JP7482506B2 - 短鎖ヘアピンDNAを用いた改良型in situ ハイブリダイゼーション反応 - Google Patents
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Description
〔1〕生体内の標的分析物を特定するin situ ハイブリダイゼーション方法において、
(A)標的分析物を含む試料を、標的分析物の配列に相補的な配列を有するスプリット-イニシエータープローブペアと結合させる工程、
(B)前記(A)工程の生成物に、蛍光標識体を含み互いに相補的なH1配列またはH2配列を持つ短鎖ヘアピンペアを添加し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始させることにより、前記プローブに結合した短鎖ヘアピンの増幅産物を生成させる工程;および
(C)前記増幅産物の蛍光標識体を検出することにより、生体組織中の標的分析物を同定することを特徴とする方法、
〔2〕H1配列を含む短鎖ヘアピンがイニシエーター配列も含む〔1〕記載の方法、
〔3〕短鎖ヘアピンが42塩基からなるDNAヘアピンである〔1〕または〔2〕記載の方法、
〔4〕短鎖ヘアピンのステム部位のグアニンおよびシトシンの割合に偏りがあることを特徴とする〔1〕から〔3〕のいずれかひとつに記載の方法、
〔5〕短鎖ヘアピンのループ部位末端の1-2塩基が相補配列であることを特徴とする〔1〕から〔4〕のいずれかひとつに記載の方法、
〔6〕短鎖ヘアピンのトーホールド部位が9塩基であることを特徴とする〔1〕から〔5〕のいずれかひとつに記載の方法、
〔7〕プロテナーゼK処理を用いずに、生体組織中の標的分析物を同定することを特徴とする〔1〕から〔6〕のいずれかひとつに記載の方法、
〔8〕短鎖ヘアピンと蛍光標識体を結合させるアミノリンカーがssHであることを特徴とする〔1〕から〔7〕のいずれか一つに記載の方法、
〔9〕短鎖ヘアピンペアの塩基配列が、H1が配列番号1でH2が配列番号2であるS10、H1が配列番号3でH2が配列番号4であるS23、H1が配列番号5でH2が配列番号6であるS25、H1が配列番号7でH2が配列番号8であるS38、H1が配列番号9でH2が配列番号10であるS40、H1が配列番号11でH2が配列番号12であるS41、H1が配列番号13でH2が配列番号14であるS45、H1が配列番号15でH2が配列番号16であるS46、H1が配列番号17でH2が配列番号18であるS62、H1が配列番号19でH2が配列番号20であるS68、H1が配列番号21でH2が配列番号22であるS71、H1が配列番号23でH2が配列番号24であるS72、H1が配列番号25でH2が配列番号26であるS73、H1が配列番号27でH2が配列番号28であるS74、H1が配列番号29でH2が配列番号30であるS76、H1が配列番号31でH2が配列番号32であるS78、H1が配列番号33でH2が配列番号34であるS81、H1が配列番号35でH2が配列番号36であるS83、H1が配列番号37でH2が配列番号38であるS85またはH1が配列番号39でH2が配列番号40であるS86のいずれかひとつである〔1〕から〔8〕のいずれかひとつに記載の方法、
〔10〕短鎖ヘアピンの蛍光標識体が、Alexa488、Atto550またはAlexa647のいずれか一つである〔1〕から〔9〕記載のいずれかひとつに記載の方法、
〔11〕互いに相補的なH1配列またはH2配列を持つ短鎖ヘアピンペアからなるハイブリダイゼーション連鎖反応用増幅剤、
〔12〕H1配列を含む短鎖ヘアピンがイニシエーター配列も含む〔11〕記載の増幅剤、
〔13〕短鎖ヘアピンが42塩基からなるDNAヘアピンである〔11〕または〔12〕記載の増幅剤、
〔14〕短鎖ヘアピンのステム部位のグアニンおよびシトシンの割合に偏りがあることを特徴とする〔11〕から〔13〕のいずれかひとつに記載の増幅剤、
〔15〕短鎖ヘアピンペアの塩基配列が、H1が配列番号1でH2が配列番号2であるS10、H1が配列番号3でH2が配列番号4であるS23、H1が配列番号5でH2が配列番号6であるS25、H1が配列番号7でH2が配列番号8であるS38、H1が配列番号9でH2が配列番号10であるS40、H1が配列番号11でH2が配列番号12であるS41、H1が配列番号13でH2が配列番号14であるS45、H1が配列番号15でH2が配列番号16であるS46、H1が配列番号17でH2が配列番号18であるS62、H1が配列番号19でH2が配列番号20であるS68、H1が配列番号21でH2が配列番号22であるS71、H1が配列番号23でH2が配列番号24であるS72、H1が配列番号25でH2が配列番号26であるS73、H1が配列番号27でH2が配列番号28であるS74、H1が配列番号29でH2が配列番号30であるS76、H1が配列番号31でH2が配列番号32であるS78、H1が配列番号33でH2が配列番号34であるS81、H1が配列番号35でH2が配列番号36であるS83、H1が配列番号37でH2が配列番号38であるS85およびH1が配列番号39でH2が配列番号40であるS86の少なくともいずれか一つである〔11〕から〔14〕のいずれかひとつに記載の増幅剤、
〔16〕生体内の標的分析物を特定するin situ ハイブリダイゼーション方法において、
(A)複数の異なる標的分析物を含む試料を、複数の異なる標的分析物の配列に相補的な配列を有するスプリット-イニシエータープローブペアと結合させる工程、
(B)前記(A)工程の生成物に、蛍光標識体を含み互いに相補的なH1配列またはH2配列を持つ複数の異なる短鎖ヘアピンペアを添加し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始させることにより、前記プローブに結合した短鎖ヘアピンの増幅産物を生成させる工程;および
(C)前記増幅産物の蛍光標識体を検出することにより、生体組織中の異なる複数の標的分析物を同定することを特徴とする方法、
〔17〕短鎖ヘアピンが42塩基からなるDNAヘアピンである〔16〕記載の方法、および
〔18〕複数の異なる短鎖ヘアピンペアの塩基配列が、H1が配列番号1でH2が配列番号2であるS10、H1が配列番号3でH2が配列番号4であるS23、H1が配列番号5でH2が配列番号6であるS25、H1が配列番号7でH2が配列番号8であるS38、H1が配列番号9でH2が配列番号10であるS40、H1が配列番号11でH2が配列番号12であるS41、H1が配列番号13でH2が配列番号14であるS45、H1が配列番号15でH2が配列番号16であるS46、H1が配列番号17でH2が配列番号18であるS62、H1が配列番号19でH2が配列番号20であるS68、H1が配列番号21でH2が配列番号22であるS71、H1が配列番号23でH2が配列番号24であるS72、H1が配列番号25でH2が配列番号26であるS73、H1が配列番号27でH2が配列番号28であるS74、H1が配列番号29でH2が配列番号30であるS76、H1が配列番号31でH2が配列番号32であるS78、H1が配列番号33でH2が配列番号34であるS81、H1が配列番号35でH2が配列番号36であるS83、H1が配列番号37でH2が配列番号38であるS85およびH1が配列番号39でH2が配列番号40であるS86の少なくともいずれか2つ以上の組合せである〔16〕または〔17〕に記載の方法に関する。
表1にステム部位におけるGとCの塩基数の違いとリーク産物が生成される頻度を示した。
表2、表3に示す全ての無標識オリゴDNAは常法(岡本晃充、化学と教育、(2009年)57巻、7号、346―347頁)に従い自動合成装置を用いた固相合成法により合成した(スタンダード脱塩グレードでインテグレーテッド DNA テクノロジー株式会社に外注し合成した)。
HCR反応を誘導できて効率的に増幅するために最も短いヘアピンDNA配列を見出すために、表2に示す36-44塩基長で12-14塩基のステム配列を持つヘアピンDNAについて検討した。ヘアピンDNAはNucleic Acid Package(商品名,NUPACK)のソフトウエアを用いたシミュレーションにより、目的の二次構造(図1)を生成するようにデザインを行った。NUPACKシミュレーションによってランダム精製されたDNA配列は先行研究のルールに従いマニュアルで編集した。この場合、トーホールドのGC含量は40%以下であり、ステムのGC含量は60%以上となる。マニュアルで配列編集したヘアピンDNA配列は、編集後に目的の二次構造を取るかどうかについて改めてNUPACKシミュレーションを行い、確認した。
表2に示す41種類全てのヘアピンDNAはスナップ-冷却(95℃で2分間加熱した後30分間室温まで冷却した)により使用前にヘアピン構造を形成させた。HCR反応は0.1%Tween20を含んだ0.75M 塩化ナトリウム+0.075Mクエン酸ナトリウム)溶液(以下、5xSSCTと言う)内で行った。それぞれのマイクロチューブは3μMのヘアピンDNAをそれぞれ2μlずつ、0,0.005,0.02,0.1μMのイニシエーターDNAを6μlずつ加え、最後に3M塩化ナトリウム+0.3Mクエン酸ナトリウム(以下,20xSSCと言う。)と10%Tweenを適量加えることによって5xSSCT溶液になるように調整し、合計量を12μlとして準備した。DNAを混ぜた2時間後に、サンプルを着色マーカーのローディング色素(Bio-craft社製)を混ぜてから1%のアガロースゲル電気泳動を行った。泳動条件は35mMホウ酸と10mM塩化ナトリウム(以下、SBバッファーと言う。)を用い135Vで30分間で行なった。それぞれの電気泳動バンドは画像データをImageJにより産物の量を定量した。
全ての動物実験は東邦大学実験動物委員会のガイドラインに従って行い、東邦大学実験動物委員会によって手順が承認されたものである(承認番号19-51-405)。C57/BL6系統マウスの交配ペアは日本エスエルシー株式会社及び日本クレア株式会社から購入した。マウスは大学内の繁殖コロニー内で12時間の明暗サイクルと23±2℃、55%プラスマイナス5%湿度の制御条件下で飼育した。20-30週齢の雄マウス脳をサンプリングした。再現性を確認するために、それぞれの実験で3匹ずつのマウスを用いた。マウスは50mg/mlペントバルビタールナトリウム腹腔内投与によって深麻酔し、経心的に4%パラホルムアルデヒドリン酸バッファーによって灌流固定した。取り出した脳は4%ホルムアルデヒドで4℃で一晩後固定し、30%スクロース溶液に二日間浸透させることによって凍結防止処理を行い、Surgipath(商品名: ライカバイオシステム社製)に封入した後に使用まで-80℃で保管した。脳切片は40μMの厚みで凍結切片を作製した。
全ての動物実験は東邦大学実験動物委員会のガイドラインに従って行い、東邦大学実験動物委員会によって手順が承認されたものである(承認番号19-51-405)。C57/BL6系統マウスの交配ペアは日本エスエルシー株式会社及び日本クレア株式会社から購入した。マウスは大学内の繁殖コロニー内で12時間の明暗サイクルと23±2℃、55%プラスマイナス5%湿度の制御条件下で飼育した。20-30週齢の雄マウス脳をサンプリングした。再現性を確認するために、それぞれの実験で3匹ずつのマウスを用いた。マウスは50mg/mlペントバルビタールナトリウム腹腔内投与によって深麻酔し、経心的に4%パラホルムアルデヒドリン酸バッファーによって灌流固定した。取り出した脳は4%ホルムアルデヒドで4℃で一晩後固定し、30%スクロース溶液に二日間浸透させることによって凍結防止処理を行い、Surgipath(商品名:ライカバイオシステム社製)に封入した後に使用まで-80℃で保管した。脳切片は40μMの厚みで凍結切片を作製した。
全ての動物実験は東邦大学実験動物委員会のガイドラインに従って行い、東邦大学実験動物委員会によって手順が承認されたものである(承認番号19-51-405)。C57/BL6系統マウスの交配ペアは日本エスエルシー株式会社及び日本クレア株式会社から購入した。マウスは大学内の繁殖コロニー内で12時間の明暗サイクルと23±2℃、55%プラスマイナス5%湿度の制御条件下で飼育した。20-30週齢の雄マウス脳をサンプリングした。再現性を確認するために、それぞれの実験で3匹ずつのマウスを用いた。マウスは50mg/mlペントバルビタールナトリウム腹腔内投与によって深麻酔し、経心的に4%パラホルムアルデヒドリン酸バッファーによって灌流固定した。取り出した脳は4%ホルムアルデヒドで4℃で一晩後固定し、30%スクロース溶液に二日間浸透させることによって凍結防止処理を行い、Surgipath(商品名:ライカバイオシステム社製)に封入した後に使用まで-80℃で保管した。脳切片は40μMの厚みで凍結切片を作製した。
全ての動物実験は東邦大学実験動物委員会のガイドラインに従って行い、東邦大学実験動物委員会によって手順が承認されたものである(承認番号19-51-405)。C57/BL6系統マウスの交配ペアは日本エスエルシー株式会社及び日本クレア株式会社から購入した。マウスは大学内の繁殖コロニー内で12時間の明暗サイクルと23±2℃、55%プラスマイナス5%湿度の制御条件下で飼育した。220-30週齢の雌マウスをc-Fos免疫染色実験のため仔マウス提示の2時間後に脳をサンプリングした。再現性を確認するために、それぞれの実験で3匹ずつのマウスを用いた。マウスは50mg/mlペントバルビタールナトリウム腹腔内投与によって深麻酔し、経心的に4%パラホルムアルデヒドリン酸バッファーによって灌流固定した。取り出した脳は4%ホルムアルデヒドで4℃で一晩後固定し、30%スクロース溶液に二日間浸透させることによって凍結防止処理を行い、Surgipath(商品名:ライカバイオシステム社製)に封入した後に使用まで-80℃で保管した。脳切片は40μMの厚みで凍結切片を作製した。
全ての動物実験は東邦大学実験動物委員会のガイドラインに従って行い、東邦大学実験動物委員会によって手順が承認されたものである(承認番号19-51-405)。C57/BL6系統マウスの交配ペアは日本エスエルシー株式会社及び日本クレア株式会社から購入した。マウスは大学内の繁殖コロニー内で12時間の明暗サイクルと23±2℃、55%プラスマイナス5%湿度の制御条件下で飼育した。20-30週齢の雄マウス脳をサンプリングした。再現性を確認するために、それぞれの実験で3匹ずつのマウスを用いた。マウスは50mg/mlペントバルビタールナトリウム腹腔内投与によって深麻酔し、経心的に4%パラホルムアルデヒドリン酸バッファーによって灌流固定した。取り出した脳は4%ホルムアルデヒドで4℃で一晩後固定し、30%スクロース溶液に二日間浸透させることによって凍結防止処理を行い、Surgipath(商品名:ライカバイオシステム社製)に封入した後に使用まで-80℃で保管した。脳切片は40μMの厚みで凍結切片を作製した。
全ての動物実験は東邦大学実験動物委員会のガイドラインに従って行い、東邦大学実験動物委員会によって手順が承認されたものである(承認番号19-51-405)。C57/BL6系統マウスの交配ペアはから購入した。マウスは大学内の繁殖コロニー内で12時間の明暗サイクルと23±2℃、55%プラスマイナス5%湿度の制御条件下で飼育した。20-30週齢の雄マウス脳をサンプリングした。再現性を確認するために、それぞれの実験で3匹ずつのマウスを用いた。マウスは50mg/mlペントバルビタールナトリウム腹腔内投与によって深麻酔し、経心的に4%パラホルムアルデヒドリン酸バッファーによって灌流固定した。取り出した脳は4%ホルムアルデヒドで4℃で一晩後固定し、30%スクロース溶液に二日間浸透させることによって凍結防止処理を行い、Surgipath(商品名:ライカバイオシステム社製)に封入した後に使用まで-80℃で保管した。脳切片は40μMの厚みで凍結切片を作製した。
全ての動物実験は東邦大学実験動物委員会のガイドラインに従って行い、東邦大学実験動物委員会によって手順が承認されたものである(承認番号19-51-405)。C57/BL6系統マウスの交配ペアは日本エスエルシー株式会社及び日本クレア株式会社から購入した。マウスは大学内の繁殖コロニー内で12時間の明暗サイクルと23±2℃、55%プラスマイナス5%湿度の制御条件下で飼育した。20-30週齢の雄マウスを用いた。再現性を確認するために、それぞれの実験で3匹ずつのマウスを用いた。マウスは50mg/mlペントバルビタールナトリウム腹腔内投与によって深麻酔し、経心的に4%パラホルムアルデヒドリン酸バッファーによって灌流固定した。取り出した脳は4%ホルムアルデヒドで4℃で一晩後固定し、30%スクロース溶液に二日間浸透させることによって凍結防止処理を行い、Surgipath(商品名:ライカバイオシステム社製に封入した後に使用まで-80℃で保管した。脳切片は40μMの厚みで凍結切片を作製した。
HCR反応を効率的に誘導する最も短いDNAヘアピンの配列を見つけるために、我々は10kb以上のHCR産物の有無に基づいて系統的に異なった長さのヘアピンDNAについて実施例3に従って検討した。これまで共通に用いられてきたDNAヘアピンは72塩基で、そのうち12塩基のトーホールド、24塩基のステム、12塩基のループ部位を含んでいるため、我々は最初に6塩基のトーホールド、12塩基のステム、6塩基のループ部位を含む表2に示す36塩基のDNAを7セット試した。イニシエーターDNAが高濃度の場合でも2時間の反応では10kb以上の産物は生成されず、多くの未反応ヘアピンDNAが残った(図2A)。そのため、36塩基のヘアピンDNAはHCR反応を起こすには短すぎる。
42塩基のヘアピンDNAの安定性はステムの配列とその長さに大きく影響する。表1は異なるGC含量における、イニシエーターDNA無しでHCR産物ができる量(リーク産物量、非特異的反応)を示す。ステム部位の片側における合計GC含量ではなくGもしくはCの塩基数の偏りはリーク産物量を減らし、一方で偏りの少ないGCではリーク産物量が増えた。このようなGとCの塩基数の差は電気泳動のバンドの強さで判定したリーク産物量と有意に相関していた(表1)。
我々は蛍光色素がマイクロチューブにおけるHCR反応効率に影響するかについて実施例3に従って検討した。FAM,Atto390,Atto488,Atto550,Alexa488,Alexa647をヘアピンDNAに標識した場合にはHCR反応を阻害しなかったが、Atto565やalexa568の標識によって反応効率が減少した(図2b)。Atto565やAlexa568標識ヘアピンDNAは1:200比のイニシエーター:ヘアピンDNA反応系においてごくわずかな量の10kb産物しか見られず、多量のヘアピンDNAが未反応であった(図2B)。また、標識に用いるアミノリンカーの種類が蛍光標識後のHCR反応効率に影響するかについても検討した。その結果、Atto550でDNAを標識した場合に6原子長のアミノリンカーでは反応が阻害されたが、ssHリンカーを用いた場合には反応阻害は見られなかった。
BNSTpr:BNSTの主核
BNSTrh:BNSTの菱形核
LOPA:外側視索前野
MN:大細胞核
MPOA:内側視索前野
LPOA:外側視索前野
PN :視床傍紐核
PVT:視床室傍核
Claims (9)
- 生体内の標的分析物を特定するin situ ハイブリダイゼーション方法において、
(A)標的分析物を含む試料を、標識分析物の配列に相補的な配列を有するスプリット-イニシエータープローブペアと結合させる工程、
(B)前記(A)工程の生成物に、
蛍光標識体を含み
H1が配列番号57でH2が配列番号58であるS9、
H1が配列番号1でH2が配列番号2であるS10、
H1が配列番号71でH2が配列番号72であるS17、
H1が配列番号3でH2が配列番号4であるS23、
H1が配列番号5でH2が配列番号6であるS25、
H1が配列番号93でH2が配列番号94であるS30、
H1が配列番号99でH2が配列番号100であるS33、
H1が配列番号101でH2が配列番号102であるS34、
H1が配列番号103でH2が配列番号104であるS35、
H1が配列番号107でH2が配列番号108であるS37、
H1が配列番号7でH2が配列番号8であるS38、
H1が配列番号109でH2が配列番号110であるS39、
H1が配列番号9でH2が配列番号10であるS40、
H1が配列番号11でH2が配列番号12であるS41、
H1が配列番号13でH2が配列番号14であるS45、
H1が配列番号15でH2が配列番号16であるS46、
H1が配列番号17でH2が配列番号18であるS62、
H1が配列番号19でH2が配列番号20であるS68、
H1が配列番号21でH2が配列番号22であるS71、
H1が配列番号23でH2が配列番号24であるS72、
H1が配列番号25でH2が配列番号26であるS73、
H1が配列番号27でH2が配列番号28であるS74、
H1が配列番号29でH2が配列番号30であるS76、
H1が配列番号31でH2が配列番号32であるS78、
H1が配列番号33でH2が配列番号34であるS81、
H1が配列番号35でH2が配列番号36であるS83、
H1が配列番号37でH2が配列番号38であるS85
またはH1が配列番号39でH2が配列番号40であるS86のいずれか一つである
42~44塩基長を持ち、かつ12~14塩基のステム配列を持つヘアピンDNA
を添加し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始させることにより、前記プローブに結合した42~44塩基長を持ち、かつ12~14塩基のステム配列を持つヘアピンDNAの増幅産物を生成させる工程;および
(C)前記増幅産物の蛍光標識体を検出することにより、生体組織中の標的分析物を同定することを特徴とする方法。 - 42~44塩基長を持ち、かつ12~14塩基のステム配列を持つヘアピンDNAが
H1が配列番号57でH2が配列番号58であるS9、
H1が配列番号1でH2が配列番号2であるS10、
H1が配列番号5でH2が配列番号6であるS25、
H1が配列番号99でH2が配列番号100であるS33、
H1が配列番号101でH2が配列番号102であるS34、
H1が配列番号103でH2が配列番号104であるS35、
H1が配列番号11でH2が配列番号12であるS41、
H1が配列番号13でH2が配列番号14であるS45、
H1が配列番号15でH2が配列番号16であるS46、
H1が配列番号17でH2が配列番号18であるS62、
H1が配列番号19でH2が配列番号20であるS68、
H1が配列番号21でH2が配列番号22であるS71、
H1が配列番号23でH2が配列番号24であるS72、
H1が配列番号25でH2が配列番号26であるS73、
H1が配列番号27でH2が配列番号28であるS74、
H1が配列番号29でH2が配列番号30であるS76、
H1が配列番号31でH2が配列番号32であるS78、
H1が配列番号33でH2が配列番号34であるS81、
H1が配列番号35でH2が配列番号36であるS83、
H1が配列番号37でH2が配列番号38であるS85
またはH1が配列番号39でH2が配列番号40であるS86
のいずれか一つであることを特徴とする請求項1記載の方法。 - プロテナーゼK処理を用いずに、生体組織中の標的分析物を同定することを特徴とする請求項1または請求項2記載の方法。
- 42~44塩基長を持ち、かつ12~14塩基のステム配列を持つヘアピンDNAと蛍光標識体を結合させるアミノリンカーがssHであることを特徴とする請求項1から請求項3のいずれか1項記載の方法。
- 42~44塩基長を持ち、かつ12~14塩基のステム配列を持つヘアピンDNAの蛍光標識体が、Alexa488、Atto550またはAlexa647のいずれか一つである請求項1から請求項4記載のいずれか1項記載の方法。
- スプリットーイニシエータープローブペアと組み合わせてin situ ハイブリダイゼーション反応に使用することを特徴とし、
H1が配列番号57でH2が配列番号58であるS9、
H1が配列番号1でH2が配列番号2であるS10、
H1が配列番号71でH2が配列番号72であるS17、
H1が配列番号3でH2が配列番号4であるS23、
H1が配列番号5でH2が配列番号6であるS25、
H1が配列番号93でH2が配列番号94であるS30、
H1が配列番号99でH2が配列番号100であるS33、
H1が配列番号101でH2が配列番号102であるS34、
H1が配列番号103でH2が配列番号104であるS35、
H1が配列番号107でH2が配列番号108であるS37、
H1が配列番号7でH2が配列番号8であるS38、
H1が配列番号109でH2が配列番号110であるS39、
H1が配列番号9でH2が配列番号10であるS40、
H1が配列番号11でH2が配列番号12であるS41、
H1が配列番号13でH2が配列番号14であるS45、
H1が配列番号15でH2が配列番号16であるS46、
H1が配列番号17でH2が配列番号18であるS62、
H1が配列番号19でH2が配列番号20であるS68、
H1が配列番号21でH2が配列番号22であるS71、
H1が配列番号23でH2が配列番号24であるS72、
H1が配列番号25でH2が配列番号26であるS73、
H1が配列番号27でH2が配列番号28であるS74、
H1が配列番号29でH2が配列番号30であるS76、
H1が配列番号31でH2が配列番号32であるS78、
H1が配列番号33でH2が配列番号34であるS81、
H1が配列番号35でH2が配列番号36であるS83、
H1が配列番号37でH2が配列番号38であるS85
またはH1が配列番号39でH2が配列番号40であるS86のいずれか一つである
42~44塩基長を持ち、かつ12~14塩基のステム配列を持つヘアピンDNA
からなるハイブリダイゼーション連鎖反応用増幅剤。 - 42~44塩基長を持ち、かつ12~14塩基のステム配列を持つヘアピンDNAが
H1が配列番号57でH2が配列番号58であるS9、
H1が配列番号1でH2が配列番号2であるS10、
H1が配列番号5でH2が配列番号6であるS25、
H1が配列番号99でH2が配列番号100であるS33、
H1が配列番号101でH2が配列番号102であるS34、
H1が配列番号103でH2が配列番号104であるS35、
H1が配列番号11でH2が配列番号12であるS41、
H1が配列番号13でH2が配列番号14であるS45、
H1が配列番号15でH2が配列番号16であるS46、
H1が配列番号17でH2が配列番号18であるS62、
H1が配列番号19でH2が配列番号20であるS68、
H1が配列番号21でH2が配列番号22であるS71、
H1が配列番号23でH2が配列番号24であるS72、
H1が配列番号25でH2が配列番号26であるS73、
H1が配列番号27でH2が配列番号28であるS74、
H1が配列番号29でH2が配列番号30であるS76、
H1が配列番号31でH2が配列番号32であるS78、
H1が配列番号33でH2が配列番号34であるS81、
H1が配列番号35でH2が配列番号36であるS83、
H1が配列番号37でH2が配列番号38であるS85
またはH1が配列番号39でH2が配列番号40であるS86
のいずれか一つであることを特徴とする
請求項6記載の増幅剤。 - 生体内の標的分析物を特定するin situ ハイブリダイゼーション方法において、
(A)複数の異なる標的分析物を含む試料を、複数の異なる標的分析物の配列に相補的な配列を有し、複数の異なる標的分析物の配列を有するスプリットーイニシエータープローブペアと結合させる工程、
(B)前記(A)工程の生成物に、蛍光標識体を含み
H1が配列番号57でH2が配列番号58であるS9、
H1が配列番号1でH2が配列番号2であるS10、
H1が配列番号71でH2が配列番号72であるS17、
H1が配列番号3でH2が配列番号4であるS23、
H1が配列番号5でH2が配列番号6であるS25、
H1が配列番号93でH2が配列番号94であるS30、
H1が配列番号99でH2が配列番号100であるS33、
H1が配列番号101でH2が配列番号102であるS34、
H1が配列番号103でH2が配列番号104であるS35、
H1が配列番号107でH2が配列番号108であるS37、
H1が配列番号7でH2が配列番号8であるS38、
H1が配列番号109でH2が配列番号110であるS39、
H1が配列番号9でH2が配列番号10であるS40、
H1が配列番号11でH2が配列番号12であるS41、
H1が配列番号13でH2が配列番号14であるS45、
H1が配列番号15でH2が配列番号16であるS46、
H1が配列番号17でH2が配列番号18であるS62、
H1が配列番号19でH2が配列番号20であるS68、
H1が配列番号21でH2が配列番号22であるS71、
H1が配列番号23でH2が配列番号24であるS72、
H1が配列番号25でH2が配列番号26であるS73、
H1が配列番号27でH2が配列番号28であるS74、
H1が配列番号29でH2が配列番号30であるS76、
H1が配列番号31でH2が配列番号32であるS78、
H1が配列番号33でH2が配列番号34であるS81、
H1が配列番号35でH2が配列番号36であるS83、
H1が配列番号37でH2が配列番号38であるS85
またはH1が配列番号39でH2が配列番号40であるS86
の少なくともいずれか2つ以上の組み合わせである42~44塩基長を持ち、かつ12~14塩基のステム配列を持つヘアピンDNAペアを添加し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始させることにより、前記プローブに結合した42~44塩基長を持ち、かつ12~14塩基のステム配列を持つヘアピンDNAの増幅産物を生成させる工程;および
(C)前記増幅産物の蛍光標識体を検出することにより、生体組織中の異なる複数の標的分析物を同定することを特徴とする方法。 - 2つ以上の組み合わせてある42~44塩基長を持ち、かつ12~14塩基のステム配列を持つヘアピンDNAペアが、
H1が配列番号3でH2が配列番号4であるS23および
H1が配列番号5でH2が配列番号6であるS25であることを特徴とする請求項8記載の方法。
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Tsuyoshi YAMAGUCHI et al.,Environmental Microbiology,2015年,Vol. 17,No. 7,pp. 2532-2541 |
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