CN105506126A - 具有较大张力的小环形核苷酸探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有较大张力的小环形核苷酸探针的制备及其应用,通过“无铜点击反应”制备得到了具有较大环张力的小环形核苷酸;其制备方法是将标记有相互作用性标记系统的核苷酸短单链和小环形核苷酸杂交,得到检测信号处于“TURN?OFF”的探针,当目标分子诱导核苷酸短单链置换,信号被“TURN?ON”,从而实现对目标分子的检测;本发明所制备的具有较大张力的小环形核苷酸探针,不仅能实现细胞外分子的高选择性识别,而且能有效地用于细胞内生物分子的识别与调控,并且制备过程温和,实验操作步骤简单,应用范围广,具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子检测领域,具体涉及具有较大张力的小环形核苷酸探针,还涉及该探针的制备方法和应用。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA,其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因,而几个miRNA也可以调节同一个基因,其在动植物中参与转录后基因表达调控。miRNA可以通过与靶基因的完全互补或不完全互补来达到靶向切割mRNA或者抑制靶基因的翻译,从而起调节基因表达的作用;然而这些靶向mRNA广泛参与一些重要的细胞过程,包括细胞的生长、增殖、分化和凋亡,并且在不同的发育阶段其表达水平也有所不同。因此miRNA被当作许多细胞活力的重调控者。miRNA表达的改变与许多疾病和失调都有或多或少的关系,但是由于miRNAs高度的序列相似性、种类的多样性以及序列的短小性,miRNA临床诊断面临了一些挑战。采用传统的方法将miRNA从组织活细胞中分离出来,然后进行检测,这个过程中由于miRNA在细胞内的浓度是非常低的,所以必须经过富集和扩增,这会大大耗费时间、精力以及资金;NorthernBlot法被认为是miRNA检测和确认的金标准,但是其特异性和灵敏度均不高,虽然后来一些科学家也对该方法进行了拓展(比如采用锁核酸LNA修饰的杂交探针、核糖核酸酶保护法),但总的来说这些方法相对来说需要的样品量较大、步骤繁琐、不适用于高通量分析等限制了其临床应用。采用RT-qPCR检测miRNA的灵敏度很高,样本量也相对少,但是由于miRNA序列短,要求引物的序列就更加短小,从而就要求更低的溶解温度,然而低的溶解温度会影响PCR扩增。导致所检测到的是前体的miRNA,而并非是成熟的miRNA,在细胞中前提的miRNA和成熟的miRNA的水平也不一致,所以该方法也常产生一些假阳性信号,且反应所需要酶和试剂以及检测的仪器都非常的昂贵,因此也使得成本相应较高。微阵列芯片技术(Microarray)发已被广泛用于miRNA的检测,相对于其他的检测方法其最大的优点是具有高通量性,然而该技术花费较大,需要机器加工,一些小型实验室也不具备这些条件;另外,其灵敏度也比较低。以纳米材料为基础的一些检测方法也越来越多的学者进行了研究,比如纳米金标记技术的检测、基于纳米孔的microRNA传感器、基于量子点的检测以及基于石墨烯的检测都为microRNA的检测提供的方法。分子信标(MB),是发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针,已被广泛用于检测DNA和RNA,具有很高的灵敏度和特异性,但是MB在活细胞中识别miRNA同源序列的应用仍然鲜有报道。近年来,几种新的miRNA检测方法已被报道,如安培磁力生物传感器、基于水凝胶的微流体方法以及等速电泳方法。虽然,电化学磁敏传感器等在检测miRNA有很高的特异性,但病毒蛋白的选择性识别是必要的。基于芯片上修饰水凝胶的方法和等速电泳法在检测miRNA中被证明是有效的,然而这些技术在检测活细胞中的miRNA的时候是非常复杂和耗时的。荧光原位杂交(FISH)被认为是活细胞中检测基因表达的最常用的方法,但是它的识别单碱基错配的miRNAs的能力是有限的。最近,四嗪介导的转移反应和滚环信号放大的方法已成功地应用于miRNA的检测和成像,然而,这些方法非常繁琐且不容易被广泛使用。因此,亟待需要一个更简单有效的、高度特异性的、敏感的miRNA的检测和成像的方法。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供具有较大张力的小环形核苷酸探针;本发明的目的之二在于提供具有较大张力的小环形核苷酸探针的制备方法;本发明的目的之三在于提供具有较大张力的小环形核苷酸探针在细胞内生物分子的识别与活性调控方面的应;本发明的目的之四在于提供具有较大张力的小环形核苷酸探针在制备定性或定量检测核酸序列的试剂中的应用;本发明的目的之五在于提供含有所述具有较大张力的小环形核苷酸探针的试剂盒。
为实现上述发明目的,本发明提供如下技术方案:
本发明通过设计具有较大张力的小环形核苷酸探针(简称为RP),由闭合小环形核苷酸单链(简称为R)与核苷酸长度短于闭合小环形核苷酸单链的核苷酸短单链(简称为DNAQ)杂交形成;所述小环形核苷酸探针利用闭合小环形核苷酸单链特异识别目标检测物并与目标检测物杂交同时置换出核苷酸短单链;所述闭合小环形核苷酸单链探针与核苷酸短单链标记有相互作用性标记系统,该相互作用性标记系统在目标检测物与核苷酸短单链置换时产生一个或者多个可检测信号,结构如图1所示。由于闭合小环就有较大的环张力,增加的分子识别的难度,提高了识别的专一性;同时“半竞争性链置换”的使用,进一步提高了检测的选择性。此外,目标分子诱导的信号由“OFF”变为“ON”,降低了背景信号,提高了信噪比,并且拓展了其在细胞内的应用。本发明中,检测信号可以为如下方式标记的信号:化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、发光标记、化学发光标记或者金属标记,优选为荧光标记;分别于闭合小环形核苷酸单链标记报道分子或猝灭分子,核苷酸短单链标记相互作用的猝灭分子或报道分子。
本发明的探针检测原理:由于R与DNAQ杂交,相互作用性标记系统以荧光标记为例,荧光报告基团与淬灭基团在荧光能量共转移作用(FRET)下荧光处于“关闭”状态,当目标检测物添加至反应体系中,目标检测物能够与DNAQ发生置换,然后与R杂交,此时荧光报告基团与淬灭基团之间的荧光能量共转移作用(FRET)被消除,荧光报告基团释放荧光从而荧光切换到“开启”状态。但是,如果目标检测物中有一个碱基发生错配时由于来自环形结的张力将不能完全置换出DNAQ链,从而能够区分完全互补序列与单碱基错配序列,并具有高的选择性。所以,本发明的RP可用核酸定性或定量检测,并用于区分完全互补核酸序列和单碱基错配核酸序列,其中核酸可以为DNA、RNA或miRNA。
本发明中,闭合小环形核苷酸单链只要能形成环状即可,优选的,所述闭合小环形核苷酸单链的长度为22~60个碱基。
本发明中,具有较大张力的小环形核苷酸探针的制备方法如下:将A信号标记的核苷酸、肽核酸、锁核酸单链的两端连接形成闭合环状或类似环状结构;然后将所形成闭合环状或类似环状结构与B信号标记的核苷酸长度短于闭合小环形核苷酸单链的核苷酸短单链杂交,得小环形核苷酸探针;
所述A信号与B信号为相互作用性标记系统。
其连接可以采用任意方式连接,优先的通过共价键、疏水相互作用、静电吸引、分子间引力或生物识别连接。
本发明中,利用小环形核苷酸探针具有识别生物分子的能力,因此可以将具有较大张力的小环形核苷酸探针用于制备识别细胞内生物分子识别与生物活性调控的试剂,用于细胞内生物分子的识别与活性调控方面的应用,所述生物分子为DNA、RNA、miRNA、蛋白质或酶中的一种或几种。其中,所述生物分子为DNA、RNA、miRNA或蛋白质。具有较大张力的小环形核苷酸探针还可以用于定性或定量检测核酸序列,所述核酸序列为DNA、RNA或miRNA序列。
为了使用方便将具有较大张力的小环形核苷酸探针作为试剂制备成试剂盒,检测时将环形DNA的探针(RP)直接与目标检测物杂交,然后通过电泳分析或荧光检测,通过信号强度判断目标基因表达量或单碱基错配以及错配位点。
本发明的有益效果在于:本发明公开了具有较大张力的小环形核苷酸探针,将探针设计为环形结构,利用环形结构的较强张力,提高检测特异性和灵敏度,不但能够区分完全互补和错配一个碱基,还能区分单碱基错配位点,并且使用本发明的环形DNA探针不需要提取所检测的DNA或RNA,可直接将探针转染进入活细胞中进行成像分析,达到检测效果,其操作简便,反应条件温和,室温即可,还可以用于识别细胞内或细胞外生物分子以及调控细胞内生物分子表达与活性,应用范围广,具有很好的应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,本发明提供如下附图:
图1为具有较大张力的小环形核苷酸探针结构及检测原理图。
图2为修饰荧光报告基团密封环DNA单链合成路线图(i:三乙胺,溶剂DMSO/H2O,室温(18~25℃),2h;ii:溶剂H2O,室温(18~25℃),1h)。
图3为RP检测完全互补和单碱基变异结果(a:RP加入完全互补或单碱基变异DNA前后荧光光谱(PBS50mM,pH7.4);b:目标DNA链浓度梯度检测(灵敏度检测)结果。
图4为M和RP在室温下分别检测完全互补和单碱基变异序列结果(a:荧光检测结果;b:电泳分析检测杂交信号。
图5为RP检测miR-21含量结果图(a:特异性证明,用RP检测miR-21的家族成员(miR21,miR21a和miR21b)其中miR21a和miR21b分别与miR21单碱基错配,具有高同源性;b:对RP分别与miR21,miR21a和miR21b的杂交的电泳分析;c:RP与miR-21检测的灵敏度实验,误差线代表三次实验结果的标准偏差)。
图6为HeLa、MCF-7和MDA-MB-231三种细胞miR-21含量检测结果(a:用实时定量PCR检测HeLa、MCF-7和MDA-MB-231三种细胞中miR-21的相对含量;b:RP探针检测HeLa、MCF-7和MDA-MB-231细胞中miR-21中的含量,进而成评价RP的特异性,标尺是2μm)。
具体实施方式
下面将结合附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如分子克隆实验指南(第三版,J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
本发明所用的DNA是购自生工生物技术上海有限公司;所有的RNA是从上海吉玛制药技术有限公司购买;所有DNA以及RNA的浓度是在260nm波长下,用1毫升的石英比色皿在Cary60紫外-可见分光光度计中进行检测(安捷伦科技公司,美国)。荧光测量是在一个3毫升的石英比色皿,在室温下使用日立F-7000荧光配备氙气灯光源进行检测。所有的光谱测定在磷酸盐缓冲溶液(50mM,pH=7.4),在激发波长为480nm。水是用微孔滤膜过滤系统(Millipore公司的纯化,Bedford,MA)。一个DYY-6c电泳电源和DYCZ-24D聚丙烯酰胺凝胶电泳(北京六一仪器厂)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析。该图像是由Doc凝胶EZ系统记录(bio-rad)。细胞的荧光图像进行了成像拍照(OlympusIX51)。脂质体2000购自Invitrogen公司(Carlsbad,CA),根据制造商的指示使用。所有其他化学物均为分析级,并被用作从制造商获得的。
实施例1、具有较大张力的小环形核苷酸探针合成
R是制备RP的至关重要的环节,由于DNA是不稳定的,所以寻找一些有效的且温和的反应对DNA做一些修饰,其中不需要Cu2+催化的“clickreaction”是非常有希望的一种反应。通过在修饰荧光报告基团的DNA单链两端分别修饰氨基,得带修饰荧光报告基团且两端修饰有氨基的DNA单链(简称为M),修饰的氨基可以与特殊的活性酯反应,反应获得改性的M(简称为MA),由于MA分子量大于M,所以在聚丙烯酰胺凝胶中MA会比M跑得慢一些,然后将MA与1,3-二叠氮丙烷反应,得到修饰荧光报告基团密封环DNA单链,简称为R,将获得的修饰荧光报告基团密封环DNA单链与修饰淬灭基团的长度短于密封环DNA单链的DNA单短链(DNAQ)进行杂交,即获得环形DNA的探针,简称为RP(图2),合成的具体步骤如下:
(1)1,3-二叠氮丙烷合成:取1,3-二溴丙烷(8.8mmol)和催化量的KI(20mg)加入50mLDMF中,然后慢慢加入(30分钟)叠氮化钠(2g,31mm);盖上铝箔纸避光然后混合物被加热到80℃,反应20h,反应完全后将黄色液体倒在冰/水(250ml)中,然后用DCM萃取三次,合并萃取剂有机相,减压除去溶剂,在室温下获得到产物为无色液体。
(2)MA制备:将修饰荧光报告基团且两端修饰有氨基的DNA单链(M)80℃进行退火20min,然后降温得到发夹结构的MA;由于M链两端修饰的氨基与活性酯(Carbonicacid,11,12-didehydro-5,6-dihydrodibenzo[a,e]cycloocten-5-yl4-nitrophenylester)按摩尔比为1:60进行反应,其中M溶解在ddH2O中,活性酯溶解在二甲基亚砜(DMSO)中,反应时ddH2O与DMSO的体积比为1:2,加入少许三乙胺使三乙胺与M的摩尔比为30:1,室温反应2h。通过PAGE胶验证是否反应完全,反应完全后将反应液用透析盒将DMSO除去,后取出溶液得到改性的M(MA)产物,保存于-20℃,用ESI质谱进行分子量确定,其均重分子量MW为12999.9。
(3)R制备:将1,3-二叠氮丙烷加入MA溶液中使MA与1,3-二叠氮丙烷的摩尔比为1:30的,室温1小时,保存于-20℃得到R备用,采用ESI质谱进行分子量确定,其均重分子量MW为13126.0。
(4)RP制备:修饰荧光报告基团密封环DNA单链与修饰淬灭基团的DNA短单链(DNAQ)进行杂交,即获得环形DNA探针。
合成RP过程中也可以在密封环DNA单链上修饰淬灭基团,DNA短单链上修饰荧光报告基团。
本实施例的RP即可通过电泳分析,也可通过荧光检测,电泳分析是在RP与DNA或者RNA杂交过程中采用质量分数为16%的非变性聚丙烯酰胺凝胶,190V电压下电泳1h,后采用EB进行染色,最后用凝胶成像系统成像进行观测;荧光检测的缓冲溶液是PBS(50mM,pH7.4),激发波长是480nm,该检测条件适用于单碱基错配的检测。
实施例2、具有较大张力的小环形核苷酸探针进行DNA检测
为证明实施例1合成的RP可以作为探针进行目标链检测,按照实施例1合成RP进行DNA检测,其中M的序列为5’-NH2-gcgag/i6FAMdT/gctcaacatcagtctgataagctaccactcgc-NH2-3’,DNAQ的序列为5’-tcagactgatgttgagca/BHQ1-3’。
同时合成目标检测链,具体序列如下:
Com完全互补:5’-tagcttatcagactgatgttga-3’(SEQIDNO.1);
1TNC:5’-tagcttatcagactgaggttga-3’(SEQIDNO.2);
1HNC:5’-tagcttatgagactgatgttga-3’(SEQIDNO.3)
将合成的目标链分别加入含RP的PBS(50mM,pH7.4)缓冲液中,在激发波长为480nm处进行荧光检测,结果如图3中a所示。结果显示,当目标检测链为互补DNA(COM)时,RP荧光得到极大地恢复,然而,当目标检测链为单碱基错配DNA(1TNC和1HNC)时,RP荧光仅很少的恢复。
在核酸检测中探针的灵敏度也是很重要的,从而进一步探讨RP的灵敏度,分别向RP中加入完全互补链使其终浓度为6.25nM、12.5nM、18.75nM、25nM、37.5nM的,结果如图2中b所示。结果显示,目标检测链浓度低至6nM的仍然可以使用标准的日立F-7000荧光检测,证明本发明的检测探针的灵敏度好。
为了研究环形DNA探针的优越性,将M和RP在室温下分别检测完全互补和单碱基变异序列,通过荧光检测和电泳分析检测杂交信号,结果如图4所示。由图4可知,M组在室温下识别单碱基错配的DNA序列差别不大(图4中a和c),而以RP为探针的这一组完全互补的DNA链与单碱基错配的DNA链得到的信号有很大的区别(图4中b和d)。表明本发明所设计的RP探针在与碱基错配的杂交时信号存在差异,并且单碱基错配的位置也能够被区分,如本实施例中1TNC比1HNC更难被检测,因此该方法在对microRNA检测中是非常重要,也非常有意义。
实施例3、具有较大张力的小环形核苷酸探针进行miRNA检测
1、RP用于miRNA检测
由于在一个家族中的miRNA可以相差一个碱基的不同,因此对miRNA的检测难度较大,特别是区分相似的miRNA序列更具有挑战性的。实施例2已经证明RP具有良好的DNA检测特异性和灵敏度,本实施例将RP用于内源性miRNA的检测。为证明RP能够检测miRNA,本实施例以检测miRNA-21(miR-21)为例,miR-21为22个核苷酸的RNA,过量表达的miR-21与各种各样的癌症相关,特别是乳腺癌细胞中,因此miR-21检测具有很大的临床诊断价值。它是被首先证明与原癌基因有关的基因之一。具体检测方法为:使用实施例1合成RP,然后向检测体系中分别加入相同浓度的miR-21、miR-21a和miR-21b,同时进行荧光检测和电泳分析,结果如图5中a和b所示。结果显示,RP可以很容易地区分miR-21中有一个碱基错配,且差异甚至达到5倍;并且miR-21a与miR-21b之间也差异,表明RP还可以识别miRNA不同单碱基错配位点。在miRNA检测中除了选择性是评估检测的重要指标,灵敏度也至关重要。为证明RP的灵敏度,采用RP分别检测不同浓度的miR-21,结果如图5中c所示。结果显示,发光强度随浓度的增加而增加,并且在miR-21浓度为0.5pmol能够检测出荧光信号,表明RP检测miRNA的灵敏度能达到0.5pmol,进一步证明了RP检测miRNA具有优势。
上述miR-21、miR-21a和miR-21b的核苷酸序列如下:
miR-21:5’-uagcuuaucagacugauguuga-3’(SEQIDNO.4);
miR-21a:5’-uagcuuaucagacugagguuga-3’(SEQIDNO.5);
miR-21b:5’-uagcuuaugagacugauguuga-3’(SEQIDNO.6)。
本实施例以检测MCF-7,MDA-MB-231和Hela细胞中miRNA-21为例证明RP可以用于miRNA检测。Hela和MCF-7细胞采用DMEM(高糖培养基),10%胎牛血清血清(FBS,HyClone,Logan,UT,USA),含质量分数1%的青霉素和链霉素。MDA-MA-231细胞是采用L-15培养基其他条件同上;培养条件是在37℃、5%CO2条件下培养。
(1)miRNA提取以及实时定量检测miRNA-21
首先采用试剂盒RNAisoforSmallRNA(Takara),按照说明书提取三种细胞中的smallRNA;然后进行逆转录以及实时定量PCR均按照说明书进行(Mir-XmiRNAqRT-PCRSYBRKits(Clontech)),其中荧光定量检测miRNA-21的引物为:5’-tagcttatcagactgatgttga-3’(SEQIDNO.7),逆转录条件是:37℃,1h;然后85℃,5min使酶失活,将得到的cDNA稀释10倍;再用实时定量PCR检测miRNA-21的相对含量,并使用U6为内参基因,反应条件是:2μlcDNA其余试剂按照说明书进行,95℃变性15s,接下来进行40个循环的95℃变性20s、60℃退火20s,然后计算miRNA-21的相对含量。
(2)RP检测MCF-7、MDA-MB-231和Hela细胞miRNA-21
用RP检测MCF-7,MDA-MB-231和Hela三种细胞中的miRNA-21。检测具体步骤如下:提前一天将三种细胞分别接种在96孔板,大约1×105细胞数/孔(总体积100μl)。然后用脂质体2000将RP转染进入细胞,6h后吸出培养基,然后用PBS洗涤3次。用Hoechst33342进行核染色,最后用显微镜在不同波长下进行观测成像,结果如图6所示。结果显示,MCF-7和MDA-MB-231两种细胞显示强荧光染色,显示这两种细胞相对高表达位点,并且MDA-MB-231细胞高于MCF-7细胞,表明MDA-MB-231细胞中miRNA-21表达量更高。而在HeLa细胞中检测到更少的荧光,表明HeLa细胞中miRNA-21表达量较低。该检测结果与RT-qPCR检测的结果一致,表明RP能够用于检测细胞中miRNA,无需提取RNA。
本发明具有较大张力的小环形核苷酸探针能够在细胞内特异识别生物分子,如DNA、miRNA、RNA,因此能够在细胞内沉默基因表达或调控分子活性,所以可以用于细胞内生物分子的识别与活性调控。
最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.具有较大张力的小环形核苷酸探针,其特征在于:所述小环形核苷酸探针由闭合小环形核苷酸单链与核苷酸长度短于闭合小环形核苷酸单链的核苷酸短单链杂交形成;所述小环形核苷酸探针通过闭合小环形核苷酸单链识别目标检测物并杂交置换核苷酸短单链;
所述闭合小环形核苷酸单链探针与核苷酸短单链标记有相互作用性标记系统,该相互作用性标记系统在目标检测物与核苷酸短单链置换时产生一个或者多个可检测信号。
2.根据权利要求1所述具有较大张力的小环形核苷酸探针,其特征在于:所述闭合小环形核苷酸的长度为22~60个碱基。
3.根据权利要求1所述具有较大张力的小环形核苷酸探针,其特征在于:所述可检测信号通过如下方式标记:化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、发光标记、化学发光标记或者金属标记。
4.权利要求1~3任一项所述具有较大张力的小环形核苷酸探针的制备方法,其特征在于:具体步骤是将A信号标记的核苷酸、肽核酸、锁核酸单链的两端连接形成闭合环状或类似环状结构;然后将所形成闭合环状或类似环状结构与B信号标记的核苷酸长度短于闭合小环形核苷酸单链的核苷酸短单链杂交,得小环形核苷酸探针;
所述A信号与B信号为相互作用性标记系统。
5.根据权利要求4所述具有较大张力的小环形核苷酸探针的制备方法,其特征在于:所述连接可以通过共价键、疏水相互作用、静电吸引、分子间引力或生物识别连接。
6.权利要求1~3任一项所述具有较大张力的小环形核苷酸探针在细胞内生物分子的识别与活性调控中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述生物分子为DNA、RNA、miRNA、小分子、蛋白质或酶中的一种或几种。
8.权利要求1~3任一项所述具有较大张力的小环形核苷酸探针在制备定性或定量检测核酸序列的试剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于:所述核酸序列为DNA、RNA或miRNA序列。
10.含有权利要求1~3任一项所述具有较大张力的小环形核苷酸探针的试剂盒。
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Cited By (2)
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CN108132241A (zh) * | 2017-12-25 | 2018-06-08 | 汕头大学医学院 | 一种利用SOL技术和化学发光技术对血清miRNA标志物进行定量检测的方法 |
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CN1468251A (zh) * | 2000-10-10 | 2004-01-14 | 纽约市公共卫生研究院有限公司 | 一种用于均相检测核酸的特异性双链探针及其实施方法 |
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2016
- 2016-01-12 CN CN201610019655.2A patent/CN105506126B/zh not_active Expired - Fee Related
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