KR20230005927A - 종양 검출 시약 및 키트 - Google Patents

Abstract

본원은 특정 핵산 단편의 변형된 서열을 검출하는 데 사용되는, 특정 핵산 단편의 메틸화를 검출하는 시약을 포함하는 종양 검출 시약 및 키트를 개시한다. 본원의 시약은 실험을 거쳤고 종양을 검출하고 진단할 수 있는 것으로 확인된다.

Description

종양 검출 시약 및 키트

본 개시내용은 유전자 검출 분야에 속하고, 보다 구체적으로 본 개시내용은 종양 검출 시약 및 키트에 관한 것이다.

사회 경제가 발달하면서, 종양을 앓고 있는 환자의 수는 증가하고, 발병 연령은 더 어려지고 있다. 초기에 통증 없이 신속하고 정확하게 종양을 검출하는 것이 점점 더 시급한 요구사항이 되었다.

기존의 통상적인 종양 진단 및 추적조사 방법은 주로 시험관내 영상화, 생체내 현미경관찰, 조직 생검, 및 박리 세포검사 또는 배설 세포검사를 포함한다. 시험관내 영상화 기법은 주로 컴퓨터 단층촬영, 핵 자기 공명 영상화, 경복부 초음파 등을 포함하고, 이 기법들은 종종 암의 초기 진단에서 높은 거짓 양성률을 가진다. 일부 종양의 진단을 위한 최고의 표준으로서 생체내 현미경관찰은 최근 몇 년 동안 개선되었고 부드러운 재료를 사용하지만, 여전히 침습성이 높고 검출 후 수일 이내에 통증, 출혈 및 다른 문제로 고통 받을 환자에게 큰 고통을 안겨준다. 더욱이, 생체내 현미경관찰은 일부 종양의 초기 진단에 대한 낮은 특이성 및 민감도를 가진다. 조직 생검은 질환이 의심되는 조직을 검출하는 데 사용되고 주로 높은 특이성 및 민감도로 종양 세포의 형태 및 바이오마커를 검출하는 데 사용된다. 그러나, 조직 생검은 샘플링 동안 환자에게 다소 침습적이고, 긴 샘플 전처리 시간 및 복잡한 단계와 같은 결점을 가진다. 박리 세포검사 또는 배설 세포검사는 비침습적 검사이므로, 여러 종양의 진단에 널리 적용되고 있다. 그러나, 일부 박리 세포검사 또는 배설 세포검사는 저등급 종양의 존재를 배제할 수 없고 낮은 민감도를 초래한다. 검출 방법, 예컨대, 핵 매트릭스 단백질-22, 종양 관련 항원, 이뮤노 사이트(Immuno Cyt) 어세이 및 유로 바이전(Uro Vysion) 어세이는 이들의 낮은 민감도 및/또는 특이성으로 인해 일상적인 임상 시험에 적용되지 않는다.

후성유전학은 암 생물학에서 빠르게 성장하는 분야이며 임상 및 중개 의학 연구에 대한 큰 잠재력을 가진다. 연구는 종양발생에 중요한 생화학적 경로가 후성유전학적 현상, 예컨대, 종양 세포에서의 DNA 메틸화의 변화, 비정상적인 히스톤 변형, 다양한 표적 유전자의 miRNA 매개 침묵 및 과오종성 뉴클레오좀의 재구축에 의해 부분적으로 조절된다는 것을 발견하였다. 비정상적인 DNA 메틸화는 모든 유형의 인간 암과 관련된 가장 광범위하게 연구된 후성유전학적 변화이다. 과메틸화 침묵 전사 인자, 예컨대, RUNX3, GATA-4 및 GATA-5는 다양한 세포 과정에 관여하는 그들의 다운스트림 표적의 불활성화를 야기한다. RUNX3은 전사 인자 계열의 중요한 구성원이고, 연구는 폐암 세포주 및 원발성 폐암 표본에서 RUNX3이 비정상적인 DNA 과메틸화에 의해 불활성화됨을 밝혔다. 유사하게, GATA 계열의 전사 인자는 위장 질환의 발병과 관련되어 있고, 대장암의 프로모터 중에서 유전자 GATA-4 및 GATA-5의 프로모터 영역은 자주 메틸화되는 것으로 관찰된다. 방광암에서 일부 유전자들의 프로모터도 48% 내지 96%의 DNA 메틸화 빈도로 고도로 메틸화되고, 이 유전자들은 A2BP1, NPTX2, POU4F2, HOXA9, MEIS1, GDF15, TMEFF2, VIM, STK11, MSH6, BRCA1, TBX2, TBX3, GATA2, ZIC4, PAX5A, MGMT 및 IGSF4과 같은 유전자를 포함한다^[1].

최근에는 혈액, 객담, 타액, 대변 또는 소변 샘플에서 종양 관련 유전자의 특정 영역의 메틸화를 검출하는 것이 암의 진단 및 초기 진단, 암의 진행의 예측, 암의 예후의 예측, 치료 후 모니터링, 및 항암 요법에 대한 반응의 예측과 같은 측면에 널리 적용되고 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 종양 검출 시약 또는 키트의 제조에 있어서 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열(이하, "뉴클레오타이드 서열" 또는 "핵산 단편")의 용도를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 종양 검출 시약 또는 키트의 제조에 있어서 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하는 시약의 용도를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 46 또는 서열번호 47로서 표시된 서열들 중 어느 한 서열 또는 이의 상보적 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머도 제공한다.

일부 실시양태에서, 프라이머는 서열번호 31 및 서열번호 32, 서열번호 34 및 서열번호 35, 서열번호 37 및 서열번호 38, 서열번호 40 및 서열번호 41, 서열번호 43 및 서열번호 44, 또는 서열번호 46 및 서열번호 47로서 표시된 임의의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머와 각각 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 다수의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 프라이머는 서열번호 34 및 서열번호 35, 서열번호 43 및 서열번호 44, 또는 서열번호 46 및 서열번호 47로서 표시된 임의의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머와 각각 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 다수의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 프라이머는 서열번호 43 및 서열번호 44로서 표시된 프라이머 쌍의 각각의 프라이머와 각각 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 다수의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열번호 33, 서열번호 36, 서열번호 39, 서열번호 42, 서열번호 45 또는 서열번호 48로서 표시된 서열들 중 어느 한 서열 또는 이의 상보적 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브도 제공한다.

일부 실시양태에서, 프로브는 서열번호 36, 서열번호 45 또는 서열번호 48로서 표시된 서열들 중 어느 한 서열 또는 이의 상보적 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 프로브는 서열번호 45로서 표시된 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 프라이머 또는 프로브는 단리된 프라이머 또는 프로브이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 종양 검출 시약 또는 키트의 제조에 있어서 상기 언급된 프라이머 및/또는 프로브의 용도를 제공한다.

본 개시내용에서, 용어 "검출"은 진단과 동의어이고, 종양의 초기 진단뿐만 아니라 중기 및 후기 진단도 포함하고, 종양 스크리닝, 위험 평가, 예후, 질환 식별, 질환 단계의 진단 및 치료 표적의 선택도 포함한다.

질환 단계에서의 임의적 실시양태에서, 진단은 상이한 단계 또는 기간에서 종양의 진행에 따라 샘플에서 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 정도를 검출함으로써 이용될 수 있다. 샘플의 구체적인 종양 단계는 상이한 단계에서 종양 샘플로부터 단리된 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 정도를, 비정상적인 세포 증식이 없는 샘플로부터 단리된 하나 이상의 핵산의 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 정도와 비교함으로써 검출될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하는 시약을 포함하는 종양 검출 시약을 제공한다.

메틸화는 메틸 기가 사이토신에 추가되는 것을 의미한다. 사이토신은 하이드로아황산염 또는 중아황산염 또는 하이드라진 염으로 처리된 후, 우라실로 전환된다. 우라실은 타이민과 유사하기 때문에 PCR 증폭 동안 타이민으로서 인식된다. 따라서, PCR에 의해 증폭된 서열에서, 메틸화되지 않은 사이토신은 타이민으로 전환되고(C는 T로 전환됨), 메틸화된 사이토신(C)은 전환되지 않는다. 처리된 메틸화된 단편(즉, 단편에서 전환되지 않은 C)에 대한 프라이머를 설계한 후 PCR 증폭을 수행하는 MSP는 유전자 메틸화를 검출하기 위해 일반적으로 이용되는 PCR 기법이다. 단편이 증폭된다는 것은 단편이 메틸화되어 있음을 표시하고, 단편이 증폭되지 않는다는 것은 단편이 메틸화되어 있지 않음을 표시한다.

일부 실시양태에서, 메틸화 수준 검출 시약은 뉴클레오타이드 서열 중 하이드로아황산염 또는 중아황산염 또는 하이드라진 염에 의해 변형된 서열을 검출하는 데 사용된다.

일부 실시양태에서, 뉴클레오타이드 서열 중 중아황산염에 의해 변형된 서열이 검출된다.

일부 실시양태에서, 메틸화 수준 검출 시약은 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하기 위해 프라이머 및 프로브를 포함한다.

일부 실시양태에서, 프라이머 중 정방향 프라이머는 하기 뉴클레오타이드 서열들 중 어느 한 뉴클레오타이드 서열을 가진다:

I. 서열번호 31, 서열번호 34, 서열번호 37, 서열번호 40, 서열번호 43 또는 서열번호 46으로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열; 또는

II. I에 제시된 서열의 상보적 서열.

일부 실시양태에서, 프라이머 중 역방향 프라이머는 하기 뉴클레오타이드 서열들 중 어느 한 뉴클레오타이드 서열을 가진다:

III. 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 41, 서열번호 44 또는 서열번호 47로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열; 또는

II. III에 제시된 서열의 상보적 서열.

프라이머는 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 데 사용된다. 프라이머의 성공적인 설계가 PCR에 중요하다는 것은 당분야에 잘 알려져 있다. 일반적인 PCR과 비교할 때, 프라이머의 설계는 메틸화 수준 검출에서 더 중요하다. 그 이유는 메틸 황화가 DNA 가닥에서 "U"로의 "C"의 전환을 유도하여, PCR 후 서열에서 GC 함량의 감소 및 긴 연속 "T"의 존재를 야기하기 때문이다. DNA 가닥 절단을 야기하기 쉬우므로, 적절한 Tm 값을 가진 안정한 프라이머를 선택하는 것은 어렵다. 다른 한편으로, 황화된 DNA를 황화되지 않은 불완전하게 처리된 DNA로부터 구별하기 위해, 프라이머는 충분한 수의 "C"를 가져야 할 필요가 있는데, 이것은 안정한 프라이머의 선택 어려움을 증가시킨다. 따라서, DNA 메틸화 수준 검출에서, 프라이머에 의해 증폭될 단편의 선택, 예컨대, 증폭될 단편의 길이와 위치, 프라이머의 선택 등은 검출 민감도 및 특이성에 영향을 미친다. 실험에 의해, 본 발명자들은 증폭될 상이한 표적 단편 및 프라이머가 검출 결과의 차이를 만든다는 것을 발견하였다. 여러 번 일부 유전자들 또는 뉴클레오타이드 서열들이 종양과 비-종양에서 차등적으로 발현되는 것으로 밝혀졌으나, 이 유전자들을 종양 마커로 전환시키고 종양 마커를 임상적으로 적용하는 길은 멀다. 주된 이유는 이 잠재적인 종양 마커의 검출 민감도 및 특이성이 검출의 요건을 충족시키기 어렵게 만드는 검출 시약의 한계이거나, 검출 방법이 작업 면에서 복잡하고 비용이 많이 들며 대규모로 임상적으로 적용되기 어렵다는 점이다.

일부 실시양태에서, 프로브는 하기 뉴클레오타이드 서열들 중 어느 한 뉴클레오타이드 서열을 가진다:

V. 서열번호 33, 서열번호 36, 서열번호 39, 서열번호 42, 서열번호 45 또는 서열번호 48로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열; 또는

VI. V에 제시된 서열의 상보적 서열.

일부 실시양태에서, 시약은 기준 유전자를 검출하는 시약을 포함한다.

일부 실시양태에서, 기준 유전자는 β-액틴(ACTB)이다.

일부 실시양태에서, 기준 유전자를 검출하는 시약은 기준 유전자에 대한 프라이머 및 프로브이다.

일부 실시양태에서, 시약은 또한 뉴클레오타이드 서열을 변형시키기 위해 하이드로아황산염, 중아황산염 및 하이드라진 염 중 적어도 하나를 포함하고, 물론 시약은 하이드로아황산염, 중아황산염 또는 하이드라진 염을 포함하지 않을 수 있다.

일부 실시양태에서, 시약은 DNA 중합효소, dNTP, Mg²⁺ 이온 및 완충제 중 하나 이상을 포함하고; 임의로, 시약은 DNA 중합효소, dNTP, Mg²⁺ 이온 및 완충제를 포함하는 PCR 반응 시스템을 포함하고 변형된 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 데 사용된다.

본 개시내용의 검출/진단 시약에 의해 검출될 샘플은 조직, 체액 및 배설물 중 적어도 하나로부터 선택될 수 있다.

임의로, 조직은 방광 조직이다.

임의로, 체액은 혈액, 혈청, 혈장, 세포외액, 조직액, 림프액, 뇌척수액 및 방수 중 적어도 하나이다.

임의로, 배설물은 객담, 소변, 타액 및 대변 중 적어도 하나로부터 선택된다.

임의로, 배설물은 소변으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 종양 검출 시약을 포함하는 키트도 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 설명서도 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 핵산 추출 시약도 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 샘플링 장치도 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 검출 시약에 의해 검출될 조직은 종양 조직 및 준-암종 정상 조직(또는 양성 종양 조직)으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 샘플에서 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법도 제공한다: (1) 검출될 샘플을 하이드로아황산염, 중아황산염 및 하이드라진 염으로 처리하여, 검출될 변형된 샘플을 수득하는 단계; (2) 예를 들어, 상기 시약 또는 키트를 사용하여 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출함으로써, 단계 (1)에서 변형된 검출될 샘플에서 뉴클레오타이드 서열의 메틸화를 검출하는 단계. 임의적 실시양태에서, 단계 (2)에서 실시간 형광 정량 메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응이 검출에 이용된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는 종양 검출 방법도 제공한다: 임의로, 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하는 상기 방법으로 검출될 샘플에서 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하는 단계; 및 임의로, 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하는 상기 방법에 의해 검출된 메틸화 수준과 정상 대조군 샘플의 상응하는 메틸화 수준의 편차, 임의로 메틸화 수준 차이에 따라 대상체가 종양을 갖거나 가질 위험이 있는지를 표시하는 단계. 상기 단계에서 용어 "편차"는 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준의 편차를 지칭한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 종양을 치료하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법도 제공한다: 대상체로부터 검출될 샘플에서 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양을 검출하는 단계, 및 상기 대상체에서의 종양의 검출이 상기 대상체가 종양을 갖거나 가질 위험이 있음을 표시하는 경우 종양을 치료하는 단계. 임의로, 메틸화 수준은 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하는 상기 방법에 의해 검출된다. 임의로, 대상체의 종양은 상기 종양 검출 방법에 의해 검출된다. 임의로, 치료는 수술, 화학요법, 방사선요법, 화학방사선요법, 면역요법, 종양용해성 바이러스 요법, 당분야에서 이용되는 임의의 다른 종류의 종양 치료 방법, 또는 이 치료 방법들의 조합의 투여이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열에 대한 프라이머를 설계하는 단계를 포함하는 프라이머 설계 방법도 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 1) 입력 구성요소; 2) 처리 구성요소; 및 3) 출력 구성요소를 포함하는 프라이머 설계 시스템도 제공한다. 임의로, 입력 구성요소는 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 판독하도록 구성된다. 임의로, 처리 구성요소는 입력 구성요소에 의해 판독된 정보를 기반으로 프라이머를 설계하는 프로그램으로 로딩된다. 임의로, 출력 구성요소는 처리 구성요소에 의해 설계된 프라이머 서열을 출력하도록 구성된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 종양 검출 시스템도 제공한다. 이 시스템은 (1) 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하는 구성요소, 및 (2) 결과 판정 시스템을 포함한다.

일부 실시양태에서, 메틸화 수준 검출 구성요소는 상기 검출 시약 또는 키트를 포함한다.

일부 실시양태에서, 결과 판정 구성요소는 검출 시스템에 의해 검출되는 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준에 따라 종양을 가질 위험 및/또는 종양 유형을 출력하도록 구성된다.

일부 실시양태에서, 종양을 가질 위험은 검출될 샘플의 메틸화 수준을 정상 샘플의 메틸화 수준과 비교함으로써 판정되고, 검출될 샘플의 메틸화 수준과 정상 샘플의 메틸화 수준 사이에 유의미한 차이 또는 현저히 유의미한 차이가 있는 경우 검출될 샘플이 종양을 가질 높은 위험을 가진 것으로 판정된다.

일부 실시양태에서, 뉴클레오타이드 서열의 메틸화가 양성인 경우, 검출될 샘플의 공여자는 종양을 갖거나 종양을 가질 높은 위험이 있는 환자임을 표시한다. 임의적 실시양태에서, 양성은 검출될 샘플의 검출 결과가 정상 샘플의 검출 결과와 비교될 때, 검출될 샘플의 증폭 결과와 정상 샘플의 증폭 결과 사이에 유의미한 차이 또는 현저히 유의미한 차이가 있는 경우, 검출될 샘플의 공여자는 양성임을 의미한다.

일부 실시양태에서, 판정 시스템의 판정 기준은 표본이 종양 표본인지 아니면 정상 표본인지를 컷-오프 값에 따라 판정하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 종양은 요로상피 종양으로부터 선택된다. 임의로, 종양은 방광암, 요관암, 신우암 및 요도암으로부터 선택된다. 임의로, 종양은 방광암으로부터 선택된다.

본원의 검출 방법은 종양 치료 전후에 이용될 수 있거나 종양 치료와 함께 이용될 수 있다. 치료 후, 검출 방법은 예를 들어, 치료가 성공적인지를 평가하고 치료 후 종양의 경감, 재발 및/또는 진행(전이를 포함함)을 모니터링하는 데 이용된다.

도 1a 내지 1f는 108개의 임상 조직 표본(66개의 방광암 조직 표본 및 42개의 방광암 준-암종 조직 표본을 포함함)에서 각각 핵산 단편 1 내지 6의 검출의 ROC 곡선을 보여주고;
도 2는 97개의 소변 샘플(45개의 방광암 샘플 및 52개의 대조군 샘플을 포함함)에서 핵산 단편 4 및 MEIS1의 검출의 ROC 곡선을 보여주고;
도 3은 핵산 단편 4를 가진 다양한 유형의 종양의 299개의 소변 샘플(1개의 저악성 잠재적 도립 요로상피 종양 샘플, 16개의 저악성 잠재적 유두상 요로상피 종양 샘플, 105개의 방광암 샘플, 31개의 전립선암 샘플, 17개의 신우암 샘플, 10개의 요관암 샘플 및 119개의 대조군 샘플을 포함함)을 비롯한 다양한 유형의 종양 샘플에서 핵산 단편 4의 검출의 통계학적 결과를 보여주고, 이때 도 3a는 대조군과 "방광암 & 요관암 & 신우암" 군의 ROC 곡선의 비교를 보여주고; 도 3b는 대조군과 요관암 군의 ROC 곡선의 비교를 보여주고; 도 3c는 대조군과 신우암 군의 ROC 곡선의 비교를 보여주고; 도 3d는 대조군과 방광암 군의 ROC 곡선의 비교를 보여주고; 도 3e는 대조군과 "저악성 잠재적 도립 요로상피 종양 & 저악성 잠재적 유두상 요로상피 종양" 군의 ROC 곡선의 비교를 보여주고; 도 3f는 대조군과 전립선암 군의 ROC 곡선의 비교를 보여주고;
도 4는 다양한 프라이머 및 프로브 세트의 증폭 곡선 및 용융 곡선을 보여주고;
도 5는 193개의 소변 샘플에서 CG441의 검출의 ROC 곡선을 보여준다.

본 개시내용의 기술적 해법은 특정 예를 참조함으로써 이하에 더 설명될 것이고, 특정 예는 본 개시내용의 보호 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 다른 사람이 본 개시내용의 개념을 기반으로 만든 일부 비필수적인 변형 및 조절은 여전히 본 개시내용의 보호 범위 내에 속한다.

본원에서, "프라이머" 또는 "프로브"는 표적 분자(예를 들어, 표적 핵산 단편)에서 적어도 6개의 연속 뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 영역을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 프라이머 또는 프로브 서열의 적어도 일부는 증폭된 서열에 상보적이지 않다. 일부 실시양태에서, 프라이머 또는 프로브는 표적 분자에서 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개의 연속 뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 영역을 포함한다. 프라이머 또는 프로브가 "표적 분자에서 적어도 x개의 연속 뉴클레오타이드에 상보적인" 영역을 포함하는 경우, 프라이머 또는 프로브는 표적 분자에서 적어도 x개의 연속 또는 불연속 블록 뉴클레오타이드에 적어도 95% 상보적이다. 일부 실시양태에서, 프라이머 또는 프로브는 표적 분자에 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상보적이다.

본원에서 "정상" 샘플은 암 또는 종양이 없는 것으로 알려진 개체로부터 단리된 동일한 유형의 샘플을 지칭한다.

본원에서, 메틸화 수준 검출을 위한 샘플은 DNA, RNA, mRNA 함유 DNA 및 RNA 샘플, 및 DNA-RNA 하이브리드를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. DNA 또는 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.

본원에서, "대상체"는 인간과 같은 포유동물이다.

본원에서, 용어 "메틸화 수준"은 "메틸화 정도"와 동의어이고, 통상적으로 메틸화된 사이토신의 수를 메틸화된 사이토신 수와 메틸화되지 않은 사이토신의 수의 합계로 나눔으로써 계산된, 메틸화된 사이토신의 백분율로서 표현된다. 현재, 메틸화 수준은 일반적으로 메틸화된 표적 유전자의 수를 기준 유전자의 수로 나눔으로써 계산되거나 다른 선행 기술의 다른 식에 의해 계산된다.

본원에서, 용어 "샘플"은 "표본"과 동의어이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 하나 이상의 관련된 나열 항목의 임의의 모든 가능한 조합을 지칭하고 커버한다. 둘 이상의 항목의 목록에서 사용될 때, 용어 "및/또는"은 나열 항목 중 어느 한 항목을 단독으로 사용할 수 있거나 나열 항목 중 둘 이상의 항목의 임의의 조합을 사용할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 조성물, 조합, 구축물 등이 구성요소 A, B, C 및/또는 D를 포함하는(또는 함유하는) 것으로 기재된 경우, 조성물은 A만을 포함할 수 있거나; B만을 포함할 수 있거나; C만을 포함할 수 있거나; D만을 포함할 수 있거나; A와 B의 조합을 포함할 수 있거나; A와 C의 조합을 포함할 수 있거나; A와 D의 조합을 포함할 수 있거나; B와 C의 조합을 포함할 수 있거나; B와 D의 조합을 포함할 수 있거나; C와 D의 조합을 포함할 수 있거나; A, B 및 C의 조합을 포함할 수 있거나; A, B 및 D의 조합을 포함할 수 있거나; A, C 및 D의 조합을 포함할 수 있거나; B, C 및 D의 조합을 포함할 수 있거나; A, B, C 및 D의 조합을 포함할 수 있다.

실시예 1

본 발명자들은 유전자의 메틸화된 부위의 분포를 연구하기 위해 수백 개의 유전자 마커 및 핵산 단편을 스크리닝하였다.

본 발명자들에 의해 스크리닝된 6개의 핵산 단편 및 스크리닝 결과는 본원에 나열되어 있다.

핵산 단편 1 내지 6의 서열은 각각 서열번호 1 내지 서열번호 6으로서 표시되어 있다.

실험 과정:

국립 세포주 자원 기반시설(National Infrastructure of Cell Line Resource)로부터 UM-UC-3, J82, SW780, T24, RT4, 5637, SCaBER, UM-UC-3 및 J82 세포주를 입수하였고, ATCC로부터 다른 세포주를 구입하였다. 모든 세포주를 권장 배지에서 소생시켰다. 모든 세포주는 마이코플라스마 검출에서 음성이었고 정상 세포 형태를 가졌다. 증식 후, 세포를 수거하고, 5X10⁶개 세포/튜브의 밀도로 소포장하고, DNA 추출을 위해 -80℃의 극저온 냉장고에 저장하였다.

1) DNA 추출

퀴아젠(QIAGEN)으로부터 구입된 DNA 추출 키트(QIAGEN DNA 미니 키트, #51306)를 사용하여 17개의 방광암 세포주로부터 DNA를 추출하였다.

2) DNA 변형

자이모 리서치(ZYMO RESEARCH)로부터 구입된 DNA 전환 키트(EZ DNA 메틸화 키트, D5002)를 사용하여 아황산염으로 DNA를 변형시켰다.

변형된 서열은 표 1에 표시되어 있다.

3) 증폭 및 검출

핵산 단편이 메틸화되어 있는지를 확인하기 위한 프라이머 및 프로브는 표 2에 표시되어 있다.

반응 시스템은 표 3에 표시되어 있다.

증폭 프로토콜은 표 4에 표시되어 있다.

검출이 완료된 후, 표준 곡선을 이용하여 각각의 세포주에서 각각의 핵산 단편 정량 시스템의 카피 수를 정량적으로 계산하였고, 17개의 방광암 세포주에서 각각의 핵산 단편의 메틸화 정도를 식 "핵산 단편의 카피 수 ÷ 기준 유전자 ACTB의 카피 수 X 100"으로 계산하였다.

17개의 방광암 세포주에서 6개의 핵산 단편의 메틸화 수준을 검출하였다. 검출 결과는 표 5에 표시되어 있다.

17개의 방광암 세포주에서 6개의 핵산 단편이 상이한 정도로 메틸화되어 있고, 이들 중 핵산 단편 3, 4 및 6이 다른 단편에 비해 더 많은 세포주에서 메틸화되어 있음을 표 5로부터 알 수 있다.

실시예 2

108개의 임상 조직 표본(66개의 방광암 조직 표본 및 42개의 방광암 준-암종 조직 표본을 포함함)에 대한 실시예 1의 각각의 핵산 단편의 민감도 및 특이성을 검출하였다.

실험 과정:

1) DNA 추출

마젠(Magen)으로부터 구입된 DNA 추출 키트(HiPure FFPE DNA 키트, D3126-03)를 사용하여 각각의 조직 슬라이스 표본으로부터 DNA를 추출하였다.

2) DNA 변형, 증폭 및 검출, 및 단편에 대한 프라이머와 프로브는 실시예 1과 동일하였다.

3) 계산 방법

검출이 완료된 후, 표준 곡선을 이용하여 각각의 세포주에서 각각의 핵산 단편 정량 시스템의 카피 수를 계산하였고, 각각의 조직 표본에서 각각의 핵산 단편의 메틸화 정도를 식 "핵산 단편의 카피 수 ÷ 기준 유전자 ACTB의 카피 수 X 100"으로 계산하였다. 마지막으로, 암 군과 대조군을 구별하는 기준으로서 역치를 선택하였다. 환산 비가 설정 역치보다 더 큰 경우, 메틸화는 양성으로서 판정되고, 환산 비가 설정 역치 이하인 경우, 메틸화는 음성으로서 판정된다. 기준에 따라, 108개의 임상 조직 샘플에서 6개의 핵산 단편을 검출한 통계학적 결과는 표 6에 표시되어 있고, ROC 곡선은 도 1a 내지 도 1f에 표시되어 있다.

결과는 상이한 단편들이 조직 샘플에 대한 민감도와 특이성에서 차이가 있음을 보여준다. 이들 중 핵산 단편 3 및 4의 민감도와 특이성은 다른 단편의 민감도와 특이성보다 더 높다.

실시예 3

본 개시내용의 핵산 단편 4를 문헌에 자주 보고된 방광암 유전자 메틸화 마커인 MEIS1, NKX6-2, OTX1, SIM2, SOX1, BARHL2, ZNF154 및 RUNX3과 비교하였다.

10개의 방광암 샘플 및 10개의 방광염 대조군 샘플을 포함하는 20개의 파라핀 포매 방광 조직 샘플을 채취하였다.

실험 과정:

1) DNA 추출

마젠으로부터 구입된 DNA 추출 키트(HiPure FFPE DNA 키트, D3126-03)를 사용하여 각각의 조직 슬라이스로부터 DNA를 추출하였다.

2) DNA 변형

자이모 리서치로부터 구입된 DNA 전환 키트(EZ DNA 메틸화 키트, D5002)를 사용하여 아황산염으로 DNA를 변형시켰다.

3) 증폭 및 검출

반응 시스템 및 증폭 프로토콜은 실시예 1과 동일하였다.

프라이머 서열은 표 7에 표시되어 있다.

4) 계산 방법은 실시예 2와 동일하였다.

20개의 조직 샘플에서 핵산 단편 4 및 마커의 검출 결과는 표 8에 표시되어 있고, 통계학적 분석 결과는 표 9에 표시되어 있다.

결과는 본 개시내용의 MEIS1, SIM2 및 핵산 단편 4가 방광암을 가진 환자의 암 조직 샘플과 방광암을 갖지 않은 사람의 방광 조직 샘플을 잘 구별할 수 있고 방광암 조직 표본에 대한 이들의 민감도 및 특이성 둘 다가 90%임을 보여준다.

실시예 4

샘플 정보: 45개의 방광암 샘플 및 52개의 대조군 샘플을 포함하는 97개의 소변 샘플.

본 실시예에서, DNA 추출 및 전환은 실시예 3과 동일하였다.

프라이머 및 프로브 서열은 표 10에 표시되어 있다.

본 실시예의 증폭 시스템은 표 11에 표시되어 있다.

본 실시예의 증폭 프로토콜은 표 12에 표시되어 있다.

97개의 소변 샘플에서, 메틸화 수준 검출의 Ct 값이 컷-오프 값보다 더 큰 경우 메틸화는 음성으로서 판정되고, 그렇지 않은 경우 메틸화는 양성으로서 판정된다. 핵산 단편 4의 검출에 대한 컷-오프 값은 34.65이고, MEIS1의 검출에 대한 컷-오프 값은 33.82이다. 검출 결과는 표 13에 표시되어 있다.

상기 검출 결과의 통계학적 분석 결과는 표 14에 표시되어 있고, ROC 곡선은 도 2에 표시되어 있다.

결과는 방광암을 검출하기 위해 소변 샘플에서 핵산 단편 4의 메틸화 수준을 검출할 때 검출 특이성이 100%만큼 높고 민감도가 91.1%임을 보여준다. 방광암을 검출하기 위해 소변 샘플에서 유전자 MEIS1의 메틸화 수준을 검출할 때, 검출 특이성은 단지 84.6%이고 민감도는 단지 71.1%이다.

실시예 5

샘플 정보: 1개의 저악성 잠재적 도립 요로상피 종양 샘플, 16개의 저악성 잠재적 유두상 요로상피 종양 샘플, 105개의 방광암 샘플, 31개의 전립선암 샘플, 17개의 신우암 샘플, 10개의 요관암 샘플 및 119개의 대조군 샘플을 포함하는 299개의 소변 샘플.

본 개시내용에서, DNA 추출과 전환, 핵산 단편 4에 대한 프라이머 및 프로브 서열, 증폭 시스템, 및 증폭 프로토콜은 실시예 4와 동일하였다.

다양한 유형의 종양 샘플들에서 핵산 단편 4의 검출 결과는 표 15에 표시되어 있다.

검출에서, ACTB 검출의 Ct 값이 32 미만이라는 것은 샘플이 적합하거나 작업이 정확함을 표시한다. 핵산 단편 4의 메틸화 수준의 검출의 Ct 값이 36.3 미만인 경우, 검출 결과는 양성인 것으로 표시되고, 그렇지 않은 경우, 검출 결과는 음성인 것으로 표시된다.

상기 검출 결과의 통계학적 분석 결과는 표 16에 표시되어 있고, ROC 곡선은 도 3에 표시되어 있다.

핵산 단편 4는 소변 샘플에서 다양한 유형의 종양의 검출에 대한 높은 민감도 및 특이성을 가짐을 상기 표의 결과로부터 알 수 있다.

실시예 6

프라이머 및 프로브는 종양 마커의 검출 효과에도 큰 영향을 미친다. 본 발명자들은 연구 과정에서 본 개시내용의 검출 시약이 임상 검출에 실제로 적용될 수 있게 하기 위해 검출 민감도와 특이성을 가능한 많이 개선할 수 있는 프로브 및 프라이머를 스크리닝하도록 많은 프라이머 쌍들과 이들의 상응하는 프로브들을 설계하였다. 일부 프라이머 및 프로브(6개의 세트)는 표 17에 표시되어 있고, 검출 결과는 표 18에 표시되어 있다. 본 발명자들은 아황산염을 사용한 전환에 의해 수득된 핵산 단편 4의 메틸화된 서열을 주형으로서 사용하여 모든 프라이머 및 프로브를 설계하였다. 이들은 산곤 바이오텍(상하이) 컴퍼니 리미티드(Sangon Biotech(Shanghai) Co., Ltd.)에 의해 합성되었다.

5637 방광암 세포주(양성) 및 SK-N-BE 세포주(음성)를 사용하여 프라이머 및 프로브 세트의 스크리닝을 수행하였다. 마이코플라스마 검출 및 세포 형태 분석을 통해 세포가 정상임을 확인하였다. 세포를 증식시키고 수거하였고, 퀴아젠으로부터 구입된 DNA 추출 키트(QIAGEN DNA 미니 키트, #51306)를 사용하여 DNA를 추출하였다. UV 분광광도계를 이용하여 추출된 DNA를 정량한 후, 자이모 리서치로부터 구입된 DNA 전환 키트(EZ DNA 메틸화 키트, D5002)를 사용하여 아황산염으로 변형시켰다. DNA를 1X TE 완충제로 6,000개 카피/㎕까지 희석하였다. 양성 기준 P0(100% 양성 DNA, 즉 핵산 단편 4의 메틸화 정도가 100%임) 및 음성 기준 N0(100% 음성 DNA, 즉 핵산 단편 4의 메틸화 정도가 0임)을 각각 수득하였다. 양성 DNA와 음성 DNA를 1:9의 비로 혼합함으로써 P1을 수득하였고, 양성 DNA와 음성 DNA를 1:99의 비로 혼합함으로써 P2를 수득하였고, 양성 DNA와 음성 DNA를 1:999의 비로 혼합함으로써 P3을 수득하였다.

실시예 1의 시스템 및 증폭 프로토콜에 따라 프라이머 용융 곡선을 수득하였고, 실시예 4의 검출 시스템 및 증폭 프로토콜에 따라 프라이머 및 프로브 세트의 증폭 결과도 수득하였다. 프라이머 및 프로브 세트의 증폭 곡선 및 용융 곡선은 도 4에 표시되어 있다.

상이한 기준에서의 프라이머 및 프로브 세트의 검출 결과 데이터는 표 18에 표시되어 있다.

결과 판정을 위한 컷-오프 값은 38이고, Ct 값이 38 이하인 경우 검출 결과는 양성인 것으로 표시되고, Ct 값이 38보다 더 큰 경우 검출 결과는 음성인 것으로 표시된다.

표 18에 나타낸 바와 같이, 6개의 프라이머와 프로브 조합 모두가 0.1%의 검출 한계(LOD)에서 5637 양성 방광암 세포주를 검출할 수 있고, 프라이머와 프로브 세트 CG441, CG446 및 CG447만이 SK-N-BE 음성 세포주에서 비특이적 증폭을 야기하지 않거나 이 세포주를 양성으로서 잘못 판정하지 않는다. 본 발명자들은 실제 임상 적용을 위해 기준 유전자 ACTB를 검출하기 위한 3개의 프라이머와 프로브 서열 세트를 설계하고 선택하였고, 기준의 검출 및 평가 결과는 프라이머 및 프로브 검출 시스템 A1, A2 및 A3의 검출 결과가 일관됨을 보여준다.

도 4는 검출 시스템 CG190, CG437 및 CG443의 용융 곡선이 2개의 피크를 갖고, 기준 P0, P1 및 P2의 검출 결과에서 용융 피크의 위치가 일관되고, 기준 P3 및 N0의 검출 결과에서 일부 검출 시스템의 용융 피크의 위치가 P0의 검출 결과와 크게 상이하고, 정량된 증폭 곡선의 Ct 값이, 검출 시스템이 음성 기준과 기준 P3을 잘 구별할 수 없음을 표시하고, 검출 한계가 1000분의 1에 도달할 수 없음을 보여준다. 검출 시스템 CG446의 용융 곡선도 2개의 피크를 갖고, N0의 검출 결과에서 CG446의 용융 피크의 위치는 P0의 검출 결과와 크게 상이하고, CG446의 정량된 증폭 곡선의 Ct 값은 검출 시스템이 음성 기준과 기준 P3을 잘 구별할 수 있음을 표시하고, 검출 한계는 1000분의 1에 도달할 수 있다. 검출 시스템 CG441 및 CG447의 용융 곡선은 단일 피크를 갖고, N0의 검출 결과에서 증폭 곡선 및 생성물 용융 피크는 없고, CG441 및 CG447의 정량된 증폭 곡선의 Ct 값은 검출 시스템이 음성 기준과 기준 P3을 잘 구별할 수 있음을 표시하고, 검출 한계는 1000분의 1에 도달한다. 플랫폼 단계에서 CG447의 형광 신호 강도는 CG441 및 CG446의 형광 신호 강도보다 유의미하게 더 낮다.

실시예 7

프라이머 및 프로브 세트 CG441은 193개의 소변 표본(89개의 방광암 표본 및 104개의 대조 표본을 포함함)에서 검출되었고, 증폭 시스템 및 증폭 프로토콜은 실시예 4와 동일하였다. 검출 결과는 표 19에 표시되어 있다.

결과 판정을 위한 컷-오프 값은 38.6으로서 설정되고, Ct 값이 38.6 이하인 경우 검출은 양성으로서 판정되고, Ct 값이 38.5보다 더 큰 경우 검출 결과는 음성으로서 판정된다. 193개의 소변 샘플에서 방광암 샘플에 대한 핵산 단편 4의 수득된 검출 특이성은 93.3%이고, 민감도는 84.3%이고, ROC 곡선하면적은 0.931이다(P＜0.001)이다. ROC 곡선은 도 5에 표시되어 있다.

참고자료:

1. Mbeutcha, A., Lucca, I., Mathieu, R., Lotan, Y. & Shariat, S. F. Current Status of Urinary Biomarkers for Detection and Surveillance of Bladder Cancer. Urologic Clinics of North America 43, 47-62 (2016).

<110> Creative Biosciences (Guangzhou) Co., LTD. <120> Tumor Detection Reagent and Kit <130> 2022-FPA-1831 <150> CN202010361690.9 <151> 2020-04-30 <160> 83 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(366) <223> nuclear acid fragment 1 sequence <400> 1 agctcggctt tgccaagcgc cccaggccag taagagcggt gcagccgagc cggcgcccca 60 gaagccgaga ggttacacaa gtctacgcag agaggcgcac cggacacggt aattaggagc 120 aattcacacg ctctcgggcg cacggaaact acttgtcagg aaattttcaa cgctcctcct 180 cgcccacttt tttccactcc tttcctggcg cgccccctcc cctcccagag gcacgcagtg 240 gagcttttgg agtttcgaat ctttcggaca ctgcagaatg cggggctccc cgggcgcggg 300 cccggccaat cagagcgccg tctgcctccc ctggccaatg gcaggcgcca cattgttgtc 360 caattc 366 <210> 2 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(372) <223> nuclear acid fragment 2 sequence <400> 2 tggagcccta aggaccaaca atagagcggg cgagcggctc attgagagtc tggcagcgcc 60 gggcaactgg gccccggctg cgcgcagcgt ccggcgcgca 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ctccccaggt ggaaacctgc gcatcttcgt tcgctctgcg 1020 cttctccaca ggccctttcc ctctgctcct t 1051 <210> 5 <211> 1200 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1200) <223> nuclear acid fragment 5 sequence <400> 5 cgacacgttt tctcccctcc cagaggccaa gttgcagaag tttgacctgt ttcctaagac 60 gctgctgcag gcaggccgcc cgggcagccc gctgccgccg ccggtgaagc ccttatcacc 120 cgacggcgca gactcggggc ccgggacgtc gtccccagag gtgcggcccg gctcaggctc 180 ggagaacggc gatggcgagt ccttttctgg ttcgccccta gctcgggcct ccaaagaggc 240 aggtggcagc tgcccaggca gcgctggccc tggcggcggc ggcgaggagg acagcccggg 300 ctccgctagc cctctgggct ctgaatccgg ttcagaggct gacaaagaag agggtgaggc 360 cgcgccggcg ccagggctgg gcggaggctc gggtccacgg cagcggacgc cgctggatat 420 cttgacacgc gtgttcccag gccaccggcg aggcgtcctg gagctggtgt tgcagggctg 480 cggcggcgac gtggtgcagg ccatcgagca ggtgctgaac caccaccgtg ggggcctggc 540 ggccggcctg ggccctgcgg cgcccccaga taaggccgcc gtgggtgctg cagcagctgc 600 agacgacgcg tggcccagcc gcgtcgacgc cgccgccgcc gccgccgccg ccgccggggg 660 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ttagggttgg gcggaggttc gggtttacgg tagcggacgt cgttggatat 420 tttgatacgc gtgtttttag gttatcggcg aggcgttttg gagttggtgt tgtagggttg 480 cggcggcgac gtggtgtagg ttatcgagta ggtgttgaat tattatcgtg ggggtttggc 540 ggtcggtttg ggttttgcgg cgtttttaga taaggtcgtc gtgggtgttg tagtagttgt 600 agacgacgcg tggtttagtc gcgtcgacgt cgtcgtcgtc gtcgtcgtcg tcgtcggggg 660 gtttgggttg tttgcgtcgt tgtaggcggg gttcgtcgta ttttcgtatt atagattttt 720 gttggtcggc gttatggcgt ttggggcgtt gggttcgttg agtagtcgtt cggttttttc 780 gtcgttgtag tttaacgtta gttatttcgg tgtcgacgcg ggcgtttatt cgttgggcgc 840 gtcgttcggt tttagttttt tgcgtttggt ttatttcgcg gcggcggcgt atagtcgcgg 900 tttggttttt atggcgtttt attttattgt cggtttggtg tttacgttcg gttttcgttt 960 atttatggat tacgttttta gcgattttat gcgtgatcgt tcggtcgtcg ttgttgcggc 1020 ggtgtataag gagtcgattt acggcggcgg tttgtacggg tttatggtta acggcgtttc 1080 ggagaagtag tagggcgagg ggtttggtag tcggtcggtt tttaaatagg aattttagtt 1140 ttgttttcgc gggttatcga ttttttttcg tttagcgttt tttttgcgtt ttggttgggt 1200 1200 <210> 30 <211> 273 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nuclear acid fragment 6 sequence after modification <400> 30 gaaaataatg tcgaatttcg tttcgttttt cgagaaatag ggggtggggg tggggcgttg 60 gggaaggtcg tgatttttta tttaggtcgc ggcgttaagg agacgtttgt tcgaggtttc 120 gtgggatttt cgattttcgg ggttattggg agaggagatt ttttgtggta ttcggaagat 180 ttattttatt agagtggcgc ggggtttata attttcgaag gattcgcgat cgttgagtag 240 agggaatata gtgtgtattt tagtttgggt att 273 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CG443 forward primer <400> 31 aggttcgttt acgaggtttt c 21 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CG443 reverse primer <400> 32 cctacgccaa ctactccg 18 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CG443 probe <400> 33 cgaacgctcc cgctccaaa 19 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CG447 forward primer <400> 34 tgcgttaagt gtacgtttat c 21 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CG447 reverse primer <400> 35 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ggtggtggtt 20 <210> 52 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB (internal reference gene) forward primer <400> 52 tggtgatgga ggaggtttag taagt 25 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB (internal reference gene) reverse primer <400> 53 aaccaataaa acctactcct cccttaa 27 <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nuclear acid fragment 4 forward primer <400> 54 gcgttcggag ttgtttagc 19 <210> 55 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nuclear acid fragment 4 reverse primer <400> 55 caccgacgcc acaaacg 17 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MEIS1 forward primer <400> 56 gttcgggata agatttcggg g 21 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MEIS1 reverse primer <400> 57 taattaaaac tacgcaaccc gact 24 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKX6-2 forward primer <400> 58 agaagaagta ttcgcgttcg at 22 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKX6-2 reverse primer <400> 59 gatcataccc aacgaataaa cg 22 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTX1 forward primer <400> 60 gttagtagta gtagagcggg agc 23 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTX1 reverse primer <400> 61 gacgtaaatt aaccactact ttcg 24 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIM2 forward primer <400> 62 gtaggcgtag aggggataat tcg 23 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIM2 reverse primer <400> 63 accccgcgct aaatctacaa c 21 <210> 64 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX1 forward primer <400> 64 taattaggat cgggttaaac ggt 23 <210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX1 reverse primer <400> 65 aaacgcttac taatctccga at 22 <210> 66 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARHL2 forward primer <400> 66 cgttagtagt cggattataa gcgaac 26 <210> 67 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARHL2 reverse primer <400> 67 aaaaattacg aaacaaacac gaccg 25 <210> 68 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZNF154 forward primer <400> 68 gttaggtttg ggatagggat cg 22 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZNF154 reverse primer <400> 69 cgctaccatc aaactctacg 20 <210> 70 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RUNX3 forward primer <400> 70 gaggtttagt acgcgttcg 19 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RUNX3 reverse primer <400> 71 cccgcctcct aaatctatcg 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nuclear acid fragment 4 forward primer <400> 72 gcgttcggag ttgtttagcg 20 <210> 73 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nuclear acid fragment 4 reverse primer <400> 73 caccgacgcc acaaacga 18 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nuclear acid fragment 4 probe <400> 74 ctattaccgc cgccgccgtc g 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MEIS1 forward primer <400> 75 gttcgggata agatttcggg g 21 <210> 76 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MEIS1 reverse primer <400> 76 taattaaaac tacgcaaccc gact 24 <210> 77 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MEIS1 probe <400> 77 cgagaggggt cgggcgagtt ag 22 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A1 forward primer <400> 78 ttggattgtg aatttgtgtt tgt 23 <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A1 reverse primer <400> 79 caataaaacc tactcctccc tta 23 <210> 80 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A2 forward primer <400> 80 gatggaggag gtttagtaag tt 22 <210> 81 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A2 reverse primer <400> 81 caataaaacc tactcctccc tta 23 <210> 82 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 forward primer <400> 82 ggaggtttag taagtttttt ggatt 25 <210> 83 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A3 reverse primer <400> 83 caataaaacc tactcctccc tta 23

Claims (17)

1. 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 46, 또는 서열번호 47로서 표시된 서열들 중 어느 한 서열, 또는 이의 상보적 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
   임의로, 서열번호 31 및 서열번호 32, 서열번호 34 및 서열번호 35, 서열번호 37 및 서열번호 38, 서열번호 40 및 서열번호 41, 서열번호 43 및 서열번호 44, 또는 서열번호 46 및 서열번호 47로서 표시된 임의의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머와 각각 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 다수의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
   임의로, 서열번호 34 및 서열번호 35, 서열번호 43 및 서열번호 44, 또는 서열번호 46 및 서열번호 47로서 표시된 임의의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머와 각각 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 다수의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
   임의로, 서열번호 43 및 서열번호 44로서 표시된 프라이머 쌍의 각각의 프라이머와 각각 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 다수의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머.
2. 서열번호 33, 서열번호 36, 서열번호 39, 서열번호 42, 서열번호 45 또는 서열번호 48로서 표시된 서열들 중 어느 한 서열 또는 이의 상보적 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브;
   임의로, 서열번호 36, 서열번호 45 또는 서열번호 48로서 표시된 서열들 중 어느 한 서열 또는 이의 상보적 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브;
   임의로, 서열번호 45로서 표시된 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브.
3. 청구항 1 및/또는 청구항 2에 있어서,
   종양을 검출하는 데 사용하기 위한 프라이머 및/또는 프로브.
4. 종양 검출 시약 또는 키트의 제조에 있어서 청구항 1에 따른 프라이머 및/또는 청구항 2에 따른 프로브의 용도.
5. 종양 검출 시약 또는 키트의 제조에 있어서 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 용도.
6. 종양 검출 시약 또는 키트의 제조에 있어서 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하는 시약의 용도.
7. 검출될 샘플을 하이드로아황산염 또는 중아황산염 또는 하이드라진 염으로 처리하여, 검출될 변형된 샘플을 수득하는 단계; 및
   서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하는 시약을 사용하여, 검출될 변형된 샘플에서 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하는 단계;
   임의로, 검출을 위해 실시간 형광 정량 메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응을 이용하는 단계;를 포함하는, 샘플에서 뉴클레오타이드 서열의 메틸화를 검출하는 방법.
8. 대상체로부터 검출될 샘플에서 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하는 단계로서, 임의로 상기 샘플에서 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 청구항 7에 따른 검출 방법으로 검출하는 단계; 및
   메틸화 수준 검출 방법에 의해 대상체의 샘플에서 수득된, 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준, 임의로 청구항 7에 따른 검출 방법에 의해 대상체의 샘플에서 검출된, 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준과, 정상 대조군 샘플에서 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준의 편차, 임의로 상대적 차이에 따라 대상체가 종양을 갖거나 가질 위험이 있는지를 표시하는 단계;를 포함하는, 대상체에서 종양을 검출하는 방법.
9. 대상체로부터 검출될 샘플에서 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양을 검출하는 단계; 및
   대상체에서의 종양 검출이 대상체가 종양을 갖거나 가질 위험이 있음을 표시하는 경우 종양을 치료하는 단계;를 포함하는, 대상체에서 종양을 치료하는 방법으로서,
   임의로, 상기 샘플에서 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준이 청구항 7에 따른 검출 방법에 의해 검출되고;
   임의로, 대상체의 종양이 청구항 8에 따른 검출 방법에 의해 검출되고;
   임의로, 치료가 수술, 화학요법, 방사선요법, 화학방사선요법, 면역요법, 종양용해성 바이러스 요법 및 이들의 조합 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
10. 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하는 시약을 포함하는 종양 검출 시약.
11. 청구항 9에 따른 종양 검출 시약을 포함하는 키트.
12. 청구항 6 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    메틸화 검출 시약이 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브를 포함하고;
    임의로, 프라이머들 중 정방향 프라이머가 하기 뉴클레오타이드 서열들 중 어느 한 뉴클레오타이드 서열을 갖고:
    I. 서열번호 31, 서열번호 34, 서열번호 37, 서열번호 40, 서열번호 43 또는 서열번호 46으로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열, 또는
    II. I에 제시된 서열의 상보적 서열;
    임의로, 프라이머들 중 역방향 프라이머가 하기 뉴클레오타이드 서열들 중 어느 한 뉴클레오타이드 서열을 갖고:
    III. 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 41, 서열번호 44 또는 서열번호 47로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열, 또는
    IV. III에 제시된 서열의 상보적 서열;
    임의로, 프라이머가 서열번호 31 및 서열번호 32, 서열번호 34 및 서열번호 35, 서열번호 37 및 서열번호 38, 서열번호 40 및 서열번호 41, 서열번호 43 및 서열번호 44, 또는 서열번호 46 및 서열번호 47로서 표시된 임의의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머와 각각 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 다수의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
    임의로, 프라이머가 서열번호 34 및 서열번호 35, 서열번호 43 및 서열번호 44, 또는 서열번호 46 및 서열번호 47로서 표시된 임의의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머와 각각 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 다수의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
    임의로, 프라이머가 서열번호 43 및 서열번호 44로서 표시된 프라이머 쌍의 각각의 프라이머와 각각 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 다수의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
    임의로, 프로브가 하기 뉴클레오타이드 서열들 중 어느 한 뉴클레오타이드 서열을 갖고:
    V. 서열번호 33, 서열번호 36, 서열번호 39, 서열번호 42, 서열번호 45 또는 서열번호 48로서 표시된 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열, 또는
    VI. V에 제시된 서열의 상보적 서열;
    임의로, 프로브가 서열번호 36, 서열번호 45 또는 서열번호 48로서 표시된 서열들 중 어느 한 서열 또는 이의 상보적 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
    임의로, 프로브가 서열번호 45로서 표시된 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 방법, 종양 검출 시약, 키트 또는 용도.
13. 청구항 3 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    검출될 샘플이 조직, 체액 및 배설물로부터 선택되고;
    임의로, 조직이 방광 조직으로부터 선택되고;
    임의로, 체액이 혈액, 혈청, 혈장, 세포외액, 조직액, 림프액, 뇌척수액 및 방수 중 적어도 하나로부터 선택되고;
    임의로, 배설물이 객담, 소변, 타액 및 대변 중 적어도 하나로부터 선택되고;
    임의로, 배설물이 소변으로부터 선택되는 것인 용도, 방법, 종양 검출 시약 또는 키트.
14. 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열에 대한 프라이머를 설계하는 단계를 포함하는 프라이머 설계 방법.
15. 1) 입력 구성요소;
    2) 처리 구성요소; 및
    3) 출력 구성요소;를 포함하는 프라이머 설계 시스템으로서,
    임의로, 입력 구성요소가 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 판독하도록 구성되고;
    임의로, 처리 구성요소가 입력 구성요소에 의해 판독된 정보를 기반으로 프라이머를 설계하는 프로그램으로 로딩되고;
    임의로, 출력 구성요소가 처리 구성요소에 의해 설계된 프라이머 서열을 출력하도록 구성된 것인 프라이머 설계 시스템.
16. a. 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준을 검출하는 구성요소; 및
    b. 결과 판정 시스템;을 포함하는 종양 검출 시스템으로서,
    임의로, 메틸화 수준 검출 구성요소가 청구항 10 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 따른 검출 시약 또는 키트를 포함하고;
    임의로, 결과 판정 구성요소가 검출 시스템에 의해 검출된, 서열번호 4로서 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열의 메틸화 수준에 따라 종양을 가질 위험 및/또는 종양 유형을 출력하도록 구성되고;
    임의로, 검출될 샘플의 메틸화 수준을 정상 샘플의 메틸화 수준과 비교하고, 검출될 샘플의 메틸화 수준과 정상 샘플의 메틸화 수준 사이에 유의미한 차이 또는 현저히 유의미한 차이가 있는 경우, 검출될 샘플이 종양을 가질 높은 위험을 가진다고 판정함으로써, 종양을 가질 위험을 판정하는 것인 종양 검출 시스템.
17. 청구항 3 내지 청구항 13 및 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 요로상피 종양으로부터 선택되고; 임의로, 종양이 방광암, 요관암, 신우암 및 요도암으로부터 선택되고; 임의로, 종양이 방광암으로부터 선택되는 것인 프라이머, 프로브, 용도, 뉴클레오타이드 서열, 종양 검출 시약, 키트, 방법 또는 시스템.

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