CN104611453B - 诊断基因甲基化的探针组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及诊断基因甲基化的探针组及其应用。本发明揭示了一种优化的基因甲基化探针制备方法，通过在甲基化探针的特定位置引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基，得到优化的甲基化检测探针，其既能够和完全甲基化的样本DNA结合，又能够容忍结合区段内存在1‑2个非甲基化的位点，从而有效提高对不完全甲基化样本的检测效率。

Description

诊断基因甲基化的探针组及其应用
技术领域
本发明属于基因检测领域，更具体地，本发明涉及诊断基因甲基化的探针组及其应用。
背景技术
DNA甲基化是基因表观修饰方式之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。哺乳动物中，DNA的甲基化仅发生于CpG的胞嘧啶上，在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’甲基胞嘧啶(mC)。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它可以调控基因的表达。DNA甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制，其在维持正常细胞功能、染色质结构修饰、X染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。
哺乳动物基因组中的CpG序列出现的频率仅有1％左右，远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在某些区域中，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为胞嘧啶和鸟嘌呤的富集区，形成所谓的CpG岛。CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区。健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的。当肿瘤发生时，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，以至于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。
目前研究DNA甲基化的方法主要有：1.甲基化敏感性内切酶法；2.重亚硫酸盐(Bisulfite)修饰法；3.特异性识别甲基化抗体分析法；4.质谱或色谱分析法等。其中重亚硫酸盐修饰法是目前应用最为广泛的CpG甲基化检测方法。该方法采用Na2S2O5处理样本DNA，将未发生甲基化的C转化为U，而发生甲基化的mC保持不变；经过PCR扩增后，U转变为T，而mC转变为C，从而使基因组上的甲基化/非甲基化转变为C/T(Y)多态性，通过检测目标位点上的C/T状态，可以确定是否存在基因的甲基化。
基于重亚硫酸盐修饰的甲基化检测方法多种多样，比如BSP克隆测序法、荧光PCR法、芯片杂交法等。其中荧光PCR法和芯片杂交法都需要通过特异性的甲基化探针和非甲基化探针来识别目标位点的甲基化状态。对于目标区段完全甲基化和完全非甲基化的样品，常规的甲基化探针和非甲基化探针可以有效地加以鉴别。由于生物样品本身的复杂性，很多样本中存在不完全甲基化的状态，它们的重亚硫酸盐修饰产物既不能与甲基化探针完全配对，又不能与非甲基化探针完全配对，按常规设计的甲基化探针不能有效检测出此类样本。
因此，需要开发新的基因甲基化探针设计方法，以便更加全面、有效地检测基因的甲基化状态。
发明内容
本发明的目的在于提供诊断基因甲基化的探针组及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种制备检测基因甲基化的探针的方法，所述的方法包括：
(1)根据待测基因经过重亚硫酸盐处理后的甲基化区域序列，设计与该区域完全互补的基础探针；
(2)用脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基(I)替换基础探针中部分与待测基因经过重亚硫酸盐处理后的甲基化区域中甲基化胞嘧啶(mC)相配对的鸟嘌呤碱基(G)；根据甲基化胞嘧啶所在位置，合成多条(包括2-6条)探针，每一探针上脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基所在位置不同。
在一个优选例中，步骤(2)合成：探针组1，其中包括：
探针a，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-I-G-I…顺序排布；和
探针b，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-G-I-G…顺序排布。
在另一优选例中，步骤(2)合成探针组2，其中包括：
探针c，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-G-I-I…顺序排布；
探针d，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-I-I-G…顺序排布；
探针e，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-I-G-G…顺序排布；和
探针f，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-G-G-I…顺序排布。
在另一优选例中，所述的探针的长度为15-60个碱基；较佳地为20-40个碱基(如25个，30个，35个碱基)。
在另一优选例中，所述探针针对待测基因的甲基化区域中4-10甲基化胞嘧啶(mC)；较佳地，所述探针针对待测基因的甲基化区域中4-7个甲基化胞嘧啶(mC)。
在另一优选例中，所述的基因是O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶基因，所述的探针是核苷酸序列如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:8所示的探针。
在另一优选例中，所述的探针还携带有可检测标记物，较佳地为荧光标记物。
在本发明的另一方面，提供一种非诊断性地检测基因甲基化的方法，所述方法包括：
(i)以所述的方法制备检测基因甲基化的探针；所述的探针还携带有可检测标记物；
(ii)以经过重亚硫酸盐处理后的基因样本，采用PCR法、基因芯片法或膜杂交法检测探针与该基因样本的结合情况，从而获得待测基因的甲基化情况。
在一个优选例中，所述的可检测标记物是荧光标记物，步骤(ii)中，利用能扩增出待测基因经过重亚硫酸盐处理后的甲基化区域的引物对以及(i)的探针进行荧光PCR法检测，从而获得待测基因的甲基化情况。
在本发明的另一方面，提供一种检测基因甲基化的试剂盒，所述的试剂盒中包括：根据所述的方法制备的探针；较佳地，包括：
探针组1，其中包括：探针a，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-I-G-I…顺序排布；探针b，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-G-I-G…顺序排布；和/或
探针组2，其中包括：探针c，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-G-I-I…顺序排布；探针d，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-I-I-G…顺序排布；探针e，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-I-G-G…顺序排布；探针f，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-G-G-I…顺序排布。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、本发明的甲基化探针设计示意图。
图2、本发明探针鉴别完全甲基化/非甲基化样本。
图3、本发明探针和1个非甲基化位点的结合。
图4、本发明探针和2个非甲基化位点的结合。
图5、采用三种荧光PCR体系，分别扩增：完全甲基化样本、含1个非甲基化位点的部分甲基化样本、含2个非甲基化位点的部分甲基化样本和非甲基化样本的荧光扩增曲线。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了一种优化的基因甲基化探针制备方法，通过在甲基化探针的特定位置引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基(I)，得到优化的甲基化检测探针，其既能够和完全甲基化的样本DNA结合，又能够容忍结合区段内存在1-2个非甲基化的位点，从而有效提高对不完全甲基化样本的检测效率。
如本文所用，“样本”或“样品”需进行DNA甲基化状态检测的核酸物质，其可以来自于个体(如人或动物)，也可以是其它来源的，例如一些经扩增或未经扩增的实验室核酸材料，或人工合成的测试品。应理解，对“样本”或“样品”的检测并非仅涉及诊断目的，还可涉及其它非诊断目的。
如本文所用，“互补”的序列通常是指将5’-3’方向的序列转换为其3’-5’方向的序列(如5’ATCG 3’→GCTA)，然后再取其互补序列(如GCTA→5’CGAT 3’)。
“互补”包括“基本上互补”，所述“基本上互补”是指两段核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的碱基是互补的；优选的，至少有80％的碱基是互补的；更优选的，至少有90％的碱基是互补的；进一步优选的，至少有95％的碱基是互补的；如96％、98％。
如本文所用，“完全互补”是指两条“互补”的核苷酸序列之间有100％的碱基是互补的。
如本文所用，碱基的“配对”是指两条序列中相应的碱基构成了键(如氢键)的连接。两条序列中足够多(如多于70％、80％或90％的碱基是配对的)碱基的“配对”使得两条序列发生互补。本发明中，除非另外说明，配对碱基之间结合力的强弱以“|||”、“||”或“│”表示；反之，碱基的不配对以“X”表示。
本发明基于重亚硫酸盐修饰的甲基化检测方法，DNA样本经过Na2S2O5处理后，未发生甲基化的C转化为U，而发生甲基化的mC保持不变，经过PCR扩增后，U转变为T，而mC转变为C，从而使甲基化/非甲基化转变为C/T(Y)多态性，通过检测甲基化探针与重亚硫酸盐修饰产物的结合情况，可以明确样本DNA的甲基化状态。
本发明的技术方案如下：根据待测基因经过重亚硫酸盐处理后的甲基化区域序列，设计与该区域完全互补的基础探针；用脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基(I)替换基础探针中部分与待测基因经过重亚硫酸盐处理后的甲基化区域中甲基化胞嘧啶(mC)相配对的鸟嘌呤碱基(G)；根据甲基化胞嘧啶所在位置，合成多条探针，每一探针上脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基所在位置不同。
作为本发明的优选方式，合成两组探针，即探针组1和探针组2，其中，探针组1包括：探针a，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-I-G-I…顺序排布；和探针b，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-G-I-G…顺序排布。探针组2包括探针c，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-G-I-I…顺序排布；探针d，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-I-I-G…顺序排布；探针e，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-I-G-G…顺序排布；和探针f，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-G-G-I…顺序排布。
一种直观的甲基化探针的设计示意图如图1。在确定所需检测的DNA模板后，进一步获得重亚硫酸盐修饰的序列，基于此获得与之完全互补的基础探针。根据该基础探针，进一步改造为不同位置上的鸟嘌呤碱基(G)被脱氧次黄嘌呤核苷酸(I)替换的探针组。较佳地，探针组1和探针组2中所包含的6条探针的长度一致，不同之处在于碱基I和G的排列方式。当其中的一条探针和DNA模板结合后，会对其它的探针产生排斥，所以在杂交反应过程中，碱基互补配对最强的探针总是会优先结合在目标DNA模板上。
次黄嘌呤核苷酸碱基(I)是一种鸟嘌呤碱基(G)的类似物，可以和胞嘧啶(C)配对结合。鸟嘌呤碱基(G)和胞嘧啶(C)之间通过3个氢键配对结合，而次黄嘌呤碱基(I)上缺少一个胺基，只能和胞嘧啶(C)形成2个氢键，尽管G∶C碱基对的结合力要高于I∶C碱基对的结合力，但在GC含量丰富的甲基化探针中，用I代替一部分G，可以有效地降低杂交体的Tm值，提高甲基化检测的特异性。次黄嘌呤核苷酸碱基(I)的另一个特性是可以和A、G、C和T四种碱基配对结合，其中I∶C碱基对的结合力最强，I∶T、I∶A和I∶G碱基对的结合力则要弱于I∶C碱基对。
本发明的探针中G和I按特定的排列方式交替出现，G和I均能和甲基化的C碱基配对结合，可以检测出完全甲基化的样本。对于非甲基化的样本，G和I对应的碱基为胸腺嘧啶(T)，G、T之间不能配对结合，I∶T之间的结合力较弱，所以探针和非甲基化DNA之间不会产生杂交信号，如图2。
依照本发明设计的探针特别适用于检测不完全甲基化的样本。当目标区段中存在任意1个非甲基化位点时，总能从探针组1中找到一条探针，使非甲基化的T和I配对结合，甲基化的C和G或I配对结合，如图3。当目标区段中存在任意2个非甲基化位点时，也总能从探针组1或2中找到一条探针，使2个非甲基化的T都和I配对结合，甲基化的C与G或I配对结合，如图4。
本发明所述探针长度优选为15-60个碱基，覆盖基因组上4-10个甲基化位点；较佳地为20-40个碱基，包含4-7个甲基化位点。依据检测方法的差异，探针的5’和3’端可以连接可检测标记物。所述的可检测标记物包括但不限于：荧光标记、生物素标记、磷酸化、氨基化、巯基化等，较佳地为荧光标记物。
本发明中的探针组1可以在检测体系中单独使用，此时可以有效检测目标区段内CpG位点完全甲基化的样本，以及目标区段内包含1个非甲基化位点的样本。探针组1和探针组2也可以配合使用，此时可以有效检测目标区段内包含1-2个非甲基化位点的样本。
本发明的探针设计方法适用于检测样本DNA中的甲基化状态，尤其适用于检测不完全甲基化的样本。
在获得了本发明的探针后，很显然，本领域人员可以将之应用于任何藉由探针实现甲基化检测的方法中。所述方法包括但不限于：荧光PCR检测、基因芯片检测、膜杂交检测等多种甲基化检测方法。
在获得了本发明的探针后，为了便于使用和商品化，可以将所述的探针集成于一个试剂盒中。因此，本发明还包括了包含本发明的探针的试剂盒。
较佳地，所述的试剂盒中还可包含其它配合所述探针的检测试剂。例如当该试剂盒是一种荧光PCR试剂盒时，其中还可包括特异性扩增待测基因的特定甲基化区域的引物对，以及PCR缓冲液等试剂。
较佳地，所述的试剂盒中还可包括说明所述的探针的使用方法的使用说明书，以用于指导本领域技术人员正确地使用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、MGMT基因的甲基化水平检测实例
本实施例以本发明方法设计甲基化探针，结合荧光PCR技术，检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)基因的甲基化。MGMT基因位于第10号染色体10q26位置，其功能是将O6-鸟嘌呤加合物从DNA上移除，对损伤的DNA进行修复。当MGMT基因启动子区的CpG位点发生甲基化时，MGMT转录停止，鸟嘌呤-O6上的甲基基团转移失败，导致不能有效修复DNA烷化损伤，与肿瘤发生密切相关。研究结果表明：MGMT启动子甲基化与一线化疗药物替莫唑胺的临床效果密切相关。一般认为，MGMT甲基化的肿瘤细胞对烷化剂类药物有效；而MGMT基因非甲基化则意味着对烷化剂耐药。MGMT基因的甲基化水平可作为胶质瘤患者化疗敏感及预后好的预测指标。
1、探针设计
MGMT基因启动子区部分序列如下：
CCCCGCCCCACGCCGCCATCCCCGTGCCCCTCGGCCCCGCCCCCGCGCCCCGGATATGCTGGGACAGCCCGCGCCCCTAGAACGCTTTGCGTC CACCGTTTGCGACTTGGTGAGTGTCTGGGTCGCCTCGCTCCCGGAAGAGTGCG(SEQ ID NO:1)
经过重亚硫酸盐即Na2S2O5处理后序列如下：
TTTYGTTTTAYGTYGTTATTTTYGTGTTTTTYGGTTTYGTTTTYGYGTTTYGGATATGTTGGGATAGTTYGYGTTTTTAGAAYGTTTTGYGTT TATYGTTTGYGATTTGGTGAGTGTTTGGGTYGTTTYGTTTTYGGAAGAGTGYG(SEQ ID NO:2)
其中的方框区段含有6个CpG甲基化位点，常规探针MGMT-P0序列为：5’-CCACCCAAAACCTACAACTCA，可以和目标区段配对结合。
依据本发明的方法，设计出两组新型荧光探针，探针组1序列如下：
MGMT-P1-1：5’-CCACCCAAAACCTACAACTCA-3’(SEQ ID NO:3)；
MGMT-P1-2：5’-CCACCCAAAACCTACAACTCA-3’(SEQ ID NO:4)。
探针组2序列如下：
MGMT-P2-1：5’-CCACCCAAAACCTACAACTCA-3’(SEQ ID NO:5)；
MGMT-P2-2：5’-CCACCCAAAACCTACAACTCA-3’(SEQ ID NO:6)；
MGMT-P2-3：5’-CCACCCAAAACCTACAACTCA-3’(SEQ ID NO:7)；
MGMT-P2-4：5’-CCACCCAAAACCTACAACTCA-3’(SEQ ID NO:8)。
探针长27个碱基，包含6个甲基化位点，全部采用5’-FAM+3’-BHQ1标记。
2、MGMT甲基化荧光PCR检测体系
依据通用引物设计原则，设计一对PCR引物，分别为：
MGMT-F：GTTTYGGATATGTTGGGATAG(SEQ ID NO:9)；和
MGMT-R：CRACCCAAACACTCACCAAAT(SEQ ID NO:10)。
采用荧光PCR法检测目标位点的甲基化状态，共配制三个荧光PCR体系，其中第一个反应体系使用常规探针MGMT-P0，第二个反应体系使用探针组1的两条探针，第三个反应体系同时使用探针组1和探组针组2的六条探针。
30uL PCR反应体系中包含：1×PCR buffer、2mM MgCl2、200μM dNTP，0.5uM PCR引物、0.2uM荧光探针1.25U Taq DNA聚合酶和20ng模板DNA。
运行如下扩增程序：
第一阶段：95℃3分钟，1个循环；
第二阶段：95℃15秒，60℃60秒，45个循环；
信号收集：第二阶段60℃时收集FAM荧光信号，每个循环收集一次荧光。
3、三种荧光PCR体系对不同类型样本的扩增结果
采用三种荧光PCR体系，分别扩增：完全甲基化样本(SEQ ID NO:2，其中所有的Y位点都甲基化)、含1个非甲基化位点的部分甲基化样本(SEQ ID NO:2，但其方框序列中第4个Y位点未甲基化)、含2个非甲基化位点的部分甲基化样本(SEQ ID NO:2，但其方框序列中第3、4个Y位点未甲基化)、和非甲基化样本(SEQ ID NO:2，其中所有的Y位点都未甲基化)，结果见图5。常规探针只能有效检测完全甲基化的样本，对含有1个或2个非甲基化的部分甲基化样本的检测效果不佳。探针组1既可以检测完全甲基化样本，对含有1个非甲基化位点的样本也可以有效检测。探针组1和2配合使用，则可以检测完全甲基化、以及包含1-2个非甲基化位点的样本。
实施例2、三种荧光PCR体系对脑胶质瘤样本的检测实例
取临床确诊的脑胶质瘤石蜡组织样本80例，制成5-10um的切片。取切片3-5张至1.5mL离心管中，经二甲苯脱蜡后，加入180μl DNA提取液和20μl蛋白酶K溶液，56℃消化至没有可见组织块；加入300μl GDT缓冲液，混匀后70℃孵育10分钟；加入300μl无水乙醇，混匀后转移至离心柱中，离心1分钟，弃收集管内的滤液；加入700μl洗涤液PW，8000转/分钟离心1分钟，弃滤液；向离心柱内加入700μl洗涤液WA，8000转/分钟离心1分钟，弃滤液；甩干离心柱中残留液体(12000转/分钟离心2分)；向离心柱内的膜中央加入100μlDNA洗脱液，室温放置1分钟后8000转/分钟离心2分钟，所得样本即为肿瘤组织DNA样本。测定OD值后将样本DNA稀释至浓度为20ng/uL备用。
取样本DNA 30uL进行重亚硫酸盐修饰，最终产物溶解于30uL TE缓冲液中。分别采用三种荧光PCR体系检测样本的甲基化状态，结果见表1。常规探针检测MGMT甲基化的阳性率为46.25％，探针组1测得的MGMT甲基化阳性率为52.50％，探针组1+2的阳性率则达到56.25％。
表1
检测结果表明，采用本发明的探针设计方法，可以有效提高脑胶质瘤样本中MGMT甲基化的检出率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (13)

1.一种制备检测基因甲基化的探针的方法，其特征在于，所述的方法包括：
(1)根据待测基因经过重亚硫酸盐处理后的甲基化区域序列，设计与该区域完全互补的基础探针；
(2)用脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基替换基础探针中部分与待测基因经过重亚硫酸盐处理后的甲基化区域中甲基化胞嘧啶相配对的鸟嘌呤碱基；根据甲基化胞嘧啶所在位置，合成多条探针，每一探针上脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基所在位置不同；所述的探针是探针组1，其中包括：
探针a，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-I重复的顺序排布；和
探针b，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-G重复的顺序排布。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，还合成探针组2，其中包括：
探针c，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-G-I-I重复的顺序排布；
探针d，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-I-I-G重复的顺序排布；
探针e，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-I-G-G重复的顺序排布；和
探针f，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-G-G-I重复的顺序排布。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的探针的长度为15-60个碱基。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的探针的长度为20-40个碱基。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针针对待测基因的甲基化区域中4-10甲基化胞嘧啶。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述探针针对待测基因的甲基化区域中4-7个甲基化胞嘧啶。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因是O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶基因，所述的探针是核苷酸序列如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:8所示的探针。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的探针还携带有可检测标记物。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可检测标记物为荧光标记物。
10.一种非诊断性地检测基因甲基化的方法，其特征在于，所述方法包括：
(i)以权利要求1-5任一所述的方法制备检测基因甲基化的探针；所述的探针还携带有可检测标记物；
(ii)以经过重亚硫酸盐处理后的基因样本，采用PCR法、基因芯片法或膜杂交法检测探针与该基因样本的结合情况，从而获得待测基因的甲基化情况。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的可检测标记物是荧光标记物，步骤(ii)中，利用能扩增出待测基因经过重亚硫酸盐处理后的甲基化区域的引物对以及(i)的探针进行荧光PCR法检测，从而获得待测基因的甲基化情况。
12.一种检测基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：
探针组1，其中包括：探针a，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-I重复的顺序排布；探针b，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-G重复的顺序排布。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：
探针组2，其中包括：探针c，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-G-I-I重复的顺序排布；探针d，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-I-I-G重复的顺序排布；探针e，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-I-G-G重复的顺序排布；探针f，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-G-G-I重复的顺序排布。
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