EA017879B1

EA017879B1 - Улучшенное определение экспрессии mage-a

Info

Publication number: EA017879B1
Application number: EA201000334A
Authority: EA
Inventors: Илзе Влассенброэк; Катя Бьеро
Original assignee: Онкометилом Сайенсиз Са; Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date: 2007-09-17
Filing date: 2008-09-17
Publication date: 2013-03-29
Also published as: CA2699856C; US10053724B2; EA201000334A1; US20160032368A1; CN101932723B; JP2010538633A; US8481700B2; BRPI0817008A2; DOP2010000076A; CN101932723A; CA2699853A1; WO2009037438A8; US20130302363A1; NZ583796A; CA2699856A1; EP2201131B1; CR11504A; US20110287416A1; KR20100085917A; ZA201001878B

Abstract

Предложены олигонуклеотид, праймер или зонд, содержащие любую нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 5, 6, 7, 2, 3, 4, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 25. Олигонуклеотиды используют для определения статуса метилирования гена, в частности гена MAGE-А3. Олигонуклеотиды используют в парах праймеров, наборах и способах для определения статуса метилирования гена MAGE-А3 и для диагностики рака, направленной терапии и отбора субъектов для лечения. Праймер или зонд может содержать петлю или шпилькообразную структуру и может быть использован в ПЦР, специфической в отношении метилирования, в режиме реального времени.

Description

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к определению экспрессии генов семейства МАСЕ-А. Более конкретно, изобретение относится к способам определения метилированных или неметилированных форм МАСЕ-А3 и ассоциированных с ними олигонуклеотидов, праймеров, зондов, пар праймеров и наборов. Способы по изобретению включают методы амплификации, в частности, методы ПЦР на основе флуоресценции в режиме реального времени и в конечной точке, и имеют диагностическое, прогностическое и терапевтическое применение.

Предшествующий уровень техники

Гены МАСЕ принадлежат семейству раково-тестикулярных антигенов. Семейство генов МАСЕ включает более 20 членов и состоит из генов МАСЕ А, В, С и Ό (8сап1ап е! а1., (2002) 1ттипо1 Есу. 188:22-32; СНотех е! а1., (2001) Сапсег Век. 61 (14):5544-51). Они кластеризованы на хромосоме X (Ьисак е! а1., 1998 Сапсег Век. 58.743-752; Ьисак е! а1., 1999 Сапсег Век 59:4100-4103; Ьисак е! а1., 2000 1п! 1 Сапсег 87:55-60; Ьигс.|шп е! а1., 1997 Сепотюк 46:397-408; Микса!еШ е! а1., 1995 Ргос Май Асай 8а И8А 92:49874991; Ро1й е! а1., 1999 Сепотюк 59:161-167; Водпег е! а1., 1995 Сепотюк 29:725-731), и имеют все еще неопределенную функцию (ОНтап е! а1., 2001 Ехр Се11 Век. 265(2): 185-94). Гены МАСЕ являются высоко гомологичными, и члены семейства МАСЕ-А, в частности, имеют 60-98% гомологии.

Человеческий ген МАСЕ-А3 экспрессируется в различных типах опухолей, включая меланому (Еиги!а е! а1. 2004 Сапсег 8сЕ 95, 962-968), рак мочевого пузыря, гепатоцеллюлярную карциному (Οίιι е! а1. 2006. С11шса1 Вюсйеткйу 39, 259-266), рак желудка (Нопйа е! а1. 2004 ВпйкН 1оитпа1 о! Сапсег 90, 838843), колоректальный рак (К1т е! а1. 2006 Аог1й 1оитпа1 о! Сак!гоеп!его1оду 12, 5651-5657) и рак легкого (Х8С1.С) (8сап1ап е! а1. 2002 1ттипо1 Веу. 188:22-32; 1апд е! а1. 2001 Сапсег Век. 61, 21: 7959-7963). Никакой экспрессии не наблюдалось в нормальных тканях взрослого, за исключением лишь зародышевых клеток семенников или плаценты (Наак е! а1. 1988 Ат 1 Вергой 1ттипо1 МюгоЫо1 18:47-51; ТакайакЫ е! а1. 1995 Сапсег Век 55:3478-382).

Антигенспецифические антираковые иммунотерапевтические средства (А8С1) представляют собой новый класс лекарственных средств, предназначенных для обучения иммунной системы высоко специфическому распознаванию и элиминации раковых клеток. Фактически, А8С1 позволяют осуществлять направленное лечение. А8С1 имеют два основных компонента: опухолевые антигены для специфического направления иммунного ответа против раковой клетки и адъювантные системы, которые включают иммуностимулирующие соединения, выбранные для увеличения противоопухолевого иммунного ответа. Антиген МАСЕ-А3 и конструкции, подходящие для применения в А8С1, описаны в \УО99/40188. и недавно были представлены обнадеживающие результаты фазы II испытания с использованием МАСЕА3 А8С1 у пациентов с немелкоклеточным раком легких (Ы8СЬС) (1. С1ш. Опсо1. Уо1. 25, Ыо. 188 (1ипе 20 8ирр1.) 2007: 7554).

Важно иметь количественные анализы с высокой производительностью, способные специфически выявлять пациентов, экспрессирующих МАСЕ-А3, которые получат пользу от иммунотерапии, позволяющие осуществлять мониторинг экспрессии МАСЕ-А3 с целью определения дозы, идентификацию образцов, экспрессирующих МАСЕ-А3, в клинических испытаниях, или просто идентификацию пациентов с раком на ранней стадии. Целый ряд используемых методов диагностики был описан и включает в себя: полуколичественную СТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией) (Ое Р1аеп е! а1. 1994 1ттиподепе!1ск 40(5):360-9), другие методы на основе ПЦР и микрочипы низкой плотности (2атша!!ео е! а1. 2002 С11шса1 С11е1шк1гу 48(1) 25-34). Кроме того, улучшенный метод ОТ-ПЦР для применения в сочетании с МАСЕ-А3 А8С1 был описан в АО 2007/147876.

Самым большим недостатком существующих анализов является то, что они требуют выделения РНК для оценки экспрессии МАСЕА3. Фиксация формалином или заключение опухолевой ткани в парафин (ГЕРЕ) является обычным способом сохранения опухолевой ткани в клинических центрах. Фиксация в формалине изменяет структуру молекул РНК в ткани, вызывая образование попоречных сшивок, а также частичную деградацию. Частичная деградация приводит к созданию меньших фрагментов РНК от 100 до 300 пар оснований. Эти структурные изменения РНК ограничивают применение РНК, экстрагированной из ГЕРЕ ткани для измерения уровней экспрессии МАСЕА3.

Целью настоящего изобретения является создание усовершенствованного анализа, в котором устранены недостатки существующих анализов.

Метилирование генов является важным регулятором экспрессии генов. В частности, метилирование цитозиновых остатков, обнаруженное в СрС динуклеотидных парах в промоторной области специфических генов, может вносить вклад во многие болезненные состояния посредством понижающей регуляции экспрессии генов. Например, аберрантное метилирование опухолевых супрессорных генов может приводить к повышающей или понижающей регуляции этих генов и, таким образом, связано с наличием и развитием многих видов рака (НоГГтапп е! а1. 2005 ВюсНет Се11 Вю1 83: 296-321). Картины аберрантного метилирования генов часто являются специфичными для ткани происхождения. Соответственно, определение статуса метилирования конкретных генов может иметь прогностическое и диагностическое значение и может быть использовано как для определения относительной стадии заболевания, так и для прогнозирования ответа на определенные типы терапии (Ьа1тй. 2003 Ыа! Веу Сапсег 3: 253-266).

- 1 017879

ПЦР, специфическая в отношении метилирования (МБР), с визуализацией результатов на геле (М§Р-анализ на основе геля) широко используется для определения эпигенетического выключения генов (Ек!е11ег М с! а1., Сапсег Век 2001;61:3225-9.), хотя были разработаны и другие количественные анализы с использованием других технологий (Байб РА., №11 Веу Сапсег 2003;3:253-66; Еабк е! а1., М.1с1с1с ЛсИк Век 2000; 28:Е32; М1кекка Т, е! а1., 1 Мо1 Б1адп 2007).

Для мониторинга реакций амплификации нуклеиновых кислот в режиме реального времени имеется ряд технологий, основанных на флуоресценции. Одна такая технология описана в И8 6090552 и ЕР 0912597 и известна как Ашр1Шио®г. Этот метод также подходит для мониторинга реакций амплификации нуклеиновых кислот по конечной точке. Кроме того, У1аккепЬтоеск и др. (У1аккепЬтоеск е! а1. 2008. 1оигпа1 оГ Мо1ес. Б1адп., У10, Ыо. 4) описали стандартизированный, прямой М8Р-анализ в режиме реального времени с использованием технологии АшрЕПиог®.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к улучшенным способам и/или анализам измерения экспрессии МАОЕ-А3. Кроме того, настоящее изобретение относится к определенным типам терапии, в частности, основанному на антигенспецифических антираковых иммунотерапевтических средствах (А8С1) лечения пациентов, выявленных по экспрессии МАОЕ-А3, с использованием олигонуклеотидов, праймеров, зондов, пар праймеров, наборов и/или способов, как описано в данной заявке. Экспрессию белка МАОЕ-А3 устанавливают путем определения статуса метилирования гена МАОЕ-А3 скорее, чем по измерению самого уровня экспрессии гена. Авторы изобретения показали, что статус метилирования, полученный с помощью их анализов метилирования, хорошо согласуется с результатами, полученными с помощью ОТ-ПЦР анализа, который доказал прогностическую ценность экспрессии МАОЕ-А3 при Ы8СБС в пользу МАОЕ-А3 иммунотерапии. Таким образом, данные анализы полезны для отбора подходящих для лечения пациентов, для прогнозирования вероятности успешного лечения пациента и могут быть использованы для облегчения выбора терапии для пациента.

В одном аспекте в настоящем изобретении предложен олигонуклеотид, праймер или зонд, содержащий или состоящий по существу или состоящий из любой нуклеотидной последовательности 8ЕО Ш N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 25, где олигонуклеотид, праймер или зонд используют для определения статуса метилирования гена.

Олигонуклеотид, праймер или зонд предпочтительно содержит, состоит по существу или состоит из следующих непрерывных последовательностей в направлении 5'-3':

(а) первая нуклеотидная последовательность приблизительно из 6-30 нуклеотидов, где нуклеотид в указанной первой нуклеотидной последовательности мечен первой группировкой, выбранной из донорной группировки и акцепторной группировки молекулярной пары для переноса энергии, где донорная группировка при возбуждении излучает флуоресценцию при одной или более конкретных длинах волн при возбуждении, а акцепторная группировка поглощает и/или гасит указанную флуоресценцию, излучаемую указанной донорной группировкой;

(б) вторая одноцепочечная нуклеотидная последовательность, содержащая, состоящая по существу или состоящая приблизительно из 3-20 нуклеотидов;

(в) третья нуклеотидная последовательность, содержащая, состоящая по существу или состоящая приблизительно из 6-30 нуклеотидов, где нуклеотид в указанной третьей нуклеотидной последовательности мечен второй группировкой, выбранной из указанной донорной группировки и указанной акцепторной группировки, и указанная вторая группировка является членом указанной группы, которая не метит указанную первую нуклеотидную последовательность, где указанная третья нуклеотидная последовательность обратно комплементарна указанной первой нуклеотидной последовательности, так что между указанной первой нуклеотидной последовательностью и указанной третьей нуклеотидной последовательностью может образовываться дуплекс, такой, что указанная первая группировка и вторая группировка находятся в такой близости, что, когда донорная группировка возбуждается и испускает флуоресценцию, акцепторная группировка поглощает и гасит флуоресценцию, излучаемую указанной донорной группировкой; и (г) на 3'-конце праймера, четвертая одноцепочечная нуклеотидная последовательность, содержащая, состоящая по существу или состоящая приблизительно из 8-40 нуклеотидов, которая содержит на своем 3'-конце любую нуклеотидную последовательность из 8ЕО Ш N0: 2, 4, 5, 7, 8, 11, 13, 14, 16, 17, 19 или 25;

где в случае, когда указанный дуплекс не образуется, указанная первая группировка и указанная вторая группировка разделены расстоянием, которое предотвращает перенос молекулярной энергии между указанными первой и второй группировкой.

Конкретные нуклеотидные последовательности на 3'-конце позволяют определить статус метилирования гена МАОЕ-А3. Эти праймеры связываются преимущественно с неметилированными формами гена МАОЕ-А3 после обработки соответствующим реагентом (как обсуждается в данной заявке). Свойства этих олигонуклеотидов обсуждаются в данной заявке, и это обсуждение используется с соответствующими изменениями. Специфические нуклеотидные последовательности способны быть затравкой

- 2 017879 для синтеза нуклеотидной последовательности, комплементарной цепи нуклеиновой кислоты, содержащей участок метилированной или неметилированной ДНК гена семейства МАСЕЛ, с помощью полимеразы нуклеиновой кислоты.

Наиболее предпочтительно, чтобы олигонуклеотид, праймер или зонд состоял из нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО N0: 3, 6, 9, 12, 15 или 18 и мог быть использован для амплификации участка интересующего гена.

Кроме того, предложена пара праймеров, содержащая праймер, содержащий или состоящий по существу, или состоящий из нуклеотидной любой последовательности из 8Е0 ГО N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 25.

В другом аспекте предложен набор, содержащий по меньшей мере один праймер, пару праймеров или набор праймеров, содержащих или состоящих по существу, или состоящих из любой нуклеотидной последовательности из 8Е0 ГО N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 25. Данный набор предназначен для определения статуса метилирования гена, в частности гена семейства МАСЕ-А, такого как МАСЕ-А3.

В другом аспекте в изобретении предложен способ определения статуса метилирования гена МАСЕ-А3 в ДНК-содержащем образце, включающий:

(а) приведение ДНК-содержащего образца в контакт с реагентом или обработку ДНК-содержащего образца реагентом, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с образованием детектируемых модифицированных остатков, но который не модифицирует метилированные остатки цитозина;

(б) амплификацию по меньшей мере участка метилированного или интересующего неметилированного гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, в которой по меньшей мере один праймер сконструирован таким образом, чтобы связываться только с последовательностью метилированной или неметилированной ДНК, соответственно, после обработки реагентом, где по меньшей мере один праймер в паре праймеров содержит, состоит по существу или состоит из любой нуклеотидной последовательности из 8Е0 ГО N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 25 (при необходимости).

В другом аспекте предложен способ диагностики рака или предрасположенности к раку, включающий определение статуса метилирования гена МАСЕ-А3 в образце с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, как описано в данной заявке, где присутствие неметилированного МАСЕ-А3 в образце является признаком рака или предрасположенности к раку.

В другом аспекте предложен способ определения наличия МАСЕ-А3-положительной опухоли, включающий определение статуса метилирования гена МАСЕ-А3 в образце с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, как описано в данной заявке, где присутствие неметилированного МАСЕ-А3 указывает на наличие МАСЕ-А3-положительной опухоли. МАСЕ-А3-положительная опухоль означает любую опухоль или опухолевые клетки (выделенные из пациента), которые экспрессируют антиген МАСЕ-А3.

Кроме того, в изобретении предложен способ идентификации и/или отбора пациента, подходящего для лечения иммунотерапевтическим МАСЕ-А3, включающий определение статуса метилирования гена МАСЕ-А3 в образце от пациента с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, как описано в данной заявке, где в случае, если ген МАСЕ-А3 не метилирован, субъекта (предпочтительно) идентифицируют и/или отбирают для лечения иммунотерапевтическим МАСЕ-А3. Таким образом, предпочтительными являются пациенты с неметилированным МАСЕ-А3, а не пациенты, у которых данный ген метилирован.

Альтернативно, если данный ген не является неметилированным, субъекта предпочтительно не идентифицируют и/или не отбирают для лечения иммунотерапевтическим МАСЕ-А3.

В родственном аспекте в изобретении предложен способ прогнозирования вероятности успешного лечения рака, включающий определение статуса метилирования гена МАСЕ-А3 в образце от пациента с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, как описано в данной заявке, где в случае, если ген не метилирован, вероятность успешного лечения иммунотерапевтическим МАСЕ-А3 выше, чем в случае метилированного гена.

Альтернативно, отсутствие неметилированного МАСЕ-А3 в образце указывает на то, что вероятность устойчивости к лечению иммунотерапевтическим МАСЕ-А3 выше, чем в случае неметилированного гена. Таким образом, обнаружение метилированного гена МАСЕ-А3 указывает на низкую вероятность успешного лечения иммунотерапевтическим средством.

В другом родственном аспекте в изобретении предложен способ выбора подходящего режима лечения рака, включающий определение статуса метилирования гена МАСЕ-А3 в образце от пациента с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, как описано в данной заявке, где в случае неметилированного гена для лечения выбирают иммунотерапевтическое средство.

Альтернативно, если ген не является неметилированным, лечение иммунотерапевтическим средством противопоказано.

- 3 017879

Также предложен способ лечения рака у субъекта, включающий введение иммунотерапевтического средства, когда субъект был выбран для лечения на основании измерения статуса метилирования гена МЛСЕ-А3, в соответствии с любым из способов по изобретению или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, как описано в данной заявке.

Предпочтительно, для всех различных аспектов, описанных в данной заявке, обнаружение неметилированного гена МЛСЕ-А3 соответствует повышенному уровню белка МЛСЕ-Л3.

Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения пациента, включающий измерение статуса метилирования гена МЛСЕ-А3 в соответствии с любым из способов по изобретению с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, как описано в данной заявке, и затем введение указанному пациенту композиции, содержащей МЛСЕ-А3. как описано в данной заявке. Композицию предпочтительно вводят, если обнаружено, что ген МЛСЕ-А3 не метилирован.

В настоящем изобретении также предложен способ лечения пациента, склонного к рецидиву МЛСЕ-А3-экспрессирующей опухоли, где пациента уже лечили с целью удаления опухолевой ткани, включающий измерение статуса метилирования гена МЛСЕ-А3 в опухолевой ткани, в соответствии с любым из способов по изобретению или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, как описано в данной заявке, и затем введение указанному пациенту композиции, содержащей МЛОЕ-А3, как описано в данной заявке. Композицию предпочтительно вводят, если обнаружено, что ген МЛСЕ-А3 не метилирован.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение композиции, содержащей МЛСЕ-А3, в изготовлении лекарственного средства для лечения пациента, страдающего от опухоли, где пациент был выбран для лечения на основании измерения статуса метилирования гена МЛСЕ-А3 в соответствии с любым из способов по изобретению или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, как описано в данной заявке. Также предложена композиция, содержащая МЛСЕ-А3, для применения в лечении пациента, страдающего от опухоли, где пациент был выбран для лечения на основании измерения статуса метилирования гена МЛСЕ-А3 в соответствии с любым из способов по изобретению или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, как описано в данной заявке.

В еще одном воплощении предложено применение композиции, содержащей МЛСЕ-А3, в изготовлении лекарственного средства для лечения пациента, склонного к рецидиву МЛСЕ-А3-экспрессирующей опухоли, где пациент был выбран для лечения на основании измерения статуса метилирования гена МЛСЕ-А3 в соответствии с любым из способов по изобретению или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, как описано в данной заявке. Также предложена композиция, содержащая МЛСЕ-А3, для применения в лечении пациента, склонного к рецидиву МЛОЕ-А3-экспрессирующей опухоли, где пациент был выбран для лечения на основании измерения статуса метилирования гена МЛСЕ-А3 в соответствии с любым из способов по изобретению или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, как описано в данной заявке.

Подробное описание изобретения

В изобретении предложен анализ для определения присутствия и/или количества метилированного или неметилированного гена МЛСЕ-А3 в ДНК-содержащем образце. Для разработки этого анализа было необходимо идентифицировать участки, подверженные метилированию, в гене МЛСЕ-А3 и разработать конкретные олигонуклеотиды, которые могут различать неметилированные и метилированные формы гена МЛСЕ-Л3.

Соответственно, в первом аспекте в изобретении предложены олигонуклеотиды, содержащие, состоящие по существу или состоящие из любой нуклеотидной последовательности из 8ЕО Ш N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 25. Эти олигонуклеотиды полезны в определении статуса метилирования интересующего гена. Олигонуклеотиды могут служить в качестве праймеров и/или зондов. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды определяют неметилированную форму гена. Олигонуклеотиды, подходящие для определения неметилированной формы, содержат, состоят по существу или состоят из любой нуклеотидной последовательности из 8Е0 Ш N0: 2, 4, 5, 7, 8, 11, 13 или 25. Олигонуклеотиды, подходящие для определения метилированной формы, содержат, состоят по существу или состоят из любой нуклеотидной последовательности из 8Е0 Ш N0: 14, 16, 17 или 19. В некоторых воплощениях эти олигонуклеотиды содержат шпилечную структуру, как описано в настоящем изобретении. Такие предпочтительные олигонуклеотиды включают последовательности в соответствии с 8Е0 Ш N0: 3, 6, 9, и 12 для определения неметилированной формы гена и 8Е0 Ш N0: 15 и 18 для определения метилированной формы гена.

Гены или интересующий ген по изобретению представляют собой предпочтительно гены МЛСЕЛ3 и/или МЛСЕЛ6. МЛСЕЛ3 и МЛСЕЛ6 представляют собой символы гена, утвержденные ниб0 Оеие №тспе1аЦ.1гс Соттй1ее. Ген МЛСЕЛ3 локализован на хромосоме X (локализация с|28) и последовательность гена зарегистрирована под номерами доступа ХМ_005362 и Е^600000197172. Ген МЛСЕ-А3 кодирует меланомный антиген семейства А, 3. Ген МЛСЕЛ6 локализован на хромосоме X

- 4 017879 (локализация с|28). МЛСЕ-Л3 часто упоминается взаимозаменяемо как МАСЕ-3 или МЛСЕЛ3. Аналогично, МАСЕ-А6 часто упоминается взаимозаменяемо как МЛСЕ-6 или МЛСЕЛ6; все используются в данной заявке. Гипометилирование этих генов может быть связано с частотой возникновения раковых заболеваний, таких как, например, меланома или рак легких (включая Ν8ί.Έί.').

Динуклеотиды СрС, подверженные метилированию, обычно концентрируются в промоторной области человеческих генов. В предпочтительном воплощении статус метилирования гена оценивают путем определения уровней метилирования в промоторной области гена. Промотор представляет собой область, расположенную выше точки инициации транскрипции (Т88), находящуюся на расстоянии приблизительно 10 т.п.о., 3 т.п.о., 1 т.п.о., 500 п.о. или 150-300 п.о. от Т88. Для МЛСЕ-3 распределение СрС в промоторной области является довольно редким.

Термин состояние метилирования или статус метилирования относится к присутствию или отсутствию 5-метилцитозина (5-шСу!) в одном или множестве динуклеотидов СрС в последовательности ДНК. Гиперметилирование определяют как увеличение уровня метилирования выше нормальных уровней. Таким образом, это относится к аберрантному метилированию цитозина (5-шСу!) в специфических сайтах СрС в гене, часто в промоторной области. Нормальные уровни метилирование могут быть установлены, например, путем определения статуса метилирования в нераковых клетках.

Гипометилирование относится к уменьшенному присутствию 5-шСу! в одном или множестве динуклеотидов СрС в последовательности ДНК (анализируемого образца ДНК), по сравнению с количеством 5-шСу!, обнаруженным в соответствующих динуклеотидах СрС в нормальной последовательности ДНК (обнаруженным в подходящем контрольном образце).

Нормальные уровни метилирования также могут быть установлены, например, путем определения уровня метилирования в нераковых клетках. В данном изобретении гипометилирование гена МЛСЕА3 и/или МЛСЕ-Л6 является признаком повышенной экспрессии этого гена опухолеассоциированного антигена, который является надежным индикатором рака.

Во втором аспекте изобретения предложен способ определения присутствия и/или количества метилированного или неметилированного гена в ДНК-содержащем образце, включающий стадию приведения ДНК-содержащего образца в контакт по меньшей мере с одним олигонуклеотидом, содержащим, состоящим по существу или состоящим из любой нуклеотидной последовательности из 8ЕЭ Ш ΝΟ: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 25. Способ предпочтительно включает дополнительную стадию оценки того, является ли ген метилированным или неметилированным. Это может зависеть от того, насколько стабильно связывается олигонуклеотид с ДНК в ДНК-содержащем образце, как обсуждается в данной заявке.

Способы оценки статуса метилирования основаны на различных подходах. Могут быть использованы любые подходящие способы, в которых используют олигонуклеотиды по изобретению. В одном воплощении в подходах для определения метилированных СрС-динуклеотидных мотивов используют реагент, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК для получения детектируемых модифицированных остатков. Данный реагент не модифицирует метилированные остатки цитозина и, таким образом, позволяет установить различие между неметилированными и метилированными молекулами нуклеиновых кислот в нижележащем процессе, который предпочтительно может вовлекать амплификацию нуклеиновой кислоты. В одном воплощении реагент может влиять на избирательное дезаминирование неметилированных остатков цитозина. Таким образом, после взаимодействия с реагентом неметилированная ДНК содержит нуклеотидную последовательность, отличную от соответствующей метилированной ДНК. Дезаминирование цитозина приводит к образованию остатка урацила, который имеет такие же свойства при спаривании оснований, как тимин, но отличается от характера спаривания цитозиновых оснований. Это позволяет установить различие между метилированными и неметилированными цитозинами.

В полезных традиционных методах оценки различий последовательностей используют олигонуклеотидные праймеры. Возможны два подхода к конструированию праймеров. Во-первых, могут быть сконструированы праймеры, которые сами не охватывают потенциальные сайты метилирования ДНК. Вариации последовательности в сайтах дифференциального метилирования локализованы между двумя сайтами связывания с праймерами и визуализация вариации последовательности требует дополнительных стадий анализа. Во-вторых, могут быть сконструированы праймеры, которые специфически гибридизуются либо с метилированным, либо с неметилированным вариантом первоначальной обработанной последовательности. После гибридизации может быть осуществлена реакция амплификации, и продукты амплификации анализируют с использованием любой системы обнаружения, известной в данной области техники. Присутствие продукта амплификации указывает на гибридизацию праймеров с ДНК. Специфичность праймера показывает, была ли ДНК модифицирована или нет, что, в свою очередь, показывает, была ли ДНК метилирована или нет. Если имеется достаточная область комплементарно сиЫ с мишенью, например, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 нуклеотидов, то праймер может содержать также дополнительные нуклеотидные остатки, которые не препятствуют гибридизации, но могут быть полезны для других манипуляций. Примерами таких других остатков могут быть сайты для расщепления рестрикционными эндонуклеазами, для связывания с лигандом или для связывания с фактором или линкеры,

- 5 017879 или повторы, или остатки с целью визуализации. Олигонуклеотидные праймеры могут быть или могут не быть специфичными для модифицированных метилированных остатков. Предпочтительные олигонуклеотиды для применения в качестве праймеров содержат, состоят по существу или состоят из любой нуклеотидной последовательности из БЕЦ ГО N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 25.

Другой способ различать модифицированные и немодифицированные нуклеиновые кислоты состоит в использовании олигонуклеотидных зондов. Такие зонды могут гибридизоваться непосредственно с модифицированной нуклеиновой кислотой или другими продуктами модифицированной нуклеиновой кислоты, такими как продукты, полученные посредством амплификации. В анализах на основе зондов используют гибридизацию олигонуклеотидов со специфическими последовательностями и последующую детекцию гибрида. Также могут быть использованы дополнительные стадии очистки перед детекцией продукта амплификации, например, стадия осаждения. Олигонуклеотидные зонды могут быть мечены с использованием любой системы детекции, известной в данной области техники. Они включают в себя, но не ограничиваются этим, флуоресцентные группировки, меченные радиоизотопами группировки, биолюминесцентные группировки, люминесцентные группировки, хемилюминесцентные группировки, ферменты, субстраты, рецепторы или лиганды. Предпочтительные олигонуклеотиды для применения в качестве зондов содержат, состоят по существу или состоят из любой нуклеотидной последовательности из БЕЦ ГО N0: 2, 4, 5, 7, 8, 11, 13, 14, 16, 17, 19 или 25.

Олигонуклеотидный праймер упоминается в данной заявке взаимозаменяемо как праймер. Аналогично, олигонуклеотидный зонд упоминается в данной заявке взаимозаменяемо как зонд.

В предпочтительных воплощениях статус метилирования гена (или его участка, особенно СрСостровков) определяют с использованием ПЦР, специфической в отношении метилирования (МБР).

Метод МБР знаком специалисту в данной области техники. При применении МБР подхода, ДНК может быть амплифицирована с использованием пары праймеров, сконструированных для того, чтобы отличать неметилированную ДНК от метилированной, воспользовавшись различиями в последовательности в результате обработки бисульфитом натрия (Негтап Ш с( а1., Ргос ΝαΙΙ Асаб Бс1 ИБА. 1996 Бер 3;93(18):9821-6 и \У0 97/46705). Конкретный пример МБР метода представляет собой количественный (ЦМБР) в режиме реального времени, который делает возможным надежное количественное определение метилированной ДНК в режиме реального времени.

Способы в режиме реального времени, как правило, основаны на непрерывном оптическом мониторинге за процедурой амплификации и в них используются флуоресцентно-меченые реагенты, включение которых в продукт может быть количественно определено и количество которых является показателем числа копий этой последовательности в матрице. Такой меченый реагент может быть флуоресцетным красителем, который предпочтительно связывается с двухцепочечной ДНК и флуоресценция которого значительно усиливается при связывании с двухцепочечной ДНК. Альтернативно, могут быть использованы меченые праймеры и/или меченые зонды. Они представляют собой конкретное применение хорошо известных и коммерчески доступных методов амплификации в режиме реального времени, таких как ТАОМАУ®. МОЕЕСиЬАК ВЕ.АС0\Б^:®. АМРЫЕЪиОК® и БС0КР10Х® 1)/л\.А®А и др. Часто эти методы в режиме реального времени используют с полимеразной цепной реакцией (ПЦР).

В технологии Тас.|Мап используют линейные, гидролитические олигонуклеотидные зонды, которые содержат флуоресцентный краситель и гасящий краситель.

При облучении возбужденный флуоресцентный краситель переносит энергию на соседнюю молекулу гасящего красителя, а не флуоресцентного красителя (принцип ЕКЕТ). Тас.|Мап зонды гибридизуются с внутренним участком ПЦР-продукта и расщепляются экзонуклеазной активностью полимеразы, когда она реплицирует матрицу. Это прекращает активность гасителя, и репортерный краситель начинает излучать флуоресценицию, которая увеличивается в каждом цикле пропорционально скорости расщепления зонда.

Молекулярные маяки также содержат флуоресцентные красители и гасящие красители, но они предназначены для принятия шпилечной структуры в свободном виде в растворе с целью приведения обоих красителей в непосредственную близость для осуществления резонансного переноса энергии флуоресценции (ЕКЕТ). Когда маяк гибридизуется с мишенью во время стадии отжига, шпилька линеаризуется, и оба красителя (донор и акцептор/гаситель) разделяются. Увеличение флуоресценции, обнаруженное от донора, будет коррелировать с количеством доступного ПЦР-продукта.

При применении зондов - скорпионов последовательность - специфический прайминг и определение ПЦР-продукта достигаются с использованием одного олигонуклеотида. Зонд-скорпион поддерживает конфигурацию типа стебель-петля в негибридизованном состоянии и ЕКЕТ происходит между флуорофором и гасителем. 3'-Участок стебля также содержит последовательность, которая комплементарна продукту удлинения праймера. Эта последовательность связана с 5'-концом конкретного праймера через неамплифицируемый мономер. После удлинения праймера -скорпиона последовательность конкретного зонда способна связываться с его дополнением в пределах удлиненного ампликона, таким образом открывая шпилечную петлю, разделяя флуорофор и гаситель и обеспечивая сигнал флуоресценции.

В случае гиперметилирования прайминг является специфическим в отношении метилирования, но вместо самих праймеров эту специфичность обеспечивают неудлиняемые олигонуклеотидные блокато

- 6 017879 ры. Блокаторы связываются с бисульфит-обработанной ДНК специфическим в отношении метилирования образом, и их сайты связывания перекрываются с сайтами связывания праймеров. Когда блокатор связан, праймер не может связаться, и поэтому ампликон не образуется. Гиперметилирование может быть использовано в комбинации с детекцией в режиме реального времени.

Системы кПЦР (количественная ПЦР) и кОТ-ПЦР Р1ехог™ имеют преимущество специфического взаимодействия между двумя модифицированными нуклеотидами для осуществления количественного ПЦР-анализа. Один из ПЦР-праймеров содержит флуоресцентную метку, примыкающую к остатку ίδοбС (5'-метилизоцитозин) на 5'-конце. Второй ПЦР праймер является немеченым. Реакционная смесь содержит дезоксинуклеотиды и ίδθ-бСТР. модифицированный гасителем баЬсу1. ЭаЬсу1-15О-бСТР преимущественно встраивается в положение, комплементарное остатку Цо-бС. Встраивание баЬсуГщо-бСТР в это положение приводит к гашению флуоресцентного красителя на комплементарной цепи и уменьшению флуоресценции, что позволяет осуществлять количественное определение во время амплификации. Для этих мультиплексных реакций используют пару праймеров с разным флуорофором для каждой последовательности-мишени.

Таким образом, олигонуклеотиды, содержащие, состоящие по существу или состоящие из любой нуклеотидной последовательности из 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 25, могут быть использованы в качестве праймеров или зондов в вышеупомянутых способах для определения статуса метилирования интересующего гена.

В предпочтительном воплощении в изобретении предложен способ определения в режиме реального времени присутствия и/или количества интересующего метилированного или неметилированного гена в ДНК-содержащем образце, включающий:

(б) амплификацию по меньшей мере участка интересующего метилированного или неметилированного гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, в которой по меньшей мере один праймер сконструирован таким образом, чтобы связываться только с последовательностью метилированной или неметилированной ДНК, соответственно, после обработки реагентом, где по меньшей мере один праймер в паре праймеров содержит, состоит по существу или состоит из любой нуклеотидной последовательности из 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19.

Интересующий ген в способах по изобретению представляет собой предпочтительно ген МАСЕ-А3 и/или МАСЕ-А6. Предпочтительно, по меньшей мере один праймер в паре праймеров является праймером, содержащим структуру стебель-петля, несущую донорную и акцепторную группировку из молекулярной пары для переноса энергии, организованной таким образом, что в отсутствие амплификации акцепторная группировка гасит флуоресценцию, излучаемую донорной группировкой (после возбуждения) и во время амплификации, структура стебель-петля разрушается, чтобы в достаточной степени разделить донорную и акцепторную группировки для производства детектируемого флуоресцентного сигнала. Это может быть определено в режиме реального времени для обеспечения показания о присутствии интересующего метилированного или неметилированного гена. Праймер в паре праймеров, которая содержит, состоит по существу или состоит из любой нуклеотидной последовательности из 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, предпочтительно несет структуру стебельпетля.

В некоторых воплощениях определяют число копий метилированного или неметилированного гена. В этом случае способ, описанный в данной заявке, предпочтительно включает дополнительную стадию:

(в) количественной оценки результатов определения в режиме реального времени относительно калибровочной кривой для интересующего метилированного или неметилированного гена для определения выхода числа копий гена.

Предпочтительно, стадия (в) дополнительно отличается тем, что амплификация считается достоверной, когда пороговое значение циклов составляет менее 40.

Для генов, таких как ген МАСЕА3 и/или МАСЕА6, определение неметилированного варианта гена может иметь первостепенное значение.

Способы по изобретению позволяют определять в режиме реального времени присутствие в образце интересующего метилированного или неметилированного гена. Поскольку способы по изобретению являются количественными способами, то (относительные) количества метилированной или неметилированной формы интересующего гена также могут быть определены по мере протекания реакции. Однако нет необходимости использовать методы в режиме реального времени. Анализы могут быть осуществлены только для того, чтобы выяснить, присутствует ли целевая ДНК в образце или нет. В методах определения амплификации по конечной точке используют те же подходы, которые широко используются для ПЦР в реальном времени. Поэтому способы по изобретению могут охватывать способ определения присутствия и/или количества интересующего метилированного или неметилированного гена в ДНКсодержащем образце по конечной точке.

- 7 017879

Таким образом, в изобретении предложен способ (по конечной точке) определения присутствия и/или количества интересующего метилированного или неметилированный гена в ДНК-содержащем образце, включающий:

(б) амплификацию по меньшей мере участка интересующего метилированного или неметилированного гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, в которой по меньшей мере один праймер сконструирован для связывания только с последовательностью метилированной или неметилированной ДНК, соответствено, после обработки реагентом, где по меньшей мере один праймер в паре праймеров содержит, состоит по существу или состоит из любой нуклеотидной последовательности из 860 ГО N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 25.

Как было упомянуто выше, интересующий ген в способах по изобретению представляет собой предпочтительно ген МАОЕ-А3 и/или МАСЕ-А6. Предпочтительно, по меньшей мере один праймер в паре праймеров представляет собой праймер, содержащий структуру стебель-петля, несущую донорную и акцепторную группировку из молекулярной пары для переноса энергии, имеющую характеристики, как описано в данной заявке. Праймер в паре праймеров, которая содержит, состоит по существу или состоит из любой нуклеотидной последовательности из 8Е0 ГО N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18 или 19, предпочтительно несет структуру стебель-петля.

Для гена МАОЕ-А3 и/или МАСЕ-А6 определение неметилированного варианта гена может иметь первостепенное значение. Праймеры, содержащие, состоящие по существу или состоящие из любой нуклеотидной последовательности из 8Е0 ГО N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 или 25, были сконструированы с целью определения неметилированной ДНК МАСЕ-А3 после обработки реагентом.

Отсутствие неметилированного гена будет указывать на присутствие метилированного гена. Однако определение метилированного гена также находится в рамках данного изобретения. Праймеры, содержащие, состоящие по существу или состоящие из любой нуклеотидной последовательности из 8Е0 ГО N0: 14, 15, 16, 17, 18 или 19, были сконструированы с целью определения метилированной ДНК МАОЕА3 после обработки реагентом.

В случае, когда желательно определение числа копий метилированного или неметилированного гена, способ предпочтительно включает дополнительную стадию:

(в) количественную оценку результатов определения интересующего метилированного или неметилированного гена относительно калибровочной кривой для определения выхода числа копий гена.

Все воплощения изобретения применимы к аспектам изобретения по конечной точке и, следовательно, используются с соответствующими изменениями. Анализ по конечной точке может включать применение флуоресцентного планшет-ридера или других подходящих приборов для определения флуоресценции в конце амплификации.

Способы по изобретению представляют собой наиболее предпочтительные способы ех νίνο или ίη νίίτο, осуществляемые на любом подходящем (ДНК-содержащем) тестируемом образце. Однако в одном воплощении способ также может включать стадию получения образца. Тестируемый образец представляет собой ДНК-содержащий образец, в частности ДНК-содержащий образец, содержащий интересующий ген. Способы по изобретению могут быть использованы для диагностики заболевания, в частности, когда (известно, что) метилирование интересующего гена связано с частотой возникновения заболевания.

ДНК-содержащий образец может содержать образец из любой подходящей ткани или жидкость организма. Предпочтительно, когда тестируемый образец получают от субъекта-человека. Для применений в отношении рака, образец может содержать образец ткани, полученный из ткани, которая предположительно является раковой, или типичной жидкости организма.

Гипометилирование гена МАОЕ-А3 было связано с раком легкого. Таким образом, в одном воплощении тестируемый образец, используемый в способах по изобретению, включающий ген МАОЕ-А3, предпочтительно содержит клетки легкого или нуклеиновые кислоты из клеток легкого. Наиболее предпочтительно, образец представляет собой ткань, фиксированную формалином и заключенную в парафин (ЕЕРЕ). Существуют два типа рака легкого: немелкоклеточный рак легкого (N8060) и мелкоклеточный рак легкого (8060). Эти названия просто описывают тип клеток, обнаруженных в опухолях. Тестируемый образец предпочтительно содержит клетки или нуклеиновую кислоту из немелкоклеточной карциномы легкого (N8060). N8060 включает в себя плоскоклеточную карциному, аденокарциному и крупноклеточную карциному и составляет около 80% от раков легкого. В предпочтительном воплощении, когда рак представляет собой N8060, тогда образец представляет собой образец ткани легкого или образец мокроты. N8060 трудно вылечить и доступное лечение, как правило, имеет своей целью продление жизни, насколько это возможно, и облегчение симптомов заболевания. N8060 является самым распространенным типом рака легкого и ассоциирован с плохими прогнозами.

Гипометилирование гена МАОЕ-А3 также связано с раком мочевого пузыря. Таким образом в до

- 8 017879 полнительных воплощениях другой предпочтительный тестируемый образец, используемый в способах по изобретению, также содержит клетки переходно-клеточного рака мочевого пузыря или клетки плоскоклеточной карциномы мочевого пузыря. Предпочтительно, тестируемый образец получают из ткани мочевого пузыря. Более предпочтительно, он происходит из мочи и содержит нуклеиновую кислоту из клеток переходно-клеточного рака мочевого пузыря или клеток плоскоклеточной карциномы мочевого пузыря. Тестируемый образец может быть получен из жидкой мочи, ее преципитата или осадка в моче. Ткани и жидкости организма могут быть собраны с использованием подходящего способа, многие из которых хорошо известны в данной области техники.

Гипометилирование гена МАСЕ-А3 также связано с меланомой. Меланома представляет собой пигментированное, легкодоступное поражение, которое было четко определено в гистопатологических терминах. Ранняя радиальная фаза роста (КОР) меланом может проникать в эпидермис и папиллярную дерму, но не имеет способности к метастазированию, резекция на этой стадии практически полностью излечивает. Последующая вертикальная фаза роста (УСР) означает переход к более агрессивной стадии, которая способна к метастазированию. Таким образом, изменения генной экспрессии, происходящие при переходе КСР/УСР, представляют большой интерес. Таким образом, в дополнительных воплощениях другой предпочтительный тестируемый образец, используемый в способах по изобретению, содержит клетки меланомы. Предпочтительно, тестируемый образец получают из повреждения кожи.

Другие ДНК-содержащие образцы для применения в способах по изобретению включают образцы для диагностического, прогностического или индивидуального медицинского применений. Такие образцы могут быть получены из хирургических образцов, таких как биопсии или материал, полученный путем аспирации тонкой иглой, из тканей, заключенных в парафин, из замороженных образцов опухолевой ткани, из свежих образцов опухолевой ткани или из свежей или замороженной жидкости тела, например. Неограничивающие примеры включают в себя цельную кровь, костный мозг, спинномозговую жидкость, жидкость брюшной полости, плевральную жидкость, лимфатическую жидкость, сыворотку, плазму, мочу, хилус, кал, эякулят, мокроту, аспират из сосков, слюну, препараты мазков, образцы смывов толстой кишки и образцы, полученные с помощью кисточки. Ткани и жидкости тела могут быть собраны с использованием подходящего способа, многие такие способы хорошо известны в данной области техники. Оценка образца, заключенного в парафин, может быть осуществлена непосредственно или на срезе ткани. Термины образец и образец от пациента являются взаимозаменяемыми и предназначены для обозначения ДНК-содержащего образца от пациента, как описано выше.

Способы по изобретению могут быть осуществлены на очищенных или неочищенных ДНКсодержащих образцах. Однако в предпочтительном воплощении до стадии (а) (стадия обработки реагентом) или в качестве предварительной стадии, ДНК выделяют/экстрагируют/очищают из ДНКсодержащего образца. Могут быть использован любой подходящий способ выделения ДНК. Примеры способов очистки можно найти в стандартных руководствах, таких как Мо1еси1аг С1ошид - А ЬаЬота1огу Мапиа1 (третье издание), 8ашЬтоок аиб Ки55е11 (см., в частности, приложение 8 и главу 5 в нем). В одном предпочтительном воплощении очистка включает осаждение ДНК спиртом. Предпочтительные спирты включают этанол и изопропанол. Подходящие способы очистки также включают способы осаждения с использованием соли. Таким образом, в одном конкретном воплощении способ очистки ДНК включает использование высокой концентрации соли для осаждения примесей. Соль может включать, состоять по существу или состоять из ацетата калия и/или ацетата аммония, например. Способ может дополнительно включать стадии удаления примесей, которые были осаждены после выделения ДНК посредством осаждения спиртом.

В альтернативном воплощении способ очистки ДНК основан на использовании органических растворителей для экстракции примесей из клеточных лизатов. Таким образом, в одном воплощении способ включает применение фенола, хлороформа и изоамилового спирта для экстракции ДНК. Подходящие условия используются для обеспечения того, чтобы примеси были отделены в органическую фазу, а ДНК осталась в водной фазе. В дополнительных наборах используют магнитные шарики, кремниевые мембраны и т.д. Такие наборы хорошо известны в данной области техники и имеются в продаже. В способах по изобретению можно использовать набор для очистки ДНК РИКЕОЕПЕ®.

В предпочтительных воплощениях этих способов очистки, экстрагированную ДНК извлекают посредством осаждения спиртом, такого как осаждение этанолом или изопропанолом.

Фиксированная формалином и заключенная в парафин (РРРЕ) опухолевая ткань представляет собой обычный способ консервации опухолевой ткани в клинических центрах. Такие РРРЕ-заключенные образцы требуют стадии депарафинизации перед экстракцией ДНК. В предпочтительном воплощении образцы РРРЕ-ткани или материал образца, иммобилизованные на покровных стеклах, сначала депарафинизируют путем обработки ксилолом. Период контакта с ксилолом должен быть достаточным для того, чтобы позволить ксилолу контактировать и взаимодействовать с образцом. В более предпочтительном воплощении РРРЕ-образцы депарафинизируют в 100%-ном ксилоле в течение около 2 ч. Эту стадию можно повторить еще раз для обеспечения полной депарафинизации. После обработки ксилолом образцы подвергают регидратации с использованием 70%-ного этанола.

Способы по изобретению также могут, при необходимости, включать (также до стадии (а) или в ви

- 9 017879 де предварительной стадии) количественное определение выделенной/экстрагированной/очищенной ДНК в образце. Количественное определение ДНК в образце может быть осуществлено с использованием любого подходящего способа. Количественное определение нуклеиновых кислот может быть основано, например, на использовании спектрофотометра, флуориметра или УФ-трансиллюминатора. Примеры подходящих способов описаны в стандартных руководствах, таких как Мо1еси1аг С1ошид - А ЬаЬотаФгу Мапиа1 (третье издание), 8атЬтоок аиб Никкей (см., в частности, приложение 8 в нем). В предпочтительном воплощении наборы, такие как набор для количественного определения дцДНК Рюодтееи®, имеющийся в продаже от Мо1еси1аг РгоЬек, 1иуйгодеи, могут быть использованы для количественного определения ДНК.

Способы по изобретению основаны на реагенте, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с образованием детектируемых модифицированных остатков. Способ действия реагента был уже объяснен. В предпочтительном воплощении реагент, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с образованием детектируемых модифицированных остатков, но который не модифицирует метилированные остатки цитозина, содержит, состоит по существу или состоит из бисульфитного реагента (Ртоттет е1 а1., Ргос. Хаб. Асаб. 8с1. И8А 1992 89:18271831). Некоторые бисульфит-содержащие реагенты известны в данной области техники, и подходящие наборы для проведения реакции дезаминирования имеются в продаже (такие как набор для метилирования ДНК ΕΖ от Ζуто Векеагсй). Особенно предпочтительный реагент для применения в способах по изобретению содержит, состоит по существу или состоит из бисульфита натрия.

После того, как ДНК в образце была обработана реагентом, необходимо затем определить различие в нуклеотидной последовательности, вызванной реагентом. Это делают с использованием методики амплификации нуклеиновых кислот. Как уже упоминалось, функционально значимое метилирование чаще всего связано с промоторными областями генов. В частности, так называемые СрО-островки включают относительно высокую частоту остатков СрО и часто обнаруживаются в промоторной области гена. Существуют различные компьютерные программы, позволяющие обнаруживать СрО-островки в интересующем гене, подлежащем идентификации. Соответственно, способы по изобретению могут включать амплификацию по меньшей мере участка интересующего метилированного или неметилированного гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров. Как описано выше, поскольку интересующие остатки, статус метилирования которых должен быть исследован, обычно обнаруживаются в определенных СрО-островках и/или в промоторной области интересующего гена, пара праймеров, как правило, амплифицирует только часть гена (в этой области), а не весь ген. Любой подходящий участок гена может быть амплифицирован в соответствии со способами по изобретению, при условии, что продукт амплификации является детектируемым в качестве надежного индикатора присутствия интересующего гена. Особенно легко обнаружить продукты амплификации, составляющие приблизительно от 50 до 250 п.о. Еще более предпочтительно, в результате амплификации с использованием по меньшей мере одной пары праймеров для амплификации интересующего метилированного или неметилированного гена получают продукт амплификации приблизительно от 100 до 200 п.о. или от 50 до 100 п.о. Это особенно актуально для образцов ткани, особенно образцов, заключенных в парафин, где обычно получают ограниченное качество ДНК и может быть желательно меньше ампликонов. В предпочтительном воплощении детектируемый продукт амплификации содержит по меньшей мере любую нуклеотидную последовательность из 8ΕΟ Ш N0: 2, 4, 5, 7, 8, 11, 13, 14, 16, 17 или 19. Предпочтительно, получают продукт амплификации (около) 100 п.о., 110 п.о., 115 п.о., 120 п.о., 125 п.о., 126 п.о., 130 п.о., 135 п.о., 140 п.о. или 142 п.о.

По меньшей мере один праймер в паре праймеров и предпочтительно оба праймера сконструированы таким образом, чтобы связываться только с последовательностью метилированной или неметилированной ДНК после обработки реагентом. Таким образом, праймер действует таким образом, чтобы установить различие между метилированным и неметилированным геном посредством спаривания оснований либо только с метилированной формой гена (которая остается немодифицированной после обработки реагентом), либо с неметилированной формой гена (которая модифицируется реагентом) в зависимости от применения, для которого используют данные способы. Поэтому праймер должен охватывать по меньшей мере один сайт метилирования в интересующем гене. Предпочтительно праймер связывается с областью гена, включающей по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 сайтов метилирования. Наиболее предпочтительно, когда праймер сконструирован для связывания с последовательностью, в которой все остатки цитозина в парах СрО в пределах сайта связывания с праймером метилированы или не метилированы, то есть представляют собой полностью метилированную или полностью неметилированную последовательность. Однако, если только один или несколько сайтов метилирования имеют функциональное значение, то праймер может быть сконструирован для связывания с целевой последовательностью, в которой только эти остатки должны быть метилированы (остаются в виде цитозина) или не метилированы (превращаются в урацил) для того, чтобы произошло эффективное связывание. Других (функционально незначимых) потенциальных сайтов метилирования можно полностью избежать за счет соответствующей конструкции праймера, или могут быть сконструированы праймеры, которые связываются независимо от статуса метилирования этих менее значимых сайтов (например, путем включения смеси остатков О и А в соответствующем положении в праймерной последовательности). Соответственно,

- 10 017879 ожидается продукт амплификации, только если метилированная или неметилированная форма интересующего гена присутствовала в исходном ДНК-содержащем образце. Дополнительно или альтернативно, может быть целесообразным, по меньшей мере для одного праймера в паре праймеров, связываться только с последовательностью неметилированной ДНК после обработки реагентом, а для другого праймера -связываться с метилированной ДНК только после обработки - например, когда ген включает функционально важные сайты, которые метилированы, и отдельные функционально важные сайты, которые не метилированы.

Предпочтительно, по меньшей мере один праймер в паре праймеров представляет собой праймер, содержащий структуру стебель-петля или шпилечную структуру, несущую донорную и акцепторную группировку из молекулярной пары для переноса энергии. Этот праймер может быть или может не быть праймером, который устанавливает различие между метилированной и неметилированной ДНК, при желании. Праймер сконструирован таким обраом, что в отсутствие амплификации акцепторная группировка гасит флуоресценцию, испускаемую донорной группировкой после возбуждения. Таким образом, до или в отсутствие амплификации, направляемой праймером, структура стебель-петля или шпилечная структура остается интактной. Флуоресценция, испускаемая донорной группировкой, эффективно принимается акцепторной группировкой, что приводит к гашению флуоресценции.

Во время амплификации конфигурация структуры праймера типа стебель-петля или шпилька изменяется. В частности, если праймер встраивается в продукт амплификации и, в частности, в двухцепочечную ДНК, (особенно во время второго раунда амплификации), структура стебель-петля или шпилька разрушается. Это изменение в структуре разделяет донорную и акцепторную группировки в достаточной степени, чтобы акцепторная группировка больше не могла эффективно гасить флуоресценцию, испускаемую донорной группировкой. Таким образом, донорная группировка продуцирует детектируемый флуоресцентный сигнал. Этот сигнал определяют в режиме реального времени, чтобы дать представление о числе копий интересующего метилированного или неметилированного гена.

Таким образом, в способах по изобретению могут быть использованы олигонуклеотиды для амплификации нуклеиновых кислот, которые мечены поддающимися детекции метками переноса молекулярной энергии (МЕТ). Праймеры содержат донорную и/или акцепторную группировку из пары МЕТ и встраиваются в амплифицированный продукт реакции амплификации, так что амплифицированный продукт содержит как донорную, так и акцепторную группировку из пары МЕТ.

Когда амплифицированный продукт является двухцепочечным, тогда пара МЕТ, встраиваемая в амплифицированный продукт, может находиться на одной и той же цепи или, когда амплификация представляет собой триамплификацию, на противоположных цепях. В некоторых случаях, когда полимераза, используемая в амплификации, имеет 5'-3'-экзонуклеазную активность, одна из группировок в паре МЕТ может отщепляться по меньшей мере от некоторой части популяции амплифицированного продукта этой экзонуклеазной активностью. Такая экзонуклеазная активность не наносит ущерба способам амплификации по изобретению.

Способы по изобретению, как описано в данной заявке, пригодны для многих способов амплификации последовательностей нуклеиновых кислот, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР), триамплификацию и другие системы амплификации.

В предпочтительном воплощении МЕТ представляет собой резонансный перенос энергии флуоресценции (ЕКЕТ), где олигонуклеотиды мечены донорной и акцепторной группировками, где донорная группировка представляет собой флуорофор, и акцепторная группировка может представлять собой флуорофор, так что флуоресцентная энергия, испускаемая донорной группировкой, поглощается акцепторной группировкой. Акцепторная группировка может представлять собой гаситель. Таким образом, праймер для амплификации представляет собой праймер со шпилечной структурой, который содержит как донорную, так и акцепторную группировки, и сконструирован таким образом, что акцепторная группировка гасит флуоресценцию донора. Когда праймер встраивается в продукт амплификации, его конфигурация изменяется, гашение прекращается и может быть определена флуоресценция донорной группировки.

Способы по изобретению позволяют определять продукт амплификации без предварительного отделения невключенных олигонуклеотидов. Кроме того, они позволяют определять продукт амплификации непосредственно, путем включения меченого олигонуклеотида в продукт.

В предпочтительном воплощении способы по изобретению также включают определение экспрессии эталонного гена. Эталонные гены важны для проведения сравнения между различными образцами. Выбрав соответствующий ген, который, как полагают, экспрессируется стабильно и надежно в сравниваемых образцах, при определении амплификации эталонного гена вместе с интересующим геном принимают во внимание вариабильность между образцами по таким параметрам, как количество вводимого материала, ферментативная эффективность, деградация образца и т.д. Эталонный ген, в идеале, в присутствии подтвержденного количества вводимой ДНК должен быть единственным геном, который постоянно экспрессируется в тестируемых образцах. Таким образом, результаты, полученные для интересующего гена, могут быть нормализованы относительно соответствующего числа копий эталонного гена. Подходящие эталонные гены для настоящего изобретения включают гены бета-актина, глицеральдегид-3

- 11 017879 фосфатдегидрогеназы (САРЭН), рибосомальной РНК, такие как ген 188 рибосомальной РНК и РНКполимеразы II (Кайошс А. с1 а1., ВюсЬет ВюрЬуз Кез Соттип. 2004 1аи 23;313 (4):856-62). В конкретном предпочтительном воплощении эталонный ген представляет собой бета-актин.

Таким образом, способы по изобретению могут быть дополнительно охарактеризованы при амплификации по меньшей мере участка эталонного гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, где по меньшей мере один праймер в паре праймеров представляет собой праймер, содержащий структуру стебель-петля, имеющую вышеупомянутые характеристики.

Любой подходящий участок эталонного гена может быть амплифицирован в соответствии со способами по изобретению, при условии, что продукт амплификации является детектируемым в качестве надежного индикатора присутствия эталонного гена. Особенно легко детектируемые продукты амплификации составляют приблизительно от 50 до 250 п.о. Еще более предпочтительно, когда при амплификации с использованием по меньшей мере одной пары праймеров для амплификации эталонного гена получают продукт амплификации приблизительно от 100 до 200 п.о. Это особенно актуально для образцов ткани, особенно для образцов, заключенных в парафин, где, как правило, получают ограниченное качество ДНК.

В воплощениях, в которых эталонный ген включают в способы по изобретению, данные способы могут дополнительно отличаться тем, что стадия способов, которая включают количественную оценку результатов определения (в режиме реального времени) относительно калибровочной кривой для интересующего метилированного или неметилированного гена, также включает количественную оценки результатов определения в режиме реального времени эталонного гена относительно калибровочной кривой для эталонного гена для получения выхода количества копий гена в каждом конкретном случае и возможно дополнительно включает нормализацию результатов путем деления числа копий интересующего метилированного или неметилированного гена на число копий эталонного гена.

Кроме того, способы отличаются тем, что амплификация считается достоверной, когда пороговое значение циклов составляет менее 40. Это предпочтительно в случае как интересующего гена, так и эталонного гена.

При амплификации по меньшей мере участка эталонного гена, как правило, используют по меньшей мере одну пару праймеров. Предпочтительно, по меньшей мере один праймер в паре праймеров представляет собой праймер, содержащий структуру стебель-петля, несущую донорную и акцепторную группировки из молекулярной пары для переноса энергии, как для интересующего гена. Механизм действия такой структуры во время амплификации был объяснен в данной заявке.

Шпилечные праймеры для применения в способах по изобретению являются наиболее предпочтительными, как описано в И8 6090552 и ЕР 0912597, описания которых таким образом включены во всей их полноте. Эти праймеры имеются в продаже в виде праймеров Атр^Пиот®. Таким образом, в конкретном предпочтительном воплощении праймер, содержащий структуру стебель-петля, используемую для амплификации участка интересующего гена и/или эталонного гена, содержит, состоит по существу или состоит из следующих непрерывных последовательностей в направлении 5'-3':

(а) первая нуклеотидная последовательность приблизительно из 6-30 нуклеотидов, где нуклеотид в указанной первой нуклеотидной последовательности мечен первой группировкой, выбранной из донорной группировки и акцепторной группировки из молекулярной пары для переноса энергии, где донорная группировка испускает флуоресценцию при одной или более конкретных длинах волн при возбуждении и акцепторная группировка поглощает и/или гасит указанную флуоресценцию, испускаемую указанной донорной группировкой;

(в) третья нуклеотидная последовательность, содержащая, состоящая по существу или состоящая приблизительно из 6-30 нуклеотидов, где нуклеотид в указанной третьей нуклеотидной последовательности мечен второй группировкой, выбранной из указанной донорной группировки и указанной акцепторной группировки, и указанная вторая группировка является членом указанной группы, которая не метит указанную первую нуклеотидную последовательность, где указанная третья нуклеотидная последовательность обратно комплементарна указанной первой нуклеотидной последовательности, так что между указанной первой нуклеотидной последовательностью и указанной третьей нуклеотидной последовательностью может образовываться дуплекс, такой, что указанная первая группировка и вторая группировка находятся в такой близости, что, когда донорная группировка возбуждается и испускает флуоресценцию, акцепторная группировка поглощает и гасит указанную флуоресценцию, испускаемую указанной донорной группировкой; и (г) на 3'-конце праймера, четвертая одноцепочечная нуклеотидная последовательность, содержащая, состоящая по существу или состоящая приблизительно из 8-40 нуклеотидов, которая на своем 3'конце содержит любую последовательность из 8ЕО ΙΌ N0: 2, 4, 5, 7, 8, 11, 13, 14, 16, 17, 19 или 25 (и таким образом, способна начать синтез с помощью полимеразы нуклеиновой кислоты нуклеотидной последовательности, комплементарной цепи нуклеиновой кислоты, содержащей участок метилированной или неметилированной ДНК гена); где в случае, когда указанный дуплекс не образуется, указанная пер

- 12 017879 вая группировка и указанная вторая группировка разделены расстоянием, которое препятствует переносу молекулярной энергии между указанной первой и второй группировкой.

В конкретном предпочтительном воплощении донорная группировка и акцепторная группировка образуют пару для резонансного переноса энергии флуоресценции (РВЕТ). Перенос молекулярной энергии (МЕТ) представляет собой процесс, посредством которого энергия передается нерадиационно между донорной молекулой и акцепторной молекулой. Резонансный перенос энергии флуоресценции (РВЕТ) представляет собой форму МЕТ. РВЕТ возникает из-за свойств некоторых химических соединений; при возбуждении воздействием определенных длин волн света, они излучают свет (то есть они флуоресцируют) при различных длинах волн. Такие соединения называются флуорофорами. При РВЕТ энергия передается нерадиационно на большое расстояние (10-100А) между донорной молекулой, которая является флуорофором, и акцепторной молекулой. Донор поглощает фотон и нерадиционно переносит эту энергию на акцептор (Ротйет, 1949, Ζ. №11игГог5с11. А4: 321-327; С1едд, 1992, Ме1йой§ Епхуток 211: 353388). Когда два флуорофора, спектры возбуждения и излучения которых перекрываются, находятся в непосредственной близости, возбуждение одного флуорофора будет заставлять его излучать свет при длинах волн, которые поглощаются вторым флуорофором и которые стимулируют второй флуорофор, заставляя его, в свою очередь, флуоресцировать. Другими словами, энергия возбужденного состояния первого (донорного) флуорофора переносится посредством резонанс-индуцированного дипольдипольного взаимодействия на соседний второй (акцепторный) флуорофор. В результате время жизни донорной молекулы уменьшается и ее флуоресценция гасится, тогда как интенсивность флуоресценции акцепторной молекулы увеличивается и деполяризуется. Когда энергия возбуженного состояния донора переносится на акцептор, который не является флуорофором, флуоресценция донора гасится без последующего излучения акцептором. В этом случае акцептор функционирует как гаситель. И гасители, и акцепторы могут быть использованы в настоящем изобретении. Пары молекул, которые могут быть заняты в резонансном переносе энергии флуоресценции (РВЕТ), называются РВЕТ парами. Для того чтобы произошел перенос энергии, донорная и акцепторная молекулы должны, как правило, находиться в непосредственной близости (от 70 до 100 А) (С1едд, 1992, Ме11юЙ5 Епхуток 211: 353-388; 8еМп, 1995, Ме1йоЙ8 Епхуток 246: 300-334). Эффективность переноса энергии резко падает с расстоянием между донорными и акцепторными молекулами. Согласно Ротйет (1949, Ζ. №11игГог5с11. А4:321-327), эффективность переноса энергии пропорциональна Ό х 10^-6, где Ό представляет собой расстояние между донором и акцептором. Фактическт это означает, что РВЕТ может происходить наиболее эффективно на расстояниях около 70 А. Молекулы, которые обычно используют в РВЕТ, рассматриваются в отдельном разделе. Является ли флуорофор донором или акцептором, определяют по его спектрам возбуждения и излучения, а также по флуорофору, с которым он образует пару. Например, РАМ наиболее эффективно возбуждается светом с длиной волны 488 нм и излучает свет со спектром от 500 до 650 нм, и максимумом излучения 525 нм. РАМ является подходящим донором флуорофором для применения вместе с ЮЕ, ТАМВА и ВОХ (которые все имеют свой максимум возбуждения при 514 нм).

В одном конкретном предпочтительном воплощении указанная донорная группировка представляет собой флуоресцеин или его производное, и указанная акцепторная группировка представляет собой ОЛВСУЙ. Предпочтительно, производное флуоресцеина содержит, состоит по существу или состоит из 6-карбоксифлуоресцеина.

МЕТ-метки могут быть присоединены к любому подходящему месту в праймерах. В конкретном предпочтительном воплощении донорные и акцепторные группировки располагаются на комплементарных нуклеотидах в пределах структуры стебель-петля, так что пока стебель-петля интактна, группировки находятся в непосредственной физической близости друг к другу. Однако праймеры по изобретению могут быть мечены группировками в любом положении, эффективном для обеспечения МЕТ/РВЕТ между соответствующим донором и акцептором в отсутствие амплификации и разделения донора и акцептора, как только праймер встроится в продукт амплификации.

Последовательность структуры стебель-петля или шпилечной структуры не зависит от нуклеотидной последовательности гена-мишени (интересующего гена или эталонного гена), поскольку она не связывается с ней. Соответственно, могут быть сконструированы универсальные последовательности типа стебель-петля или шпильки, которые затем могут быть объединены с последовательностью конкретного праймера для облегчения определения в режиме реального времени интересующей последовательности. Основное требование к последовательности заключается в том, чтобы последовательность образовывала структуру стебель-петля/''шпилька', которая стабильна в отсутствие амплификации (и таким образом обеспечивает эффективное гашение). Таким образом, последовательность-специфический участок праймера связывается с матричной цепью и направляет синтез комплементарной цепи. Поэтому праймер становится частью продукта амплификации в первом раунде амплификации. При синтезе комплементарной цепи амплификация происходит через структуру стебель-петля/''шпилька. Это разделяет молекулы флуорофора и гасителя, вызывая таким образом генерацию флуоресценции по мере протекания амплификации.

Структура стебель-петля предпочтительно находится на 5'-конце последовательности - специфического участка праймера, используемого для амплификации.

- 13 017879

Как упомянуто выше, этот детекторную последовательность обычно метят ЕКЕТ-парой. Предпочтительно, одна группировка в ЕКЕТ-паре находится по направлению к 5'-концу последовательности, около него или на 5'-конце последовательности, а другая группировка находится по направлению к 3'концу последовательности, около него или на З'-конце последовательности, так что, когда структура стебель-петля или шпилька остается интактной, ЕКЕТ является эффективным между двумя группировками.

Как подробно показано в экспериментальной части, праймеры должны быть тщательно подобраны для того, чтобы обеспечить чувствительность и специфичность способов по изобретению. Соответственно, особенно предпочтительные праймеры для применения в определении статуса метилирования гена включают праймер, содержащий, состоящий по существу или состоящий из нуклеотидной последовательности, определенной как:

5’-АСССАТСССТТССАССАТСССи-3’ (8ЕО Ю N0: 1) б’-АТТТТТСТТТССААТТТАСООТАС-З’ (8ЕО Ю N0: 2) и/или,

5’-АСССАТСССТТС(ЗА(ЗСАТСССиССААСАТСАААССАТСАСТСА-3’ (8ΕΩ Ю N0: 3) .

и/или,

5-ССААСАТСАААССАТСАСТСА-3’ (8ΕΩ Ю N0: 4) и/или,

5’-ТССААТТТАСССТАСТАТТСТ-3’ (8ΕΩ Ю N0: 5) и/или,

5’-А6ССАТСС(ЗТТС6АССАТСССиТССААТТТА(ЗССТА6ТАТТ<ЗТ-3’ (8ΕΩ

Ю N0: 6) и/или,

5’-СССТССАССААСАТСААА-3’ (8ΕΩ Ю N0: 7) и/или,

5’-ТТАССАТСТ<ЗАТСТТАТТеАТТТСТ-3’ (8ΕΩ Ю N0: 8) и/или,

5’-АСССАТСС6ТТССАССАТСССиТТАСОАТСТСАТ(ЗТТАТТСАТТТ(ЗТ-3’ (8ΕΩ Ю N0: 9) и/или,

5’-ТСТТТССААТТТАСЗССТАСТАТТСТ-3’ (8ΕΩ Ю N0:11) и/или,

5’-АСССАТСССТТССА(ЗСАТСССиТСТТТССААТТТАСССЗТА(ЗТАТТСТ-3’ (8ΕΩ Ю N0: 12) и/или,

5-ССАТСА СТСАТТАСТСААААСААА-3’ (8Е0 Ю N0: 13) и/или,

5’-АТТТТТСТТС66ААТТТАС(ЗСТАС-3¹ (8Е0 Ю N0: 14) и/или,

5’-АСССАТСС0ТТС6А6САТС0СиСССАССТСАААСССТС6СТС0-3’ (8ΕΩ Ю ΝΟ: 15) и/или, б’-ССОАССТСАААСССТСССТСС-З’ (8Е0 Ю N0: 16) и/или,

5’-СССААТТТАСССТА6ТАТССТ-3’ (8Е0 Ю N0: 17) и/или,

5’-АСССАТСССТТС(ЗАССАТСССиСССТССОСССАССТСААА-3’ (8Е0 Ю

N0: 18) и/или, .

5’-СССТССССССАССТСААА-3’ (8Е0 Ю N0: 19).

8Е^ ГО N0: 1 представляет собой последовательность шпилечной структуры.

8Е^ ГО N0: 2, 5, 8 или 11 представляют собой последовательности прямых праймеров, комплементарные бисульфит-конвертированной неметилированной последовательности промотора Маде.

- 14 017879

БЕО ГО N0: 1 представляет собой последовательность шпилечной структуры.

БЕО ГО N0: 6, 9 и 12 содержат последовательность шпилечной структуры и последовательность БЕО ГО N0: 5, 8 и 11, соответственно.

БЕО ГО N0: 4, 7 и 13 представляют собой последовательность обратного праймера, комплементарную бисульфит-конвертированной неметилированной последовательности промотора Маде.

БЕО ГО N0: 3 содержит последовательность шпилечной структуры и последовательность БЕО ГО N0: 4.

БЕО ГО N0: 14 и 17 представляют собой последовательности прямых праймеров, комплементарные бисульфит-конвертированной метилированной последовательности промотора Маде.

БЕО ГО N0: 16 и 19 представляют собой последовательность обратного праймера, комплементарную бисульфит-конвертированной метилированной последовательности промотора Маде.

БЕО ГО N0: 15 и 18 содержит последовательность шпилечной структуры и последовательность БЕО ГО N0: 16 и 19, соответственно.

Как подробно показано в экспериментальной части, уровни экспрессии и метилирования МАСЕ-А3 показали наилучшее соответствие в анализах, которые включали БЕО ГО N0: 2, 5 или 11, все три праймера, содержащие последовательность 5'-Т66ААТТТА666ТА6-3' (БЕО ГО N0: 25). Таким образом, в другом воплощении предпочтительный праймер, связывающийся с промоторным участком МАСЕ-А3. содержит БЕО ГО N0: 25. Часть праймера, комплементарная бисульфит-конвертированной последовательности МАСЕ-А3, составляет предпочтительно менее 25 п.о.; это предпочтительно 23, 22, 21, 20 или 19 п.о. в длину. Таким образом, МАСЕ-А3-специфическая часть такого предпочтительного праймера составляет предпочтительно от 24 до 18 п.о. или от 23 до 19 п.о. в длину. Предпочтительно это 19 п.о. в длину. Таким образом, праймер может содержать любую последовательность из 23, 22, 21, 20 или 19 последовательных оснований из последовательности 5'-А™Т6ТТТ66ААТТТА666ТА6ТАТТ6Т-3' (БЕО 10 N0: 26). МАСЕ-А3-специфическая часть праймера наиболее предпочтительно состоит из нуклеотидной последовательности, представленной в виде БЕО ГО N0: 2, 4, 5 или 7.

Праймер, содержащий, состоящий по существу или состоящий из любой нуклеотидной последовательности из БЕО ГО N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 или 13, особенно полезен для определения гипометилированного (неметилированного) гена МАСЕ-А3. Предпочтительные праймеры имеют нуклеотидную последовательность из БЕО ГО N0: 2, 3, 4, 5, 6 или 7.

Праймер, содержащий, состоящий по существу или состоящий из любой нуклеотидной последовательности из БЕО ГО N0: 14, 15, 16, 17, 18 или 19 особенно полезен для определения гиперметилированного (метилированного) гена МА6Е-А3.

Предпочтительные пары праймеров для применения в способах/наборах и анализах по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один праймер, содержащий, состоящий по существу или состоящий из любой нуклеотидной последовательности из БЕО ГО N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 25. Предпочтительные пары праймеров содержат, состоят по существу или состоят из любой нуклеотидной последовательности из БЕО ГО N0: 2 и 3; БЕО ГО N0: 6 и 7; БЕО ГО N0: 9 и 4; БЕО ГО N0: 12 и 13; БЕО ГО N0: 14 и 15; или БЕО ГО N0: 17 и 18. Наиболее предпочтительная пара праймеров содержит, состоит по существу или состоит из нуклеотидной последовательности БЕО ГО N0: 6 и 7.

Либо один, либо оба праймера можно метить подходящей структурой стебель-петля или шпилька или синтезировать так, чтобы включить подходящую структуру стебель-петля или шпилька, несущую донорную и акцепторную группировку, предпочтительно на 5'-конце, как подробно описано выше. В предпочтительном воплощении один или оба праймера метят структурой стебель-петля или синтезируют так, чтобы включить, предпочтительно на 5'-конце, структуру стебель-петля, содержащую, состоящую по существу или состоящую из нуклеотидной последовательности, представленной в виде 5'А6С6АТ6С6ТТС6А6САТС6Си-3' (БЕС) ГО N0: 1).

Эту детекторную последовательность обычно метят ЕВЕТ-парой. Предпочтительно, одна группировка в ЕВЕТ-паре находится по направлению к 5'-концу последовательности, около него или на 5'-конце последовательности, а другая группировка находится по направлению к 3'-концу последовательности, около него или на 3'-конце последовательности, так что когда структура стебель-петля или шпилька остается интактной, ЕВЕТ является эффективным между двумя группировками. В особенно предпочтительном воплощении структуру стебель-петля или шпилька, особенно нуклеиновую кислоту, содержащую, состоящую по существу или состоящую из последовательности, представленной в виде БЕО ГО N0: 1, метят на 5'-конце с помощью ЕАМ и на 3'-конце с помощью ОАВСУБ. Другие предпочтительные комбинации обсуждаются в данной заявке, и это обсуждение касается соответствующих изменений.

Эти праймеры образуют отдельные аспекты настоящего изобретения. Дополнительные характеристики этих праймеров приведены в подробном описании (экспериментальная часть) ниже. Следует отметить, что в настоящем изобретении могут быть использованы варианты этих последовательностей. В частности, могут быть добавлены дополнительные фланкирующие последовательности, например, для улучшения специфичности связывания или образования структуры стебель-петля, при необходимости. Различные последовательности предпочтительно имеют по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей

- 15 017879 мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности нуклеотидных последовательностей с нуклеотидными последовательностями праймеров и/или зондов, представленных в 8ЕО ГО N0: 1 до 9 и 11 до 19 или 25. Праймеры и шпилечные структуры могут включать синтетические нуклеотидные аналоги, при необходимости, или могут быть основаны, например, на ДНК, РНК или ПНК, или их смесях. Аналогично, могут быть использованы альтернативные флуоресцентные донорные и акцепторные группировки/ЕВЕТ-пары, при необходимости. В дополнение к мечению флуоресцентными донорными и акцепторными группировками, праймеры могут включать модифицированные олигонуклеотиды и другие дополнительные группы и метки, при условии, что функциональность в качестве праймера и/или структуры стебель-петля/''шпилька в способах по изобретению не нарушается.

Для каждой пары праймеров по меньшей мере один праймер метят донорной и акцепторной группировкой из молекулярной пары для переноса энергии, организованной таким образом, что в отсутствие амплификации, акцепторная группировка гасит флуоресценцию, испускаемую донорной группировкой (при возбуждении) и во время амплификации, структура стебель-петля разрушается, чтобы в достаточной степени разделить донорную и акцепторную группировки для получения детектируемого сигнала флуоресценции, который определяют в режиме реального времени для обеспечения показателя числа копий гена. Предпочтительно указанная донорная группировка и указанная акцепторная группировка представляют собой ЕВЕТ-пару. В одном воплощении указанная донорная группировка и указанная акцепторная группировка выбраны из 5-карбоксифлуоресцеина или 6-карбоксифлуоресцеина (ЕАМ), 2'7'диметокси-4'5'-дихлор-6- карбоксифлуоресцеина (ЮЕ), родамина, 6-карбоксиродамина (В6С), Ν,Ν,Ν'тетраметил-6-карбоксиродамина (ТАМВА), 6-карбокси-Х-родамина (В0Х), 5-(2'-аминоэтил)аминонафталин-1-сульфокислоты (ΕΌΑΝ8), антраниламида, кумарина, хелатных производных тербия, малахитового зеленого, реактивного красного 4, ПАВСУЬ, тетраметилродамина, пиренбутирата, эозиннитротирозина, этидия и техасского красного. В еще одном воплощении указанная донорная группировка выбрана из флуоресценина, 5-карбоксифлуоресценина или 6-карбоксифлуоресценина (ЕАМ), родамина, 5-(2'аминоэтил)аминонафталин-1-сульфокислоты (Ε0ΛΝ8). антраниламида, кумарина, хелатных производных тербия, малахитового зеленого и реактивного красного 4, и указанная акцепторная группировка выбрана из ПАВСУЬ, родамина, тетраметилродамина, пиренбутирата, эозиннитротирозина, этидия и техасского красного. Предпочтительно, указанная донорная группировка представляет собой флуоресценин или его производное, и указанная акцепторная группировка представляет собой ПАВСУЬ, и наиболее предпочтительно, донорная группировка представляет собой 6-карбоксифлуоресценин. Другие предпочтительные комбинации, особенно в контексте мультиплексирования обсуждаются в данной заявке, и эти комбинации также рассматриваются для этих аспектов изобретения.

В изобретении также предложены наборы, которые могут быть использованы для осуществления способов по изобретению. Наборы могут включать любые предпочтительные признаки, упомянутые в связи с различными способами (и применениями) по изобретению, описанными в данной заявке. Таким образом, в изобретении предложен набор для определения присутствия и/или количества интересующего метилированного или неметилированного гена в ДНК-содержащем образце, включающий по меньшей мере одну пару праймеров по изобретению. Предпочтительно, набор включает пару праймеров по изобретению для определения присутствия и/или количества неметилированного и/или метилированного гена МАСЕ-А3 и пару праймеров для определения присутствия и/или количества эталонного гена, в частности бета-актина. Таким образом, набор может включать пары праймеров, содержащих праймер, содержащий, состоящий по существу или состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной в виде 8ЕЦ ГО N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 25. Предпочтительно по меньшей мере один праймер в каждой паре праймеров метят соответствующей структурой стебельпетля или шпилечной структурой для облегчения определения в режиме реального времени, как описано выше (это обсуждение используется в данной заявке с соответствующими изменениями). Наиболее предпочтительно, по меньшей мере один праймер в каждой паре праймеров структуру включает стебель-петля или шпилечную структуру, которая содержит, состоит по существу или состоит из нуклеотидной последовательности, представленной в виде 8ЕЦ ГО N0: 1. Структуру стебель-петля метят соответствующей донорной и акцепторной группировкой, как описано в данной заявке (это обсуждение используется в данной заявке с соответствующими изменениями).

Как упомянуто выше, дополнительные характеристики праймеров по изобретению приведены в подробном описании (экспериментальная часть) ниже. В настоящем изобретении могут быть использованы варианты этих последовательностей, как описано в данной заявке. Альтернативные флуоресцентные донорные и акцепторные группировки/ЕВЕТ-пары могут быть использованы при необходимости, как обсуждается в данной заявке.

В одном воплощении набор по изобретению дополнительно включает реагент, который модифицирует неметилированный цитозин, как обсуждается в данной заявке (вместо метилированных остатков цитозина, которые защищены). Такой реагент полезен для различения метилированных и неметилированных остатков цитозина. В предпочтительном воплощении реагент содержит бисульфит, предпочтительно бисульфит натрия. Этот реагент способен превратить неметилированные остатки цитозина в ура

- 16 017879 цил, в то время как метилированные цитозины остаются неизмененными. Это различие между остатками может быть использовано для различения метилированной и неметилированной нуклеиновой кислоты в последующем процессе, таком как ПЦР с использованием праймеров, которые устанавливают различие между цитозином и урацилом (цитозин спаривается с гуанином, тогда как урацил спаривается с аденином).

Как уже упоминалось в связи со способами по изобретению в данной заявке, подходящие контроли могут быть использованы для контроля качества этих способов. Соответственно, в одном воплощении набор по изобретению дополнительно включает, состоит по существу или состоит из одной или более контрольных молекул нуклеиновых кислот, статус метилирования которых известен. Эти (одна или более) контрольные молекулы нуклеиновых кислот могут включать обе нуклеиновые кислоты, которые, как известно, являются или обработаны таким образом, чтобы быть метилированными, и/или молекулы нуклеиновых кислот, которые, как известно, являются или обработаны таким образом, чтобы быть неметилированными. Одним примером подходящего внутреннего эталонного гена, который обычно является неметилированным, но может быть обработан таким образом, чтобы стать метилированным, является бета-актин.

Наборы по изобретению могут дополнительно включать подходящие буферы и другие реагенты для проведения заявленных способов по изобретению. Таким образом, обсуждение, предложенное в отношении способов по изобретению, используется с соответствующими изменениями в данной заявке и не повторяется из соображений краткости. В одном воплощении набор по изобретению дополнительно содержит, состоит по существу или состоит из буферов для амплификации нуклеиновых кислот.

Набор также может дополнительно включать, состоять по существу или состоять из ферментов, катализирующих амплификацию нуклеиновых кислот. Таким образом, набор также может дополнительно включать, состоять по существу или состоять из подходящей полимеразы для амплификации нуклеиновых кислот. Примеры включают полимеразы из семейств полимераз типа А и типа В, таких как Тад, РЕи, Уеп! и т.д.

Различные компоненты набора могут быть упакованы отдельно в индивидуальных ячейках или могут храниться, например, вместе, при необходимости.

Набор также может включать подходящие инструкции по использованию, которые могут быть напечатаны на отдельном листе или, например, включены в упаковку набора. Инструкции могут облегчить применение наборов по изобретению с соответствующим аппаратом амплификации в режиме реального времени, многие из которых имеются в продаже.

Последняя стадия способов по изобретению в режиме реального времени включает количественную оценку результатов определения в режиме реального времени относительно калибровочной кривой для интересующего метилированного или неметилированного гена и возможно эталонного гена (если он включен). Калибровочные кривые могут быть получены с использованием набора стандартов. Каждый стандарт содержит известное число копий или концентрацию интересующего гена и/или эталонного гена, при необходимости. Как правило, фоновое значение флуоресценции будет установлено для учета фоновой флуоресценции. Например, в одном воплощении используют программное обеспечение ТНе 8есщепсе Ие!ес!юп 8уйет (8И8). Это программное обеспечение устанавливает по умолчанию базовый диапазон циклов от 3 до 15 реакции амплификации до определения продуктов амплификации. Пороговое значение флуоресценции затем определяют по статистически значимой величине выше этой базовой величины. Как правило, порог устанавливают на 10 стандартных отклонений выше базовой флуоресценции. Соответствующее программное обеспечение предложено вместе с апаратом для проведения реакций амплификации в режиме реального времени. Программное обеспечение автоматически вычисляет базовый уровень и пороговые значения для реакции. Пороговое значение цикла (С!) затем может быть определено для каждого стандарта. Это число циклов, необходимых для достижения порогового уровня амплификации. Таким образом, чем больше исходная концентрация стандартного гена в реакционной смеси, тем меньше требуется циклов для получения определенного выхода амплифицированного продукта. Зависимость С! относительно 1од₁₀ известного исходного числа копий набора стандартных молекул ДНК представляет собой прямую линию. Это калибровочная кривая. Таким образом, каждое значение С! для амплификации интересующего гена и эталонного гена, в случае использования, можно интерполировать относительно соответствующей калибровочной кривой для определения числа копий в ДНК-содержащем образце. Таким образом, результат способа представляет собой число копий гена для каждого интересующего гена и эталонного гена. Данные результаты могут быть нормализованы путем деления числа копий интересующего метилированного или неметилированного гена на число копий эталонного гена. В предпочтительном воплощении для осуществления способов по изобретению используют быструю ПЦРсистему в режиме реального времени ЛррНеб Вюкуйетк 7900 НТ. Предпочтительно, используют 8И8 программное обеспечение, предпочтительно включающее подходящий алгоритм, такой как алгоритм Ли!о СТ для автоматического образования базовых и пороговых значений для индивидуальных детекторов.

Хотя способы по изобретению могут быть использованы с любым подходящим способом амплификации, наиболее предпочтительно, когда амплификацию осуществляют с использованием полимеразной

- 17 017879 цепной реакции (ПЦР). Таким образом, хотя ПЦР является предпочтительным способом амплификации, для включения вариантов основного способа, таких как гнездовая ПЦР, в объем изобретения также могут быть включены эквиваленты. Примеры включают, без ограничения, способы изотермической амплификации, такие как ΝΆΞΕΆ, 38К, ТМА и триамплификация, которые все хорошо известны в данной области техники, и подходящие реагенты имеются в продаже. Другие подходящие способы амплификации включают, без ограничения, лигазную цепную реакцию (ЬСК) (Ваггшдег е! а1., 1990), МЬРА, селективную амплификацию целевых полинуклеотидных последовательностей (патент США № 6410276), полимеразную цепную реакцию, праймированную консенсусной последовательностью (патент США № 4437975), технологию туабег (ТЫгб \Уауе ТесНпокщеь МабЦои, \У1), технологию со смещением цепи, произвольно праймированную полимеразную цепную реакцию (\У0 90/06995) и амплификацию со смещением разрывов (\У0 2004/067726).

Способы ПЦР в режиме реального времени по изобретению обычно включают стадии снижения температуры для отжига праймера, повышение температуры для удлинения праймера, повышение температуры для денатурации и понижение температуры для сбора данных. В одном конкретном воплощении стадию сбора данных осуществляют при температуре приблизительно от 60 до 64°С, наиболее предпочтительно приблизительно 62°С, поскольку это, как было показано, дает максимально точные и конкретные результаты, как описано в разделе примеров.

В конкретном воплощении температурный профиль полимеразной цепной реакции включает от 40 до 50 повторов, предпочтительно приблизительно 45 повторов цикла:

(а) приблизительно 50°С в течение приблизительно 2 мин (б) приблизительно 95°С в течение приблизительно 10 мин (в) приблизительно 95°С в течение приблизительно 15 с (г) приблизительно 62°С в течение приблизительно 1 мин.

Предпочтительная схема реакции, которая, как показано, приводит к конкретным и точным результатам в способах по изобретению, представляет собой стадию 1: 50°С в течение 2 мин, стадию 2: 95°С в течение 10 мин, стадию 3: 95°С в течение 15 с, 59°С в течение 30 с, 59°С в течение 30 с (= плато-сбор данных) по 45 повторов.

Можно использовать способы по изобретению для определения более чем одного интересующего гена в одной и той же реакции. Посредством применения нескольких конкретных наборов праймеров, амплификацию нескольких целевых нуклеиновых кислот можно осуществлять в одной и той же реакционной смеси. Это может назвать мультиплексированием. В предпочтительном воплощении один или оба праймера для каждой мишени могут представлять собой шпилечные праймеры, меченые флуоресцентной группировкой и гасящей группировкой, которые образуют РКЕТ-дару. Амплификация нескольких целевых нуклеиновых кислот требует, чтобы разная флуоресцентная донорная и/или акцепторная группировка, с разной длиной волны излучения, была использована для мечения каждого набора праймеров. Во время определения и анализа после амплификации реакционную смесь облучают и считывают при каждой из конкретных длин волн, характерных для каждого из наборов праймеров, используемых в реакции. Таким образом, можно определить, какие конкретные целевые ДНК в смеси были амплифицированы и мечены. В конкретном воплощении используют две или более пар праймеров для амплификации различных соответствующих целевых последовательностей. Таким образом, присутствие и/или количество панели интересующих метилированных/неметилированных генов может быть определено в одном ДНК-содержащем образце.

Мультиплексирование также может быть использовано применительно к определению как интересующего гена, так и эталонного гена в одной и той же реакции. В свою очередь, праймеры, меченые соответствующими различающимися донорными и/или акцепторными группировками, позволяют различить сигнал, образующийся в результате амплификации интересующего гена и эталонного гена, соответственно.

В одном воплощении используют универсальный гаситель вместе с подходящими флуорофорными донорами, каждый из которых имеет различимый максимум длины волны излучения. Особенно предпочтительным гасителем является ПАВСУЬ. Вместе с ПАВСУЬ в качестве гасителя может быть использован каждый из следующих флуорофоров для обеспечения мультиплексирования: Кумарин (максимум излучения 475 нм), ЕЭЛ№ (491 нм), флуоресценин (515 нм), Люцифер желтый (523 нм), Β0ΌΙΡΥ (525 нм), эозин (543 нм), тетраметилродамин (575 нм) и техасский красный (615 нм) (Туа§1 е! а1., №11иге Вю!есйио1о§у, Уо1. 16, 1аи 1998; 49-53). Другие предпочтительные комбинации обсуждаются в данной заявке.

В альтернативном воплощении ДНК-содержащий образец может быть разделен, и способы по изобретению осуществляются на подходящих частях образца для того, чтобы непосредственно получить сравнимые результаты. Таким образом, когда определяют как интересующий ген, так и эталонный ген, образец может быть разделен на две части, чтобы сделать возможным определение амплификации интересующего гена в режиме реального времени в одном участке образца и определение амплификации эталонного гена в режиме реального времени в другом участке образца. Образец может быть дополнительно разделен для того, чтобы позволить осуществление подходящих контрольных реакций, при необходимо

- 18 017879 сти. Преимущество этой схемы в том, что универсальная ЕКЕТ-пара может быть использована для мечения каждой пары праймеров и устраняет необходимость определения излучения в диапазоне длин волн. Однако этот способ исходно не зависит от получения подходящего образца для обеспечения разделения образца. Хотя может быть использован любой подходящий объем реакции, в одном конкретном воплощении общий объем реакции для стадии амплификации составляет приблизительно от 10 до 40 мкл, более предпочтительно приблизительно от 10 до 30 мкл и наиболее предпочтительно около 12 мкл.

В одном аспекте олигонуклеотиды, праймеры или зонды, пары праймеров, наборы или способы по настоящему изобретению используют для диагностики рака или предрасположенности к раку, где присутствие неметилированного (или гипометилированного) МАСЕ-А3 в образце является признаком рака или предрасположенности к раку. Таким образом, в настоящем изобретении предложены наборы, способы и праймеры для диагностики рака или предрасположенности к раку.

Диагноз определяют в данной заявке как включающий скрининг заболевания или предварительной стадии заболевания, идентификации заболевания или предварительной стадии заболевания, мониторинг стадии заболевания и состояние и развитие заболевания, проверка рецидива заболевания после лечения и мониторинг успеха конкретного лечения. Испытания также могут иметь прогностическое значение, и это включено в определение термина диагноз. Прогностическое значение испытаний может быть использовано в качестве маркера потенциальной чувствительности к раку или в качестве маркера развития рака. Таким образом, пациенты с риском заболевания могут быть идентифицированы до того, как заболевание имеет шанс проявить себя в симптомах, идентифицируемых у пациента. В предпочтительном воплощении рак выбран из рака легких, меланомы или рака мочевого пузыря. В предпочтительном воплощении в способах и анализах для диагностики используют по меньшей мере один олигонуклеотид, содержащий, состоящий, состоящий по существу или состоящий из любой нуклеотидной последовательности из БЕЦ ΙΌ N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 25. В предпочтительном воплощении при диагностике рака или предрасположенности к раку используют олигонуклеотиды, содержащие, состоящие, состоящие по существу или состоящие из любой нуклеотидной последовательности из БЕЦ ΙΌ N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 или 25, и определяют неметилированную форму гена. В альтернативном воплощении в способах и анализах для диагностики используют по меньшей мере один олигонуклеотид, содержащий состоящий по существу или состоящий из любой нуклеотидной последовательности из БЕЦ ΙΌ N0: 14, 16, 17 или 19.

Тестирование может быть осуществлено диагностически или в сочетании с терапевтической схемой. Как упомянуто выше, были описаны ОТ-ПЦР анализы, которые устанавливают прогностическое значение экспрессии МАСЕ-А3 при ХБСБС. Эти анализы находят свое применение в отборе пациентов, подходящих для лечения иммунотерапевтическим МАСЕ-А3. Авторы изобретения показали, что анализ, предназначенный для определения неметилированного МАСЕ-А3 с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров или наборов по изобретению, может надежно классифицировать образцы как экспрессирующие МАСЕ-А3. Результат статуса метилирования, полученный с помощью теста на метилирование, хорошо согласуется с результатами, полученными с помощью существующего ОТ-ПЦР теста для определения МАСЕ-А3. который используется на образцах РНК. Соответственно, тест на метилирование имеет клиническое применение.

В дополнительном аспекте в изобретении предложен способ прогнозирования вероятности успешного лечения рака у субъекта, включающий:

(а) приведение ДНК-содержащего тестируемого образца, полученного от субъекта, в контакт с реагентом или обработку ДНК-содержащего тестируемого образца, полученного от субъекта, реагентом, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК, с получением детектируемых модифицированных остатков, но который не модифицирует метилированные остатки цитозина;

(б) амплификацию по меньшей мере участка неметилированного гена МАСЕА3 с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, в которой по меньшей мере один праймер сконструирован таким образом, чтобы связываться только с последовательностью неметилированной ДНК, соответственно, после обработки реагентом, где по меньшей мере один праймер в паре праймеров содержит, состоит по существу или состоит из любой нуклеотидной последовательности из БЕЦ ΙΌ N0: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 или 25;

(в) определение статуса метилирования гена МАСЕ-А3;

где присутствие неметилированного МАСЕ-А3 в образце указывает на то, что вероятность успешного лечения иммунотерапевтическим МАСЕ-А3 выше, чем при определении отсутствия или более низких уровней неметилированного гена МАСЕ-А3.

Стадия (в) включает идентификацию образования продукта амплификации. Идентификация продукта амплификации (с использованием любого подходящего способа, описанного в данной заявке) указывает на присутствие неметилированного или гипометилированного МАСЕА3 в образце.

Конечно, обратная ситуация также применима, и поэтому способы по изобретению также могут быть использованы для того, чтобы определить вероятность устойчивости к лечению или неуспешного лечения при применении иммунотерапевтического агента МАСЕА3 - отсутствие неметилированного

- 19 017879

МАСЕ-А3 в образце указывает на вероятную устойчивость к лечению и/или что лечение, скорее всего, будет неуспешным. Праймеры, специфические к метилированной ДНК, также могут быть использованы в дополнительных способах в некоторых воплощениях.

Способы по изобретению также могут быть использованы для выбора подходящего курса лечения для пациента - присутствие неметилированного МАСЕ-А3 указывает на то, что введение иммунотерапевтических агентов МАСЕ-А3 может быть полезным, тогда как отсутствие или низкий уровень неметилированного МАСЕ-А3 указывает на то, что иммунотерапевтические агенты противопоказаны. Обсуждение, предложенное в связи с олигонуклеотидами, праймерами или зондами, парами праймеров, наборами или способами по изобретению, относится к настоящему аспекту с соответствующими изменениями, и поэтому все воплощения рассматриваются соответствующим образом для этого аспекта изобретения.

Под вероятностью успешного лечения подразумевают возможность того, что лечение рака с использованием одного или более из перечисленных терапевтических агентов, предпочтительно иммунотерапевтическим МАСЕ-А3 или композицией, содержащей МАСЕ-А3. будет успешным.

Устойчивость определяют как уменьшенную возможность того, что лечение рака будет успешным при применении любого из указанных иммунотерапевтических агентов и/или что для достижения терапевтического эффекта потребутся более высокая доза.

Гипометилирование МАСЕ-А3 может быть связано с определенными типами рака. Соответственно, в конкретном воплощении в изобретении предложен способ определения предрасположенности или частоты возникновения рака мочевого пузыря, рака легких, в том числе N8060 или меланомы, в образце, включающий определение статуса метилирования гена МАОЕ-А3 с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров, наборов или способов по изобретению, где определение неметилированного МАОЕ-А3 в образце является признаком предрасположенности к раку, или частоты возникновения рака, в частности меланомы; рака легких, включающего немелкоклеточную карциному легкого (N8060); или рака мочевого пузыря, включая переходно-клеточную карциному. В другом воплощении опухоль или рак выбраны из рака молочной железы, рака головы и шеи, включающего рак пищевода, плоскоклеточный рак, семиному, рак печени, множественную миелому и рак толстой кишки.

В другом аспекте предложен способ определения присутствия МАОЕ-А3-положительной опухоли, включающий определение статуса метилирования гена МАОЕ-А3 в образце с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров, наборов или способов, описанных в данной заявке, где присутствие неметилированного МАОЕ-А3 является признаком присутствия МАОЕ-А3-положительной опухоли.

Тестирование может быть осуществлено диагностически или в сочетании с терапевтической схемой. МА0Е-А3-специфические иммунотерапевтические средства (А8С1) были разработаны и в настоящее время оцениваются в клинических испытаниях. Тестирование также может быть использовано для определения того, какая терапевтическая или профилактическая схема может быть применена к пациенту и может использоваться для мониторинга эффективности терапевтической схемы.

Соответственно, в изобретении также предложен способ идентификации и/или выбора пациента, подходящего для лечения иммунотерапевтическим МАОЕ-А3, включающий определение статуса метилирования гена МАОЕ-А3 в образце от пациента с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров, наборов или способов, описанных в данной заявке, где в случае, если ген МАОЕА3 является неметилированным, субъекта идентифицируют и/или отбирают для лечения иммунотерапевтическим МАОЕ-А3.

Альтернативно, если ген не является неметилированным, субъекта предпочтительно не отбирают для лечения иммунотерапевтическим МАОЕ-А3.

В родственном аспекте в изобретении предложен способ прогнозирования вероятности успешного лечения рака, включающий определение статуса метилирования гена МАОЕ-А3 в образце от пациента с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров, наборов или способов, описанных в данной заявке, где в случае, если ген является неметилированным, вероятность успешного лечения иммунотерапевтическим МАОЕ-А3 выше, чем в случае метилированного гена.

Альтернативно, отсутствие неметилированного МАОЕ-А3 в образце указывает на то, что вероятность устойчивости к лечению иммунотерапевтическим МАОЕ-А3 выше, чем в случае неметилированного гена. Таким образом, определение метилированного гена МАОЕ-А3 (или отсутствие определения гипометилированного гена) указывает на низкую вероятность успешного лечения иммунотерапевтическим средством.

Таким образом, группа пациентов может быть выбрана для лечения на основе их статуса метилирования в отношении гена МАОЕ-А3. Это приводит к гораздо более конкретной и индивидуализированной форме терапии и, таким образом, приводит к повышению показателей успеха, так как пациентов будут лечить лекарственными средствами, которые, по всей вероятности, будут наиболее эффективными.

В другом родственном аспекте в изобретении предложен способ выбора подходящей схемы лечения рака, включающий определение статуса метилирования гена МАОЕ-А3 в образце от пациента с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров, наборов или способов, описан

- 20 017879 ных в данной заявке, где в случае неметилированного гена для лечения выбирают иммунотерапевтическое средство (в частности МАСЕ иммунотерапевтическое средство).

Кроме того, предложен способ лечения рака у субъекта, включающий введение иммунотерапевтического средства, где субъекта выбрали для лечения на основании измерения статуса метилирования гена МАСЕ-А3 в соответствии с любым из способов по изобретению или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, как описано в данной заявке. Предпочтительно для всех различных аспектов, описанных в данной заявке, определение неметилированного гена МАСЕ-А3 соответствует повышенному уровню белка МАСЕ-А3.

МАСЕ-А3 иммунотерапевтические средства, полезные в настоящем изобретении, включают композиции на основе МАСЕ-А3. Примеры композиций, содержащих МАСЕ-А3, включают композиции, содержащие полноразмерный МАСЕ-А3, по существу полноразмерный МАСЕ-А3 и фрагменты МАСЕ-А3, например, пептиды МАСЕ-А3.

Примеры пептидов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают следующие пептиды МАСЕ-А3:

8ΕΩ Ю ΝΟ	Пептидная последовательность
8ЕО Ю ΝΟ: 27	ΕΙ_ν\/(3ΡΚΑΙ_ν
8ΕΩ Ю ΝΟ: 28	ΕνϋΡΙ<3ΗΙ_Υ
8ΕΩ ΙΟΝΟ.-29	ΜΕνϋΡΙΟΗΪΥ
8ΕΩ Ю ΝΟ: 30	νΗΓΙ_Ι_Ι_ΚΥΡΑ
8ЕО Ю ΝΟ; 31	ίνΗΡΙ 1 Ι ΚΥΚ
8Е0 Ю ΝΟ: 32	Ι_ΚΥΠΑΠΕΡνΤ
8ΕΩ Ю ΝΟ: 33	Α0ΥΕΕΙ_\Λ/0ΡΕΑΙ_νΕΤ8
8ΕΩ Ю ΝΟ: 34	ΤΩΗΡνΟΕΝΥίΕΥ

Белок МАСЕ может представлять собой полноразмерный МАСЕ-А3 или может содержать по существу полноразмерный фрагмент из МАСЕ3, например, аминокислоты 3-314 МАСЕ3 (всего 312 аминокислот), или другие фрагменты МАСЕ-А3, в которых от 1 до 10 аминокислот делетированы из Ν-конца и/или С-конца белка МАСЕ-А3.

В одном воплощении белок, фрагмент или пептид МАСЕ-А3 может быть связан с белкомпартнером для слияния.

Белок, фрагмент или пептид МАСЕ-А3 и белок-партнер для слияния могут быть химически конъюгированы или могут экспрессироваться в виде рекомбинантного слитого белка. В воплощении, где антиген и партнер экспрессируются в виде рекомбинантного слитого белка, это может привести к повышению продуцируемых уровней в экспрессирующей системе по сравнению с неслитым белком. Таким образом, белок-партнер для слияния может принимать участие в обеспечении Т-хелперных эпитопов (иммунологический белок-партнер для слияния), предпочтительно Т-хелперных эпитопов, распознаваемых человеком, и/или содействовать экспрессии белка (экспрессия энхансерного белка) с более высокими выходами, чем нативного рекомбинантного белка. В одном воплощении белок-партнер для слияния может представлять собой как иммунологический белок-партнер для слияния, так и белок-партнер для усиления экспрессии.

В одном воплощении изобретения иммунологический белок-партнер для слияния, который может быть использован, происходит из белка Ώ, поверхностного белка грамотрицательной бактерии НаеторЫ1ик тйиеп/а В (АО 91/18926) или его производного. Производное белка Ώ может включать первую 1/3 белка или приблизительно первую 1/3 белка. В одном воплощении первые 109 Ν-концевых остатков белка Ώ могут быть использованы в качестве партнера для слияния для обеспечения антигена МАСЕ-А3 дополнительными экзогенными Т-клеточными эпитопами и увеличения уровня экспрессии в Е. сой (таким образом, действуя в качестве усилителя экспрессии). В альтернативном воплощении производное белка Ώ может содержать первые 100-110 Ν-концевых аминокислот или приблизительно первые 100-110 Ν-концевых аминокислот. В одном воплощении белок Ώ или его производное могут быть липидированы, и липопротеин Ώ может быть использован: липидный хвост может обеспечить оптимальное представление антигена антигенпредставляющим клеткам. В альтернативном воплощении белок Ώ или его производное не липидированы. Последовательность секреции или сигнальная последовательность белка Ώ относится приблизительно к аминокислотам 1-16, 17, 18 или 19 природного белка. В одном воплощении последовательность секреции или сигнальная последовательность белка Ώ относится к 19 Ν-концевым аминокислотам белка Ώ. В одном воплощении последовательность секреции или сигнальная последовательность включена в Ν-конец белка ϋ-партнера для слияния. Как использовано в данной заявке, первая треть (1/3), первые 109 аминокислот и первые 100-110 Ν-концевых аминокислот относятся к аминокислотам последовательности белка Ώ, следующим сразу за последовательностью секреции или сигналь

- 21 017879 ной последовательностью. Аминокислоты 2-К и 3-Ь сигнальной последовательности возможно могут быть заменены аминокислотами 2-М и 3-Ό.

В одном воплощении МЛСЕ-А3 может представлять собой белок О-МЛСЕ-Л3-Н|5, слитый белок из 432 аминокислотных остатков. Этот слитый белок содержит сигнальную последовательность белка Ό, аминокислоты 1-109 белка Ό, 312 аминокислот белка МЛСЕ-А3 (аминокислоты 3-314), спейсер и полигистидиновый хвост (ΗΪ8), который может облегчать очистку слитого белка во время процесса производства, например:

1) Сигнальную последовательность из 18 остатков и первые 109 ^концевых остатков белка Ό;

2) Два независимых остатка (метионин и аспарагиновая кислота);

3) Остатки 3-314 нативного белка МЛСЕ-3;

4) Два глициновых остатка, функционирующих в качестве шарнирной области; и

5) Семь гистидиновых остатков.

Аминокислотная последовательность для этой молекулы показана на фиг. 10 (8ЕО Ш N0: 40). Этот антиген и антигены, упомянутые ниже, описываются более подробно в \У0 99/40188.

В другом воплощении иммунологическим белком-партнером для слияния может быть белок, известный как ЕуЗЛ, или белок, полученный из него. йуЗЛ происходит из 83гер3ососси5 рпеитошае, который синтезирует №ацетил-Ь-аланинамидазу, амидазу йуЗЛ (кодируемую геном йуЗЛ (Сепе, 43 (1986) раде 265-272)), аутолизин, который специфически разрушает определенные связи в пептидогликановом скелете. С-концевой домен белка й-уЗЛ ответственен за сродство к холину или к некоторым аналогам холина, таким как ПЕЛЕ. Это свойство было использовано для разработки Е. сой С-йуЗЛэкспрессирующих плазмид, полезных для экспрессии слитых белков. Очистка гибридных белков, содержащих фрагмент С-йуЗЛ на его аминоконце, была описана (ВюЗесйпо1оду: 10, (1992) раде 795-798). В одном воплощении может быть использован С-концевой участок молекулы. Может быть использован повторяющийся участок молекулы ЬуЗЛ, обнаруженный на С-конце, начиная с остатка 178. В одном воплощении участок йуЗЛ может включать остатки 188-305.

Другие партнеры для слияния включают неструктурный белок вируса гриппа N81 (гемагглютинин). В одном воплощении используют 81 ^концевых аминокислот N81, хотя могут быть использованы и другие фрагменты, при условии, что они включают Т-хелперные эпитопы.

В одном воплощении настоящего изобретения белок МЛСЕ-А3 может содержать дериватизированный свободный тиол. Такие антигены были описаны в \У099/40188. В частности, могут быть использованы карбоксиамидированные или карбоксиметилированные производные.

В другом воплощении композиция МЛСЕ-А3 содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, фрагмент или пептид МЛСЕ-А3 или слитый белок, как описано в данной заявке. В одном воплощении настоящего изобретения последовательности могут быть встроены в подходящий экспрессирующий вектор и использованы для ДНК/РНК-вакцинации. Микробные векторы, экспрессирующие нуклеиновую кислоту, также могут быть использованы в качестве вектор-доставляемых иммунотерапевтических средств.

Примеры подходящих вирусных векторов включают ретровирусные, лентивирусные, аденовирусные, аденоассоциированные вирусные, герпесвирусные, включающие системы на основе вируса простого герпеса, альфа-вирусные, поксвирусные, такие как системы на основе вируса оспы птиц и вируса осповакцины. Способы переноса генов с использованием этих вирусов известны специалистам в данной области техники. Ретровирусные векторы, например, могут быть использованы для стабильной интеграции полинуклеотида по изобретению в геном хозяина, хотя такая рекомбинация не является предпочтительной. Аденовирусные векторы, дефектные по репликации, напротив, остаются эписомными и поэтому допускают временную экспрессию. Векторы, способные запускать экспрессию в клетках насекомых (например, бакуловирусные векторы), в человеческих клетках, дрожжах или в бактериях могут быть использованы для количественного получения белка МЛСЕ-А3, кодируемого полинуклеотидами по настоящему изобретению, например, для применения в качестве субъединичных вакцин или в иммунноанализах.

В предпочтительном воплощении аденовирус, используемый в качестве живого вектора, является аденовирусом обезьяны, дефектным по репликации. Обычно эти вирусы содержат делецию Е1 и могут выращиваться в клеточных линиях, которые трансформированы геном Е1. Предпочтительные аденовирусы обезьян представляют собой вирусы, выделенные из шимпанзе. В частности, С68 (также известный как Рап 9) (см. патент США № 6083716) и Рап 5, 6 и Рап 7 (\У0 03/046124) являются предпочтительными для применения в настоящем изобретении. Эти векторы могут быть использованы для вставки гетерологичного гена по изобретению, такого гена, продукт которого может экспрессироваться. Применение, приготовление в виде препарата и изготовление таких рекомбинантных аденовирусных векторов подробно изложены в \У0 03/046142.

Традиционные рекомбинантные методы получения последовательностей нуклеиновых кислот и получение экспрессирующих векторов описаны в Машайз еЗ а1., Мо1еси1аг С1ошпд - Л ЬаЬогаЗогу Мапиа1; СоИ 8рппд НагЬог, 1982-1989.

Для композиций на основе белка, белки по настоящему изобретению могут быть предложены либо

- 22 017879 растворимыми в жидкой форме, либо в лиофилизированной форме.

Каждая человеческая доза может содержать от 1 до 1000 мкг белка. В одном воплощении доза может содержать от 30 до 300 мкг белка.

Композиция, содержащая МАОЕ-А3, как описано в данной заявке, дополнительно может содержать вакцинный адъювант и/или иммуностимулирующий цитокин или хемокин.

Подходящие вакцинные адъюванты для применения в настоящем изобретении имеются в продаже, такие как, например, неполный адъювант и полный адъювант Фрейнда (Б1£со БаЬогаШпез, Бейой, М1); адъювант 65 Мегск (Мегск апб Сотрапу, 1пс., КаИ^ау, N6); А8-2 (8тйИК1те БеесИагг!, РИ11абе1рИ1а, РА); соли алюминия, такие как гель гидрата окиси алюминия (квасцы) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина; ацелированные сахара; дериватизированные катионами или анионами полисахариды; полифосфазены; биодеградируемые микросферы; монофосфориллипид А и ςυί1 А. В качестве адъювантов также могут быть использованы цитокины, такие как ОМ-С8Р или интерлейкин-2, -7 или -12, и хемокины.

В одном воплощении адъювант может содержать комбинацию монофосфориллипида А, такого как З-де-О-ацилированный монофосфориллипид А (3П-МРБ) вместе с солью алюминия. Альтернативно, адъювант может содержать 3П-МРБ или другие лиганды 1о11-подобного рецептора 4 (ТБК4), такие как аминоалкилглюкозаминида фосфаты, как раскрыто в ШО 98/50399, ШО 01/34617 и ШО 03/065806.

Другой адъювант, который может быть использован, представляет собой сапонин, например 0821 (Адш1а БюрИагтасеийсак 1пс., РгаттдИат, МА), который может быть использован отдельно или в комбинации с другими адъювантами. Например, в одном воплощении предложена комбинация монофосфориллипида А и производного сапонина, такая как комбинация 0821 и 3П-МРБ, как описано в ШО 94/00153, или композиция, в которой 0821 гасится холестерином, как описано в ШО 96/33739. Другие подходящие препараты содержат эмульсию типа масло-в-воде и токоферол. В одном воплощении адъювант содержит 0821, 3П-МРБ и токоферол в эмульсии типа масло-в-воде, как описано в ШО 95/17210.

Другие адъюванты для применения в настоящем изобретении могут содержать антагонисты ТБК9, такие как неметилированные СрО-содержащие олигонуклеотиды, в которых динуклеотид СрО неметилирован. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в ШО 96/02555.

Подходящие олигонуклеотиды для применения в настоящем изобретении (в этом контексте) могут включать:

5Е<2 Ю N0:35	ТСС АТС АСС ТТС СТС АСС ТТ	СрС 1826
ЗЕ<2 Ю ΝΟ: 36	ТСТ ССС АСС СТС ССС САТ	СрС 1758
5Е<2 Ю ΝΟ: 37	АСС САТ САС СТС ССС СОТ САС ССС АСС АСС
8Е<2 Ιϋ ΝΟ: 38	ТСС ТСС ТТТ ТСТ СОТ ТТТ СТС СТТ	СрС 2006, СрС 7909
ЗЕ<2 Ιϋ ΝΟ: 39	ТСС АТС АСС ТТС СТС АТС СТ	СрС 1668

СрО-содержащие олигонуклеотиды также могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими адъювантами. Например, в одном воплощении адъювант содержит комбинацию СрОсодержащего олигонуклеотида и производного сапонина, в частности комбинацию СрО и 0821, как раскрыто в ШО 00/09159 и ШО 00/62800.

Соответственно, предложена композиция, содержащая МАОЕ-А3, как описано в данной заявке, где адъювант содержит один или более из 3Б-МРЬ, 0821, СрО-олигонуклеотида, простого или сложного эфира полиэтилена или комбинации двух или более этих адъювантов. Компонент МАОЕ-А3 в композиции может быть представлен в носителе-эмульсии типа масло-в-воде или вода-в-масле или в липосомальном препарате в некоторых воплощениях.

В одном воплощении адъювант может содержать один или более из 3Б-МРЬ, 0821 и иммуностимулирующего СрО-олигонуклеотида. В воплощении присутствуют все три адъювантных компонента. Компоненты могут быть представлены либо в липосомальном препарате, либо в эмульсии типа масло-вводе, такой, как описано в ШО 95/17210.

В другом воплощении 3П-МРБ и 0§21 представлены в эмульсии типа масло-в-воде, в отсутствие СрО-олигонуклеотида.

Количество используемого 3П-МРБ является обычно небольшим, но в зависимости от препарата может варьировать от 1 до 1000 мкг на дозу, предпочтительно от 1 до 500 мкг на дозу и более предпочтительно от 1 до 100 мкг на дозу.

Количество СрО или иммуностимулирующих олигонуклеотидов в адъювантах по настоящему изобретению является обычно небольшим, но в зависимости от состава может варьировать от 1 до 1000 мкг на дозу, предпочтительно от 1 до 500 мкг на дозу и более предпочтительно от 1 до 100 мкг на дозу.

Количество сапонина для применения в адъювантах по настоящему изобретению может варьировать от 1 до 1000 мкг на дозу, предпочтительно от 1 до 500 мкг на дозу, более предпочтительно от 1 до 250 мкг на дозу и наиболее предпочтительно от 1 до 100 мкг на дозу.

- 23 017879

Адъювантные препараты, как описано в данной заявке, могут дополнительно содержать эмульсию типа масло-в-воде и/или токоферол или могут быть приготовлены в липосомальной композиции.

Другие подходящие адъюванты включают Монтанид Ι8Ά 720 (8еррю, Етапсе), 8ЛР (СЫгоп, СаНГогша, Ипйеб 81а1ек). 18СОМ8 (С8Ь), МЕ-59 (СЫгоп), ИЬ1 ЭеЮх. ИС-529 (С8К, НатШоп, МТ) и другие аминоалкилглюкозаминид-4-фосфаты (ЛСИк).

Как правило, каждая доза для человека может содержать 0,1-1000 мкг антигена, например 0,1-500 мкг, 0,1-100 мкг или 0,1-50 мкг. Оптимальное количество конкретного иммунотерапевтического средства может быть получено посредством стандартных исследований, включающих наблюдение за соответствующими иммунными ответами у вакцинированных субъектов. После первичной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустерных иммунизаций с адекватным интервалом.

Альтернативно, композиция для применения в способе по настоящему изобретению может содержать фармацевтическую композицию, содержащую МЛОЕ-А3, как описано в данной заявке, в фармацевтически приемлемом эксципиенте.

Изобретение теперь будет описано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры:

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 - локализация праймеров МЛОЕЛ3_и на неконвертированной последовательности (Фиг. 1а 8ЕО ΙΌ N0: 10) и соответствующей конвертированной последовательности (Фиг. 1Ь - 8ЕЦ ΙΌ N0: 41). Положение праймера МА6ЕЛ3_ОО1 и заключено в рамку, положение праймера МАОЕА3_ОО2 и выделено, положение праймера МАОЕА3_ЕиииТА и выделено жирным шрифтом, положение праймера

I

МАОЕА3_рГО и подчеркнуто, положение О, обозначенное ' соответствует сайту начала транскрипции.

Фиг. 2 - локализация праймеров МАОЕА3_ОО_2_и на неконвертированной последовательности (Фиг. 2а - 8ЕЦ ΙΌ NО: 10) и соответствующей конвертированной последовательности (Фиг. 2Ь - 8ЕЦ ΙΌ NО: 41), сайт начала транскрипции подчеркнут.

Фиг. 3 - предела графика определения.

Фиг. 3а - МА6ЕА3_ОО_2_и: вводимая и ДНК (клетки ^NСаΡ) наносится на график относительно значений С!, 1,5 нг вводимой и ДНК все еще определяются.

Фиг. 31) - МАОЕА3_ЕигЫа_и: вводимая и ДНК (клетки Оет1) наносится на график относительно значений С!, 1,5 нг вводимой и ДНК все еще определяются.

Фиг. 4 - схематическое представление способа АтрНГЫот®. По меньшей мере один праймер (прямой праймер в этом случае) в паре праймеров содержит шпилечную структуру, несущую донорную (ЕАМ) и акцепторную группировка (ОАБСУЕ) из молекулярной пары для переноса энергии. В отсутствие амплификации флуоресценция, испускаемая донорной группировкой, эффективно поглощается акцепторной группировкой, что приводит к гашению флуоресценции. Во время амплификации праймер встраивается в продукт амплификации. Во время второго раунда амплификации структура стебельпетля или шпилечная структура разрушается. Акцепторная группировка больше не способна эффективно гасить флуоресценцию, испускаемую донорной группировкой. Таким образом, донорная группировка производит детектируемый флуоресцентный сигнал.

Фиг. 5 - древо решений для классификации образца (метилированный, неметилированный или недостоверный);

Фиг. 6 - статус метилирования МАОЕ-А3 в образцах меланомы. Кривые функциональных характеристик приемника (ИесеЫет Оретайпд СйатаЫепкйск) (ИОС) рассчитывали для 4 анализов неметилированных МАОЕ-А3 путем построения графика истинно-положительного уровня (чувствительность) в зависимости от ложно-положительного уровня (100-специфичность).

Фиг. 6а - СО_1_И анализ: чувствительность 91,7%, специфичность 76,5%, порог отсечения 214,8, площадь под кривой (АИС) равна 0,912. При 95% ДИ (доверительный интервал) диапазон составлял от 0,781 до 0,977 при уровне значимости Р = 0,0001 для площади=5.

Фиг. 6Ь - ОО_2_И анализ: чувствительность 87,5%, специфичность 100%, порог отсечения 292,6, площадь под кривой (АИС) равна 0,971. При 95% ДИ диапазон составлял от 0,863 до 0,996 при уровне значимости Р = 0,0001 для площади=5.

Фиг. 6с - Еити1а_и анализ: чувствительность 66,7%, специфичность 100%, порог отсечения 943,1, площадь под кривой (АИС) равна 0,939. При 95% ДИ диапазон составлял от 0,817 до 0,989 при уровне значимости Р = 0,0001 для площади=5.

Фиг. 66 - Οίιι_υ анализ: чувствительность 83,3%, специфичность 94,1%, порог отсечения 431,1, площадь под кривой (АИС) равна 0,944. При 95% ДИ диапазон 0,824 до 0,990 при уровне значимости Р = 0,0001 для площади=5.

Фиг. 6е - сводная таблица результатов, полученных для каждого из четырех анализов.

Фиг. 7 - статус метилирования МАОЕ-А3 в биопсиях легкого. Кривые функциональных характеристик приемника (ИОС) рассчитывали для 4 анализов неметилированных МАОЕ-А3 путем построения графика истинно-положительного уровня (чувствительность) в зависимости от ложно-положительного уровня (100-специфичность).

- 24 017879

Фиг. 7а - С0_1_и анализ: чувствительность 84,6%, специфичность 91,7%, порог отсечения 115,8, площадь под кривой (АИС) равна 0,954. При 95% ДИ диапазон составлял от 0,868 до 0,990 при уровне значимости Р = 0,0001 для площади=5.

Фиг. 7Ь - С0_2_и анализ: чувствительность 88,5%, специфичность 94,4%, порог отсечения 108,28, площадь под кривой (АИС) равна 0,971. При 95% ДИ диапазон составлял от 0,893 до 0,996 при уровне значимости Р = 0,0001 для площади=5.

Фиг. 7с - Еиги1а_и анализ: чувствительность 84,6%, специфичность 91,7%, порог отсечения 296,8, площадь под кривой (АИС) равна 0,949. При 95% ДИ диапазон составлял от 0,861 до 0,988 при уровне значимости Р = 0,0001 для площади=5.

Фиг. 7й - Цш и анализ: чувствительность 84,6%, специфичность 91,7%, порог отсечения 176,71, площадь под кривой (АИС) равна 0,948. При 95% ДИ диапазон составлял от 0,859 до 0,988 при уровне значимости Р = 0,0001 для площади=5.

Фиг. 7е - сводная таблица результатов, полученных для каждого из четырех анализов на биопсиях легкого.

Фиг. 8 - статус метилирования МАСЕ-А3 в ГЕРЕ образцах легких. Кривые функциональных характеристик приемника (К0С) рассчитывали для 4 анализов неметилированных МАСЕ-А3 путем построения графика истинно-положительного уровня (чувствительность) в зависимости от ложно-положительного уровня (100-специфичность).

Фиг. 8а - С0_1_и анализ: чувствительность 84,0%, специфичность 96,0%, порог отсечения 21,88, площадь под кривой (АИС) равна 0,933. При 95% ДИ диапазон составлял от 0,825 до 0,984 при уровне значимости Р = 0,0001 для площади=5.

Фиг. 8Ь - С0_2_и анализ: чувствительность 84,0%, специфичность 96,3%, порог отсечения 17,75, площадь под кривой (АИС) равна 0,932. При 95% ДИ диапазон составлял от 0,826 до 0,983 при уровне значимости Р = 0,0001 для площади=5.

Фиг. 8с - Еиги1а_и анализ: чувствительность 80,0%, специфичность 96,2%, порог отсечения 214,26, площадь под кривой (АИС) равна 0,923. При 95% ДИ диапазон составлял от 0,813 до 0,979 при уровне значимости Р = 0,0001 для площади=5.

Фиг. 8й - Цш_И анализ: чувствительность 72,0%, специфичность 96,2%, порог отсечения 68,91, площадь под кривой (АИС) равна 0,912. При 95% ДИ диапазон составлял от 0,799 до 0,973 при уровне значимости Р = 0,0001 для площади=5.

Фиг. 8е - сводная таблица результатов, полученных для каждого из четырех анализов на ЕЕРЕ образцах легкого.

Фиг. 9 - эффект меланина на ингибирование ПЦР при мечении на различных стадиях реакционного процесса.

Фиг. 9а - материал клеточной линии Б-НСаР с и без меченого меланина, прошедший через М8Р МАСЕ-А3 и в режиме реального времени. ВТ = обработка бисульфитом.

Фиг. 9Ь - материал клеточной линии МСЕ7 с и без меченого меланина, прошедший через М8Р Сз1Р1 М в режиме реального времени.

Фиг. 10 - белок П-МАСЕ-А3-Н15.

Подчеркнуто одной линией = первые 109 аминокислот Белка Ό.

Подчеркнуто двойной линией = сигнальная последовательность Белка Ό (18 а.к.).

Заключено в рамку] = встроенные/замещенные последовательности: Ме!-Азр в положении 2-3 (замещенные); Ме!-Азр в положении 128-129 (встроенные) и С1у-С1у в положении 442-443 (встроенные).

Жирный шрифт = фрагмент МАСЕ3: аминокислоты 3-314 МАСЕ3 (всего 312 а.к.).

Серый = 7 хвостовых гистидинов.

Подробное описание - экспериментальный раздел

Пример 1. Анализ АтрШЗиот в режиме реального времени.

Прямой, специфический в отношении метилирования ПЦР-анализ на основе флуоресценции в режиме реального времени (М8Р-анализ в режиме реального времени) разработали для определения статуса метилирования промотора МСМТ (У1аз5епЬтоеск е1 а1., I Мо1 Ωιηβη 2008, 10:332-337). Эта технология проиллюстрирована и вкратце охарактеризована в пояснении к фиг. 4.

Количественный анализ аналита для МАСЕ-А3 успешно осуществляли с использованием этой технологии. Он состоял из параллельных процессов амплификации/количественного определения с использованием специфического праймера и пары праймер/детектор для МАСЕ-А3 с помощью аналитического формата Атр1Шио®г на приборе АВ1 Рпзт® 7900НТ (АррНей В1озуз1ет5).

Конечные концентрации праймеров в реакционной смеси составляли 100 нМ как для прямого праймера/детектора, так и для обратного праймера. 12,5 мкл |Тас.|ТМ 8иретт1х вместе с Кох (ВюКай, 2хбуфер) использовали для ПЦР реакции. Общий объем реакции, включая 5мкл модифицированной матричной ДНК, составлял 25 мкл. Прибор АВ1 7900НТ 8Ό8 включали за 10 мин до использования, позволяя нагревательной крышке достичь 105°С. Использовали следующий температурный профиль: стадия 1: 50°С в течение 2 мин, стадия 2: 95°С в течение 10 мин, стадия 3: 95°С в течение 15 с, 62°С в течение 1 мин (=плато-сбор данных) по 45 повторов.

- 25 017879

Плазмидный материал, используемый в качестве калибровочной кривой, получали следующим образом: промоторную последовательность, как определено праймерами, амплифицируют с помощью ПЦР и клонируют (используя подходящую выделенную и бисульфит-модифицированную ДНК клеточной линии). Последовательность проверяли путем секвенирования и сравнения с опубликованной промоторной последовательностью.

Калибровочную кривую (2х10⁶ - 20 копий) включали для определения числа копий неизвестных образцов путем интерполяции их значений С! к калибровочной кривой. В качестве эталонного гена в анализе использовали β-актин.

Пример 2. Анализы МАОЕ-А3 и конструирование праймеров.

Праймеры, используемые для определения неметилированного МАОЕ-АЗ, как описано в Цш е! а1.: СНшса1 Вюсйет18йу 39 (2006), 259-2; 1апд е! а1.: Сапсег Векеагсй 61 (2001), 7959-7963 и РигЩа и е! а1.: Сапсег 8с1 95 (2004), 962-968, синтезировали и представили в табл. 1 в дополнение к новым последовательностям праймеров.

Конструирование ш кШсо прямых (Р) и обратных (В) праймеров для определения неметилированной или, альтернативно, метилированной формы Маде А3 осуществляли с использованием программного обеспечения Рптег3, адаптированного к требованиям М8Р (й!!р://Гоккег.’№1.тй.еби/рптег3/три!.й!т). Условия были следующими: размер ампликона: 60-120 н.; размер праймера: 18-27 н.; температура плавления: 55-65°С; максимальная 3' самокомплементарность = 0; Окно 200 п.о. около Т88 (точка инициации транскрипции) (число для возврата = 2000).

и_праймеры конструировали для определения неметилированного МАОЕ-А3, тогда как М_праймеры конструировали для определения метилированного МАОЕ-А3. В конце концов, праймеры А МАОЕ_А3 и МАОЕА3_ОО_1_и_Р, МАОЕА3_ОО_2_и_В, МАОЕА3_ОО_1_и_В_АМР, МАОЕА3_ОО_2_и_Р_АМР, МАОЕА3_ОО_1_М_Р, МАОЕА3_ОО_2_М_Р, МАОЕА3_ОО_1_М_В_АМР и МАОЕА3_ОО_2_М_В_АМР сохраняли для дальнейшего исследования. Локализация Ц-праймеров относительно точки инициации транскрипции (Т88) показана на фиг. 1 и фиг. 2. Праймеры расположены около точки инициации транскрипции.

Либо прямой, либо обратный праймер синтезировали для включения подходящей структуры стебель-петля или шпилька, несущей донорную и акцепторную группировку на 5'-конце, имеющей нуклеотидную последовательность: 5'-АОСОАТОСОТТСОАОСАТСОСЦ-3' (8ЕР Ш ХО: 1.)

Тестировали различные комбинации МАОЕА3 праймеров. В конце сохраняли 4 Ц-анализа и 2 Манализа для дальнейшей разработки. Выбранные комбинации праймеров для каждого анализа приведены в табл. 1.

Таблица 1. Праймерные и атрйДиог детекторные последовательности МАОЕА3

Название	Анализ Длина ампликона	5'-3' последовательности Модификации детектора: 5' ЕАМ и внутренний сШс1аЬсу1
МАСЕАЗ_СО_1_О_Е Прямой праймер	□ анализ (набор 2)	АТТТТТСТТТОСААТТТАСССТАС (ЗЕО Ю N0: 2)
МА6ЕАЗ_СО_1_Ц_К_АМР Обратный детектор	142 п.о.	АССбАТССОТТССАССАТСОСОССААСАТСАААСС АТСАСТСА (ЗЕО Ιϋ N0: 3)
МАСЕАЗ (30 2 ϋ Е АМР Прямой детектор	и анализ (набор 3)	АССОАТСССТТССАССАТСССиТССААТТТАОСОТ АСТАТТСТ (ЗЕО Ю N0: 6)
МАСЕАЗ_СО_2_и_К Обратный праймер	140 п.о.	СССТССАССААСАТСААА (ЗЕО Ю ΝΟ: 7)
МАСЕАЗ_гикитА_и_г_АМР Прямой детектор	и анализ (набор 7)	АОССАТСССТТСОАССАТСССиТТАССАТСТОАТС ТТАТТСАТТТСТ (ЗЕО Ю ΝΟ: 9)
мАСЕАЗ_гикитА_и_к Обратный праймер	110 п.о.	ССААСАТСАААССАТСАСТСА (ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 4)
МАСЕ А3_<21 и_и_Е_АМР Прямой детектор	ϋ анализ (набор 9)	АССОАТОССТТСеАОСАТСССиТСТТТССААТТТА ССОТАСТАТТОТ (ЗЕО Ю N0: 12)
ΜΑθΕΑ3_οιυ_υ_κ Обратный праймер	126 п.о.	ССАТСАСТСАТТАСТСААААСААА (ЗЕО Ю N0: 13)
АСТВ Е АМР		АСССАТССОТТССАССАТСОСиТАОССАСТАТАТА
Прямой детектор	Эталон	ССТТОСССААСТТ (ЗЕО Ю ΝΟ: 21, или ЗЕО Ю N0: 1 + ЗЕО Ю ΝΟ: 20)
АСТВ_К. Обратный праймер ‘	125 п.о.	ААСАСАСААТААСАААСАСАААТТСАС (ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 22)
МАСЕАЗ_СО 1_М_Г Прямой праймер	М анализ (набор 2)	АТТТТТСТТСССААТТТАСОСТАС (ЗЕО Ю ΝΟ: 14) '
МАСЕАЗ_СО_1_М_К_АМР Обратный детектор	142 п.о.	АССОАТСССТТССАССАТСССиСССАССТСАААСС 6ТСССТСС (ЗЕО Ю ΝΟ: 15)
МАСЕАЗ_СО_2__М_Е Прямой праймер	М анализ (набор 4)	С6СААТТТАСССТАСТАТССТ (ЗЕО Ю ΝΟ: 17)
МАСЕАЗ_СО_2_М_К_АМР Обратный детектор	140 п.о.	АССОАТСССТТССАОСАТСССиСССТССССССАСС ТСААА (ЗЕО 10 ΝΟ: 18)

Пример 3. Расчетная эффективность анализа.

- 26 017879

Расчетную эффективность (предел и специфичность определения) анализа демонстрировали с использованием реконструированных субстратов.

Предел определения

Для определения чувствительности МЗР для неметилированного паттерна, материал из положительной подтвержденной клеточной линии (ЬЫСаР и Сег1) последовательно разбавляли и смешивали с ДНК контрольной (отрицательной) клеточной линии (Όυ145). Делали разведения 1/10; 1/100 и 1/500 (см. табл. 2). Общее количество 750 нг ДНК (и ДНК + М ДНК), обрабатывали бисульфитом с использованием набора для метилирования ДНК ЕΖ от Ζуто ВезеагсЬ.

Таблица 2. Схема разведения клеточных смесей

и днк (нг) [ЬИСаР или <3ег1]	М ДНК (нг) [ОШ45]
750 нг	0 нг
75 нг	675 нг
7,5 нг	742,5 нг
1,5 нг	748,5 нг
0 нг	750 нг

Затем 2,4 мкл химически обработанной ДНК использовали в качестве матрицы для МЗР МАСЕА3 в режиме реального времени с использованием специфических праймеров для неметилированного СО 2 и анализа (смесь ДНК ЬЫСаР/Эи145) и неметилированного РигШа анализа (смесь ДНК Сег1/Ои145). Результаты представлены на фиг. 3.

Как можно видеть, нижний предел определения МАСЕА3 СО_2_и и МАСЕА3_Риги1а МЗР в режиме реального времени часто устанавливали на 1,5 нг (разведение 1/500), учитывая всю процедуру приготовления образца. Поскольку 10% образца используют для ПЦР реакции, конечная аналитическая чувствительность составляет 0,15 нг.

Аналитическая специфичность

Специфичность набора праймеров МАСЕА3 СО_1_и/СО_2_и/Риги1а_и и (_х)Ш_и подтверждали посредством МЗР с использованием универсальной Метилированной/Неметилированной ДНК СрСепотеТМ (СЬеткоп 1п1егпа11опа1, СА, иЗА; Кат.# 37821 и Кат.# 37822) и последующего анализа на агарозном геле. Кратко, МЗР атрИйиог в режиме реального времени осуществляли на циклере I (Вю-Ваф, используя следующий температурный профиль: стадия 1: 50°С в течение 2 мин, стадия 2: 95°С в течение 10 мин, стадия 3: 95°С в течение 15 с, 62°С в течение 1 мин (= плато-сбор данных) по 45 повторов. Поскольку высокая специфичность имеет важное значение для определения на основе АтрИПиог, для стадии 3 использовали температурный градиент для того, чтобы выбрать наилучшую температуру отжига (57°С, 58,1°С, 60,3°С и 61,8°С).

Все полученные ПЦР-продукты проверяли на 3%-ном агарозном геле. Никакой полосы не обнаружили, когда универсальную метилированную ДНК СрСепотеТМ использовали в качестве матричной ДНК (тестировали при 57°С), что подтверждает специфичность для неметилированной ДНК.

Кроме того, специфичность МАСЕА3 анализов исследовали среди других членов генов семейства МАСЕ-А с использованием выравнивания последовательностей. Количество несовпадений в наборе праймеров МАСЕ-А3 СО_1_и/СО_2_и/Риги1а_и и (_х)Ш_и относительно последовательностей МАСЕА2 и МАСЕ-А12 (конвертированные последовательности) представлены в табл. 3. Оказалось, что исследуемые и-праймеры специфичны для МАСЕ-А3 и/МАСЕ-А6 и.

Таблица 3. Выравнивание последовательностей

- 27 017879

Клонирование регуляторных последовательностей МА6Е-А3 и оценка калибровочной кривой

Регуляторную последовательность МЛСЕ-А3 и ДНК из 364 п.о. клонировали с использованием фланкирующих праймеров, как показано в табл. 4.

Таблица 4. Фланкирующие праймеры, используемые для получения МЛСЕЛ3 плазмидного материала

Фланкирующие праймеры	Название мишени или гена	Смысловой (8), Антисмысловой (А)	Последовательность 5-3’
МА6ЕАЗ_ГЬ_1__8	МАСЕАЗ		АТТТТСА6ССАТСАТССАС {ЗЕ<2 ΙΟ ΝΟ: 23)
МАСЕАЗ_ЕЕ_1_А5	МАСЕАЗ	А	СТААААТААААССССССТА (ЗЕ<2 Ю ΝΟ: 24)

Этот клонированный материал использовали в качестве материала для построения калибровочной кривой для М8Р в режиме реального времени. Воспроизводимость сначала подтверждали применением 2 пластин 6 калибровочных кривых (2х10⁶-2х10¹ копий) (2 разных оператора, 3 ПЦР смеси/оператор/ пластина). Наклон, эффективность ПЦР и значения К² контролировали и получили приемлемые результаты.

Расчетная калибровочная кривая

Последовательное разведение плазмидного материала МЛСЕЛ3 (2х10⁶-2х10¹ копий/5 мкл) наносили в двух повторностях с использованием специфического праймера и ЛтрИПиог детекторной последовательности, указанной в Таблице 1, с соответствующим оптимизированным температурным профилем: стадия 1: 50°С в течение 2 мин, стадия 2: 95°С в течение 10 мин, стадия 3: 95°С в течение 15 с, 59°С в течение 30 с, 59°С в течение 30 с (= плато-сбор данных) по 45 повторов. Результаты получали с использованием программного обеспечения 8Ώ8 2.2 (ЛррИеб Вюзуз1етз) и представляли в виде значений С1 (число циклов, при которых кривые амплификации пересекают пороговое значение, установленное автоматически программным обеспечением).

Параметры калибровочной кривой представлены в табл. 5.

Т аблица 5. Обобщение результатов о наклоне кривых и эффективностей ПЦР МЛСЕЛ3

Название	Наклон	К²	Эффективность
МА6ЕАЗ_и набор 2 калибровочная кривая (плазмида)	3,6736	0,9999	87,2%
МАСЕАЗ_и набор 3 калибровочная кривая (плазмида)	3,6994	0,9998	86,3%
МАСЗЕАЗ_и набор 7 калибровочная	3,6108	0,9994	89,2%

кривая (плазмида)
МАСЕАЗ_и набор 9 калибровочная кривая (плазмида)	3,4885	0,9988	93,5%
МАСЕАЗ_М набор 2 калибровочная кривая (плазмида)	3,8601	0,9997	81,6%
МАСЕАЗ_М набор 4 калибровочная кривая (плазмида)	3,6701	0,9997	87,3%

Пример 4. Эффективность анализа на материале из клеточной линии.

Статус метилирования МЛСЕЛ3 исследовали на 19 клеточных линий. Наиболее метилированные и неметилированные клеточные линии для МЛСЕЛ3 и и М анализа, соответственно, показаны ниже.

Таблица 6. Клеточные линии, прошедшие через МЛСЕЛ3 и анализы

	β-Актин	Набор праймеров 11_2	Набор праймеров 1)_3	Набор праймеров
Клеточные	Οί:	копии:	Οί:	копии:	соотн-я:	С1:	копии:	соотн-я:	СС	копии:
линии:
Сег! (108216)	29,28	2086	29,57	1403	673	29,73	1753	841	26,97	2431
(108217)	28,09	4484	35,93	26	6	ΙΙΝϋ			34,41	16
СШ9609 (108218)	27,58	6192	32,47	225	36	34,98	73	12	29,80	358
1 ЫСаР	28,82	2814	28,54	2684	954	28,64	3364	1195	25,88	5085
Ои145	29,07	2393	>40			υΝϋ			>40
ΗΙ.60	28,29	3940	39,89	2,10	0,53	>40			>40

- 28 017879

Таблица 7. Клеточные линии, прошедшие через МАОЕАЗ М анализы

	β-Актин	Набор прайме!	эов М 2	Набор прайме!	эов М 4
Клеточные линии:	С1:	копии:	Οί:	копии:	соотн-я:	С1:	копии:	соотн-я:
СеН (108216)	29,28	2086	>40			>40
Зкк (108217)	28,09	4484	29,09	1388	309	27,54	2100	468
СКЮ609 (108218)	27,58	6192	27,3	3363	543	26,89	3200	517
ИМСаР	28,82	2814	>40			>40
Эи145	29,07	2393	29,72	945	395	28,96	839	351
НЬ60	28,29	3940	28,97	1492	379	27,91	1657	421

Пример 5. Внутрилабораторная погрешность.

Внутрилабораторная погрешность тестировали путем многократного осуществления одного и того же анализа для неметилированного и метилированного варианта промоторной последовательности МЛОЕЛЗ. Различные числа полностью модифицированных промоторных ДНК молекул МЛОЕЛЗ и и МЛОЕЛЗ М (материал для калибровочной кривой) измеряли многократно. Кроме того, операторный множитель тестировали путем повторного осуществления анализа в 2 разных дня 2 разными квалифицированными лаборантами (операторы А и В) (З различных разведения для калибровочной кривой в двух повторностях применяли на оператора в день). Таблицы 8 и 9 обощают эксперименты, проведенные для тестирования внутрилабораторной погрешности ОО_1 и ОО_2 и и М МАОЕАЗ анализа. Было показано, что стандартные отклонения всех результатов, относящиеся к одинаковым количествам молекул, варьируют от 0,11 до 1,29. Обобщенная информация обо всех коэффициентах корреляции (разные операторы и дни) представлена в табл. 9, среднее В² варьирует от 0,9959 до 0,9997).

Таблица 8. Анализы, проведенные для тестирования внутрилабораторной погрешности (оператор А и В в 2 разных дня): колонка 1: число молекул (1од), следующие колонки: среднее значений С1 и стандартное отклонение для каждого МАОЕАЗ анализа

1_од копии	семи Среднее всех значений С1 (5ϋ)	со_2_и Среднее всех значений С1 (80)	Риги1а Среднее всех значений С1 (80)	6О_1_М Среднее всех значений С1 (8ϋ)	6О_2_М Среднее всех значений С1 (5ϋ)
6,30	17,69 (0,27)	19,31 (0,33)	17,23 (0,84)	17,78(0,47)	17,73(0,12)
5,30	21,41 (0,23)	22,98 (0,37)	20,70 (0,87)	21,55 (0,44)	21,32(0,11)
4,30	25,00 (0,27)	26,64 (0,39)	24,30 (0,86)	25,36 (0,46)	24,90(0,11)
3,30	28,70 (0,37)	30,34 (0,68)	27,85 (0,78)	29,21 (0,36)	28,51 (0,14)
2,30	32,77(1,28)	34,06 (0,46)	31,42(0,85)	33,26 (0,52)	32,10(0,38)
1,30	36,24(1,16)	37,86(1,29)	34,97 (1,20)	37,23(1,20)	35,75(1,25)
	К²= 0,9997	Р²= 1,000	Р²= 1,000	К²= 0,9998	К²= 1,000

Таблица 9. Коэффициенты корреляции, найденные для каждой проанализированной серии разведений

день	оператор	точки	К²ео 1 и	К² 60 2 и	В²Риги1а	К² 60 1 м	К² 6О 2 М
1	А	6	0,9993	0,9974	0,9999	0,9972	0,9996
1	А	6	0,9993	0,9998	0,9993	0,9991	0,9992
1	А	6	0,9997	0,9969	0,9992	0,9988	0,9994
1	В	6	0,9997	0,9989	0,9999	0,9996	0,9999
1	В	6	0,9996	0,9971.	0,9998	0,9986	0,9996
1	В	6	0,9983	0,9987	0,9999	0,9998	0,9959
2	А	6	0,9950	0,9996	0,9997	0,9989	0,9912
2	А	6	0,9988	0,9966	0,9998	0,9990	0,9994
2	А	6	0,9997	0,9957	0,9996	0,9970	0,9997
2	В	6	0,9995	0,9994	0,9999	0,9976	0,9980
2	В	6	0,9975	0,9997	0,9998	0,9998	0,9999
2	В	6	0,9648 Среднее 0,9959	1,0000 Среднее 0,9983	0,9992 Среднее 0,9997	0,9976 Среднее 0,9986	0,9999 Среднее 0,9985

Пример 6. Интерференция меланина.

Ранее была показана низкая эффективность ПЦР образцов, содержащих меланин. Ескйаг! и др. (2000) обнаружили, что как РНК-, так и кДНК-препараты, полученные из меланоцитов, содержат ингибитор ОТ-ПЦР, который очищается вместе с нуклеиновыми кислотами. Исследование предполагаемого ингибитора меланина обнаружило, что он обратимо связывается с термостабильной ДНК-полимеразой и ингибирует ее активность. Перед обработкой образцов меланомы посредством МАОЕАЗ и ашрййиог анализов, исследовали потенциал ингибирования меланином.

Синтетический меланин готовили, как описано у Ескйаг! и др. Вкратце, меланин (81ОМА М86З1) растворяли в дистиллированной воде в концентрации 2 мг/мл, интенсивно перемешивали и подвергали ультразвуковой обработке в водяной бане при комнатной температуре в течение 10 мин. Нерастворенный меланин удаляли посредством центрифугирования при 9000 д. Потенциал эффекта ингибирования

- 29 017879 тестировали путем добавления меланина на различных стадиях реакционного процесса:

1) Перед экстракцией: 1 мкг и 5 мкг приготовленного меланина добавляли к 250000 клеток ^NСаΡ и 250000 клеток МСЕ7.

2) После экстракции: 1 мкг и 5 мкг приготовленного меланина добавляли к 1 мкг ДНК ^NСар и МСЕ7.

3) После обработки бисульфитом: 1 мкг и 5 мкг приготовленного меланина непосредственно метили в ПЦР реакции. Бисульфитные элюирующие объемы подбирали таким образом, чтобы иметь либо постоянную концентрацию матрицы (аннотированную как 'а', например, ΕΝΕτιΡ а) или постоянное количество матрицы в ПЦР реакции (аннотированное как 'Ь', например, ΕΝΕτιΡ Ь).

Эти меланинсодержащие образцы ^NСаΡ и МСЕ7 одновременно обрабатывали с соответствующими немеченными образцами меланина.

Далее образцы обрабатывали с использованием набора для очистки ДНК ΡϋΒΕΘΕΝΕ® и набора для метилирования ДНК ΕΖ. Химически модифицированную ДНК использовали в качестве вводимого материала для МА6ЕА3 и, Θδΐ-Ρί М и АСТВ М8Р в режиме реального времени.

Установленные числа копий промотора тестируемого гена и АСТВ эталонного гена рассчитывали и сравнивали для каждого условия.

Результаты представлены на фиг. 9. Никакого существенного ингибирующего эффекта в отношении ПЦР не обнаружено при добавлении меланина до или после экстракции ДНК. Меланин продемонстрировал четкое ингибирование только при непосредственном добавлении в ПЦР реакцию. В отличие от ОТ-ПЦР, образцы меланомы с высоким содержанием меланина можно проводить через М8Р в режиме реального времени без риска ингибирования ПЦР.

Пример 7. Статус метилирования МАСЕ-А3 в образцах меланомы/легких и соответствие с экспрессией РНК.

Материалы и способы Клинические образцы

Хирургические образцы от пациентов с меланомой и раком легких обеспечивали с помощью ОЖВю: образцы геномной ДНК (гДНК), биопсийный материал в растворе ΒNΛ 1а1ег® и соответствующую ткань, фиксированную формалином и заключенную в парафин (ЕЕРЕ), классифицировали как МА6ЕА3 положительные или МА6ЕА3 отрицательные, основываясь на результатах экспрессии РНК О8КВю. Обзор представленного набора образцов подробно изложен в табл. 10.

Таблица10. Коллекция клинических образцов

Диагностическая группа	Тип образца	Число образцов	Классификация экспрессии РНК МА6ЕАЗ по ОТ-ПЦР
Меланомы	гДНК	41	24 положительных
17 отрицательных
№СЮ	ткань в ΡΝΑ 1а1ег®	61	26 положительных
35 отрицательных
N8010	ЕРРЕ	52	26 положительных*
2 6 отрицательных*

* классификация сделана на основе соответствующей ткани в ΒNΛ 1а1е®г

Клеточные линии

Клеточные линии включали в каждый раунд в качестве положительного и отрицательного контролен. Перед использованием М8Р анализа ашрБйиог в режиме реального времени на клинических образцах, чувствительность и специфичность анализа подтверждали на материале клеточных линий. Наиболее метилированные и неметилированные клеточные линии в отношении МА6ЕА3 представлены в табл. 11. Сег1, 81ац и СВБ9609 получали из О8КВю, клеточные линии ^NСаΡ и Όυ145 получены из Американской коллекции типовых культур.

Таблица 11. Контрольные клеточные линии в отношении МА6ЕА3

	Статус экспрессии РНК ΜΑΘΕΑ3	Статус метилирования МАСЕАЗ
СеП	Положительный	неметилированный
	Отрицательный	метилированный
СКЬ9609	Отрицательный	метилированный
ЬЫСаР	Не тестировали	неметилированный
О1Л45	Не тестировали	метилированный

- 30 017879

Выделение ДНК

Образцы, фиксированные формалином и заключенные в парафин, сначала подвергали депарафинизации в 750 мкл ксилола в течение 2 ч. После этого осуществляли вторую обработку ксилолом (400 мкл, ксилол в течение 2 ч.) Затем добавляли 250 мкл 70%-ного этанола перед центрифугированием при 13000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляли и образцы сушили на воздухе при комнатной температуре.

Образцы в КНА 1а1ег® разрезали с помощью лезвия бритвы на очень маленькие кусочки после удаления из КИА 1а(ег® раствора.

После этого ДНК экстрагировали с использованием классического способа экстракции фенолом/хлороформом и ресуспендировали в 50 мкл ЬоТЕ (3 мМ ТРИС, 0,2 мМ ЕЭТА, рН 8,0).

Количество ДНК определяли с использованием набора для количественного определения дцДНК Рюодгееп® (Мо1еси1аг РгоЬек, #Р7589) в соответствии с рекомендациями производителя. ЛДНК, предоставленный в наборе, использовали для построения калибровочной кривой. Данные собирали с использованием устройства для считывания планшетов Е1ио81аг Са1аху (ВМС ЬаЬ 1ес11по1од1е5, Сегтапу).

Модификация ДНК

1,5 мкг ДНК подвергали бисульфитной модификации с использованием набора для метилирования ДНК Е2 от 2уто Кекеагсй.

Вкратце, аликвоты по 45 мкл смешивали с 5 мкл М-буфера для разведения и инкубировали при 37°С в течение 15 мин при встряхивании 1100 об/мин. Затем добавляли 100 мкл разведенного реагента для конверсии СТ, и образцы инкубировали при 70°С в течение 3 ч, встряхивая при 1100 об/мин в темноте. После конверсии образцы дополнительно подвергали обессоливанию и десульфированию в соответствии с инструкциями производителя и элюировали в 25 мкл Трис-НС1 1 мМ рН 8,0. Модифицированную ДНК хранили при -80°С до дальнейшей обработки.

Амплификация ДНК

М8Р в режиме реального времени осуществляли на быстром ПЦР-циклере 7900НТ в режиме реального времени от АррНеб ВюууЧетх

Четыре МАСЕА3 гипометилированных образца, предназначенных для нацеливания на неметилированный вариант промоторной последовательности гена, тестировали на соответствие с предоставленными результатами по экспрессии РНК, которую измеряли в соответствии со способами, описанными в ^02007/147876, например, с использованием праймеров и зонда из табл. 2, праймеров, специфических в отношении экзона 3 МАСЕ-А3, и зонда 8ЕО ΙΌ N0: 3, 4 и 13. Также измеряли независимый эталонный ген В-актин (АСТВ). Праймерные и атрНЛиог детекторные последовательности представлены в табл. 1.

2,4 мкл образца модифицированной геномной ДНК добавляли к 12 мкл конечного объема ПЦР реакции, включающего: 6 мкл |Тас.|™ 8ирегш1х с Кох (ВюИаф 2хбуфер) и конечные концентрации праймера 100 нМ как для прямого праймера/детектора, так и для обратного праймера. Условия проведения циклов для каждой конструкции МАСЕА3 представляли собой 50°С в течение 2 мин; 95°С в течение 10 мин; затем 45 циклов 95°С в течение 15 с, 59°С в течение 30 с [62°С для АСТВ] и 59°С в течение 30 с [62°С для АСТВ] (= плато-сбор данных).

Результаты получали с использованием программного обеспечения 8Ό8 2.2.2 (АррНеб ВюууЧепъ), выражали в виде значений С! (число циклов, при которых кривые амплификации пересекают пороговое значение, установленное автоматически программным обеспечением), и затем используют для расчета числа копий на основании линейной регрессии значений, нанесенных на калибровочную кривую из 20-2 х 10^л6 эквивалентов копий гена, с использованием плазмидной ДНК или очищенных ПЦР-продуктов, содержащих интересующую бисульфит-модифицированную последовательность. Для получения результата теста вычисляли соотношение между МАСЕА3 и АСТВ. Для интерпретации данных определяли клинический порог отсечения (порог) на основе неслепых (ип-ЬНпйеф данных экспрессии РНК.

Образцы классифицировали как метилированные, неметилированные или недостоверные на основании древа решений, представленного на фиг. 5. Клеточные линии включали в каждый эксперимент в качестве положительных и отрицательных контролей и вводили в процедуру на стадии экстракции ДНК.

Эксперимент считался достоверным при соблюдении следующих критериев: а) эффективность ПЦР обеих калибровочных кривых выше 80%; б) гЛ2 по меньшей мере 4 релевантныхх точек данных выше 0,990; в) Δ С! между повторностями менее 1,5; г) рутинно включенная №ГС не амплифицировалась; д) 10% из 1,5 мкг реакции конверсии из контроля положительной клеточной линии было детектируемым; и е) 10% из 1,5 мкг реакции конверсии из контроля отрицательной клеточной линии не определялось на калибровочной кривой.

Результаты

Соответствие между метилированием и экспрессией гена.

Меланомы.

Экспрессия и уровни метилирования МАСЕА3 сравнивали на одном и том же наборе образцов. В целом, 41 образец меланомы обработали с использованием ОТ-ПЦР и М8Р в режиме реального времени. Некоторые конструкции МАСЕА3 и атрППиог анализа тестировали для того, чтобы посмотреть, какая

- 31 017879 из них лучше всего соответствует данным экспрессии РНК, представленным ОБК. Клинический порог отсечения устанавливали таким образом, чтобы иметь максимальное соответствие и минимум ложных положительных образцов (см. табл. 12). Кривые К0С для статуса метилирования МАОЕА3 в этих образцах представлены на фиг. 6. Среди 17 отрицательных образцов, 9 были положительными для других членов семейства МАОЕ-А; О0_2_и и Еиги1а и анализ правильно классифицировал эти 9 образцов (специфичность 100%).

Взятые вместе, эти данные показали, что МАОЕА3_О0_2_и анализ показал лучшие результаты с 92,7% соответствием и 100% специфичностью.

Таблица 12. Соответствие данных в образцах меланомы

	МАСЕАЗ СО 1 и	МАСЕАЗ- СО 2 и	МАСЕАЗ Еиги(а и	МАСЕАЗ О\|и и
Порог отсечения	315	330	946	434
Правильно классифицируемые для МАСЕАЗ отрицательных (С5К-» 17)	13	17	17	16
Правильно классифицируемые для МАСЕАЗ положительных (С5К-^ 24)	22	21	16	20
Правильно классифицируемые образцы (общее количество образцов: 41)	35	38	33	36
Соответствие	85,4%	92,7%	80,5%	87,8%

Образцы из легких (биопсии и ЕЕРЕ).

Такую же схему эксперимента, как описано выше, тестировали на различных наборах образцов: 52 ЕЕРЕ образца из легких и 61 легочную ткань в К№А 1а1ег® подвергали скринингу посредством 4 МАОЕА3 и атрИПиог анализа и согласовывали с соответствующими данными на РНК.

Кривые К0С для статуса метилирования МАОЕА3 в этой легочной биопсии и ЕЕРЕ образцах представлены на фиг. 7 и 8, соответственно. Среди МАОЕА3 отрицательных образцов, 9 были положительными для других членов семейства МАОЕ-А; МАОЕА3 и анализы правильно классифицировали все 9 образцов (специфичность 100%). Полученные результаты подтвердили, что МАОЕА3_О0_2_и анализ является лучшим анализом с 90,4% соответствием в ЕЕРЕ и 91,8% соответствием в биопсиях, при сохранении 100% специфичности (табл. 13).

Таблица 13. Соответствие данных, полученных на образцах из легких (МАОЕА3_О0_2_и анализ)

Соответствие классифицируемые для

МАСЕАЗ положительных

Правильно

	МАСЕАЗ .60. 2 и
ЕЕРЕ	Биопсии
Порог отсечения	29	112
Правильно классифицируемые для МАСЕАЗ отрицательных (С8К)	26/26	33/35

Правильно классифицируемые

Общее количествообразцов

Пример 8. Тестирование образцов из легких посредством МАОЕА3 анализов.

ДНК из рака легких подвергали обработке посредством анализов МАОЕА3 (и и М версии анализа) и β-актина параллельно с контрольными клеточными линиями ^NСаР и Ώυ145. Некоторые конструкции МАОЕА3 υ атрИПиог анализа тестировали для того, чтобы посмотреть, какая из них лучше всего соответствует МАОЕА3 О0_2 υ анализу. Использовали экспериментальные условия, как описано в примере

7. Калибровочные кривые показали эффективность выше 80%. К² составлял выше 0,99. Значения порога отсечения устанавливали на уровне 29 для МАОЕА3 О0_2 υ анализа; 22 для МАОЕА3 О0_1 υ анализа; 229 для МАОЕА3 Еиги1а υ анализа; 87 для МАОЕА3 рщ анализа; 148 для МАОЕА3 О0_1 М анализа и 167 для МАОЕА3 О0_2 М анализа. Уровни метилирования МАОЕА3 сравнивали на одном и том же наборе образцов.

Результаты представлены в табл. 14 и 15. Для МАОЕА3 О0_2 υ анализа (порог отсечения = 29):

образца классифицированы как недостоверные, и эти образцы не включены в сравнение с другими υ и М анализами;

образцов классифицированы как неметилированные;

образцов классифицированы как метилированные.

- 32 017879

Четыре МАОЕА3 и анализа дали сходные результаты с 96% соответствием с МАОЕА3 00_2 и анализом для достоверных образцов. МАОЕА3 М анализы дали 71% и 75% соответствие с МАОЕА3 00_2 и анализом.

Таблица 14. Сводная таблица сравнения различных и анализов, показывающая соответствие, рассчитанное для и анализов по сравнению с 00_2 и анализом (в этой таблице представлены только достоверные образцы)

	МАОЕАЗ и набор 3 (60 2 и)	МАОЕАЗ и набор 2 (СОД_Ш	МАОЕаз и набор 7 (ЕигЩа II, повтор)	МАОЕАЗи набор 9 (Οϊιι Ц)
Метилированный (/15):	15	14	14	¹⁴
Неметилированный (/9):	9	9	9	9 ' .
Всего	24	23	23	²³
Соответствие:	100%	96%	96%	96% \|

Таблица 15. Сводная таблица сравнения различных М анализов, показывающая соответствие, рассчитанное для М анализов по сравнению с 00_2 и анализом (в этой таблице представлены только достоверные образцы)

	МАОЕАЗ и набор 3 (ОО 2 и)	МАОЕАЗ М набор 2 (ОО 1 М)	МАОЕАЗ М набор 4 (ОО 2 М)
Метилированный (/15):	15	11	13
Неметилированный (/9):	9	6	5
Всего	24	17	18
Соответствие:	100%	71%	75%

Настоящее изобретение не следует ограничивать рамками конкретных воплощений, описанных в данной заявке. Действительно, различные модификации изобретения, в дополнение к описанным в данной заявке, станут очевидными для специалиста в данной области техники из вышеизложенного описания и сопровождающих графических материалов. Предполагается, что такие модификации подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения. Кроме того, считается, что все воплощения, описанные в данной заявке, имеют широкое применение и могут быть объединены с любым или всеми другими соответствующими воплощениями, при необходимости.

В данной заявке приводятся различные публикации, описания которых включены посредством ссылки во всей их полноте.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Олигонуклеотид, праймер или зонд, состоящий по существу или состоящий из любой нуклеотидной последовательности из 81 :С) ΙΌ N0: 5, 6, 7, 2 или 3, где олигонуклеотид, праймер или зонд используют для определения статуса метилирования гена МАОЕ А3.
2. Олигонуклеотид, представляющий собой праймер или зонд по п.1, где указанный олигонуклеотид содержит или состоит по существу или состоит из следующих непрерывных последовательностей в направлении 5'-3':

(а) первая нуклеотидная последовательность приблизительно из 6-30 нуклеотидов, где нуклеотид в указанной первой нуклеотидной последовательности мечен первой группировкой, выбранной из донорной группировки и акцепторной группировки из молекулярной пары для переноса энергии, где донорная группировка испускает флуоресценцию при одной или более конкретных длинах волн при возбуждении, а акцепторная группировка поглощает и/или гасит указанную флуоресценцию, испускаемую указанной донорной группировкой;

(б) вторая одноцепочечная нуклеотидная последовательность, содержащая, состоящая по существу или состоящая приблизительно из 3-20 нуклеотидов;

(в) третья нуклеотидная последовательность, содержащая, состоящая по существу или состоящая приблизительно из 6-30 нуклеотидов, где нуклеотид в указанной третьей нуклеотидной последовательности мечен второй группировкой, выбранной из указанной донорной группировки и указанной акцепторной группировки, и указанная вторая группировка является членом указанной группы, которая не метит указанную первую нуклеотидную последовательность, где указанная третья нуклеотидная последовательность обратно комплементарна указанной первой нуклеотидной последовательности, так что между указанной первой нуклеотидной последовательностью и указанной третьей нуклеотидной последовательностью может образовываться дуплекс, такой, что указанная первая группировка и вторая группировка находятся в такой близости, что, когда донорная группировка возбуждается и испускает флуоресценцию, акцепторная группировка поглощает и гасит указанную флуоресценцию, испускаемую указанной донорной группировкой; и

- 33 017879 (г) на 3'-конце праймера, четвертая одноцепочечная нуклеотидная последовательность, содержащая, состоящая по существу или состоящая приблизительно из 18-40 нуклеотидов, которая на своем 3'конце содержит или состоит по существу или состоит из любой последовательности из БЕС ΙΌ N0: 5, 7, 2 или 3 (и способна начать синтез с помощью полимеразы нуклеиновой кислоты нуклеотидной последовательности, комплементарной цепи нуклеиновой кислоты, содержащей участок неметилированной ДНК гена МАСЕ А3);

где в случае, когда указанный дуплекс не образуется, указанная первая группировка и указанная вторая группировка разделены расстоянием, которое препятствует переносу молекулярной энергии между указанной первой и второй группировкой.
3. Олигонуклеотид, праймер или зонд по п.1 или 2, дополнительно содержащие структуру стебельпетля БЕС ΙΌ N0: 1.
4. Пара праймеров, содержащая праймер по любому из пп.1-3.
5. Пара праймеров, содержащая праймеры, состоящие по существу или состоящие из нуклеотидной последовательности БЕС ΙΌ N0: 6 и 7 или БЕС ΙΌ N0: 2 и 3.
6. Набор для определения статуса метилирования гена МАСЕ А3, включающий по меньшей мере один олигонуклеотид, праймер или зонд, как определено в любом из пп.1-3, или пару праймеров, как определено в п.4 или 5.
7. Способ определения присутствия и/или количества неметилированного гена МАСЕ-А3 в ДНКсодержащем образце, включающий:

(а) приведение ДНК-содержащего образца в контакт с реагентом или обработку ДНК-содержащего образца реагентом, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с образованием детектируемых модифицированных остатков, но который не модифицирует метилированные остатки цитозина;

(б) амплификацию по меньшей мере участка интересующего неметилированного гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, в которой по меньшей мере один праймер сконструирован таким образом, чтобы связываться только с последовательностью неметилированной ДНК после обработки реагентом, где по меньшей мере один праймер в паре праймеров состоит по существу или состоит из любой нуклеотидной последовательности из БЕС ΙΌ N0: 5, 6, 7, 2 или 3.
8. Способ диагностики рака или предрасположенности к раку, включающий определение статуса метилирования гена МАСЕ-А3 в образце с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, как определено в любом из пп.1-3, пары праймеров, как определено в любом из пп.4, 5, набора по п.6 или способа по п.7, где присутствие неметилированного МАСЕ-А3 в образце является признаком рака или предрасположенности к раку.
9. Способ идентификации и/или отбора пациента, подходящего для лечения иммунотерапевтическим МАСЕ-А3, включающий определение статуса метилирования гена МАСЕ-А3 в образце от пациента с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, как определено в любом из пп.1-3, пары праймеров, как определено в любом из пп.4, 5, набора по п.6 или способа по п.7, где в случае, если ген МАСЕ-А3 не метилирован, субъекта идентифицируют и/или отбирают для лечения иммунотерапевтическим МАСЕ-А3.
10. Способ прогнозирования вероятности успешного лечения рака, включающий определение статуса метилирования гена МАСЕ-А3 в образце от пациента с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, как определено в любом из пп.1-3, пары праймеров, как определено в любом из пп.4, 5, набора по п.6 или способа по п.7, где в случае, если ген МАСЕ-А3 не метилирован, вероятность успешного лечения иммунотерапевтическим МАСЕ-А3 выше, чем в случае метилированного гена.
11. Способ выбора подходящей схемы лечения рака, включающий определение статуса метилирования гена МАСЕ-А3 в образце от пациента с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, как определено в любом из пп.1-3, пары праймеров, как определено в любом из пп.4, 5, набора по п.6 или способа по п.7, где в случае неметилированного гена МАСЕ-А3 для лечения выбирают иммунотерапевтическое средство.
12. Применение композиции, содержащей МАСЕ-А3, в изготовлении лекарственного средства для лечения пациента, страдающего от опухоли или склонного к рецидиву МАСЕ-А3-экспрессирующей опухоли, который был выбран для лечения на основании измерения статуса метилирования гена МАСЕА3, с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, как определено в любом из пп.1-3, пары праймеров, как определено в любом из пп.4, 5, набора по п.6 или способа по п.7.
13. Применение по п.12, где композиция, содержащая МАСЕ-А3, содержит полноразмерный МАСЕ-А3, по существу полноразмерный МАСЕ-А3 или фрагменты МАСЕ-А3, например пептиды МАСЕ-А3.

14. Применение по п.13, где пептиды МАСЕ-А3 выбраны из

- 34 017879

8ΕΩ Ю ΝΟ Пептидная последовательность 8ΕΩ Ю ΝΟ: 27 ΕΙ_νν6ΡΚΑΙ_ν 8ΕΩ Ю ΝΟ: 28 ЕХ/ОРЮНЬУ 8ΕΩ Ю ΝΟ: 29 ΜΕνΩΡΙΟΗίΥ 8ΕΩ Ю ΝΟ: 30 УНЕШ-КУКА 8ΕΩ Ю ΝΟ: 31 ЬУНРШКУК 8ΕΩ Ю N0: 32 Ι_ΚΥΚΑΡΕΡνΤ 8ΕΩ Ю N0: 33 Α0ΥΕΓΙΑ/ν0ΡΡΑΙ_νΕΤ8 8ΕΩ Ю N0: 34 ΤΩΗΕνΩΕΝΥΙ_ΕΥ

15. Применение по п.13, где МАОЕ-А3 представляет собой полноразмерный МАОЕ-А3 или по существу полноразмерный фрагмент МАОЕ3, в котором от 1 до 10 аминокислот делетированы из Ν-конца и/или С-конца белка МАОЕ-А3.
16. Применение по п.13, где МАОЕ-А3 представляет собой аминокислоты 3-314 МАОЕ3 (всего 312 аминокислот).
17. Применение по п.13, где белок, фрагмент или пептид МАОЕ-А3 связан с белком-партнером для слияния.
18. Применение по п.17, где белок-партнер для слияния представляет собой белок Ώ, поверхностный белок грамотрицательной бактерии НаеторЫ1и8 тПиеп/а В или их производное.
19. Применение по п.18, где производное белка I) содержит первую 1/3 белка Ώ, приблизительно первую 1/3 белка Ώ, первые 100-110 Ν-концевых остатков белка Ώ, первые 109 Ν-концевых остатков белка Ώ.
20. Применение по п.18 или 19, где на Ν-конце белка Ώ-партнера для слияния дополнительно включена секретирующая или сигнальная последовательность.
21. Применение по любому из пп.15-20, где МАОЕ-А3 представляет собой слитый белок, содержащий сигнальную последовательность белка Ώ; аминокислоты 1-109 белка Ώ; 312 аминокислот из белка МАОЕ-А3 (аминокислоты 3-314); спейсер и полигистидиновый хвост.
22. Применение по п.17, где белок-партнер для слияния представляет собой Ьу1А или его производное, содержащее или состоящее из повторяющегося участка молекулы Ьу1А, обнаруженной в С-концевой области, начинающейся с остатка 178, или содержащей остатки 188-305; или где белок-партнер для слияния представляет собой N81 (гемагглютинин) или его производное, содержащее 81 Ν-концевую аминокислоту из Ν81.
23. Применение по любому из пп.12-22, где МАОЕ-А3 содержит дериватизированный свободный тиол.
24. Применение по любому из пп.12-23, где композиция содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, фрагмент или пептид МАОЕ-А3 или его слитый белок, и где молекула нуклеиновой кислоты возможно представлена в экспрессирующем векторе.
25. Применение по любому из пп.12-24, где МАОЕ-А3-содержащая композиция дополнительно содержит один или более чем один адъювант, иммуностимулирующий цитокин и хемокин.