MAGE 12 (Figura 14) 25 SEQ ID NO:49 - fragmento MAGE-A6 (Figura 14)
SEQ ID N0:50 - fragmento MAGE-A3 (Figura 14) SEQ ID NO:51 - fragmento MAGE-A3 (Figura 15) SEQ ID NO:52 - fragmento MAGE-A6 (Figura 15) SEQ ID NO:53 - seqüência de sonda sintética de MAGE-A3: MAGEA3F-646MOD (Tabela 7).
SEQ ID NO:54 - seqüência de sonda MAGEA3F-646MOD tendo nucleotídeos não modificados.
SEQ ID NO:55 - seqüência de iniciador β-actina: RGI BACT
F2 (Tabela 8)
SEQ ID NO:56 - seqüência de iniciador β-actina: RGI BACT
R2 (Tabela 8)
SEQ ID NO:57 - seqüência de sonda β-actina: HW RGIBACT
H (Tabela 8)
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os presentes inventores têm desenvolvido um ensaio para identificar pacientes tendo tecido de tumor expressando MAGE-A3 que conseqüentemente se beneficiariam da imunoterapia específica para MAGE- A3.
Em uma modalidade da presente invenção é fornecido um iniciador compreendendo a seqüência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NO. 3-12. Em uma outra modalidade, é proporcionado um conjunto de iniciadores compreendendo um ou mais dos seguintes pares de iniciadores:
a) SEQ ID NO: 3 e 4;
b) SEQ ID NO: 5 e 6;
c) SEQ ID NO: 7 e 8;
d) SEQ ID NO: 9 e 10; e
e) SEQ ID NO: 11 e 12.
Em um outro aspecto da presente invenção é fornecida uma sonda compreendendo a seqüência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NO: 13 a 17, 53 ou 54.
Em uma outra modalidade, é fornecido um kit compreendendo:
(i) um iniciador direto; (ii) um iniciador inverso; e
(iii) uma sonda,
no qual os componentes (i), (ii) e (iii) são capazes de hibridizarem com uma seqüência alvo de MAGE-A3 sob condições estringentes, e no qual pelo menos uma das seqüências alvo de (i), (ii) ou (iii) difere em pelo menos um nucleotídeo comparada com a região equivalente de todas as outras seqüências de nucleotídeos MAGE A e no qual o conjunto é capaz de ser usado para discriminar entre MAGE-A3 e MAGE-A6.
Adicionalmente, é fornecido um kit compreendendo:
(i) um iniciador direto;
(ii) um iniciador inverso; e
(iii) uma sonda,
no qual os componentes (i), (ii) e (iii) são capazes de hibridizarem com uma seqüência alvo de MAGE-A3 sob condições estringentes, e no qual pelo menos uma das seqüências alvo de (i), (ii) ou (iii) difere em pelo menos um nucleotídeo comparada com a região equivalente da seqüência de nucleotídeos MAGE-6 e no qual o conjunto é capaz de ser usado para discriminar entre MAGE-A3 e MAGE-A6.
Em uma modalidade, um kit da presente invenção pode compreender os seguintes componentes: (i) pelo menos um iniciador ou conjunto de iniciadores como aqui descrito; e (iii) pelo menos uma sonda como aqui descrito. Em um exemplo, componente (i) compreende SEQ ID NO: 3 e 4; e componente (ii) compreende SEQ ID NO: 13; alternativamente, componente (i) compreende SEQ ID NO: 5 e 6; e componente (ii) compreende SEQ ID NO: 14; ou componente (i) compreende SEQ ID NO: 7 e 8; e componente (ii) compreende SEQ ID NO: 15; ou componente (i) compreende SEQ ID NO: 9 e 10; e componente (ii) compreende SEQ ID NO: 16; ou componente (i) compreende SEQ ID NO: 11 e 12; e componente (ii) compreende SEQ ID NO: 17; ou componente (i) compreende SEQ ID NO: .11 e 12; e componente (ii) compreende SEQ ID NO:53 ou SEQ ID NO:54.
Em uma outra modalidade da presente invenção é fornecido um método para determinar a presença ou ausência de tecido de tumor positivo para MAGE-A3, compreendendo a etapa de contatar uma seqüência de nucleotídeos isolada obtida ou derivada de uma amostra biológica com pelo menos um iniciador como aqui descrito, conjunto de iniciadores como aqui descrito, sonda como aqui descrito ou kit como aqui descrito.
Outro aspecto da presente invenção é um método para determinar a presença ou ausência de tecido de tumor positivo para ΜΑΘΕ- A3, pelo ensaio de uma amostra biológica com um iniciador, sonda, ou conjunto de iniciadores como aqui descrito.
Em um outro aspecto é fornecido um método de diagnose de paciente compreendendo a etapa de contatar uma seqüência de nucleotídeos isolada obtida ou derivada de uma amostra biológica com pelo menos um iniciador como aqui descrito, conjunto de iniciadores como aqui descrito, sonda como aqui descrito ou kit como aqui descrito e avaliar se MAGE-A3 é expressado na amostra.
O método pode adicionalmente compreender a etapa de amplificar uma seqüência de nucleotídeos e detectar na amostra a seqüência de nucleotídeos amplificada.
Em ainda outro aspecto é fornecido um método para determinar a presença ou ausência de tecido de tumor positivo para MAGE- A3, compreendendo contatar uma seqüência de nucleotídeos isolada obtida ou derivada de uma amostra biológica com pelo menos um iniciador ou sonda como aqui descrito. O método pode adicionalmente compreender a etapa de determinar se a seqüência de nucleotídeos isolada hibridiza com o pelo menos um iniciador ou sonda sob condições estringentes, determinando deste modo se o tecido de tumor é positivo para MAGE-A3. Em uma modalidade, o método pode adicionalmente compreender a etapa de usar hibridização in situ para detectar se a seqüência de nucleotídeos hibridiza com o pelo menos um iniciador ou sonda.
Os métodos como aqui descritos podem ser usados em uma amostra biológica que é tecido congelado; alternativamente ou adicionalmente, os métodos aqui descritos podem ser realizados em uma amostra biológica que é tecido conservado em parafina, por exemplo Tecido Fixado em Formalina, Embebido em Parafina (FFPE).
A presente invenção adicionalmente fornece um método para tratar um paciente compreendendo: determinar se um tecido de tumor de paciente expressa MAGE-A3 usando um método como aqui descrito e então administrar uma composição compreendendo um agente imunoterapêutico ou uma imunoterapia para MAGE-A3 como aqui descrito ao paciente.
Em uma outra modalidade é fornecido um método para tratar um paciente suscetível à recorrência de um tumor expressando MAGE-A3, o paciente tendo sido tratado para remover/tratar tecido de tumor expressando MAGE-A3, o método compreendendo: determinar se o tecido de tumor de paciente expressa MAGE-A3 usando um método como aqui descrito e então administrar uma composição compreendendo um agente imunoterapêutico ou uma imunoterapia para MAGE-A3 como aqui descrito ao dito paciente.
Em uma outra modalidade da presente invenção é fornecido o uso de uma composição compreendendo um agente imunoterapêutico ou uma imunoterapia para MAGE-A3 na manufatura de um medicamento para o tratamento de um paciente sofrendo de um tumor expressando MAGE-A3, no qual um paciente é identificado como tendo tecido de tumor expressando MAGE-A3 usando um método como aqui descrito.
Em ainda uma outra modalidade é fornecido o uso de a uma composição compreendendo um agente imunoterapêutico ou uma imunoterapia para MAGE-A3 na manufatura de um medicamento para o tratamento de um paciente suscetível à recorrência de um tumor expressando MAGE-Α3, no qual um paciente é identificado como tendo tecido de tumor expressando MAGE-A3 usando um método como aqui descrito.
Em uma modalidade é fornecido um método de tratamento ou uso como aqui descrito, no qual a composição compreendendo um agente imunoterapêutico ou uma imunoterapia para MAGE-A3 compreende um antígeno MAGE-A3 ou seu peptídeo. Em uma modalidade o antígeno MAGE-A3 ou seu peptídeo compreende ou consiste do peptídeo EVDPIGHLY.
O peptídeo ou antígeno MAGE-A3 para uso na presente invenção pode estar fundido ou conjugado em uma proteína carreadora. Em uma modalidade, a proteína carreadora pode ser selecionada de proteína D, NS1 ou CLytA ou seus fragmentos.
Em uma modalidade da presente invenção a composição compreendendo um agente imunoterapêutico ou uma imunoterapia para MAGE-A3 pode adicionalmente compreender um adjuvante. Por exemplo, o adjuvante pode compreender um ou mais ou combinações de: 3D-MPL; sais de alumínio; oligonucleotídeos contendo CpG; adjuvantes contendo saponina tais como QS21 ou ISCOMs; emulsões de óleo-em-água; e lipossomos. Em uma modalidade, o adjuvante pode compreender 3D-MPL, oligonucleotídeos contendo CpG e QS21.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Como aqui usado, o termo 'seqüência alvo' é uma região da seqüência de nucleotídeos MAGE-A3 (quer DNA quer RNA, e.g. DNA genômico, RNA mensageiro, ou suas versões amplificadas) na qual a seqüência da sonda ou iniciador tem identidade parcial (i.e. com algum grau de má combinação) ou total; embora o iniciador inverso seja o complemento inverso (ou, como acima, tem algum grau de má combinação) da seqüência que ele reconhece. A seqüência alvo geralmente se refere a uma região da seqüência MAGE-A3 que difere em pelo menos um nucleotídeo comparada com todas a outra, ou com todas as outras, seqüências de nucleotídeos MAGE-A. Contudo, em algumas modalidades da presente invenção a seqüência alvo pode, para um ou mais dos iniciadores e sonda, ser idêntica entre seqüências de nucleotídeos MAGE-A, desde que pelo menos um ou dois dos iniciadores e sonda a serem usados para reconhecer uma seqüência alvo que difere entre os genes a serem diferenciados.
Portanto, em uma modalidade, um iniciador ou sonda específico(a) se ligaria na seqüência MAGE-A3 alvo sem más combinações e se ligaria na região equivalente de uma outra seqüência MAGE-A, por exemplo a seqüência de MAGE-6, com más combinações de um ou mais pares de bases.
A seqüência alvo para os iniciadores ou sonda da presente invenção pode ser a seqüência tendo as maiores diferenças (más combinações) entre os dois genes, para permitir detecção de MAGE-A3 com especificidade muito alta.
Em uma modalidade da presente invenção, as seqüências alvo estão nas regiões identificadas em texto dentro de retângulo em Figura 15.
Adequadamente, o iniciador ou sonda pode ser pelo menos 95% idêntico(a) à seqüência alvo sobre o comprimento inteiro do iniciador ou sonda, adequadamente mais do que 95% idêntico tal como 96%, 97%, 98%, 99% e muito mais preferivelmente tem 100% de identidade sobre seu comprimento inteiro em comparação com a seqüência MAGE-A3 alvo. Os iniciadores ou sondas da invenção podem ser idênticos à seqüência alvo em todas as posições de nucleotídeo do iniciador ou sonda, ou podem ter 1, 2, ou mais más combinações dependendo do comprimento de sonda, temperatura, condições de reação e exigências do ensaio, por exemplo. Claro que desde que o iniciador inverso atenda a estas condições para a região que é o complemento inverso da seqüência de iniciador.
Adequadamente cada nucleotídeo do iniciador ou sonda pode formar uma ligação de hidrogênio com sua contra-parte nucleotídeo alvo.
Preferivelmente a complementaridade de iniciador ou sonda com a seqüência alvo é avaliada pelo grau de pareamento de bases A:T e C:G, de tal modo que um nucleotídeo adenina (A) pareie com uma timina (T), e de tal modo que um nucleotídeo guanina (G) pareie com uma citosina (C), ou vice versa. Na forma de RNA, T pode ser substituída por U (uracila).
Onde inosina é usada em sondas universais, por exemplo, então a complementaridade também pode ser avaliada pelo grau de interações de nucleotídeo alvo-(sonda) inosina.
Conseqüentemente, a presente invenção fornece um iniciador compreendendo a seqüência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NO.1-12, como mostrado em Tabelas 1 e 2. O termo "iniciador" como aqui usado significa qualquer seqüência de nucleotídeos de fita única capaz de ser usada como um iniciador em, por exemplo, tecnologia de PCR. Assim, um 'iniciador', de acordo com a invenção refere-se uma seqüência de oligonucleotídeo de fita única que é capaz de atuar como um ponto de iniciação para síntese de um produto de extensão de iniciador que é substancialmente idêntico (para um iniciador direto) ou substancialmente o complemento inverso ( para um iniciador inverso) à fita de ácido nucleico a ser copiada. O planejamento (comprimento e seqüência específica) do iniciador dependerá da natureza dos alvos DNA e/ou RNA e das condições nas quais o iniciador é usado (tais como temperatura e força iônica).
Os iniciadores podem consistir das seqüências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NO: 1-12, ou podem ser 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,50, 75, 100 ou mas pares de bases que compreendem ou caem dentro das seqüências de SEQ ID NO: 1-12, desde que sejam adequadas para especificamente ligarem uma seqüência alvo dentro de uma seqüência de nucleotídeos MAGE-A3, sob condições estringentes. Quando necessárias, modificações ligeiras dos iniciadores das sondas em comprimento ou em seqüência podem ser realizadas para manter a especificidade e a sensibilidade exigidas sob as circunstâncias dadas. Sondas e/ou iniciadores aqui listados podem ser estendidos ou reduzidos em comprimento por 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos, por exemplo, em qualquer direção.
Como aqui usado, o termo "condições estringentes" significa quaisquer condições de hibridização que permitem que os iniciadores se liguem especificamente em uma seqüência de nucleotídeos dentro da seqüência de nucleotídeos MAGE-A3, mas não em quaisquer outras seqüências de nucleotídeos MAGE. 'Ligação específica' ou 'hibridização específica', de uma sonda em uma região da seqüência de nucleotídeos MAGE-A3 significa que o iniciador ou sonda forma um duplex (seqüência de nucleotídeos de fita dupla) com parte desta região ou com a região inteira sob as condições experimentais usadas, e que sob aquelas condições o iniciador ou sonda não forma um duplex com outras regiões da seqüência de nucleotídeos presente na amostra a ser analisada. Deve ser entendido que os iniciadores e sondas da presente invenção que são planejados para hibridização específica dentro de uma região da seqüência de nucleotídeos MAGE-A3 podem cair inteiramente dentro de dita região ou podem em uma extensão grande sobrepor com dita região (i.e. formar um duplex com nucleotídeos fora bem como dentro de dita região).
Adequadamente, a hibridização específica de uma sonda em uma região alvo de ácido nucleico ocorre sob condições de hibridização "estringentes", tais como 3X SSC, 0,1% SDS, a 50°C. A pessoa experiente sabe como variar os parâmetros de temperatura, comprimento de sonda e concentração de sal de tal modo que hibridização específica possa ser realizada. Condições de hibridização e lavagem são bem conhecidas e exemplificadas em, por exemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), particularmente Chapter 11 do mesmo. A presente invenção adicionalmente fornece um conjunto de iniciadores compreendendo um ou mais dos seguintes pares de iniciadores:
<table>table see original document page 20</column></row><table>
A presente invenção adicionalmente fornece uma sonda compreendendo a seqüência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NO: 13-17, 53 ou 54. O termo "sonda" é aqui usado para significar qualquer seqüência de oligonucleotídeo de fita única capaz de se ligar em ácido nucleico sendo usado como uma sonda em, por exemplo, tecnologia de PCR: as sondas podem consistir das seqüências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NO: 13-17, 53 ou 54 ou podem ser 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 ou mais pares de bases que compreendem ou caem dentro das seqüências de SEQ ID NO: 13-17, 53 ou 54 desde que sejam adequadas para especificamente ligarem uma seqüência alvo dentro da seqüência de nucleotídeos MAGE-A3.
Em uma modalidade da invenção, na qual uma sonda é para ser usada em um método em combinação com um par de iniciadores, o par de iniciadores deve permitir a amplificação de parte de ou de todo o fragmento de polinucleotídeo MAGE-A3 no qual as sondas são imobilizadas sobre um suporte sólido.
O iniciador e/ou sonda pode adicionalmente compreender um marcador, permitindo que a sonda seja detectada. Exemplos de marcadores que podem ser usados incluem: marcadores fluorescentes, por exemplo, 6- carbóxi-fluoresceína (6FAM™), NED™ (Applera Corporation), HEX™ ou VIC™ (Applied Biosystems); marcadores TAMRA™ (Applied Biosystems, CA, USA); marcadores quimioluminescentes, por exemplo sondas de Rutênio,; e marcadores radioativos, por exemplo trítio na forma de timidina tritiada. Fósforo-32 também pode ser usado como um radiomarcador. Em uma modalidade da presente invenção, a sonda pode compreender um corante repórter fluorescente em sua extremidade-5' e um corante extintor em sua extremidade-31. O corante repórter fluorescente pode compreender 6-carbóxi-fluoresceína (6FAM) e o corante extintor pode compreender um extintor não-fluorescente (NFQ). Opcionalmente, uma proteína Ligante de Sulco Menor (MGB™; Applied Biosystems, CA, USA) pode ser adicionada na sonda, por exemplo na extremidade-31 da sonda.
Em uma modalidade, uma sonda MGB™ Eclipse pode ser usada (Epoch Biosciences, WA, USA). Sondas MGB™ Eclipse têm um EclipseˇTM Dark Quencher e um grupo MGB posicionado na extremidade- 5' da sonda. Um corante repórter fluorescente está localizado na extremidade-3' da sonda.
Em uma modalidade, as seqüências de iniciador e sonda da presente invenção podem conter ou compreender bases ou estruturas de nucleotídeo naturalmente ocorrentes, por exemplo adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) e uracila (U).
Em uma outra modalidade, análogos sintéticos ou modificados de bases ou estruturas de nucleotídeo podem ser incluídos na seqüência da sonda. Sintético ou modificado significa uma base ou estrutura de nucleotídeo não-naturalmente ocorrente. Tais bases sintéticas ou modificadas podem substituir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou todas as bases na seqüência da sonda. Em uma modalidade, Citosina pode ser substituída por 5-Metil dC e Timina pode ser substituída por 5-Propinil dU. Extintor BHQ2 também pode ser incluído dentro da seqüência.
A presente invenção adicionalmente fornece um kit compreendendo os seguintes componentes: (i) pelo menos um iniciador ou conjunto de iniciadores como aqui descrito; e (ii) pelo menos uma sonda como aqui descrito. Em uma modalidade, o kit compreende um iniciador direto, um iniciador inverso e uma seqüência de sonda que tem uma seqüência alvo dentro da região amplificada pelos iniciadores direto e inverso. Nesta modalidade, o conjunto de iniciadores é capaz de amplificar uma porção (amplicon) da seqüência de MAGE-A3 e a sonda é capaz de hibridizar sob condições estringentes no amplicon.
As seqüências de MAGE-A3 e MAGE-A6 são elevadamente homólogas, tendo 98% de alinhamento de suas seqüências de nucleotídeos e 95% de alinhamento de suas seqüências de proteína. Com o objetivo de especificamente identificar as seqüências MAGE-A3, é necessário identificar iniciadores e sondas capazes de diferenciar entre MAGE-A3 e MAGE-A6.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece um conjunto de iniciadores e/ou sondas que especificamente hibridizam com uma seqüência alvo de MAGE-A3 sob condições estringentes no qual pelo menos uma das seqüências alvo do iniciador ou sonda difere em pelo menos um nucleotídeo comparada com a região equivalente de todas as outras seqüências de nucleotídeos MAGE A e no qual o conjunto é capaz de discriminar entre MAGE-A3 e MAGE-A6.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece um conjunto de iniciadores e/ou sondas que especificamente hibridizam com uma seqüência alvo de MAGE-A3 sob condições estringentes no qual pelo menos uma das seqüências alvo do iniciador ou sonda difere em pelo menos um nucleotídeo comparada com a região equivalente da seqüência de nucleotídeos MAGE A6 e no qual o conjunto é capaz de discriminar entre MAGE-A3 e MAGE-A6.
Em uma modalidade, a seqüência alvo de pelo menos um iniciador ou sonda pode diferir em um nucleotídeo na seqüência alvo de MAGE-A3, comparada com a região equivalente de MAGE-A6. Em uma outra modalidade, a seqüência alvo de pelo menos um iniciador ou sonda pode diferir em dois nucleotídeos comparada com a região equivalente de MAGE-A6. Em uma modalidade, um kit compreendendo dois iniciadores e uma sonda pode ter as seguintes diferenças nas seqüências alvo dos iniciadores e sonda:
(i) a seqüência alvo de um dos dois iniciadores ou sondas difere em um nucleotídeo entre MAGE-A3 e MAGE-A6;
(ii) a seqüência alvo de um iniciador ou sonda não referida em parte (i), difere em um nucleotídeo entre MAGE-A3 e MAGE-A6; e
(iii) a seqüência alvo do iniciador ou sonda restante é idêntica a ambos MAGE-A3 e MAGE-A6;
Por exemplo, em uma modalidade, um kit compreendendo iniciador A, iniciador B e sonda C pode compreender as seguintes diferenças nas seqüências alvo:
(i) a seqüência alvo de iniciador A difere em um nucleotídeo entre MAGE-A3 e MAGE-A6; 15 (ii) a seqüência alvo de iniciador B difere em dois nucleotídeos
entre MAGE-A3 e MAGE-A6; e
(iii) a seqüência alvo de sonda C é idêntica a ambos MAGE- A3 e MAGE-A6.
Por exemplo, em uma modalidade, um kit compreendendo 20 iniciador A, iniciador B e sonda C pode compreender as seguintes diferenças nas seqüências alvo:
(i) a seqüência alvo de iniciador A difere em dois nucleotídeos entre MAGE-A3 e MAGE-A6;
(ii) a seqüência alvo de iniciador B é idêntica a ambos MAGE- 25 A3 e MAGE-A6; e
(iii) a seqüência alvo de sonda C difere em um nucleotídeo entre MAGE-A3 e MAGE-A6;
Por exemplo, em uma modalidade, um kit compreendendo iniciador A, iniciador B e sonda C pode compreender as seguintes diferenças nas seqüências alvo:
(i) a seqüência alvo de iniciador A é idêntica a ambos MAGE- A3 e MAGE-A6;
(ii) a seqüência alvo de iniciador B difere em um nucleotídeo entre MAGE-A3 e MAGE-A6; e
(iii) a seqüência alvo de sonda C difere em dois nucleotídeos entre MAGE-A3 e MAGE-A6;
Em uma modalidade, o kit pode compreender: o par de iniciadores de ou compreendendo SEQ ID NO: 3 e 4 e a sonda de ou compreendendo SEQ ID NO: 13; o par de iniciadores de ou compreendendo SEQ ID NO: 5 e 6 e a sonda de ou compreendendo SEQ ID NO: 14; o par de iniciadores de ou compreendendo SEQ ID NO: 7 e 8 e a sonda de ou compreendendo SEQ ID NO: 15; o par de iniciadores de ou compreendendo SEQ ID NO: 9 e 10 e a sonda de ou compreendendo SEQ ID NO: 16; e/ou o par de iniciadores de ou compreendendo SEQ ID NO: 11 e 12 e a sonda de ou compreendendo SEQ ID NO: 17.
Em uma outra modalidade da presente invenção é fornecido um método para determinar a presença ou ausência de tecido de tumor positivo para MAGE-A3, compreendendo a etapa de contatar uma seqüência de nucleotídeos obtida ou derivada de uma amostra biológica com pelo menos um iniciador ou pelo menos um conjunto de iniciadores ou sonda como aqui descrito. Tecido de tumor positivo para MAGE-A3 significa quaisquer tumores ou células de tumor expressando o antígeno MAGE-A3 que têm sido isolados de um paciente. O método como aqui descrito pode ser usado para determinar se uma amostra biológica compreende ou consiste de tecido de tumor positivo para MAGE-A3.
Amostra biológica significa uma amostra de tecido ou de células de um paciente que tem sido removida ou isolada do paciente.
É adicionalmente fornecido um método de diagnose de paciente compreendendo a etapa de contatar uma seqüência de nucleotídeos obtida ou derivada de uma amostra biológica com pelo menos um iniciador ou pelo menos um conjunto de iniciadores ou sonda como aqui descrito e avaliar se MAGE-A3 é expressado na amostra.
Em uma modalidade, a seqüência de nucleotídeos é ou tem sido isolada da amostra biológica.
O termo "obtida ou derivada de" como aqui usado significa ser usado inclusivamente. Isto é, é intencionado para incluir qualquer seqüência de nucleotídeos diretamente isolada de uma amostra de tumor ou qualquer seqüência de nucleotídeos derivada da amostra por exemplo pelo uso de transcrição reversa para produzir mRNA ou cDNA.
Um método da presente invenção pode adicionalmente compreender amplificar uma seqüência de nucleotídeos e detectar na amostra a seqüência de nucleotídeos amplificada. Alternativa ou adicionalmente, o método da presente invenção pode adicionalmente compreender contatar a seqüência de nucleotídeos isolada ou amplificada com uma ou mais sondas como aqui descrito.
Em uma modalidade, a seqüência de nucleotídeos é isolada ou purificada da amostra de tumor. Em RT-PCR, contaminação de DNA genômico pode ocasionar resultados de falso-positivo. Em uma modalidade, o DNA genômico é removido ou substancialmente removido da amostra a ser testada ou incluído nos métodos da presente invenção.
Os métodos da presente invenção são adequados para detectar tecido de tumor positivo para MAGE-A3. Em uma modalidade da presente invenção, positivo para tecido MAGE-A3 pode se detectado usando hibridização in situ. Hibridização in situ significa uma reação de hibridização realizada usando um iniciador ou sonda de acordo com a presente invenção em cromossomos intactos, células ou tecidos isolados de um paciente para visualização direta de sítios morfológicos de seqüências de DNA ou RNA específicas.
Hibridização dos polinucleotídeos pode ser realizada usando qualquer método de hibridização e sistema de detecção adequados. Exemplos de sistemas de hibridização incluem métodos de sanduíche, dot blot, e Southern blots convencionais. Por exemplo, um método adequado pode incluir uma abordagem de hibridização inversa, sendo que as sondas específicas para tipo são imobilizadas sobre um suporte sólido em localizações distintas conhecidas (pontos, linhas ou outras figuras), e poli(ácidos nucleicos) amplificados são marcados com o propósito de detectar formação de híbrido. As seqüências de ácido nucleico específicas para MAGE-A3, por exemplo uma sonda ou iniciador como aqui descrito, podem ser marcadas com biotina e o híbrido pode ser detectado via copulação de biotina-estreptavidina com um sistema de revelação colorida não-radioativo. Contudo, outros sistemas de hibridização reversa também podem ser empregados, por exemplo, como ilustrado em Gravitt et al, (Journal de Clinicai Microbiology, 1998, 36(10): 3020-3027) cujo conteúdo é também incorporado como referência. Condições de hibridização e lavagem padrão são descritas em Kleter et al., Journal de Clinicai Microbiology, 1999, 37(8): 2508-2517 e serão otimizadas sob as dadas circunstâncias para manter a especificidade e a sensibilidade exigidas pelo comprimento e pela seqüência da(s) sonda(s) e do(s) iniciador(es).
Em uma modalidade, o método da presente invenção pode compreender o uso de:
a) o par de iniciadores compreendendo SEQ ID NO: 3 e 4; e uma sonda compreendendo SEQ ID NO: 13;
b) o par de iniciadores compreendendo SEQ ID NO: 3 e 4; e uma sonda compreendendo SEQID NO: 17
c) o par de iniciadores compreendendo SEQ ID NO: 3 e 4; e uma sonda compreendendo SEQID NO:53 d) o par de iniciadores compreendendo SEQ ID NO: 3 e 4; e uma sonda compreendendo SEQ ID NO:54
e) o par de iniciadores compreendendo SEQ ID NO: 5 e 6 e a sonda compreendendo SEQID NO: 14;
f) o par de iniciadores compreendendo SEQ ID NO: 7 e 8 e a sonda compreendendo SEQID NO: 15;
g) o par de iniciadores compreendendo SEQ ID NO: 9 e IOea sonda compreendendo SEQID NO: 16;
h) o par de iniciadores compreendendo SEQ ID NO: 11 e 12 e a sonda compreendendo SEQ ID NO: 17;
i) o par de iniciadores compreendendo SEQ ID NO: 11 e 12; e uma sonda compreendendo SEQ ID NO:53; e/ou
j) o par de iniciadores compreendendo SEQ ID NO: 11 e 12; e uma sonda compreendendo SEQ ID NO:54
Os métodos como aqui descritos são adequados para uso em tecido fresco, tecido congelado, tecido conservado em parafina e/ou tecido conservado em etanol. Procedimentos de extração e purificação bem conhecidos estão disponíveis para o isolamento de RNA ou DNA de uma amostra (e.g. em Sambrook et al., 1989). O RNA ou DNA pode ser usado diretamente após extração da amostra ou, mais preferivelmente, após uma etapa de amplificação de polinucleotídeo (e.g. PCR). Em casos específicos, tal como para ensaios de hibridização inversa, pode ser necessário reversamente transcrever RNA em cDNA antes da amplificação. Em ambos os últimos casos o polinucleotídeo amplificado é derivado da amostra.
Em uma modalidade, no qual a amostra é tecido conservado em parafina, os seguintes conjuntos de iniciadores e sondas pode ser usado:
a) o par de iniciadores compreendendo SEQ ID NO: 7 e 8 e a sonda compreendendo SEQ ID NO: 15;
b) o par de iniciadores compreendendo SEQ ID NO: 9 e 10 e a sonda compreendendo SEQID NO: 16;
c) o par de iniciadores compreendendo SEQ ID NO: 11 e 12 e a sonda compreendendo SEQID NO: 17;
d) o par de iniciadores compreendendo SEQ ID NO: 11 e 12; e uma sonda compreendendo SEQ ID NO:53; e/ou
e) o par de iniciadores compreendendo SEQ ID NO: 11 e 12; e uma sonda compreendendo SEQ ID NO:54
A presente invenção adicionalmente fornece um método para tratar um paciente compreendendo: determinar se o tecido de tumor de paciente expressa MAGE-A3 usando um método como aqui descrito, e administrar ao dito paciente uma composição compreendendo um antígeno MAGE-A3, epítopo ou derivado de antígeno ou uma imunoglobulina ou um anticorpo específico para MAGE-A3. O paciente pode ter tecido de tumor expressando MAGE-A3 (ambiente de doença ativa), ou pode ser suscetível à recorrência de um tumor expressando MAGE-A3, o paciente tendo sido tratado para remover/tratar tecido de tumor expressando MAGE-A3 (ambiente adjuvante).
A presente invenção adicionalmente fornece o uso de uma composição compreendendo um antígeno a MAGE-A3, epítopo ou derivado de antígeno ou uma imunoglobulina ou um anticorpo específico para MAGE- A3 na manufatura de um medicamento para o tratamento de um paciente sofrendo de um tumor expressando MAGE-A3 ou suscetível à recorrência de um tumor expressando MAGE-A3, no qual um paciente é identificado como tendo ou identificado como tendo tido tecido de tumor expressando MAGE- A3 usando um método diagnóstico, kit, iniciador ou sonda como aqui descrito.
A composição compreendendo um antígeno a MAGE-A3, epítopo ou derivado de antígeno pode compreender um antígeno MAGE-A3 ou seu peptídeo. Em uma modalidade, o antígeno MAGE-A3 ou seu peptídeo compreende ou consiste do peptídeo EVDPIGHLY. O peptídeo ou antígeno MAGE-A3 pode estar fundido ou conjugado em uma proteína carreadora, que pode ser selecionada de proteína D, NS 1 ou CLytA ou seus fragmentos.
Em uma modalidade, a composição pode adicionalmente compreender um adjuvante; por exemplo um adjuvante compreendendo um ou mais ou uma combinação de: 3D-MPL; sais de alumínio; oligonucleotídeos contendo CpG; adjuvantes contendo saponina tais como QS21 ou ISCOMs; emulsões de óleo-em-água; e lipossomos.
Assim a presente invenção fornece um método para selecionar, em aplicações clínicas, amostras de tecido de um paciente humano para a presença ou ausência da expressão de MAGE-A3. Tais amostras poderiam consistir de, por exemplo, núcleos de biopsia de agulha, amostras de ressecção cirúrgica ou tecido de linfonodo. Por exemplo, estes métodos incluem obter uma biopsia, que é opcionalmente fracionada por seccionamento por crypstat para enriquecer células de tumor em cerca de 80% da população de células total. Em certas modalidades, ácidos nucleicos podem ser extraídos destas amostras usando técnicas bem conhecidas na técnica. Em outras modalidades ácidos nucleicos extraídos da amostra de tecido podem ser amplificados usando técnicas bem conhecidas na técnica. O nível de expressão de MAGE-A3 pode ser detectado e pode ser comparado com grupos estatisticamente válicos e/ou controles de pacientes negativos para MAGE-A3.
Em uma modalidade, o método diagnóstico compreende determinar se um sujeito expressa o produto de gene MAGE-A3, por exemplo por detecção do correspondente nível de proteína e/ou mRNA do produto de gene. Por exemplo pelo uso de técnicas tais como análise Northern blot, transcrição reversa - reação em cadeia da polimerase (RT-PCR), RT-PCR semi-quantitativa, RT-PCR quantitativa, TaqMan PCR, hibridização in situ, imunoprecipitação, análise Western blot ou imuno-histoquímica. De acordo com um tal método, células ou tecido podem ser obtidos de um sujeito e o nível de mRNA e/ou proteína pode ser comparado com aqueles de tecido não expressando MAGE-A3.
Tecnologia de TaqMan PCR
A Taq DNA polimerase tem atividade de 5'-3' exonuclease. O ensaio Taqman PCR usa esta atividade de exonuclease para clivar sondas dual-marcadas para selecionar seqüências durante amplificação por PCR.
Resumidamente, RNA é extraído de uma amostra e cDNA é sintetizado (transcrição reversa). O cDNA é então adicionado em uma mistura reacional PCR contendo componentes de PCR padrão (veja, por exemplo, componentes fornecidos por Roche (CA, USA) para Taqman PCR. A mistura reacional adicionalmente contém uma sonda que anela na seqüência de nucleotídeos modelo entre os dois iniciadores (i.e. dentro da seqüência amplificada pela reação PCR, o "amplicon"). A sonda compreende um corante repórter fluorescente na extremidade-5' e um corante extintor na extremidade-3'. O extintor é capaz de extinguir a fluorescência repórter, mas apenas quando os dois corantes estiverem próximos um do outro; isto ocorre em sondas intactas.
Durante e após a amplificação, a sonda é degradada pela Taq DNA polimerase, e qualquer fluorescência é detectada.
Para medições quantitativas, é usado o número de ciclos de PCR no qual a fluorescência alcança um valor limite de 10 vezes o desvio padrão da emissão de linha base. Este número de ciclos, chamado de limite de ciclos (Ct), é inversamente proporcional à quantidade inicial de cDNA alvo e permite que a quantidade de cDNA seja medida. Essencialmente, quanto mais RNA alvo estiver presente em uma amostra, menor será o número de Ct obtido.
As medições obtidas para o valor de Ct são comparadas com aquelas obtidas para um gene doméstico. Isto leva em consideração quaisquer erros baseados na quantidade de RNA total adicionado em cada reação de transcrição reversa (baseado em absorbância em comprimento de onda) e sua qualidade (i.e., degradação): nenhuns dos quais são parâmetros confiáveis para medir o material inicial. Portanto, transcritos de um gene doméstico são quantificados como um controle endógeno. Beta-actina é um dos genes domésticos mais usados, embora outros possam ser utilizados.
Em ainda uma outra modalidade da invenção, é fornecido um método para tratar um paciente sofrendo de um tumor expressando MAGE- A3, o método compreendendo determinar, através do uso de um método da presente invenção, se o paciente expressa a proteína MAGE-A3 e subseqüentemente administrar uma composição compreendendo um antígeno MAGE-A3, epítopo ou derivado de antígeno ou uma imunoglobulina ou um anticorpo específico para MAGE-A3 para prevenir ou melhorar a recaída da doença. O paciente pode primeiro receber tratamento tal como ressecção por cirurgia de qualquer tumor ou outro tratamento de quimioterapia ou radioterapia.
Assim, a invenção adicionalmente proporciona o uso de imunoterapia específica para MAGE na manufatura de um medicamento para o tratamento de pacientes sofrendo de tumor expressando MAGE-A3 ou pacientes que têm recebido tratamento (cirurgia, quimioterapia ou radioterapia) para remover ou tratar um tumor expressando MAGE-A3, dito paciente tendo sido determinado em ter tecido de tumor expressando MAGE- A3, através do uso de um método diagnóstico, kit, iniciador ou sonda de acordo com a presente invenção.
Assim, esta invenção pode ser usada para pacientes tendo cânceres expressando MAGE-A3, tais como: melanoma; câncer de mama; câncer de bexiga incluindo carcinoma de célula transicional; câncer de pulmão incluindo câncer de pulmão de célula não-pequena (NSCLC); câncer de cabeça e pescoço incluindo carcinoma esofágico; carcinoma de célula escamosa; câncer de fígado; mieloma múltiplo e carcinoma de cólon. Em uma modalidade, a invenção pode ser usada no tratamento de pacientes em um ambiente adjuvante (pós-operativo) em tais cânceres particularmente pulmonar e melanoma. A invenção também encontra utilidade no tratamento de cânceres metastáticos. Imunoterapia
Composições adequadas para uso em métodos para tratar pacientes da presente invenção são aquelas capazes de produzir uma resposta imune específica para MAGE-A3. A composição conterá pelo menos um epítopo de um produto de gene MAGE-A3. Um tal epítopo pode estar presente como um antígeno de peptídeo opcionalmente ligado covalentemente em um suporte. Alternativamente, fragmentos de proteína maiores podem ser usados. Os fragmentos e peptídeos para uso precisam contudo, quando adequadamente apresentados serem capazes de produzir uma resposta imune contra MAGE-A3, por exemplo uma resposta imune específica para MAGE- A3.
Exemplos de peptídeos que podem ser usados na presente invenção incluem os seguintes peptídeos MAGE-A3:_
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Em uma modalidade, o antígeno pode compreender uma proteína ou peptídeo MAGE ligada(o) em um parceiro intensificador de expressão ou fusão imunológica. A proteína MAGE pode ser MAGE-A3 de comprimento total ou pode compreender um fragmento de MAGE3, por exemplo aminoácidos 3-314 de MAGE3 (312 aminoácidos em total).
O antígeno e parceiro podem estar quimicamente conjugados, ou podem ser expressados como uma proteína de fusão recombinante. Em uma modalidade na qual o antígeno e parceiro são expressados como proteína de fusão recombinante, isto pode permitir que níveis aumentados sejam produzidos em um sistema de expressão comparado com a proteína não- fundida. Assim o parceiro de fusão pode ajudar no fornecimento de epítopos auxiliador T (parceiro de fusão imunológico), preferivelmente epítopos auxiliador T reconhecidos por humanos, e/ou ajudar na expressão da proteína (intensificador de expressão) em rendimentos mais altos do que a proteína recombinante nativa. Em uma modalidade, o parceiro de fusão pode ser ambos um parceiro de fusão imunológico e um parceiro intensificador de expressão.
Em uma modalidade a invenção, o parceiro de fusão imunológico que pode ser usado é derivado da proteína D, uma proteína de superfície de bactéria gram-negativa, Haemophilus influenza B (W091/18926) ou um seu derivado. O derivado de proteína D pode compreender o primeiro 1/3 da proteína, ou aproximadamente o primeiro 1/3 da proteína. Em uma modalidade, os primeiros 109 resíduos de proteína D podem ser usados como um parceiro de fusão para dar um antígeno MAGE- A3 com epítopos de célula-T exógenos adicionais e aumentar o nível de expressão em E. coli (assim atuando também como um intensificador de expressão). Em uma modalidade alternativa, o derivado de proteína D pode compreender os primeiros 100-110 aminoácidos N-terminais ou aproximadamente os primeiros 100-110 aminoácidos N-terminais. Em uma modalidade, a proteína D ou seu derivado pode ter lipídeo ligado e lipoproteína D pode ser usada: a cauda lipídeo pode garantir apresentação ótima do antígeno às células apresentando antígeno.
Em uma modalidade, a MAGE-A3 pode ser a Proteína D- MAGE-A3/His, uma proteína de fusão de 432 resíduos de aminoácido. Esta proteína de fusão compreende aminoácidos 1 a 109 de Proteína D, uma lipoproteína presente sobre a superfície da bactéria gram-negativa Haemophilus Influenzae B, 312 aminoácidos da proteína MAGE-A3 (aminoácidos 3-314), um espaçador e uma cauda poli-histidina (His) que pode facilitar a purificação da proteína de fusão durante o processo de produção, por exemplo:
i) Uma seqüência de sinal de 18 resíduos e os primeiros 109 resíduos da proteína D processada, a seqüência de sinal sendo clivada da proteína de fusão durante produção para deixar os primeiros 109 resíduos;
ii) Dois resíduos não relacionados (metionina e ácido
aspártico);
iii) Resíduos 3-314 da proteína nativa MAGE-3;
iv) Dois resíduos de glicina funcionando como uma região de
dobradiça;
v) Sete resíduos de Histidina;
Em uma modalidade alternativa, o construto acima pode ser usado exceto (i) pode ser substituído por uma seqüência compreendendo os primeiros 100-110 aminoácidos N-terminais ou aproximadamente os primeiros 100-110 aminoácidos N-terminais de Proteína D.
MAGE-3 pode ser expressada como uma proteína de fusão com proteína D na terminação N e uma seqüência de sete resíduos de histidina (cauda His) na terminação-C. Proteína D é uma proteína ligante de imunoglobulina-D de 42-kDa, exposta sobre a superfície da bactéria Gram- negativa Haemophilus Influenzae B.
Em outra modalidade o parceiro de fusão imunológico proteína D pode ser substituído por proteína conhecida como LytA. LytA é derivada de Streptococcus pneumoniae que sintetiza uma N-acetil-L-alanina- amidase, amidase LytA, (codificada pelo gene LytA (Gene, 43 (1986) páginas 265-272)) uma autolisina que especificamente degrada certas ligações na estrutura principal base de peptidoglicano. O domínio C-terminal da proteína LytA é responsável pela afinidade para com colina ou para com alguns análogos de colina tal como DEAE. Esta propriedade tem sido explorada para o desenvolvimento de plasmídeos expressando E. coli C-LytA úteis para a expressão de proteínas de fusão. Purificação de proteínas híbridas contendo o fragmento C-LytA em sua terminação amino tem sido descrita (Biotechnology: 10, (1992) páginas 795-798). Em uma modalidade, a porção C terminal da molécula pode ser usada. A modalidade pode utilizar a porção repetida da molécula LytA encontrada na extremidade C terminal partindo do resíduo 178. Em uma modalidade, a porção LytA pode incorporar os resíduos 188 -305.
Em uma modalidade da presente invenção, a proteína MAGE- A3 pode compreender um derivado livre de tiol. Tais antígenos têm sido descritos em W099/40188. Em particular derivados carbóxi-amidados ou carbóxi-metilados podem ser usados.
Em uma modalidade da presente invenção, o antígeno associado a tumor compreende uma molécula de MAGE-A3-Proteína D. As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos para esta molécula são mostradas em Figura 9 (SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:36). Este antígeno e aqueles resumidos abaixo são descritos com mais detalhe em W099/40188.
Em outras modalidades da presente invenção, o antígeno associado a tumor pode compreender qualquer uma das seguintes proteínas de fusão:
Uma proteína de fusão de NS 1-MAGE3, e cauda histidina, por exemplo como mostrado em Figuras IOell (SEQ ID NO:37 e SEQ ID NO:38); uma proteína de fusão de CLYTA-MAGE3-Histidina, por exemplo como mostrado em Figuras 12 e 13 (SEQ ID NO:39 e SEQ ID N0:40).
Uma outra modalidade da presente invenção compreende utilização de um agente imunoterapêutico ácido nucleico que compreende uma molécula de ácido nucleico codificadora de um antígeno associado a tumor específico para MAGE-A3 como aqui descrito. Em uma modalidade da presente invenção, as seqüências podem ser inseridas em um vetor de expressão adequado e usadas para vacinação com DNA/RNA. Vetores microbianos expressando o ácido nucleico também podem ser usados como agentes imunoterapêuticos liberados de vetor.
Exemplos de vetores virais adequados incluem sistemas retroviral, lentiviral, adenoviral, viral adeno-associado, herpes-viral incluindo herpes-simples-viral, alfa-viral, pox-viral tais como Canarypox e vacínia- viral. Técnicas de transferência de gene usando estes vírus são conhecidas por aqueles pessoas experientes na técnica. Vetores retrovirais por exemplo podem ser usados para estavelmente integrar o polinucleotídeo da invenção no genoma hospedeiro, embora tal recombinação não seja preferida. Vetores de adenovírus defeituosos em replicação em contraste permanecem epissomais e portanto permitem expressão transiente. Vetores capazes de dirigir a expressão em células de inseto (por exemplo vetores de baculovírus), em células de humano, levedura ou em bactérias podem ser empregados com o propósito de produzir quantidades de proteína MAGE-A3 codificada pelos polinucleotídeos da presente invenção, por exemplo para uso como vacinas de subunidade ou em imunoensaios.
Em uma modalidade preferida o adenovírus usado como um vetor vivo é um adenovírus simiano defeituoso em replicação. Tipicamente estes vírus contêm uma deleção El e podem ser crescidos sobre linhagens celulares que são transformadas com um gene El. Adenovírus simianos preferidos são vírus isolados de chimpanzé. Em particular C68 (também conhecido como Pan 9) (veja patente US de N0' 6083 716) e Pan 5, 6 e Pan 7 (WO 03/046124) são preferidos para uso na presente invenção. Assim estes vetores podem ser manipulados para inserir um gene heterólogo da invenção de tal modo que o produto de gene possa ser expressado. O uso, a formulação e a manufatura de tais vetores adenovirais recombinantes são descritos em detalhe em WO 03/046142.
Técnicas recombinantes convencionais para obter seqüências de ácido nucleico, e produção de vetores de expressão são descritas em Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989.
Para agentes imunoterapêuticos baseados em proteína as proteínas da presente invenção são fornecidas quer solúvel em uma forma líquida quer em uma forma liofilizada.
Cada dose de humano pode compreender 1 a 1,000 μg de proteína. Em uma modalidade, a dose pode compreender 30 - 300 μg de proteína.
O agente imunoterapêutico como aqui descrito pode adicionalmente compreender um adjuvante de vacina, e/ou uma quimiocina ou citocina imunoestimulante.
Adjuvantes de vacina adequados para uso na presente invenção estão comercialmente disponíveis tais como, por exemplo, Adjuvante Completo e Adjuvante Incompleto de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI); Merck Adjuvant 65 (Merck & Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); sais de alumínio tais como gel de hidróxido de alumínio (alume) ou fosfato de alumínio; sais de cálcio, ferro ou zinco; uma suspensão insolúvel de tirosina acilada; açúcares acilados; polissacarídeos catiônica ou anionicamente derivados; polifosfazenos; microesferas biodegradáveis; monofosforil lipídeo A e quil A. Citocinas, tais como GM-CSF ou interleucina-2, -7, ou -12, e quimiocinas também podem ser usadas como adjuvantes.
Em formulações da invenção pode ser desejável que a composição de adjuvante induza uma resposta imune predominantemente do tipo Th 1. Níveis altos de citocinas de tipo-Thl (e.g., IFN-γ, TNFa, IL-2 e IL-12) tendem a favorecer a indução de respostas imunes mediadas por célula a um antígeno administrado. De acordo com uma modalidade, na qual a resposta é predominantemente de tipo-Thl, o nível de citocinas de tipo-Thl aumentará em uma extensão maior do que o nível de citocinas de tipo-Th2. Os níveis destas citocinas pode ser prontamente avaliado usando ensaios padrão. Para uma revisão das famílias de citocinas, veja Mosmann e Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989.
Conseqüentemente, adjuvantes adequados que podem ser usados para produzir uma resposta predominantemente de tipo-Thl incluem, por exemplo uma combinação de monofosforil lipídeo A, tal como monofosforil lipídeo A 3-de-0-acilado (3D-MPL) junto com um sal de alumínio. 3D-MPL ou outros ligantes de receptor 4 ^//-semelhante (TLR4) tais como amino-alquil glicosaminida fosfatos como descritos em W09850399, W00134617 e W003065806 também podem ser usados sozinhos para gerar uma resposta predominantemente de tipo-Thl.
Outros adjuvantes conhecidos que podem preferencialmente induzir uma resposta imune de tipo Th 1, incluem antagonistas de TLR9 tais como oligonucleotídeos não-metilados contendo CpG. Os oligonucleotídeos são caracterizados pelo fato de que o dinucleotídeo CpG está não-metilado. Tais oligonucleotídeos são bem conhecidos e são descritos em, por exemplo WO 96/02555.
Oligonucleotídeos adequados incluem:
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Oligonucleotídeos contendo CpG também podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros adjuvantes. Por exemplo, um sistema intensificado envolve a combinação de um oligonucleotídeo contendo CpG e um derivado de saponina particularmente a combinação de CpG e QS21 como descrito emWO00/09159 e WO00/62800.
A formulação pode adicionalmente compreender uma emulsão de óleo-em-água e/ou tocoferol.
Outro adjuvante adequado é uma saponina, por exemplo QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), que pode ser usada sozinha ou em combinação com outros adjuvantes. Por exemplo, um sistema intensificado envolve a combinação de um monofosforil lipídeo A e derivado de saponina, tal como a combinação de QS21 e 3D-MPL como descrito em WO 94/00153, ou uma composição menos reatogênica onde o QS21 está extinto com colesterol, como descrito em WO 96/33739. Outras formulações adequadas compreendem uma emulsão de óleo-em-água e tocoferol. Uma formulação de adjuvante particularmente potente envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol em uma emulsão de óleo-em-água é descrita em WO 95/17210.
Em outra modalidade, os adjuvantes podem ser formulados em uma composição lipossômica. A quantidade de 3DMPL usada é geralmente pequena, mas dependendo da formulação imunoterapêutica pode estar dentro da região de l-1.000μg por dose, preferivelmente l-500μg por dose, e mais preferivelmente entre 1 e 100 pg por dose.
Em uma modalidade, o sistema adjuvante compreende três imunoestimulantes: um oligopeptídeo CpG, 3D-MPL, & QS21 quer apresentados em uma formulação lipossômica quer em uma emulsão de óleo- em-água tal como descrito em WO 95/17210.
A quantidade de CpG ou oligonucleotídeos adjuvantes ou agentes imunoterapêuticos da presente invenção é geralmente pequena, mas dependendo da formulação imunoterapêutica pode estar dentro da região de 1 - 1.000pg por dose, preferivelmente l-500pg por dose, e mais preferivelmente entre 1 e 100 pg por dose.
A quantidade de saponina para uso nos adjuvantes da presente invenção pode estar dentro da região de 1-1.000pg por dose, preferivelmente 1-50µg por dose, mais preferivelmente 1-25µg por dose, e muito mais preferivelmente entre 1 e 100μg por dose.
Geralmente, cada dose pode compreender 0,1-1.000 de antígeno, por exemplo 0,1-500 μg, 0,1-100 μg, ou 0,1 a 50 μg. Uma quantidade ótima para um agente imunoterapêutico particular pode ser determinada por estudos padrão envolvendo observação de respostas imunes apropriadas em sujeitos vacinados. Após uma vacinação inicial, sujeitos podem receber uma ou várias imunizações de reforço adequadamente espaçadas.
Outros adjuvantes adequados incluem Montanide ISA 720 (Seppic, France), SAF (Chiron, Califórnia, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), Ribi Detox, RC-529 (GSK, Hamilton, MT) e outros amino- alquil-glicosaminida-4-fosfatos (AGPs).
Conseqüentemente é fornecida uma composição imunogênica para uso no método da presente invenção compreendendo um antígeno como aqui descrito e um adjuvante, sendo que o adjuvante compreende um ou mais de 3D-MPL, QS21, um oligonucleotídeo CpG, um polietileno-éter ou -éster ou uma combinação de dois ou mais destes adjuvantes. O antígeno dentro da composição imunogênica pode ser apresentado em um veículo de emulsão de óleo-em-água ou em um veículo de emulsão de água-em-óleo ou em uma formulação lipossômica.
Em uma modalidade, o adjuvante pode compreender um ou mais de 3D-MPL, QS21 e um oligonucleotídeo CpG imunoestimulante. Em uma modalidade todos os três imunoestimulantes estão presentes. Em outra modalidade 3D MPL e Qs21 estão presentes em uma emulsão de óleo-em- água, e na ausência de um oligonucleotídeo CpG.
Uma composição para uso no método da presente invenção pode compreender uma composição farmacêutica compreendendo antígeno associado a tumor como aqui descrito, ou a proteína de fusão, em um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Em todo este relatório descritivo e nas reivindicações que seguem, a não ser que o contexto exija de outra maneira, a palavra "compreender", e variações tais como "compreende" e "compreendendo", serão entendidas em conterem a inclusão de um número inteiro enunciado ou etapa enunciada ou grupo de números inteiros enunciados mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas.
A invenção será descrita adicionalmente referindo-se aos seguintes exemplos não limitantes, nos quais RT-PCR refere-se à transcrição- reversa-reação em cadeia da polimerase:
EXEMPLOS
Exemplo 1
PCR semi-quantitativa - amostras de tecido congelado
Iniciadores: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:2
Extração de RNA: método de purificação de RNA em nitrogênio líquido
Um pedaço pequeno de tecido foi rapidamente congelado em nitrogênio líquido e então posicionado em um almofariz para moagem mecânica por um pilão. 100 mg de pó resultante foram adicionados em 100 μΐ de reagente de isolamento TriPure e RNA foi extraído de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen, Venlo, Países-Baixos). Concentração de RNA foi determinada a partir do valor de densidade óptica em 260 nm. MAGE-A3 RT-PCR semi-quantitativa
RT-PCR semi-quantitativa foi realizada como descrito por De Plaen et al. (Immunogenetics 40:360, 1994). Síntese de cDNA a partir de 2 μg de RNA total foi conduzida em uma mistura de 20 μΐ contendo tampão de primeira fita lx, 0,5 mM de cada dNTP, IOmM de ditiotreitol, 20 U de inibidor de rRNase, 2 μΜ de oligo (dT) 15 e 200 U de transcriptase reversa M- MLV por lh30 a 42°C. 50 ng de cDNA foram amplificados por PCR em uma mistura de 25 μl contendo iniciadores específicos para MAGE-A3 (SEQ ID NOs 1 e 2). Uma alíquota de ΙΟμΙ de cada reação foi corrida em uma eletroforese de gel de agarose 1% e visualizada por fluorescência de brometo de etídio. Os tamanhos dos amplicons são 725 pb e 805 pb quando mRNA e DNA genômico (gDNA) são respectivamente amplificados. Controles positivos para MAGE-A3 RT-PCR semi-quantitativa:
Três controles foram introduzidos para estes experimentos:
(i) Um fragmento clonado de MAGE-A3 DNA genômico foi adicionado em cada mistura de reação PCR. Isto gera um fragmento de 805 pb (80 pb maior do que o fragmento gerado do cDNA) e está sempre presente na ausência da inibição PCR. Este atua como um controle positivo para checar eficiência de PCR em amostras negativas para MAGE-A3;
(ii) Para cada ensaio de MAGE-A3, síntese de cDNA foi realizada em paralelo em amostras de tumor e em RNA extraído da linhagem celular MZ-2-3.0 de melanoma "Geri". Para ser consideradas "positivas", as amostras de tumor têm que dar um sinal em 1% do nível de cDNA de linhagem celular Gerl MZ-2-3.0
(iii) Beta-actina PCR (Tabela 1) foi realizada em cada amostra com o propósito de detectar amostra com RNA fortemente degradado. Se o sinal de beta-actina gerado de uma amostra de tumor negativa para MAGE- A3 foi mais fraco do que o sinal gerado de MZ-2-3.0 o número de ciclos foi ajustado para a amostra clínica de modo que a intensidade de beta-actina amplicon alcançasse o nível requerido.
Controles negativos para MAGE-A3 RT-PCR semi-quantitativa.
Três controles negativos foram introduzidos para estes experimentos:
(i) RNA extraído de cultura celular LB 23-1/2, conhecida em ser negativa para MAGE-A3;
(ii) um controle de água em reação-RT; e (iii) um controle de água nas etapas de PCR.
Interpretação dos dados
Uma amostra de 50ng de mRNA de uma amostra de tumor foi considerada positiva para MAGE-A3 quando a quantidade de amplicon de 725 pb foi igual a ou maior do que a quantidade de amplicon obtida usando 0,5 ng de RNA do RNA de linhagem celular Gerl MZ-2-3.0 (i.e. equivalente a Gerl RNA 1%; veja controles positivos). Quantidades foram estimadas por fluorescência de brometo de etídio. Controles negativos e positivos foram adicionados.
Classes para MAGE-A3 RT-PCR semi-quantitativa: cinco classes padrão (De Plaen et al., 1994) foram designadas para ensaio de MAGE-A3 RT-PCR semi-quantitativa. Estas são uma medição subjetiva e foram, da expressão mais baixa para a mais alta -, -/+, +, ++, +++. Um exemplo de como estas classes podem ser designadas é mostrado em Figura 16: nesta figura, as classes são designadas de acordo com a banda gerada pelo controle positivo como mostrado em Tabela 6, abaixo:
Tabela 6
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Exemplo 2: RT-PCR Quantitativa Taqman em Tempo Real - Amostra de tecido congelado
RT-PCR quantitativa Taqman em tempo real:
Iniciadores: SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO:4; Sonda: SEQ ID NO: 13 (exon)
Iniciadores: SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO:6; Sonda: SEQ ID NO: 14 (íntron) 25 PCR semi-quantitativa (para estudos de comparação):
Iniciadores: SEQID NO: 1 e SEQ ID NO:2 Materiais e Métodos Pacientes e coleta de amostra
Biopsias de tumores de Carcinoma de Pulmão de Célula Não- Pequena (NSCLC) nos estágios IB e II foram obtidas por cirurgia. Pacientes haviam sido escritos em dois testes clínicos, o GSK 249553/004 (MAGE3- AS02B-004) e o Epidemio-MAGE3-153; pacientes haviam assinado o consentimento informado e foram explicados sobre a natureza e as possíveis conseqüências dos estudos. Biopsias foram imersas em solução estabilizadora de RNA (RNA-later, Ambion, Cambridge, UK) diretamente após ressecção cirúrgica e armazenadas a -20°C.
RNA-later é um reagente de armazenagem de tecido que estabiliza e protege RNA celular em amostra de tecido não-congeladas, intactas. RNA-later elimina a necessidade de imediatamente congelar as amostras em nitrogênio líquido.
Extração de RNA: método de purificação de RNA em moinho misturador
Tecido de tumor é removido de RNA-Later e adicionado em um Reagente de Isolamento TriPure (Roche, Vilvoorde, Belgium). O tecido é então adicionado em um Moinho Misturador contendo bolas de tungstênio. Após rompimento no Moinho Misturador, o RNA celular total foi extraído de um mínimo de 100 mg de tecido usando o reagente TriPure de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen, Venlo, Países-Baixos). Concentração de RNA foi determinada do valor de densidade óptica em 260 nm. Ensaio de MAGE-A3 TaqMan RT-PCR - tecido congelado.
cDNA correspondendo a 50 ng de RNA total foi amplificado por PCR em uma mistura de 25 μL contendo tampão TaqMan, MgCl2 5mM, dUTP 0,4 mM, 0,2 mM de cada nucleotídeo, 0,625 U de Ampli Taq Gold DNA polimerase, 0,05 U de UNG, 0,2 μΜ de cada um dos iniciadores oligonucleotídeo e 0,2 μΜ de uma sonda TaqMan. Sondas e iniciadores foram usados (Tabela 2; SEQ IDs 3, 4 e 13 e SEQ IDs 5, 6 e 14. As sondas estão marcadas com os corantes FAM™, NED™ e VIC™ (Applied Biosystems, CA, USA) e têm um Grupo de Ligação de Sulco Menor (MGBTM; também de Applied Biosystems, CA, USA). Outros experimentos estão agora sendo realizados usando o corante FAM no lugar de NED para sondas específicas para MAGE.
Genes beta-actina e MAGE-A3 exon foram amplificados por PCR quantitativa usando química TaqMan no sistema 7700 ou 7900 (PE Applied Biosystems, Warrington, UK). Amplificação por PCR também foi realizada em um íntron de gene MAGE-A3 para checar a ausência de contaminação de DNA genômico. O perfil de amplificação foi 1 ciclo de 2 10 min a 50°C, 1 ciclo de 12 min a 95°C e 35 ciclos de 15 s a 95°C e 1 min a 60°C. O sinal fluorescente gerado pela degradação da sonda TaqMan foi detectado em tempo real durante todas as etapas de alongamento. Validação do ensaio de TaqMan RT-PCR para determinar especificidade para MAGE-A3
Iniciadores: SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO:4;
Sonda: SEQ ID NO: 13 (exon) - Taqman RT-PCR
: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:2 (PCR semi-
quantitativa - para estudos de comparação)
Plasmídeos e linhagens celulares
Plasmídeos empregados continham, o cDNA de comprimento total dos genes MAGE-Al (MAGE-1; Acesso no GenBank de NM 004988), MAGE-A2 (MAGE-2; Acesso no GenBank de L18920), MAGE-A3 (MAGE- A3; Acesso no GenBank de NM 005362), MAGE-A4 (MAGE-4; Acesso no GenBank de 002362), MAGE-A6 (MAGE-6; Acesso no GenBank de NM 005363), MAGE-A8 (MAGE-8; Acesso no GenBank de NM 005364), MAGE-A9 (MAGE-9; Acesso no GenBank de NM 005365), MAGE-A10 (MAGE-10; Acesso no GenBank de NM 021048), MAGE-Al 1 (MAGE-11; Acesso no GenBank de NM 005366) e MAGE-A12 (MAGE-12; Acesso no GenBank de NM 005367). As linhagens celulares MZ-2-3.0 (positiva para MAGE-Α3) e LB 23-1/2 (negativa para MAGE-A3) foram um fornecidas gentilmente pelo Professor Thierry Boon, Ludwig Institute, Brussels, Bélgica.
A especificidade do método MAGE-A3 TaqMan foi testada usando IxlO4, IxlO5, e IxlO6 cópias de plasmídeos contendo cDNA de comprimento total de genes MAGE-A1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11 e 12.
Uma comparação de seqüências dos genes MAGE A (MAGE 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11 e 12) na área dos iniciadores e sondas de MAGE-A3 PCR designados é mostrada em Figura 14. As seqüências dos iniciadores direto e inverso MAGE-A3 estão sublinhadas; a seqüência de sonda MAGE- A3 está dentro de retângulo. Os iniciadores inversos são complementares à região da seqüência que reconhecem, ie. A é T; G é C; T é A; e C é G.
Controles positivos para MAGE-A3 TaqMan RT-PCR: (i) um fragmento de MAGE-A3 DNA genômico e (ii) quantidades conhecidas de RNA extraído de linhagem celular Gerl MZ-2-3.0 (uma linhagem celular de melanoma positiva para MAGE-A3).
Controles negativos para MAGE-A3 TaqMan RT-PCR'. (i) RNA extraído de cultura celular de LB 23-1/2, conhecida em ser negativa para MAGE-A3, (ii) branco de água na reação RT, e (iii) branco de água nas etapas de PCR. 40 ciclos de RT-PCR são realizados. O controle negativo precisa ser ≥ 35. Alguns dos resultados dos experimentos de TaqMan têm sido representados como 1/Ct. Estatística: Comparação de duas técnicas de PCR
Uma tabela de contingência de 2 χ 2 foi criada para comparar os resultados de RT-PCR semi-quantitativa (iniciadores de SEQ ID NO:l e SEQ ID NO:2) e Taqman PCR quantitativa em tempo real (Iniciadores: SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO:4; Sonda: SEQ ID NO: 13), usando técnicas aqui descritas (Tabela 3). A variável de escala nominal caracterizou dois valores: positivo e negativo. Os valores negativos incluíram zero e avaliações limítrofes; avaliação limítrofe significa que a avaliação está entre 0,8% e 1,2% de Gerl da RT-PCR semi-quantitativa e todos os resultados abaixo de 1% de ensaio TaqMan. Os valores positivos foram graduados baseado em escore visível das bandas de gel em relação à expressão de beta-actina para o método de RT-PCR semi-quantitativa e incluíram todos os resultados 1% do ensaio TaqMan. A concordância entre ambos os métodos foi calculada como o número de amostras negativas duplas mais positivas duplas dividido pelo número total de amostras. O teste de McNemar foi usado para comparar as proporções de pares discordantes (negativo-positivo). Intervalos de confiança (CI) foram calculados.
Optimização de TaqMan RT-PCR, Quantitativa
TaqMan RT-PCR para MAGE-A3 usando verde Sybr.
Verde Sybr é um componente que liga amplicons não- seletivamente, sem uma sonda específica para seqüência. RT-PCR em tempo real foi conduzida nos clones de gene da família MAGE-A, usando quatro diluições diferentes dos clones MAGE-A (20 pg, 2 pg, 0,2 pg e 0,02 pg) (Figura 1, onde resultados são mostrados como 1/CT sobre eixo Y). Um resultado positivo foi obtido para MAGE-A3 em Ct 14 e um valor de Ct 16 foi obtido para MAGE-A6 (a 20 pg de plasmídeos). MAGE A4, A8 e A9 mostraram um nível de Ct de 30 e os outros genes MAGE mostraram expressão muito limitada em Ct 35 e acima.
TaqMan RT-PCR para MAGE-A3 usando sonda específica para seqüência.
Usando os mesmos iniciadores MAGE-A3 (SEQ ID 3 e 4) mas com uma sonda (SEQ ID No 13), a efetividade para discriminar MAGE-A3 de A6 foi testada usando diluições diferentes dos clones relevantes dos membros da família MAGE-A (Figura 2). Primeiramente, Ct de MAGE-A3 teve um decréscimo esperado em cada uma das diluições. O clone MAGE-A6 não mostrou um 1/Ct alto quando uma sonda é usada, indicando ausência de reatividade cruzada.
A adição de 1 χ 10^6 plasmídeos MAGE-A6 na diluição de plasmídeo MAGE-A3, como mostrado em Figura 3, não tem qualquer efeito e os resultados espelham o resultado de titulação de plasmídeo MAGE-A3. Isto mostra ausência de efeito competitivo de MAGE-A6 na presença de MAGE- A3 usando TaqMan PCR.
Resultados
Expressão tumoral de MAGE-A3, comparação de métodos semi-quantitativo e quantitativo
A PCR quantitativa TaqMan-específica foi adicionalmente avaliada contra a RT-PCR semi-quantitativa padrão para MAGE-A3 (usando iniciadores SEQ ID No 1 e 2). 71 amostra de tumor de pacientes com NSCLC foram usadas para comparar diretamente entre métodos quantitativo (usando iniciadores SEQ ID NO: 3 e 4 e sonda SEQ ID NO: 13) e semi-quantitativo de expressão de MAGE-A3 (usando iniciadores SEQ ID NO:l e 2).
Os resultados indicam uma concordância boa de 95,8% (Tabela 3) entre os dois métodos com 68/71 em concordância. O ensaio de TaqMan RT-PCR quantitativa e o ensaio de RT-PCR semi-quantitativa foram discordantes para três amostras, sendo que o ensaio de RT-PCR semi- quantitativa superestimou a positividade dos resultados. Contudo, o teste de McNemar revelou uma repartição simétrica destes três resultados discordantes (p—0,25), indicando que nenhuma técnica tendeu a produzir resultados mais discordantes comparada com a outra técnica. Em investigação mais rigorosa, o nível variável de expressão de beta-actina sobre estas amostras resultou em um positivo falso para o método de RT-PCR semi-quantitativa método.
Uma plotagem em tabela (Figura 4) foi usada para representar a dispersão dos dados de TaqMan PCR para cada classe definida para a RT- PCR semi-quantitativa. Embora a concordância entre ambos os métodos, baseado na tabela de contingência de 2 χ 2, fosse excelente, as plotagens em tabela revelaram alguma sobreposição entre as classes diferentes, indicando que a avaliação semi-quantitativa não coincidiu completamente com a medição de TaqMan RT-PCR quantitativa. A sobreposição pode ser devido ao fato de que a avaliação foi realizada por operadores diferentes em ocasiões diferentes, que pode aumentar a variabilidade. Neste sentido, o ensaio de TaqMan RT-PCR quantitativa é muito mais independente daqueles fatores e conseqüentemente reproduzíveis.
EXEMPLO 3:AnáIise por RT-PCR de tecido fixado em parafina (FFPE) MATERIAIS E MÉTODOS
RNA foi extraído de amostras de FFPE usando um método patenteado de Response Genetics Inc., como descrito em patentes US: US6.613.518; US6.610.488; US6.428.963; US6.248.535, aqui incorporadas como referências. Alternativamente RNA pode ser obtido de tecido fixado em parafina de acordo com qualquer método adequado. Por exemplo, seções de tecido podem ser removidas da parafina usando d-limoneno ou outro tampão de Iise e então lavadas em uma solução baseada em etanol. As seções podem ser então tratadas com proteinase K durante a noite e então lavadas e o RNA pode ser purificado usando cromatografia em coluna. Taqman RT-PCR em Tempo Real foi realizada nas amostras usando iniciadores SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO:4 e sonda SEQ ID NO: 13; iniciadores e sondas desenvolvidos para uso em tecido congelado (veja Exemplo 2, acima). RESULTADOS: Expressão de Mage A3
Tabela 4 mostra os resultados expressados como valores de Ct, para o tecido Fixado em Formalina, Embebido em Parafina (FFPE). Os números do eixo-Y representam as amostra de tumor de humano 990118-990784. Também foram incluídos na análise controles positivos: TCl (Mage3); Gerl (linhagem celular de melanoma MAGE-A3); e CRL 1675 (linhagem celular de melanoma). Os valore de Ct são mais altos do que o que seria esperado para iniciadores MAGE-A3 em RT-PCR semi-quantitativa baseada em tecido congelado. O nível de Ct 36-37 é considerado o limite mais alto da sensibilidade para o propósito destes experimentos. O controle positivo para Gerl MAGE-A3 está em Ct 31 e exatamente dentro do limite de sensibilidade mas grandemente reduzido do ensaio de RT-PCR semi- quantitativa. Com estes níveis os iniciadores e sonda para quantificação de MAGE-A3 em tecido congelado (Tabela 2, iniciadores específicos para exon 3 MAGE-A3 SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 e sonda SEQ ID NO: 13) podem não ser suficientemente sensíveis para detectar a expressão de MAGE-A3 dentro de amostras de tumor FFPE: amostras que são positivas para MAGE- A3 mas apenas expressam MAGE-A3 em níveis baixos podem não ser detectados.
Amostras de controles positivos de tecido FFPE foram incluídas no experimento: TCl (Mage3) e Gerl (controle positivo para MAGE-A3) e CRL 1675. Tumores 990118-990784 de humano foram analisados por Taqman RT-PCR quantitativa usando os iniciadores para tecido congelado SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 e sonda SEQ ID NO: 13 usando RNA de tecido em parafina. O resultado desta análise é mostrado em Figura 5.
Replanejamento de iniciadores para MAGE-A3 TaqMan para uso em tecido FFPE
O tamanho do amplicon para o ensaio de MAGE-A3 de tecido congelado baseado RNALater, (descrito em exemplo 2) é maior do que 100pb. Com o objetivo de obter resultados mais sensíveis para RNA degradado encontrado em amostras de FFPE, iniciadores novos foram planejados para reduzir o tamanho do amplicon, com o propósito de aumentar a sensibilidade do ensaio de MAGE-A3 (Tabela 5). Para ambos os ensaios descritos em Exemplos 2 e 3 uma sonda MGB™ (Minor Groove Binding, Ligação de Sulco Menor) foi usada para aumentar a especificidade dos ensaios. A sonda MGB se liga no sulco menor do DNA formando um duplex extremamente estável resultando em um aumento na especificidade de iniciador. Teste de novos inicíadores MAGE-A3para especificidade e sensibilidade
Os conjuntos de inicíadores recém-planejados (Tabela 5) foram testados em cDNA de membros da família de genes Mage-A (Figura 6a), na qual Conjunto 1 é inicíadores: SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, sonda: SEQ ID NO: 15; Conjunto 2 é inicíadores: SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, sonda: SEQ ID NO: 16; Conjunto 3 é inicíadores: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, sonda: SEQ ID NO: 17; e Conjunto 4 é inicíadores: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, sonda: SEQ ID NO: 13.
Como mostrado em Figura 6a, os inicíadores SEQ ID NO: 7 e 8 têm níveis de Ct altos para MAGE-A3 mas também para Mage-2 e Mage-12. Os inicíadores SEQ ID NO: 9 e 10 têm níveis de Ct altos para MAGE-A3 e Ct pequeno para MAGE-A6 mas este está fora da faixa normal de expressão de MAGE-A3. Os inicíadores SEQ ID NO: 11 e 12 são ligeiramente menos sensíveis do que SEQ ID NO: 9 e 10. Assim, nos presentes experimentos, os inicíadores SEQ ID NO: 9 e 10 foram escolhidos para serem adicionalmente testados em tecido FFPE. Estes inicíadores SEQ ID NO: 9 e 10 foram adicionalmente testados em uma diluição serial de RNA e mostraram faixa linear boa até diluições menores, sugerindo que os inicíadores devem ter uma sensibilidade boa e são adequados para o ensaio (Figura 6b). Comparação de ensaios TaqMan em tecido congelado versus FFPE para MAGE-A 3
Quarenta e duas amostras de tumor FFPE foram comparadas usando inicíadores SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 e sonda SEQ ID NO: 16 com o mesmo ensaio completado em tecido congelado usando inicíadores SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e sonda SEQ ID NO: 13 (Figura 7). O nível de positividade do ensaio é ajustado em 1% geri (controle positivo) e comparando diretamente parece haver alguma concordância entre os dois ensaios. Há alguns pacientes MAGE-A3 positivos para MAGE-A3 que não concordaram com o ensaio de MAGE-A3 em tecido congelado; isto poderia ser explicado pela macrodissecação das áreas tumorais causando um aumento na pureza de células tumorais que expressam a MAGE-A3. A remoção de maior parte das células normais em diluição causou um resultado positivo para MAGE-A3. Um valor de R2 (teste estatístico para correlação linear) de 0,92 foi mostrado entre o tecido FFPE e o tecido congelado em RNA later sugerindo uma correlação boa entre os dois métodos (Figura 8)
EXEMPLO 4 - Teste de COBAS™ Taqman MAGE-A3
Tabela 7
Seqüências de sonda e de iniciador COBAS™ TaqMan MAGE-A3
<table>table see original document page 52</column></row><table>
E= Corante Repórter FAM, F= 5-Metil dC, Q = Extintor BHQ2, L = 5-Propinil dU, P=
Fosfato, I = Repórter HEX
Seqüência de sonda MAGEA3F-646MOD compreende os seguintes nucleotídeos modificados (SEQ ID NO:54): 5' - TCTTTCCTGTGATCTTCAGCAAAGCTTC - 3'
Tabela 8
Seqüências de sonda e de iniciador beta-actina COBAS TaqMan
Seqüências de iniciador esbeta-actina TaqMan <table>table see original document page 52</column></row><table>
E= Corante Repórter FAM, F= 5-Metil dC, Q = Extintor BHQ2, L = 5-Propinil dU, P= Fosfato, I = Repórter HEX
Tabela 9
Faixa de CT válido de controle & amostra
<table>table see original document page 52</column></row><table> <table>table see original document page 53</column></row><table>
Tabela 10
Perfil de ciclos térmicos
Perfil térmico de PCR para experimento de exclusividade para MAGE-A3
<table>table see original document page 53</column></row><table>
Tabela 11
Perfil térmico de RT-PCR para Linearidade e Eficiência de RT-PCR, Sensibilidade Analítica (Limite de Detecção), Correlação de Método, e Experimentos de Reprodutibilidade
<table>table see original document page 53</column></row><table>
Temperatura de anelamento relativamente alta de 63°C foi implementada para melhorar a especificidade para MAGE-A3 em relação aos outros membros de família MAGE-A.
Análise dos dados
Valores de Ct para MAGE-A3 e β-actina são calculados usando o programa de computador AMPLILINK™ 3.1 (Roche, CA, USA) na estação de trabalho COBAS™ TaqMan 48 Analyzer (Roche, CA, USA) baseado em parâmetros de ensaio definidos no Arquivo de Definição de Teste. Análise de dados para expressão de gene será realizada pela extração dos valores de Ct para MAGE-A3 e β-actina de AMPLILINK™ para cálculos posteriores para determinar expressão de gene MAGE-A3 em relação ao gene β-actina. Para cada corrida, controles serão incluídos para estabelecer o nível de expressão de MAGE-A3 limite que necessita ser atendido ou ultrapassado com o propósito de que a amostra seja chamada de positiva para MAGE-A3. Como um controle positivo, é usado RNA da linhagem celular GERL. GERL RNA é diluído 1:100 (GERL 1%) em água e o Ct de MAGE-A3 foi determinado. Em adição, GERL RNA não diluído (GERL 100%) é testado sem diluição para medição de Ct de β-actina. Um delta valor de Ct entre Ct de β-actina de controle de GERL 100% menos o Ct de MAGE-A3 do controle de GERL 1% é calculado e expressão relativa de MAGE-A3 é determinada baseado no cálculo abaixo:
Expressão Limite de MAGE-A3 = 2'(Ctdc ^actinadeGKRL ioo%-ctdemage-a3 de gerlio/o)
Para amostras embebidas em parafina, a mesma estratégia de controle será usada exceto que RNA de GERL FFPE Xenoenxerto extraído usando o método QIAGEN FFPE substituirá o RNA de linhagem celular GERL para o estabelecimento da expressão limite.
Visto que o teste COBAS™ Taqman MAGE-A3 é uma reação multiplex, valore de Ct de MAGE-A3 e de β-actina são derivados do mesmo tubo de reação. Expressão relativa de MAGE-A3 é calculada para cada amostra de teste pela seguinte equação:
<formula>formula see original document page 54</formula> MAGE-A3 de amostra)
Se Expressão de MAGE-A3 na amostra de teste é maior do que ou igual àquela do nível limite de MAGE-A3 estabelecido dos Controles GERL RNA, então a amostra é chamada de positiva para MAGE-A3. Se Expressão de MAGE-A3 na amostra de teste é menor do que aquela do nível limite de MAGE-A3 estabelecido dos Controles, então a amostra é chamada de negativa para MAGE-A3. Expressão de MAGE-A3 será determinada tomando-se a média dos valores de Ct de MAGE-A3 e Ct de β-actina das repetições para cada espécime para o cálculo de delta Ct (Ct de β-actina - Ct de MAGE-A3). Se uma repetição tem um Ct de MAGE-A3 ou um Ct de β-actina menor do que o corte de Ct do teste, mas outra repetição tem um Ct de MAGE-A3 ou Ct de β-actina Ct maior do que o corte de Ct, a amostra será testada de novo. Se ambas as repetições têm Cts de β-actina maiores do que o corte de Ct, a amostra é marcada como de Ct de β-actina fora da faixa e nenhum resultado é dado. Se ambas as repetições têm valores de Ct de MAGE-A3 Ct maiores do que o valor de corte de Ct de MAGE-A3, mas expressão de MAGE-A3 está acima do limite, então a amostra é marcada como Ct de MAGE-A3 fora da faixa e nenhum resultado é dado. Esta estratégia para análise de dados está consistente com os estudos de validação cruzada realizados para a correlação de método que são descritos em Seção "Correlação de Método", abaixo.
Para o teste COBAS™ Taqman MAGE-A3, Human QPCR
Human Reference Total RNA (UHR) de Stratagene pode ser implementado do Controle Positivo e ajustado um limite de expressão baseado em expressão de MAGE-A3 neste RNA bem caracterizado. UHR diluído pode ser testado com cada corrida juntamente com os controles de GERL RNA para estabelecer limite de expressão apropriado com o controle UHR. Condições de armazenagem de amostra e reagente
Todos os plasmídeos incluindo RNA e DNA, DNA controle positivo P53, FFPET RNA clínico, UHR, GERL, e STAC são armazenados a -80°C. Todos os reagentes de teste incluindo Universal RNA Master Mix, mistura de iniciador/sonda, mistura de co-factor, e controle negativo / diluente de amostra são armazenados a 2-8°C.
Exclusividade para MAGE-A3
Teste experimental de iniciadores e sondas com plasmídeos DNA contendo membros da família MAGE-A Propósito: determinar a capacidade do teste para especificamente amplificar o gene MAGE-A3 enquanto exclui co- amplificação/detecção significativa de outros genes relacionados.
Material de amostra: plasmídeo DNA contendo MAGE-A3 e membros da família relacionados serão testados (para detalhes de plasmídeos veja Exemplo 2, acima).
Procedimento: teste experimental do Teste de COBAS TaqMan MAGE-A3 usando plasmídeos DNA contendo membros da família MAGE-A para determinar se genes relacionados são amplificados e detectados em quantidades significativas.
Cada amostra de plasmídeo DNA foi testada três vezes em quatro concentrações diferentes de DNA (20, 2, 0,2, 0,02 pg). Perfil de ciclo térmico mostrado em Tabela 10 foi modificado para remover a etapa de transcrição reversa a 60°C por 20 minutos. Concentração de DNA plasmídeo foi determinada por análise Nanodrop.
Análise:
Valores de Ct para plasmídeo MAGE-A3 foram determinados e comparados com valores de Ct de plasmídeos MAGE-Al, MAGE-A2, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-Al 1, e MAGE-Al2. Delta Ct foi calculado pela subtração de Ct de MAGE-AX (cada membro de família relacionado) pelo Ct de MAGE-A3. Valores médios de Ct das quatro repetições foram usados para cálculos de Ct e delta Ct. Critérios de aceitação:
• Valores de Delta Ct precisam ser maiores do que ou iguais a 10 entre MAGE- A3 e todos os outros plasmídeos exceto MAGE-A6. Resultados de exclusividade para MAGE-A3
Tabelas e Figuras aqui, em algumas ocasiões o termo "CURIE" é usado no lugar de "MAGE"; contudo, o termo "MAGE" é intencionado em todos os casos. Valores de Ct são mostrados para todos os plasmídeos MAGE testados em Tabela 12 e Figura 17 mostradas abaixo. Para plasmídeos onde não houve amplificação, um valor de Ct de 55 foi designado porque houve 55 ciclos no perfil de ciclo térmico. Como esperado, Cts de MAGE-A3 são os mais iniciais para todos os níveis testados (Tabela 12 e Figura 17). Valores de Delta Ct foram maiores do que 10 ciclos entre MAGE- A3 e todos os outros plasmídeos exceto MAGE-A6 (Tabela 13 e Figura 18). Um Delta Ct entre MAGE-A3 e MAGE-A6 não foi exigido porque 95% dos pacientes que expressam MAGE-A6, também expressam MAGE-A3.
Delta Ct entre MAGE-A3 e MAGE-A6 para 20 pg, 2 pg, 0,2 pg e 0,02 pg de entrada de plasmídeo DNA foi 9,3, 8,4, 7,8, e 8,2 ciclos, respectivamente. Visto que os valores de Ct de MAGE-A3 para RNA de amostras FFPE mostraram-se, em sua maioria, maiores do que 27,2 para amostras FFPE testadas, sinal de MAGE-A6 será mínimo porque um atraso de 8,2 ciclos geraria um valor de Ct fora da faixa do ensaio. Critérios de aceitação para exclusividade foram atendidos.
Tabela 14 mostra Validação de Experimento de Exclusividade para MAGE-A3; Cts de controle estiveram dentro da faixa validada. Experimento passou na validação. Tabelas 15 e 16 mostram detalhes de Experimento de Exclusividade para MAGE-A3.
Linearidade e Eficiência de RT-PCR
Propósito: determinar a linearidade e a eficiência de transcrição reversa do teste.
Material de amostra: diluições seriais de FFPE Xenoenxerto GERL RNA foram usadas para estudos de linearidade e eficiências de RT- PCR.
Procedimento: FFPE Xenoenxerto GERL RNA foi serialmente diluído 2 vezes a partir de 100 ng a 0,1 ng e testado usando o Teste de COBAS TaqMan MAGE-A3 para determinar a faixa linear do ensaio. Dez repetições foram testadas em cada nível de concentração. Análise:
Valores de Ct para cada repetição para ambas MAGE-A3 e β- actina foram plotados versus Iog (base 2) de concentração de entrada de RNA para calcular a inclinação da linha e as eficiências de RT-PCR. Eficiência de amplificação por RT-PCR foi calculada usando a equação:
Inclinação = -1/log (base 2) * Eficiência de Amplificação (AE).
Eficiência de Amplificação de 2 é equivalente a 100%. Valores de Delta Ct (Ct de MAGE-A3 - Ct de β-actina) para cada repetição foram plotados versus Iog (base 2) de concentração de entrada de RNA para determinar inclinação de Delta Ct. Médias, desvio padrão, e coeficiente de variação percentual (%CV) para Ct de MAGE-A3, Ct de β-actina e Delta Ct foram calculados de todas as dez repetições. Critérios de aceitação de Linearidade:
Faixa linear do ensaio foi determinada baseado nos seguintes critérios:
CV de Ct de MAGE-A3 < 5%
CV de Ct de β-actina < 5%
CV de Delta Ct < 20%
-0,10 < inclinação de Delta Ct < 0,10
R2 > 0,95
Critérios de aceitação de Eficiência de RT-PCR:
Eficiência de Amplificação de MAGE-A3 por RT-PCR > 80
%
Eficiência de Amplificação de β-actina por RT-PCR > 80 % Diferença de Eficiência de Amplificação por RT-PCR de MAGE-A3 e β-actina dentro de 10% Resultados de Linearidade /Eficiência de RT-PCR
Figura 20 mostra um gráfico com Iog (base 2) de entrada de RNA versus valores de Ct para MAGE-A3 e β-actina. O teste de COBAS TaqMan MAGE-A3 é linear entre valores de entrada de 100 - 0,1 ng de GERL RNA extraído de FFPE Xenoenxerto usando o método QIAGEN baseado em resultados de R .
Valores de R2 foram 0,983 para MAGE-A3 e 0,998 para β- actina. Estes valores estão acima da especificação de R > 0,95. Em adição,
ambos Ct de MAGE-A3 e de β-actina para todas as 10 repetições em cada nível testado estão abaixo da especificação de CV < 5 % como mostrado em
Tabela 17.
A eficiência de amplificação de MAGE-A3 e β-actina por RT- PCR foi calculada da inclinação da linha gerada da plotagem de Iog (base 2) de entrada de RNA versus valores de Ct para MAGE-A3 e β-actina mostrado em Figura 19. A eficiência de amplificação por RT-PCR pode ser calculada usando a seguinte equação:
Inclinação = -l/Log(base2) Eficiência de Amplificação (AE).
Eficiência de amplificação foi 2,14 (107 %) e 2,06 (103,1%) para MAGE-A3 e β-actina, respectivamente. AE ficou acima da especificação de 80% para MAGE-A3 e β-actina. A diferença em AE entre os dois genes foi 3,9 %, que também ficou dentro da especificação de + 10 %.
Figura 20 mostra um gráfico com Iog (base 2) de entrada de RNA versus Delta Ct entre MAGE-A3 e β-actina. Inclinação de Delta Ct é 0,0474, bem dentro da especificação de inclinação de -0,10 a 0,10. Nos dois níveis mais baixos de entrada de RNA testados (0,2 & 0,1 ng), o %CV para Delta Ct ficou acima da especificação de 20%. Como um resultado, os últimos dois níveis de entrada de RNA não ficaram incluídos na faixa linear do ensaio. A faixa linear do ensaio usando GERL Xenoenxerto RNA é 100 ng - 0,39 ng de RNA.
Baseado nestes dados, critérios de aceitação para linearidade e eficiência de RT-PCR foram atendidos. Tabela 18 mostra Eficiência de Amplificação por RT-PCR de MAGE-A3 e β-actina; Tabela 19 é Validação de Experimento de Eficiência de RT-PCR / Linearidade.
Cts de controle ficaram dentro da faixa validada. Experimento passou na validação.
Tabelas 20, 21 e 22 fornecem detalhes sobre Experimento de Eficiência de RT-PCR /Linearidade
Sensibilidade Analítica (Limite de Detecção)
Propósito: para estabelecer a concentração mais baixa de RNA onde expressão de gene MAGE-A3 pode ser detectada pelo Teste de COBAS™ TaqMan MAGE-A3 pelo menos 95% do tempo.
Material de amostra: sensibilidade analítica foi avaliada usando RNA isolado de tecido FFPE Xenoenxerto usando o QIAGEN RNeasy FFPE Kit com etapa de DNase. RNA foi extraído de dois Xenoenxertos de FFPE derivados de duas linhagens de células de RNA diferentes. Um Xenoenxerto chamado de GERL expressa MAGE-A3. O outro Xenoenxerto chamado de STAC não expressa MAGE-A3. RNA destes dois Xenoenxertos foram usados para experimentos de mistura com o propósito de testar 5% GERL RNA em um fundo de 95% STAC RNA, 1% GERL RNA em um fundo de 99% STAC RNA, e 0,5% GERL RNA um fundo de 99,5% STAC RNA. Estas três misturas diferentes de GERL e STAC RNA foram testadas em quatro níveis diferentes de RNA total.
Procedimento: vinte e quatro resultados de teste foram gerados de 4 séries de diluições independentes de misturas de GERL e STAC RNA. Quatro níveis de entrada de RNA foram testados (100, 50, 25, e 12,5 ng). Seis repetições para cada nível foram testadas.
Análise: Determinar o nível de RNA no qual é obtida taxa de positividade > 95% para MAGE-A3 baseado em valor de Ct dentro da faixa validade do ensaio. Critérios de aceitação: LOD < 50 ng de entrada de RNA Total para detecção de GERL 1% Resultados de limite de detecção
Taxa de sucesso é definida como valor de Ct dentro da faixa linear do ensaio baseado nos experimentos de linearidade descritos neste relatório. Para determinar a extremidade da faixa de Ct, os Cts de MAGE-A3 e β-actina do nível de entrada de RNA de 0,39 ng do estudo de linearidade (extremidade da faixa linear) foram tomados na média e limites de confiança de 95% foram calculados para Cts de MAGE-A3 e β-actina. Baseado nestes cálculos, Ct de MAGE-A3 precisa ser menor do que ou igual a 35,2 e Ct de β- actina precisa ser menor do que 32,1 para a amostra ser considerada um sucesso. Taxas de sucesso para MAGE-A3 e β-actina são mostradas em Tabela 23 e Tabela 25. Percentagens de taxa de sucesso para MAGE-A3 e β- actina são mostradas em Tabela 24 e Tabela 26.
Limite de Detecção é 50 ng de RNA de entrada onde GERL RNA 1% diluído em STAC RNA 99% é detectado > 95 % do tempo baseado em Ct de MAGE-A3 caindo dentro da faixa validada do ensaio. Critérios de Aceitação para Sensibilidade Analítica (Limite de Detecção) são atendidos.
Validação de Experimento de Limite de Detecção. Cts de controle de MAGE Gene FAM são mostrados em Tabela 27; Cts de controle de β-actina HEX são mostrados em Tabela 28. Cts de controle estão dentro da faixa validada. Experimento passou na validação.
Tabela 29; Tabela 30; e Tabela 31 mostram Detalhes de Experimento de Limite de Detecção.
Correlação de Método
Propósito: para correlacionar e cruzadamente validar o Teste de COBAS™ TaqMan MAGE-A3 e um Ensaio Protótipo sobre amostras clínicas de FFPET.
Material de amostra: aproximadamente 120 amostras clínicas de FFPET de qualidade adequada foram analisadas usando o Teste de COBAS TaqMan MAGE-A3 e usando o Ensaio Protótipo.
Procedimento: RNA foi extraído usando o QIAGENTM RNeasy FFPE Kit com etapa DNase adicional. Uma extração foi realizada para cada amostra FFPET, a amostra foi dividida e uma alíquota foi testada pelo teste de COBAS TaqMan MAGE-A3 e uma alíquota foi testada pelo ensaio protótipo. Controles idênticos foram corridos para ambos os ensaios para estabelecer o limite de expressão de MAGE-A3. Análise:
A chamada de MAGE-A3 para cada amostra foi relatada como positiva ou negativa baseado no limite de expressão de MAGE-A3 gerado pelos controles GERL RNA. Resultados entre os dois ensaios foram comparados para estabelecer o positivo e o negativo pelos valores de concordância percentual de comparador do teste RMS.
Para cálculos de concordância percentual, resultados obtidos previamente usando um ensaio de RT-PCR de duas etapas para tecido congelado foi usado para resolver os resultados discordantes.
Positivo por Concordância Percentual de Comparador = # de amostras de expressor de MAGE-A3 corretamente chamadas / # número de amostras testadas * 100
Negativo por Concordância Percentual de Comparador = # de amostras de não-expressor de MAGE-A3 corretamente chamadas / # número de amostras testadas * 100 Critérios de Aceitação:
Positivo por Concordância Percentual de Comparador > 95% Negativo por Concordância Percentual de Comparador > 85% Validação cruzada de espécimes clínicos de um teste clínico de NSCLC foi realizada para avaliar o positivo e negativo por concordância percentual de comparador do Teste de COBAS TaqMan MAGE-A3. O ensaio MAGE-A3 protótipo RT-PCR foi usado como comparador para estes estudos. No caso de discordância entre resultados, resultados prévios gerados da mesma amostra como tecido fresco congelado que não foi manualmente microdissecado seriam usadas para resolução de resultado discordante.
Usando o método QIAGEN RNeasy FFPE com etapa de digestão por DNase I, RNA foi extraído de 131 espécimes de FFPE manualmente microdissecados. Cada amostra foi então dividida igualmente entre RMS e RGI para teste usando o teste de RMS COBAS TaqMan MAGE- A3 e o ensaio protótipo RGI. Análise de dados foi realizada como descrito em Seção 3, neste relatório limite de expressão de MAGE-A3 foi determinado sobre o controle de GERL RNA 1%. Correlação de Método / Resultados de Validação Cruzada
Amostras de RNA foram extraídas de 131 amostras clínicas de NSCLC FFPE. Sete amostras tiveram contaminação de DNA genômico maior do que 25% baseado em reação de controle de RT de RGI. Estas amostras foram excluídas de positivo e negativo pelos cálculos de concordância percentual de comparador. Adicionalmente, houve 6 resultados indeterminados do ensaio COBAS e 15 do ensaio protótipo onde quer a amostra não teve material suficiente baseado em β-actina Ct fora da faixa linear range do ensaio quer expressão de MAGE-A3 para a amostra ficou acima do limite, mas o Ct de MAGE-A3 Ct ficou fora da faixa linear. Como um resultado, houve 117 resultados do ensaio COBAS e 108 resultados do ensaio protótipo com dados que poderiam ser usados para a validação cruzada para comparar os dois testes diferentes (Tabela 32). A concordância total entre os ensaios COBAS e protótipo foi 98/107 ou 91,6 % (Tabela 33). O positivo pela concordância percentual de comparador do teste COBAS usando o ensaio protótipo como o "padrão ouro" foi 59/ 64 ou 92,2 %, enquanto que o negativo pela concordância percentual de comparador foi 39/43 ou 90,7 % (Tabela 33). No caso de resultados discordantes entre os ensaios COBAS e protótipo, resultados gerados pela amostra de tecido congelado foram usados para resolver a discordância (Tabela 34).
As 9 amostras com resultados discordantes entre os ensaios COBAS e protótipo, 7 demonstraram concordância entre os ensaios COBAS e congelado e 2 demonstraram concordância entre os ensaios protótipo e congelado. Como um resultado quando se usa o resultado de congelado para resolver a discordância, positivo pela concordância percentual de comparador dos ensaios COBAS aumenta para 63/64 ou 98,4% e negativo pela concordância percentual de comparador aumenta para 42/43 ou 97,7 % (Tabela 34).
O Positivo e Negativo pela concordância percentual de comparador do Teste de COBAS TaqMan MAGE-A3 ultrapassaram as especificações de maior do que ou igual a 85%. Os critérios de aceitação para Positivo e Negativo pela concordância percentual de comparador foram atendidos.
Correlação de Método / Validação de Controle de Validação Cruzada
Cts de Gene MAGE Gene de Controle de Experimento são mostrados em Tabela 30; Cts de Gene β-actina de Controle de Experimento são mostrados em Tabela 31. Cts de Controle estão dentro da faixa validada. Experimento passou na validação.
Correlação de Método / Detalhes de Experimento de Validação Cruzada são mostrados em Tabelas 37, 38 e 39. Reprodutibilidade
Propósito: Demonstrar reprodutibilidade e robustez dos conjuntos de dados através de teste gerados por múltiplos operadores em múltiplos dias com múltiplos lotes de reagentes e múltiplos instrumentos. Material de amostra:
.12 amostras de Amostras Clínicas de NSCLC FFPE manualmente microdissecadas foram extraídas usando o QIAGEN RNeasy FFPE Kit com etapa de Digestão por DNase I e amplificadas / detectadas usando o Teste de COBAS TaqMan MAGE-A3.
Procedimento:
O estudo consistiu de duas repetições por amostra.
Dois lotes de reagentes foram testados para a preparação de amostra QIAGEN e reagentes TaqMan.
Experimentos foram realizados por dois operadores diferentes em dois dias diferentes usando dois Analisadores COBAS TaqMan 48 diferentes.
Análise:
Expressão de MAGE-A3 para cada espécime clínico foi calculada da média de duas repetições de RT-PCR. Em adição, chamada de MAGE-A3 foi avaliada para cada repetição de cada amostra.
Reprodutibilidade também foi baseada em comparação da expressão de gene MAGE-A3 calculada do valor de Delta Ct entre o gene MAGE-A3 e o gene β-actina. Comparação entre expressão de MAGE-A3 para amostras testadas com lotes de reagentes, instrumentos, operadores diferentes e em dias diferentes foi realizada usando Correlação de Pearson.
Critérios de Aceitação:
Concordância de chamada de MAGE-A3 > 90% entre amostras que são pelo menos 3X o Limite de Detecção do teste (GERL 3%) de corrida para corrida e dentro de repetições de corrida.
Correlação de Pearson > 90% entre amostras
Resultados de Reprodutibilidade
Limite de Expressão de MAGE-A3 é o nível de corte de expressão de MAGE-A3 que determina se um paciente receberá uma imunoterapia específica para MAGE-A3. Pacientes com expressão de MAGE-A3 igual ao ou acima do limite terão um positivo para a chamada de MAGE-A3 e receberão tratamento. Pacientes com expressão de MAGE-A3 abaixo do limite terão uma chamada negativa para MAGE-A3 e não receberão tratamento. Estudos de reprodutibilidade do teste foram baseados na chamada de expressão de MAGE-A3 para cada espécime usando as seguintes equações:
Limite de Expressão de MAGE-A3 = 2A(Ct de ^actina de controle de GERL 100% " Ct de MAGE-A3 Ct de Controle de GERL 1%)
de β-actina de espécime - Ct de
Expressão de MAGE-A3 para especime clinico = 2
MAGE-A3 de espécime)
Em adição, reprodutibilidade de ensaio foi avaliada por comparação da correlação de expressão de MAGE-A3 entre as duas corridas pelo Coeficiente de Correlação de Momento-Produto de Pearson (r). Tabela 40 e Tabela 37 mostram o limite de expressão de MAGE-A3 gerado de controles de GERL RNA testados com Corridas 1 e 2 baseado em delta Ct entre β-actina e MAGE-A3. Tabela 41 e Tabela 43 mostram a chamada de MAGE-A3 para cada um dos 12 espécimes testados em Corridas 1 e 2.
Tabela 42 mostra Corrida 2 - Limite de Expressão de MAGE- A3 de Controles de GERL RNA; Tabela 43 mostra Corrida 2 - Chamada de Expressão de MAGE-A3 para Espécimes de Reprodutibilidade.
Para todas as amostras testadas, houve correlação de 100% para chamada de expressão de MAGE-A3 entre as duas corridas. Em adição, reprodutibilidade de ensaio foi avaliada por comparação da correlação da expressão de MAGE-A3 entre as duas corridas pelo Coeficiente de Correlação de Momento-Produto de Pearson (r). Coeficiente de Correlação de Pearson foi 0,987 quando se compara Expressão de MAGE-A3 entre as duas corridas diferentes.
Critérios de Aceitação para reprodutibilidade foram atendidos.
Tabela 44 mostra Validação de Reprodutibilidade; Cts de Controle estão dentro da faixa validada. Experimento passou na validação.
Detalhes de Experimento de Reprodutibilidade são mostrados em Tabelas 45, 46 e 47.

Claims (33)

1. Iniciador, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NO. 3-12.
2. Conjunto de iniciadores, caracterizado pelo fato de compreender um ou mais dos seguintes pares de iniciadores: a) SEQ ID NO: 3 e 4; b) SEQ ID NO: 5 e 6; c) SEQ ID NO: 7 e 8; d) SEQ ID NO: 9 e 10; e e) SEQ ID NO: 11 e 12.
3. Conjunto de iniciadores, caracterizado pelo fato de compreender um ou mais dos seguintes pares de iniciadores: a) SEQ ID NO: 3 e 4; e b) SEQ ID NO: 5 e 6.
4. Conjunto de iniciadores, caracterizado pelo fato de compreender um ou mais dos seguintes pares de iniciadores: a) SEQ ID NO: 7 e 8; b) SEQ ID NO: 9 e 10; e c) SEQ ID NO: 11 e 12.
5. Sonda, caracterizada pelo fato de compreender a seqüência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NO: 13 a 17, 53 ou 54.
6. Kit, caracterizado pelo fato de compreender: (i) um iniciador direto; (ii) um iniciador inverso; e (iii) uma sonda, no qual os componentes (i), (ii) e (iii) são capazes de hibridizarem com uma seqüência alvo de MAGE-A3 sob condições estringentes, e no qual pelo menos uma das seqüências alvo de (i), (ii) ou (iii) difere em pelo menos um nucleotídeo comparada com a região equivalente de todas as outras seqüências de nucleotídeos MAGE A e no qual o conjunto é capaz de ser usado para discriminar entre MAGE-A3 e MAGE-A6.
7. Kit, caracterizado pelo fato de compreender: (i) um iniciador direto; (ii) um iniciador inverso; e (iii) uma sonda, no qual os componentes (i), (ii) e (iii) são capazes de hibridizarem com uma seqüência alvo de MAGE-A3 sob condições estringentes, e no qual pelo menos uma das seqüências alvo de (i), (ii) ou (iii) difere em pelo menos um nucleotídeo comparada com a região equivalente da seqüência de nucleotídeos MAGE-A6 e no qual o conjunto é capaz de ser usado para discriminar entre MAGE-A3 e MAGE-A6.
8. Kit, caracterizado pelo fato de compreender os seguintes componentes: (i) pelo menos um iniciador como definido na reivindicação 1 ou conjunto de iniciadores como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 4; e (ii) pelo menos uma sonda como definida na reivindicação 5.
9. Kit de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender (i) um par de iniciadores e (ii) uma sonda, no qual componente (i) compreende SEQ ID NO: 3 e 4; e componente (ii) compreende SEQ ID NO: 13.
10. Kit de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender (i) um par de iniciadores e (ii) uma sonda, no qual componente (i) compreende SEQ ID NO: 5 e 6; e componente (ii) compreende SEQ ID NO: 14.
11. Kit de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender (i) um par de iniciadores e (ii) uma sonda, no qual componente (i) compreende SEQ ID NO: 7 e 8; e componente (ii) compreende SEQ ID NO: 15
12. Kit de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender (i) um par de iniciadores e (ii) uma sonda, no qual componente (i) compreende SEQ ID NO: 9 e 10; e componente (ii) compreende SEQ ID NO: 16.
13. Kit de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender (i) um par de iniciadores e (ii) uma sonda, no qual componente (i) compreende SEQ ID NO: 11 e 12; e componente (ii) compreende SEQ ID NO: 17.
14. Kit de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender (i) um par de iniciadores e (ii) uma sonda, no qual componente (i) compreende SEQ ID NO: 11 e 12; e componente (ii) compreende SEQ ID NO:53 ou SEQ ID NO:54.
15. Método para determinar a presença ou ausência de tecido de tumor positivo para MAGE-A3, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de contatar uma seqüência de nucleotídeos isolada obtida ou derivada de uma amostra biológica com pelo menos um iniciador como definido na reivindicação 1, conjunto de iniciadores como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 4, sonda como definida na reivindicação 5 ou kit como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 14.
16. Método de diagnose de paciente, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de contatar uma seqüência de nucleotídeos isolada obtida ou derivada de uma amostra biológica com pelo menos um iniciador como definido na reivindicação 1, conjunto de iniciadores como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 4, sonda como definido na reivindicação -5 ou kit como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 14 e avaliar se MAGE-A3 é expressado na amostra.
17. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender a etapa de amplificar uma seqüência de nucleotídeos e detectar na amostra a seqüência de nucleotídeos amplificada.
18. Método para determinar a presença ou ausência de tecido de tumor positivo para MAGE-A3, caracterizado pelo fato de compreender contatar uma seqüência de nucleotídeos isolada obtida ou derivada de uma amostra biológica com pelo menos um iniciador como definido na reivindicação 1 ou sonda como definida na reivindicação 5.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender a etapa de determinar se a seqüência de nucleotídeos isolada hibridiza com o pelo menos um iniciador ou sonda sob condições estringentes, determinando deste modo se o tecido de tumor é positivo para MAGE-A3.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender a etapa de usar hibridização in situ para detectar se a seqüência de nucleotídeos hibridiza com o pelo menos um iniciador ou sonda.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações a 20, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é tecido congelado.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações a 20, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é tecido conservado em parafina.
23. Método para tratar um paciente, caracterizado pelo fato de compreender: determinar se um tecido de tumor de paciente expressa MAGE- A3 usando o método como definido em qualquer uma das reivindicações 15a -22 e então administrar ao paciente uma composição compreendendo um agente imunoterapêutico específico para MAGE-A3.
24. Método para tratar um paciente suscetível à recorrência de um tumor expressando MAGE-A3, o paciente tendo sido tratado para remover/tratar tecido de tumor expressando MAGE-A3, caracterizado pelo fato de compreender: determinar se o tecido de tumor de paciente expressa MAGE-A3 usando o método como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 22 e então administrar ao dito paciente uma composição compreendendo um agente imunoterapêutico específico para MAGE-A3.
25. Uso de uma composição compreendendo um agente imunoterapêutico específico para MAGE-A3, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para o tratamento de um paciente sofrendo de um tumor expressando MAGE-A3, no qual um paciente é identificado como tendo tecido de tumor expressando MAGE-A3 usando o método como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 22.
26. Uso de uma composição compreendendo um agente imunoterapêutico específico para MAGE-A3, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para o tratamento de um paciente suscetível à recorrência de um tumor expressando MAGE-A3, no qual um paciente é identificado como tendo tecido de tumor expressando MAGE-A3 usando o método como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 22.
27. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo um agente imunoterapêutico específico para MAGE-A3 compreende um antígeno MAGE-A3 ou seu peptídeo.
28. Método ou uso de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o antígeno MAGE-A3 ou seu peptídeo compreende ou consiste do peptídeo EVDPIGHLY.
29. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 28, caracterizado pelo fato de que o peptídeo ou antígeno MAGE-A3 está fundido ou conjugado em uma proteína carreadora.
30. Método ou uso de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a proteína carreadora é selecionada de proteína D, NSl ou CLytA ou seus fragmentos.
31. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 30, caracterizado pelo fato de que a composição adicionalmente compreende um adjuvante.
32. Método ou uso de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o adjuvante compreende uma ou mais ou combinações de: 3D-MPL; sais de alumínio; oligonucleotídeos contendo CpG; adjuvantes contendo saponina tal como QS21 ou ISCOMs; emulsões de óleo-em-água; e lipossomos.
33. Método ou uso de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que o adjuvante compreende 3D-MPL, oligonucleotídeos contendo CpG e QS21.
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B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]
B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]