CN107385056A - 一种检测SEPT9基因不同Cpg岛甲基化的试剂盒及应用 - Google Patents

一种检测SEPT9基因不同Cpg岛甲基化的试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测SEPT9基因不同Cpg岛甲基化的试剂盒及应用。所述试剂盒中含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1—6所示的探针。所述试剂盒中的探针可用于制备结直肠癌检测试剂。

Description

一种检测SEPT9基因不同Cpg岛甲基化的试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测SEPT9基因不同Cpg岛甲基化的试剂盒及应用。
背景技术
DNA甲基化是基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。哺乳动物中，DNA的甲基化仅发生于CpG的胞嚓陡上，在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核甘酸5’端的胞嚓陡转变为5’甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它可以调控基因的表达。DNA甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制，其在维持正常细胞功能、染色质结构修饰、X染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。
结直肠癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，全球每年新发病例数约为120万，年病死人数超过60万。发病率仅次于肺癌和乳腺癌，位居恶性肿瘤第3位，病死率居第4位。近年来，其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。WHO统计数据表明，结直肠癌患者的5年生存率在北美国家约为60％，而我国仅有32％。我国在结直肠癌诊断、治疗水平上，与发达国家相比还存在较大的差距。研究认为，5年生存率与诊断时疾病的严重程度具有明显的相关性，进展期患者的5年生存率不到10％，而早期诊断的结直肠癌患者的5年生存率则可达90％以上。因此，早发现、早诊断、早治疗对于提高结直肠癌治疗效果具有重大意义。
Septin蛋白是一类具有鸟普三磷酸激酶(GTPase)活性的蛋白家族，在人体内参与了一系列的重要生理过程，如细胞内物质运输、细胞分裂以及细胞凋亡等。人体内编码septin蛋白的基因共有13种。其中septin 9基因(SEPT9)位于第17号染色体的17q25位置，全长219kb，一共有18种不同的剪接产物，可以编码15种多肤。这些变异剪接体的分布具有组织特异性。最近的研究结果显示，SEPT9基因的甲基化(尤其是位于SEPT9基因V2剪接体启动子区CpG岛的甲基化)与结直肠癌的发生和发展密切相关。它可以作为结直肠癌早期诊断的一个特异性分子标记。因此，检测SEPT9基因的甲基化状态，对结直肠癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。
目前研究DNA甲基化的方法主要有：1.甲基化敏感性内切酶法；2.重亚硫酸盐(Bisulfitc)修饰法；3.特异性识别甲基化抗体分析法；4.质谱或色谱分析法等。其中重亚硫酸盐修饰法是口前应用最为广泛的CpG甲基化检测方法。该方法采用Na2S2O5处理样本DNA，将未发生甲基化的C转化为U，而发生甲基化的保持不变；经过PCR扩增后，U转变为T，而甲基化的C转变为C，从而使基因组上的甲基化/非甲基化转变为C/T(Y)多态性，通过检测目标位点上的C/T状态，可以确定是否存在基因的甲基化。
基于重亚硫酸盐修饰的甲基化检测方法多种多样，比如BSP克隆测序法、荧光PCR法、芯片杂交法等。其中荧光PCR法和芯片杂交法都需要通过使用甲基化探针来识别目标位点的甲基化状态。通常情况下，甲基化探针基于完全甲基化的基因序列而设计，即检测区段内所有的CpG位点都采用G碱基与甲基化的C碱基互补配对，所以只能有效检测完全甲基化的样品。肿瘤的发生、发展是一个极为复杂的过程，肿瘤细胞具有明显的异质性特征。不同的肿瘤细胞处在不同的发育阶段，导致肿瘤细胞中SEPT9基因的甲基化程度随发育进程不断变化。但该基因的CpG岛有很多，是否每个CpG岛都对疾病的诊断都有直接的相关性、是否其中某个CpG岛和疾病发生的严重程度都有直接相关性，现在还没有非常权威的研究证据能够说明。
目前有很多检测SEPT9基因全部CpG岛的试剂盒进行检测，但没有一种试剂盒能对具体的某个CpG岛进行分型检测，故很难获得CpG岛位点和疾病的相关性的信息并开展研究。因此，需要开发新的SEPT9基因具体CpG岛甲基化的试剂盒，以便作为一种直观的工具更加全面、有效地检测和了解基因的甲基化具体信息，以便研究与疾病的相关性。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种检测SEPT9基因不同Cpg岛甲基化的试剂盒及应用。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述检测SEPT9基因不同Cpg岛甲基化的试剂盒中含有核苷酸序列如SEQ IDNO.1—6所示的探针。
优选地，所述探针携带检测标记物。
更优选地，所述检测标记物为：5’端标记FAM，3’端标记MGB荧光标记。
优选地，所述试剂盒中还包括SEPT9基因的PCR扩增引物。
更优选地，所述SEPT9基因的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7—8所示。
优选地，所述试剂盒中还包括ACTB基因的PCR扩增引物和特异性检测ACTB基因的探针，所述ACTB基因为内参。
更优选地，所述ACTB基因的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9—10所示；所述特异性检测ACTB基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
优选地，所述ACTB基因的PCR扩增引物和特异性检测ACTB基因的探针携带检测标记物。
更优选地，所述ACTB基因的PCR扩增引物的5’端标记VIC荧光标记,3’端标记BHQI荧光标记。
所述试剂盒中的探针(SEQ ID NO.1—6)可用于制备结直肠癌检测试剂。
下面对本发明作进一步说明：
本发明的发明人经过深入的研究，揭示了一种优化的检测SEPT9基因具体某CpG岛甲基化的探针，通过通过设计5条特异的MGB探针，在探针的其他可能发生甲基化位置引入脱氧次黄镖吟核苷酸碱基(N)，得到优化的SEPT9甲基化检测探针，其既能够和针对目的CpG岛位点的完全甲基化的样本DNA结合，又能够容忍结合区段内存在1-2个非甲基化的位点，从而有效提高对不完全甲基化样本的检测效率。
本发明基于重亚硫酸盐修饰的甲基化检测方法，DNA样本经过Na2S2O5处理后，未发生甲基化的C转化为U，而发生甲基化的C保持不变，经过PCR扩增后，U转变为T，而甲基化的C转变为C，从而使甲基化/非甲基化转变为C/T(Y)多态性，通过检测甲基化探针与重亚硫酸敖修饰产物的结合情况,可以明确样本DNA的甲基化状态。
本发明根据SEPT9基因经过重亚硫酸盐处理后的甲基化区域序列，选择一段包含5个CpG位点的区域：(5'-TYGGATTTYGYGGTTAAYGYG-3'，其中YG代表CpG位点)作为甲基化探针结合区：设计5条与目标区段互补的甲基化MGB探针：
探针1：5'-GNGATTNGTTGTTTATTAGTTATTATGT-3'(SEQ ID NO.1)
探针2：5'-GTTGTTTATTAGTTATTATGTNGGATTT-3'(SEQ ID NO.2)
探针3：5'-TTATTAGTTATTATGTNGGATTTNG-3'(SEQ ID NO.3)
探针4：5'-AAATAATCCCATCCAACTACNC-3'(SEQ ID NO.4)
探针5：5'-CNAAATAATCCCATCCAACTAC-3'(SEQ ID NO.5)
探针6：5'-GTNGGATTTNGNGGTTAANGNG-3'(SEQ ID NO.6)
目的序列设计
在获得了本发明的探针后，为了便于使用和商品化，可以将所述的探针集成于一个试剂盒中。因此，本发明还包括了包含本发明的探针的试剂盒。例如当该试剂盒是一种荧光PCR试剂盒时，其中还可包括特异性扩增SEPT9基因的特定甲基化区域的引物对，用于扩增外控基因的引物和探针，以及PCR缓冲液等试剂。
用于扩增SEPT9基因具体某CpG岛甲基化片段的PCR引物，序列如下：
上游引物：5'-TAGGGTTTGGGTTTTGTTGGG-3'(SEQ ID N0.7)；
下游引物：5'-TCCAAAATAATCCCATCCAACT-3'(SEQ ID N0.8)；
内参序列设计
较佳地，所述的试剂盒中的外控采用甘油％％-3-磷酸脱氧酶基因(ACTB),PCR引物及探针序列如下：
上游引物：5’-GGTGTTTAAGATAGTGTTGTGG-3'(SEQ ID N0.9)；
下游引物：5’-CTACTTAATACACACTCCAAAACC-3'(SEQ ID N0.10)；
荧光探针：5’-CTTTACACCAACCTCATAACC-3'(SEQ ID N0.11)。
在获得了本发明的探针和/或引物后，为了便于使用和商品化，可以将所述的探针和/或引物集成于一个试剂盒中。因此，本发明还包括了包含本发明的探针和/或引物的试剂盒。
试剂盒其他组分
本发明所述的试剂盒中还可包含其它配合所述探针和/或引物的检测试剂。例如当该试剂盒是一种荧光PCR试剂盒时，其中还可包括特异性扩增待测基因的特定甲基化区域的引物对，以及PCR缓冲液等试剂。
所述的试剂盒中还可包括说明所述的探针的使用方法的使用说明书，以用于指导本领域技术人员正确地使用。
利用本发明所述的试剂盒，可以非诊断性地检测SEPT9基因具体某CpG岛甲基化，具体过程为：以经过Sanger测序法确认的样本，采用试剂盒与该基因样本的结合情况，从而获得待测基因样本的SEPT9基因具体某CpG岛甲基化情况。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:SEPT9基因的甲基化水平检测
1、原理
本实施例中，采用荧光PCR技术，测试SEPT9基因具体某CpG岛甲基化探针对不同甲基化水平样本的检测情况。
SEPT9基因V2剪接体启动子区待测序列如下：
TCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGCCGCTGCCCTCCGCGCGACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGTCGGACCCCGCGGTCAACGCGCAGCTGGATGGGATCATTTCGGACTTCGAAGGTGGGTGCTGGGCTGGCTGCTGCGGCCGCGGACGTGCTGGAGAGGACCCTGCGGGTGGGCCTGGCGCGGGACGGGGGTG(SEQ ID NO.12)
其中的下划线段含有5个CpG甲基化位点，是本实施例中探针结合位点。
上述SEPT9基因序列经过重亚硫酸盐即Na％S％O：处理后的序列如下：
TTTGTATTGTAGGAGYGYGGGYGYGGYGTTTTAGTTAGYGYGTAGGGTTYGGGTTTYGTYGGGGGYGTTTTTTYGTYGTTGTTTTTYGYGYGATTYGTTGTTTATTAGTTATTATGTYGGATTTYGYGGTTAAYGYGTAGTTGGATGGGATTATTTYGGATTTYGAAGGTGGGTGTTGGGTTGGTTGTTGYGGTYGYGGAYGTGTTGGAGAGGATTTTGYGGGTGGGTTTGGYGYGGGAYGGGGGTG(SEQ IDNO.13)
其中的下划线段含有5个甲基化位点，按照5'—3'顺序依次称为：位点1—位点5。
2、探针和引物设计
2.1 SEPT9基因
依据SEPT9基因启动子区片段经过重亚硫酸盐处理后的序列，设计PCR探针和引物如下：
EPT9-P-1：5'-GNGATTNGTTGTTTATTAGTTATTATGT-3'(本发明探针1,SEQ IDN0.1)；
SEPT9-P-2：5'-GTTGTTTATTAGTTATTATGTNGGATTT-3'(本发明探针2,SEQ IDN0.2)；
SEPT9-P-3：5’-TTATTAGTTATTATGTNGGATTTNG-3'(本发明探针3,SEQ ID N0.3)；
SEPT9-P-4：5’-5'AAATAATCCCATCCAACTACN -3'(本发明探针4,SEQ ID N0.4)；
SEPT9-P-5：5’-CNAAATAATCCCATCCAACTAC-3'(本发明探针5,SEQ ID N0.5)；
SEPT9-P-6：5’-GTNGGATTTNGNGGTTAANGNG-3'(本发明探针6,SEQ ID N0.6)；
SEPT9-F：5’-TAGGGTTTGGGTTTTGTTGGG-3'(SEQ ID N0.7)；
SEPT9-R：5’-TCCAAAATAATCCCATCCAACT-3'(SEQ ID N0.8)；
全部探针均采用5’-FAM以及3’-MGB荧光标记。
N代表脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基。
2.2 内参基因
依据内参基因ACTB片段，设计PCR探针和引物如下：
ACTB-P：5’-GGTGTTTAAGATAGTGTTGTGG-3'(SEQ ID N0.9)；
ACTB-F：5’-CTACTTAATACACACTCCAAAACC-3'(SEQ ID N0.10)；
ACTB-R：5’-CTTTACACCAACCTCATAACC-3'(SEQ ID N0.11)；
全部探针均采用5’-VIC以及3’-BHQ1荧光标记。
3、SEPT9基因具体某CpG岛甲基化荧光PCR检测体系
采用荧光PCR法检测目标位点的甲基化状态，共配制两个荧光PCR体系，其中第一个反应体系使用探针SEPT9-P-1、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F、ACTB-R；第二个反应体系使用探针SEPT9-P-2、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F、ACTB-R；第三个反应体系使用探针SEPT9-P-3、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F、ACTB-R；第四个反应体系使用探针SEPT9-P-4、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F、ACTB-R；第五个反应体系使用探针SEPT9-P-5、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F、ACTB-R；第六个反应体系使用探针SEPT9-P-6、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F、ACTB-R。
3.1 模板DNA的制备：
采用人工合成的基因片段来测试SEPT9基因具体某CpG岛甲基化荧光PCR体系。一共合成5种不同的SEPT9基因片段(SEQ ID N0.14—18)，其差别在于探针结合区段5个CpG位点的甲基化状态不同。
TTTGTATTGTAGGAGYGYGGGYGYGGYGTTTTAGTTAGYGYGTAGGGTTYGGGTTTYGTYGGGGGYGTTTTTTYGTYGTTGTTTTTYGYGYGATTYGTTGTTTATTAGTTATTATGT GATTTTGTGGTTAATGTGTAGTTGGATGGGATTATTTYGGATTTYGAAGGTGGGTGTTGGGTTGGTTGTTGYGGTYGYGGAYGTGTTGGAGAGGATTTTGYGGGTGGGTTTGGYGYGGGAYGGGGGTG(SEQ ID NO.14)
TTTGTATTGTAGGAGYGYGGGYGYGGYGTTTTAGTTAGYGYGTAGGGTTYGGGTTTYGTYGGGGGYGTTTTTTYGTYGTTGTTTTTYGYGYGATTYGTTGTTTATTAGTTATTATGTTGGATTT TGGTTAATGTGTAGTTGGATGGGATTATTTYGGATTTYGAAGGTGGGTGTTGGGTTGGTTGTTGYGGTYGYGGAYGTGTTGGAGAGGATTTTGYGGGTGGGTTTGGYGYGGGAYGGGGGTG(SEQ ID NO.15)
TTTGTATTGTAGGAGYGYGGGYGYGGYGTTTTAGTTAGYGYGTAGGGTTYGGGTTTYGTYGGGGGYGTTTTTTYGTYGTTGTTTTTYGYGYGATTYGTTGTTTATTAGTTATTATGTTGGATTTTG GTTAATGTGTAGTTGGATGGGATTATTTYGGATTTYGAAGGTGGGTGTTGGGTTGGTTGTTGYGGTYGYGGAYGTGTTGGAGAGGATTTTGYGGGTGGGTTTGGYGYGGGAYGGGGGTG(SEQ ID NO.16)
TTTGTATTGTAGGAGYGYGGGYGYGGYGTTTTAGTTAGYGYGTAGGGTTYGGGTTTYGTYGGGGGYGTTTTTTYGTYGTTGTTTTTYGYGYGATTYGTTGTTTATTAGTTATTATGTGGATTTTGTGGTTAA TGTAGTTGGATGGGATTATTTYGGATTTYGAAGGTGGGTGTTGGGTTGGTTGTTGYGGTYGYGGAYGTGTTGGAGAGGATTTTGYGGGTGGGTTTGGYGYGGGAYGGGGGTG(SEQ ID NO.17)
TTTGTATTGTAGGAGYGYGGGYGYGGYGTTTTAGTTAGYGYGTAGGGTTYGGGTTTYGTYGGGGGYGTTTTTTYGTYGTTGTTTTTYGYGYGATTYGTTGTTTATTAGTTATTATGTTGGATTTTGTGGTTAATG TAGTTGGATGGGATTATTTYGGATTTYGAAGGTGGGTGTTGGGTTGGTTGTTGYGGTYGYGGAYGTGTTGGAGAGGATTTTGYGGGTGGGTTTGGYGYGGGAYGGGGGTG(SEQ ID NO.18)
合成片段采用紫外分光光度计测定浓度，并换算成相应的基因拷贝数(copies)。采用TE缓冲液将合成片段稀释至200copies/uL，作为甲基化荧光PCR检测的DNA模板。
3.2 反应体系：
3.2.1 反应体系1：
30u1,PCR反应体系中包含：1X PCR buffer,2.5mM MgCL2,200uM dNTP，上游及下游扩增引物各0.5uM、荧光探针SEPT9-P-1、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F和ACTB-R各0.2uM，1.25U Taq DNA聚合酶和5uL模板DNA(SEQ ID N0：14)。
3.2.2 反应体系2：
30u1,PCR反应体系中包含：1X PCR buffer,2.5mM MgCL2,200uM dNTP，上游及下游扩增引物各0.5uM、荧光探针SEPT9-P-2、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F和ACTB-R各0.2uM，1.25U Taq DNA聚合酶和5uL模板DNA(SEQ ID N0.15)。
3.2.3 反应体系3：
30u1,PCR反应体系中包含：1X PCR buffer,2.5mM MgCL2,200uM dNTP，上游及下游扩增引物各0.5uM、荧光探针SEPT9-P-3、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F和ACTB-R各0.2uM，1.25U Taq DNA聚合酶和5uL模板DNA(SEQ ID N0.16)。
3.2.4 反应体系4：
30u1,PCR反应体系中包含：1X PCR buffer,2.5mM MgCL2,200uM dNTP，上游及下游扩增引物各0.5uM、荧光探针SEPT9-P-4、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F和ACTB-R各0.2uM，1.25U Taq DNA聚合酶和5uL模板DNA(SEQ ID N0.17)。
3.2.5 反应体系5：
30u1,PCR反应体系中包含：1X PCR buffer,2.5mM MgCL2,200uM dNTP，上游及下游扩增引物各0.5uM、荧光探针SEPT9-P-5、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F和ACTB-R各0.2uM，1.25U Taq DNA聚合酶和5uL模板DNA(SEQ ID N0.18)。
3.2.5 反应体系6：
30u1,PCR反应体系中包含：1X PCR buffer,2.5mM MgCL2,200uM dNTP，上游及下游扩增引物各0.5uM、荧光探针SEPT9-P-6、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F和ACTB-R各0.2uM，1.25U Taq DNA聚合酶和5uL模板DNA(SEQ ID N0.13)。
3.3 扩增程序：
第一阶段：95℃5分钟，1个循环：
第二阶段：95℃5秒，58℃35秒，93℃30秒，45个循环：信号收集：第二阶段60℃时收集FAM和VIC荧光信号，每个循环收集一次荧光。
第三阶段：40℃30秒，1个循环：
4、结果解释
4.1 反应体系1
反应体系1结果为阳性，代表SEQ ID N0.14双划线CpG岛位点发生了甲基化。
4.2 反应体系2
反应体系2结果为阳性，代表SEQ ID N0.15双划线CpG岛位点发生了甲基化。
4.3 反应体系3
反应体系3结果为阳性，代表SEQ ID N0.16双划线CpG岛位点发生了甲基化。
4.4 反应体系4
反应体系4结果为阳性，代表SEQ ID N0.17双划线CpG岛位点发生了甲基化。
4.5 反应体系5
反应体系5结果为阳性，代表SEQ ID N0.18双划线CpG岛位点发生了甲基化。
4.6 反应体系6
反应体系6结果为阳性，代表SEQ ID N0.13的5个CpG岛中的1-5个位点发生了甲基化。
上述实验结果表明，本发明中的试剂盒可以有效知道SEPT9基因具体某CpG岛甲基化的情况。
实施例2：SEPT9基因具体某CpG岛甲基化检测试剂盒在结直肠癌样本检测中的应用
1、原理
SEPT9基因启动子甲基化是结直肠癌早期诊断的一个特异性分子标记。通常情况下，结直肠癌患者的肿瘤组织或血液样本中SEPT9基囚呈甲基化状态，而正常组织或血液样本中SEPT9基因呈非甲基化状态。采用本发明中的SEPT9甲基化探针，结合荧光PCR检测法，可以开发出针对SEPT9基因具体某CpG岛甲基化检测试剂盒，可以快速、灵敏地检测样本中SEPT9基因的甲基化状态。在试剂盒中还可以加入ACTB基因扩增的对照试剂，用于反应管的内对照，使检测结果更加准确,A」一靠。
2、SEPT9基因具体某CpG岛甲基化检测试剂盒中的PCR引物及探针
(1)用于SEPT9基因具体某CpG岛甲基化检测的引物和探针如下：
EPT9-P-1：5'-GNGATTNGTTGTTTATTAGTTATTATGT-3'(本发明探针1,SEQ IDN0.1)；
SEPT9-P-2：5'-GTTGTTTATTAGTTATTATGTNGGATTT-3'(本发明探针2,SEQ IDN0.2)；
SEPT9-P-3：5’-TTATTAGTTATTATGTNGGATTTNG-3'(本发明探针3,SEQ ID N0.3)；
SEPT9-P-4：5’-5'AAATAATCCCATCCAACTACNC-3'(本发明探针4,SEQ ID N0.4)；
SEPT9-P-5：5’-CNAAATAATCCCATCCAACTAC-3'(本发明探针5,SEQ ID N0.5)；
SEPT9-P-6：5’-GTNGGATTTNGNGGTTAANGNG-3'(本发明探针6,SEQ ID N0.6)；
SEPT9-F：5’-TAGGGTTTGGGTTTTGTTGGG-3'(SEQ ID N0.7)；
SEPT9-R：5’-TCCAAAATAATCCCATCCAACT-3'(SEQ ID N0.8)；
全部探针均采用5’-FAM以及3’-MGB荧光标记。
N代表脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基。
(2)用于ACTB基因扩增的引物(ACTB-F和ACTB-R)和探针(ACTB-P)如下：
ACTB-P：5’-GGTGTTTAAGATAGTGTTGTGG-3'(SEQ ID N0.9)；
ACTB-F：5’-CTACTTAATACACACTCCAAAACC-3'(SEQ ID N0.10)；
ACTB-R：5’-CTTTACACCAACCTCATAACC-3'(SEQ ID N0.11)；
全部探针均采用5’-VIC以及3’-BHQ1荧光标记。
3、样本DNA的提取
3.1 材料准备：提取试剂盒，15ml离心管，1.5ml离心管，高速离心机，移液器等。
3.2 试剂准备：
1)使用前请先根据说明要求在相应试剂中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
2)在第一次使用Carrier RNA时，请将Carrier RNA(310μg)溶解在310μl RNase-Free ddH2O中，将溶液分装储存于-20℃，此时该溶液的浓度为1μg/μl；该储存液应避免反复冻融，冻融次数不能超过3次。
3.3 操作步骤：
提取步骤本流程适用于处理1-5ml血浆样品)：
1)根据样品体积按下表选择合适规格的离心管，依次加入血浆、裂解液、Proteinase K和1μl Carrier RNA(客户自备)。具体见表1：
表1
2)涡旋振荡混匀后室温孵育20min，期间每3-5min上下颠倒混匀10sec，使磁珠和核酸充分结合。孵育结束后需简短离心以去除管盖内壁的液滴。
3)将离心管置于磁力架上2min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
4)加入750μl缓冲液GDF(使用前请先检查是否已加入终浓度为40％的无水乙醇)，上下颠倒混匀30sec使磁珠充分悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
注意：可将步骤4中所有磁珠及液体转移至1.5ml规格磁力架进行后续操作。
如果离心管壁上有残留磁珠，可以再加入200μl缓冲液GDF漂洗，然后一并转移到1.5ml离心管中。
5)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
6)加入750μl漂洗液PWG(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，上下颠倒混匀30sec使磁珠充分悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
7)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
8)重复步骤6和7一次。
9)将离心管置于磁力架上，室温晾干5-10min。
注意：乙醇残留会抑制后续的酶反应，所以晾干时要确保乙醇挥发干净。但也不要干燥太长时间，以免难以洗脱核酸。
10)加入65μl洗脱缓冲液TBC，用移液器吹吸使磁珠重新悬浮，56℃孵育5min，期间每2min轻轻晃动使核酸充分洗脱。
11)将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移至新的离心管中，并于适当条件保存。
4、样本DNA的重亚硫酸盐修饰
4.1 材料准备：PCR管，1.5ml离心管，无水乙醇，水，PCR仪。
4.2 试剂准备：
1)CT Conversion Reagent：在CT Conversion Reagent管中加入900μl水，300μlM-Dilution Buffer，50μl M-Dissolving Buffer.室温下剧烈震荡10min至全部溶解。该溶液对光敏感，最好现配现用；4℃可存1周，-20℃可存1月。冻存过的试剂需37℃水浴加热融化，震荡混匀后使用。
2)M-Wash Buffer:按试剂瓶上的说明，在M-Wash Buffer中加入相应体积的无水乙醇，混匀备用。
4.3 操作步骤：
1)将130μl的CT Conversion Reagent加到装有20μl DNA(若不足20μl，用水补至20μl)的PCR管中，用移液器吹吸混匀，然后短暂离心收集管壁液体。
2)将PCR管置于PCR仪中，执行以下程序：98℃10min，64℃2.5hr，4℃保持。
3)加600μl的M-Binding Buffer到Zymo-Spin IC Column中，并将柱子放入提供的Collection Tube中。
4)将步骤2)中的混合液加入柱子中，盖好管盖，颠倒混匀多次，室温全速离心(>10000g)30s，弃废液。
5)加100μl的M-Wash Buffer到柱子中，室温全速离心(>10000g)30s。
6)加200μl的M-Desulphonation Buffer到柱子中，室温(20-30℃)放置15-20min，全速离心(>10000g)30s。
7)加入200μl的M-Wash Buffer到柱子中，室温全速离心(>10000g)30s。
8)重复步骤7)。
9)将柱子放入干净的1.5ml离心管内，向柱子底部加入20μl的M-Elution Buffer，室温全速离心(>10000g)30s，收集洗脱下来的DNA，-20℃保存。长期保存可置于-70℃冰箱。
5、SEPT9基因和ACTB基因复合荧光PCR检测体系
5.1 反应体系1：
30u1,PCR反应体系中包含：1X PCR buffer,2.5mM MgCL2,200uM dNTP，上游及下游扩增引物各0.5uM、荧光探针SEPT9-P-1、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F和ACTB-R各0.2uM，1.25U Taq DNA聚合酶和5uL模板DNA(SEQ ID N0.14)。
5.2 反应体系2：
30u1,PCR反应体系中包含：1X PCR buffer,2.5mM MgCL2,200uM dNTP，上游及下游扩增引物各0.5uM、荧光探针SEPT9-P-2、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F和ACTB-R各0.2uM，1.25U Taq DNA聚合酶和5uL模板DNA(SEQ ID N0.15)。
5.3 反应体系3：
30u1,PCR反应体系中包含：1X PCR buffer,2.5mM MgCL2,200uM dNTP，上游及下游扩增引物各0.5uM、荧光探针SEPT9-P-3、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F和ACTB-R各0.2uM，1.25U Taq DNA聚合酶和5uL模板DNA(SEQ ID N0.16)。
5.4 反应体系4：
30u1,PCR反应体系中包含：1X PCR buffer,2.5mM MgCL2,200uM dNTP，上游及下游扩增引物各0.5uM、荧光探针SEPT9-P-4、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F和ACTB-R各0.2uM，1.25U Taq DNA聚合酶和5uL模板DNA(SEQ ID N0.17)。
5.5 反应体系5：
30u1,PCR反应体系中包含：1X PCR buffer,2.5mM MgCL2,200uM dNTP，上游及下游扩增引物各0.5uM、荧光探针SEPT9-P-5、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F和ACTB-R各0.2uM，1.25U Taq DNA聚合酶和5uL模板DNA(SEQ ID N0.18)。
5.5 反应体系6：
30u1,PCR反应体系中包含：1X PCR buffer,2.5mM MgCL2,200uM dNTP，上游及下游扩增引物各0.5uM、荧光探针SEPT9-P-6、SEPT9-F、SEPT9-R、ACTB-P、ACTB-F和ACTB-R各0.2uM，1.25U Taq DNA聚合酶和5uL模板DNA(SEQ ID N0.13)。
5.2 扩增程序：
第一阶段：95℃5分钟，1个循环：
第二阶段：95℃5秒，58℃35秒，93℃30秒，45个循环：信号收集：第二阶段60℃时收集FAM和VIC荧光信号，每个循环收集一次荧光。
第三阶段：40℃30秒，1个循环：
荧光PCR检测结果显示，SEPT9和ACTB基因复合荧光PCR检测体系可以有效检测样本中SEPT9基因的甲基化状态。同时检测到FAM和VIC荧光信号的扩增，表明样本为SEPT9基因具体某CpG岛甲基化阳性；只能检测到JOE荧光信号的扩增，表明样本为SEPT9基因具体某CpG岛甲基化阴性。FAM和VIC两种荧光信号都检测不到，表明检测体系异常，结果不可信，需重新制备样本后再进行荧光PCR检测。
6、结果解释：
在30例结直肠癌组织样本中，共检测到SEPT9基因具体某CpG岛甲基化阳性28例，阳性符合率为93％。
其中反应体系1和反应体系6FAM和VIC通道同时检测为阳性7例；
反应体系2和反应体系6FAM和VIC通道同时检测为阳性8例；
反应体系3和反应体系6FAM和VIC通道同时检测为阳性4例；
反应体系4和反应体系6FAM和VIC通道同时检测为阳性3例；
反应体系5和反应体系6FAM和VIC通道同时检测为阳性6例。
在20例癌旁组织对照样本中，检测结果全部为SEPT9基因具体某CpG岛甲基化阴性(反应体系1—反应体系6FAM均为阴性、VIC均为阳性)。
在30例结直肠癌组织样本中，共检测到SEPT9基因具体某CpG岛甲基化阴性2例，反应体系1—反应体系6FAM均为阴性、VIC均为阳性)。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海时代基因医学科技有限公司
<120> 一种检测SEPT9基因不同Cpg岛甲基化的试剂盒及应用
<130> 11
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n 是脱氧次黄嘌呤核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n 是脱氧次黄嘌呤核苷酸
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gngattngtt gtttattagt tattatgtc 29
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n 是脱氧次黄嘌呤核苷酸
<400> 2
gttgtttatt agttattatg tnggatttc 29
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<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n 是脱氧次黄嘌呤核苷酸
<220>
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<222> (24)..(24)
<223> n 是脱氧次黄嘌呤核苷酸
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ttattagtta ttatgtngga tttngc 26
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<222> (21)..(21)
<223> n 是脱氧次黄嘌呤核苷酸
<400> 4
aaataatccc atccaactac ncc 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n 是脱氧次黄嘌呤核苷酸
<400> 5
cnaaataatc ccatccaact acc 23
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<222> (19)..(19)
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<220>
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<223> n 是脱氧次黄嘌呤核苷酸
<400> 6
gtnggatttn gnggttaang ng 22
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<212> DNA
<213> 人工合成
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tccaaaataa tcccatccaa ct 22
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ggtgtttaag atagtgttgt gg 22
<210> 10
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<212> DNA
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ctacttaata cacactccaa aacc 24
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<212> DNA
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ctttacacca acctcataac c 21
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
tctgcactgc aggagcgcgg gcgcggcgcc ccagccagcg cgcagggccc gggccccgcc 60
gggggcgctt cctcgccgct gccctccgcg cgacccgctg cccaccagcc atcatgtcgg 120
accccgcggt caacgcgcag ctggatggga tcatttcgga cttcgaaggt gggtgctggg 180
ctggctgctg cggccgcgga cgtgctggag aggaccctgc gggtgggcct ggcgcgggac 240
gggggtg 247
<210> 13
<211> 247
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
tttgtattgt aggagygygg gygyggygtt ttagttagyg ygtagggtty gggtttygty 60
gggggygttt tttygtygtt gtttttygyg ygattygttg tttattagtt attatgtygg 120
atttygyggt taaygygtag ttggatggga ttatttygga tttygaaggt gggtgttggg 180
ttggttgttg yggtygygga ygtgttggag aggattttgy gggtgggttt ggygygggay 240
gggggtg 247
<210> 14
<211> 247
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
tttgtattgt aggagygygg gygyggygtt ttagttagyg ygtagggtty gggtttygty 60
gggggygttt tttygtygtt gtttttygyg ygattygttg tttattagtt attatgtygg 120
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gggggtg 247
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
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<210> 16
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<212> DNA
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gggggtg 247
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ggggtg 246
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<212> DNA
<213> 人工合成
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Claims (10)

1.一种检测SEPT9基因不同Cpg岛甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1—6所示的探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针携带检测标记物。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测标记物为：5’端标记FAM，3’端标记MGB荧光标记。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括SEPT9基因的PCR扩增引物。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述SEPT9基因的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7—8所示。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括ACTB基因的PCR扩增引物和特异性检测ACTB基因的探针，所述ACTB基因为内参。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述ACTB基因的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9—10所示；所述特异性检测ACTB基因的探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述ACTB基因的PCR扩增引物和特异性检测ACTB基因的探针携带检测标记物。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述ACTB基因的PCR扩增引物的5’端标记VIC荧光标记,3’端标记BHQI荧光标记。
10.权利要求1所述试剂盒中的探针在制备结直肠癌检测试剂中的应用。
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