CN109540856B - 一种基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂，包括A、B溶液，A溶液是包含三种发夹型分子信标HP1、HP2、HP3的Tris溶液，HP1的3’端标记Cy3荧光供体基团、HP2的3’端标记Alexa488荧光供体基团、HP3的3’端标记Alexa405荧光供体基团；B溶液是包含三种发夹型分子信标HP4、HP5、HP6的Tris溶液，HP4的5’端标记Cy5荧光受体基团、HP5的5’端标记Cy3荧光受体基团、HP6的5’端标记Alexa488荧光受体基团。本发明试剂通过观察受体荧光基团荧光信号增强来实现对miRNAs靶序列的检测分析，进而实现对不同亚型乳腺癌细胞的同时准确检测。

Description

一种基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂。

背景技术

乳腺癌已经成为一个不容忽视的女性健康杀手之一,由于其具有很强的异质性，2000年Perou首先提出了乳腺癌分子分类的概念，后经过众多学者研究人员的逐步完善将其分为正常细胞样型(normal-like subtype)、基底细胞样型(basal-like subtype)、腔面型(luminal subtype)、人表皮生长因子受体2过表达型(Her2++)。这是一种通过检测细胞表面受体(主要为雌激素受体ER、孕激素受体PgR、人表皮生长因子受体2Her2)表达情况来判断乳腺癌分子分型的方法，虽然这一方法已经用于临床上乳腺癌分型的诊断但其仍然是属于一种细胞层面的检测手段，存在着灵敏度不足，伪阳性的问题，从而可能导致误诊而使患者错过最佳治疗时间。

因此通过一种“媒介”将几种受体表达情况与临床上乳腺癌分子分型联系起来，实现几种不同亚型乳腺癌同时检测，从而为个体化治疗提供依据是一件颇有意义的事情。

microRNAs(miRNAs)是一端长度为19-25nt的内源性非编码基因序列，它参与到动植物体的生长发育过程中，并参与细胞增殖、分化、凋亡、死亡进程，人类大约有30％的基因受miRNAs调控，而且miRNAs异常表达与人类很多疾病如癌症、阿尔兹海默症、糖尿病等有关，所以可以选择miRNAs作为靶分子从基因层面进一步检测受体表达情况不同的乳腺癌亚型细胞。因此检测miRNAs有助于深入了解其作用机制并实现对疾病的早期诊断，治疗以及预后等，而且miRNAs的原位检测对于实时地了解疾病发展过程尤为重要。

目前传统的检测方法Northern Blot印迹法，微阵列技术，以及实时定量聚合酶链式反应都只能在体外检测miRNAs，而无法实现对活细胞内miRNAs的原位检测。NorthernBlot印迹法是早期检测miRNAs的标准方法，虽然此法允许探针的部分不匹配性，且杂交过后的膜可以重复使用但是实验过程中需要用到大量有毒试剂，处理过程繁琐复杂，需用待测样品量多导致灵敏度不高，特异性不足导致实验结果假阳性较高；微阵列技术虽然可以同时多组分的分析待测物但是该法因为特异性不足会产生交叉杂交现象而且重复性低，仪器和芯片制作费用高从而使其应用受到限制；实时定量聚合酶链式反应技术是一类实用性较广泛的方法，反应过程不产热，准确性好，灵敏度高，但实验过程需要分布操作和精确的循环温度控制，且引物设计复杂从而限制了其应用范围。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂，可通过对miRNAs靶序列的检测分析观察受体荧光基团荧光信号的增强来实现不同亚型乳腺癌细胞的同时准确检测。

本发明的试剂选择在不同亚型乳腺癌细胞中表达程度不同的miR-let-7a、miR-141、miR-21作为检测靶目标，靶目标引发试剂反应后可通过各受体基团荧光信号的增强情况来实现不同亚型乳腺癌细胞的同时准确检测，本发明的试剂可用于鉴别不同亚型乳腺癌细胞，在不同分型乳腺癌的临床诊断中具有潜在应用价值。通过该试剂进行检测具有成本低、操作简单、准确性好、灵敏度高、安全可靠等优点。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂，包括A溶液和B溶液，所述A溶液是包含三种发夹型分子信标DNA链HP1、HP2、HP3的三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris溶液)，HP1的3’端标记Cy3荧光供体基团、HP2的3’端标记Alexa488荧光供体基团、HP3的3’端标记Alexa405荧光供体基团；所述B溶液是包含三种发夹型分子信标DNA链HP4、HP5、HP6的Tris溶液，HP4的5’端标记Cy5荧光受体基团、HP5的5’端标记Cy3荧光受体基团、HP6的5’端标记Alexa488荧光受体基团。

其中，所述HP1是由15个核苷酸(nucleotide，nt)的环和12对碱基对(base-pair，bp)的茎部分组成，且茎部分有1对碱基错配，HP2是由5nt的环和17bp的茎部分组成，且茎部分有2对碱基错配，HP3是由15nt的环和12bp的茎部分组成，且茎部分有1对碱基错配。

其中，所述HP4由14nt的环和12bp的茎部分组成，且茎部分有2对碱基错配，HP5由8nt的环和15bp的茎部分组成，且茎部分有3对碱基错配，HP6是由14nt的环和12bp的茎部分组成，且茎部分有1对碱基错配。

作为优选，所述A溶液和B溶液中Tris的浓度为15-20mmol/L，pH为7.4，其中，20mmol/L Tris溶液由0.0285g MgCl₂和0.242g Tris溶于100ml去离子水中制得，15mmol/LTris溶液由0.0214g MgCl₂和0.1815g Tris溶于100ml去离子水中制得。

进一步地，所述A溶液和B溶液中分子信标浓度均为5-10μmol/L长期储存浓度，最优选的分子信标浓度均为10μmol/L长期储存浓度。

作为优选，所述A溶液和B溶液中分子信标所用到的碱基序列在合成的同时分别对其两端的三个碱基进行硫代磷酸酯键修饰，是为了维持结构稳定性进行的修饰。

其中，所述A溶液和B溶液在在不同靶序列引发下反应后会产生三种由多个HP1-HP4、HP2-HP5、HP3-HP6形成的多级发夹状DNA结构单元，它们满足荧光共振能量转移对供受体荧光基团距离的要求，从而使Cy3供体基团在543nm激发光源激发后能量转移到受体Cy5上，导致Cy5荧光基团在发射波长665nm处的红色荧光增强；Alexa488供体基团在488nm激发光源激发后能量转移到受体Cy3上，导致Cy3荧光基团在发射波长562nm处的黄色荧光增强；Alexa405供体基团在405nm激发光源激发后能量转移到受体Alexa488上，导致Alexa488荧光基团在发射波长519nm处的绿色荧光增强。

本发明所述的基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂中的分子信标HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6的碱基序列分别由SEQ ID NO.1-6所示。

本发明中A、B两种溶液中的分子信标和检测对象及对照试剂中分子信标和对照靶分子的碱基序列为：

SEQ ID NO.1：

HP1:5'-G*C*C*TCG T AC TAT ACA ACC TAC TAC CTC ATA GT C CGA*G*G*C-Cy3-3'

SEQ ID NO.2：

HP2:5'-G*C*C*TCGTTTGTGACAGACCATTTCTACCACAACCGA*G*G*C-Alexa488-3

SEQ ID NO.3：

HP3:5'-G*C*C*TCGCCAACATCAGTCTGATAAGCTTGTTGACGA*G*G*C-Alexa405-3'

SEQ ID NO.4：

HP4:5'-Cy5-A*G*G*TAG T AG GTT GGC CTC GGA CTA TA AAC CT C CTA*C*C*G-3'

SEQ ID NO.5：

HP5:5'-Cy3-T*A*G*AAATGGTCTGGCCTCGGTTGTGGAGACCCTTT*C*T*A-3'

SEQ ID NO.6：

HP6:5'-Alexa488-G*C*T*TATCAGACTGGCCTCGTCAACAAAGTCTAATA*A*G*C-3'

SEQ ID NO.7：

HP7:5'-G*C*C*TCG T CC TGA GTG TAT AAC AGA ACT TCA GGC CGA*G*G*C-Cy3-3'

SEQ ID NO.8：

HP8:5'-Cy5-G*T*T*CTG T TAT ACA GCC TCG G CCT GAA GTA TAC CAG*A*A*C-3'

SEQ ID NO.9：miR-let-7a:5'-TGAG GTA GTA GGT TGT ATA GTT-3'

SEQ ID NO.10：miR-141:5'-GGT AGA AAT GGT CTG TCA CAAT-3'

SEQ ID NO.11：miR-21:5'-TAG CTT ATC AGA CTG ATG TTGA-3'

SEQ ID NO.12：miR-let-7f:5'-TGAGGTAGTAGATTGTATAGTT-3'

SEQ ID NO.13：miR-let-7i:5'-TGAGGTAGTAGTTTGTGCTGTT-3'

SEQ ID NO.1-8序列中的星号表示对碱基进行硫代磷酸酯键修饰。

本发明中A溶液和B溶液单独存在时，其包含的分子信标会维持其发夹状稳定结构；

在A溶液中加入B溶液并且靶序列(如miR-let-7a，miR-141，miR-21)存在时，各靶序列的大部分碱基会与A溶液中相应的三种分子信标的茎部分杂交；

如选择检测miR-let-7a时的A和B溶液，有miR-let-7a存在的条件下，把B溶液加入A溶液后，miR-let-7a的大部分碱基会与A溶液中的HP1分子信标的茎部分a*杂交；HP1暴露的环部分b与HP4的茎部分c杂交；接着，HP4暴露出来的环部分d将与HP1的环部分b杂交；HP1暴露的茎部分a*与HP4的环部分d杂交；暴露出来的HP4的茎部分c与HP1的环部分b杂交，如此循环；其中，a*所指为分子信标HP1的茎部分，与其互补的茎部分为a，它在反应过程中没有参与碱基互补配对下的杂交，b为其环部分。c为分子信标HP4的茎部分，与其互补的茎部分为c*，它在反应过程中没有参与碱基互补配对下的杂交，d为其环部分。

结果，在miR-let-7a引发下，A、B溶液反应会产生由多个HP1-HP4形成的多级发夹状DNA结构单元，它满足FRET对供受体荧光基团距离的要求，从而使Cy3供体基团在543nm激发光源激发后能量转移到Cy5上，导致Cy5荧光基团在发射波长665nm处的红色荧光增强；

此时由于靶序列miR-141、miR-21不存在，所以B溶液加入后Alexa488供体基团能量未能转移到Cy3上，导致Cy3荧光基团在波长562nm处的荧光没有增强；Alexa405供体基团能量也未能转移到Alexa488上，导致Alexa488荧光基团在波长519nm处的荧光没有增强。

相反，如果三种目标均存在时，B溶液加入后会形成三种由多个HP1-HP4(miR-let-7a引发反应)、HP2-HP5(miR-141引发反应)、HP3-HP6(miR-21引发反应)形成的多级发夹状DNA结构单元，它们均满足FRET对供受体荧光基团距离的要求，从而使Cy3供体基团在543nm激发光源激发后能量转移到Cy5上，导致Cy5荧光基团在发射波长665nm处的红色荧光增强；Alexa488在488nm激发光源激发后能量转移到Cy3上，导致Cy3荧光基团在发射波长562nm处的黄色荧光增强；Alexa405供体基团在405nm激发光源激发后能量转移到Alexa488上，导致Alexa488荧光基团在发射波长519nm处的绿色荧光增强。通过以三种荧光受体增强情况作为可读信号来实现对三种待测物的检测从而鉴别出不同亚型癌细胞。

本发明使用该试剂具体检测不同亚型乳腺癌细胞中靶序列的步骤如下：

取所述分子信标浓度为10μmol/L的A溶液100μL、B溶液400μL，用20mmol/L Tris溶液稀释至1mL。此时，A溶液分子信标浓度均为1μmol/L工作前浓度、B溶液分子信标浓度均为4μmol/L工作前浓度；

取上述稀释后1μmol/L A溶液100μL，4μmol/L B溶液100μL，与含有800μL DMEM营养液的MDA-MB-231(基底样型)、MCF-7(腔面A型)、Sk-Br-3(Her2过表达型)(均为10⁵/mL)细胞共同孵育6h，此时A溶液中各分子信标浓度均为0.1μmol/L，B溶液中各分子信标浓度均为0.4μmol/L。然后以543nm、488nm、405nm作为激发光源，665nm、562nm、519nm作为接收波长进行激光共聚焦成像，因为不同亚型乳腺癌细胞表达靶分子情况不同，因而可以用不同颜色荧光强度来区分出不同亚型乳腺癌细胞。

在本发明中为了进一步提高检测准确性和灵敏度，采用一种基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂，该试剂会在靶分子引发下产生杂交链式反应，反应会产生多发夹的DNA结构单元，该结构单元满足荧光供受体间产生FRET现象的距离条件，从而使供体基团能量转移到受体上，导致受体荧光基团在发射波长处的荧光增强，以此作为可读信号来实现对靶序列的高效、准确、原位的选择性检测，也即实现对不同亚型乳腺细胞的检测。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明的不同亚型乳腺癌细胞检测试剂，选择与该疾病相关的miRNAs作为靶序列，引发荧光基团单标记的分子信标间形成多级发夹状DNA结构单元，从而产生多次FRET效应，使得不同最佳发射波长处受体荧光增强从而实现了对靶序列的高效、准确、原位的选择性检测，也即实现对不同亚型乳腺细胞的检测，并且进一步提高检测准确性和灵敏度。对辅助该疾病的临床检查、早期诊断、预后等具有潜在的应用价值。

本发明所采用的荧光基团单标记的分子信标克服了传统的分子信标双标记的缺点，降低了使用成本，且分子信标的使用提高了检测准确性。

本发明所采用的试剂不需要进行昂贵的转染试剂转染步骤，简化了操作，进一步降低使用成本，同时本发明的试剂具有良好的生物相容性，安全可靠。

附图说明

图1.为本发明中试剂检测靶序列miR-let-7a的荧光响应图；

图2.为本发明中试剂对不同亚型乳腺癌细胞的同时检测；

图3.为本发明中试剂检测不同类型靶序列的荧光响应图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例、对照例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂

A溶液和B溶液，A溶液包含三种发夹型分子信标DNA链HP1、HP2、HP3的Tris溶液，HP1的3’端标记Cy3荧光供体基团、HP2的3’端标记Alexa488荧光供体基团、HP3的3’端标记Alexa405荧光供体基团；B溶液包含三种发夹型分子信标DNA链HP4、HP5、HP6的Tris溶液，HP4的5’端标记Cy5荧光受体基团、HP5的5’端标记Cy3荧光受体基团、HP6的5’端标记Alexa488荧光受体基团。

HP1是由15个核苷酸(nucleotide，nt)的环和12对碱基对(base-pair，bp)的茎部分组成，且茎部分有1对碱基错配，HP2是由5nt的环和17bp的茎部分组成，且茎部分有2对碱基错配，HP3是由15nt的环和12bp的茎部分组成，且茎部分有1对碱基错配。

HP4由14nt的环和12bp的茎部分组成，且茎部分有2对碱基错配，HP5由8nt的环和15bp的茎部分组成，且茎部分有3对碱基错配，HP6是由14nt的环和12bp的茎部分组成，且茎部分有1对碱基错配。

分子信标HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6的碱基序列分别由SEQ ID NO.1-6所示。

A、B溶液中所用Tris的浓度为20mmol/L，pH为7.4，分子信标浓度均为10μmol/L长期储存浓度。

实施例2

取实施例1中各分子信标浓度均为10μmol/L的A溶液100μL、B溶液400μL，用20mmol/L Tris溶液稀释至1mL。此时，A溶液中各分子信标浓度均为1μmol/L工作前浓度、B溶液中各分子信标浓度均为4μmol/L工作前浓度。miR-let-7a溶于410μL 20mmol/L Tris溶液中，作为10μmol/L长期储存浓度；接着取50μL 10μmol/L miR-let-7a溶液溶于950μL20mmol/L Tris溶液中，作为0.5μmol/L工作前浓度。

取上述稀释后1μmol/L A溶液100μL，4μmol/L B溶液100μL，0.5μmol/LmiR-let-7a溶液20μL，一起加入含有20mmol/L Tris溶液(780μL)的总体积为1mL的石英皿中，此时A溶液中各分子信标最终工作浓度均为0.1μmol/L，B溶液中各分子信标最终工作浓度均为0.4μmol/L，miR-let-7a最终工作浓度为0.01μmol/L。

荧光实验中，在Cy3最佳激发波长543nm激发后，发现在Cy5发射波长665nm处的荧光信号增强(如图1)，结果说明HP1-HP4形成了多级发夹状DNA结构单元，且可以用于靶分子miR-let-7a的检测，同时图1中溶液B和目标miR-let-7a加入后665nm处的荧光增强3倍(由b、d线到e线)，说明具有较高的检测灵敏度。

实施例3

取实施例2中稀释后1μmol/L A溶液100μL，4μmol/L B溶液100μL，0.5μmol/L miR-let-7a溶液20μL，一起加入含有20mmol/L Tris溶液的总体积为1mL的石英皿中，此时A溶液中各分子信标最终工作浓度均为0.1μmol/L，B溶液中各分子信标最终工作浓度均为0.4μmol/L，miR-let-7a最终工作浓度为0.01μmol/L。

在Alexa488最佳激发波长488nm激发后，在Cy3发射波长562nm处的荧光信号增强，结果说明HP2-HP5形成了多级发夹状DNA结构单元，且可以用于靶分子miR-141的检测。

实施例4

取实施例2中稀释后1μmol/L A溶液100μL，4μmol/L B溶液100μL，0.5μmol/L miR-let-7a溶液20μL，一起加入含有20mmol/L Tris溶液的总体积为1mL的石英皿中，此时A溶液中各分子信标最终工作浓度均为0.1μmol/L，B溶液中各分子信标最终工作浓度均为0.4μmol/L，miR-let-7a最终工作浓度为0.01μmol/L。

在Alexa405最佳激发波长405nm激发后，在Alexa488发射波长519nm处的荧光信号增强，结果说明HP3-HP6形成了多级发夹状DNA结构单元，且可以用于靶分子miR-21的检测。

实施例5

取实施例2稀释后1μmol/L A溶液100μL，4μmol/L B溶液100μL，与各含有800μLDMEM营养液的MDA-MB-231(基底样型)、MCF-7(腔面A型)、Sk-Br-3(Her2过表达型)(均为10⁵/mL)细胞分别共同孵育6h，此时A溶液中各分子信标最终工作浓度均为0.1μmol/L，B溶液中各分子信标最终工作浓度均为0.4μmol/L。然后以405nm、488nm、543nm作为激发光源，519nm(绿色)、562nm(黄色)、665nm(红色)作为接收波长进行激光共聚焦成像，因为不同亚型乳腺癌细胞表达miR-let-7a、miR-141、miR-21情况不同，因而可以用荧光强度来区分出不同亚型乳腺癌细胞。如图2所示，在MDA-MB-231(基底样型)细胞中红色荧光最强，黄色荧光最弱；在MCF-7(腔面A型)细胞中绿色荧光最强，红色荧光最弱；在Sk-Br-3(Her2过表达型)细胞中黄色荧光最强，绿色荧光最弱。结果说明A、B溶液可以安全可靠的用于三种不同亚型乳腺癌细胞的同时检测。

实施例6

A、B溶液中所用Tris的浓度为15mmol/L，pH为7.4，分子信标浓度均为5μmol/L长期储存浓度。

取各分子信标浓度为5μmol/L的A溶液200μL、B溶液800μL，用15mmol/L Tris溶液稀释至1mL。此时，A溶液分子信标浓度为1μmol/L工作前浓度、B溶液分子信标浓度为4μmol/L工作前浓度。miR-let-7a靶序列溶于410μL15mmol/L Tris溶液中成10μmol/L作为长期储存浓度；接着取50μL 10μmol/LmiR-let-7a靶序列溶液溶于950μL 15mmol/L Tris溶液中，作为0.5μmol/L工作前浓度。

取上述稀释后1μmol/L A溶液100μL，4μmol/L B溶液100μL，0.5μmol/LmiR-let-7a溶液20μL，一起加入含有15mmol/L Tris溶液的总体积为1mL的石英皿中，进行检测miR-let-7a、miR-141、miR-21。

对照例1

将miR-let-7a和对照靶序列miR-let-7f(同家族错配1nt)、miR-let-7i(同家族错配4nt)、miR-21(不同家族)溶于410μL 20mmol/L Tris溶液中，作为10μmol/L长期储存浓度；接着各取50μL上述四种10μmol/L溶液溶于950μL 20mmol/L Tris溶液中成为0.5μmol/L工作前浓度；最后各取2、20、200μL 0.5μmol/L上述各溶液(最终工作浓度为1、10、100nmol/L)，取稀释后1μmol/L A溶液100μL(分子信标最终工作浓度为0.1μmol/L)，4μmol/L B溶液100μL(分子信标最终工作浓度为0.4μmol/L)一起加入含有20mmol/L Tris溶液的总体积为1mL的石英皿中(图3)。

在Cy3最佳激发波长543nm激发后，发现几种靶序列在Cy5发射波长665nm处的荧光信号增强情况不同，miR-let-7f、miR-let-7i、miR-21的增强均小于miR-let-7a；结果说明本发明试剂可以用于靶分子miR-let-7a的特异性检测。

在543nm激发后，665nm处miR-let-7a最强说明溶液中的分子信标HP1、HP4在miR-let-7a引发下形成了一个多级发夹状DNA结构单元。而miR-let-7f，miR-let-7i不会引发溶液中任何分子信标间反应或者很少反应。miR-21(引发溶液中分子信标HP3、HP6反应形成多级发夹状结构)需要在405nm激发下观察488nm处的荧光强度来检测。在选择了特定的激发光源后，可以实现对miR-let-7a的准确性检测。

对照例2

将miR-let-7a靶序列溶于410μL 20mmol/L Tris溶液中，作为10μmol/L长期储存浓度；接着取50μL 10μmol/L miR-let-7a溶液溶于950μL 20mmol/L Tris溶液中成为0.5μmol/L工作前浓度。

取C溶液(含10μmol/L HP7分子信标，由15bp的茎部分和9nt的环部分组成，茎部分有2对碱基错配)100μL、D溶液(含10μmol/L HP8分子信标，由15bp的茎部分和8nt的环部分组成，茎部分有2对碱基错配)400μL，用20mmol/L Tris溶液稀释至1mL，此时，C溶液分子信标浓度为1μmol/L工作前浓度、D溶液分子信标浓度为4μmol/L工作前浓度。

取上述稀释后1μmol/L C溶液100μL，4μmol/L D溶液100μL，20μL 0.5μmol/L miR-let-7a溶液加入含有20mmol/L Tris溶液的总体积为1mL的石英皿中，此时C溶液中分子信标最终工作浓度为0.1μmol/L，D溶液分子信标最终工作浓度为0.4μmol/L，miR-let-7a最终工作浓度为0.01μmol/L。

在Cy3最佳激发波长543nm激发后，发现在Cy5发射波长665nm处的荧光信号没有明显变化，结果说明试剂C、D不能用于区分不同亚型乳腺癌细胞。这是由于HP7、HP8结构中的茎部分互补的碱基对数较多且错配不多，使得两分子信标非常稳定，检测目标难以引发反应。而HP1、HP4，HP3、HP6分子信标的茎部分相对而言互补的碱基对数少一些，使得miR-let-7a和miR-21可以引发反应，HP2、HP5茎部分虽然碱基对数也较多但是其错配碱基对数也多，所以当miR-141出现时可以引发反应。本分明中的分子信标不仅在无目标时可以维持其结构稳定，而且在目标出现时可以有效引发反应进行。一方面避免了分子信标过于稳定导致不能引发反应的问题，另一方面也避免了分子信标不稳定导致产生伪阳性信号的问题。

对照例说明本发明试剂中的分子信标只有在对相应靶分子miR-let-7a，miR-141，miR-21，出现后才引发形成了三种多级发夹状DNA结构单元，并且当相应激发光激发后，在不同发射处产生荧光从而实现对目标的检测来区分不同亚型乳腺癌细胞。分子信标序列变化后茎部分互补配对的碱基过多且错配少也不能实现对靶分子的检测从而区分不同癌细胞。

序列表

<110> 南京师范大学

<120> 一种基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcctcgtact atacaaccta ctacctcata gtccgaggc 39

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcctcgtttg tgacagacca tttctaccac aaccgaggc 39

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcctcgccaa catcagtctg ataagcttgt tgacgaggc 39

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggtagtagg ttggcctcgg actataaacc tcctaccg 38

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tagaaatggt ctggcctcgg ttgtggagac cctttcta 38

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcttatcaga ctggcctcgt caacaaagtc taataagc 38

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcctcgtcct gagtgtataa cagaacttca ggccgaggc 39

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gttctgttat acagcctcgg cctgaagtat accagaac 38

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgaggtagta ggttgtatag tt 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtagaaatg gtctgtcaca at 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tagcttatca gactgatgtt ga 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgaggtagta gattgtatag tt 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgaggtagta gtttgtgctg tt 22

Claims (6)

1.一种基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂，其特征在于，包括A溶液和B溶液，所述A溶液是包含三种发夹型分子信标HP1、HP2、HP3的Tris溶液，HP1的3’端标记Cy3荧光供体基团、HP2的3’端标记Alexa488荧光供体基团、HP3的3’端标记Alexa405荧光供体基团；所述B溶液是包含三种发夹型分子信标HP4、HP5、HP6的Tris溶液，HP4的5’端标记Cy5荧光受体基团、HP5的5’端标记Cy3荧光受体基团、HP6的5’端标记Alexa488荧光受体基团；所述A溶液和B溶液在不同靶序列引发下反应后会产生三种由多个HP1-HP4、HP2-HP5、HP3-HP6形成的多级发夹状DNA结构单元；所述HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6的碱基序列分别由SEQ ID NO.1-6所示。

2.根据权利要求1所述的基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂，其特征在于，所述A溶液和B溶液中Tris的浓度为15-20 mmol/L。

3.根据权利要求1所述的基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂，其特征在于，所述A溶液和B溶液中分子信标浓度均为5-10 μmol/L长期储存浓度。

4.根据权利要求1所述的基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂，其特征在于，所述A溶液和B溶液中分子信标所用到的碱基序列在合成的同时分别对其两端的三个碱基进行硫代磷酸酯键修饰。

5.根据权利要求1所述的基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂，其特征在于，A溶液和B溶液在不同靶序列引发下反应后会产生三种由多个HP1-HP4、HP2-HP5、HP3-HP6形成的多级发夹状DNA结构单元，它们满足荧光共振能量转移对供受体荧光基团距离的要求，从而使Cy3供体基团在543 nm激发光源激发后能量转移到受体Cy5上，导致Cy5荧光基团在发射波长665 nm处的红色荧光增强；Alexa488供体基团在488 nm激发光源激发后能量转移到受体Cy3上，导致Cy3荧光基团在发射波长562 nm处的黄色荧光增强；Alexa405供体基团在405 nm激发光源激发后能量转移到受体Alexa488上，导致Alexa488荧光基团在发射波长519 nm处的绿色荧光增强。

6.根据权利要求1所述的基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂，其特征在于，所述不同靶序列为miR-let-7a、miR-141和miR-21，其碱基序列分别由SEQ IDNO.9-11所示。

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