KR101766005B1

KR101766005B1 - 폐암 환자의 생존기간 예측용 키트와 생존기간 예측을 위한 정보 제공 방법

Info

Publication number: KR101766005B1
Application number: KR1020150040863A
Authority: KR
Inventors: 장윤수; 김은영; 황승용; 연종필; 임세리; 홍지영
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2015-03-24
Filing date: 2015-03-24
Publication date: 2017-08-08
Also published as: KR20160114784A

Abstract

본 발명은 상피세포성장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) 복합 돌연변이를 이용한 폐암 환자의 생존기간 예측용 키트와 생존기간 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명은 폐암 환자의 생존기간과 깊게 연관된 EGFR 복합 돌연변이를 비교적 정확하고 용이하게 검출할 수 있도록 한다. 이로써, 본 발명은 현재 암 사망의 주요 원인에 해당하는 폐암 환자의 예후를 보다 정확하게 예측하여 그에 따른 치료적 대비가 가능하도록 한다.

Description

폐암 환자의 생존기간 예측용 키트와 생존기간 예측을 위한 정보 제공 방법{Predicting kit for survival of lung cancer patients and the method of providing the information for predicting survival of lung cancer patients}

본 발명은 폐암 환자의 생존기간 예측용 키트와 생존기간의 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상피세포성장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)의 복합 돌연변이를 이용한 폐암 환자의 생존기간 예측용 키트와 생존기간 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

폐암은 전세계적으로 암으로 인한 사망에서 30%를 차지할 정도로 암으로 인한 사망의 주요 원인 중의 하나이다. WHO 연말 보고에 따르면, 2012년 기준 폐암은 전세계적으로 1,824,701 증례가 새로이 발생하고, 이중 대략 1,590,000명의 환자들이 동 질환으로 사망한 것으로 보고되었다. 동기간 동안 한국에서도 21,753명의 새로운 폐암 환자가 발생하였으며, 16,654명이 사망하는 등 폐암은 국내외적으로 암 사망률 1위에 해당하는 무서운 다빈도 질환이다(Jung KW et al., Prediction of cancer incidence and mortality in Korea, 2014. Cancer Res Treat 2014; 46: 124-130).

암 유발 돌연변이는 유전적 변화의 다양한 타입을 나타내는데, 이는 암의 발전 및 진행 유지에 중요한 요인으로 작용할 수 있다. 적절한 표적 치료제를 선택하여 활성화된 암 유발 돌연변이를 확인함으로써 많은 폐암 환자들의 의학적 결과를 개선시킬 수 있다. 암 유발 돌연변이에 기반한 표적 치료제의 적용은 종양 유전형질 분석을 치료 의사 결정에 이용할 수 있게 하였다(Kris MG et al., Using multiplexed assays of oncogenic drivers in lung cancers to select targeted drugs. Jama 2014; 311: 1998-2006).

한편, 폐암은 상피세포들의 비정상적인 가속화된 성장을 특징으로 하는 상피세포암(epithelial cell cancer)의 일종으로, 상피세포의 표면에 발현되는 표피성장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor; 이하 "EGFR")가 암화 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, EGFR 은 폐암 치료의 표적으로 인식되어 왔으며, EGFR 을 표적으로 하는 암 치료법의 대표적인 예로, EGFR 타이로신 키나아제 저해제(EGFR tyrosine kinase inhibitor: EGFR-TKI)의 개발을 들 수 있다.

상기한 EGFR 돌연변이는 다른 지역에서 보다 동아시아 지역의 폐선암 환자에게서 빈번하게 발견되는데, 종양 유전형질 분석의 발전으로 인해 소량의 샘플로부터 상기한 EGFR 돌연변이를 확인할 수 있게 되었다.

EGFR 돌연변이 중에는 LREA 모티프(아미노산 잔기 747 내지 750) 주변 엑손 19 결실이 EGFR 돌연변이 중 45%를 차지할 정도로 가장 많이 차지하고, 그 다음으로는 엑손 21의 L858R 점 돌연변이가 40%를 차지한다(Shigematsu H et al., Clinical and biological features associated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancers. J Natl Cancer Inst 2005; 97: 339-346; Sequist LV et al, Molecular predictors of response to epidermal growth factor receptor antagonists in non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol 2007; 25: 587-595; Tokumo M et al., The relationship between epidermal growth factor receptor mutations and clinicopathologic features in non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res 2005; 11: 1167-1173.). 그 외에도 EGFR 단백질 돌연변이로는 G719 위치의 엑손 18 점 돌연변이가 3%를 차지하고, 엑손 21 L861Q 돌연변이가 2%를 차지하며, 이러한 활성화된 돌연변이들은 EGFR-타이로신 카이네이즈 억제제(EGFR-tyrosine kinase inhibitors, TKIs)에 대한 민감도를 보인다(Mitsudomi T et al., Epidermal growth factor receptor in relation to tumor development: EGFR gene and cancer. Febs j 2010; 277: 301-308; Mitsudomi T et al., Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Sci 2007; 98: 1817-1824; Yeh P et al., DNA-Mutation Inventory to Refine and Enhance Cancer Treatment (DIRECT): a catalog of clinically relevant cancer mutations to enable genome-directed anticancer therapy. Clin Cancer Res 2013; 19: 1894-1901).

반면, EGFR 단백질 돌연변이 중 4 내지 10%의 빈도를 차지하는 EGFR 엑손 20의 인프레임 삽입 돌연변이와, 다른 희귀 돌연변이로, 예를 들어, L747S, D761Y, T790M, T854A는 EGFR-TKIs에 대한 저항성을 갖는다(Mitsudomi T et al., Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Sci 2007; 98: 1817-1824; Pao W et al., Rational, biologically based treatment of EGFR-mutant non-small-cell lung cancer. Nat Rev Cancer 2010; 10: 760-774; Yasuda H et al., EGFR exon 20 insertion mutations in non-small-cell lung cancer: preclinical data and clinical implications. Lancet Oncol 2012; 13: e23-31; Yasuda H et al., Structural, biochemical, and clinical characterization of epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 20 insertion mutations in lung cancer. Sci Transl Med 2013; 5: 216ra177.).

보다 정밀한 유전형질 분석 시스템의 의학적 적용을 위하여는 희귀한 EGFR 돌연변이의 생물학적 및 의료학적 중요성이 커지고 있다. 게놈 DNA의 대략적 위치의 잔기에서 돌연변이가 존재하는 경우라도 각각 EGFR-TKI에 대하여 다른 반응성을 보일 수 있다. 예를 들어, EGFR 엑손 20의 인프레임 삽입의 경우, EGFR-TKI에 대하여 낮은 반응 비율(<5%)과 질병 컨트롤에 짧은 간격을 요구하여 EGFR-TKI 저항 돌연변이로 간주되나, A763_Y746 ins FQEA는 현재 EGFR-TKI에 대하여 민감한 돌연변이로 보고되고 있다. 따라서, 이러한 돌연변이들의 생물학적 및 의학적 의미에 대하여 지속적인 연구가 필요하다.

본 발명의 일 목적은 EGFR 복합 돌연변이를 이용하여 폐암 환자의 생존기간을 예측하기 위한 키트를 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 EGFR 복합 돌연변이를 이용하여 폐암 환자의 생존기간을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.

일반적으로 폐암과 관련된 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 돌연변이로는 단일 돌연변이(simple mutation)가 흔히 알려져 있지만, 일부 복합 돌연변이(multiple mutation)에 대하여는 알려진 바 없고, 더 나아가서 상기한 복합 돌연변이가 갖는 생물학적 및 의학적 의미에 대하여는 밝혀진 바가 전혀 없었다.

본 발명의 발명자들은 EGFR 돌연변이 중에서 폐암 환자의 생존기간과 관련된 복합 돌연변이를 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 돌연변이를 코딩하는 유전자와 혼성화될 수 있는 프로브 또는 프라이머 세트를 포함하며,

상기 돌연변이는 L858R 돌연변이, G719A 돌연변이, G719S 돌연변이, 엑손 19 결손, V689L 돌연변이, L833V 돌연변이, H870R 돌연변이, A871G 돌연변이, R776H 돌연변이, I706T 돌연변이, E709K 돌연변이 및 R776H 돌연변이로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 복합 돌연변이인 것을 특징으로 하는, 폐암 환자의 생존기간 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 돌연변이를 포함하는 단백질, 또는 이와 결합할 수 있는 항체를 포함하며,

상기 구체예에서, 상기 EGFR 돌연변이를 포함하는 단백질은 폐암 환자의 혈청 내 항체와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 폐암 환자의 생존기간 예측용 키트를 제공할 수 있고, 또는 상기 항체는 폐암 환자의 EGFR 돌연변이와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 폐암 환자의 생존기간 예측용 키트를 제공할 수 있다.

또한, 상기 EGFR을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가질 수 있고, 상기 EGFR은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

바람직하게는, 상기 복합 돌연변이는 EGFR-TKI 민감 돌연변이로 예를 들어, L858R 돌연변이, G719A 돌연변이, G719S 돌연변이 및 엑손 19 결손으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 돌연변이와,

엑손 18의 비전형 돌연변이로, V689L 돌연변이, I706T 돌연변이 및 E709K 돌연변이; 엑손 20의 비전형 돌연변이로, R776H 돌연변이; 및 엑손 21의 비전형 돌연변이로, L833V 돌연변이, H870R 돌연변이 및 A871G 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.

또한, 바람직하게는 상기 복합 돌연변이는 L858R 돌연변이와 엑손 19 결손을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 돌연변이 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 단계를 포함하며,

상기 돌연변이는 L858R 돌연변이, G719A 돌연변이, G719S 돌연변이, 엑손 19 결손, V689L 돌연변이, L833V 돌연변이, H870R 돌연변이, A871G 돌연변이, R776H 돌연변이, I706T 돌연변이, E709K 돌연변이 및 R776H 돌연변이로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 복합 돌연변이인 것을 특징으로 하는, 폐암 환자의 생존기간을 예측하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

여기서, 상기 EGFR을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

또한, 상기 EGFR은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

다만, 본 발명에서는 상기 복합 돌연변이의 검출은 차세대 염기서열 분석법에 의해 수행됨으로써 보다 용이하고 정확하게 폐암 환자의 생존기간과 관련된 EGFR 복합 돌연변이를 검출할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, "복합 돌연변이(multiple mutation)"는 EGFR 타이로신 키네이즈 도메인(EGFR-TKD)에서 독립적으로 분리된 돌연변이들의 2 이상의 조합을 의미하는 것이다.

본 발명의 일 구체예에서, "EGFR-TKI 민감 돌연변이(EGFR-TKI sensitizing mutation)"는 EGFR 타이로신 키네이즈 억제제(EGFR-TKI)에 대하여 대략 62-82%의 높은 반응 비율을 갖는 돌연변이를 의미하는 것이다.

본 발명의 일 구체예에서, "예후"는 환자에서의 전반적 생존기간, 무질병 생존기간, 무진행 생존, 이벤트가 없는 생존과, 암의 재발 가능성의 예측 및 종양의 전이 가능성을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 질병의 회복 가능성 또는 질병의 발병 가능성 또는 결과의 예측을 의미하는 것이다.

본 발명의 일 구체예에서, "무질병 생존(Disease-free survival)"은 이 업계의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 모니터링 대상이 되는 질병이 없는 상태로 생존하는 것을 일컫는 말이다.

본 발명의 일 구체예에서, "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)), 노던블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001))을 이용하여 실시할 수 있다.

RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시료를 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 단일가닥 cDNA를 제조한다. 이어, 단일가닥 cDNA를 주형으로 이용하고, 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 유전자-특이적 프라이머 세트는 하기 표 2에서 열거 되어 있다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 유전자의 발현량 변화를 측정한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 “차세대 염기서열 분석법”이란, 짧은 시간 내에 분석대상이 되는 시료에 대해 대량의 염기서열의 판독이 가능하고 대량의 염기서열 데이터를 생성할 수 있는 신개념의 염기서열 분석 기술로서, 예를 들어 로슈/454, 일루미나(Illumina)/Solexa 및 SOLiD와 같은 장비를 이용한 이용한 염기서열 분석기술 등을 들 수 있다(Michael L. Metzker, Aapplications of next-generation sequencing; Sequencing technologies the next generation, Nature Reviews Genetics, Vol.11, pp31-46, January 2010). 차세대 염기서열 분석 과정은 하기의 3단계로 구분될 수 있다.

(1) 엑솜의 포획

질병의 원인 유전자를 찾기 위하여 차세대 염기서열 분석법을 이용해 전장유전체(Whole-genome)를 시퀀싱하거나 엑솜 영역만을 목표로 하여 시퀀싱할 수 있다(Targeted sequencing). 엑솜 영역만을 시퀀싱하는 경우에는 비용이나 효율성 측면에서 유리하다. 또한 유전자의 변화가 암과 같은 직접적인 질병으로 나타나는 경우가 많기 때문에 엑솜 영역에서의 염기서열의 변화를 보는 것이 원인 유전자를 찾는데 효과적이라고 할 수 있다. 엑솜만을 시퀀싱하기 위해서는 엑솜만 포획할 수 있는 라이브러리가 필요하다. 가장 많이 사용되는 것이 SureSelect Human All Exon Kits(http:// www.genomics.agilent.com)이나, 이에 한정하는 것은 아니다. SureSelect Human All Exon Kits는 CCDS(Consensus CDS, NCBI, EBI, UCSC, Wellcome Trust Sanger Institute가 참여하여 정의한 인간 유전체의 유전자 세트) 엑손을 기초로 디자인 되었으며, 인간유전체의 1.22%에 해당하는 영역을 포함하고 있다.

(2) 대용량 병렬 DNA 시퀀싱

차세대 서열 확인법(Next Generation Sequencing: NGS)은 기존의 모세관 서열 확인법(capillary sequencing)에 비해서 빠르면서 한 번에 더 많은 양의 서열확인을 수행할 수 있고, 기존의 모세관 서열 확인법에 사용하는 벡터를 이용한 시료의 증폭 과정이 생략되기 때문에 이 과정에서 발생하는 실험적인 오류를 피할 수 있다는 장점이 있다. 현재 3곳의 회사에서 제작한 NGS 시스템이 주로 사용되고 있다. 2004년에 출시된 로슈(Roche)사의 454 GS FLX는 처음 소개된 NGS 장비로, 이 장치는 피로시퀀싱(pyrosequencing) 방법과 유화제-중합효소반응(emulsion-polymerase chain reaction)을 사용하여 서열 확인을 수행하고, 실험의 최종단계에서 나오는 빛의 세기에 따라서 특정 염기를 확인할 수 있다. 7시간 가동시켰을 때 100Mb 정도의 서열을 확인할 수 있는데, 기존의 ABI 3730 기기가 같은 시간에 440kb의 서열을 확인할 수 있는 것에 비해서 월등히 높은 성능을 나타낸다. 일루미나(Illumina)사의 Illimina Genome Analyzer는 합성에 의한 서열 확인(sequencing by synthesis)이라는 개념을 도입한 것으로, 유리판 위에 한 가닥만으로 이루어진 DNA 조각을 부착한 후에, 이 조각들을 중합반응을 거쳐서 군집(cluster)을 이루게 한다. 이 과정을 거칠 때 검사하려는 DNA 조각에 붙은 염기의 종류를 확인하면서 서열 확인법을 수행하는데, 약 4일 정도의 작업으로 32-40개의 염기길이를 가지는 단편이 4-5천만 개가 생산이 된다. 라이프 테크놀로지(Life Technologies)사의 SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation) 기기는 1 μm 크기의 자성 구슬에 검사하려는 DNA 조각을 부착시킨 후에 유화제-중합효소연쇄반응을 이용하여 서열 확인을 수행한다. 서열 확인을 할 때는 8-mer의 단편들을 반복해서 붙이는 방식을 사용하는데, 이 8-mer의 4, 5번째에 실제 서열 확인에 사용될 염기가 위치하고 있다. 그 뒤에 붙은 나머지 부위에는 형광물질이 연결되어 있어서 어느 염기가 검사하려는 DNA 조각에 상보적으로 결합하는 지를 표시해 준다. 한 번의 결합 주기마다 8-mer를 모두 5번 붙이고, 같은 작업을 5번 시행하면 총 25염기로 이루어진 DNA 조각의 서열을 확인할 수 있다. SOLiD 기기의 특징은 두 개의 염기를 이용한(two-base encoding) 서열 확인으로, 이 방법은 하나의 염기의 서열을 결정할 때 같은 부위를 두 번의 서열 확인을 통해서 확인하는 것이다. 자성구슬에 부착된 부착제(adaptor)쪽으로 한번의 결합 주기마다 한 염기씩 서열을 이동시키면서 서열 확인을 수행한다. 이 과정을 통해서 서열 확인 실험에서 발생하는 오류를 제거할 수 있는 장점이 있다.

(3) 염기서열 데이터의 분석

질병의 원인 유전자를 찾기 위해서는 기존의 유전자 염기서열로부터 어떤 변화가 일어났는지 조사해야 하기 때문에 개인(환자)의 염기서열 데이터(sequence reads)를 표준 염기서열(reference Genome)과 비교하는 작업을 하게 된다. 이 작업을 매핑(Mapping)이라고 한다. 매핑을 통해 개인과 표준 염기서열의 차이를 알아낸 후 이를 적당한 선택 기준을 정해 신뢰할 수 있는 염기서열 변이 정보만 추출(Variant Calling)하게 된다. 이 변이 정보는 단일염기서열변이(SNV: Single Nucleotide Variation)4)이거나 짧은 삽입/결실(Short Indel)이다. 그런 다음 염기서열 변이 정보를 기존 데이터베이스(dbSNP)와 비교하여 이미 밝혀진 변이인지 새롭게 발견된 변이인지 판단한다. 그리고 그 변이가 아미노산의 변화를 가져올 것인지 아닌지, 또한 단백질 구조에 있어서 어떤 영향을 줄 것인지 예측하게 된다. 이 과정을 주석달기(Annotation)라고 한다. 추출한 단일 염기서열 변이와 짧은 삽입/결실에 관한 정보는 정보의 품질을 더 높이기 위하여 데이터베이스에 등재하거나 전장유전체연관분석(Genome Wide Association Study; GWAS)과 통합 연구를 통해 질병의 원인 변이를 찾는 연구를 수행할 수도 있다.

다만, 본 발명의 명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에서 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명은 폐암 환자의 생존기간과 깊게 연관된 EGFR 단백질의 복합 돌연변이를 비교적 정확하고 용이하게 검출할 수 있도록 한다.

이로써, 본 발명은 현재 암 사망의 주요 원인에 해당하는 폐암 환자의 예후를 보다 정확하게 예측하여 그에 따른 치료적 대비가 가능하도록 한다.

도 1은 EGFR 돌연변이를 가진 폐선암 61례 중 EGFR 단일 돌연변이를 가진 증례와 EGFR 복합 돌연변이를 가진 증례의 무병 생존기간을 분석하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 EGFR 돌연변이를 가진 폐선암 61례 중 EGFR 단일 돌연변이를 가진 증례와 EGFR 복합 돌연변이를 가진 증례의 총 생존기간을 분석하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 EGFR 단일 돌연변이를 가진 증례에서 폐암 관련 주요 유전자의 미스센스 돌연변이를 나타낸 것이다.
도 4는 EGFR 복합 돌연변이를 가진 증례에서 폐암 관련 주요 유전자의 미스센스 돌연변이를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

환자의 특성 및 종양 DNA 샘플의 준비

연세 의료원과 연계된 병원으로부터, p스테이지 IB~IIA 병기의 폐선암을 진단받은 후 완치 목적의 외과 수술적 치료와 백금 제제를 기반으로 수술 후 보조항암화학요법을 받은 총 143명 환자의 샘플을 제공받았다. 그 중에서 EGFR 돌연변이를 보이면서 종양 유전형질 분석 전에 EGFR-TKI를 처리하지 않은 61례에 대하여 이하의 실험을 수행하였다.

모든 샘플은 파라핀으로 고정시킨 뒤, 실란화된 슬라이드에 4μM 두께로 로딩시켰다. 모든 블록의 각 슬라이드는 H&E 염색되었고, 암세포의 존재를 재확인한 뒤 밀집 지역을 표시하였다. 이 후, 암세포 밀집 지역을 미세 절개한 뒤, QIAamp DNA 추출 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 DNA(gDNA)를 추출하였다.

차세대 염기서열 분석( NGS )용 라이브러리 제작

gDNA 10㎍을 아이온 AmpliSeqTM 커스텀 패널(Ion AmpliSeqTM Custom Panel, Life Technologies)을 이용하여 증폭시켰다. 유전자 데이터 풀(Multiplex pool)은 Agencourt AmPure XP 비즈(Beckman Coulter Incorporated)를 이용하여 정제되었고, 아이언 엑스프레스 바코드 어뎁터(Ion Xpress barcode adapters, Life Technologies)로 결합하였다. 각 라이브러리의 조각 사이즈와 양은 고감도 칩(High Sensitivity Chip, Agilent, Santa Clara, CA)을 이용한 바이오어날라이져(BioAnalyzer)에 의해 분석되었다. 라이브러리는 희석되었고, 에멀젼 PCR 반응(emulsions PCR reactions)은 OnetouchTM 반응 키트(Life Technologies)를 사용하여 수행하였다; 그 후에, 다이나비즈R 마이원스트렙타아비딘 C1 비즈(DynaBeadsR MyOneTM Streptavidin C1 Beads)(Life Technologies)를 이용하여 에멀젼 PCR 결과물의 양을 증가시켰다. 최종적으로 양이 증가된 이온구(Ion spheres)들에 시퀀싱 프라이머 및 폴리머라제를 혼합시켰고, 5개의 318 v2 칩에 로딩하였다. 라이브러리는 심층 분석 대상(deep coverage)(1,000X 목표)에서 Ion 원터치 200 템플레이트 키트 v2 DL(Life Technologies)과 아이언 PGM 시퀀싱 200 키트 v2(Ion PGM Sequencing 200 kit v2, Life Technologies)를 318 v2 칩 키트(Life Technologies)와 함께 사용하여 아이언 토렌트 PGM 시퀀서(Ion Torrent PGM sequencer)로 시퀀싱을 수행하였다. 서열 확인은 레퍼런스 염기서열로 인간 GRCh37 게놈과 대조하며 수행되었고, 베이스 콜링(base calling)은 Ion Torrent 서버에서 t맵-f3을 이용하여 아이언 토렌트 수트 V3.4.2(Ion Torrent Suite V3.4.2)에 의해 수행되었다. 아이언 토렌트 배리언트 콜러(Ion Torrent Variant Caller, ITVC) v3.4는 돌연변이를 검출하고, 돌연변이 빈도를 5% 이상으로 높이기 위하여 사용되었다. Bam (Binary sequence Alignment/Map format) 및 FASTQ 파일 (정렬)은 염기서열 정보 추출 결과를 기반으로 수행되었고, 단일염기다형성(SNPs:Single Nucleotide Polymorphisms)이나 삽입/결손(INDELs)과 같은 염기서열의 변이 정보를 추출하는 데에 사용되었다.

통계적 분석

상기와 같이 제작된 라이브러리를 기반으로 61례의 EGFR 돌연변이들을 분석하여 그 결과를 표 1에 나타내었다. 변수들은 퍼센트로 나타내었고, χ²-테스트로 비교하였다. 두 독립된 샘플들 사이의 연속 변수들 분포의 차이는 Mann-Whitney U test를 이용하여 수행되었다. 상기 분석은 IBM SPSS 통계 버전 20 (IBM Corp)을 이용하여 수행되었으며, 통계적 테스트는 양측 검정으로 수행되었고, P-value <0.05는 통계적 유의성을 의미한다.

	EGFR 돌연변이 종류		증례 수	빈도(%)
단일 돌연변이	엑손 19 결손		24	39.3
	엑손 19 삽입	V738_K739insKIPVAI	1	1.6
	엑손 20 삽입	M766_A767insASV	1	1.6
	엑손 20 삽입	D770_N771insG+N771T	1	1.6
	엑손 20 돌연변이	N771F	1	1.6
	엑손 21 돌연변이	L858R	17	27.9
	엑손 21 돌연변이	L861R	1	1.6
복합 돌연변이	L858R+V689L		1	1.6
	L858R+L833V		1	1.6
	L858R+H870R		1	1.6
	L858R+A871G		1	1.6
	L858R+R776H		1	1.6
	L858R+엑손 19 결손		1	1.6
	G719A+I706T		1	1.6
	G719S+E709K		1	1.6
	G719S+R776H		1	1.6
	엑손 19 결손+I706T		2	3.3
	D770_N771insNPY+H773Y		1	1.6
	L688F+G824S		1	1.6
	E749Q+A750P		1	1.6
	T785I+Y813H+V845M+V851I+G857R		1	1.6
총 합계			61	100

(상기 표 1에서 '빈도'는 총 증례 수에 대한 해당 증례 수를 %로 나타낸 것이다.)

상기 표 1에서 보는 바와 같이, EGFR 돌연변이 중 가장 흔한 돌연변이로는 단일 돌연변이가 46례(75.4%)를 차지하였다. 보다 상세하게는, 상기 단일 돌연변이로는 엑손 19 결손이 24례(39.3%), 다음으로 L858R 점 돌연변이가 17례(27.9%), EGFR 엑손 20 삽입 돌연변이가 2례(3.2 %)를 차지하였다. 엑손 20 및 19 삽입이나 L861R과 관련한 점 돌연변이는 매우 적은 빈도를 나타내었다.

한편, 복합 돌연변이는 총 61례 중 15례(24.6%)를 차지하였는데, EGFR 단백질의 복합 돌연변이의 상당수(10례, 66.7%)가 G719X (n = 3), L858R (n = 6), 및 엑손 19 결손 (n = 1)과 같이 EGFR TKI-민감 돌연변이와 관련된 것을 볼 수 있다. 그리고, 1례는 L858R 돌연변이와 엑손 19 결손을 포함하는 것을 볼 수 있었으며, 엑손 20 삽입+H773Y 돌연변이나, 그 외의 희귀 돌연변이로 E749Q+A750P 및 L688F+G824S의 이중 돌연변이가 관찰되었고, 엑손 20 및 엑손 21에 분포된 다중 돌연변이(T785I+Y813H+V845M+V851I+G857R)도 관찰되었다.

본 발명은 EGFR 단백질 돌연변이를 검출함에 있어서 차세대 염기서열 분석법에 의함으로써 EGFR-TKD를 구성하는 엑손 18~21의 전체 서열을 파악할 수 있고, 이로써 종래에 폐선암과 관련된 EGFR 단백질 돌연변이로 알려진 단일 돌연변이 외에도 EGFR 복합 돌연변이를 빠르고 용이하게 확인할 수 있다.

EGFR 복합 돌연변이를 가진 증례의 임상적 및 병리적 특성 분석

폐암 환자 중 EGFR 단백질 돌연변이를 갖는 61례에 대하여 단일 돌연변이와 복합 돌연변이의 임상적 및 병리적 특성을 비교 분석하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

특성		단일 돌연변이(n=46)	복합 돌연변이(n=15)	p-value
나이(mean±SD); 년		59.6±10.52	58.9±7.93	0.778*
성별	남성	10	7	0.061**
성별	여성	36	8	0.061**
흡연상태	비흡연자	39	11	0.488**
	현 흡연자	4	2
	과거 흡연자	3	2
스테이지	IB	4	1	0.970**
	IIA	16	5
	IIB	2	1
	IIIA	24	8
최대 종양 직경(cm)		2.9±0.96	3.4±1.01	0.075**
조직학적 하위유형	비늘 우세형	3	0	0.732**
	포상 우세형	31	9
	유두/미세유두 우세형	7	4
	뮤신을 형성하는 고상 우세형	3	1
	기타	2	1

상기 표 2에서 보는 바와 같이, EGFR-TKD에 돌연변이를 갖는 폐선암 환자 61례의 연령 분포는 59 ± 9.9 세 (34~78세 범위)이고, 남성은 17례(2%), 여성은 44례(72.1%)를 차지하였으며, 남성 환자와 여성 환자에 있어서 폐암을 진단받았을 당시의 나이에는 큰 차이가 없었다.

또한, 다수의 경우(50례, 82%)에서 흡연 경험은 없었고, 현재 흡연자나 과거 흡연자는 각각 5례(9.8%)에 불과하였다.

이러한 임상적 분석 결과로부터 EGFR 단일 돌연변이와 EGFR 복합 돌연변이를 갖는 경우 폐선암의 발병 나이나 성 분포에 큰 차이를 갖지 않는 것을 알 수 있고, 흡연 경험이나 진단 당시의 p스테이지가 EGFR 돌연변이의 유형에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.

또한, 조직학적 하위유형 분포에 있어서, 비늘 우세형(lepidic predominant types)에서는 복합 돌연변이가 관찰되지 않았고, 유두/미세유두 우세형(papillary/micropapillary predominant types)과 뮤신을 형성하는 고상 우세형(solid predominant with mucin production type)에서는 복합 돌연변이가 각각 4례(26.7%) 및 1례(6.7%)로 많은 증례를 나타냈지만, 통계학적 유의성에는 미치지 못하였다.

또한, 폐종괴의 크기에 있어서도, EGFR 복합 돌연변이를 갖는 경우가 EGFR 단일 돌연변이를 갖는 경우에 비하여 종괴 크가가 상대적으로 큰 편이었으나, 이 역시 통계학적 유의성에는 미치지 못하였다(2.9 ± 0.96 vs. 3.4 ± 1.01 cm).

EGFR 복합 돌연변이를 가진 증례의 생존 분석

EGFR 복합 돌연변이를 가진 증례가 임상적 예후에 좋지 않은 영향을 주는지 확인하기 위하여, Kaplan-Myer 평가기를 이용해 생존 분석으로, 무병 생존기간(Disease Free Survival, DFS)과 총 생존기간(Overall Survival, OS) 을 평가하여 그 결과를 도 1 및 도 2에 각각 나타내었다. 단, 상기 분석은 IBM SPSS 통계 버전 20(IBM Corp)을 이용하여 수행되었으며, 통계적 테스트는 양측 검정으로 수행되었고, P-value <0.05는 통계적 유의성을 의미한다.

상기한 생존 분석은 총 81.9개월 (95% Confidence Interval: 65.7~98.1 개월)동안 수행되었고, 분석 동안 총 61례 중 33례(54.1%)에서 폐선암이 재발하였고, 15례(24.6%)는 분석 기간 동안 동질환으로 사망하였다.

도 1 및 도 2에서 보는 바와 같이, 무병 생존기간에 있어서는 단일 돌연변이나 복합 돌연변이 양자에서 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나, 총 생존기간의 경우, 복합 돌연변이가 단일 돌연변이의 경우보다 현저히 짧은 기간을 갖는 것을 볼 수 있었고(p=0.007, Log Rank test), 이를 통하여, 복합 돌연변이는 EGFR-TKI에 대하여 반응성이 매우 낮은 것을 용이하게 예측할 수 있었다.

EGFR 복합 돌연변이의 생존기간 관련 이유 분석

복합 돌연변이를 가진 폐선암 환자들에게서 짧은 생존기간을 보이는 이유를 확인하기 위하여, FISH로 확인된 ALK 유전자의 파괴(break apart)와 함께 시제품의 AKT1, BRAF , DDR2 , ERBB2 , FGFR1 , KRAS , MAPK2K1 , MET, NRAS , PI3CA , PTEN , RET, ROS1 의 변이 및 BIM 유전자의 인트론 2 결손 등의 동시 발생-돌연변이(Co-mutation)를 확인하여, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3 및 도 4 각각은 EGFR 단일 돌연변이 혹은 복합 돌연변이를 가진 증례에서 폐암 관련 주요 유전자의 미스센스 돌연변이를 나타낸 것으로, 동시 발생-돌연변이(Co-mutation)의 빈도는 EGFR 단일 돌연변이를 가진 증례와 EGFR 복합 돌연변이를 가진 증례간에 유의미한 차이가 없었다. 그러나, 복합 돌연변이를 보인 4 증례에서 검사 대상 유전자들의 여러 부분에서 다발성 미스센스 돌연변이가 발견되었는바, 이는 단일 돌연변이를 보인 증례와 유의미한 차이를 갖는 것을 볼 수 있다(P=0.003, χ²-test).

이상, 본 발명을 상기 실시 예를 중심으로 하여 설명하였으나 이는 예시에 지나지 아니하며, 본 발명은 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 다양한 변형 및 균등한 기타의 실시 예를 이하에 첨부한 청구범위 내에서 수행할 수 있다는 사실을 이해하여야 한다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Predicting kit for survival of lung cancer patients and the method of providing the information for predicting survival of lung cancer patients <130> DPB150014 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9821 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gccggagtcc cgagctagcc ccggcggccg ccgccgccca gaccggacga caggccacct 60 cgtcggcgtc cgcccgagtc cccgcctcgc cgccaacgcc acaaccaccg cgcacggccc 120 cctgactccg tccagtattg atcgggagag ccggagcgag ctcttcgggg agcagcgatg 180 cgaccctccg ggacggccgg ggcagcgctc ctggcgctgc tggctgcgct ctgcccggcg 240 agtcgggctc tggaggaaaa gaaagtttgc caaggcacga gtaacaagct cacgcagttg 300 ggcacttttg aagatcattt tctcagcctc cagaggatgt tcaataactg tgaggtggtc 360 cttgggaatt tggaaattac ctatgtgcag aggaattatg atctttcctt cttaaagacc 420 atccaggagg tggctggtta tgtcctcatt gccctcaaca cagtggagcg aattcctttg 480 gaaaacctgc agatcatcag aggaaatatg tactacgaaa attcctatgc cttagcagtc 540 ttatctaact atgatgcaaa taaaaccgga ctgaaggagc tgcccatgag 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gggcctggag tctctgcaga ccaattcaac ccaaatctcg ggggctcttt catgattcta 7380 atgggcaacc agggttgaaa cccttatttc tagggtcttc agttgtacaa gactgtgggt 7440 ctgtaccaga gcccccgtca gagtagaata aaaggctggg tagggtagag attcccatgt 7500 gcagtggaga gaacaatctg cagtcactga taagcctgag acttggctca tttcaaaagc 7560 gttcaattca tcctcaccag cagttcagct ggaaaggggc aaataccccc acctgagctt 7620 tgaaaacgcc ctgggaccct ctgcattctc taagtaagtt atagaaacca gtctcttccc 7680 tcctttgtga gtgagctgct attccacgta ggcaacacct gttgaaattg ccctcaatgt 7740 ctactctgca tttctttctt gtgataagca cacactttta ttgcaacata atgatctgct 7800 cacatttcct tgcctggggg ctgtaaaacc ttacagaaca gaaatccttg cctctttcac 7860 cagccacacc tgccatacca ggggtacagc tttgtactat tgaagacaca gacaggattt 7920 ttaaatgtaa atctattttt gtaactttgt tgcgggatat agttctcttt atgtagcact 7980 gaactttgta caatatattt ttagaaactc atttttctac taaaacaaac acagtttact 8040 ttagagagac tgcaatagaa tcaaaatttg aaactgaaat ctttgtttaa aagggttaag 8100 ttgaggcaag aggaaagccc tttctctctc ttataaaaag gcacaacctc attggggagc 8160 taagctaggt cattgtcatg gtgaagaaga gaagcatcgt ttttatattt aggaaatttt 8220 aaaagatgat ggaaagcaca tttagcttgg tctgaggcag gttctgttgg ggcagtgtta 8280 atggaaaggg ctcactgttg ttactactag aaaaatccag ttgcatgcca tactctcatc 8340 atctgccagt gtaaccctgt acatgtaaga aaagcaataa catagcactt tgttggttta 8400 tatatataat gtgacttcaa tgcaaatttt atttttatat ttacaattga tatgcattta 8460 ccagtataaa ctagacatgt ctggagagcc taataatgtt cagcacactt tggttagttc 8520 accaacagtc ttaccaagcc tgggcccagc caccctagag aagttattca gccctggctg 8580 cagtgacatc acctgaggag cttttaaaag cttgaagccc agctacacct cagaccgatt 8640 aaacgcaaat ctctggggct gaaacccaag cattcgtagt ttttaaagct cctgaggtca 8700 ttccaatgtg cggccaaagt tgagaactac tggcctaggg attagccaca aggacatgga 8760 cttggaggca aattctgcag gtgtatgtga ttctcaggcc tagagagcta agacacaaag 8820 acctccacat ctgtcgctga gagtcaagaa cctgaacaga gtttccatga aggttctcca 8880 agcactagaa gggagagtgt ctaaacaatg gttgaaaagc aaaggaaata taaaacagac 8940 acctctttcc atttcctaag gtttctctct ttattaaggg tggactagta ataaaatata 9000 atattcttgc tgcttatgca gctgacattg ttgccctccc taaagcaacc aagtagcctt 9060 tatttcccac agtgaaagaa aacgctggcc tatcagttac attacaaaag gcagatttca 9120 agaggattga gtaagtagtt ggatggcttt cataaaaaca agaattcaag aagaggattc 9180 atgctttaag aaacatttgt tatacattcc tcacaaatta tacctgggat aaaaactatg 9240 tagcaggcag tgtgttttcc ttccatgtct ctctgcacta cctgcagtgt gtcctctgag 9300 gctgcaagtc tgtcctatct gaattcccag cagaagcact aagaagctcc accctatcac 9360 ctagcagata aaactatggg gaaaacttaa atctgtgcat acatttctgg atgcatttac 9420 ttatctttaa aaaaaaagga atcctatgac ctgatttggc cacaaaaata atcttgctgt 9480 acaatacaat ctcttggaaa ttaagagatc ctatggattt gatgactggt attagaggtg 9540 acaatgtaac cgattaacaa cagacagcaa taacttcgtt ttagaaacat tcaagcaata 9600 gctttatagc ttcaacatat ggtacgtttt aaccttgaaa gttttgcaat gatgaaagca 9660 gtatttgtac aaatgaaaag cagaattctc ttttatatgg tttatactgt tgatcagaaa 9720 tgttgattgt gcattgagta ttaaaaaatt agatgtatat tattcattgt tctttactcc 9780 tgagtacctt ataataataa taatgtattc tttgttaaca a 9821 <210> 2 <211> 1210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu 130 135 140 His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175 Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro 180 185 190 Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln 195 200 205 Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220 Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln 420 425 430 His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu 435 440 445 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser 450 455 460 Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 510 Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590 Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620 Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655 Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu 675 680 685 Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu 690 695 700 Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser 705 710 715 720 Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu 725 730 735 Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser 740 745 750 Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser 755 760 765 Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser 770 775 780 Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp 785 790 795 800 Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn 805 810 815 Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg 820 825 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1030 1035 1040 Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln 1045 1050 1055 Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp 1060 1065 1070 Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro 1075 1080 1085 Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser 1090 1095 1100 Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser 1105 1110 1115 1120 Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro 1125 1130 1135 Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp 1140 1145 1150 Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp 1155 1160 1165 Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn 1170 1175 1180 Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val 1185 1190 1195 1200 Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1205 1210

Claims

EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 돌연변이를 코딩하는 유전자와 혼성화될 수 있는 프로브 또는 프라이머 세트를 포함하며,
상기 돌연변이는, 엑손 19 결손 돌연변이 및 I706T 돌연변이를 포함하는 복합 돌연변이인 것을 특징으로 하는, 폐암 환자의 생존기간 예측용 키트로,
상기 EGFR은 서열번호 2로 표시되는, 폐암 환자의 생존기간 예측용 키트.
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 돌연변이를 포함하는 단백질, 또는 이와 결합할 수 있는 항체를 포함하며,
상기 돌연변이는, 엑손 19 결손 돌연변이 및 I706T 돌연변이를 포함하는 복합 돌연변이인 것을 특징으로 하는, 폐암 환자의 생존기간 예측용 키트로,
상기 EGFR은 서열번호 2로 표시되는, 폐암 환자의 생존기간 예측용 키트.
삭제
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삭제
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 돌연변이 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 단계를 포함하며,
상기 돌연변이는, 엑손 19 결손 돌연변이 및 I706T 돌연변이를 포함하는 복합 돌연변이인 것을 특징으로 하는, 폐암 환자의 생존기간을 예측하기 위한 정보 제공 방법으로,
상기 EGFR은 서열번호 2로 표시되는, 폐암 환자의 생존기간을 예측하기 위한 정보 제공 방법.
삭제
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제6항에 있어서,
상기 검출하는 단계는 차세대 염기서열 분석법에 의해 수행되는, 폐암 환자의 생존기간을 예측하기 위한 정보 제공 방법.