PT2041308E - Método para a detecção e diagnóstico do cancro envolvendo iniciadores e sondas para a detecção específica do marcador mage�a3 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODO PARA A DETECÇÃO E DIAGNÓSTICO DO CANCRO ENVOLVENDO INICIADORES E SONDAS PARA A DETECÇÃO ESPECÍFICA DO MARCADOR MAGE-A3"

ANTECEDENTES A família MAGE (antigénio de melanoma) de genes foi originalmente identificada devido ao reconhecimento a partir de linfócitos citolíticos derivados de linfócitos do sangue de doentes de cancro (Van der Bruggen et al. 1991) . A família MAGE de genes compreende agora mais de 20 membros e é constituída pelos genes MAGE A, B, C e D (Scanlan et al., (2002) Immunol Rev. 188:22-32; Chomez et al., (2001) Câncer Res. 61(14):5544-51).

Estes estão agrupados no cromossoma X (Lucas et al., 1998 Câncer Res. 58:743-752; Lucas et al., 1999 Câncer Res 59:4100-4103; Lucas et al., 2000 Int J Câncer 87:55-60; Lurquin et al., 1997

Genomics 46:397-408; Muscatelli et al., 1995 Proc Natl Acad Sei USA 92:4987-4991; Pold et al., 1999 Genomics 59:161-167; Rogner et al. 1995 Genomics 29:725-731) e têm uma função ainda não identificada (Ohman et al. 2001 Exp Cell Res. 265(2):185-94). Os genes MAGE são altamente homólogos e os membros da família MAGE-A, especialmente, têm homologia entre 60-98%. Os genes MAGE não são expressos em todas as células normais com excepção da expressão em espermatogónios e placenta (Haas et al. 1988 Am J Reprod Immunol Microbiol 18:47-51; Takahashi et al. 1995 Câncer Res 55:3478-382). 1 A reactivação da expressão do gene MAGE no cancro é devida à desmetilação anormal do promotor (De Smeet et ai. 1996 Proc Natl Acad Sei USA 93 (14): 7149-53; De Smeet et ai. 1999 Mol Cell Biol. 19(11):7327-35). Os 12 genes MAGE-A são sobre-expressos variavelmente nos seguintes cancros: carcinoma das células transicionais, carcinoma esofágico, melanoma, carcinoma da bexiga e carcinoma de células não pequenas do pulmão (NSCLC) (Scanlan et ai. 2002 Inununol Rev. 188:22-32). A sobreexpressão e a especificidade da expressão de MAGE em tecidos cancerosos tem feito com que a proteína MAGE-A3 seja utilizada como um antigénio para vacinas contra o cancro (Scanlan et ai. 2002 Immunol Rev. 188:22-32). No entanto, devido à ampla gama de expressão encontrada em doentes de cancro, o nível de expressão de MAGE-A3 deve ser estimado com precisão em cada doente, para direccionar a vacinação para doentes expressando a proteína. MAGE-A3 é muitas vezes designada indistintamente MAGE-3; são aqui utilizadas ambas.

Melanoma

Os doentes que apresenta melanoma maligno em metástases distante (estádio IV de acordo com a classificação do "American Joint Committee on Câncer" (AJCC)) têm um tempo de sobrevivência mediano de um ano, com uma proporção de sobrevivência a longo prazo de apenas 5%. Mesmo a quimioterapia convencional para o melanoma de estádio IV tem proporções de resposta terapêutica de apenas 8-25%, mas nenhum efeito sobre a sobrevivência total. Doentes com metástases regionais (estádio III) têm uma sobrevivência mediana de dois a três anos com probabilidade muito baixa de sobrevivência a longo prazo, mesmo após um controlo cirúrgico adequado das metástases primárias e regionais 2 (Balch et al., 1992 Semin Surg Oncol. 8(6):400-14). A maioria dos doentes com melanoma de estádio I a III têm os seus tumores removidos cirurgicamente, mas estes doentes mantêm um risco substancial de recaída. Deste modo persiste uma necessidade de prevenir a progressão do melanoma e de ter regimes de tratamento melhorados para melanoma metastático e tratamentos adjuvantes para doentes gue tiveram um tumor primário removido.

Cancro do pulmão

Existem dois tipos de cancro do pulmão: cancro de células não pequenas do pulmão (NSCLC) e cancro de células pequenas do pulmão (SCLC). Os nomes apenas descrevem o tipo de célula encontrada nos tumores. O NSCLC inclui carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma e carcinoma de células grandes e totaliza cerca de 80% dos cancros do pulmão. O NSCLC é difícil de curar e os tratamentos disponíveis tendem a ter o objectivo de prolongar a vida o máximo possível e aliviar os sintomas da doença. O NSCLC é o tipo mais comum de cancro do pulmão e está associado a resultados insatisfatórios. Da totalidade dos doentes com NSCLC, cerca de 25% têm doença loco-regional no momento do diagnóstico e ainda são tratáveis por excisão cirúrgica (estádios IB, IIA ou IIB de acordo com a classificação AJCC) . No entanto, mais de 50% destes doentes irá recair dentro de dois anos, após a ressecção cirúrgica completa. Existe consequentemente uma necessidade para proporcionar melhor tratamento a estes doentes. 3

Expressão de MAGE-A3

Anteriormente vários métodos têm tentado medir a expressão de genes MAGE-A3 dentro de linhas celulares e de amostras tumorais. RT-PCR semi-quantitativa (De Plaen et al. 1994 Immunogenetics 40(5):360-9), outras técnicas baseadas em PCR e também micromatrizes de baixa densidade têm sido todas utilizadas (Zammatteo et al. 2002 Clinicai Chemistry 48(1) 25-34). No entanto, em muitos destes estudos um problema significativo tem consistido na homologia muito elevada entre os membros da família MAGE originando falsos positivos. Para ensaios de Fase II e III extensos é desejável um ensaio quantitativo de produtividade elevada, capaz de identificar especificamente amostras expressando MAGE-A3 e de reduzir a possibilidade das amostras serem falsos positivo.

Outra dificuldade provém da utilização de tecido tumoral Fixado em Formalina, Embebido em Parafina (FFPE), que é o método normal de conservação de tecido tumoral em centros clínicos. A fixação em formalina altera a estrutura das moléculas de ARN dentro do tecido, causando reticulação e também degradação parcial. A degradação parcial origina a criação de pedaços menores de ARN e entre 100 e 300 pares de base. Estas alterações estruturais no ARN tornam difícil a utilização de ARN extraído de tecido FFPE em técnicas de diagnóstico convencionais.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1: Especificidade dos iniciadores TaqMan em RT-PCR de MAGE-A3 dentro dos membros da família MAGE-A. 4

Figura 2: Especificidade da sonda de Ligação ao Sulco Menor (MGB) em RT-PCR com TaqMan para a expressão de MAGE-A3.

Figura 3: Teste de especificidade dos iniciadores MAGE-A3 na presença dos plasmideos MAGE-A3 e MAGE-6.

Figura 4:. Expressão de MAGE-A3 em tumores como medida por PCR quantitativa com TaqMan.

Figura 5: Teste da expressão de MAGE-A3.

Figura 6a: Especificidade dos iniciadores MAGE-A3 concebidos para utilização em tecido FFPE.

Figura 6b: Teste de linearidade dos iniciadores em relação a quantidades diferenciais de ARN.

Figura 7: Comparação entre PCR de ensaio de congelamento com RNAlater e tecido FFPE.

Figura 8: Comparação relativa entre os ensaios de MAGE-A3 de congelamento com RNAlater e baseados em FFPE.

Figura 9: Sequência nucleotidica codificando a proteína de fusão de fragmento da lipoproteína D, fragmento Mage3 e cauda de histidina e a sua respectiva sequência de aminoácidos (SEQ ID N°: 35 e 36).

Figura 10: Proteína de fusão NS1-MAGE3 e cauda de Histidina (SEQ ID N°: 37) 5

Figura 11: ADN codificando a proteína de fusão NSl-MAGE3-His (SEQ ID N°: 38)

Figura 12: Proteína de fusão CLYTA-MAGE3-Histidina (SEQ ID N°: 39)

Figura 13: ADN para a proteína de fusão CLYTA-MAGE3-His (SEQ ID N°: 40)

Figura 14: Alinhamento de sequências da família do gene MAGE-A para a concepção de sondas e iniciadores de RT-PCR para MAGE-A3

Figura 15: Alinhamento das sequências MAGE-A3 e MAGE-A6 para identificar regiões contendo sequências alvo (texto em caixa).

Figura 16: Classes para RT-PCR Semi-quantitativa de MAGE-A3: um exemplo de como podem ser atribuídas cinco classes ao ensaio de RT-PCR semi-quantitativa de MAGE-A3.

Figura 17: Comparação gráfica entre valores de Ct de plasmídeos MAGE-A utilizando 20, 2, 0,2, 0,02 pg de ADN.

Figura 18: Comparação gráfica entre valores de Delta Ct relativos a MAGE-A3 para outros plasmídeos MAGE-A utilizando 20, 2, 0,2, 0,02 pg de ADN.

Figura 19: Linearidade do ARN de Xenoenxerto GERL FFPE diluições em série 2 de vezes de 100 a 0,1 ng de adição de ARN.

Figura 20: mostra um gráfico com o log (base 2) do adição de ARN versus Delta Ct entre MAGE-A3 e β-actina. 6

Descrição das Tabelas e Sequências

Tabela 1: Iniciadores oligonucleotídicos utilizados para RT-PCR semi-quantitativa de MAGE.

Tabela 2: Iniciadores oligonucleotídicos utilizados para RT-PCR quantitativa com TaqMan.

Tabela 3: Comparação entre PCR semi-quantitativa de MAGE-A3 vs. PCR quantitativa com TaqMan.

Tabela 4: Comparação entre valores de Ct e Delta Ct utilizando a mistura de PCR 1 e a mistura de PCR 2.

Tabela 5: Iniciadores oligonucleotídicos utilizados para RT-PCR quantitativa com MGB TaqMan a partir de tecido congelado.

Tabela 6: Classes para RT-PCR semi-quantitativa de MAGE-A3: um exemplo de como podem ser atribuídas cinco classes ao ensaio de RT-PCR semi-quantitativa de MAGE-A3 (refere-se à Figura 16).

Tabela 7: Sequências do Iniciador e da Sonda COBAS™ TaqMan para MAGE-A3.

Tabela 8: Sequências do Iniciador e da Sonda COBAS™ TaqMan para a beta-actina.

Tabela 9: Gama de CT válida para COBAS™ TaqMan da Amostra e do Controlo.

Tabela 10: Perfil de ciclo térmico para COBAS™ TaqMan - Perfil térmico da PCR para a experiência de exclusividade para MAGE-A3. 7

Tabela 11: Perfil térmico de RT-PCR para Linearidade e Eficiência da RT-PCR, Sensibilidade Analítica (Limite de Detecção), Correlação do Método, Experiências de Reprodutibilidade.

Tabela 12: Valores de Ct dos plasmídeos MAGE-A utilizando 20, 2, 0,2, 0,02 pg de ADN.

Tabela 13: Valores de Delta Ct relativos a MAGE-A3 para outros plasmídeos MAGE-A utilizando 20, 2, 0,2, 0,02 pg de ADN.

Tabela 14: Validação da Experiência de Exclusividade para MAGE-A3.

Tabela 15 e Tabela 16: Detalhes da Experiência de Exclusividade para MAGE-A3.

Tabela 17: Linearidade de Ct e de Delta Ct para MAGE-A3 e da β-actina a partir de 10 replicados em 11 níveis.

Tabela 18: Eficiência da amplificação por RT-PCR de MAGE-A3 e da β-actina.

Tabela 19: Validação da experiência de linearidade/eficiência da RT-PCR.

Tabelas 20, 21 e 22: Detalhes da experiência de linearidade/eficiência da RT-PCR.

Tabela 23: Proporção de Acerto do Ct para MAGE-A3, N = 24 para cada condição.

Tabela 24: Percentagem da Proporção de Acerto de MAGE-A3 Ct, N = 24 para cada condição.

Tabela 25: Proporção de acerto do Ct para a β-actina, N = 24 para cada condição.

Tabela 26: Percentagem da proporção de acerto do Ct para a β-actina, N = 24 para cada condição.

Tabela 27: Ct de controlo com FAM para o gene MAGE.

Tabela 28: Ct de controlo com HEX para a β-actina.

Tabela 29; Tabela 30; e Tabela 31: Detalhes da experiência do limite de detecção.

Tabela 32: Sumário da Validação Cruzada de Amostras.

Tabela 33: Testes COBAS e protótipo Positivo e Negativo por

Concordância Percentual do Comparador.

Tabela 34: Testes COBAS e protótipo Positivo e Negativo por

Concordância Percentual do Comparador com Teste congelado para Resolver Resultados Discordantes.

Tabela 35: Experiência de Controlo do Ct do Gene MAGE.

Tabela 36: Experiência de Controlo do Ct do Gene da β-actina.

Tabelas 37, 38 e 39: Detalhes da Experiência Método de

Correlação/Validação Cruzada 9

Tabela 40: Corrida 1 - Limiar de Expressão de MAGE-A3 a partir de Controlos de ARN de GERL.

Tabela 41: Corrida 1 - Detecção da Expressão de MAGE-A3 para

Espécimes de Reprodutibilidade.

Tabela 42: Corrida 2 - Limiar de Expressão de MAGE-A3 a partir de Controlos de ARN de GERL

Tabela 43: Corrida 2 - Detecção da Expressão de MAGE-A3 para

Espécimes de Reprodutibilidade.

Tabela 44: Validação de reprodutibilidade.

Tabelas 45, 46 e 47: Detalhes da Experiência de eprodutibilidade. SEQ ID N°: 1 - MAGE3-E2F (iniciador para ensaio semi-quantitativo de MAGE3) (Tabela 1) SEQ ID N°: 2 - MAGE3-E3R (iniciador para ensaio semi-quantitativo de MAGE3) (Tabela 1) SEQ ID N°: 3 - E3 MAGE3 TMF (iniciador directo para o exão 3 de MAGE-A3) (Tabela 2) SEQ ID N°: 4 - E3 MAGE3 TMR (iniciador inverso para o exão 3 de MAGE-A3; este iniciador é o complemento inverso da sequência de MAGE-A3 que este reconhece) (Tabela 2) SEQ ID N°: 5-13 MAGE3 TMF (iniciador directo para o intrão 3 de MAGE-A3) (Tabela 2) 10 SEQ ID N°: 6-13 MAGE3 TMR (iniciador inverso para o intrão 3 de MAGE-A3; este iniciador é o complemento inverso da sequência de intrão MAGE-A3 que este reconhece) (Tabela 2) SEQ ID N°: 7 - MAGEA3-775F (iniciador directo para MAGE-A3) (Tabela 5) SEQ ID N°: 8 - MAGEA3-849R (iniciador inverso para MAGE-A3; este iniciador é o complemento inverso da sequência MAGE-A3 que este reconhece) (Tabela 5) SEQ ID N°: 9 - MAGEA3e-950F (iniciador directo para MAGE-A3) (Tabela 5) SEQ ID N° : 10 - MAGEA3e-l03 7R este iniciador é o complemento este reconhece) (Tabela 5) (iniciador inverso para MAGE-A3; inverso da sequência MAGE-A3 que SEQ ID N° : 11 - MAGEA3f-623F (iniciador directo para MAGE-A3) (Tabela 5) SEQ ID N°: 12 - MAGEA3f-697R (iniciador inverso para MAGE-A3; este iniciador é o complemento inverso da sequência MAGE-A3 que este reconhece) (Tabela 5) SEQ ID N°: 13 - E3 MAGE3 TMP (sonda para o exão 3 de MAGE3) (Tabela 2) SEQ ID N°: 14 - 13 MAGE-A3 TMP (sonda para o intrão 3 de MAGE3) (Tabela 2) SEQ ID N°: 15 - MAGEA3-80lTmc (sonda para MAGE3) (Tabela 5) 11 SEQ ID N°: 16 - MAGEA3e-1000Tmc (sonda para MAGE3) (Tabela 5) SEQ ID N°: 17 - MAGEA3f-651Tm (sonda para MAGE3) (Tabela 5) SEQ ID N°: 18 - B-actin-E4F (iniciador para B-actina) (Tabela 1) SEQ ID N°: 19 - B-actin-E6R (iniciador para B-actina) (Tabela 1) SEQ ID N°: 20 - B-actin-TMF (iniciador para B-actina) (Tabela 2) SEQ ID N°: 21 - B-actin-TMR (iniciador para B-actina) (Tabela 2) SEQ ID N°: 22 - B-actina TMP (sonda para B-actina) (Tabela 2) SEQ ID N° 23 - SEQ ID N°: 29: imunopéptidos MAGE3 SEQ ID N°: 30 -SEQ ID N°: 34: oligonucleótidos adjuvantes SEQ ID N° : 35 - sequência nucleotídica da proteína de fusão do fragmento lipoproteína D-fragmento MAGE3-cauda de histidina (Figura 9) SEQ ID N° : 36 - sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 35 (Figura 9) SEQ ID N°: 37 - sequência de aminoácidos de proteína de fusão NS1-MAGE3- cauda de histidina (Figura 10)

SEQ ID N°: 38 - sequência nucleotídica codificando a SEQ ID N° : 3 7 (Figura 11) 12 SEQ ID N° : 39 - sequência de aminoácidos da proteína de fusão CLYTA-MAGE3-Histidina (Figura 12) SEQ ID N°: 40 - sequência nucleotídica codificando a proteína de fusão CLYTA-MAGE3-histidina (Figura 13) SEQ ID N° : 41 - fragmento de MAGE 1 (Figura 14) SEQ ID N° : 42 - fragmento de MAGE 2 (Figura 14) SEQ ID N° : 43 - fragmento de MAGE 4a (Figura 14 SEQ ID N° : 44 - fragmento de MAGE 7 (Figura 14) SEQ ID N° : 45 - fragmento de MAGE 8 (Figura 14) SEQ ID N° : 46 - fragmento de MAGE 10 (Figura 14 SEQ ID N° : 47 - fragmento de MAGE 11 (Figura 14 SEQ ID N° : 48 - fragmento de MAGE 12 (Figura 14 SEQ ID N° : 49 - fragmento de MAGE- -A6 (Figura 14 SEQ ID N° : 50 - fragmento de MAGE- -A3 (Figura 14 SEQ ID N° : 51 - fragmento de MAGE- -A3 (Figura 15 SEQ ID N° : 52 - fragmento de MAGE- -A6 (Figura 15 SEQ ID N°: 53 - sequência da sonda sintética MAGEA3F-646MOD de MAGE-A3 (Tabela 7). 13 SEQ ID N°: 54 - sequência da sonda MAGEA3F-646MOD tendo nucleótidos não modificados. SEQ ID N°: 55 - sequência do iniciador RGI BACT F2 para β-actina (Tabela 8) SEQ ID N°: 56 - sequência do iniciador RGI BACT R2 para β-actina (Tabela 8) SEQ ID N°: 57 - sequência da sonda HW RGIBACT H para β-actina: (Tabela 8)

SUMARIO DA INVENÇÃO A actual requerente desenvolveu um ensaio para identificar doentes tendo tecido tumoral expressando MAGE-A3 que irão consequentemente beneficiar de imunoterapia especifica para MAGE-A3.

Numa forma de realização, é proporcionado um conjunto de iniciadores consistindo dos seguintes pares de iniciadores: a) SEQ ID N°: 11 e 12.

Num aspecto adicional da presente invenção é proporcionada uma sonda consistindo na sequência nucleotidica de qualquer das SEQ ID N°: 17 tendo um corante fluorescente repórter na extremidade 5' e um extintor na extremidade 3' ou SEQ ID N°: 53. 14

Numa forma de realização adicional, é proporcionado um kit compreendendo: (i) um iniciador consistindo da SEQ ID N°: 11 (ii) um iniciador consistindo da SEQ ID N°: 12 e (iii) uma sonda consistindo da SEQ ID N°: 17 tendo 6-carboxifluoresceina na extremidade 5' e um extintor não fluorescente na extremidade 3'.

Numa forma de realização adicional, é proporcionado um kit compreendendo (I) um iniciador consistindo da SEQ ID N° 11, um iniciador consistindo da SEQ ID N° 12 e um sonda consistindo da SEQ ID N° 53.

Numa forma de realização adicional da presente invenção é proporcionado um método para determinar a presença ou ausência de MAGE-A3 em tecido tumoral fixado em formalina e embebido em Parafina (FFPE), compreendendo o passo de fazer contactar uma sequência nucleotidica isolada obtida ou derivada de tecido tumoral FFPE com um conjunto de iniciadores consistindo da SEQ ID N°: 11 e da SEQ ID N°: 12 e uma sonda de acordo com a reivindicação 2.

Num aspecto adicional é proporcionado um método de diagnóstico de doentes compreendendo o passo de fazer contactar uma sequência nucleotidica isolada obtida ou derivada de uma amostra de tecido tumoral FFPE com um conjunto de iniciadores consistindo da SEQ ID N° : 11 e da SEQ ID N° : 12 e uma sonda de 15 acordo com a reivindicação 2 e avaliar se MAGE-A3 é expresso na amostra. 0 método pode ainda compreender o passo de amplificar uma sequência nucleotidica e detectar a sequência nucleotidica amplificada na amostra. 0 método pode ainda compreender o passo de determinar se a sequência nucleotidica isolada híbrida com o iniciador ou a sonda sob condições restringentes, detectando deste modo se o tecido tumoral é positivo para MAGE-A3. Numa forma de realização, o método pode ainda compreender o passo de utilização de hibridação in situ para detectar se a sequência nucleotidica híbrida com o pelo menos um iniciador ou sonda.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Como aqui utilizado, a expressão "sequência alvo" é uma região da sequência de ácidos nucleicos MAGE-A3 (ADN ou ARN, e. g. ADN genómico, ARN mensageiro ou as suas versões amplificadas) com a qual a sequência da sonda ou do iniciador tem identidade parcial (i. e., com algum grau de emparelhamento incorrecto) ou total; apesar do iniciador inverso ser o complemento inverso (ou, como acima, tem algum grau de emparelhamento incorrecto) da sequência que este reconhece. A sequência alvo refere-se geralmente a uma região da sequência MAGE-A3 que difere em pelo menos um nucleótido em comparação com outra ou com todas as outras, sequências nucleotídicas MAGE-A. No entanto, em algumas formas de realização da presente invenção a sequência alvo pode, para um ou mais dos iniciadores e sonda, ser idêntica entre sequências nucleotídicas de MAGE-A, desde que pelo menos um ou 16 dois dos iniciadores e sonda a serem utilizados reconheçam uma sequência alvo que difira entre os genes a serem diferenciados.

Consequentemente, numa forma de realização, um iniciador ou sonda específico irá ligar-se à sequência MAGE-A3 alvo sem emparelhamentos incorrectos e ligar-se à região equivalente de uma outra sequência MAGE-A, por exemplo a sequência de MAGE-6, com emparelhamentos incorrectos de um ou mais pares de bases. A sequência alvo para os iniciadores ou sonda da presente invenção pode ser a sequência tendo as maiores diferenças (emparelhamentos incorrectos) entre os dois genes, para permitir detecção de MAGE-A3 com especificidade muito elevada.

Numa forma de realização da presente invenção, as sequências alvo estão nas regiões identificadas na caixa de texto da Figura 15.

Adequadamente, o iniciador ou a sonda pode ser pelo menos 95% idêntico(a) à sequência alvo ao longo do comprimento do iniciador ou da sonda, adequadamente mais de 95% idêntico tal como 96%, 97%, 98%, 99% e de, um modo muito preferido, tem 100% de identidade ao longo do seu comprimento, em comparação com a sequência MAGE-A3 alvo. Os iniciadores ou sondas da invenção podem ser idênticos à sequência alvo em todas as posições nucleotidicas do iniciador ou da sonda ou podem ter 1, 2 ou mais emparelhamentos incorrectos dependendo, por exemplo, do comprimento da sonda, temperatura, condições de reacção e exigências do ensaio. Desde que, evidentemente, o iniciador inverso preencha estas condições para a região que é o complemento inverso da sequência do iniciador. 17

Adequadamente, cada nucleótido do iniciador ou da sonda pode formar uma ligação de hidrogénio com o seu nucleótido alvo equivalente.

De um modo preferido a complementaridade do iniciador ou da sonda com a sequência alvo é avaliada pelo grau de emparelhamento de bases A:T e C:G, modo que um nucleótido adenina (A) emparelhe com uma timina (T) e de modo que um nucleótido guanina (G) emparelhe com uma citosina (C) ou vice-versa. Na forma de ARN, T pode ser substituída por U (uracilo).

Quando é utilizada inosina, por exemplo, em sondas universais, então a complementaridade pode ser também avaliada pelo grau de interacções nucleotídicas inosina (sonda)-alvo.

Consequentemente, a presente invenção proporciona um iniciador consistindo na sequência nucleotídica das SEQ ID N° 11-12, como mostrado nas Tabelas 1 e 2. 0 termo "iniciador" é aqui utilizado para significar qualquer sequência nucleotídica de cadeia simples capaz de ser utilizada como um iniciador em, por exemplo, tecnologia de PCR. Deste modo, um "iniciador", de acordo com a invenção refere-se a uma sequência oligonucleotídica de cadeia simples que é capaz de actuar como um ponto de iniciação para a síntese de um produto de extensão do iniciador que é substancialmente idêntico (para um iniciador directo) ou substancialmente o complemento inverso (para um iniciador inverso) da cadeia de ácido nucleico a ser copiada. A concepção (comprimento e sequência específica) do iniciador irá depender da natureza dos alvos de ADN e/ou de ARN e das condições em que o iniciador é utilizado (tais como temperatura e força iónica). 18

Como aqui utilizado, a expressão "condições restringentes" significa quaisquer condições de hibridação que permitam aos iniciadores ligarem-se especificamente a uma sequência nucleotidica dentro da sequência nucleotidica MAGE-A3, mas não a quaisquer outras sequências nucleotidicas MAGE. "Ligação específica" ou "hibridação específica" de uma sonda a uma região da sequência nucleotidica MAGE-A3 significa que o iniciador ou sonda forma um duplex (sequência nucleotidica de cadeia dupla) com parte desta região ou com a totalidade da região sob as condições experimentais utilizadas e que sob essas condições o iniciador ou a sonda não formam um duplex com outras regiões da sequência nucleotidica presente na amostra a ser analisada. Deve ser entendido que os iniciadores e sondas da presente invenção que são concebidos para hibridação específica dentro de uma região da sequência nucleotidica de MAGE-A3 podem situar-se totalmente dentro da referida região ou podem sobrepor-se à referida região numa grande extensão (i. e., formar um duplex com nucleótidos fora bem como dentro da referida região).

Adequadamente, a hibridação específica de uma sonda com uma região alvo de um ácido nucleico ocorre sob condições de hibridação "restringentes", tais como SSC 3X SDS a 0,1%, a 50 °C. O especialista na técnica sabe como variar os parâmetros de temperatura, comprimento da sonda e concentração salina de forma a poder ser obtida uma hibridação específica. São bem conhecidas e exemplificadas condições de hibridação e de lavagem em, por exemplo, Sambrook, et ai., Molecular Clonlng: Ά Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor, N.I., (1989), particularmente o Capítulo 11. 19 A presente invenção proporciona adicionalmente um conjunto de iniciadores consistindo nd seguintes par de iniciadores:

Conjunto 5: SEQ ID N°: 11 e 12 A presente invenção proporciona adicionalmente uma sonda compreendendo a sequência nucleotidica de qualquer das SEQ ID N°: 17 tendo um repórter fluorescente na extremidade 5' e um extintor não-fluorescente na extremidade 3' ou SEQ ID N°: 53. 0 termo "sonda" é aqui utilizado para significar qualquer sequência oligonucleotidica de cadeia simples capaz de se ligar a ácido nucleico e sendo utilizada como uma sonda em, por exemplo, tecnologia de PCR.

Numa forma de realização da invenção, em que seja utilizada uma sonda num método em combinação com um par de iniciadores, o par de iniciadores deve permitir a amplificação de parte ou da totalidade do fragmento do polinucleótido MAGE-A3 ao qual as sondas se podem ligar ou com o qual as sondas são imobilizadas sobre um suporte sólido. 0 iniciador e/ou sonda pode ainda compreender um marcador, permitindo que a sonda seja detectada. Exemplos de marcadores que podem ser utilizados incluem: marcadores fluorescentes, por exemplo, 6-carboxi-fluoresceína (6FAM™), NED™ (Applera Corporation), HEX™ ou VIC™ (Applied Biosystems); marcadores TAMRA™ (Applied Biosystems, CA, EUA); marcadores quimioluminescentes, por exemplo sondas de Ruténio; e marcadores radioactivos, por exemplo trítio na forma de timidina tritiada. Pode ser também utilizado fósforo-32 como um radiomarcador. 20

Numa forma de realização da presente invenção, a sonda pode compreender um corante repórter fluorescente na sua extremidade-5' e um corante extintor na sua extremidade-3'. 0 corante repórter fluorescente pode compreender 6-carboxi-fluoresceína (6FAM) e o corante extintor pode compreender um extintor não-fluorescente (NFQ). Opcionalmente, pode ser adicionada uma proteína Ligante do Sulco Menor (MGB™; Applied Biosystems, CA, EUA) à sonda, por exemplo na extremidade-3' da sonda.

Numa forma de realização, pode ser utilizada uma sonda MGB™ Eclipse (Epoch Biosciences, WA, EUA) . As sondas MGB™ Eclipse têm um Eclipse™ Dark Quencher e uma parte MGB™ colocados na extremidade-5' da sonda. Na extremidade-3' da sonda está localizado um corante repórter fluorescente.

Numa forma de realização, as sequências do iniciador e da sonda da presente invenção podem conter ou compreender bases ou estruturas nucleotídicas de ocorrência natural, por exemplo adenina (A), citosina (C) , guanina (G), timina (T) e uracilo (U) .

Numa forma de realização adicional, podem ser incluídos análogos sintéticos ou modificados de bases ou estruturas nucleotídicas na sequência da sonda. Por sintético ou modificado entende-se uma base ou estrutura nucleotídicas de ocorrência não-natural. Essas bases sintéticas ou modificadas podem substituir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou todas as bases na sequência da sonda. Numa forma de realização, a Citosina pode ser substituída por 5-Metil dC e a Timina pode ser substituída por 5-Propinil dU. Pode ser também incluído um Extintor BHQ2 dentro da sequência. 21 A presente invenção proporciona adicionalmente um kit como descrito nas reivindicações 3 ou 4.

As sequências de MAGE-A3 e MAGE-Αβ são altamente homólogas, tendo 98% de alinhamento das suas sequências nucleotidicas e 95% de alinhamento das suas sequências de proteína. É necessário identificar iniciadores e sondas capazes de discriminar entre MAGE-A3 e MAGE-Αβ, de forma a identificar especificamente as sequências MAGE-A3.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um conjunto de iniciadores e/ou sondas que hibridam especificamente com uma sequência alvo de MAGE-A3 sob condições restringentes em que pelo menos uma das sequências alvo do iniciador ou da sonda difere em pelo menos um nucleótido em comparação com a região equivalente de todas as outras sequências nucleotidicas MAGE A e em que o conjunto é capaz de diferenciar entre MAGE-A3 e MAGE-A6.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um conjunto de iniciadores e/ou sondas que hibridam especificamente com uma sequência alvo de MAGE-A3 sob condições restringentes em que pelo menos uma das sequências alvo do iniciador ou da sonda difere em pelo menos um nucleótido em comparação com a região equivalente da sequência nucleotídica MAGE A6 e em que o conjunto é capaz de discriminar entre MAGE-A3 e MAGE-A6.

Numa forma de realização, a sequência alvo de pelo menos um iniciador ou sonda pode diferir num nucleótido na sequência alvo de MAGE-A3, em comparação com a região equivalente de MAGE-A6. Numa forma de realização adicional, a sequência alvo de pelo menos um iniciador ou sonda pode diferir em dois nucleótidos em comparação com a região equivalente de MAGE-A6. 22

Numa forma de realização, um kit compreendendo dois iniciadores e uma sonda pode ter as seguintes diferenças nas sequências alvo dos iniciadores e sonda: (i) a sequência alvo de um dos dois iniciadores ou sondas difere num nucleótido entre MAGE-A3 e MAGE-A6; (ii) a sequência alvo de um iniciador ou sonda não referida na parte (i), difere num nucleótido entre MAGE-A3 e MAGE-A6; e (iii) a sequência alvo do iniciador ou da sonda restante é idêntica para MAGE-A3 e MAGE-A6;

Por exemplo, numa forma de realização, um kit compreendendo iniciador A, iniciador B e sonda C pode compreender as seguintes diferenças nas sequências alvo: (i) a sequência alvo do iniciador A difere num nucleótido entre MAGE-A3 e MAGE-A6; (ii) a sequência alvo do iniciador B difere em dois nucleótidos entre MAGE-A3 e MAGE-A6; e (111) a sequência alvo da sonda C é idêntica a MAGE—A3 e MAGE—A6.

Por exemplo, numa forma de realização, um kit compreendendo iniciador A, iniciador B e sonda C pode compreender as seguintes diferenças nas sequências alvo: (i) a sequência alvo do iniciador A difere em dois nucleótidos entre MAGE-A3 e MAGE-A6; 23 (ii) a sequência alvo do iniciador B é idêntica a MAGE-A3 e a MAGE-A6; e (iii) a sequência alvo da sonda C difere num nucleótido entre MAGE-A3 e MAGE-A6;

Por exemplo, numa forma de realização, um kit compreendendo iniciador A, iniciador B e sonda C pode compreender as seguintes diferenças nas sequências alvo: (i) a sequência alvo do iniciador A é idêntica tanto a MAGE-A3 como a MAGE-A6; (ii) a sequência alvo do iniciador B difere num nucleótido entre MAGE-A3 e MAGE-Αβ; e (iii) a sequência alvo da sonda C difere em dois nucleótidos entre MAGE-A3 e MAGE-A6;

Numa forma de realização, o kit pode compreender: o par dos iniciadores consistindo da SEQ ID N°: 11 e 12 e a sonda consistindo da SEQ ID N°: 17.

Numa forma de realização adicional da presente invenção é proporcionado um método para determinar a presença ou ausência de tecido tumoral de MAGE-A3 Fixado em Formalina Embebido em Parafina (FFPE), compreendendo o passo de fazer contactar uma sequência nucleotidica obtida ou derivada de uma amostra de tecido tumoral FFPE com um conjunto de iniciadores consistindo da SEQ ID N°: 11 e da SEQ ID N°: 12 e uma sonda de acordo com a reivindicação 2. Por tecido tumoral positivo para MAGE-A3 entendem-se quaisquer tumores ou células de tumor expressando o 24 antigénio MAGE-A3 que foram isolados de um doente. 0 método como aqui descrito pode ser utilizado para determinar se uma amostra biológica compreende ou consiste de tecido tumoral positivo para MAGE-A3.

Por amostra biológica entende-se uma amostra de tecido ou de células de um doente que foi removida ou isolada do doente. É proporcionado adicionalmente um método de diagnóstico de doentes compreendendo o passo de fazer contactar uma sequência nucleotidica obtida ou derivada de uma amostra de tecido tumoral FFPE com um conjunto de iniciadores consistindo da SEQ ID N°: 11 e da SEQ ID N°: 12 e uma sonda de acordo com a reivindicação 2 e avaliar se MAGE-A3 é expresso na amostra.

Numa forma de realização, a sequência nucleotidica é ou foi isolada a partir da amostra biológica. A espressão "obtida ou derivada de" como aqui utilizada pretende ser utilizada inclusivamente. Ou seja, é pretendido abranger qualquer sequência nucleotidica isolada directamente a partir de uma amostra de tumor ou qualquer sequência nucleotidica derivada da amostra por exemplo por utilização de transcrição reversa para produzir ARNm ou ADNc.

Um método da presente invenção pode ainda compreender amplificar a sequência nucleotidica e detectar a sequência nucleotidica amplificada na amostra. Alternativa ou adicionalmente, o método da presente invenção pode ainda compreender fazer contactar a sequência nucleotidica isolada ou amplificada com uma ou mais sondas como aqui descrito. 25

Numa forma de realização, a sequência nucleotídica é isolada ou purificada a partir da amostra de tumor. Em RT-PCR, a contaminação com ADN genómico pode ocasionar resultados falsos-positivos. Numa forma de realização, o ADN genómico é removido ou substancialmente removido da amostra a ser testada ou incluída nos métodos da presente invenção.

Os métodos da presente invenção são adequados para detectar tecido tumoral positivo para MAGE-A3. Numa forma de realização da presente invenção, pode ser detectado tecido positivo para MAGE-A3 utilizando hibridação in situ. Por hibridação in situ entende-se uma reacção de hibridação realizada utilizando um iniciador ou sonda de acordo com a presente invenção em cromossomas, células ou tecidos intactos isolados de um doente para visualização directa de locais morfológicos de sequências de ADN ou ARN específicas. A hibridação dos polinucleótidos pode ser realizada utilizando qualquer método de hibridação e sistema de detecção adequados. Os exemplos de sistemas de hibridação incluem métodos convencionais de transferência por gota, transferências de Southern e sanduíche. Por exemplo, um método adequado pode incluir uma abordagem de hibridação reversa, em que são imobilizadas sondas específicas para um tipo sobre um suporte sólido em localizações distintas conhecidas (pontos, linhas ou outras figuras) e os poli(ácidos nucleicos) amplificados são marcados para detectar a formação de híbridos. As sequências de ácido nucleico específicas para MAGE-A3, por exemplo uma sonda ou iniciador como aqui descritos, podem ser marcadas com biotina e o híbrido pode ser detectado através da ligação biotina-estreptavidina com um sistema de revelação de cor não-radioactivo. No entanto, podem ser também utilizados outros 26 sistemas de hibridação reversa, por exemplo, como ilustrado em Gravitt et al. , (Journal of Clinicai Microbiology, 1998, 36(10): 3020-3027) cujos conteúdos são também incorporados por referência. Em Kleter et al., Journal of Clinicai Microbiology, 1999, 37(8): 2508-2517 são descritas condições de hibridação e lavagem convencionais e serão optimizadas sob as circunstâncias proporcionadas para manter a especificidade e a sensibilidade requeridas pelo comprimento e pela sequência da(s) sonda(s) e do(s) iniciador(es) .

Numa forma de realização, o método da presente invenção pode compreender a utilização do par de iniciadores consistindo das SEQ ID N°: 11 e 12 e a sonda consistindo da SEQ ID N°: 17;

Estão disponíveis processos de extracção e purificação bem conhecidos para o isolamento de ARN ou ADN a partir de uma amostra (e. g., em Sambrook et al., 1989) . O ARN ou ADN pode ser utilizado directamente após extracção a partir da amostra ou, de um modo mais preferido, após um passo de amplificação polinucleotídica (e. g., PCR) . Em casos específicos, tal como para ensaios de hibridação reversa, pode ser necessário transcrever reversamente ARN em ADNc antes da amplificação. Em ambos os últimos casos o polinucleótido amplificado é "derivado" da amostra.

Deste modo, a presente invenção proporciona um método para rastrear, em aplicações clínicas, amostras de tecido provenientes de um doente humano para a presença ou ausência de expressão de MAGE-A3. Essas amostras podem consistir de, por exemplo, núcleos de biópsia com agulha, amostras de ressecção cirúrgica ou tecido de nódulo linfático. Por exemplo, estes métodos incluem obter uma biópsia, que é opcionalmente fraccionada por seccionamento com 27 crypstat para enriquecer as células tumorais para cerca de 80% da população celular total. Em determinadas formas de realização, podem ser extraídos ácidos nucleicos a partir destas amostras utilizando técnicas bem conhecidas na técnica. Noutras formas de realização podem ser amplificados ácidos nucleicos extraídos da amostra de tecido utilizando técnicas bem conhecidas na técnica. O nível de expressão de MAGE-A3 pode ser detectado e pode ser comparado com grupos estatisticamente válidos e/ou controlos de doentes negativos para MAGE-A3.

Numa forma de realização, o método de diagnóstico compreende determinar se um indivíduo expressa o produto de gene MAGE-A3, por exemplo por detecção do nível correspondente de proteína e/ou ARNm do produto génico. Por exemplo, pela utilização de técnicas, tais como análise de transferência de Northern, transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR), RT-PCR semi-quantitativa, RT-PCR quantitativa, PCR com TaqMan, hibridação in situ, imunoprecipitação, análise de transferência de Western ou imuno-histoquímica. De acordo com esse método, podem ser obtidos células ou tecido de um indivíduo e pode ser comparado o nível de ARNm e/ou de proteína com os de tecido não expressando MAGE-A3.

Tecnologia de PCR com TaqMan A Polimerase de ADN Taq tem actividade exonucleásica 5'-3'. O ensaio PCR com Taqman utiliza esta actividade exonucleásica para quebrar sondas marcadas duplamente ligadas a sequências alvo durante a amplificação por PCR.

Resumidamente, é extraído ARN a partir de uma amostra e é sintetizado ADNc (transcrição reversa). O ADNc é então adicionado 28 numa mistura de reacção de PCR contendo componentes de PCR convencionais (ver, por exemplo, componentes fornecidos por Roche (CA, EUA) para PCR com Taqman. A mistura de reacção contém adicionalmente uma sonda que se liga à sequência nucleotidica molde entre os dois iniciadores (i. e., dentro da sequência amplificada pela reacção PCR, o "amplicão"). A sonda compreende um corante repórter fluorescente na extremidade-5' e um corante extintor na extremidade-3'. 0 extintor é capaz de extinguir a fluorescência repórter, mas apenas quando os dois corantes estiverem próximos entre si; isto ocorre em sondas intactas.

Durante e após a amplificação, a sonda é degradada pela Polimerase de ADN Taq e qualquer fluorescência é detectada.

Para medições quantitativas, é utilizado o número de ciclos de PCR em que a fluorescência atinge um valor limiar de 10 vezes o desvio padrão da emissão da linha de base. Este número de ciclos, designado limiar de ciclos (Ct), é inversamente proporcional à quantidade inicial de ADNc alvo e permite que seja medida a quantidade de ADNc. Essencialmente, quanto mais ARN alvo estiver presente numa amostra, menor irá ser o número de Ct obtido.

As medições obtidas para o valor de Ct são comparadas com as obtidas para um gene de manutenção. Isto leva em consideração quaisquer erros baseados na quantidade de ARN total adicionado a cada reacção de transcrição reversa (baseado na absorvência de comprimento de onda) e sua qualidade (i. e., degradação): nenhuns dos quais são parâmetros fiáveis para medir o material inicial. Consequentemente, são quantificados transcritos de um gene de manutenção como um controlo endógeno. A beta-actina é um dos 29 genes de manutenção mais utilizados, embora possam ser utilizados outros.

Ao longo desta descrição e nas reivindicações que se seguem, a menos que o contexto determine de outra forma, a palavra "compreender" e variações, tais como "compreende" e "compreendendo", serão entendidas como sugerindo a inclusão de um número inteiro ou de um passo especificado ou um grupo de números inteiros ou de passos especificados, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou passo ou grupo de números inteiros ou de passos. A invenção irá ser descrita adicionalmente por referência aos seguintes exemplos não limitativos, em que RT-PCR se refere à reacção de transcrição reversa em cadeia da polimerase:

EXEMPLOS

Exemplo 1 PCR semi-quantitativa - amostras de tecido congelado

Iniciadores: SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 2

Extracção de ARN: Método de purificação de ARN em azoto líquido

Foi congelado rapidamente um pequeno pedaço de tecido em azoto liquido e depois colocado num almofariz para trituração mecânica com um pilão. Foram adicionados 100 mg do pó resultante a 100 pL de reagente de isolamento TriPure e foi extraído ARN de 30 acordo com as instruções do fabricante (Qiagen, Venlo, Holanda). A concentração de ARN foi determinada a partir do valor de densidade óptica a 260 nm. RT-PCR semi-quantitativa de MAGE-A3 A RT-PCR semi-quantitativa foi realizada como descrito por De Plaen et al. (Immunogenetics 40:360, 1994). A síntese de ADNc a partir de 2 pg de ARN total foi realizada numa mistura de 20 pL contendo tampão de primeira cadeia lx, cada dNTP 0,5 mM, ditiotreitol 10 mM, 20 U de inibidor de rARNase, oligo (dT)15 2 pM e 200 U de transcriptase reversa M-MLV durante 1 h 30 a 42 °C. Foram amplificadas 50 ng de ADNc por PCR numa mistura de 25 pL contendo iniciadores específicos para MAGE-A3 (SEQ ID N° 1 e 2) . Foi separada uma alíquota de 10 pL de cada reacção numa eletroforese em gel de agarose a 1% e visualizada por fluorescência de brometo de etídio. Os tamanhos dos amplicões são 725 pb e 805 pb quando são amplificados ARNm e ADN genómico (ADNg), respectivamente.

Controlos positivos para RT-PCR Semi-quantitativa de MAGE-A3:

Foram introduzidos três controlos para estas experiências: (i) Foi adicionado um fragmento clonado de ADN genómico de MAGE-A3 a cada mistura de reacção de PCR. Isto produz um fragmento de 805 pb (80 pb maior do que o fragmento produzido a partir do ADNc) e está sempre presente na ausência de inibição da 31 PCR. Este actua como um controlo positivo para verificar a eficiência da PCR em amostras negativas para MAGE-A3; (ii) Para cada ensaio de MAGE-A3, foi realizada síntese de ADNc em paralelo em amostras tumorais e em ARN extraído da linha celular de melanoma "Geri" MZ-2-3.0. Para serem consideradas "positivas", as amostras tumorais têm que originar um sinal a 1% do nível de ADNc da linha celular Geri MZ-2-3.0. (iii) Foi realizada PCR para a beta-actina (Tabela 1) em cada amostra para detectar amostras com ARN fortemente degradado. Se o sinal da beta-actina produzido a partir de uma amostra de tumor negativa para MAGE-A3 era mais fraco do que o sinal produzido a partir de MZ-2-3.0 o número de ciclos foi ajustado para a amostra clínica de modo que a intensidade do amplicão da beta-actina alcançasse o nível requerido.

Controlos negativos para RT-PCR Semi-quantitativa de MAGE-A3.

Foram introduzidos três controlos negativos para estas experiências: (i) ARN extraído da cultura celular LB 23-1/2, conhecida por ser negativa para MAGE-A3; (ii) controlo de água na reacção RT; e (iii) controlo de água nas etapas de PCR. 32

Interpretação dos dados

Uma amostra de 50 ng de ARNm de uma amostra de tumor foi considerada positiva para MAGE-A3 quando a quantidade de amplicão de 725 pb foi igual ou superior à quantidade de amplicão obtida utilizando 0,5 ng de ARN provenientes do ARN da linha celular Geri MZ-2-3.0 (i. e. equivalente a ARN de GERL a 1%; ver controlos positivos). As quantidades foram estimadas por fluorescência de brometo de etidio. Foram adicionados controlos negativos e positivos.

Classes para RT-PCR semi-quantitativa de MAGE-A3: foram atribuídas cinco classes padrão (De Plaen et ai., 1994) a um ensaio de RT-PCR semi-quantitativa de MAGE-A3. Estas são uma medição subjectiva e foram, da expressão mais baixa para a mais elevada -, -/+, +, ++, +++. Na Figura 16 é mostrado um exemplo em como estas classes podem ser atribuídas: nesta figura, as classes são atribuídas de acordo com a banda produzida pelo controlo positivo como mostrado na Tabela 6, abaixo:

Tabela 6

Controlo positivo de ARN 100 50 10 2 1 0,5 Classe + + + + + + +/-

Exemplo 2: RT-PCR Quantitativa com Taqman em Tempo

Real - Amostras de tecido congelado 33 RT-PCR quantitativa com Taqman em tempo real:

Iniciadores: SEQ ID N° : 3 e SEQ ID N° : 4; Sonda: SEQ ID N° : 13 (exão)

Iniciadores: SEQ ID N°: 5 e SEQ ID N° : 6; Sonda: SEQ ID N° : 14 (intrão) PCR semi-quantitativa (para estudos de comparação): Iniciadores: SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 2

Materiais e Métodos

Doentes e recolha de amostra

Foram obtidas biópsias de tumores de Carcinoma de células não pequenas do pulmão (NSCLC) nos estádios IB e II, por cirurgia. Os doentes foram inscritos em dois testes clínicos, GSK 249553/004 (MAGE3-AS02B-004) e Epidemio-MAGE3-153; os doentes assinaram o termo de responsabilidade e foi-lhes explicada a natureza e as possíveis consequências dos estudos. Foram imersas biópsias em solução estabilizadora de ARN (RNAlater, Ambion, Cambridge, UK) directamente após ressecção cirúrgica e armazenadas a -20 °C. O RNAlater é um reagente de armazenamento de tecidos que estabiliza e protege o ARN celular em amostras de tecido não-congeladas, intactas. O RNAlater elimina a necessidade de congelar imediatamente as amostras em azoto líquido. 34

Extracçao de ARN: método de purificação de ARN em moinho misturador 0 tecido tumoral é removido do RNAlater e adicionado ao TriPure Isolation Reagent (Roche, Vilvoorde, Belgium). 0 tecido é então adicionado a um Moinho Misturador contendo bolas de tungsténio. Após desagregação no Moinho Misturador, foi extraído o ARN celular total a partir de um máximo de 100 mg de tecido utilizando o reagente TriPure de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen, Venlo, Holanda). A concentração de ARN foi determinada a partir do valor de densidade óptica a 260 nm.

Ensaio de RT-PCR com TaqMan de MAGE-A3 - tecido congelado.

Foi amplificado por PCR ADNc correspondendo a 50 ng de ARN total numa mistura de 25 pL contendo tampão TaqMan, MgC12 5 mM, dUTP 0,4 mM, cada nucleótido 0,2 mM, 0,625 U de Polimerase de ADN Ampli Taq Gold, 0,05 U de UNG, cada dos iniciadores oligonucleot ídicos 0,2 μΜ e uma sonda TaqMan 0,2 μΜ. Foram utilizados sondas e iniciadores oligonucleotídicos específicos (Tabela 2; SEQ ID 3, 4 e 13 e SEQ ID 5, 6 e 14. As sondas estão marcadas com os corantes FAM , NED e VIC (Applied Biosystems, CA, EUA) e têm um Parte de Ligação ao Sulco Menor (MGB™; também de Applied Biosystems, CA, EUA). Estão agora a ser realizadas outras experiências utilizando o corante FAM em vez de NED para as sondas específicas para MAGE. O exão MAGE-A3 e os genes da beta-actina e foram amplificados por PCR quantitativa utilizando química TaqMan no sistema 7700 ou 7900 (PE Applied Biosystems, Warrington, UK). Foi também realizada amplificação por PCR num intrão do gene MAGE-A3 35 para verificar a ausência de contaminação por ADN genómico. 0 perfil de amplificação foi 1 ciclo de 2 min a 50 °C, 1 ciclo de 12 min a 95 °C e 35 ciclos de 15 s a 95 °C e 1 min a 60 °C. O sinal fluorescente produzido pela degradação da sonda TaqMan foi detectado em tempo real durante todas as etapas de alongamento.

Validação do ensaio de RT-PCR com TaqMan para determinar a especificidade para MAGE-A3

Iniciadores: SEQ ID N° : 3 e SEQ ID N° : 4; Sonda: SEQ ID N° : 13 (exão) - RT-PCR com Taqman

Iniciadores: SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 2 (PCR semi-quantitativa -para estudos de comparação)

Plasmídeos e linhas celulares

Os plasmídeos utilizados continham o ADNc completo dos genes MAGE-Al (MAGE-1; Acesso GenBank NM 004988), MAGE-A2 (MAGE-2; Acesso GenBank L18920), MAGE-A3 (MAGE-A3; Acesso GenBank

NM 005362), MAGE-A4 (MAGE-4; Acesso GenBank 002362), MAGE-A6 (MAGE-6; Acesso GenBank NM 005363), MAGE-A8 (MAGE-8; Acesso GenBank NM 005364), MAGE-A9 (MAGE-9; Acesso GenBank NM 005365) , MAGE-A10 (MAGE-10; Acesso GenBank NM 021048), MAGE-Al 1 (MAGE-11; Acesso GenBank NM 005366) e MAGE-Al2 (MAGE-12; Acesso GenBank NM 005367). As linhas celulares MZ-2-3.0 (positiva para MAGE-A3) e LB 23-1/2 (negativa para MAGE-A3) foram uma oferta amável do Professor Thierry Boon, Ludwig Institute, Bruxelas, Bélgica. 36

Foi testada a especificidade do método com TaqMan para MAGE-A3 utilizando 1 x 104, 1 x 105 e 1 x 106 cópias dos plasmídeos contendo ADNc completo dos genes MAGE-A1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11 e 12.

Na Figura 14 é mostrada uma comparação da sequência dos genes MAGE A (MAGE 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11 e 12) na área dos iniciadores de PCR e sondas de MAGE-A3 concebidas. As sequências dos iniciadores directo e inverso MAGE-A3 estão sublinhadas; a sequência da sonda MAGE-A3 está dentro de uma caixa de texto. Os iniciadores inversos são complementares à região da sequência que reconhecem, i. e., A é T; G é C; T é A; e C é G.

Controlos positivos para RT-PCR com TaqMan de MAGE-A3: (i)

Um fragmento de ADN genómico de MAGE-A3 e (i i) quantidades conhecidas de ARN extraído da linha celular Geri MZ-2-3.0 (uma linha celular de melanoma positiva para MAGE-A3).

Controlos negativos para RT-PCR com TaqMan de MAGE-A3: (i) ARN extraído da cultura celular LB 23-1/2, conhecida por ser negativa para MAGE-A3, (ii) branco com água na reacção RT e (iii) branco com água nas etapas da PCR. São realizados 40 ciclos de RT-PCR. O controlo negativo deve ser > 35. Alguns dos resultados das experiências de TaqMan foram representados como 1/Ct.

Estatística: Comparação entre duas técnicas de PCR

Foi criada uma tabela de contingência 2x2 para comparar os resultados provenientes da RT-PCR semi-quantitativa (iniciadores 37 da SEQ ID N°: 1 e da SEQ ID N°: 2) e da PCR quantitativa com TaqMan em tempo real (Iniciadores: SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4; Sonda: SEQ ID N° : 13), utilizando as técnicas aqui descritas (Tabela 3). A variável de escala nominal apresentou dois valores: positivo e negativo. Os valores negativos incluíram zero e classificações de limiar; classificação de limiar significa que a classificação está entre Geri a 0,8% e 1,2% a partir da RT-PCR semi-quantitativa e todos os resultados abaixo de 1% a partir do ensaio TaqMan. Os valores positivos foram classificados com base na pontuação visível das bandas de gel em relação à expressão da beta-actina para o método de RT-PCR semi-quantitativa e incluíram todos os resultados > 1% do ensaio TaqMan. A concordância entre ambos os métodos foi calculada como o número de amostras duplamente negativas mais as duplamente positivas dividido pelo número total de amostras. Foi utilizado o teste de McNemar para comparar proporções de pares discordantes (negativo-positivo). Foram calculados intervalos de confiança (Cl).

Optimização da RT-PCR com TaqMan, Quantitativa RT-PCR com TaqMan para MAGE-A3 utilizando Sybr green.

Sybr green é um componente que se liga de modo não selectivo a amplicões, sem uma sonda específica para uma sequência. Foi realizada RT-PCR em tempo real nos clones de genes da família MAGE-A, utilizando quatro diluições diferentes dos clones MAGE-A (20 pg, 2 pg, 0,2 pg e 0,02 pg) (Figura 1, em que os resultados são mostrados como 1/CT no eixo do Y) . Foi obtido um resultado positivo para MAGE-A3 a Ct 14 e foi obtido um valor de Ct 16 para MAGE-A6 (a 20 pg de plasmídeos). MAGE A4, A8 e A9 apresentaram um 38 nível de Ct de 30 e os outros genes MAGE apresentaram expressão muito limitada em Ct 35 e acima. RT-PCR com TaqMan para MAGE-A3 utilizando uma sonda específica para uma sequência.

Foi testada a eficiência da discriminação entre MAGE-A3 e A6 utilizando diluições diferentes dos clones relevantes dos membros da família MAGE-A (Figura 2), utilizando os mesmos iniciadores MAGE-A3 (SEQ ID 3 e 4) mas com uma sonda (SEQ ID N° 13) . Em primeiro lugar, o Ct para MAGE-A3 teve um decréscimo esperado em cada uma das diluições. O clone MAGE-A6 não apresentou um 1/Ct elevado quando é utilizada uma sonda, indicando ausência de reactividade cruzada. A adição de 1 x 106 plasmídeos MAGE-A6 à diluição do plasmídeo MAGE-A3, como mostrado na Figura 3, não tem qualquer efeito e os resultados espelham o resultado da titulação do plasmídeo MAGE-A3. Isto demonstra a ausência de efeito competitivo de MAGE-A6 na presença de MAGE-A3 utilizando PCR com Taqman.

Resultados

Expressão tumoral de MAGE-A3, comparação entre os métodos semi-quantitativo e quantitativo A PCR quantitativa específica com TaqMan foi adicionalmente avaliada contra a RT-PCR semi-quantitativa convencional para MAGE-A3 (utilizando os iniciadores SEQ ID N° 1 e 2) . Foram 39 utilizadas 71 amostras tumorais provenientes de doentes com NSCLC para comparar directamente entre métodos quantitativos (utilizando os iniciadores SEQ ID N°: 3 e 4 e a sonda SEQ ID N°: 13) e semi-quantitativos da expressão de MAGE-A3 (utilizando os iniciadores SEQ ID N°: 1 e 2).

Os resultados indicam uma boa concordância de 95,8% (Tabela 3) entre os dois métodos com 68/71 em concordância. 0 ensaio de RT-PCR com TaqMan quantitativa e o ensaio de RT-PCR semi-quantitativa foram discordantes para três amostras, em que o ensaio de RT-PCR semi-quantitativa sobrestimou a positividade dos resultados. No entanto, o teste de McNemar revelou uma repartição simétrica destes três resultados discordantes (p = 0,25), indicando que nenhuma das técnicas tendeu a produzir resultados mais discordantes em comparação com a outra técnica. Numa investigação mais rigorosa, o nivel variável de expressão da beta-actina nestas amostras resultou num falso positivo para o método de RT-PCR semi-quantitativa.

Foi utilizado um diagrama de caixa (Figura 4) para representar a dispersão dos dados da PCR com Taqman para cada classe definida para a RT-PCR semi-quantitativa. Embora a concordância entre ambos os métodos, baseada na tabela de contingência 2x2, fosse excelente, os diagramas de caixa revelaram alguma sobreposição entre as diferentes classes, indicando que a avaliação semi-quantitativa não coincidiu completamente com a medição por RT-PCR com TaqMan quantitativa. A sobreposição pode ser devida ao facto da avaliação ter sido realizada por operadores diferentes em ocasiões diferentes, o que pode aumentar a variabilidade. Neste sentido, o ensaio de RT-PCR com TaqMan quantitativa é muito mais independente desses factores e deste modo mais reproduzível. 40 EXEMPLO 3: Análise por RT-PCR de tecido fixado em parafina (FFPE)

MATERIAIS E MÉTODOS

Foi extraído ARN a partir de amostras FFPE utilizando um método patenteado de Response Genetics Inc., como descrito nas patentes US: US6613518; US6610488; US6428963; US6248535, aqui incorporadas por referência. Alternativamente pode ser obtido ARN de tecido fixado em parafina de acordo com qualquer método adequado publicado. Por exemplo, podem ser removidas secções de tecido da parafina utilizando d-limoneno ou outro tampão de lise e depois lavadas numa solução baseada em etanol. As secções podem ser depois tratadas com proteinase K, de um dia para o outro, e depois lavadas e o ARN pode ser purificado utilizando cromatografia em coluna. Foi realizada RT-PCR com Taqman em Tempo Real nas amostras utilizando os iniciadores SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4 e a sonda SEQ ID N°: 13; iniciadores e sondas desenvolvidos para utilização em tecido congelado (ver Exemplo 2, acima). RESULTADOS: Expressão de Mage A3 A Tabela 4 mostra os resultados expressos como valores de Ct, para tecido Fixado em Formalina, Embebido em Parafina (FFPE). Os números do eixo do Y representam as amostra de tumor humano 990118-990784. Foram também incluídos controlos positivos na análise: TC1 (Mage3); Geri (linha celular de melanoma MAGE-A3); e CRL 1675 (linha celular de melanoma) . Os valores de Ct são mais elevados do que o que seria esperado para iniciadores MAGE-A3 em RT-PCR semi-quantitativa baseada em tecido congelado. O nível de Ct de 36-37 é considerado o limite superior de sensibilidade para 41 o objectivo destas experiências. 0 controlo positivo para Geri MAGE-A3 está no Ct de 31 e precisamente dentro do limite de sensibilidade mas significativamente reduzido do ensaio de RT-PCR semi-quantitativa. Com estes niveis os iniciadores e a sonda para a quantificação de MAGE-A3 em tecido congelado (Tabela 2, iniciadores específicos para o exão 3 de MAGE-A3 SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4 e sonda SEQ ID N°: 13) podem não ser suficientemente sensíveis para detectar a expressão de MAGE-A3 em amostras tumorais FFPE: amostras que são positivas para MAGE-A3 mas expressam MAGE-A3 apenas em níveis baixos podem não ser detectadas.

Foram incluídas na experiência amostras de controlos positivos provenientes de tecido FFPE: TC1 (Mage3) e Geri (controlo positivo para MAGE-A3) e CRL 1675. Foram analisados os tumores 990118-990784 humanos por RT-PCR com Taqman quantitativa utilizando os iniciadores para tecido congelado SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4 e a sonda SEQ ID N°: 13 utilizando ARN de tecido em parafina. O resultado desta análise é mostrado na Figura 5.

Nova concepção dos iniciadores TaqMan para MAGE-A3 para utilização em tecido FFPE O tamanho do amplicão para o ensaio de MAGE-A3 de tecido congelado baseado em ARNLater, (descrito no exemplo 2) tem mais de 100 pb. Para se obterem resultados mais sensíveis para ARN degradado encontrado em amostras FFPE, foram concebidos novos iniciadores para reduzir o tamanho do amplicão, para aumentar a sensibilidade do ensaio de MAGE-A3 (Tabela 5). Foi utilizada uma sonda MGB™ (Ligação ao Sulco Menor) para aumentar a especificidade dos ensaios, para ambos os ensaios descritos nos 42

Exemplos 2 e 3. A sonda MGB liga-se ao sulco menor do ADN formando um duplex extremamente estável resultando num aumento da especificidade de iniciador.

Teste de novos iniciadores MAGE-A3 para especificidade e sensibilidade

Os conjuntos dos iniciadores recém concebidos (Tabela 5) foram testados em ADNc de membros da família de genes Mage-A (Figura 6a), em que o Conjunto 1 é iniciadores: SEQ ID N° : 7, SEQ ID N°: 8, sonda: SEQ ID N°: 15; Conjunto 2 é iniciadores: SEQ ID N° : 9, SEQ ID N° : 10, sonda: SEQ ID N° : 16; Conjunto 3 é iniciadores: SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12, sonda: SEQ ID N°: 17; e Conjunto 4 é iniciadores: SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, sonda: SEQ ID N°: 13.

Como mostrado na Figura 6a, os iniciadores SEQ ID N°: 7 e 8 têm níveis de Ct elevados para MAGE-A3 mas também para Mage-2 e Mage-12. Os iniciadores SEQ ID N° : 9 e 10 têm níveis de Ct elevados para MAGE-A3 e Ct baixo para MAGE-A6 mas este está fora da gama normal de expressão de MAGE-A3. Os iniciadores SEQ ID N°: 11 e 12 são ligeiramente menos sensíveis que os SEQ ID N° : 9 e 10. Deste modo, nas presentes experiências, os iniciadores SEQ ID N° : 9 e 10 foram seleccionados para serem testados adicionalmente em tecido FFPE. Estes iniciadores SEQ ID N°: 9 e 10 foram testados adicionalmente numa diluição em série de ARN e apresentaram uma boa gama linear até às diluições mais baixas, sugerindo que os iniciadores devem ter uma boa sensibilidade e são adequados para o ensaio (Figura 6b). 43

Comparaçao entre ensaios TaqMan em tecido congelado vs. FFPE para MAGE-A3

Foram comparadas quarenta e duas amostras tumorais FFPE utilizando os iniciadores SEQ ID N° : 9, SEQ ID N° : 10 e a sonda SEQ ID N° : 16 com o mesmo ensaio realizado em tecido congelado utilizando os iniciadores SEQ ID N° : 3, SEQ ID N° : 4 e a sonda SEQ ID N°: 13 (Figura 7) . O nível de positividade do ensaio é estabelecido com geri a 1% (controlo positivo) e parece existir alguma concordância entre os dois ensaios, comparando directamente. Existem alguns doentes MAGE-A3 positivos para MAGE-A3 que não concordaram com o ensaio de MAGE-A3 em tecido congelado; isto poderá ser explicado pela macrodissecação das áreas tumorais originando um aumento da pureza das células tumorais que expressam o MAGE-A3. A remoção da maioria das células normais diluentes originou um resultado positivo para MAGE-A3. Foi verificado um valor de R2 (teste estatístico para correlação linear) de 0,92 entre o tecido FFPE e o tecido congelado em RNAlater sugerindo uma boa correlação entre os dois métodos (Figura 8) 44 EXEMPLO 4 - Teste COBAS™ Taqman de MAGE-A3

Tabela 7

Sequências da sonda e do iniciador COBAS™ TaqMan para MAGE-A3

Sequências dos Iniciadores COBAS™ TaqMan para MAGE-A3 MAGEA3f-623F: (HW_MAGEA3_F; SEQ ID N°: 11) 5'TGTCGTCGGAAATTGGCAGTAT3' MAGEA3Í-697R: (HW_MAGEA3_R; SEQ ID N°: 12) 5'CAAAGACCAGCTGCAAGGAACT3' Sequência da Sonda COBAS™ TaqMan para MAGE-A3 MAGEA3F-6 46MOD SEQ ID N°: 53 5'CAAAGACCAGCTGCAAGGAACT 3'

E= Corante Repórter FAM, F= 5-Metil dC, Q = Extintor BHQ2, L = 5-Propinil dU, P= Fosfato, I = Repórter HEX A sequência da sonda MAGEA3F-646MOD compreende os seguintes nucleótidos modificados (SEQ ID N°: 54): 5' - TCTTTCCTGTGATCTTCAGCAAAGCTTC - 3' 45

Tabela 8

Sequências da sonda e do iniciador COBAS TaqMan para beta-actina

Sequências do iniciador TaqMan para a beta-actina RGI_BACT_F2: (SEQ ID N°: 55) 5'-GAGCGCGGCTACAGCTT-3’ RGI_BACT_R2: (SEQ ID N°: 56) 5'-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’ Sequência da sonda beta-actina TaqMan HW_RGIBACT_H: (SEQ ID N°: 57) 5'-IACCACCAQCGGCCGAGCGGP-3'

E= Corante Repórter FAM, F= 5-Metil dC, Q = Extintor BHQ2, L = 5-Propinil dU, P= Fosfato, I = Repórter HEX

Tabela 9

Gama de CT válida do controlo e da amostra

Controlos Gama de Ct válida Gene Mage da amostra FFPET 50 ng FAM <35, 2 Gene Bactina da amostra FFPET 50 n HEX <32,1 Gene Mage de Geri a 100% 50 ng FAM 26,0-29,5 Gene Bactina de Geri a 100% 50 ng HEX 24,0-27,0 Gene Mage de Geri a 1% 50 ng FAM 33,0-35,5 Gene Bactina de Geri a 1% 0,5 ng HEX 29,0-32,5 Gene Mage de UHR a 100% 50 ng FAM 25,0-28,0 Gene Bactina de UHR a 100% 50 ng HEX 22,0-25,0 Gene Mage de UHR a 1% 0,5 ng FAM 31,0-33,0 46 (continuação)

Gene Bactina de UHR a 1% 0,5 ng HEX 27,0-29,0 ADN de Controlo Positivo P53 20 ng FAM 26,5-29,0 Controlo Negativo (NC) >38,0

Tabela 10

Perfil de ciclos térmicos

Perfil térmico da PCR para a experiência de exclusividade para MAGE-A3

Passos Descrição Temperatura Tempo Número de ciclos 1 Descontaminação UNG 50 °C 5 min. 1 X 2 Desnaturação ΟΊ O O 15 seg. 2 X Ligação 63 °C 25 seg. 3 Desnaturação 92 °C 15 seg. 53 X Ligação 63 °C 50 seg. 4 Pós-Ciclo O o O 2 min. 1 X 47

Tabela 11

Experiências de Perfil térmico da RT-PCR para Linearidade e Eficiência da RT-PCR, Sensibilidade Analítica (Limite de

Detecção), Correlação do Método e Reprodutibilidade

Passos Descrição Temperatura Tempo Número de ciclos 1 Descontaminação UNG 50 °C 5 min. 1 X 2 Desnaturação 95 °C 1 min. 1 X 3 Transcrição Reversa O o O kO 20 min. 1 X 4 Desnaturação 95 °C 15 seg. 2 X Ligação 63 °C 25 seg. 6 Desnaturação 92 °C 15 seg. 53 X Ligação 63 °C 50 seg. 7 Pós-Ciclo O O O 2 min. 1 X

Foi implementada uma temperatura de ligação relativamente elevada de 63 °C para melhorar a especificidade para MAGE-A3 em relação aos outros membros da família MAGE-A.

Análise dos Dados

Os valores de Ct para MAGE-A3 e β-actina são calculados utilizando o software AMPLILINK™ 3.1 (Roche, CA, EUA) na estação de trabalho COBAS™ TaqMan 48 Analyzer (Roche, CA, EUA) com base em parâmetros de ensaio definidos no Ficheiro de Definição de Teste. A análise de dados para a expressão génica irá ser realizada por extracção dos valores de Ct para MAGE-A3 e β-actina a partir de AMPLILINK™ para cálculos a jusante para determinar expressão do gene MAGE-A3 em relação ao gene da β-actina. Serão incluídos controlos para cada corrida, para estabelecer o nível 48 limiar de expressão de MAGE-A3 que deve ser atingido ou ultrapassado para que a amostra seja designada positiva para MAGE-A3. É utilizado ARN da linha celular GERL, como um controlo positivo. É diluído ARN de GERL 1:100 (GERL a 1%) em água e foi determinado o Ct para MAGE-A3. Além disso, é testado ARN de GERL não diluído (GERL a 100%) sem diluição para a medição do Ct para a β-actina. É calculado um valor de delta Ct entre o Ct para a β-actina do controlo de GERL a 100% menos o Ct para MAGE-A3 do controlo de GERL a 1% e é determinada expressão relativa de MAGE-A3 baseada no cálculo abaixo:

Expressão Limiar de MAGE-A3 2Λ(

Ct para a β-actina de GERL a 100%

Ct para MAGE-A3 de GERL a 1%)

Irá ser utilizada a mesma estratégia de controlo para amostras incluídas em parafina, excepto por o ARN de Xenoenxerto GERL FFPE extraído utilizando o método QIAGEN FFPE ir substituir o ARN da linha celular GERL para o estabelecimento da expressão limiar. dado que o teste COBAS™ Taqman para MAGE-A3 é uma reacção multiplex, os valores do Ct para MAGE-A3 e β-actina são derivados do mesmo tubo de reacção. A expressão relativa de MAGE-A3 é calculada para cada amostra de teste pela seguinte equação:

Expressão de MAGE-A3 na amostra do teste = 2λ (a ^ a p~actlna ^ “ ct ^ ^ “ΟΞίΓί1)

Se a Expressão de MAGE-A3 na amostra de teste for maior ou igual à do nível limiar de MAGE-A3 estabelecido a partir dos Controlos de ARN de GERL, então a amostra é designada positiva para MAGE-A3. Se a Expressão de MAGE-A3 na amostra de teste for menor do que a do nível limiar de MAGE-A3 estabelecido a partir dos Controlos, então a amostra é designada negativa para MAGE-A3. 49 A expressão de MAGE-A3 irá ser determinada realizando a média dos valores do Ct para MAGE-A3 e do Ct para a β-actina a partir dos replicados para cada espécime para o cálculo do delta Ct (Ct para a β-actina - Ct para MAGE-A3). Se um replicado tem um Ct para MAGE-A3 ou um Ct para a β-actina menor do que o Ct de exclusão do teste, mas o outro replicado tem um Ct para MAGE-A3 ou um Ct para a β-actina Ct maior do que o Ct de exclusão, a amostra irá ser testada de novo. Se ambos os replicados têm Ct para a β-actina maiores do que o Ct de exclusão, a amostra é assinalada como Ct para a β-actina fora da gama e não é proporcionado qualquer resultado. Se ambos os replicados têm valores de Ct para MAGE-A3 Ct maiores do que o valor de Ct de exclusão para MAGE-A3, mas a expressão de MAGE-A3 está acima do limiar, então a amostra é assinalada como Ct para MAGE-A3 fora da gama e não é proporcionado qualquer resultado. Esta estratégia para análise de dados é consistente com os estudos de validação cruzada realizados para a correlação de método que são descritos na Secção abaixo "Correlação de Método".

Para o teste COBAS™ Taqman para MAGE-A3, o Human QPCR Human Reference Total ARN (UHR) de Stratagene pode ser implementado como Controlo Positivo e ajustado um limiar de expressão baseado na expressão de MAGE-A3 neste ARN bem caracterizado. Pode ser testado UHR diluído com cada corrida juntamente com os controlos de ARN de GERL para estabelecer um limiar de expressão adequado com o controlo UHR.

Condiçoes de Armazenamento da Amostra e Reagentes

Todo o ARN e ADN incluindo plasmídeos, ADN de controlo positivo para P53, ARN FFPET clínico, UHR, GERL e STAC são 50 armazenados a -80 °C. Todos os reagentes de teste incluindo Universal RNA Master Mix, mistura iniciador/sonda, mistura de co-factor e diluente de amostra/controlo negativo são armazenados a 2-8 °C.

Exclusividade para MAGE-A3

Teste experimental dos iniciadores e sondas com plasmídeos de ADN contendo membros da família MAGE-A

Objectivo: determinar a capacidade do teste para amplificar especificamente o gene MAGE-A3 excluindo co-amplificação/detecção significativa de outros genes relacionados.

Material de amostra: Serão testados ADN plasmídico contendo MAGE-A3 e membros da família relacionados (para detalhes dos plasmídeos ver Exemplo 2, acima).

Processo: Teste experimental do Teste COBAS TaqMan de MAGE-A3 utilizando plasmídeos de ADN contendo membros da família MAGE-A para determinar se são amplificados e detectados genes relacionados em quantidades significativas.

Cada amostra de ADN plasmídico foi testada três vezes em quatro concentrações de ADN diferentes (20, 2, 0,2, 0, 02 pg) . O perfil de ciclo térmico mostrado na Tabela 10 foi modificado para remover o passo de transcrição reversa a 60 °C durante 20 minutos. A concentração de ADN plasmídeo foi determinada por análise com Nanodrop. 51

Análise :

Foram determinados os valores do Ct para o plasmídeo MAGE-A3 e comparados com os valores do Ct dos plasmídeos MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 e MAGE-A12. Foi calculado o delta Ct por subtracção do Ct para MAGE-AX (cada membro da família relacionado) do Ct para MAGE-A3. Foram utilizados valores médios do Ct dos quatro replicados para os cálculos do Ct e do delta Ct.

Critérios de aceitação:

Os valores de Delta Ct devem ser maiores ou iguais a 10 entre MAGE- A3 e todos os outros plasmídeos excepto MAGE-A6.

Resultados de exclusividade para MAGE-A3

Nas tabelas e Figuras é aqui utilizado em algumas ocasiões o termo "CURIE" em vez de "MAGE"; No entanto, é pretendido o termo "MAGE" em todos os casos.

Na Tabela 12 e na Figura 17 mostradas abaixo são mostrados valores de Ct para todos os plasmídeos MAGE testados. Para plasmídeos em que não houve qualquer amplificação, foi atribuído valor de Ct de 55 uma vez que ocorreram 55 ciclos no perfil de ciclos térmicos. Como esperado, os Ct de MAGE-A3 são os mais precoces para todos os níveis testados (Tabela 12 e Figura 17). Valores de Delta Ct foram superiores a 10 ciclos entre MAGE- A3 e todos os outros plasmídeos excepto MAGE-A6 (Tabela 13 e Figura 18). Não foi necessário um Delta Ct entre MAGE-A3 e 52 MAGE-A6 uma vez que 95% dos doentes que expressam MAGE-A6, expressam também MAGE-A3. 0 Delta Ct entre MAGE-A3 e MAGE-A6 para 20 pg, 2 pg, 0,2 pg e 0,02 pg de adição de ADN plasmídico foi 9,3, 8,4, 7,8 e 8,2 ciclos, respectivamente. Uma vez que a maioria dos valores do Ct para MAGE-A3 para ARN proveniente de amostras FFPE revelou ser superior a 27,2 para amostras FFPE testadas, o sinal proveniente de MAGE-A6 irá ser mínimo uma vez que um atraso de 8,2 ciclos irá produzir um valor de Ct fora da gama do ensaio.

Foram cumpridos os critérios de aceitaçao para exclusividade. A Tabela 14 mostra a Validação da Experiência de Exclusividade para MAGE-A3; os Ct de controlo estavam dentro da gama validada. A experiência passou na validação. As Tabelas 15 e 16 mostram detalhes de Experiência de Exclusividade para MAGE-A3.

Linearidade e Eficiência da RT-PCR

Objectivo: determinar a linearidade e a eficiência da transcrição reversa do teste.

Material de amostra: Foram utilizadas diluições em série de ARN de Xenoenxerto GERL FFPE para estudos de linearidade e de eficiências de RT-PCR.

Processo: Foi diluído ARN de Xenoenxerto GERL FFPE em série de 2 vezes desde 100 ng até 0,1 ng e testado utilizando o Teste 53 gama linear do cada nível de COBAS TaqMan para MAGE-A3 para determinar a ensaio. Foram testados dez replicados para concentração.

Análise:

Foram representados graficamente valores do Ct para cada replicado tanto para MAGE-A3 como para β-actina versus log (base 2) da concentração de adição de ARN para calcular o declive da recta e as eficiências de RT-PCR. A eficiência da amplificação por RT-PCR foi calculada utilizando a equação:

Declive = -1/log (base 2) * Eficiência da Amplificação (AE).

Uma eficiência da Amplificação de 2 é equivalente a 100%. Foram representados graficamente os valores de Delta Ct (Ct para MAGE-A3 - Ct para a β-actina) para cada replicado versus log (base 2) de concentração de adição de ARN para determinar o declive de Delta Ct. Foram calculados médias, desvio padrão e coeficiente de variação percentual (%CV) para Ct para MAGE-A3, Ct para a β-actina e Delta Ct, a partir de todos os dez replicados.

Critérios de aceitaçao de Linearidade:

Foi determinada a gama linear do ensaio baseada nos seguintes critérios: CV do Ct para MAGE-A3 <5% CV do Ct para a β-actina < 5% 54 CV de Delta Ct < 20% -0,10 < declive de Delta Ct < 0,10 R2 > 0,95

Critérios de aceitação da Eficiência da RT-PCR:

Eficiência da Amplificação de MAGE-A3 por RT-PCR > 80%

Eficiência da Amplificação da β-actina por RT-PCR > 80%

Diferença de Eficiência da Amplificação por RT-PCR entre MAGE-A3 e β-actina dentro de 10%

Resultados de Linearidade/Eficiência da RT-PCR A Figura 20 mostra um gráfico com log (base 2) da adição de ARN versus valores do Ct para MAGE-A3 e β-actina. O teste COBAS TaqMan para MAGE-A3 é linear entre valores de adição de 100 - 0,1 ng de ARN de GERL extraído de Xenoenxerto FFPE utilizando o método QIAGEN baseado em valores de R2. Os valores de R2 foram de 0,983 para MAGE-A3 e 0, 998 para β-actina. Estes valores estão acima da especificação de R2 > 0,95. Além disso, os Ct para MAGE-A3 e para a β-actina para todos os 10 replicados em cada nível testado estão abaixo da especificação de CV < 5% como mostrado na Tabela 17. 55

Foi calculada a eficiência da amplificação de MAGE-A3 e da β-actina por RT-PCR a partir do declive da recta produzida a partir da representação gráfica do log (base 2) do ARN adicionado versus valores do Ct para MAGE-A3 e β-actina mostrados na Figura 19. A eficiência da amplificação por RT-PCR pode ser calculada utilizando a seguinte equação:

Declive = -1/Log(base2) * Eficiência da Amplificação (AE). A eficiência da amplificação foi 2,14 (107%) e 2,06 (103,1%) para MAGE-A3 e β-actina, respectivamente. A AE ficou acima da especificação de 80% para MAGE-A3 e β-actina. A diferença na AE entre os dois genes foi 3,9%, o que estava também dentro da especificação de +10%.

A Figura 20 mostra um gráfico com log (base 2) do ARN

adicionado versus Delta Ct entre MAGE-A3 e β-actina. Declive de Delta Ct é 0,0474, bem dentro da especificação de declive de -0,10 a 0,10. Nos dois níveis mais baixos de adição de ARN testados (0,2 e 0,1 ng) , a %CV para Delta Ct ficou acima da especificação de 20%. Como resultado, os últimos dois níveis de adição de ARN não ficaram incluídos na gama linear do ensaio. A gama linear do ensaio utilizando ARN de Xenoenxerto GERL é 100 ng - 0,39 ng de ARN.

Com base nestes dados, foram cumpridos os Critérios de aceitação para linearidade e eficiência da RT-PCR. A Tabela 18 mostra a Eficiência da Amplificação por RT-PCR de MAGE-A3 e β-actina; A Tabela 19 é Experiência de Linearidade/Validação da Eficiência da RT-PCR. 56

Os Ct de controlo situaram-se dentro da gama validada. A experiência passou na validaçao.

As Tabelas 20, 21 e 22 proporcionam detalhes sobre

Experiência de Linearidade/Eficiência da RT-PCR

Sensibilidade Analítica (Limite de Detecção)

Objectivo: Estabelecer a concentração mais baixa de ARN a que possa ser detectada a expressão do gene MAGE-A3 pelo Teste COBAS™ TaqMan de MAGE-A3 em pelo menos 95% das vezes.

Material da amostra: Foi avaliada a sensibilidade analítica utilizando ARN isolado de tecido de Xenoenxerto FFPE utilizando o Kit QIAGEN RNeasy FFPE com passo de ADNase adicional. Foi extraído ARN a partir de dois Xenoenxertos FFPE derivados de duas linhas celulares de ARN diferentes. Um Xenoenxerto designado GERL expressa MAGE-A3. 0 outro Xenoenxerto designado STAC não expressa MAGE-A3. Foram utilizados ARN destes dois Xenoenxertos para experiências de mistura com o objectivo de testar ARN de GERL a 5% num fundo de ARN de STAC a 95%, ARN de GERL a 1% num fundo de ARN de STAC a 99% e ARN de GERL a 0,5% um fundo de ARN de STAC a 99,5%. Estas três misturas diferentes de ARN de GERL e STAC foram testadas em quatro níveis diferentes de ARN total.

Processo: Foram produzidos vinte e quatro resultados a partir do teste de 4 diluições em série independentes de misturas de ARN de GERL e de STAC. Foram testados quatro níveis de adição de ARN (100, 50, 25 e 12,5 ng) . Foram testados seis replicados para cada nível. 57

Análise: Determinar o nível de ARN em que é obtida uma proporção de positividade > 95% para MAGE-A3 baseada no valor do Ct dentro da gama validade do ensaio.

Critérios de aceitação: LOD < 50 ng de adição de ARN Total para detecção de GERL a 1%

Resultados do Limite de Detecção A proporção de acerto é definida como valor do Ct dentro da gama linear do ensaio baseado nas experiências de linearidade descritas neste relatório. Para determinar o final da gama do Ct, foi realizada a média dos Ct de MAGE-A3 e da β-actina a partir do nível de adição de ARN de 0,39 ng do estudo de linearidade (final da gama linear) e foram calculados os limites de confiança a 95% para os Ct de MAGE-A3 e da β-actina. Com base nestes cálculos, o Ct para MAGE-A3 deve ser menor ou igual a 35,2 e o Ct para a β-actina deve ser menor que 32,1 para a amostra ser considerada certa. Na Tabela 23 e na Tabela 25 são mostradas as proporções de acerto para MAGE-A3 e β-actina. Na Tabela 24 e Tabela 26 são mostradas percentagens das proporções de acerto para MAGE-A3 e β-actina. O Limite de Detecção é de 50 ng de adição de ARN em que o ARN de GERL diluído a 1% em ARN de STAC a 99% é detectado em > 95% das vezes baseado no Ct para MAGE-A3 situando-se dentro da gama validada do ensaio. São cumpridos os critérios de Aceitação para Sensibilidade Analítica (Limite de Detecção). 58

Validação de Experiência de Limite de Detecção. Na Tabela 27 são mostrados os Ct do controlo FAM do Gene MAGE; Na Tabela 28 são mostrados os Ct do controlo HEX da β-actina. Os Ct de controlo estão dentro da gama validada. A experiência passou na validação.

Tabela 29; Tabela 30; e Tabela 31 mostram Detalhes de Experiência do Limite de Detecção. Método de Correlação

Objectivo: correlacionar e validar de modo cruzado o Teste COBAS™ TaqMan de MAGE-A3 e um Ensaio Protótipo utilizando amostras clínicas de FFPET.

Material de amostra: Foram analisadas aproximadamente 120 amostras clínicas de FFPET de qualidade adequada utilizando o Teste COBAS TaqMan de MAGE-A3 e utilizando o Ensaio Protótipo.

Processo: Foi extraído ARN utilizando o Kit QIAGEN™ RNeasy FFPE com um passo adicional de ADNase. Foi realizada uma extracção para cada amostra FFPET, a amostra foi dividida e foi testada uma alíquota pelo teste COBAS TaqMan de MAGE-A3 e foi testada uma alíquota utilizando o ensaio protótipo. Foram corridos controlos idênticos para ambos os ensaios para estabelecer o limiar de expressão de MAGE-A3. 59

Análise: A detecção de MAGE-A3 para cada amostra foi descrita como positiva ou negativa com base no limiar de expressão de MAGE-A3 produzido pelos controlos de ARN de GERL. Foram comparados resultados entre os dois ensaios para estabelecer o positivo e o negativo pelos valores de concordância percentual do comparador do teste RMS.

Para cálculos de concordância percentual, foram utilizados resultados obtidos previamente utilizando um ensaio de RT-PCR de dois passos para tecido congelado para esclarecer os resultados discordantes.

Positivo por Concordância Percentual do Comparador = # de amostras de MAGE-A3 expressoras detectadas correctamente/f número de amostras testadas * 100

Negativo por Concordância Percentual do Comparador = # de amostras de MAGE-A3 não-expressoras detectadas correctamente/f número de amostras testadas * 100

Critérios de Aceitação:

Positivo por Concordância Percentual do Comparador > 95%

Negativo por Concordância Percentual do Comparador > 85%

Foi realizada a validação cruzada de espécimes clínicos a partir de um teste clínico NSCLC para avaliar o positivo e negativo por concordância percentual do comparador do Teste COBAS 60

TaqMan de MAGE-A3. 0 ensaio de MAGE-A3 RT-PCR protótipo foi utilizado como comparador para estes estudos. No caso de discordância entre resultados, serão utilizados resultados anteriores produzidos a partir da mesma amostra como tecido fresco congelado que não foi microdissecado manualmente para esclarecimento do resultado discordante.

Foi extraído ARN a partir de 131 espécimes de FFPE microdissecados manualmente, utilizando o método QIAGEN RNeasy FFPE com passo de digestão com ADNase I. Cada amostra foi então dividida igualmente entre RMS e RGI para teste utilizando o teste RMS COBAS TaqMan de MAGE-A3 e o ensaio protótipo RGI. A análise de dados foi realizada como descrito na Secção 3, neste relatório em que foi determinado o limiar de expressão de MAGE-A3 baseado no controlo de ARN de GERL a 1%.

Resultados de Correlação do Método/Validação Cruzada

Foram extraídas amostras de ARN a partir de 131 amostras clínicas de NSCLC FFPE. Sete amostras apresentaram contaminação por ADN genómico superior a 25% com base na reacção de controlo de RT de RGI. Estas amostras foram excluídas do positivo e do negativo por cálculos de concordância percentual do comparador. Adicionalmente, ocorreram 6 resultados indeterminados a partir do ensaio COBAS e 15 do ensaio protótipo em que ou a amostra não tem material suficiente com base no Ct para a β-actina fora da gama linear do ensaio ou a expressão de MAGE-A3 para a amostra estava acima do limiar, mas o Ct para MAGE-A3 estava fora da gama linear. Como resultado, obtiveram-se 117 resultados a partir do ensaio COBAS e 108 resultados a partir do ensaio protótipo com dados que poderão ser utilizados para a validação cruzada para 61 comparar os dois testes diferentes (Tabela 32). A concordância total entre os ensaios COBAS e protótipo foi 98/107 ou 91,6% (Tabela 33). O positivo por concordância percentual do comparador do teste COBAS utilizando o ensaio protótipo como o "padrão-ouro" foi 59/ 64 ou 92,2%, enquanto que o negativo por concordância percentual do comparador foi 39/43 ou 90,7% (Tabela 33). No caso de resultados discordantes entre os ensaios COBAS e protótipo, foram utilizados resultados produzidos pela amostra de tecido congelado para esclarecer a discordância (Tabela 34).

Das 9 amostras com resultados discordantes entre os ensaios COBAS e protótipo, 7 revelaram concordância entre os ensaios COBAS e congelado e 2 revelaram concordância entre os ensaios protótipo e congelado. Como resultado quando se utiliza o resultado congelado para esclarecer a discordância, o positivo por concordância percentual do comparador dos ensaios COBAS aumenta para 63/64 ou 98,4% e o negativo por concordância percentual do comparador aumenta para 42/43 ou 97,7% (Tabela 34). O Positivo e o Negativo por Concordância Percentual do Comparador do Teste COBAS TaqMan de MAGE-A3 ultrapassaram as especificações de maior ou igual a 85%. Foram cumpridos os critérios de aceitação para Positivo e Negativo por concordância percentual do comparador.

Validação da Correlação do Método/Controlo de Validação Cruzada

Na Tabela 30 são mostrados Ct da Experiência de Controlo do Gene MAGE; Na Tabela 31 são mostrados Ct da Experiência de 62

Controlo do Gene da β-actina. Os Ct de Controlo estão dentro da gama validada. A experiência foi validada.

Na Tabelas 37, 38 e 39 são mostrados Detalhes da Experiência do Método de Correlação /Validação Cruzada.

Reprodutibilidade

Objectivo: Demonstrar a reprodutibilidade e robustez dos testes ao longo dos conjuntos de dados produzidos por operadores múltiplos em dias múltiplos com lotes múltiplos de reagentes e instrumentos múltiplos.

Material de amostra:

Foram extraídas 12 amostras de Amostras Clínicas de NSCLC FFPE microdissecadas manualmente utilizando o Kit QIAGEN RNeasy FFPE com passo de Digestão com ADNase I e amplificadas/detectadas utilizando o Teste COBAS TagMan de MAGE-A3.

Processo: 0 estudo consistiu de dois replicados por amostra.

Foram testados dois lotes de reagentes para a preparaçao da amostra QIAGEN e reagentes TagMan. 63

As experiências foram realizadas por dois operadores diferentes em dois dias diferentes utilizando dois Analisadores COBAS TaqMan 48 diferentes.

Análise:

Foi calculada a expressão de MAGE-A3 para cada espécime clínico a partir da média de dois replicados de RT-PCR. Além disso, foi avaliada a detecção de MAGE-A3 para cada replicado de cada amostra. A reprodutibilidade foi também baseada na comparação da expressão do gene MAGE-A3 calculada a partir do valor de Delta Ct entre o gene MAGE-A3 e o gene da β-actina. Foi realizada uma comparação entre a expressão de MAGE-A3 para amostras testadas com lotes de reagentes, instrumentos, operadores diferentes e em dias diferentes utilizando a Correlação de Pearson.

Critérios de Aceitaçao:

Concordância de detecção de MAGE-A3 > 90% entre amostras gue são pelo menos 3 X o Limite de Detecção do teste (GERL a 3%) de corrida para corrida e dentro de replicados de corrida.

Correlação de Pearson > 90% entre amostras

Resultados de Reprodutibilidade O limiar de Expressão de MAGE-A3 é o nível de exclusão da expressão de MAGE-A3 gue determina se um doente irá receber uma 64 imunoterapia específica para MAGE-A3. Doentes com expressão de MAGE-A3 igual ou acima do limiar irão ter uma detecção positiva para a MAGE-A3 e irão receber tratamento. Doentes com expressão de MAGE-A3 abaixo do limiar, irão ter uma detecção negativa para MAGE-A3 e não irão receber tratamento. Os estudos de reprodutibilidade do teste foram baseados na detecção da expressão de MAGE-A3 para cada espécime utilizando as seguintes equações:

Limiar de Expressão de MAGE-A3 = 2 A(Ct para a β-actina do controlo de GERL a 100% - Ct para MAGE-A3 do Controlo de GERL a 1%)

Expressão de MAGE-A3 para espécime clinico = 2A(Ct para a β-actina do espécime - Ct para MAGE-A3 do espécime)

Além disso, a reprodutibilidade do ensaio foi avaliada por comparação da correlação de expressão de MAGE-A3 entre as duas corridas pelo Coeficiente de Correlação Produto-Momento de Pearson (r) . A Tabela 40 e a Tabela 37 mostram o limiar de expressão de MAGE-A3 produzido a partir de controlos de ARN de GERL testados com a Corrida 1 e 2 baseado no delta Ct entre β-actina e MAGE-A3. A Tabela 41 e a Tabela 43 mostram a detecção de MAGE-A3 para cada um dos 12 espécimes testados nas Corridas 1 e 2. A Tabela 42 mostra a Corrida 2 - Limiar de Expressão de MAGE-A3 a partir de Controlos de ARN de GERL; A Tabela 43 mostra a Corrida 2 - Detecção da Expressão de MAGE-A3 para Espécimes de Reprodutibilidade. 65

Para todas as amostras testadas, verificou-se uma correlação de 100% para detecção da expressão de MAGE-A3 entre as duas corridas. Além disso, foi avaliada a reprodutibilidade do ensaio por comparação entre a correlação da expressão de MAGE-A3 entre as duas corridas pelo Coeficiente de Correlação Produto-Momento de Pearson (r). O Coeficiente de Correlação de Pearson foi 0,987 quando comparando a Expressão de MAGE-A3 entre as duas corridas diferentes. Foram cumpridos os Critérios de Aceitação para a reprodutibilidade.

Tabela 44 mostra a Validação da Reprodutibilidade; Os Ct de Controlo estão dentro da gama validada. A experiência passou na validação.

Nas Tabelas 45, 46 e 47 são mostrados Detalhes da Experiência de Reprodutibilidade.

Lisboa, 28 de Setembro de 2012 66

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Conjunto de iniciadores consistindo no seguinte par de iniciadores. a) SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N°: 12.
2. 2. Sonda consistindo de: a) a sequência nucleotidica (de qualquer de) SEQ ID N°: 17, tendo um corante repórter fluorescente na extremidade 5' e um extintor não-fluorescente na extremidade 3'; ou b) SEQ ID N°: 53.
3. 3. Kit compreendendo (i) um iniciador consistindo da SEQ ID N° : 11; (ii) um iniciador consistindo da SEQ ID N°: 12 e uma sonda consistindo da SEQ ID N° : 17 tendo 6-carboxifluoresceina na extremidade 5' e um extintor não-fluorescente na extremidade 3'.
4. 4. Kit compreendendo (i) um iniciador consistindo da SEQ ID N°: 11; (ii) um iniciador consistindo da SEQ ID N°: 12 e uma sonda consistindo da SEQ ID N°: 53.
5. 5. Método para determinar a presença ou a ausência de MAGE-A3 em tecido tumoral Fixado em Formalina Embebido em Parafina (FFPE), compreendendo o passo de fazer contactar uma sequência nucleotidica isolada, obtida ou derivada de uma amostra de tecido tumoral FFPE com um conjunto de 1 iniciadores consistindo da SEQ ID N°: 11 e da SEQ ID N°: 12 e uma sonda de acordo com a reivindicação 2.
6. 6. Método de diagnóstico de um doente compreendendo o passo de fazer contactar uma sequência nucleotidica isolada obtida ou derivada de uma amostra de tecido tumoral FFPE com um conjunto de iniciadores consistindo da SEQ ID N°: 11 e da SEQ ID N°: 12 e uma sonda de acordo com a reivindicação 2 e avaliar se MAGE-A3 é expresso na amostra.
7. 7. Método da reivindicação 5 ou 6, compreendendo ainda o passo de amplificar uma sequência nucleotidica e detectar a sequência nucleotidica amplificada na amostra.
8. 8. Método da reivindicação 5, compreendendo ainda o passo de determinar se a sequência nucleotidica isolada hibrida com o iniciador ou a sonda em condições de restringência, detectando, deste modo, se o tecido tumoral é positivo para MAGE-A3.
9. 9. Método da reivindicação 8, compreendendo ainda o passo da utilização de hibridação in situ para detectar se a sequência nucleotidica hibrida com, pelo menos, um iniciador ou sonda. Lisboa, 28 de Setembro de 2012 2