KR102600347B1 - Nras 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물, 상기 조성물을 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머/프로브 세트를 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 프라이머/프로브 세트는 암 환자의 치료제에 대한 반응성 예측, 진단뿐만 아니라 암의 전이 또는 재발에 대한 예측이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 프라이머/프로브 세트는 암 환자의 치료제에 대한 반응성 예측, 진단뿐만 아니라 암의 전이 또는 재발에 대한 예측이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물, 상기 조성물을 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머/프로브 세트를 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트에 관한 것이다.
암이란 다양한 원인에 의해 세포의 분열과 사멸 간의 균형이 파괴됨으로써 계속적인 분열과 증식에 의해 발생한 비정상적인 세포의 집단을 의미하며, 종양 또는 신생물이라고도 한다. 일반적으로 장기, 백혈구, 뼈, 림프절 등을 포함한 100 가지 이상의 신체의 여러 부분에 발병하며, 주변조직으로 침윤하는 현상 및 다른 기관으로 이동하는 전이를 통해 심각한 증상으로 발전한다.
암의 치료제는 지속적으로 개발되고 있어, 현재 임상에서 사용되는 각종 암에 대한 치료제는 수십 가지에 이르고 있다. 하지만 현재까지도 임상의들은 두 가지의 어려움을 겪고 있는데, 첫째는 치료제가 치료 효과를 나타내기까지는 몇주 정도의 시간이 소요되고 개개 환자들에게 효과가 있는 치료제를 미리 알 수가 없다는 것이다. 즉, 항암제의 치료 효과는 며칠 내에 판정할 수 있는 것이 아니라 수주에 걸쳐서 서서히 나타나기 때문에 처방된 약물이 효과가 없다고 판단하기까지는 오랜 시간이 걸린다는 것이다. 그 후 치료 효과가 부적절하다면 다른 종류의 치료제로 변경을 고려하는데, 결국 치료 개시 시기에 임상의가 환자에게 적절한 치료제를 선택하지 못하였다면, 그만큼 효과적인 치료에 이르는데, 시간이 그만큼 지체하게 되며, 병의 진행, 재발 및 예후에 치명적인 영향을 미치게 된다.
두 번째 어려움은 치료제에 치료 반응을 보이지 않는 환자가 다수 존재하는 점이다. 예를 들어, 유방암 치료제인 라파티닙(lapatinib)은 HER2 단백질의 수치가 높고 (HER2 양성) EGRF 단백질의 수치가 낮은 경우에 치료효과가 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 그러나 전이성의 HER2 음성 유방암은 라파티닙에 반응을 하지 않아 라파티닙이 효과가 없는 것으로 드러났다. 이러한 연구결과를 참고하면, 일단 유방암 환자들은 치료를 받기 전에 정확한 검사를 통하여 HER2 음성인지 혹은 양성인지를 확실히 밝혀야 적절한 치료를 선택할 수 있음을 알 수 있다.
따라서, 치료제에 대한 치료반응과 그 부작용을 미리 예측할 수 있다면, 환자에게 맞는 약물을 미리 선별하여 약물을 잘못 선택함으로 인하여 생기는 치료 탈락(dropout)률을 낮추고 약물의 순응도를 높일 수 있을 것이다. 또한 약물의 효과가 나타나기까지 걸리는 시간과 환자가 겪을 지도 모르는 부작용의 위험을 피해 갈 수 있을 것이다.
한편, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 암 성장에 중요한 역할을 하는 티로신 키나아제이다. 예를 들어, 전이성 결장암(CRC)을 갖는 환자의 종양 중 85%를 초과하는 종양에서 EGFR의 과발현이 관찰된다(Lee JJ and Chu E,Clin Colorectal Cancer 2007; 6 Suppl 2:S42-6). 이러한 EGFR을 표적으로 하는 항암 약물이 개발되어 왔다. 세툭시맵(cetuximab) 및 파니툼맵(panitumumab)은 전이성 CRC를 위한 2차 용도 및 옥살리플라틴 및 이리노테칸-기반의 치료요법과 조합된 1차 용도에 있어서 유망한 치료 효과를 나타내는 두 가지 EGFR 억제제이다Lee JJ and Chu E, Clin Colorectal Cancer. 2007; 6 Suppl 2:S42-6; Zhang W, et al., Ann Med. 2006;38: 545-51). 그러나 모든 환자들이 세툭시맵 및 파니툼맵에 반응하는 것은 아니다.
Ras 유전자의 변이는 암의 유전적 변이에 있어서 가장 흔하게 발견되는 돌연변이 중 하나이다. 이 중 N-ras(NRAS) 돌연변이는 GTP를 GDP로 가수분해하는 NRAS의 기능에 영향을 주어 NRAS가 계속적으로 활성화 상태가 되도록 한다. NRAS 유전자의 엑손 2 및 3에서의 돌연변이는 잘 알려져 있으며, 최근 엑손 4에서의 돌연변이가 발견되었고, 이는 대장암 환자에서 약물의 반응성에 영향을 미친다는 것이 보고되고 있다(BMJ Open. 2014 May 23;4(5):e004652.).
NRAS의 유전자 돌연변이는 20%의 악성흑색종, 12%의 백혈병, 8% 갑상선암 및 2~3%의 대장암 환자에서 발견이 되는 것으로 보고되고 있다. 악성 흑색종, 갑상선암 및 대장암에서 NRAS의 돌연변이는 주로 codon 61에서 발견이 되나, 혈액암에서는 다양한 코돈에서의 돌연변이가 병변에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. NRAS 유전자의 돌연변이는 방사선 요법 및 EGFR 저해제 치료 요법에 대한 저항성과 연관이 있는 것으로 보고되고 있다. NRAS 변이가 존재하면 EGFR 저해제인 세툭시맵 또는 파니툼맵에 대한 약효가 나타나지 않을 것이라는 점이 예측될 수 있기 때문에, 변이된 NRAS 를 지니는 환자들은 이들 EGFR 저해제를 이용한 치료 요법에 대한 효과를 나타내지 못할 수 있다.
이와 같이, NRAS 돌연변이의 존재는 세툭시맵 또는 파니툼맵과 같은 EGFR 키나아제 저해제에 반응하는 약물 감수성의 강력한 예측인자로 작용하므로, 최적의 치료적 접근을 위해 NRAS 돌연변이의 효과적이고 신속한 검출 방법이 요구된다.
이에, 본 발명자들은 NRAS 돌연변이를 간편하고 신속하게 검출하여 NRAS 돌연변이와 관련된 암 환자의 약물치료 전략을 선택할 수 있는 프라이머/프로브 세트를 발굴하고, 이에 적합한 키트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 21 내지 26 로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 27 내지 32로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 정방향 프라이머, 및 서열번호 34 내지 36으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 37 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 정방향 프라이머, 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 16의 정방향 프라이머, 서열번호 17의 역방향 프라이머, 서열번호 18의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 19의 정방향 프라이머, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 46 내지 48로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트
를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머/프로브 세트를 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 21 내지 26 로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 27 내지 32로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 정방향 프라이머, 및 서열번호 34 내지 36으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 37 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 정방향 프라이머, 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 16의 정방향 프라이머, 서열번호 17의 역방향 프라이머, 서열번호 18의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 19의 정방향 프라이머, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 46 내지 48로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트
를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머/프로브 세트를 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY (2th ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walkered., 1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.
이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 21 내지 26 로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 27 내지 32로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 정방향 프라이머, 및 서열번호 34 내지 36으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 37 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 정방향 프라이머, 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 16의 정방향 프라이머, 서열번호 17의 역방향 프라이머, 서열번호 18의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 19의 정방향 프라이머, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 46 내지 48로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 조성물은 바람직하게는 EGFR 저해제에 대한 치료 반응성 (responsiveness) 예측을 위한 것일 수 있다. NRAS는 EGFR 하류 이펙터이고, 항-EGFR 단클론항체의 치료효과 대한 1차 저항의 마커이다. NRAS 돌연변이를 갖는 환자들은 EGFR 저해제인 세툭시맵(cetuximab) 또는 파니툼맵(panitumumab) 치료로부터 항암효과를 나타내지 못할 가능성이 존재한다.
따라서, 상기 EGFR 저해제는 바람직하게는 세툭시맵(cetuximab) 또는 파니툼맵(panitumumab) 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다 .
본 발명에서 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 발명에서 “프로브”는 정량적 PCR에 이용되는 taqman probe의 일종으로 디자인된 것이다. 바람직하게는 프로브에는 형광 물질 (HEX, VIC, FAM dye)를 부착하였으며, 모든 프로브의 3'쪽에는 ??쳐 (quencher)로 BHQ1이 이용될 수 있다. TaqMan probe는 일반적으로 5‘ 말단을 형광 물질로, 3’ 말단을 quencher 물질로 tagging한 oligonucleotide이며, TaqMan probe는 annealing step에서 template DNA에 특이적으로 hybridization하지만, probe의 3‘ 말단에 quencher가 있기 때문에 빛을 주어도 형광을 발하지 못하지만, 다음 과정인 extension step에서 Taq DNA polymerase가 가지고 있는 5’→3‘ exonuclease 활성에 의해, 주형에 hybridization한 TaqMan probe가 분해되면 형광물질이 probe로부터 분리되어 quencher에 의한 억제가 해제되고 형광을 발하게 되는 원리에 의해서 PCR 반응에 따른 형광이 정량적으로 발하게 된다.
본 발명에서의 게놈 DNA 유전자 변이에 특이적인 프라이머 및 프로브는 NRAS 유전자의 돌연변이를 검출하기 위한 것일 수 있다. 바람직하게는 게놈 DNA 유전자 변이에 특이적인 프라이머 및 프로브는 PCR 반응 용액 및 표준 PCR 반응 용액에 대해서 동일한 서열로 사용되며, 각각 독립적으로 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 21 내지 26 로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 27 내지 32로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 정방향 프라이머, 및 서열번호 34 내지 36으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 37 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 정방향 프라이머, 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트,
서열번호 16의 정방향 프라이머, 서열번호 17의 역방향 프라이머, 서열번호 18의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 19의 정방향 프라이머, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 46 내지 48로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
PCR 반응 여부의 측정은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으나, 리포터 형광 염료 및/또는 ??쳐 (quencher) 형광 염료로 표지된 프로브를 사용한 광학적 정량 분석 시스템에 의해서 측정될 수 있으며, 바람직하게는 각 미분화된 작은 방울 각각의 PCR 반응에 대한 형광값을 측정하는 것에 의해서 수행될 수 있다.
구체적으로 프로브에 FAM, HEX, VIC 형광염료 (형광물질) 또는 EvaGreen 형광염료가 결합된 형태를 사용하였으므로 이들에 대한 형광을 측정하는 것에 의해서 수행될 수 있다. 이와 같은 과정은 상용의 검출장치 (예를 들어, biorad사의 Droplet Reader)에 의해서 수행될 수 있으며, 해당 장치내에서 각각의 샘플의 droplet 형광 신호를 각각 감지 및 positive와 negative droplet의 수를 세어 자동으로 분석까지 완료될 수 있다.
이 때 검출을 위해서 PCR 반응 용액에 첨가되는 프로브 및 표준 PCR 반응 용액에 첨가되는 프로브는 각각 상이한 형광물질과 결합되어 있을 수 있다.
한편, 본 발명은 본 발명의 프라이머/프로브 세트를 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
본 발명이 상기 키트는, background (noise)를 줄이기 위해 돌연변이 위치에 상응하는 야생형 서열을 이용하여 돌연변이 검출용 프로브가 야생형 서열에 non-specific 하게 binding 하지 못하도록 디자인 한 oligomer (blocker)를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 바람직하게는 본 발명의 프라이머/프로브 세트를 이용한 PCR 반응에 의한 NRAS 유전자의 돌연변이의 검출에 이용될 수 있다. 본 발명의 키트는 PCR 이나 이의 검출에 사용되는 당업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트, 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명의 키트는 RUO (research use only) 또는 IVD (investigation use only) 키트일 수 있다. IVD 키트에는 IVD-CDx 키트도 포함된다.
한편, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 21 내지 26 로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 27 내지 32로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 정방향 프라이머, 및 서열번호 34 내지 36으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 37 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 정방향 프라이머, 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호 16의 정방향 프라이머, 서열번호 17의 역방향 프라이머, 서열번호 18의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 19의 정방향 프라이머, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 46 내지 48로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 qPCR (quantitative PCR) 또는 digital PCR 방법에 사용되는 것이다.
본 발명의 키트에 적용가능한 주형은 NRAS의 돌연변이 검출이 필요하며, PCR 반응이 가능한 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 본 발명의 키트는 FFPE (formalin fixed parafin embedded) 조직에서 분리된 DNA 또는 상기 조직 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA, 또는 혈액에서 분리된 cfDNA(cell-free DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
인간 혈장에서 순환하는 cfDNA는 염증성 장애, 산화 스트레스 및 악성 종양 등의 다양한 생리학적 및 병리학적 병태들에서 연구되고 있다. cfDNA의 혈류 방출과 관련된 정확한 기전은 불확실하지만, 아마도 세포자살, 세포괴사 및 세포로부터의 능동적인 방출이 종합적으로 작용하는 것으로 보인다. 혈관을 통해 순환하는 cfDNA는 잠재적으로 유용한 바이오마커이다. DNA 수준과 단편화 패턴은 진단 및 예후 예측 목적으로 흥미로운 가능성을 제시한다. 특히 환자의 혈액에서 간단히 검출할 수 있다는 점에서 삶의 질을 크게 훼손하지 않고 간편하고 신속하게 바이오마커를 검출할 수 있다는 유용성이 있다.
생검 후 환자에게서 얻은 조직은 통상적으로 포르말린(포름알데히드) 등에 의해서 고정화한다. 고정화한 생물학적 샘플은 일반적으로 탈수시키고, 파라핀 등의 고체 지지체에 포매하며, 이렇게 제조된 시료를 FFPE 시료라고 한다. FFPE 시료 상의 핵산, 특히 DNA는 고정된 세포에 존재하고, 단편화 되어 있거나 포르말린에 의해 교차 결합되어 있으므로 파라핀을 제거하고 고정된 세포를 용해하여 DNA를 비롯한 핵산을 세포 내에서 용출시킬 필요가 있다.
본 발명에 있어서 용어 “파라핀”은 형태학적, 면역조직화학적 및 효소조직화학적인 해석을 포함하는 모든 해석에 있어서 사용되는 생체시료의 포매 매체를 포괄적으로 말하는 것이다. 즉, 본 발명에 있어서의 파라핀은 석유계 파라핀 왁스 단체(單體)여도 되고, 당해 석유계 파라핀 왁스를 기제(基劑)로 하여, 포매 매체의 품질향상 등의 목적으로 첨가될 수 있는 모든 다른 성분을 포함한 것이어도 된다. 여기서, 석유계 파라핀 왁스는 석유에 유래하는 상온에서 고형인 탄화수소류의 혼합물을 말한다.
일반적으로 FFPE 처리된 암 환자의 검체 시료를 회전식 미세톱 (rotary microtome)으로 5~10μm 의 두께로 절단한 다음 상용의 FFPE 용 핵산 분리 키트 또는 이를 활용하는 장치를 통해 DNA를 포함하는 핵산을 분리할 수 있다. FFPE에서 핵산을 분리하는 키트/장치는 예를 들어 지멘스 사의 Tissue Preparation System 및 이와 관련된 시약 (VERSANT tissue preparation reagents)을 들 수 있다.
아울러, 본 발명의 키트는 혈액에서 분리된 CTC (circulating tumor cell)에서 분리된 DNA 또는 상기 CTC 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA를 주형으로 할 수 있다. CTC는 악성 종양 환자의 말초혈액에서 발견되는 종양세포이다. CTC가 암전이 과정에서 중요한 역할을 하기 때문에 CTC는 암의 연구, 진단 등에 있어서 매우 중요하게 여겨지고 있으나, 말초혈액 내 순환종양세포 존재 수가 매우 드물어, 수백만 개 이상의 정상 혈구세포에 섞여 있는 수십 개 이하의 종양세포를 검출할 수 있는 정도의 민감도가 요구되는 검출 시스템이 필요하다.
본 발명에서 치료 반응성은 암의 성장률이 치료제와 접촉하지 않은 그의 성장과 비교해서 치료제와 접촉한 결과로서 억제된다면 치료제에 대해서 "반응성"이라고 정의할 수 있다. 암의 성장은 다양한 방식으로 측정될 수 있고, 예를 들어, 종양의 크기 또는 그 종양 유형에 적합한 종양 마커의 발현이 측정될 수 있다. 아울러, 상기 “반응성”에는 유의미한 생존곡선상의 생존시기의 증가를 나타낼 수도 있다.
암은 성장률이 치료제와 접촉하지 않은 그의 성장과 비교해서 치료제와 접촉한 결과로서 매우 낮은 정도로 억제되거나 억제되지 않는다면 치료제에 대해서 "비반응성"이다. 위에서 언급된 바와 같이, 암의 성장은 다양한 방식으로 측정될 수 있고, 예를 들어, 종양의 크기 또는 그 종양 유형에 적합한 종양 마커의 발현이 측정될 수 있다. 비반응성의 척도는 환자의 삶의 질, 전이도 등을 비롯하여 종양의 성장 크기를 넘는 추가의 기준을 이용해서 평가될 수 있다.
암 치료제에 대한 치료 반응성으로 EGFR (epidermal growth factor receptor)의 저해제에 대한 치료 반응성일 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 암은 악성흑색종, 백혈병, 갑상선암, 직장대장암 및 폐암 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
Ras 유전자의 변이는 암의 유전적 변이에 있어서 가장 흔하게 발견되는 돌연변이 중 하나이다. 이 중 NRAS 돌연변이는 GTP를 GDP로 가수분해하는 NRAS의 기능에 영향을 주어 NRAS가 계속적으로 활성화 상태가 되도록 한다. NRAS 유전자의 엑손 2 및 3에서의 돌연변이는 잘 알려져 있으며, 최근 엑손 4에서의 돌연변이가 발견되었고, 이는 대장암 환자에서 약물의 반응성에 영향을 미친다는 것이 보고되고 있다(BMJ Open. 2014 May 23;4(5):e004652.).
NRAS의 유전자 돌연변이는 20%의 악성흑색종, 12%의 백혈병, 8% 갑상선암 및 2~3%의 대장암 환자에서 발견이 되는 것으로 보고되고 있다. 악성 흑색종, 갑상선암 및 대장암에서 NRAS의 돌연변이는 주로 codon 61에서 발견이 되나, 혈액암에서는 다양한 코돈에서의 돌연변이가 병변에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. NRAS 유전자의 돌연변이는 방사선 요법 및 EGFR 저해제 치료 요법에 대한 저항성과 연관이 있는 것으로 보고되고 있다. NRAS 변이가 존재하면 세툭시맵 또는 파니툼맵에 대한 약효가 나타나지 않을 것이라는 점이 예측될 수 있기 때문에, 변이된 NRAS 를 지니는 환자들은 이들 EGFR 억제제를 이용한 치료 요법에 대한 효과를 나타내지 못할 수 있다.
악성흑색종, 백혈병, 갑상선암, 직장대장암, 폐암 등의 암을 치료하기 위하여 다양한 EGFR 표적 약물이 개발되었으며, 이의 대표적인 예로는 세툭시맵(cetuximab) 또는 파니툼맵(panitumumab)를 들 수 있다.
본 발명의 시료에서 분리되는 핵산은 바람직하게는 게놈 DNA이며, 더 바람직하게는 돌연변이를 보유하고 있을 것으로 추정되는 게놈 DNA이다.
본 발명의 조성물 또는 키트는 바람직하게는 자동화 또는 반자동화된 방법의 NRAS 돌연변이 검출에 이용될 수 있다. 상기에서 자동화는 샘플 (시료)의 투입; 추출, 분리, 반응이 완료된 기재 (예를 들어, 튜브, 플레이트)의 재배치 또는 이동; 시약, 버퍼의 스톡 (stock)에의 투입, 보충; 장비의 유지관리를 제외한 전부 또는 대부분 과정이 인간 이외의 수단 (예를 들어, 로봇)을 통해서 이루어지는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물 또는 키트는 NRAS 유전자의 돌연변이의 검출에 있어서 우수한 민감도로 돌연변이 검출하였으며, NRAS와 높은 homologous를 보이는 K-ras와 교차반응 없이 각 키트에 상응하는 돌연변이 사이트만을 검출하는 우수한 특이도를 나타내었다.
참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990); Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997); Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987); De Andres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995); Held et al., Genome Research 6:986-994 (1996); T.E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)).
본 발명의 프라이머/프로브 세트는 암 환자의 치료제에 대한 반응성 예측, 진단뿐만 아니라 암의 전이 또는 재발에 대한 예측이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 표준물질로 사용될 mini-clone의 모식도롤 나타낸 도면이다.
도 2는 NC1-F6 정방향 프라이머 및 NC1-R61 역방향 프라이머 쌍의 검출 민감도 및 직선성을 평가한 결과이다(A: 검출 민감도, B: 검출 직선성)
도 3은 NC23-F4 정방향 프라이머 및 NC23-R4 역방향 프라이머 쌍의 검출 민감도 및 직선성을 평가한 결과이다(A: 검출 민감도, B: 검출 직선성)
도 4는 NC39-F8 정방향 프라이머 및 NC39-R10 역방향 프라이머 쌍의 검출 민감도 및 직선성을 평가한 결과이다(A: 검출 민감도, B: 검출 직선성)
도 5는 NC39-F10 정방향 프라이머 및 NC39-R9 역방향 프라이머 쌍의 검출 민감도 및 직선성을 평가한 결과이다(A: 검출 민감도, B: 검출 직선성)
도 6은 NRAS 돌연변이 검출용 키트에 포함된 프라이머 구성, 프로브의 구성 및 검출 가능한 돌연변이의 종류를 나타낸 것이다.
도 7은 NRAS 돌연변이 검출용 프로브들이 NRAS 돌연변이를 특이성 있게 검출하는지를 교차반응 여부로 평가한 결과를 나타낸 도면이다(A: NP8, B: NP9-1, C: NP10, D: NP11-1, E: NP12, F: NP13).
도 8은 NRAS allele specific-NC14 프라이머가 KRAS와 교차반응을 하는지 여부를 평가한 결과이다(A: NC14, B: NRAS exon 3, 4 miniclone, C: KRAS cxon 2, 3, 4 miniclone).
도 9는 NRAS와 높은 homologou를 갖는 KRAS 돌연변이 miniclone을 이용하여 본 발명의 프라이머 및 프로브가 교차반응을 나타내는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 도면이다(A: NP4-CP:21, B: NP6-CP:22, C: NP18-CP: 22, D: NP10-CP:22).
도 10은 NRAS 돌연변이 검출용 프로브와 NRAS 돌연변이 miniclone들 간의 교차반응 여부에 대한 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 NRAS 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브가 ddPCR 적용시 NRAS와 높은 homologuou를 가지는 KRAN 돌연변이 miniclone과 교차반응을 하는지 여부에 대한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 allele specific-NC15 프라이머 및 allele specific-NC16 프라이머들의 직진성을 평가한 결과이다.
도 13은 본 발명의 NRAS 돌연변이 검출용 키트 내 MMX1, MMX3 및 MMX6에 포함된 프로브 mixture에 대한 해당 돌연변이 site에 대한 특이도를 평가한 결과이다.
도 14는 같은 형광을 갖는 allele specific-프라이머 상호간에 간섭받지 않고 각 프라이머에 해당하는 돌연변이 site를 검출할 수 있는지 여부를 평가한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 블로커 올리고뉴클레오티드를 사용하였을 때의 돌연변이 검출 효과를 평가한 결과이다.
도 16는 NRAS 돌연변이 검출용 키트의 MMX1 또는 MMX2의 프라이머 및 프로브가 해당 돌연변이 site를 검출할 수 있는지 여부를 평가한 결과이다.
도 17는 NRAS 돌연변이 검출용 키트의 MMX3 또는 MMX4의 프라이머 및 프로브가 해당 돌연변이 site를 검출할 수 있는지 여부를 평가한 결과이다.
도 18은 NRAS 돌연변이 검출용 키트의 MMX5 또는 MMX6의 프라이머 및 프로브가 해당 돌연변이 site를 검출할 수 있는지 여부를 평가한 결과이다.
도 19는 FFPE reference 표준샘플에서 NRAS 돌연변이 검출용 키트가 NRAS 돌연변이를 검출할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, horizon사의 FFPE 조직 (HD412와 HD351)에서 추출한 DNA(Q61L, Q61K)와 human genomic DNA(#G3041,Promega, LOT#0000092266)내 돌연변이 site를 본 발명의 키트로 검출한 결과이다.
도 20은 돌연변이 빈도수(frequency)를 제공하는 FFPE reference 표준샘플에서 본 발명의 NRAS 돌연변이 검출키트가 검출해 낸 돌연변이 copy 수를 측정한 결과이다.
도 2는 NC1-F6 정방향 프라이머 및 NC1-R61 역방향 프라이머 쌍의 검출 민감도 및 직선성을 평가한 결과이다(A: 검출 민감도, B: 검출 직선성)
도 3은 NC23-F4 정방향 프라이머 및 NC23-R4 역방향 프라이머 쌍의 검출 민감도 및 직선성을 평가한 결과이다(A: 검출 민감도, B: 검출 직선성)
도 4는 NC39-F8 정방향 프라이머 및 NC39-R10 역방향 프라이머 쌍의 검출 민감도 및 직선성을 평가한 결과이다(A: 검출 민감도, B: 검출 직선성)
도 5는 NC39-F10 정방향 프라이머 및 NC39-R9 역방향 프라이머 쌍의 검출 민감도 및 직선성을 평가한 결과이다(A: 검출 민감도, B: 검출 직선성)
도 6은 NRAS 돌연변이 검출용 키트에 포함된 프라이머 구성, 프로브의 구성 및 검출 가능한 돌연변이의 종류를 나타낸 것이다.
도 7은 NRAS 돌연변이 검출용 프로브들이 NRAS 돌연변이를 특이성 있게 검출하는지를 교차반응 여부로 평가한 결과를 나타낸 도면이다(A: NP8, B: NP9-1, C: NP10, D: NP11-1, E: NP12, F: NP13).
도 8은 NRAS allele specific-NC14 프라이머가 KRAS와 교차반응을 하는지 여부를 평가한 결과이다(A: NC14, B: NRAS exon 3, 4 miniclone, C: KRAS cxon 2, 3, 4 miniclone).
도 9는 NRAS와 높은 homologou를 갖는 KRAS 돌연변이 miniclone을 이용하여 본 발명의 프라이머 및 프로브가 교차반응을 나타내는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 도면이다(A: NP4-CP:21, B: NP6-CP:22, C: NP18-CP: 22, D: NP10-CP:22).
도 10은 NRAS 돌연변이 검출용 프로브와 NRAS 돌연변이 miniclone들 간의 교차반응 여부에 대한 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 NRAS 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브가 ddPCR 적용시 NRAS와 높은 homologuou를 가지는 KRAN 돌연변이 miniclone과 교차반응을 하는지 여부에 대한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 allele specific-NC15 프라이머 및 allele specific-NC16 프라이머들의 직진성을 평가한 결과이다.
도 13은 본 발명의 NRAS 돌연변이 검출용 키트 내 MMX1, MMX3 및 MMX6에 포함된 프로브 mixture에 대한 해당 돌연변이 site에 대한 특이도를 평가한 결과이다.
도 14는 같은 형광을 갖는 allele specific-프라이머 상호간에 간섭받지 않고 각 프라이머에 해당하는 돌연변이 site를 검출할 수 있는지 여부를 평가한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 블로커 올리고뉴클레오티드를 사용하였을 때의 돌연변이 검출 효과를 평가한 결과이다.
도 16는 NRAS 돌연변이 검출용 키트의 MMX1 또는 MMX2의 프라이머 및 프로브가 해당 돌연변이 site를 검출할 수 있는지 여부를 평가한 결과이다.
도 17는 NRAS 돌연변이 검출용 키트의 MMX3 또는 MMX4의 프라이머 및 프로브가 해당 돌연변이 site를 검출할 수 있는지 여부를 평가한 결과이다.
도 18은 NRAS 돌연변이 검출용 키트의 MMX5 또는 MMX6의 프라이머 및 프로브가 해당 돌연변이 site를 검출할 수 있는지 여부를 평가한 결과이다.
도 19는 FFPE reference 표준샘플에서 NRAS 돌연변이 검출용 키트가 NRAS 돌연변이를 검출할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, horizon사의 FFPE 조직 (HD412와 HD351)에서 추출한 DNA(Q61L, Q61K)와 human genomic DNA(#G3041,Promega, LOT#0000092266)내 돌연변이 site를 본 발명의 키트로 검출한 결과이다.
도 20은 돌연변이 빈도수(frequency)를 제공하는 FFPE reference 표준샘플에서 본 발명의 NRAS 돌연변이 검출키트가 검출해 낸 돌연변이 copy 수를 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
표준물질로 사용될 clone의 제작
디자인된 프라이머와 프로브를 검증하기 위해, 그리고 ddPCR 수행에 필요한 표준물질을 만들기 위해 본 연구단계에서 mini-clone을 제작하였다. Mini-clone의 제작과정은 먼저 EGFR의 각각 exon에서 돌연변이가 일어난 구간, 즉 probe 위치를 가운데로 하여 약 300bp을 합성하였다. 합성된 die 300bp DNA fragment는 vector pUC57 vector의 universal link sequence 사이에 삽입하고(도 1 참조), 제작된 clone은 대장균 DH5α 세포에 형질전환 (transformation) 시켰다.
<실시예 2>
프라이머/프로브 디자인 및 선발
대장직장암 관련 유전자인 NRAS의 바이오 마커를 개발하기 위해 cosmic번호 (http://cancer.sanger.ac.uk)를 기반으로 하여 돌연변이 위치를 확인하였다. 유전자의 exon별 프라이머를 primer3 plus 프로그램과 PyroMa가 Assay Design 2.0을 사용하여 NRAS aexon 2,3,4의 forward는 모두 intron부분과 overlapping될 수 있도록 디자인 하였으나 reverse primer는 forward primer와 맞는 조건을 찾기위해 intron 부분이 포함되지 않은 것도 포함되었다. 이 때, 프라이머의 Tm값은 58~60℃로 하였으며 GC%는 40~60%로 디자인하였다. 프라이머 다이머 및 헤어핀 루프를 확인한 후 Blast search를 통해 해당 서열들의 homology를 확인 하였다.
프로브는 조건을 충족하는 것들을 선별하여 taqman probe로 디자인하였다. 5‘ wild type 프로로브에는 HEX/FAM reporter fluorescence를 부착하였으며, 5’ mutant probe에는 FAM dye를 부착하여 이후에 증폭 여부를 검출가능하도록 하였다. 모든 프로브의 3' 쪽에는 quencher로 BHQ1를 사용하였다. NRAS exon 2, 3, 4번에 각각 10, 5, 5개의 프로브들이 final로 결정되어 프로브들을 디자인하여 합성하였다. 본 발명자들에 의해 디자인된 프로브는 allele specific을 갖고 있으며 대부분의 프로브들이 cosmic 번호를 가지고 있었다.
NRAS의 exon 별 10쌍이상의 프라이머(Forward, Reverse set)를 선별하여 SYBR green을 이용해 serial dilution한 9개의 wild type miniclone 을 template로 하여 saturation point 와 R2 값이 0.999에 가까운 프라이머 1쌍을 선정하여 이후 실험에 사용하였다. 프라이머 농도는 10 pmoles/ul로 결정하여 사용하였다.
이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.
도2 는 NRAS RUO kit 구성을 위한 선택된 primer 들로서 선택요건을 프라이머의 민감도를 테스트하였다. 민감도를 알아보기 위한 항목들은 프라이머가 작동가능한 DNA의 시료농도를 희석하여 측정범위 산출하였으며 또한 그 측정범위의 최소 량도 산출하였다. 또한 이 프라이머의 성능을 알아보는 지표로는 지선성을 산출하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 프라이머 선별을 하기 위해 109 에서 101 까지의 miniclone DNA 카피수를 이용하여 직선성 값을 구한 결과, 모든 프라이머의 Cp값 20~24 로 안정한 값을 취하며 직선성의 R2이 0.99이상을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 프라이머의 민감도는 miniclone의 101 카피에서도 보이고 있어 매우 우수한 것으로 확인되었다.
한편, background(noise)를 줄이기 위해 돌연변이 위치에 상응하는 야생형 시퀀스를 이용하여 돌연변이 검출용 프로브가 야생형 시퀀스에 non-specific하게 결합하지 못하도록 blocker oligomer를 제작하였다.
디자인된 프라이머(표 1), 프로브(표 2) 및 블로커(표 3)의 정보는 다음과 같다.
상기 제작된 프라이머와 프로브를 조합하여 NRAS의 총 43개의 돌연변이를 검출할 수 있는 NRAS 돌연변이 검출용 RUO 키트를 구성하였으며, 상기 키트에 포함된 조성물의 구성은 도 6에 나타내었다.
<실시예 3>
프로브, 프라이머의 특이성 테스트
프로브가 서로 다른 돌연변이 clone과도 교차반응이 일어나는지를 알아보기 위해 NRAS 돌연변이 위치에 특이적으로 결합하는 프로브를 디자인하였다. 상기 디자인된 프로브 선별 과정에서 Ct값이 20~25를 해당하는 copy수인 105 copy의 miniclone template를 이용하여 각각의 프로브가 같은 엑손 또는 다른 엑손의 돌연변이간 cross-reactivity가 있는지 여부를 qPCR로 확인하였다.
qPCR 조건은 선행된 실험 조건을 따라 annealing/extension 온도를 67℃로 올려 30cycle로 증폭으로 실험을 수행하였고, 따라서 이후 실험에 사용하는 모든 프로브의 농도를 2pmoles/ul, annealing/extension 온도는 67℃, 30cycle로 고정으로 PCR 조건을 확립하였다.
본 발명의 상기 프로브들이 NRAS 돌연변이를 특이성 있게 검출하는지를 교차반응 여부를 통해 평가하였으며, 이에 대한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 각각의 프로브는 각각의 미니클론에서 특이도를 보였으며, Exon2 안에 위치한 각 mutation 프로브를 같은 exon2와 다른 exon 3,4 모두와 교차 반응을 수행한 결과 각 프로브 간에 상응하는 miniclone 및 같은 codon에만 특이도를 보이고 다른 exon간에는 교차반응이 없어 매우 우수한 검출 특이도를 나타내는 것을 확인하였다.
한편, 상기 NRAS 돌연변이 검출용 RUO 키트에 포함되어 있는 allele specific(AS) 프라이머간에 다중 PCR(multiplex PCR)을 수행하여 교차반응을 나타내는지 여부를 확인하였으며, 이에 대한 결과를 도 8에 나타내었다..
도 8에 나타낸 바와 같이, AS-NC14 primer는 같은 codon의 돌연변이들과 반응을 보였으나 같은 exon 내 다른 codon 돌연변이들 및 다른 NRAS exon 그리고 K-ras exon 2,3,4의 miniclone과 교차반응을 하지 않았음.
또한 NRAS와 높은 homologou를 같는 KRAS 돌연변이에 대해서도 본 발명의 프라이머 및 프로브가 교차반응을 나타내는지 여부를 확인하고지 실험을 수행하였으며, 이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, NRAS 프로브 NP4, NP6, NP18, NP10은 그에 상응하는 miniclone과 NRAS의 다른 exon 3, 4 그리고 KRAS exon 2, 3, 4 wild type miniclone을 이용하여 본 발명의 프라이머 및 프로브가 교차반응을 나타내는지 여부를 확인하고자 실험을 수행하였으며, 교차반응을 실험한 결과 각 프로브에 해당하는 miniclone을 이용한 Cp값은 21~22을 보였으며, 관계없는 miniclone과는 Cp값이 35이상으로 교차반응을 보이지 않는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 4>
ddPCR 적용시 프로브들의 특이성 테스트
표준물질로서 제작된 miniclone을 이용하여 ddPCR(droplet digital PCR)을 이용한 기초실험을 수행하였다. Miniclone의 정량은 qubit으로 하였으며, DNA 정량은 Invitrogen사의 qubit으로 3번 정량하여 실험값으로 사용하였다. Circular form과 super coiled form 포함을 가지는 plasmid를 linearized 시켜줌으로써 ddPCR의 효율을 극대화할 수 있다. Incubator에서 30분 반응 후 5ul는 따로 취해서 Gel runing하여 확인하고 나머지 volume은 정량 후 103 copies/ul(1/10 step으로)되게 dilution하여 -20도 냉동고에 보관하였다.
Template로서 각 프로브에 맞는 digested NRAS miniclone들을 103 copy가 되게 넣어줌으로써 각 프로브(2pmole/ul)가 그에 상응하는 NRAS miniclone과 ddPCR이 잘 되는지 알아보기 위한 실험을 진행하였다.
또한, NRAS 프로브와 NRAS 돌연변이 miniclone들 간의 교차반응 여부에 대한 실험을 진행하였다. 즉, NRAS exon 2, 3, 그리고 4에 해당하는 모든 돌연변이 검출용 프로브들은 각 exon에 제작된 NRAS wild-type/ mutant miniclone들과 교차반응을 나타내는지 여부를 확인하고자 하였다. 실험의 조건은 총 reaction volume을 20ul하며 PCR 조건은 annealing과 extension 온도를 62℃로 하였다. ddPCR 반응에 사용된 샘플은 제작된 miniclone과 human genomic DNA(#G3041,Promega, LOT#0000092266)의 103 카피 (약 3.3ng)을 spiking 하여 50% 돌연변이 frequency로 만들어 사용하였다.
이에 대한 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 103 카피의 같은 miniclone과 gDNA를 사용하여 실험을 수행한 결과 NRAS mutant를 검출하는 프로브에 상응하는 mutation 사이트에만 반응하는 특이도를 보여줌을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명의 프라이머 및 프로브가 ddPCR 적용시 NRAS와 높은 homologuou를 가지는 NRAS 돌연변이 miniclone과 교차반응을 하는지 여부에 대한 실험을 진행하였고, 이에 대한 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 각각의 프로브들은 103 카피의 각각의 프로브들은 103 카피의 NRAS AS-primer에 상응하는 NRAS miniclone을 사용하여 실험을 수행한 결과 NRAS AS-primer는 KRAS 및 NRAS의 다른 exon과 교차반응이 없었으며 각 프라이머에 상응하는 같은 codon mutation 사이트에만 반응하는 특이도를 보여주는 것을 확인하였다.
<실시예 6>
Allele specific 프라이머의 직선성 평가
103 카피로 고정된 DNA농도에서 돌연변이 빈도 %를 50%, 5%, 0.5%, 0.05%로 희석하여 allele specific 프라이머의 직선성을 평가하였다. 그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, R2 값이 1로 나타나, 이 primer 방식의 돌연변이 검출법도 유용하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 7>
동일 형광으로 구성된 프로브 또는 프라이머의 검출능 평가
하나의 mixture 안에 FAM 프로브 혹은 HEX 프로브을 섞어서 상호간에 간섭받지 않고 각 프로브 또는 프라이머에 해당하는 돌연변이 site를 검출할 수 있는지 여부를 평가하기 위한 실험을 진행하였다.
이에 대한 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 한 반응에 들어갈 같은 codon 돌연변이를 검출할 수 있는 프로브들의 mixture에 대한 특이도를 본 결과 gDNA에는 반응하지 않고 사용된 프로들에 해당하는 돌연변이 clone들을 검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
또한 도 14에 나타낸 바와 같이, 같은 codon을 검출할 수 있는 allele specific-primer들을 한 반응에 섞어 실험한 결과 gDNA에사는 cut-off로 해당하는 돌연변이 miniclone들과 구분할 수 있었으며 해당하는 돌연변이 사이트를 검출할 수 있었다.
또한, FAM/HEX 프로브들을 섞어서 다중 PCR을 수행할 때 서로 간섭받지 않고 각 프로브에 해당하는 돌연변이 site를 검출할 수 있는지 여부를 평가하기 위한 실험을 진행하였다.
이에 대한 결과를 도 15 내지 도 17에 나타내었다.
도 15 내지 도 17에 나타낸 바와 같이, 한 reaction (MMX)에 두 개의 exon에 해당하는 돌연변이 site을 혼합한 후, 두 exon을 구분하기 위해 각각의 TaqMan probe인 다른 형광색을 띄는 FAM과 HEX를 사용하였고 PCR 반응을 위한 프라이머도 두 exon 에 해당하는 프로브들을 혼합하여 반응하게 하였다. 프로브와 프라이머가 서로 혼합 되었지만 서로 간섭반응을 보이지 않고 해당하는 돌연변이 site만을 검출하는 것을 확인할 수 있었다.
또한 6개의 reaction을 통하여 41개의 NRAS 돌연변이를 검출할 수 있으며 codon으로 그 돌연변이를 구별할 수 있었다. 특히, MMX2에 Exon 2 WT probe, NP23-2를 이용하여 환자샘플에 대한 quality를 확인할 수 있도록 키트가 제작되었다. 또한, 본 키트는 MMX1에 대장직장암에 NRAS 돌연변이 (codon12와 codon61)의 frequency 가 높게 나타나는 프로브를 한 mixture에 반응하도록 디자인되었다.
한편, 본 발명자들은 PCR 수행시 background (noise)를 줄이기 위해 돌연변이 위치에 상응하는 wild-type 서열을 이용하여 돌연변이 검출용 프로브가 야생형 서열에 non-specific 하게 binding 하지 못하도록 디자인 한 oligomer (블로커)를 추가적 디자인 하여 multiplex PCR 반응에 첨가하였다. 그 결과 도 18에 나타낸 바와 같이, 프로브들의 mix는 base line이 올라가는 것을 초래하여 non-specific 과 positive signal이 분리가 되지 않았으나 WT 블로커를 첨가한 결과 non-specific 과 분리가 용이하게 되는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 6>
FFPE reference 표준샘플에 대한 돌연변이 검출능 평가
본 발명의 키트 조성물이 FFPE reference 표준샘플에서 돌연변이를 우수하게 검출할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, Horizon사의 FFPE 조직 (HD412와 HD351)에서 추출한 DNA(Q61L, Q61K)와 human genomic DNA(#G3041,Promega, LOT#0000092266)을 이용하여 본 연구의 RUO kit로 분석 하였다.
이에 대한 결과를 도 19 및 도 20에 나타내었다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 각 돌연변이에 상응하는 NRAS 프로브로 검체 내의 돌연변이가 검출이 되었다. 또한 도 20에 나타낸 바와 같이 돌연변이 frequency를 제공하는 샘플로 검출 된 카피 수를 분석한 결과 reference와 정확한 카피수를 나타내어 본 발명의 키트가 우수한 돌연변이 검출능을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 프라이머/프로브 세트는 암 환자 예후의 치료제에 대한 반응성 예측, 진단뿐만 아니라 암의 전이 또는 재발에 대한 예측이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적으로 유용하게 사용할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
<110> Gencurix Inc
Seoul National University R&DB Foundation
<120> Composition for detecting mutations of N-ras gene and kit
comprising the same
<130> np15-0094
<160> 52
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(NC1-F6)
<400> 1
ggttcttgct ggtgtgaaat gact 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(NC1-R6)
<400> 2
tctggattag ctggattgtc agtg 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(NC23-F4)
<400> 3
cccccaggat tcttacagaa a 21
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(NC23-R4)
<400> 4
cctgtcctca tgtattggtc tctc 24
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(AS-F14)
<400> 5
ggtggtggtt ggagcaaa 18
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(AS2-R5)
<400> 6
cctctatggt gggatcatat tca 23
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(AS-F15)
<400> 7
tggtggtggt tggagcacc 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(AS-F16)
<400> 8
tggtggtggt tggagcata 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(NC39-F10)
<400> 9
gccaagagtt acgggattcc at 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(NC39-R9)
<400> 10
ttgcacaaat gctgaaagct gta 23
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(AS-F30-1)
<400> 11
gacatactgg atacagctgg ta 22
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(AS3-R4)
<400> 12
ttattgatgg caaatacaca gag 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(AS-F32-3)
<400> 13
catactggat acagctggaa g 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(AS-F33-3)
<400> 14
catactggat acagctggat t 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(AS-F37-3)
<400> 15
atactggata cagctggact g 21
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(NC39-F8)
<400> 16
ttagggagca gattaagcga gta 23
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(NC39-R10)
<400> 17
ttcgtgggct tgttttgtat c 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(AS-F19)
<400> 18
gtggtggttg gagcaggtaa 20
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(AS-F20)
<400> 19
tggtggttgg agcaggtta 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(AS-F21)
<400> 20
ggtggttgga gcaggtgtc 19
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP24-1)
<400> 21
ctggatacag ctggaaaaga agagtaca 28
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP25-1)
<400> 22
tggatacagc tggacgagaa gagtac 26
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP2-2)
<400> 23
tggttggagc aagtggtgtt g 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP3-1)
<400> 24
tggtggttgg agcatgtggt g 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP5-2)
<400> 25
tggttggagc agatggtgtt g 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP6-1)
<400> 26
tggttggagc agttggtgtt g 21
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP8)
<400> 27
ttggagcagg tagtgttggg aa 22
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP9-1)
<400> 28
tggagcaggt tgtgttggga 20
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP10)
<400> 29
tggttggagc aggtcgtgtt g 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP11-1)
<400> 30
tggttggagc aggtgatgtt g 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP12)
<400> 31
tggttggagc aggtgttgtt g 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP13)
<400> 32
tggttggagc aggtgctgtt g 21
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP23-2)
<400> 33
tggttataga tggtgaaacc tgtttg 26
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(AP2W)
<400> 34
tgggaaaagc gcactgacaa 20
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP38-1)
<400> 35
tggacatact ggatacagat ggacaag 27
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP43-2)
<400> 36
tggacatact ggatacaact ggacaag 27
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP27-1)
<400> 37
tggatacagc tggacatgaa gagtaca 27
<210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP28-1)
<400> 38
tggatacagc tggacacgaa gagtac 26
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP31-1)
<400> 39
tggatacagc tggagaagaa gagtaca 27
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP35-1)
<400> 40
tggatacagc tggaccagaa gagtac 26
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP40-1)
<400> 41
ttgaaacctc aaccaagacc agaca 25
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(AP3W)
<400> 42
caatacatga ggacaggcga agg 23
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP4)
<400> 43
tggtggttgg agcacgtgg 19
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP7)
<400> 44
tggttggagc agctggtgtt 20
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP18)
<400> 45
tggttggagc aggcggtgt 19
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(AP2W)
<400> 46
tgggaaaagc gcactgacaa 20
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP41)
<400> 47
tgggaaacaa ctgtgatttg cca 23
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe(NP42-1)
<400> 48
tgggaaacaa ttgtgatttg cc 22
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Blocker(N-ex3-b1)
<400> 49
ctggatacag ctggacaaga agagt 25
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Blocker(N-ex2-b1)
<400> 50
tggagcaggt ggtgttgg 18
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Blocker(N-ex4-b2)
<400> 51
tgaaacctca gccaagacca ga 22
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Blocker(N-ex4-b1)
<400> 52
gtgggaaaca agtgtgattt gc 22
Claims (22)
- 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 21 내지 26 로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 27 내지 32로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 정방향 프라이머, 및 서열번호 34 내지 36으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 37 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 정방향 프라이머, 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; 및
서열번호 16의 정방향 프라이머, 서열번호 17의 역방향 프라이머, 서열번호 18의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 19의 정방향 프라이머, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 46 내지 48로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 NRAS 유전자 돌연변이 검출은 EGFR 저해제에 대한 치료 반응성 (responsiveness) 예측을 위한 것임을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 EGFR 저해제는 세툭시맵(cetuximab) 또는 파니툼맵(panitumumab)인 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프로브는 형광물질과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 형광물질은 VIC, HEX, FAM, EverGreen dye로 이루어진 군에서 선택된 하나이상인 것임을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
- 삭제
- 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 21 내지 26 로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트.
- 제8항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 49, 50 또는 서열번호 49 및 50의 블로커 올리고머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제8항에 있어서, 상기 키트는
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 27 내지 32로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 정방향 프라이머, 및 서열번호 34 내지 36으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 37 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 정방향 프라이머, 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; 및
서열번호 16의 정방향 프라이머, 서열번호 17의 역방향 프라이머, 서열번호 18의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 19의 정방향 프라이머, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 46 내지 48로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 세트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 RUO (research use only) 또는 IVD (investigation use only) 키트인 것을 특징으로 하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트.
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- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 qPCR (quantitative PCR) 또는 digital PCR 방법에 사용되는 것임을 특징으로 하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 혈액에서 분리된 cfDNA(cell-free DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 FFPE (formalin fixed parafin embedded) 조직에서 분리된 DNA 또는 상기 조직 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA (complementary DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 혈액에서 분리된 CTC (circulating tumor cell)에서 분리된 DNA 또는 상기 CTC 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA (complementary DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 하는 NRAS 유전자 돌연변이 검출용 키트.
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| KR1020150101919A KR102600347B1 (ko) | 2015-07-17 | 2015-07-17 | Nras 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020150101919A KR102600347B1 (ko) | 2015-07-17 | 2015-07-17 | Nras 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트 |
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Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (1)
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| PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0121891 (2015.05.08) 1부.* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| KR20170009605A (ko) | 2017-01-25 |
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