JP2023524224A - 大腸癌の早期検出、治療応答性および予後の予測のための方法 - Google Patents
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- C12Q2600/154—Methylation markers
Abstract
Description
本開示は、大腸癌のリスクまたは感受性の予測のためのエピジェネティックバイオマーカーに関する。特に、本開示は、遺伝子バイオマーカーのメチル化状態に基づく大腸癌の早期検出、治療応答性の予測および予後予測のための方法を提供する。
癌は、身体の他の部位に侵入または拡散する可能性のある異常な細胞増殖を含む疾患群であり、世界の主要な死因である。
本開示は、大腸癌の早期検出、治療応答性の予測および予後予測のための1以上の新規なエピジェネティックバイオマーカーを開示する。エピジェネティックバイオマーカーの異常なメチル化は、癌患者由来の腫瘍組織および血漿サンプルで検出されるが、正常個体では検出されない。本開示はまた、本明細書で使用されるプライマーおよびプローブも開示する。
TMEM240もしくはそのフラグメントのCt値が45未満であればTMEM240のスコア1と定義し;TMEM240もしくはそのフラグメントのCt値が45以上であればTMEM240のスコアを0と定義すること;
MROH6もしくはそのフラグメントのCt値が40未満であればMROH6のスコアを1と定義し;MROH6もしくはそのフラグメントのCt値が45以上であればMROH6のスコアを0と定義すること;
BEND5もしくはそのフラグメントのCt値が45未満であればBEND5のスコアを1と定義し、スコアを合計し;BEND5もしくはそのフラグメントのCt値が45以上であればBEND5のスコアを0定義すること;または
SMAD3もしくはそのフラグメントのCt値が45より高ければSMAD3のスコアを1と定義し;SMAD3もしくはそのフラグメントのCt値が45以下であればSMAD3のスコアを0と定義すること;および
TMEM240、MROH6、BEND5およびSMAD3のスコアを合計すること
をさらに含む。
本発明は本明細書に記載される特定の材料および方法に限定されるものではないと理解される。本明細書で使用される技術用語は、特定の実施形態を記載するためのものであり、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきできる。
サンプル調製
血液サンプルは、in vitro診断ccfDNA検査用に特殊設計されたETDA-K2チューブおよびPAXgene Blood ccfDNA(循環細胞非含有DNA)チューブ(Qiagen、ヒルデン、ドイツ、768165)を用いて採取した。ETDA-K2チューブ(BD、プリマス、UK、367525)を用いて採取したサンプルは、すぐに2000×g、4℃で10分間遠心分離した。2時間以内に、各サンプルからの上清を新しい遠沈管に移し、6000×g、4℃で30分間遠心分離した後、-80℃で保存した。PAXgene Blood ccfDNAチューブを用いて採取したサンプルは、3日以内の使用まで室温(15~25℃)で維持し、その後、2000×g、4℃で10分間、次いで血漿分離のために6000×g、4℃で30分間遠心分離した。各サンプルの血漿を1.6mLアリコートに分割し、さらなる使用まで-80℃で冷凍した。
欧米のコホートのデータは、Genomic Data Commons(GDC)データポータルのThe Cancer Genome Atlas(TCGA)研究ネットワークによって作成されたデータに基づいている。The Cancer Genome Atlas(TCGA)は、米国国立癌研究所(NCI)と米国立ヒトゲノム研究所(NHGRI)の共同研究で、33種類の癌における主要なゲノム変化の包括的な多次元マップを作成した。現在、癌の予防、診断および治療を改善するために癌研究コミュニティに2ペタバイトを超えるゲノムデータからなるTCGAデータセットが利用可能である。
同じ患者の原発腫瘍と隣接する結腸直腸組織の一致する対からのゲノムDNAを、製造者の説明書に従い、QIAamp DNA MiniKit(Qiagen、ボン、ドイツ、カタログ番号51306)を用いて抽出した。DNA定量の後、NanoDrop ND-1000分光光度計(NanoDrop Technologies Inc、ウィルミントン、DE、USA)を用いてA260/A280比(範囲1.8~2.0)を測定することによって純度を確認した。
血漿サンプルからの循環細胞非含有DNA(cfDNA)は、製造者の推奨プロトコールに従い、MagMAX Cell-free DNA単離キット(Thermo Fisher Scientific、オースティン、TX、USA)またはCatch-cfDNA血清/血漿キット(CatchGene、新北市、台湾)を用いて抽出した。ccfDNAサンプルは140~200bpの間に明瞭なフラグメントサイズのピークを持っていた。DNA単離キットから最高収量および低分子量画分が得られた。血漿は、すぐに、10mLの末梢血から2時間以内に単離した。DNA定量の後、NanoDrop ND-1000分光光度計(NanoDrop Technologies、Inc.、ウィルミントン、DE、USA)を用いてA260/A280比(範囲1.8~2.0)を測定することによって純度を確認した。
KingFisher(商標)Duo Prime精製システム(ThermoFisher Scientific、シンガポール)でのccfDNA抽出およびバイサルファイト変換のための自動処理を製造者の説明書に従って適用した。この処理は、同時に最大6つのサンプルの磁性ビーズに基づくDNA抽出を完全に自動で行う。ワークフローは、MagMAX(商標)細胞非含有DNA単離キット(ThermoFisher Scientific、オースティン、TX、USA、A29319)とともに供給されている説明マニュアルに記載されているように適合させた。ccfDNAを1.6mLの血漿から抽出し、60μLの分子生物学グレードの水(Corning、NY、USA、46-000-CM)に溶出させた。バイサルファイト変換の洗浄も、この機器で半自動アッセイとして行った。バイサルファイト変換洗浄の自動プロトコールは、EZ-96DNA Methylation-Lightning(商標)MagPrepキット(Zymo Research、アーバイン、CA、USA、D5046)とともに供給されている説明マニュアルを用いて開発した。抽出されたccfDNAを60℃のインキュベーター内で30分間、重硫酸ナトリウム(6M)およびヒドロキノン(10mM)とともにインキュベートした後、自動処理を行った。本発明者らはバイサルファイト変換に60μLのccfDNAを使用し、バイサルファイトにより変換されたccfDNAを100μLの分子生物学グレード水に溶出させた。24ディープウェルプレート(ThermoFisher Scientific、ヴァンター、フィンランド、95040470)を用いて自動サンプル処理を行った。溶出したバイサルファイト変換ccfDNAをすぐにメチル化特異的リアルタイムPCRのために使用した。
製造者の説明書に従い、LabTurbo 24 Compact System(Taigen Bioscience Co.、台北市、台湾)を用いて自動ccfDNA抽出処理を行った。ワークフローは、Labturbo循環DNAミニキット(カタログ番号AIOLCD1600、Taigen Bioscience Co.、台北市、台湾)とともに供給されている説明マニュアルに従い、同時に最大24サンプルの真空に基づく完全自動DNA抽出を用いた。1.6mLの血漿からccfDNAを抽出し、60μLの分子生物学グレード水(46-000-CM、Corning、NY、USA)に溶出させた。
メチル化EPIC BeadChip(EPIC)アレイは、850,000のCpG部位をカバーし、90%を超えるCpGおよび99%のHM450由来Refseq遺伝子およびさらに413,743のCpGを含む。EPICアレイは、血液サンプルの450Kプラットフォームと比較して評価された。ゲノムワイドメチル化解析は、Infinium(登録商標)メチル化EPIC BeadChipアレイ(Illumina、サンディエゴ、CA、USA)を用いて行った。バイサルファイト変換は、500ngのDNAに対して、製造者の説明書に従ってEpiTect Fast DNAバイサルファイトキット(QIAGEN、ボン、ドイツ、カタログ番号59826)を用いて行った。各CpG部位のメチル化スコアは、メチル化および非メチル化シグナル出力の合計に対するメチル化シグナル強度の比を決定することにより、0(非メチル化)~1(完全メチル化)の範囲の「β」値として表される。Infinium MethylationEPIC BeadChipデータを、GenomeStudio Methylation Moduleバージョン2011.1を用いて分析した。Infinium MethylationEPIC BeadChipは、Infinium IアッセイとInfinium IIアッセイの両方を用いる。Infinium Iアッセイデザインは、CpG遺伝子座当たり、メチル化状態および非メチル化状態それぞれに1つとして2つのビーズタイプを使用する。Infinium IIデザインは1つのビーズタイプを使用し、メチル化状態はハイブリダイゼーション後に単一塩基伸張工程で決定される(右のパネル)。標的遺伝子の差次的にメチル化されたCpGヒートマップは、ヒートマッパーソフトウエアを用いてヒートマップにより可視化した。低~高のDNAメチル化レベルを可視化するために勾配スケールヒートマップを使用した。
製造者の推奨プロトコールに従って行ったDNAのバイサルファイト変換の後、TMEM240、MROH6、BEND5、およびSMAD3のDNAメチル化レベルを、LightCycler 96(Roche Applied Science、ペンツベルク、ドイツ)を用いたTaqMan定量的メチル化特異的PCR(qMSP)で測定した。SensiFAST(商標)プローブNo-ROXキット(Bioline、ロンドン、UK、カタログ番号BIO-86020)を候補遺伝子の特異的プライマーおよびメチル-TaqManプローブとともに用いてqMSPを行った。対照群に対して計算された正規化DNAメチル化値は、LightCycler Relative Quantificationソフトウエア(バージョン1.5、Roche Applied Science)を用いて得た。メチル化非依存性DNA対照としてβ-アクチン(ACTB)遺伝子を使用した。CpG部位のないACTB遺伝子のプライマー/プローブを設計した(投入DNAの対照として)。候補遺伝子のプライマー/プローブは、それらのメチル化プロモーター領域、特に、正常組織と腫瘍組織の間に特定された差次的領域に対して設計した。シークエンシング結果によれば、全てのCpG部位がメチル化される場合にのみ首尾良くPCR反応が起こり得る。標的遺伝子は、対とされた正常結腸直腸組織サンプルに比べて結腸直腸腫瘍でメチル化レベルがACTB遺伝子のメチル化レベルの少なくとも2倍となった場合に高メチル化と見なした。候補遺伝子メチル化最終産物の特異性は、バイサルファイトシークエンシングによって確認した。qMSPに使用したプライマーおよびプローブを表1に挙げる。
ピアソンのカイ二乗検定、マン・ホイットニーU検定、ウィルコクソン検定およびスピアマンの順位相関分析は、SPSS(IBM、アーモンク、NY、USA)を用いて行った。大腸癌患者を候補遺伝子のメチル化、RNA発現およびその他の臨床データの観点から比較するために、ピアソンのカイ二乗検定を使用した。腫瘍とマッチした隣接する正常組織との間、異なる癌種間のメチル化の違い、ならびに大腸癌患者における手術治療間の候補ccfDNAメチル化の違いを比較するためにペアサンプルウィルコクソン検定およびt検定を使用した。腫瘍および血漿サンプルのメチル化レベルを分析するためにスピアマンの順位相関を採用した。
Illumina Methylation 450Kアレイに基づくデータのβ値は、The Cancer Genome Atlas(TCGA)研究ネットワークから作成された。正常組織からのβ値が0.15未満であり;Δβ値(腫瘍の値から正常組織の値を差し引いたもの)が0.5より高いかまたは0.25より低い場合に、それらの標的核酸および遺伝子を選択した。標的DNA配列のメチル化状態Δβ値(T)を表2に示す。
循環細胞非含有DNAを血漿から抽出した。簡単に述べれば、3.5mLの血漿をすぐに10mLの末梢血から単離した。大腸癌患者および健常被験者から得た血漿から循環細胞非含有DNA(cfDNA)を抽出した後、バイサルファイト変換によってcfDNAの性能を調べた。プローブに基づくメチル化特異的リアルタイムPCR(qMSP)をcfDNAメチル化解析に使用した。
Claims (24)
- 被験者において大腸癌の素因を検出する、または大腸癌の可能性、治療応答性、予後もしくは再発を予測するための方法であって、(a)前記被験者から生物学的サンプルを準備すること、および(b)前記生物学的サンプルにおいてTMEM240もしくはそのフラグメントまたはMROH6もしくはそのフラグメントを含む標的DNA配列のメチル化状態を決定することを含み、前記被験者の標的DNA配列における高メチル化または低メチル化の存在が大腸癌の素因、可能性、治療応答性の不良、予後不良または再発を示す、方法。
- 前記生物学的サンプルが組織、細胞、血液、尿、血清、血漿、便、腹水、痰、唾液、胃液、胆汁、または口腔粘膜である、請求項1に記載の方法。
- 各遺伝子またはそのフラグメントの高メチル化または低メチル化が存在すればスコアを1と定義し、各遺伝子またはそのフラグメントの高メチル化または低メチル化が不在であればスコア0と定義し、そのスコアを合計する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記被験者の標的DNA配列における高メチル化または低メチル化の存在が、標的DNA配列のメチル化状態と対照DNA配列のメチル化状態を比較することによって決定される、請求項1に記載の方法。
- 前記メチル化状態がポリメラーゼ連鎖反応により決定される、請求項1に記載の方法。
- ヒト被験者におけるTMEM240またはそのフラグメントのメチル化状態を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応のCt値が50未満である場合に前記高メチル化が示される;または、ヒト被験者におけるMROH6またはそのフラグメントのメチル化状態を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応のCt値が45未満である場合に前記高メチル化が示される、請求項5に記載の方法。
- ヒト被験者におけるTMEM240またはそのフラグメントのメチル化状態を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応のCt値が45未満である場合に高メチル化が示される;または、ヒト被験者におけるMROH6またはそのフラグメントのメチル化状態を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応のCt値が40未満である場合に高メチル化が示される、請求項5に記載の方法。
- TMEM240もしくはそのフラグメントまたはMROH6もしくはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プライマーがメチル化の決定に使用され、TMEM240もしくはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プライマーが配列番号1、2、および3からなる群から選択される配列と約85%の同一性を有し;MROH6もしくはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プライマーは、配列番号5および6からなる群から選択される配列と約85%の同一性を有する、請求項1に記載の方法。
- TMEM240もしくはそのフラグメントまたはMROH6もしくはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プローブがメチル化の決定において使用され、TMEM240もしくはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プローブは、配列番号4の配列と約85%の同一性を有し;MROH6もしくはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プローブは、配列番号7の配列と約85%の同一性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記標的DNA配列は、BEND5もしくはそのフラグメントおよびSMAD3もしくはそのフラグメントからなる群から選択される1以上のDNA配列、またはその組合せのいずれかをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標的DNA配列が、以下のDNA配列の組合せ:TMEM240またはそのフラグメントおよびMROH6またはそのフラグメント;TMEM240またはそのフラグメント、MROH6またはそのフラグメントおよびBEND5またはそのフラグメント;TMEM240またはそのフラグメント、MROH6またはそのフラグメント、BEND5またはそのフラグメントおよびSMAD3またはそのフラグメント;TMEM240またはそのフラグメント、BEND5またはそのフラグメントおよびSMAD3またはそのフラグメント;TMEM240またはそのフラグメント、MROH6またはそのフラグメント、およびSMAD3またはそのフラグメント;MROH6またはそのフラグメントおよびBEND5またはそのフラグメント;ならびにMROH6またはそのフラグメント、BEND5またはそのフラグメントおよびSMAD3またはそのフラグメントのいずれかを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記メチル化状態がポリメラーゼ連鎖反応により決定され、ヒト被験者におけるBEND5もしくはそのフラグメントのメチル化状態を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応のCt値が50未満である場合に高メチル化が示される;または、ヒト被験者におけるSMAD3もしくはそのフラグメントのメチル化状態を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応のCt値が40より高い場合に低メチル化が示される、請求項10または11に記載の方法。
- 前記メチル化状態がポリメラーゼ連鎖反応により決定され、ヒト被験者におけるBEND5もしくはそのフラグメントのメチル化状態を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応のCt値が45未満である場合に高メチル化が示される;または、ヒト被験者におけるSMAD3もしくはそのフラグメントのメチル化状態を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応のCt値が45より高い場合に低メチル化が示される、請求項10または11に記載の方法。
- BEND5もしくはそのフラグメントまたはSMAD3もしくはそのフラグメントまたはその組合せの標的DNA配列メチル化特異的プライマーがメチル化の決定において使用され、BEND5またはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プライマーは、配列番号8~11からなる群から選択される配列と約85%の同一性を有し;SMAD3もしくはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プライマーは、配列番号14~15からなる群から選択される配列と約85%の同一性を有する、請求項10または11に記載の方法。
- BEND5もしくはそのフラグメント、またはSMAD3もしくはそのフラグメントまたはその組合せの標的DNA配列メチル化特異的プローブがメチル化の決定において使用され、BEND5またはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プローブは、配列番号12~13からなる群から選択される配列と約85%の同一性を有し;SMAD3またはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プローブは、配列番号16の配列と約85%の同一性を有する、請求項10または11に記載の方法。
- メチル化状態を決定することが、加重和スコア解析により特異度および感度を測定する工程をさらに含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号1~16からなる群から選択される配列を有する単離された核酸分子。
- 被験者において大腸癌の素因を検出する、または大腸癌の可能性、治療応答性、予後もしくは再発を予測するためのキットであって、TMEM240もしくはそのフラグメントまたはMROH6もしくはそのフラグメントを含む標的DNA配列のメチル化状態を検出するための標的DNA配列メチル化特異的プライマー対を含む、キット。
- TMEM240もしくはそのフラグメントまたはMROH6もしくはそのフラグメントを含む標的DNA配列のメチル化状態を検出するための標的DNA配列メチル化特異的プローブをさらに含む、請求項18に記載のキット。
- TMEM240またはそのフラグメントのための標的DNA配列メチル化特異的プライマー対が配列番号1と2または1と3を含み;MROH6またはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プライマー対が配列番号5と6を含む、請求項18に記載のキット。
- TMEM240またはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プローブが配列番号4を含み;MROH6またはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プローブが配列番号7を含む、請求項19に記載のキット。
- 前記標的DNA配列がBEND5もしくはそのフラグメントまたはSMAD3もしくはそのフラグメントをさらに含み、前記キットがBEND5もしくはそのフラグメントまたはSMAD3もしくはそのフラグメント、またはそのいずれかの組合せのメチル化状態を検出するための1以上の標的DNA配列メチル化特異的プライマー対をさらに含む、請求項18~21のいずれか一項に記載のキット。
- BEND5またはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プライマー対が配列番号8と9または10と11を含み;SMAD3またはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プライマー対が配列番号14と15を含む、請求項22に記載のキット。
- 前記キットがBEND5もしくはそのフラグメントまたはSMAD3もしくはそのフラグメント、またはそのいずれかの組合せのメチル化状態を検出するための1以上の標的DNA配列メチル化特異的プローブをさらに含み、BEND5またはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プローブが配列番号12または13を含み;SMAD6またはそのフラグメントの標的DNA配列メチル化特異的プローブが配列番号16を含む、請求項22に記載のキット。
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