ES2389513T3 - Procedimiento para la detección y el diagnóstico del cáncer que implica cebadores y sondas para la detección específica del marcador MAGE-A3 - Google Patents
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Abstract
Un conjunto de cebadores que consiste en el siguiente par de cebadores:a) SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12.
Description
Procedimiento para la detección y el diagnóstico del cáncer que implica cebadores y sondas para la detección específica del marcador MAGE-A3
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a un procedimiento de diagnóstico para la detección de MAGE-A3.
Antecedentes de la Invención
La familia de genes MAGE (antígeno del Melanoma) se identificó originalmente debido al reconocimiento de los linfocitos citolíticos derivados de linfocitos de sangre de pacientes con cáncer (Van der Bruggen y col., 1991). La familia de genes MAGE comprende actualmente más de 20 miembros y está constituida por los genes MAGE A, B, C y D (Scanlan y col., (2002) Immunol Rev. 188:22-32; Chomez y col., (2001) Cancer Res. 61(14):5544-51). Estos están agrupados en el cromosoma X (Lucas y col., 1998 Cancer Res. 58:743-752; Lucas y col., 1999 Cancer Res 59:4100-4103; Lucas y col., 2000 Int J Cancer 87:55-60; Lurquin y col., 1997 Genomics 46:397-408; Muscatelli y col., 1995 Proc Natl Acad Sci E.U.A., 92:4987-4991; PoId y col., , 1999 Genomics 59: 161-167; Rogner y col., 1995 Genomics 29:725-731), y tienen una función aún no definida (Ohman y col., 2001 Exp Cell Res. 265(2): 185-94). Los genes MAGE son altamente homólogos y los miembros de la familia MAGE-A, especialmente, tienen una homología entre 60 - 98 %. Los genes MAGE no se expresan en todas las células normales salvo en las espermatogonias y en la placenta (Haas y col.,1988 Am J Reprod Immunol Microbiol 18:47-51; Takahashi y col., 1995 Cancer Res 55:3478-382).
La re-activación de la expresión de los genes MAGE en el cáncer se debe en parte a una desmetilación anómala del promotor (De Smeet y col., 1996 Proc Natl Acad Sci E.U.A., 93(14):7149-53; De Smeet y col., 1999 MoI Cell Biol. 19(11):7327-35). Los 12 genes MAGE-A se sobre-expresan de forma variable en los siguientes cánceres: carcinoma de células transicionales, carcinoma esofágico, melanoma, carcinoma de vejiga y carcinoma pulmonar no microcítico (NSCLC) (Scanlan y col., 2002 Immunol Rev. 188:22-32). La sobre-expresión y especificidad de la expresión de MAGE en tejidos cancerosos, ha conducido a que la proteína MAGE-A3 se utilice para vacunas contra el cáncer (Scanlan y col., 2002 Immunol Rev. 188:22-32). Sin embargo, debido al amplio intervalo de expresión encontrado en pacientes con cáncer, el nivel de expresión de MAGE-A3 debe calcularse exactamente en cada paciente para dirigir la vacunación hacia pacientes que expresan la proteína. Con frecuencia la proteína MAGE-A3 se denomina indistintamente MAGE-3; ambos términos se usan en la presente invención.
Melanoma
Los pacientes que presentan melanoma maligno en metástasis distante (fase IV de acuerdo con la clasificación del Comité de Unión Americana en Cáncer (American Joint Committee on Cancer (AJCC)) tienen un tiempo de supervivencia promedio de un año, con un índice de supervivencia a largo plazo únicamente del 5 %. Incluso la quimioterapia convencional para el melanoma en fase IV tiene índices de respuesta terapéuticos únicamente del 825 %, pero sin efecto en la supervivencia general. Los pacientes con metástasis regionales (fase III) tienen una supervivencia promedio de dos a tres años con muy poca oportunidad de supervivencia a largo plazo, incluso después de un control quirúrgico adecuado de las metástasis primarias y regionales (Balch y col., 1992 Semin Surg Oncol. 8(6):400-14). La mayoría de los pacientes con melanoma en fase I a III tienen su tumor extirpado quirúrgicamente, aunque estos pacientes mantienen un riesgo sustancial de recaída. Por lo tanto sigue existiendo una necesidad para prevenir el avance del melanoma, y de tener regímenes de tratamiento mejorados para el melanoma metastásico y tratamientos complementarios para pacientes que han tenido un tumor primario extirpado.
Cáncer de pulmón
Existen dos tipos de cáncer de pulmón; el cáncer pulmonar no microcítico (NSCLC, por las siglas en inglés Non-Small Cell Lung Cancer) y el cáncer pulmonar microcítico (SCLC, por las siglas en inglés Small Cell Lung Cancer ). Los nombres simplemente describen el tipo de célula encontrada en los tumores. El NSCLC incluye carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, y carcinoma de células grandes y representa aproximadamente el 80 % de los cánceres de pulmón. El NSCLC es difícil de curar y los tratamientos disponibles tienden a tener el objetivo de prolongar la vida hasta donde sea posible y aliviar los síntomas de la enfermedad. El NSCLC es el tipo más común de cáncer de pulmón y se asocia con malos resultados. De todos los pacientes con NSCLC, aproximadamente el 25 % tiene una enfermedad loco-regional en el momento del diagnóstico y aún son candidatos de extirpación quirúrgica (fases IB, II A o IIB de acuerdo con la clasificación del AJCC). Sin embargo, más del 50 % de estos pacientes recaerán dos años después de la resección quirúrgica total. Por lo tanto existe la necesidad de proporcionar un mejor tratamiento para estos pacientes.
Expresión de MAGE-A3
Anteriormente, diversos procedimientos han intentado medir la expresión de los genes MAGE-A3 tanto dentro de líneas celulares como de muestras de tumor. Se han usado técnicas por RT-PCR semi-cuantitativa (De Plaen y col., 1994 Immunogenetics 40(5):360-9), otras técnicas basadas en PCR y también en micromatrices de baja densidad
(Zammatteo y col., 2002 Clinical Chemistry 48(1) 25-34). Sin embargo, en muchos de estos estudios, un problema principal ha sido la muy alta homología entre los miembros de la familia MAGE que producen positivos falsos. Para pruebas amplias de Fase II y III, se desea un ensayo cuantitativo de alto rendimiento, que sea capaz de identificar específicamente muestras que expresen MAGE-A3 y de reducir la probabilidad de muestras falsamente positivas en ensayos.
Otra dificultad surge con el uso de tejido tumoral Fijado en Formol e Incluido en Parafina (FFPE, por las siglas en inglés Formalin Fixed Paraffin Embedded), que es el procedimiento habitual de conservación de tejido tumoral en los centros clínicos. La fijación en formol cambia la estructura de las moléculas de ARN dentro del tejido, produciendo reticulación y también degradación parcial. La degradación parcial conduce a la creación de trocitos de ARN de entre 100 a 300 pares de bases. En técnicas de diagnóstico convencionales, estos cambios estructurales del ARN dificultan el uso de ARN extraído de tejido FFPE.
Breve Descripción de las Figuras
Figura 1: Especificidad de cebadores de MAGE-A3 para la RT-PCR TaqMan dentro los miembros de la familia
MAGE-A.
Figura 2: Especificidad de la sonda de Unión al Surco Menor (MGB, por las siglas Minor Groove Binding) para la
RT-PCR TaqMan para la expresión de MAGE-A3.
Figura 3: Ensayo de especificidad de cebadores MAGE-A3 en presencia de plásmidos MAGE-A3 y MAGE-6.
Figura 4: Expresión Tumoral de MAGE-A3 medida por PCR TaqMan cuantitativa.
Figura 5: Ensayo de expresión de MAGE-A3.
Figura 6a: Especificidad de los cebadores de MAGE-A3 diseñados para usar en tejidos FFPE.
Figura 6b: Ensayo de linealidad de los cebadores sobre cantidades diferenciales de ARN.
Figura 7: Comparación entre el ensayo de congelación con ARN later y la PCR con tejido FFPE.
Figura 8: Comparación relativa de los ensayos de congelación con ARN later y MAGE-A3 basado tejido FFPE.
Figura 9: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión del fragmento de Lipoproteína D,
fragmento Mage3, y cola de histidina, y su secuencia de aminoácidos respectiva (SEC ID NO: 35 y 36).
Figura 10: Proteína de fusión de NS1-MAGE3, y cola de Histidina (SEC ID NO:37).
Figura 11: ADN que codifica la proteína de fusión NS1-MAGE3-His (SEC ID NO:38).
Figura 12: Proteína de fusión de CLYTA-MAGE3-Histidina (SEC ID NO:39).
Figura 13: ADN de la proteína de fusión CLYTA-MAGE3-His (SEC ID NO:40).
Figura 14: Alineamiento de secuencias de la familia de genes MAGE-A3 para el diseño de cebadores y sondas
de la RT-PCR para MAGE-A3.
Figura 15: Alineamiento de secuencias de MAGE-A3 y MAGE-A6 para identificar regiones que contienen
secuencias diana (tipografía en recuadro).
Figura 16: Clases para RT-PCR semi-cuantitativa para MAGE-A3: un ejemplo de cómo pueden asignarse cinco
clases al ensayo por RT-PCR semi-cuantitativa para MAGE-A3.
Figura 17: Comparación Gráfica de valores de Ct de Plásmidos de MAGE-A usando 20, 2, 0.2 0.02 pg de ADN.
Figura 18: Comparación Gráfica de valores de Ct Delta en relación con MAGE-A3 para otros plásmidos de
MAGE-A usando 20, 2, 0.2 0.02 pg de ADN.
Figura 19: Linealidad de ARN de GERL de xenoinjerto FFPE - diluciones en serie, con factor de dilución de 2, de
100 a 0,1 ng de entrada de ARN.
Figura 20: muestra una gráfica con log (base 2) de entrada de ARN frente al Ct Delta entre MAGE-A3 y �-actina.
Descripción de tablas y secuencias
Tabla 1: Cebadores oligonucleotídicos usados para la RT-PCR semi-cuantitativa de MAGE.
Tabla 2: Cebadores oligonucleotídicos usados para la RT-PCR cuantitativa de tipo TaqMan.
Tabla 3: Comparación de la PCR semi-cuantitativa de MAGE-A3 frente a la PCR cuantitativa de tipo TaqMan
Tabla 4: Comparación de Valores Ct y Ct Delta usando la mezcla de la PCR 1 y la mezcla de la PCR 2.
Tabla 5: Cebadores oligonucleotídicos usados para RT-PCR cuantitativa TaqMan MGB de tejido congelado.
Tabla 6: Clases para RT-PCR semi-cuantitativa de MAGE-A3: un ejemplo de cómo pueden asignarse cinco
clases al ensayo por RT-PCR semi-cuantitativa para MAGE-A3 (en referencia a la figura 16).
Tabla 7: Secuencias de cebador y sonda para TaqMan COBAS™ de MAGE-A3.
Tabla 8: Secuencias de cebador y sonda para TaqMan COBAS™ de beta-actina
Tabla 9: Intervalo de CT Válido de Muestra y Control para TaqMan COBAS™.
Tabla 10: Perfil de ciclo térmico para TaqMan COBAS™ - Perfil Térmico de la PCR para el Experimento de
Exclusividad de MAGE-A3.
Tabla 11: Perfil Térmico de la RT-PCR para los Experimentos de Linealidad y Eficacia de la RT-PCR,
Sensibilidad Analítica (Limite de Detección), Procedimiento de Correlación y Reproducibilidad.
Tabla 12: Valores de Ct de Plásmidos de MAGE-A usando 20, 2, 0.2 0.02 pg de ADN.
Tabla 13: Valores de Ct Delta Relativos a MAGE-A3 para otros plásmidos MAGE-A usando 20, 2, 0.2 0.02 pg de
ADN.
Tabla 14: Validación del Experimento de Exclusividad de MAGE-A3.
Tabla 15 y Tabla 16: Detalles del Experimento de Exclusividad de MAGE-A3.
Tabla 17: Linealidad de Ct de MAGE-A3 y �-Actina y Ct delta de 10 copias a 11 Niveles.
Tabla 18: Eficacia de Amplificación por RT-PCR de MAGE-A3 y -actina.
Tabla 19: Validación del Experimento de Linealidad / Eficacia de RT-PCR.
Tablas 20, 21 y 22: Detalles del Experimento de Linealidad / Eficacia de RT-PCR.
Tabla 23: Índice de acierto del Ct de MAGE-A3, N = 24 para cada condición.
Tabla 24: Porcentaje de índice de acierto del Ct de MAGE-A3, N = 24 para cada condición.
Tabla 25: Índice de acierto del Ct de la -actina, N = 24 para cada condición.
Tabla 26: Porcentaje de índice de acierto del Ct de la -actina, N = 24 para cada condición.
Tabla 27: Valores Ct de Control con FAM de Genes MAGE.
Tabla 28: Valores Ct Control con HEX de la -actina.
Tablas 29, 30 y 31: Detalles del Experimento del Límite de Detección.
Tabla 32: Resumen de Validación Cruzada de Muestras.
Tabla 33: Ensayos COBAS y de prototipo Positivo y Negativo mediante Comparador de Porcentaje de
Coincidencia.
Tabla 34: Ensayos COBAS y de prototipo Positivo y Negativo mediante Comparador de Porcentaje de
Coincidencia con ensayo de congelación para Resolver los Resultados Discordantes.
Tabla 35: Valores Ct del Gen MAGE de Control de Experimento.
Tabla 36: Valores Ct del Gen de la -actina de Control de Experimento.
Tablas 37, 38 y 39: Detalles del Experimento del procedimiento de Correlación /Validación Cruzada.
Tabla 40: Proceso 1 - Umbral de la Expresión deMAGE-A3 de Controles de ARN de GERL.
Tabla 41: Proceso 1 - Respuesta de Expresión de MAGE-A3 para la Reproducibilidad de Especímenes.
Tabla 42: Proceso 2 - Umbral de la Expresión de MAGE-A3 de Controles de ARN de GERL.
Tabla 43: Proceso 2 - Respuesta de Expresión de MAGE-A3 para la Reproducibilidad de Especímenes.
Tabla 44: Validación de la Reproducibilidad.
Tablas 45, 46 y 47: Detalles del Experimento de Reproducibilidad.
SEC ID NO: 1 - MAGE3-E2F (cebador para ensayo MAGE3 semi-cuantitativo) (Tabla 1).
SEC ID NO: 2 - MAGE3-E3R (cebador para ensayo MAGE3 semi-cuantitativo) (Tabla 1).
SEC ID NO: 3 - E3 MAGE3 TMF (cebador directo para exón 3 MAGE-A3) (Tabla 2).
SEC ID NO: 4 - E3 MAGE3 TMR (cebador inverso para exón 3 MAGE-A3; este cebador es el complemento
inverso de la secuencia de exón MAGE-A3 que reconoce) (Tabla 2).
SEC ID NO: 5 - 13 MAGE3 TMF (cebador directo para intrón 3 MAGE-A3) (Tabla 2).
SEC ID NO: 6 - 13 MAGE3 TMR (cebador inverso para intrón 3 MAGE-A3; este cebador es el complemento
inverso de la secuencia de intrón MAGE-A3 que reconoce) (Tabla 2).
SEC ID NO: 7 - MAGEA3-775F (cebador directo para MAGE-A3) (Tabla 5).
SEC ID NO: 8 - MAGEA3-849R (cebador inverso para MAGE-A3; este cebador es el complemento inverso de la
secuencia MAGE-A3 que reconoce) (Tabla 5).
SEC ID NO: 9 - MAGEA3e-950F (cebador directo para MAGE-A3) (Tabla 5).
SEC ID NO: 10 - MAGEA3e-1037R (cebador inverso para MAGE-A3; este cebador es el complemento inverso
de la secuencia MAGE-A3 que reconoce) (Tabla 5).
SEC ID NO: 11 - MAGEA3f-623F (cebador directo para MAGE-A3) (Tabla 5).
SEC ID NO: 12 - MAGEA3f-697R (cebador inverso para MAGE-A3; este cebador es el complemento inverso de
la secuencia MAGE-A3 que reconoce) (Tabla 5).
SEC ID NO: 13 - E3 MAGE3 TMP (sonda para exón 3 MAGE3) (Tabla 2).
SEC ID NO: 14 - 13 MAGE-A3 TMP (sonda para intrón 3 MAGE3) (Tabla 2).
SEC ID NO: 15 - MAGEA3-801Tmc (sonda para MAGE3) (Tabla 5).
SEC ID NO: 16 - MAGEA3e- 1000Tmc (sonda para MAGE3) (Tabla 5).
SEC ID NO: 17 - MAGEA3f-65 ITm (sonda para MAGE3) (Tabla 5).
SEC ID NO: 18 - B-actina -E4F (cebador de B-actina) (Tabla 1).
SEC ID NO: 19 - B-actina -E6R (cebador de B-actina) (Tabla 1).
SEC ID NO: 20 - B-actina -TMF (cebador de B-actina) (Tabla 2).
SEC ID NO: 21 - B-actina -TMR (cebador de B-actina) (Tabla 2).
SEC ID NO: 22 - B-actina TMP (sonda de B-actina) (Tabla 2).
SEC ID NO 23 - SEC ID NO: 29: inmunopéptidos MAGE3.
SEC ID NO: 30 - SEC ID NO: 34: oligonucleótidos adyuvantes.
SEC ID NO: 35 - secuencia de nucleótidos de la proteína de fusión del fragmento de Lipoproteína D - fragmento
MAGE3 - cola de Histidina (Figura 9).
SEC ID NO: 36 - secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 35 (Figura 9).
SEC ID NO: 37 - secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión de NS1 - MAGE3 - cola de histidina (Figura
10).
SEC ID NO: 38 - secuencia de nucleótidos que codifica la SEC ID NO: 37 (Figura 11).
SEC ID NO: 39 - secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión de CLYTA - MAGE3 -Histidina (Figura 12).
SEC ID NO: 40 - secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión CLYTA-MAGE3 - histidina (Figura
13).
SEC ID NO: 41 - fragmento MAGE 1 (Figura 14).
SEC ID NO: 42 - fragmento MAGE 2 (Figura 14).
SEC ID NO: 43 - fragmento MAGE 4a (Figura 14).
SEC ID NO: 44 - fragmento MAGE 7 (Figura 14).
SEC ID NO: 45 - fragmento MAGE 8 (Figura 14).
SEC ID NO: 46 - fragmento MAGE 10 (Figura 14).
SEC ID NO: 47 - fragmento MAGE 11 (Figura 14).
SEC ID NO: 48 - fragmento MAGE 12 (Figura 14).
SEC ID NO: 49 - fragmento MAGE-A6 (Figura 14).
SEC ID NO: 50 - fragmento MAGE-A3 (Figura 14).
SEC ID NO: 51 - fragmento MAGE-A3 (Figura 15).
SEC ID NO: 52 - fragmento MAGE-A6 (Figura 15).
SEC ID NO: 53 - secuencia de sonda sintética MAGEA3F-646MOD de MAGE-A3 (Tabla 7).
SEC ID NO: 54 - secuencia de sonda MAGEA3F-646MOD que tiene nucleótidos no modificados.
SEC ID NO: 55 - secuencia cebadora de la -actina RGI BACT F2 (Tabla 8).
SEC ID NO: 56 - secuencia cebadora de la -actina RGI BACT R2 (Tabla 8).
SEC ID NO: 57 - secuencia de sonda de la -actina HW RGIBACT H (Tabla 8).
Sumario de la Invención
Los inventores de la presente invención han desarrollado un ensayo para identificar pacientes que tienen un tejido tumoral que expresa MAGE-A3, que podrían beneficiarse de la inmunoterapia específica de MAGE-A3.
En una realización de la presente invención, se proporciona un conjunto de cebadores que comprende los siguientes pares de cebadores:
a) SEC ID NO: 11 y 12.
En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una sonda que consiste en la secuencia de nucleótidos de cualquiera de la SEC ID NO: 17, que tiene un colorante de tipo indicador fluorescente en el extremo 5’ y un extintor no fluorescente en el extremo 3’ o la SEC ID NO: 53.
En una realización adicional, se proporciona un kit que comprende:
- (i)
- un cebador directo que consiste en la SEC ID NO: 11
- (ii)
- un cebador inverso que consiste en la SEC ID NO: 12; y
(iii) una sonda que consiste en la SEC ID NO: 17 que en el extremo 5’ tiene 6-carboxifluoresceína y en el extremo 3’ un extintor no fluorescente.
En una realización adicional, se proporciona un kit que comprende (1) un cebador que consiste en la SEC ID NO: 11, un cebador que consiste en la SEC ID NO: 12 y una sonda que consiste en la SEC ID NO: 53.
En una realización adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para determinar la presencia
o ausencia de MAGE-A3 en tejido tumoral Fijado en Formol-Incluido en Parafina (FFPE) que comprende la etapa de poner en contacto una secuencia de nucleótidos aislada obtenida o derivada de una muestra de tejido tumoral FFPR con un conjunto de cebadores que consiste en la SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12 y una sonda de acuerdo con la reivindicación 2.
En un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento de diagnóstico de pacientes que comprende la etapa de poner en contacto una secuencia de nucleótidos aislada obtenida o derivada de una muestra de tejido tumoral con un conjunto de cebadores que consiste en la SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12 y una sonda de acuerdo con la reivindicación 2 y evaluar si MAGE-A3 se expresa en la muestra.
Adicionalmente el procedimiento comprende la etapa de amplificar una secuencia de nucleótidos y detectar en la muestra la secuencia de nucleótidos amplificada.
El procedimiento puede comprender además la etapa de determinar si la secuencia de nucleótidos aislada se hibrida al cebador o a la sonda en condiciones rigurosas, detectando de esta forma si el tejido tumoral es positivo a MAGE-A3. En una realización, el procedimiento puede comprender además la etapa de usar hibridación in situ para detectar si la secuencia de nucleótidos se hibrida al menos con un cebador o una sonda.
Descripción Detallada de la Invención
Como se usa en la presente invención, la expresión “secuencia diana” es una región de la secuencia de ácido nucleico de MAGE-A3 (ya sea ADN o ARN, por ejemplo ADN genómico, ARN mensajero, o versiones amplificadas de los mismos) con la que la secuencia de la sonda o del cebador tiene identidad parcial (es decir, con cierto grado de desapareamiento) o total; aunque el cebador inverso es el complemento inverso (o, tal como se describió anteriormente, tiene cierto grado de desapareamiento) de la secuencia que reconoce. La secuencia diana se refiere generalmente a una región de la secuencia de MAGE-A3 que difiere al menos en un nucleótido en comparación con otra, o con el resto, de las secuencias de nucleótidos de MAGE-A. Sin embargo, en algunas realizaciones de la presente invención, la secuencia diana puede, para uno o más cebadores y sondas, ser idéntica entre las
secuencias de nucleótidos de MAGE-A, siempre que al menos uno o dos de los cebadores y sondas que se utilicen reconozcan una secuencia diana que difiere entre los genes que van a diferenciarse.
Por lo tanto, en una realización, una sonda o un cebador específicos pueden unirse a la secuencia diana de MAGE-A3 sin desapareamientos y unirse a la región equivalente de una secuencia de MAGE-A adicional, por ejemplo, la secuencia de MAGE-6, con desapareamientos para uno o más pares de bases.
La secuencia diana para los cebadores o sondas de la presente invención, puede ser la secuencia que tenga la mayoría de las diferencias (desapareamientos) entre los dos genes, para permitir la detección de MAGE-A3 con muy alta especificidad.
En una realización de la presente invención, las secuencias diana están en las regiones identificadas en el texto en cuadros de la figura 15.
Adecuadamente, el cebador o la sonda puede ser al menos el 95 % idéntico a la secuencia diana con respecto a la longitud del cebador o sonda, en forma adecuada mayor al 95 % idéntico, tal como 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y más preferentemente tiene el 100 % de identidad en su longitud con la secuencia MAGE-A3 diana. Los cebadores o sondas de la presente invención pueden ser idénticos a la secuencia diana en todas las posiciones de nucleótidos del cebador o de la sonda, o pueden tener 1, 2, ó más desapareamientos dependiendo de la longitud de la sonda, temperatura, condiciones de reacción y exigencias del ensayo, por ejemplo. Por supuesto, siempre que el cebador inverso cumpla con estas condiciones para la región que es el complemento inverso de la secuencia cebadora.
Adecuadamente cada nucleótido del cebador o de la sonda puede formar un enlace de hidrógeno con su nucleótido diana equivalente.
Preferentemente, la complementariedad del cebador o de la sonda con la secuencia diana se evalúa mediante el grado de emparejamiento de bases A:T y C:G, de modo que un nucleótido de adenina (A) se empareje con una timina (T), y de modo que un nucleótido de guanina (G) se empareje con una citosina (C), o viceversa. En la forma de ARN, la timina T puede sustituirse por el uracilo U.
Cuando se usa inosina en sondas universales, por ejemplo, entonces la complementariedad también puede evaluarse a través del grado de interacciones de nucleótidos diana de inosina (sonda).
Por consiguiente, la presente invención proporciona un cebador que consiste en la secuencia de nucleótidos de las SEC ID NO. 1-12, tal como se muestra en las Tablas 1 y 2. El término “cebador” se usa en la presente invención para referirse a cualquier secuencia de oligonucleótidos monocatenaria que pueda usarse como un cebador, por ejemplo, en tecnología PCR. Por lo tanto, un 'cebador' de acuerdo con la presente invención se refiere a una secuencia de oligonucleótidos monocatenaria que puede actuar como un punto de inicio para la síntesis de un producto de extensión de cebador que es sustancialmente idéntico (para un cebador directo) o sustancialmente el complemento inverso (para un cebador inverso) a la cadena de ácido nucleico que va a copiarse. El diseño (longitud y secuencia específica) del cebador, dependerá de la naturaleza de las dianas de ADN y/o ARN y de las condiciones en las cuales se usa el cebador (tales como temperatura y fuerza iónica).
Tal como se usa en la presente invención, la expresión “condiciones rigurosas” significa cualesquiera condiciones de hibridación que permitan que los cebadores se unan específicamente a una secuencia de nucleótidos dentro de la secuencia de nucleótidos MAGE-A3, pero no a cualesquiera otras secuencias de nucleótidos MAGE. La “unión específica” o “hibridación específica” de una sonda con una región de la secuencia de nucleótidos MAGE-A3, significa que el cebador o la sonda forma un dúplex (secuencia de nucleótidos bicatenaria) con parte de esta región
o con toda la región en las condiciones experimentales usadas, y que en dichas condiciones la sonda o el cebador no forma un dúplex con otras regiones de la secuencia de nucleótidos presentes en la muestra que va a analizarse. Deberá entenderse que los cebadores y las sondas de la presente invención que se diseñan para la hibridación específica dentro de una región de la secuencia de nucleótidos MAGE-A3, puede quedar completamente dentro de dicha región o puede, en un mayor grado, solapar con dicha región (por ejemplo, formar un dúplex con nucleótidos fuera así como dentro de dicha región).
En forma adecuada, la hibridación específica de una sonda con una región diana de ácido nucleico se produce en condiciones de hibridación “rigurosas”, tales como 3X SSC, SDS al 0,1 %, a una temperatura de 50 ºC. Los expertos en la técnica saben cómo variar los parámetros de temperatura, longitud de sonda y concentración salina, de modo que pueda lograrse la hibridación específica. Las condiciones de hibridación y lavado, son bien conocidas y se ilustran, por ejemplo, en la Publicación de Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), particularmente en su capítulo 11.
La presente invención proporciona además un conjunto de cebadores que consiste en los siguientes pares de cebadores:
Conjunto 5: SEC ID NO: 1 1 y 12 5
la SEC ID NO: 17 que tiene un colorante indicador fluorescente en el extremo 5’ y un extintor no fluorescente en el extremo 3’, o la SEC ID NO: 53. El término “sonda” se usa en la presente invención para referirse a cualquier secuencia de oligonucleótidos monocatenaria que pueda unirse al ácido nucleico y usarse como una sonda, por ejemplo, para tecnología PCR:
En una realización de la presente invención, en la que se usa una sonda en un procedimiento en combinación con un par de cebadores, el par de cebadores debe permitir la amplificación de parte o de todo el fragmento del polinucleótido MAGE-A3 al cual pueden unirse las sondas o en el cual las sondas se inmovilizan en un soporte sólido.
Adicionalmente, el cebador y/o la sonda pueden comprender un marcador que permita detectar la sonda. Los ejemplos de marcadores que pueden usarse incluyen: marcadores fluorescentes, por ejemplo, 6-carboxifluoresceína (6FAM™), NED™ (Applera Corporation), HEX™ o VIC™ (Applied Biosystems); marcadores TAMRA™ (Applied Biosystems, CA, USA); marcadores quimioluminiscentes, por ejemplo, sondas de Rutenio; y etiquetas radioactivas, por ejemplo, tritio en la forma de timidina tritiada. También puede usarse 32-Fósforo como una radioetiqueta.
En una realización de la presente invención, la sonda puede comprender un colorante indicador fluorescente en su extremo 5' y un colorante extintor en su extremo 3’. El colorante indicador fluorescente puede comprender 6carboxifluoresceína (6FAM) y el colorante extintor puede comprender un extintor no fluorescente (NFQ, siglas en inglés de Quencher Non-Fluorescent). Opcionalmente, a la sonda puede añadirse una proteína de unión al surco menor (Minor Groove Binder, MGB™; Applied Biosystems, CA, USA.), por ejemplo, en el extremo 3' de la sonda.
En una realización, puede usarse una sonda MGB™ Eclipse (Epoch Biosciences, WA, E.U.A.). Las sondas MGB™ Eclipse tienen un extintor oscuro Eclipse™ y un resto MGB™ colocado en el extremo 5’ de la sonda. En el extremo 3’ de la sonda se localiza un colorante indicador fluorescente.
En una realización, las secuencias del cebador y de la sonda de la presente invención pueden contener o comprender estructuras o bases de nucleótidos de origen natural, por ejemplo, adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) y uracilo (U).
En una realización adicional, pueden incluirse análogos sintéticos o modificados de estructuras o bases de nucleótidos en la secuencia de la sonda. Por sintético o modificado se entiende una estructura o base de nucleótidos que no es de origen natural. Dichas bases sintéticas o modificadas pueden sustituir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o todas las bases en la secuencia de la sonda. En una realización, la Citosina puede sustituirse por 5-etil dC y la Timina puede sustituirse por 5-propinil dU. El extintor BHQ2 también puede incluirse dentro de la secuencia.
La presente invención proporciona adicionalmente un kit como se describe en las reivindicaciones 3 o 4.
Las secuencias de MAGE-A3 y MAGE-A6 son altamente homólogas, teniendo el 98 % de alineamiento de su nucleótido y un alineamiento del 95 % de sus secuencias de proteína. Con el objeto de identificar en forma específica las secuencias MAGE-A3, es necesario identificar cebadores y sondas que sean capaces de diferenciar entre MAGE-A3 y MAGE-A6.
En una realización, la presente invención proporciona un conjunto de cebadores y/o sondas que se hibridan específicamente con una secuencia diana de MAGE-A3 en condiciones rigurosas, en las cuales al menos una de las secuencias diana del cebador o sonda, difiere al menos en un nucleótido en comparación con la región equivalente de todas las otras secuencias de nucleótidos MAGE A y en el que el conjunto es capaz de diferenciar entre MAGE-A3 y MAGE-A6.
En una realización, la presente invención proporciona un conjunto de cebadores y/o sondas que se hibridan específicamente con una secuencia diana de MAGE-A3 en condiciones rigurosas, en las cuales al menos una de las secuencias diana del cebador o sonda difiere al menos en un nucleótido en comparación con la región equivalente de la secuencia de nucleótidos MAGE A6, y en el que el conjunto es capaz de diferenciar entre MAGE-A3 y MAGE-A6.
En una realización, la secuencia diana de al menos un cebador o una sonda puede diferir en un nucleótido en la secuencia diana de MAGE-A3, en comparación con la región equivalente de MAGE-A6. En una realización adicional, la secuencia diana de al menos un cebador o una sonda puede diferir en dos nucleótidos en comparación con la región equivalente de MAGE-A6.
En una realización, un kit que comprende dos cebadores y una sonda puede tener las siguientes diferencias en las secuencias diana de los cebadores y sondas:
- (i)
- la secuencia diana de uno de los dos cebadores o sondas difiere en un nucleótido entre MAGE-A3 y MAGE-A6;
- (ii)
- la secuencia diana de un cebador o sonda no mencionado en la parte (i), difiere en un nucleótido entre MAGE-A3 y MAGE-A6; y
(iii) la secuencia diana del cebador o sonda restante es idéntico tanto a MAGE-A3 como MAGE-A6.
Por ejemplo, en una realización, un kit que comprende un cebador A, un cebador B y una sonda C puede comprender las siguientes diferencias en las secuencias diana:
- (i)
- la secuencia diana del cebador A difiere en un nucleótido entre MAGE-A3 y MAGE-A6;
- (ii)
- la secuencia diana del cebador B difiere en dos nucleótidos entre MAGE-A3 y MAGE-A6; y
(iii) la secuencia diana de la sonda C es idéntica tanto para MAGE-A3 como para MAGE-A6. Por ejemplo, en una realización, un kit que comprende un cebador A, un cebador B y una sonda C, puede comprender las siguientes diferencias en las secuencias diana:
- (i)
- la secuencia diana del cebador A, difiere en dos nucleótidos entre MAGE-A3 y MAGE-A6;
- (ii)
- la secuencia diana del cebador B es idéntica tanto para MAGE-A3 como para MAGE-A6; y
(iii) la secuencia diana de la sonda C difiere en un nucleótido entre MAGE-A3 y MAGE-A6;
Por ejemplo, en una realización, un kit que comprende un cebador A, un cebador B y sonda C puede comprender las siguientes diferencias en las secuencias diana:
- (i)
- la secuencia diana del cebador A es idéntica tanto para MAGE-A3 como para MAGE-A6;
- (ii)
- la secuencia diana para el cebador B difiere en un nucleótido entre MAGE-A3 y MAGE-A6; y
(iii) la secuencia diana de la sonda C difiere en dos nucleótidos entre MAGE-A3 y MAGE-A6;
En una realización, el kit puede comprender: el par de cebadores que consiste en la SEC ID NO: 11 y 12 y la sonda que consiste en la SEC ID NO:17.
En una realización adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para determinar la presencia
o ausencia de MAGE-A3 en tejido tumoral Fijado en Formol Incluido en Parafina (FFPE), que comprende la etapa de poner en contacto una secuencia de nucleótidos obtenida o derivada de una muestra de tejido tumoral FFPE con un conjunto de cebadores que consiste en la SEC ID NO: 11 y 12 y una sonda de acuerdo con la realización 2. Por tejido tumoral positivo a MAGE-A3, se entiende cualesquiera tumores o células tumorales que expresan el antígeno de MAGE-A3 que se ha aislado de un paciente. El procedimiento, tal como se describe en el presente documento, puede usarse para determinar si la muestra biológica comprende o consiste en un tejido tumoral positivo a MAGE-A3.
Por muestra biológica se entiende una muestra de tejido o células de un paciente que se ha extirpado o aislado del paciente.
Se proporciona además un procedimiento de diagnóstico de pacientes, que comprende la etapa de poner en contacto una secuencia de nucleótidos obtenida o derivada de una muestra de tejido tumoral Fijado en Formol Incluido en Parafina (FFPE) con un conjunto de cebadores que consiste en la SEC ID NO: 11 y 12 y una sonda de acuerdo con la realización 2 y evaluar si MAGE-A3 se expresa en la muestra.
En una realización, la secuencia de nucleótidos es, o se ha aislado de, la muestra biológica.
La expresión “obtenido o derivado de“, tal como se usa en la presente invención, significa que se usará de forma inclusiva. Esto es, se entiende que incluye cualquier secuencia de nucleótidos aislada directamente de una muestra tumoral o cualquier secuencia de nucleótidos derivada de la muestra, por ejemplo, a través del uso de transcripción inversa para producir ARNm o ADNc.
Un procedimiento de la presente invención puede comprender además amplificar la secuencia de nucleótidos y detectar en la muestra la secuencia de nucleótidos amplificada. Como alternativa o adicionalmente, el procedimiento de la presente invención puede comprender además poner en contacto la secuencia de nucleótidos aislada o amplificada con una o más sondas tal como se describe en el presente documento.
En una realización, la secuencia de nucleótidos se aísla o se purifica de la muestra tumoral. En RT-PCR, la contaminación de ADN genómico puede conducir a resultados positivos falsos. En una realización, el ADN genómico se elimina o se elimina sustancialmente de la muestra a ensayar o se incluye en los procedimientos de la presente invención.
Los procedimientos de la presente invención son adecuados para detectar tejido tumoral positivo a MAGE-A3. En una realización la presente invención, el tejido positivo a MAGE-A3 puede detectarse usando hibridación in situ. Por hibridación in situ, se entiende una reacción de hibridación realizada usando un cebador o una sonda de acuerdo con la presente invención en cromosomas intactos, células o tejidos aislados de un paciente para observación directa de sitios morfológicos de secuencias de ADN o ARN específicas.
La hibridación de los polinucleótidos puede realizarse usando cualquier procedimiento de hibridación y sistema de detección adecuados. Los ejemplos de sistemas de hibridación incluyen transferencia puntual convencional, transferencias de Southern, y procedimientos de intercalado (sándwich). Por ejemplo, un procedimiento adecuado puede incluir una estrategia de hibridación inversa, en la que se inmovilizan sondas específicas de tipo en un soporte sólido en ubicaciones distintas conocidas (puntos, líneas, u otras figuras) y los ácidos polinucleicos
amplificados se marcan para detectar la formación de híbridos. Las secuencias de ácidos nucleico específicas de MAGE-A3, por ejemplo, una sonda o cebador, como se describe en el presente documento, pueden marcarse con biotina y el hibrido puede detectarse mediante un acoplamiento de biotina con estreptavidina con un sistema de desarrollo de color no radioactivo. Sin embargo, también pueden emplearse otros sistemas de hibridación inversa, por ejemplo, como se ilustra en la Publicación de Gravitt y col., (Journal of Clinical Microbiology, 1998, 36(10): 30203027), cuyos contenidos también se incorporan por referencia. La condiciones de hibridación y de lavado convencionales, se describen en la Publicación de Kleter y col., Journal of Clinical Microbiology, 1999, 37(8): 25082517 y se optimizarán en las circunstancias determinadas para mantener la especificidad y sensibilidad requeridas por la longitud y secuencia de la sonda(s) y cebador(s).
En una realización, el procedimiento de la presente invención puede comprender el uso de:
a) el par de cebadores que consiste en la SEC ID NO: 11 y 12 y la sonda que consiste en la SEC ID NO: 17;
Los procedimientos de extracción y purificación bien conocidos están disponibles para el aislamiento de ARN o ADN de una muestra (por ejemplo en la Publicación de Sambrook y col.,1989). El ARN o ADN puede usarse directamente después de la extracción de la muestra o, más preferentemente, después de una etapa de amplificación del polinucleótido (por ejemplo, PCR). En casos específicos, tales como para ensayos de hibridación inversa, puede ser necesario invertir la transcripción de ARN o ADNc antes de la amplificación. En estos dos últimos casos, el polinucleótido amplificado “deriva” de la muestra.
Por lo tanto la presente invención proporciona un procedimiento para explorar, en aplicaciones técnicas, muestras de tejido de un paciente humano para determinar la presencia o ausencia de la expresión de MAGE-A3. Dichas muestras pueden consistir, por ejemplo, en núcleos de biopsia con aguja, muestras de resección quirúrgica o de tejido de nódulo linfático. Por ejemplo, estos procedimientos incluyen obtener una biopsia, que opcionalmente se fracciona seccionado con un criostato para enriquecer las células tumorales en aproximadamente el 80 % de la población de células totales. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos pueden extraerse de estas muestras usando técnicas bien conocidas en la materia. En otras realizaciones, los ácidos nucleicos extraídos de las muestras de tejido pueden amplificarse usando técnicas conocidas en la materia. El nivel de expresión de MAGE-A3 puede detectarse y compararse con grupos estadísticamente válidos y/o controles de pacientes negativos a MAGE-A3.
En una realización, el procedimiento de diagnóstico comprende determinar si un sujeto expresa el producto génico MAGE-A3, por ejemplo, detectando el ARNm correspondiente y/o el nivel de proteína del producto génico. Por ejemplo, el uso de técnicas tales como análisis de transferencia de Northern, reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), RT-PCR semi-cuantitativa, RT-PCR cuantitativa, PCR TaqMan, hibridación in situ, inmunoprecipitación, análisis de transferencia de Western o inmunohistoquímica. De acuerdo con dicho procedimiento, las células o tejidos pueden obtenerse a partir de un sujeto, y el nivel de ARNm y/o de proteína compararse con el del tejido que no expresa MAGE-A3.
Tecnología PCR TaqMan
La Taq ADN polimerasa tiene actividad exonucleasa 5'-3’. Los ensayos mediante PCR Taqman usan esta actividad exonucleasa para escindir sondas marcadas-duales hibridadas con las secuencias diana durante la amplificación por PCR.
En síntesis, el ARN se extrae de una muestra y el ADNc se sintetiza (transcripción inversa). Después, el ADNc se añade a una mezcla de reacción de PCR que contiene componentes patrones de PCR (véanse, por ejemplo, los componentes suministrados por Roche (CA, E.U.A.) para la PCR Taqman. La mezcla de reacción contiene además una sonda que se hibrida con la secuencia de nucleótidos molde entre los dos cebadores (es decir dentro la secuencia amplificada mediante la reacción PCR, el “amplicón”). La sonda comprende un colorante indicador fluorescente en el extremo 5’ y un colorante extintor en el extremo 3’. El extintor es capaz de extinguir la fluorescencia del indicador, aunque únicamente cuando los dos colorantes están próximos entre sí: esto ocurre para sondas intactas.
Durante y después de la amplificación, la Taq ADN polimerasa degrada la sonda, y se detecta cualquier fluorescencia.
Para mediciones cuantitativas, se usa el número de ciclos de la PCR en el que la fluorescencia alcanza un valor umbral de 10 veces la desviación típica de la emisión inicial. Este número de ciclos, denominado umbral de ciclo (Ct, Thresold cycle en inglés), es inversamente proporcional a la cantidad de partida de ADNc diana y permite medir la cantidad de ADNc. Esencialmente, a mayor cantidad de ARN diana presente en una muestra menor es el Ct obtenido.
Las mediciones obtenidas para el valor Ct, se comparan con las obtenidas para un gen constitutivo. Esto tiene en cuenta cualquier error basado en la cantidad de ARN total añadida a cada reacción de transcripción inversa (en base a la absorbancia de longitud de onda) y su calidad (por ejemplo, degradación): ninguno de los dos son parámetros fiables para medir el material de partida. Por lo tanto, las transcripciones de un gen constitutivo se cuantifican como un control endógeno. La beta-actina es uno de los genes constitutivos no específicos más usados, aunque pueden
usarse otros.
A lo largo de la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones indicadas más adelante, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que, la palabra “comprende”, y variaciones tales como “que comprende” y “comprendiendo”, implican la inclusión de un número entero indicado o una etapa o un grupo de números enteros indicados o etapas pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.
La presente invención se describirá adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, en los cuales una RT-PCR se refiere a una reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa.
Ejemplos
Ejemplo 1
PCR semicuantitativa - Muestras de tejido congeladas
Cebadores: SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2
Extracción de ARN: Procedimiento de purificación de ARN con nitrógeno líquido
Se congeló de forma instantánea un trocito de tejido en nitrógeno líquido y después se colocó en un mortero para el molido mecánico mediante un almirez. A 100 1l de un reactivo de aislamiento TriPure se añadieron 100 mg del polvo resultante y el ARN se extrajo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Venlo, Holanda). La concentración de ARN se determinó a partir del valor de densidad óptica a 260 nm.
RT-PCR semicuantitativa de MAGE-A3
La RT-PCR semicuantitativa se realizó como describen De Plaen y col. (Immunogenetics 40:360, 1994). La síntesis del ADNc se realizó a partir de 2 1g de ARN total en una mezcla de 20 1l que contenía tampón 1x de primera cadena, 0,5 mM de cada dNTP, 10 mM de ditiotreitol, 20 U de inhibidor de rRNAsa, 2 1M de oligo (dT) 15 y 200 U de transcriptasa inversa M-MLV durante 1h30 a una temperatura de 42 °C. Se amplificaron 50 ng de ADNc median te PCR en una mezcla de 25 1l que contenía cebadores específicos para MAGE-3 (SEC ID NOs 1 y 2). Para cada reacción se procesó una alícuota de 10 1l en una electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se observó por fluorescencia con bromuro de etidio. Cuando se amplificaron el ARMm y el ADN genómico, los tamaños de los amplicones fueron de 725 pb y de 805 pb, respectivamente.
Controles positivos para RT-PCR semicuantitativa de MAGE-A3:
Se introdujeron tres controles positivos para estos experimentos:
- (i)
- Un fragmento clonado del ADN genómico de MAGE-A3 se añadió a cada mezcla de reacción PCR. Esto generó un fragmento de 805 pb (80 pb mayor que el fragmento generado a partir del ADNc) y siempre está presente en ausencia de inhibición PCR. Esto actúa como un control positivo para controlar la eficacia de la PCR en muestras negativas a MAGE-A3;
- (ii)
- Para cada ensayo MAGE-A3, se realizó la síntesis de ADNc en paralelo en muestras de tumor y en ARN extraído de la línea celular de melanoma “Gerl” MZ-2-3.0. Para considerarse como “positivas”, las muestras de tumor deben producir una señal en el 1 % del nivel del ADNc de la línea celular Gerl MZ-2-3.0.
(iii) En cada muestra se realizó PCR con la beta-actina (tabla 1) para detectar muestras con ARN fuertemente degradado. Si la señal de la beta-actina generada a partir de una muestra de tumor negativa a MAGE-A3 era más débil que la de la señal generada a partir de MZ-2-3.0, el número de ciclos se ajustaba para la muestra clínica, de modo que la intensidad del amplicón de la beta-actina alcanzase el nivel requerido.
Controles negativos para la RT-PCR semicuantitativa de MAGE-A3:
Se introdujeron tres controles negativos para estos experimentos:
- (i)
- ARN extraído de cultivo celular LB 23-1/2, que se sabía que era negativo a MAGE-A3;
- (ii)
- un control de agua en la reacción-RT; y
(iii) un control de agua en las etapas de la PCR.
Interpretación de los datos
Una muestra de 50 ng de ARNm, procedente de una muestra de tumor, se consideró positiva a MAGE-A3, cuando la cantidad de amplicón de 725 pb era igual a, o mayor que, la cantidad de amplicón obtenida usando 0,5 ng de ARN procedente del ARN de la línea celular Gerl MZ-2-3.0 (es decir equivalente al 0,1 % de ARN de Gerl; véanse los controles positivos). Las cantidades se calcularon mediante fluorescencia con bromuro de etidio. Se añadieron controles positivos y negativos.
Clases de RT-PCR semicuantitativas de MAGE-A3: se asignaron cinco clases patrón (De Paen y col., 1994) al ensayo mediante RT-PCR semicuantitativa de MAGE-A3. Estas son una medición subjetiva, y fueron, de la expresión más baja a la más alta -, -/+, +, ++, +++. En la Figura 16 se muestra un ejemplo de cómo pueden asignarse estas clases: en esta figura, las clases se asignan de acuerdo con la banda generada por el control positivo tal y como se muestra en la siguiente Tabla 6:
Tabla 6
- Control positivo ARN
- 100
- 50 10 2 1 0,5
- Clase
- +++ ++ + +/-
Ejemplo 2: RT-PCR cuantitativa Taqman en Tiempo Real - Muestras de tejido congelado
RT-PCR cuantitativa Taqman en tiempo real:
Cebadores: SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4; Sonda: SEC ID NO: 13 (exón)
Cebadores: SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 6; Sonda: SEC ID NO: 14 (intrón)
PCR semicuantitativa (para estudios de comparación):
Cebadores: SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2
Materiales y procedimientos
Pacientes y recolección de muestras
Mediante cirugía se obtuvieron biopsias de tumores de Carcinoma Pulmonar No Microcítico (NSCLC) de fase IB y II. Los pacientes se inscribieron en dos ensayos clínicos, el GSK 249553/004 (MAGE3-AS02B-004) y el EpidemioMAGE3-153; los pacientes firmaron el consentimiento informado y se les explicó la naturaleza y las posibles consecuencias de los estudios. Las biopsias se sumergieron en una solución de estabilización de ARN (ARN-later, Ambion, Cambridge, UK) directamente después de la resección quirúrgica y se conservaron a -20°C. El ARNla ter es un reactivo de conservación de tejidos que estabiliza y protege el ARN celular en muestras de tejido intacto, no congelado. El ARNlater elimina la necesidad de congelar inmediatamente las muestras en nitrógeno líquido.
Extracción de ARN: Procedimiento de purificación de ARN con molino mezclador
El tejido tumoral se retiró del ARNLater y se añadió a un Reactivo de Aislamiento TriPure (Roche, Vilvoorde, Bélgica). Posteriormente, el tejido se añadió a un molino mezclador que contenía bolas de tungsteno. Después de la rotura en el molino mezclador, de un máximo de 100 mg de tejido, se extrajo ARN celular total usando el reactivo TriPure de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Venlo, Holanda). Se determinó la concentración de ARN a partir del valor de densidad óptica a 260 nm.
Ensayo mediante RT-PCR Taqman de MAGE-A3 - tejido congelado
El ADNc correspondiente a 50 ng del ARN total, se amplificó mediante PCR en una mezcla de 25 1l que contenía tampón TaqMan, MgCl2 5mM, dUTP 0,4 mM, 0,2 mM de cada nucleótido, 0,625 U de ADN polimerasa Ampli Taq oro, 0.05 U de UNG, 0,2 1M de cada uno de los cebadores oligonucleotídicos y 0,2 1M de una sonda TaqMan. Se usaron cebadores y sondas oligonucleotídicos específicos (Tabla 2; SEC ID Nos: 3, 4 y 13 y SEC ID Nos: 5, 6 y 14. Las sondas se marcaron con los colorantes FAMTM, NEDTM y VICTM (Applied Biosystems, CA, Estados Unidos) y tenían un resto de unión al surco menor (MGBTM; también de Applied Biosystems, CA, Estados Unidos). Actualmente, para las sondas específicas de MAGE, se realizan otros experimentos usando el colorante FAM en lugar de NED.
Los genes del exón de MAGE-A3 y de la beta-actina se amplificaron mediante PCR cuantitativa usando química TaqMan en el sistema 7700 ó 7900 (PE Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido). La amplificación mediante PCR también se realizó en un intrón del gen de MAGE-A3 para comprobar la ausencia de contaminación de ADN genómico. El perfil de amplificación fue de 1 ciclo de 2 minutos a una temperatura de 50 °C, 1 ciclo de 12 minutos a una temperatura de 95 °C y 35 ciclos de 15 s a una temperatura de 95 °C y 1 minuto a una temperatura d e 60 °C. La señal fluorescente generada por la degradación de la sonda TaqMan se detectó en tiempo real durante todas las etapas de elongación.
Validación del ensayo mediante RT-PCr TaqMan para determinar la especificidad para MAGE-A3
Cebadores: SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4; Sonda: SEC ID NO: 13 (exon) - Taqman RT-PCR
Cebadores: SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2 (PCR semicuantitativa para estudios de comparación)
Plásmidos y líneas celulares
Los plásmidos empleados contenían el ADNc de longitud completa de los genes MAGE-A1 (MAGE-1; acceso al Genbank NM 0049881 MAGE-A2 (MAGE-2; acceso al Genbank L18920), MAGE-A3 (MAGE-A3; acceso al Genbank NM005362), MAGE-A4 (MAGE-4; acceso al Genbank 002362), MAGE-A6 (MAGE-6; acceso al Genbank NM005363), MAGE-A8 (MAGE-8; acceso al Genbank NM005364), MAGE-A9 (MAGE-9; acceso al Genbank NM005365), MAGE-A10 (MAGE-10; acceso al Genbank NM021048), MAGE-A11 (MAGE-11; acceso al Genbank NM005366) y MAGE-A12 (MAGE-12; acceso al Genbank NM005367). Las líneas celulares MZ-2-3.0 (positiva a MAGE-A3) y LB 23-1/2 (negativa a MAGE-A3) fueron un obsequio generoso del profesor Thierry Boon, instituto Ludwig, Bruselas, Bélgica.
La especificidad del procedimiento Taqman de MAGE-A3 se sometió a ensayó usando 1x104, 1x105, y 1x106 copias de plásmidos que contenían el ADNc de longitud completa de los genes MAGE-A1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11 y 12.
En la figura 14 se muestra una comparación de secuencias de los genes MAGE A (MAGE 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11 y 12) en el área de los cebadores y sondas PCR MAGE-A3 designada. Las secuencias de los cebadores directo e inverso de MAGE-A3 están subrayadas; la secuencia de la sonda de MAGE-A3 está dentro de un cuadro. Los cebadores inversos son complementarios con la región de la secuencia que reconocen, es decir, A es T; G es C; T es A; y C es G.
Controles positivos para la RT-PCR TaqMan de MAGE-A3: (i) un fragmento de ADN genómico de MAGE-A3 y (ii) cantidades conocidas de ARN extraídas de la línea celular Gerl MZ 2-3.0 (una línea celular de melanoma positiva para MAGE-A3).
Controles negativos para la RT-PCR TaqMan: (i) ARN extraído de cultivo celular LB 23-1/2, que se sabía que era negativo a MAGE-A3, (ii) control de agua en la reacción RT, y (iii) control con agua en las etapas de la PCR. Se realizaron 40 ciclos de la RT-PCR. El control negativo debe ser � 35. Algunos de los resultados de los experimentos TaqMan se han representado como 1/Ct.
Estadísticas: Comparación de las dos técnicas de PCR
Se creó un tabla de contingencia 2 x 2 para comparar los resultados de la RT-PCR semicuantitativa (cebadores de la SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2) y PCR Taqman cuantitativa en tiempo real (Cebadores: SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4; Sonda: SEC ID NO: 13), usando las técnicas descritas en el presente documento (Tabla 3). La variable de escala nominal caracterizó dos valores: positivo y negativo. Los valores negativos incluyeron índices de cero y limítrofes; por índice limítrofe se entiende que el índice está entre el 0,8 % y el 1,2 % de Gerl de la RT-PCR semicuantitativa y que todos los resultados del ensayo TaqMan están por debajo del 1 %. Los valores positivos se clasificaron en base a la puntuación visible de las bandas de gel en relación con la expresión de la beta-actina para el procedimiento de la RT-PCR semicuantitativa y se incluyeron todos los resultados �1 % del ensayo TaqMan. La coincidencia entre ambos procedimientos se calculó como el número de muestras negativas dobles más muestras positivas dobles dividido entre el número total de muestras. Se usó el ensayo de McNermar para comparar proporciones de pares discordantes (negativos-positivos). Se calcularon intervalos de confianza (C1).
Optimización de la RT-PCR TaqMan cuantitativa
RT-PCR TaqMan para MAGE-A3 usando Sybr green
El Sybr green es un componente que une amplicones de forma no selectiva, sin sonda específica de secuencia. Se realizó RT-PCR en tiempo real en los clones de los genes de la familia MAGE-A, usando cuatro diluciones diferentes de los clones MAGE-A (20 pg, 2 pg, 0,2 pg y 0,02 pg) (Figura 1, en la que los resultados se muestran como 1/CT en el eje-Y). Se obtuvo un resultado positivo para MAGE-A3 a un Ct (umbral de ciclo) de 14 y se obtuvo un valor de Ct de 16 para MAGE-A6 (en 20 pg de plásmidos). MAGE-A4, A8 y A9 mostraron un nivel de Ct de 30 y otros genes de MAGE mostraron expresión muy limitada a un Ct de 35 y superior.
RT-PCR TaqMan para MAGE-A3 usando una sonda específica de secuencia
Usando los mismos cebadores de MAGE-A3 (SEC ID 3 y 4) aunque con una sonda (SEC ID No 13), se sometió a ensayo la efectividad para diferenciar MAGE-A3 de A6 usando diferentes diluciones de los clones pertinentes de los miembros de la familia MAGE-A (Figura 2). En primer lugar, El Ct de MAGE-A tuvo una disminución esperada en cada una de las diluciones. El clon MAGE-A6 no mostró un 1/Ct superior, cuando se usó una sonda, lo que indicaba que no había reactividad cruzada.
La adición del plásmido 1 x 106 MAGE-A6 a la dilución del plásmido MAGE-A3, tal como se muestra en la Figura 3, no tuvo efecto alguno y los resultados reflejan el resultado de la titulación del plásmido MAGE-A3. Esto no muestra un efecto competitivo de MAGE-A6 en presencia de MAGE-A3 usando la PCR TaqMan.
Resultados
Expresión de tumor de MAGE-A3, comparación de procedimientos semicuantitativos y cuantitativos
La PCR cuantitativa específica de TaqMan, se validó adicionalmente frente a la RT-PCR semicuantitativa convencional de MAGE-A3 (usando los cebadores de las SEC ID No 1 y 2). Se usaron 71 muestras de tumor de pacientes con NSCLC para comparar directamente entre procedimientos cuantitativos (usando los cebadores de las SEC ID NO: 3 y 4 y la sonda de la SEC ID NO: 13) y semicuantitativos de la expresión de MAGE-A3 (usando los cebadores de la SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2).
Los resultados indican una buena concordancia del 95,8 % (Tabla 3) entre los dos procedimientos con 68/71 de coincidencia. La RT-PCR TaqMan cuantitativa y el ensayo RT-PCR semicuantitativa fueron discordantes para tres muestras, en las que el ensayo de RT-PCR semicuantitativa sobreestimó la positividad de los resultados. Sin embargo, el ensayo McNemar reveló una distribución simétrica de estos tres resultados discordantes (p=0,25), lo que indica que ninguna técnica tiende a producir resultados más discordantes en comparación con la otra técnica. En investigaciones más cercanas, el nivel variable de la expresión de la beta-actina en estas muestras dio como resultado un positivo falso para el procedimiento por RT-PCR semicuantitativa.
Se usó una representación gráfica en forma de cuadro (Figura 4) para representar la dispersión de los datos de la PCR TaqMan para cada clase definida para la RT-PCR semicuantitativa. Aunque la concordancia entre ambos procedimientos, basada en la tabla de contingencia de 2 x 2 fue excelente, las representaciones gráficas en forma de cuadro revelaron cierto solapamiento entre las diferentes clases, lo que indicaba que la clasificación semicuantitativa no coincidía completamente con la medición de la RT-PCR TaqMan cuantitativa. El solapamiento puede deberse al hecho de que la clasificación se realizó mediante diferentes operadores en diferentes ocasiones, lo cual puede incrementar la variabilidad. En este sentido, en ensayo mediante RT-PCR TaqMan cuantitativa es mucho más independiente de dichos factores y por lo tanto más reproducible.
Ejemplo 3: Análisis de tejido fijado en parafina (FFPE) mediante RT-PCR
MATERIALES Y METODOS
El ARN se extrajo de muestras FFPE usando un procedimiento propiedad de Response Genetics Inc., tal como se desvela en las Patentes de Estados Unidos Números US6,613,518; US6,610,488; US6,428,963; US6,248,535, incorporadas en la presente invención como referencia. Alternativamente el ARN puede obtenerse de tejido fijado en parafina de acuerdo con cualquier procedimiento publicado adecuado. Por ejemplo, se pueden extraer secciones de tejido de la parafina usando d-limoneno u otro tampón de lisis, y posteriormente lavándose en una solución a base de etanol. Las secciones posteriormente pueden tratarse con proteinasa K durante una noche, y posteriormente lavarse y el ARN puede purificarse usando cromatografía de columna. Se realizó RT-PCR Taqman en tiempo real en las muestras usando los cebadores de la SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4 y la sonda de la SEC ID NO: 13; cebadores y sondas desarrollados para su uso en tejido congelado (véase el Ejemplo 2 anterior).
RESULTADOS: Expresión de Mage A3
La Tabla 4 muestra resultados expresados como valores Ct, para el tejido fijado en formol, incluido en parafina (FFPE). Los números de eje Y representan muestras de tumor humano 990118-990784. También se incluyeron en el análisis controles positivos: TC1 (Mage3); Gerl (línea celular de melanoma MAGE-A3); y CRL 1675 (línea celular de melanoma). Los valores Ct son mayores a lo que se podría esperar para los cebadores MAGE-A3 RT-PCR semicuantitativa a base de tejido congelado. El nivel de Ct de 36-37 se considera el límite máximo de sensibilidad para el propósito de estos experimentos. El control positivo para MAGE-A3 de Gerl está en un Ct de 31 y justo dentro del límite de sensibilidad, aunque reducido en gran parte del ensayo por RT-PCR semicuantitativa. Con estos niveles los cebadores y sondas para la cuantificación de MAGE-A3 en tejido congelado (Tabla 2, cebadores específicos de exón MAGE-A3 SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4 y la sonda SEC ID NO: 13) pueden no ser lo suficientemente sensibles para detectar la expresión de MAGE-A3 dentro de las muestras tumorales FFPE: las muestras que son positivas a MAGE-A3 pero que únicamente expresan MAGE-A3 a niveles bajos, pueden no detectarse.
En el experimento se incluyeron muestras de controles positivos de tejido FFPE: TC1 (Mage3) y Gerl (control positivo a MAGE-A3) y CRL 1675. Se analizaron tumores humanos 990118-990784 mediante RT-PCR cuantitativa Taqman usando los cebadores de tejido congelado de las SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4 y la sonda de la SEC ID NO: 13 usando ARN de tejido incluido parafina. El resultado de estos análisis se muestra en la Figura 5.
Rediseño de cebadores TaqMan de MAGE-A3 para su uso en tejido FFPE
El tamaño del amplicón para el ensayo de MAGE-A3 basado en ARNlater con tejido congelado (descrito en el ejemplo 2) es de aproximadamente 100 pb. Con objeto de obtener resultados más sensibles para el ARN degradado encontrado en muestras FFPE, se diseñaron nuevos cebadores que redujesen el tamaño del amplicón, con objeto de aumentar la sensibilidad del ensayo MAGE-A3 (Tabla 5). Para los dos ensayos descritos en los ejemplos 2 y 3 se usó una sonda MGBTM (Minor Groove Binding) para aumentar la especificidad de los ensayos. La sonda MGB se une en el interior del surco menor del ADN que forma un dúplex extremadamente estable dando como resultado un aumento en la especificidad de cebador.
Ensayo de los nuevos cebadores de MAGE-A3 para especificidad y sensibilidad
Los conjuntos de cebadores recientemente diseñados (Tabla 5) se sometieron a ensayo en el ADNc de los miembros de la familia de genes Mage-A (Figura 6a), en el que el Conjunto 1 son los cebadores: SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, sonda: SEC ID NO: 15; el Conjunto 2 son los cebadores: SEC ID NO:9, SEC ID NO: 10, sonda: SEC ID NO: 16; el Conjunto 3 son los cebadores: SEC ID NO:11, SEC ID NO: 12, sonda: SEC ID NO: 17; y el Conjunto 4
5 son los cebadores: SEC ID NO:3, SEC ID NO: 4, sonda: SEC ID NO: 13.
Tal como se muestra en la figura 6a, los cebadores de las SEC ID NO: 7 y 8 tienen altos niveles de Ct para MAGE-A3, aunque también para Mage-2 y Mage-12. Los cebadores de las SEC ID NO: 9 y 10 tienen altos niveles de Ct para MAGE-A3 y un Ct ligero para MAGE-A6, aunque esto está fuera con el intervalo normal de expresión de MAGE-A3. Los cebadores de las SEC ID NO: 11 y 12 son ligeramente menos sensibles que los de las SEC ID NO: 9
10 y 10. Por lo tanto, en los experimentos de la presente invención, los cebadores de las SEC ID NO: 9 y 10 se seleccionaron para someter a un ensayo posterior en tejido FFPE. Adicionalmente, los cebadores de las SEC ID NO: 9 y 10 se sometieron a ensayo en una dilución en serie de ARN y mostraron un buen intervalo lineal hasta las diluciones inferiores, lo que sugiere que los cebadores deben tener una buena sensibilidad y son adecuados para el ensayo (figura 6b).
15 Comparación de ensayos TaqMan de tejidos congelados frente a tejidos FFPE para MAGE-A3
Se compararon cuarenta y dos muestras tumorales FFPE usando los cebadores SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10 y la sonda SEC ID NO: 16 completándose el mismo ensayo en tejido congelado usando los cebadores SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4 y la sonda SEC ID NO: 13 (figura 7). El nivel de positividad del ensayo se ajustó al 1 % de gerl (control positivo) y comparando directamente parece haber alguna concordancia entre los dos ensayos. Hay algunos 20 pacientes positivos a MAGE-A3, que no coincidieron con el ensayo de tejido congelado para MAGE-A3; esto puede explicarse por la macrodisección de las áreas tumorales que originan un aumento en la pureza de las células tumorales que expresan MAGE-A3. La eliminación de la mayor parte de las células normales en dilución origina un valor An R2 de resultado positivo a MAGE-A3 (ensayo estadístico para correlación lineal) de 0,92 que se mostró entre el tejido FFPE y el tejido congelado en ARNlater lo que sugiere una buena correlación entre los dos
25 procedimientos (figura 8).
EJEMPLO 4 – Ensayo de MAGE-A3 Taqman COBASTM
Tabla 7
- Secuencias de Cebador y Sonda de MAGE-A3 TaqMan COBAS™
- Secuencias de Cebadores de MAGE-A3 TaqMan COBAS™
- MAGEA3F-623F: (HW_MAGEA3_F; SEC ID Nº: 11)
- 5’ TGTCGTCGGAAATTGGCAGTAT3’
- MAGEA3f-697R:(HW_MAGEA3_R; SEC ID Nº: 12)
- 5’CAAAGACCAGCTGCAAGGAACT3’
- Secuencias de la Sonda de MAGGE-A3 TaqMan COBAS™
- MAGEA3F-646MOD SEC ID Nº: 53
- 5’ -ELFLLLFFLQGLGALFLLFAGFAAAGFLLFP-3’
- E= Colorante Indicador FAM, F= 5-Metil dC, Q = Extintor BHQ2, L = 5-Propinil dU, P= Fosfato, I = Indicador HEX
La secuencia de la sonda de MAGEA3F-646MOD comprende los siguientes nucleótidos modificados (SEC ID Nº: 30 54): 5’-TCTTTCCTGTGATCTTCAGCAAAGCTTC-3’
Tabla 8
- Secuencias de Cebadores y Sonda de la beta actina TaqMan COBAS
- Secuencias de Cebadores de la beta actina TaqMan
- RGI_BACT_F2: (SEC ID Nº: 55)
- 5’-GAGCGCGGCTACAGCTT-3’
- RGI_BACT_R2: (SEC ID Nº:56)
- 5’-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’
- Secuencia de Sonda beta actina TaqMan
- HW_RGIBACT_H: (SEC ID Nº: 57)
- 5’-IACCACCAQCGGCCGAGCGGP-3’
- E= Colorante Indicador FAM, F= 5-Metil dC, Q = Extintor BHQ2, L = 5-Propinil dU, P= Fosfato, I = Indicador HEX
Tabla 9 Tabla 10
- Intervalo CT Válido de Muestra y Control
- Controles
- Intervalo Ct Válido
- Gen Mage Muestra FFPET 50 ng de FAM
- <35,2
- Gen β actina Muestra FFPET 50 ng de HEX
- <32,1
- Gen Mage de Gerl al 100 % 50 ng de FAM
- 26,0-29,5
- Gen β actina de Gerl al 100 % 50 ng de HEX
- 24,0-27,0
- Gen Mage de Gerl al 1 % 0,5 ng de FAM
- 33,0-35,5
- Gen β actina de Gerl al 1 % 0,5 ng de HEX
- 29,0-32,5
- Gen Mage de UHR al 100 % 50 ng de FAM
- 25,0-28,0
- Gen β actina de UHR al 100 % 50 ng de HEX
- 22,0-25,0
- Gen Mage de UHR al 1 % 0,5 ng de FAM
- 31,0-33,0
- Gen β actina de UHR al 1 % 0,5 ng de HEX
- 27,0-29,0
- Control de ADN Positivo P53 20 ng de FAM
- 26,5-29,0
- Control Negativo (CN)
- >38,0
- Perfil de ciclos térmicos Perfil Térmico de PCR para el Experimento de Exclusividad de MAGE-A3
- Etapas
- Descripción Temperatura Tiempo Número de ciclo
- 1
- Descontaminación UNG 50 ºC 5 min 1X
- 2
- Desnaturalización 95 ºC 15 seg 2X
- Hibridación
- 63 ºC 25 seg
- 3
- Desnaturalización 92 ºC 15 seg 53X
- Hibridación
- 63 ºC 50 seg
- 4
- Post Ciclo 40 ºC 2 min 1X
Tabla 11
- Perfil Térmico RT-PCR para Ensayos de Linealidad y Eficacia de RT-PCR, Sensibilidad Analítica (Límite de Detección), Procedimiento de Correlación y Reproducibilidad
- Etapas
- Descripción Temperatura Tiempo Número de ciclo
- 1
- Descontaminación UNG 50 ºC 5 min 1X
- 2
- Desnaturalización 95 ºC 1 min 1X
- 3
- Transcripción Inversa 60 ºC 20 min 1X
- 4
- Desnaturalización 95 ºC 15 seg 2X
- Hibridación
- 63 ºC 25 seg
- 6
- Desnaturalización 92 ºC 15 seg 53X
- Hibridación
- 63 ºC 50 seg
- 7
- Post Ciclo 40 ºC 2 min 1X
Para mejorar la especificidad de MAGE-A3 con relación a los otros miembros de la familia MAGE-A se implementó una temperatura de hibridación relativamente alta de 63 ºC
Análisis de Datos
Los valores de umbral de ciclo, Ct, para MAGE-A3 y -actina se calcularon usando el programa informático
AMPLILINKTM 3.1 (Roche, CA, Estados Unidos) en la estación de trabajo del analizador COBASTM TaqMan 48 (Roche, CA, Estados Unidos) basado en parámetros de ensayo definidos en el Archivo de Definición de Ensayo. Se realizaron análisis de datos para la expresión génica, extrayendo los valores Ct de MAGE-A3 y de -actina a partir del programa AMPLILINKTM para cálculos descendentes para determinar la expresión del gen MAGE-A3 respecto al gen -actina. Para cada proceso, se incluirán controles para establecer el nivel de expresión MAGE-A3 de valor de umbral que necesita cumplirse o excederse con objeto de que la muestra dé un resultado positivo a MAGE-A3. Como un control positivo, se usó ARN de la línea celular GERL. El ARN de GERL se diluyó a 1:100 (GERL al 1 %) en agua y se determinó el Ct de MAGE-A3. Además, el ARN de GERL no diluido (GERL al 100 %) se ensayó sin dilución para la medición del Ct de la -actina. Se calcula un valor Ct delta entre Ct de la -actina del control GERL al 100 % menos el Ct de MAGE-A3 del control GERL al 1 % y la expresión relativa de MAGE-A3 se determina en base al siguiente cálculo:
Expresión del valor de umbral de MAGE-A3 = 2
(Ct de �-actina de GERL al 100 % - Ct de MAGE-A3 de GERL al 1 %)
Para muestras incluidas en parafina, se usará la misma estrategia de control excepto que el ARN del xenoinjerto de FFPE de GERL extraído usando el procedimiento de QIAGEN para FFPE, sustituirá al ARN de la línea celular GERL para el establecimiento de la expresión de valor de umbral.
Ya que el ensayo de MAGE-A3 con Taqman COBASTM es una reacción múltiple, los valores Ct de MAGE-A3 y actina derivaron del mismo tubo de reacción. Se calculó la expresión relativa de MAGE-A3 para cada muestra de ensayo mediante la siguiente ecuación:
Expresión de MAGE-A3 en la muestra de ensayo = 2
(Ct de �-actina de la muestra - Ct de MAGE-A3 de la muestra)
Si la expresión de MAGE-A3 en la muestra de ensayo es mayor o igual a la del nivel de valor de umbral de MAGE-A3 establecido a partir de los controles de ARN de GERL, entonces la muestra se denomina positiva para MAGE-A3. Si la expresión de MAGE-A3 en la muestra de ensayo es menor que la del nivel de valor de umbral de MAGE-A3 establecido a partir de los controles, entonces la muestra se denomina negativa para MAGE-A3.
La expresión de MAGE-A3 se determinará tomando el promedio de los valores Ct de MAGE-A3 y Ct de -actina de las copias para cada espécimen para el cálculo de Ct delta (Ct de -actina -Ct de MAGE-A3). Si una copia tiene un Ct de MAGE-A3 o Ct de -actina menor que el punto de corte Ct del ensayo, aunque la otra copia tenga un Ct de MAGE-A3 o un Ct de -actina mayor al punto de corte Ct, la muestra se ensayará nuevamente. Si ambas copias tienen valores de Ct de -actina mayores al punto de corte Ct, la muestra se marca como Ct de -actina fuera del intervalo y no se proporciona un resultado. Si ambas copias tienen valores Ct de MAGE-A3 mayores al valor de punto de corte Ct de MAGE-A3, pero la expresión de MAGE-A3 está por encima del valor de umbral, entonces la muestra se marca como Ct de MAGE-A3 fuera de intervalo y no se proporciona resultado. Esta estrategia para análisis de datos coincide con los estudios de validación cruzada llevados a cabo para el Procedimiento de Correlación que se describen en la sección de “Procedimiento de Correlación” que se encuentra más adelante.
Para el ensayo de MAGE-A3 por Taqman COBASTM, puede implementarse ARN total de referencia humano (UHR) QPCR humano de Stratagene, como control positivo y ajustarse un valor de umbral de expresión en base a la expresión de MAGE-A3 en este ARN bien caracterizado. El UHR puede ensayarse con cada proceso junto con los controles de ARN de GERL para establecer un valor de umbral de expresión adecuado con el control UHR.
Condiciones de conservación de la Muestra y del Reactivo
Todos los ARN y ADN, incluyendo plásmidos, ADN de control positivo a P53, ARN clínico FFPET, UHR, GERL y STAC se conservaron a una temperatura de -80°C. Todos los reactivos de ensayo, incluyendo la Mezcla Maestra de ARN Universal, mezcla de cebador/sonda, combinación de cofactor y diluyente de muestra/control negativo se conservaron a una temperatura de 2-8°C.
Exclusividad de MAGE-A3
Ensayo experimental de cebadores y sondas con plásmidos de ADN que contienen miembros de la familia MAGE-A3.
Propósito: Determinar la capacidad del ensayo para amplificar específicamente el gen MAGE-A3, excluyendo al mismo tiempo la co-amplificación/detección significativa de otros genes relacionados.
Material de muestra: Se someterá a ensayo, ADN plasmídico que contiene MAGE-A3 y miembros de familia relacionados (para detalles de plásmidos véase el ejemplo 2 anterior).
Procedimiento: Ensayo experimental del ensayo de MAGE-A3 con TaqMan COBAS usando ADN plasmídico que contiene los miembros de la familia MAGE-A3 para determinar si los genes relacionados se amplifican y detectan en cantidades significativas.
Cada muestra de ADN plasmídico se somete a ensayo por triplicado en cuatro concentraciones de ADN diferentes
(20, 2, 0.2, 0.02 pg). El perfil de Ciclo Térmico mostrado en la tabla 10, se modificó para eliminar la etapa de transcripción inversa a una temperatura de 60 °C du rante 20 minutos. La concentración del ADN plasmídico se determinó mediante análisis Nanodrop.
Análisis:
Los valores Ct para el plásmido MAGE-A3 se determinaron y se compararon con valores Ct procedentes de los plásmidos MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, y MAGE-A12. El Ct delta se calculó sustrayendo el Ct de MAGE-AX (cada miembro de familia relacionado) del Ct de MAGE-A3. Se usaron los valores promedio Ct de cuatro copias para los cálculos de Ct y Delta Ct.
Criterios de aceptación:
Los valores Ct delta deben ser mayores o iguales a 10 entre MAGE-A3 y el resto de plásmidos excepto MAGE-A6.
Resultados de exclusividad de MAGE-A3
En algunas ocasiones, en las Tablas y en las Figuras de la presente invención, se usa el término “CURIE” en lugar de “MAGE”; sin embargo, en todos los casos se desea el término “MAGE”.
Los valores Ct se muestran, para todos los plásmidos MAGE sometidos a ensayo, en la Tabla 12 y en la Figura 17 mostradas más adelante. Para plásmidos en los que no hubo amplificación, se asignó un valor Ct de 55, ya que hubo 55 ciclos en el perfil de ciclo térmico. Como era de esperar, los Ct de MAGE-A3 son los primeros para todos los niveles sometidos a ensayo (Tabla 12 y Figura 17). Los valores Ct delta fueron mayores a 10 ciclos entre MAGE-A3 y el resto de plásmidos excepto MAGE-A6 (Tabla 13 y Figura 18). Un Ct delta entre MAGE-A3 y MAGE-A6 no fue necesario ya que el 95 % de los pacientes que expresaban MAGE-A6, también expresaban MAGE-A3.
El Ct delta entre MAGE-A3 y MAGE-A6 para 20 pg, 2 pg y 0.02 pg de entrada del ADN plasmídico fue de 9.3, 8.4,
7.8 y 8.2 ciclos, respectivamente. Como la mayor parte de los valores Ct de MAGE-A3 para ARN de muestras FFPE mostró ser mayor que 27,2 para las muestras FFPE sometidas a ensayo, la señal procedente de MAGE-A6 será mínima ya que un retraso de 8,2 ciclos podría generar un valor Ct fuera del intervalo del ensayo.
Los criterios de aceptación de exclusividad se cumplieron.
La tabla 14 muestra la validación del experimento de exclusividad de MAGE-A3; los Ct de control estuvieron dentro del intervalo validado. El experimento aprobó la validación. Las tablas 15 y 16 muestran los detalles del Experimento de Exclusividad de MAGE-A3.
Linealidad y eficacia de la RT-PCR
Propósito: Determinar la linealidad y la eficacia de la transcripción inversa del ensayo.
Material de muestra: Se usaron diluciones en serie del ARN de GERL de xenoinjerto de FFPE, para estudios de linealidad y eficacia de la RT-PCR.
Procedimiento: El ARN de GERL de xenoinjerto de FFPE se diluyó en serie con factor de dilución 2 de 100 ng a 0,1 ng y se sometió a ensayo usando el ensayo MAGE-A3 con TaqMan COBAS para determinar el intervalo lineal del ensayo. Se sometieron a ensayo diez copias a cada nivel de concentración.
Análisis:
Los valores Ct para cada copia tanto de MAGE-A3 como de -actina se representaron gráficamente frente al log (base 2) de la concentración de entrada del ARN, para calcular la pendiente de la línea y la eficacia de la RT-PCR. Se calculó la eficacia de amplificación por RT-PCR usando la ecuación:
Pendiente = 1/log (base 2)* Eficacia de Amplificación (EA).
Una eficacia de amplificación de 2 equivale al 100 %. Los valores Ct delta (Ct de MAGE-A3 - Ct de -actina) para cada copia se representaron gráficamente frente al log (base 2) de la concentración de entrada del ARN para determinar la pendiente Ct delta. Se calcularon los promedios, desviación típica y porcentaje de coeficiente de variación ( %CV) para el Ct de MAGE-A3, Ct de -actina y el Ct Delta de las diez copias.
Linealidad de criterios de aceptación:
El intervalo lineal del ensayo se determinó en base a los siguientes criterios:
CV de Ct de MAGE-A3 <5 %
CV de Ct de -actina <5 %
CB de Ct Delta <20 %
-0,10 < pendiente Ct Delta <0.10
R2 > 0,95
Criterios de Aceptación de la Eficacia de la RT-PCR:
Eficacia de amplificación por RT-PCR de MAGE-A3 >80 %
Eficacia de amplificación por RT-PCR de -actina >80 %
Diferencia de eficacia de amplificación por RT-PCR entre MAGE-A3 y -actina dentro del 10 %.
Resultados de eficacia de linealidad/RT-PCR
La figura 20 muestra una gráfica con un log (base 2) de entrada de ARN frente a valores Ct para MAGE-A3 y actina. El ensayo de MAGE-A3 por TaqMan COBAS es lineal entre valores de entrada de 100 - 0.1 ng de ARN de GERL extraído del xenoinjerto de FFPE usando el procedimiento QIAGEN basado en valores R2. Los valores R2 fueron 0,983 para MAGE-A3 y 0,998 para la -actina. Estos valores están por encima de la especificación de R2 > 0,95. Además, el Ct tanto de MAGE-A3 como el de -actina de las 10 copias en cada nivel sometido a ensayo, está por debajo de la especificación del VC < 5 %, tal como se muestra en la tabla 17.La eficacia de amplificación por RT-PCR de MAGE-A3 y de la -actina se calculó a partir de la pendiente de la línea generada del log representado gráficamente (base 2) de entrada de ARN frente a valores Ct de MAGE-A3 y -actina mostrados en la figura 19. La eficacia de amplificación por RT-PCR puede calcularse usando la siguiente ecuación:
Pendiente = -1/Log(base 2) * Eficacia de Amplificación (EA).
La eficacia de amplificación fue de 2,14 (107 %) y DE 2,06 (103.1 %) para MAGE-A3 y -actina, respectivamente. La EA estuvo por encima arriba de la especificación del 80 % para MAGE-A3 y la -actina. La diferencia en la EA entre los dos genes fue de 3,9 %, lo cual también estuvo dentro de la especificación de +10 %.
La figura 20, muestra una gráfica con log (base 2) de entrada de ARN frente a Ct Delta entre MAGE-A3 y -actina. La pendiente de Delta Ct es de 0,0474, y está dentro de la especificación de pendiente de -0,10 a 0,10. En los dos niveles más bajos de entrada de ARN sometidos a ensayo (0,2 y 0,1 ng), el % del CV para el Ct Delta estuvo por encima de la especificación del 20 %. Como resultado, los últimos dos niveles de entrada de ARN no se incluyeron en el intervalo lineal del ensayo. El intervalo lineal del ensayo usando el ARN de xenoinjerto de GERL es de 100 ng
– 0,39 ng de ARN.
En base a estos datos, se cumplieron los criterios de aceptación para la linealidad y eficacia por RT-PCR.
La tabla 18 muestra la Eficacia de la Amplificación por RT-PCR de MAGE-A3 y de la -actina; la tabla 19 es la Validación del Experimento de Linealidad/Eficacia por RT-PCR.
Los Cts de control estuvieron dentro del intervalo validado. El experimento aprobó la validación.
Las tablas 20, 21 y 22 proporcionan detalles del experimento de Linealidad / Eficacia por RT-PCR
Sensibilidad Analítica (Límite de Detección)
Propósito: Establecer la concentración más baja de ARN, en la que la expresión del gen MAGE-A3 puede detectarse mediante el ensayo de MAGE-A3 por TaqMan COBASTM al menos en 95 % de las veces. Material de muestra: Se evaluó la sensibilidad analítica usando ARN aislado de tejido de xenoinjerto FFPE usando el kit QIAGEN RNeasy FFPE con una etapa de DNasa adicional. El ARN se extrajo de los xenoinjertos FFPE derivados de dos líneas celulares diferentes de ARN. Un xenoinjerto denominado GERL, expresaba MAGE-A3. El otro xenoinjerto denominado STAC no expresaba MAGE-A3. El ARN de estos dos xenoinjertos se usó para experimentos de mezcla con el objeto de ensayar el ARN de GERL al 5 % en un fondo de ARN de STAC al 95 %, ARN de GERL al 1 % en un fondo de ARN de STAC al 99 % y ARN de GERL al 0,5 % en un fondo de ARN de STAC al 99,5 %. Estas tres mezclas diferentes de ARN de GERL y STAC se sometieron a ensayo a cuatro niveles diferentes de ARN total. Procedimiento: Se generaron veinticuatro resultados de ensayo de cuatro series de dilución independientes de las mezclas de ARN de GERL y STAC. Se sometieron a ensayo cuatro niveles de entrada de ARN (100, 50, 25 y 12,5 ng). Se sometieron a ensayo seis copias para cada nivel.
Análisis: Determinar el nivel de ARN al cual se obtiene el intervalo de positividad >95 % de MAGE-A3 en base al valor Ct dentro del intervalo de ensayo validado.
Criterios de aceptación: LOD < 50 ng de entrada ARN total para detección del 1 % de GERL.
Límite de resultados de detección
El índice de acierto se define como el valor de umbral de ciclo, Ct, dentro del intervalo lineal del ensayo en base a los experimentos de linealidad descritos en este informe. Para determinar el extremo de intervalo de Ct, se realizó el promedio de los Ct de MAGE-A3 y -actina del nivel de entrada de ARN de 0,39 ng del estudio de linealidad
(extremo del intervalo lineal) y se calcularon los límites de confianza de 95 % para los Ct de MAGE-A3 y -actina. En base a estos cálculos, el Ct de MAGE-A3 debe ser menor o igual a 35,2 y el Ct de la -actina debe ser menor a 32,1 para la muestra que se considera como un acierto. Los índices de acierto de MAGE-A3 y -actina se muestran en la tabla 23 y tabla 25. Los porcentajes del índice de acierto para MAGE-A3 y -actina se muestran en la tabla 24 y tabla 26.
El límite de detección es de 50 ng de ARN de entrada, en el que el ARN de GERL al 1 % diluido en ARN de STAC al 99 % se detecta > 95 % de las veces en base al Ct de MAGE-A3 que se encuentra dentro del intervalo del ensayo validado. Se cumplen los criterios de aceptación para la Sensibilidad Analítica (límite de detección).
Validación de Experimento del Límite de Detección. Los Ct de control FAM del gen MAGE se muestran en la tabla 27; los Ct de control HEX de -actina se muestran en la tabla 28. Los Ct de control están dentro del intervalo validado. El experimento aprobó la validación.
Las Tablas 29, 30, 31 muestran los detalles del experimento del límite de detección.
Correlación del procedimiento
Propósito: Correlacionar y validar en forma cruzada el ensayo de MAGE-A3 por TaqMan COBASTM y un ensayo prototipo en muestras FFPET clínicas.
Material de muestra: Se analizaron aproximadamente 120 muestras FFPET clínicas de calidad adecuada usando el ensayo de MAGE-A3 por TaqMan COBAS y usando el ensayo prototipo.
Procedimiento: Se extrajo ARN usando el kit QIAGENTM RNeasy FFPE con una etapa de DNasa adicional. Se realizó una extracción para cada muestra FFPET, la muestra se dividió y se sometió a ensayo una alícuota mediante el ensayo de MAGE-A3 por TaqMan COBAS y se sometió a ensayo una alícuota usando el ensayo prototipo. Se procesaron controles idénticos para ambos ensayos para establecer el valor de umbral de la expresión de MAGE-A3.
Análisis:
La respuesta de MAGE-A3 para cada muestra se registró como positiva o negativa en base al valor de umbral de la expresión de MAGE-A3 generado por los controles de ARN de GERL. Los resultados entre los dos ensayos se compararon para establecer el positivo y negativo a través del comparador de valores de porcentaje de coincidencia del ensayo RMS.
Para los cálculos de porcentaje de coincidencia, se usaron los resultados obtenidos previamente usando el ensayo de la RT-PCR de dos etapas para tejido congelado, para resolver los resultados discordantes.
Positivo determinado por el comparador de porcentaje de coincidencia = Nº de muestras denominadas correctamente expresadoras de MAGE-A3 / Nº de muestras sometidas a ensayo * 100.
Negativo determinado por el comparador de porcentaje de coincidencia: = Nº de muestras denominadas correctamente no expresadoras de MAGE-A3 / Nº número de muestras sometidas a ensayo * 100.
Criterios de aceptación:
Positivo determinado por comparador de porcentaje de coincidencia > 85 %
Negativo determinado por el comparador de porcentaje de coincidencia > 85 %
Se realizó la validación cruzada de especímenes clínicos de un estudio clínico de NSCLC para evaluar el positivo y negativo mediante el comparador de porcentaje de coincidencia del ensayo de MAGE-A3 por TaqMan COBAS. Como un comparador para estos resultados se usó el ensayo de MAGE-A3 de prototipo RT-PCR. En el caso de discordancia entre resultados, para resolver los resultados discordantes, pueden usarse los resultados previos generados procedentes de la misma muestra, como tejido congelado reciente no micro-diseccionado manualmente.
Usando el procedimiento QIAGEN RNeasy FFPE con la etapa de digestión con DNasa I, se extrajo ARN de 131 especímenes FFPE clínicos micro-diseccionados manualmente. Posteriormente, cada muestra se dividió por igual entre RMS y RG1 para someter a ensayo usando el ensayo MAGE-A3 con TaqMan RMS COBAS y el ensayo de prototipo RGI. El análisis de datos se realizó como se describe en la sección 3, en este informe el valor de umbral de la expresión de MAGE-A3 se determinó en base al control de ARN de GERL al 1 %.
Resultados del Procedimiento de Correlación / Validación cruzada
Se extrajeron muestras de ARN de 131 especímenes clínicos de NSCLC FFPE. Siete muestras tuvieron una contaminación de ADN genómico mayor al 25 % basándose en la reacción de control RT de los RGI. Estas muestras se excluyeron del positivo y negativo determinado por los cálculos del comparador de porcentaje de coincidencia. Además, hubo 6 resultados indeterminados procedentes del ensayo COBAS y 15 del ensayo prototipo, en el que la
muestra no tuvo suficiente material en base al Ct de la -actina fuera del intervalo lineal del ensayo, o la expresión de MAGE-A3 para la muestra estuvo por encima del valor de umbral, aunque el Ct de MAGE-A3 estuvo fuera del intervalo lineal. Como resultado, hubo 117 resultados del ensayo COBAS y 108 resultados del ensayo de prototipo, con datos que podían usarse para que la validación cruzada comparase los dos ensayos diferentes (tabla 32). La concordancia general entre los ensayos COBAS y de prototipo fue de 98/107 ó 91.6 % (tabla 33). El positivo a través del comparador de porcentaje de coincidencia del ensayo COBAS, usando el ensayo de prototipo como “patrón de oro”, fue de 59/64 ó 92,2 %, mientras que el negativo a través del comparador de porcentaje de coincidencia fue de 39/43 ó 90,7 % y (tabla 33). En el caso de resultados discordantes entre los ensayos COBAS y de prototipo, para resolver la discordancia, se usaron los resultados generados por el análisis de muestra de tejido congelado (Tabla 34).
De las 9 muestras con resultados discordantes entre los ensayos COBAS y de prototipo, 7 demostraron concordancia entre los ensayos COBAS y de congelación y 2 demostraron concordancia entre los ensayos de prototipo y de congelación. Como resultado, cuando se usa el resultado de congelación para resolver la discordancia, el positivo a través del comparador de porcentaje de concordancia del ensayo COBAS aumenta a 63/64 y el negativo a través del comparador de porcentaje de coincidencia aumenta a 42/43 ó al 97,7 % (tabla 34).
El positivo y el negativo determinados por el comparador de porcentaje de coincidencia del ensayo MAGE-A3 TaqMan COBAS superaron las especificaciones mayores o iguales al 85 %. Los criterios de aceptación para positivo y negativo a través del comparador de porcentaje de coincidencia se cumplieron.
Validación Control de Correlación del Procedimiento/ Validación Cruzada
Los Ct de los genes MAGE de control del experimento se muestran en la tabla 30; los Ct del gen de la -actina de control del experimento se muestran en la tabla 31. Los Ct de control están dentro del intervalo validado. El experimento aprobó la validación.
En las tablas 37, 38 y 39 se muestran los detalles del experimento de Correlación del Procedimiento/Validación Cruzada.
Reproducibilidad
Propósito: demostrar la reproducibilidad y fiabilidad del ensayo a través de grupos de datos generados por operadores múltiples en días múltiples con lotes de reactivos múltiples e instrumentos múltiples.
Material de muestra:
Se extrajeron 12 muestras de las muestras clínicas de NSCLC FFPE micro-diseccionadas manualmente usando el kit QIAGEN RNeasy FFPE con etapa de digestión DNasa I y se amplificaron/detectaron usando el ensayo MAGE-A3 TaqMan COBAS.
Procedimiento:
El estudio consistió en dos copias por muestra
Se sometieron a ensayo dos lotes de reactivo para la preparación de muestra QIAGEN y reactivos TaqMan.
Los experimentos se realizaron por dos operadores diferentes en dos días diferentes usando dos analizadores TaqMan 48 COBAS diferentes.
Análisis:
La expresión de MAGE-A3 de cada espécimen clínico se calculó a partir del promedio de dos copias de RT-PCR. Además, para cada copia de cada muestra se evaluó la respuesta de MAGE-A3. La reproducibilidad también se basó en la comparación de la expresión del gen MAGE-A3 calculada a partir del valor de Ct Delta entre el gen MAGE-A3 y -actina. La comparación entre la expresión de MAGE-A3 para muestras sometidas a ensayo con diferentes lotes de reactivos, instrumentos, operadores y en diferentes días, se realizó usando la correlación de Pearson.
Criterios de aceptación:
> 90 % de concordancia de la respuesta de MAGE-A3 entre las muestras que son al menos 3X el límite de detección del ensayo (GERL al 3 %) de proceso a proceso y dentro de copias de procesos.
Correlación de Pearson > 90 % entre muestras.
Resultados reproducibilidad
El umbral de la expresión de MAGE-A3 es el nivel de corte de la expresión de MAGE-A3 que determina si un paciente recibirá una inmunoterapia específica de MAGE-A3. Los pacientes con expresión de MAGE-A3 igual o por encima del valor de umbral, tendrán una respuesta positiva MAGE-A3 y recibirán tratamiento. Los pacientes con expresión de MAGE-A3 por debajo del valor de umbral tendrán una respuesta negativa a MAGE-A3 y no recibirán tratamiento. Los estudios de reproducibilidad del ensayo se basaron en la respuesta de la expresión de MAGE-A3 para cada espécimen usando las siguientes ecuaciones:
5 Valor de umbral de expresión MAGE-A3 = 2
(Ct de -actina del control GERL al 100 % - Ct de MAGE-A3 del control GERL al 1 %).
Expresión de MAGE-A3 para el espécimen clínico = 2
(Ct de -actina del espécimen – Ct de MAGE-A3 del espécimen)
Además, se evaluó la reproducibilidad del ensayo comparando la correlación de la expresión de MAGE-A3 entre los
10 dos procesos mediante el Coeficiente de Correlación Producto-Momento de Pearson (r). La tabla 40 y la tabla 37 muestran el valor de umbral de la expresión de MAGE-A3 generado a partir de los controles de ARN de GERL sometidos a ensayo con el proceso 1 y 2 en base al Ct delta entre la -actina y MAGE-A3. La tabla 41 y la tabla 43 muestran la respuesta de MAGE-A3 para cada uno de los 12 especímenes sometidos a ensayo en los procesos 1 y
2.
15 La tabla 42 muestra el proceso 2 - Valor de Umbral de la Expresión de MAGE-A3 de los Controles de ARN de GERL; la tabla 43 muestra el proceso 2 - respuesta de la Expresión de MAGE-A3 para Especímenes de Reproducibilidad.
Para todas las muestras sometidas a ensayo, hubo una correlación del 100 % para la respuesta de la expresión de MAGE-A3 entre los dos procesos. Además, la reproducibilidad del ensayo se evaluó comparando la correlación de la
20 expresión de MAGE-A3 entre los dos procesos mediante el Coeficiente de Correlación Producto-Momento de Pearson (r). El Coeficiente de Correlación de Pearson fue de 0,987, cuando se comparó la expresión de MAGE-A3 entre los dos procesos diferentes. Se cumplieron los criterios de aceptación para la reproducibilidad.
La tabla 44 muestra la Validación de la Reproducibilidad; los Ct de Control están dentro del intervalo validado. El experimento aprobó la validación.
25 Los detalles del Experimento de Reproducibilidad se muestran en las tablas 45, 46 y 47.
Claims (9)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un conjunto de cebadores que consiste en el siguiente par de cebadores:
a) SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12. -
- 2.
- Una sonda que consiste en:
5 a) la secuencia de nucleótidos de (cualquiera de) la SEC ID NO:17, que tiene un colorante indicador fluorescente en el extremo 5’ y un extintor no fluorescente en el extremo 3’ o; b) la SEC ID NO: 53. - 3. Un kit que comprende (i) un cebador que consiste en la SEC ID NO:11; (ii) un cebador que consiste en la SEC IDNO:12; y una sonda que consiste en la SEC ID NO:17 que en el extremo 5’ tiene 6-carboxifluoresceína y en el 10 extremo 3’ tiene un extintor no fluorescente.
-
- 4.
- Un kit que comprende (i) un cebador que consiste en la SEC ID NO:11; (ii) un cebador que consiste en la SEC ID NO:12; y una sonda que consiste en la SEC ID NO:53.
-
- 5.
- Un procedimiento para determinar la presencia o ausencia de MAGE-A3 en tejido tumoral Fijado en Formol e Incluido en Parafina (FFPE), que comprende la etapa de poner en contacto una secuencia de nucleótidos aislada
15 obtenida o derivada de una muestra de tejido tumoral FFPE con un conjunto de cebadores que consiste en la SEC ID NO:11 y SEC ID NO:12 y una sonda de acuerdo con la reivindicación 2. - 6. Un procedimiento de diagnóstico en pacientes que comprende la etapa de poner en contacto una secuencia de nucleótidos aislada obtenida o derivada de una muestra de tejido tumoral FFPE con un conjunto de cebadores que consiste en la SEC ID NO:11 y SEC ID NO:12 y una sonda de acuerdo con la reivindicación 2 y evaluar si MAGE-A320 se expresa en la muestra.
-
- 7.
- El procedimiento de la reivindicación 5 ó 6, que adicionalmente comprende la etapa de amplificar una secuencia de nucleótidos y detectar en la muestra la secuencia de nucleótidos amplificada.
-
- 8.
- El procedimiento de la reivindicación 5, que adicionalmente comprende la etapa de determinar si la secuencia de
nucleótidos se hibrida, en condiciones rigurosas, con el cebador o con la sonda, detectando de este modo si el tejido 25 tumoral es positivo a MAGE-A3. - 9. El procedimiento de la reivindicación 8, que adicionalmente comprende la etapa de usar la hibridación in situ para detectar si la secuencia de nucleótidos se hibrida al menos con un cebador o con una sonda.FIG. 9Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión del fragmento de Proteína D, fragmento Mage3, y cola de histidina, y su secuencia de aminoácidos respectiva (SEC IDFIG. 10Proteína de fusión de NS1-MAGE3, y cola de Histidina (SEC ID Nº:37)FIG. 11ADN que codifica la proteína de fusión NS1-MAGE3-His (SEC ID Nº:38)FIG. 12Proteína de fusión de CLYTA -MAGE3 -Histidina (SEC ID Nº:39)FIG. 13ADN de la proteína de fusión CLYTA-MAGE3-His (SEC ID Nº:40)FIG. 15Comparación de MAGE-A3 (SEC ID Nº:51) y MAGE-A6 (SEC ID Nº:52)96,4 %Tampón RBC
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