TW202204638A - 結直腸癌的早期檢測、預測治療反應和預後之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示用於結直腸癌之早期檢測、預測治療反應及預後的新穎表觀遺傳生物標記物集合。表觀遺傳生物標記物的異常甲基化可在結直腸癌患者的腫瘤組織及血漿樣品中檢測到，但在正常個體中檢測不到。本發明亦揭示本文所用之引子及探針。

Description

結直腸癌的早期檢測、預測治療反應和預後之方法
本發明係關於用於預測結直腸癌之風險或易感性的表觀遺傳生物標記物。特定言之，本發明提供一種基於基因生物標記物之甲基化狀態對結直腸癌進行早期檢測、預測治療反應及預後的方法。
癌症為涉及異常細胞生長、具有侵入或擴散至身體其他部分之潛能的一組疾病且為全世界死亡之主要原因。
甲基化DNA已作為大部分腫瘤類型之組織中的一類潛在生物標記物加以研究。在許多情況下，DNA甲基轉移酶將甲基添加至胞嘧啶-磷酸酯-鳥嘌呤(CpG)島位點處的DNA，以便對基因表現進行表觀遺傳控制。
US 20210003575係關於BMW Rep蛋白用作結腸癌生物標記物的用途。US 20200291479提供藉由測定癌症組織中之miR-133a含量來評估化學療法(諸如奧沙利鉑療法)在結直腸癌患者中之有效性可能性以及其生存前景的方法。US 20200377959揭示一種檢測(例如篩檢)結直腸癌的方法，該方法包含：測定人類個體之去氧核糖核酸(DNA)中之以下中之每一者的甲基化狀態：(a)基因ZNF132內的甲基化基因座；(b)基因ADAMTS2內的第一甲基化基因座；及(c)基因ADAMTS2內的第二甲基化基因座；以及基於該所測定之甲基化狀態診斷該人類個體的結直腸癌。
然而，當前檢測結直腸癌的技術不令人滿意。
本發明揭示用於結直腸癌之早期檢測、預測治療反應及預後的一或多種新穎表觀遺傳生物標記物。表觀遺傳生物標記物的異常甲基化係在癌症患者的腫瘤組織及血漿樣品中檢測到，但在正常個體中檢測不到。本發明亦揭示本文所用之引子及探針。
在一個實施例中，本發明提供一種檢測個體之甲基化狀態的方法，該個體需要檢測結直腸癌易感性或需要預測結直腸癌之可能性、治療反應、預後或復發，該方法包含(a)提供來自個體的生物樣品，及(b)測定該生物樣品中之包含TMEM240 或其片段或MROH6 或其片段之標靶DNA序列的甲基化狀態；其中該個體之標靶DNA序列存在高甲基化或低甲基化指示結直腸癌且/或指示結直腸癌之易感性、可能性、不良治療反應、不良預後或復發。
在一個實施例中，本發明提供一種檢測個體之結直腸癌之易感性或預測個體之結直腸癌之可能性、治療反應、預後或復發的方法，其包含(a)提供來自個體的生物樣品，及(b)測定該生物樣品中之包含TMEM240 或其片段或MROH6 或其片段之標靶DNA序列的甲基化狀態，其中該個體之標靶DNA序列存在高甲基化或低甲基化指示結直腸癌之易感性、可能性、不良治療反應、不良預後或復發。
在一些實施例中，使用標靶DNA序列甲基化特異性探針或標靶DNA序列甲基化特異性引子分析生物樣品中之標靶DNA序列及對照DNA序列的甲基化狀態。
在一個實施例中，個體之標靶DNA序列存在高甲基化或低甲基化係藉由比較標靶DNA序列之甲基化狀態與對照DNA序列之甲基化狀態來測定。在一些實施例中，本發明提供一種檢測個體之結直腸癌易感性或預測個體之結直腸癌可能性、治療反應、預後或復發的方法，其包含(a)提供來自個體之生物樣品，該生物樣品包含含有TMEM240 或其片段或MROH6 或其片段的標靶DNA序列；及(b)使用標靶DNA序列甲基化特異性探針或標靶DNA序列甲基化特異性引子測定該生物樣品中之標靶DNA序列及對照DNA序列的甲基化狀態；(c)量測標靶DNA序列相較於對照DNA序列的相對甲基化狀態；(d)當相對甲基化狀態存在高甲基化或低甲基化時，鑑別出該個體具有結直腸癌之易感性、可能性、不良治療反應、不良預後或復發。在一些實施例中，當TMEM240 或其片段之甲基化狀態比對照DNA序列之甲基化狀態高約30倍、約32倍、約34倍、約35倍、約36倍、約37倍、約38倍、約39倍或約40倍時，指示本文所述之高甲基化。在另一實施例中，TMEM240 或其片段之甲基化狀態比對照DNA序列之甲基化狀態高或低約37.5倍指示結直腸癌。在一些實施例中，當MROH6 或其片段之甲基化狀態比對照DNA序列之甲基化狀態高約35倍、約37倍、約39倍、約40倍、約41倍、約42倍、約43倍、約44倍、約45倍、約46倍、約47倍或約48倍時，指示本文所述之高甲基化。在另一實施例中，MROH6 或其片段之甲基化狀態比對照DNA序列之甲基化狀態高或低約44倍指示結直腸癌。在另一實施例中，對照DNA序列存在於正常組織中。
在一些實施例中，本文所述之生物樣品為組織、細胞、血液、尿液、血清、血漿、糞便、腹水、痰、唾液、胃液、膽汁或口腔黏膜。
在一些實施例中，藉由聚合酶鏈反應、核酸定序(諸如亞硫酸氫鹽定序或焦磷酸定序)、亞硫酸氫鹽轉化、質譜、甲基化特異性核酸酶、基於質量之分離、標靶捕捉或微陣列來檢測甲基化狀態。在一個特定實施例中，藉由聚合酶鏈反應檢測甲基化狀態。
在一些實施例中，當用於測定人類個體中之TMEM240 或其片段之甲基化狀態的聚合酶鏈反應Ct 值小於40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50時，指示高甲基化。在一些實施例中，當用於測定人類個體中之MROH6 或其片段之甲基化狀態的聚合酶鏈反應Ct 值小於35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45時，指示高甲基化。在本發明之一個較佳實施例中，當用於測定人類個體中之TMEM240 或其片段之甲基化狀態的聚合酶鏈反應Ct 值小於45時，指示高甲基化；或當用於測定人類個體中之MROH6 或其片段之甲基化狀態的聚合酶鏈反應Ct 值小於40時，指示高甲基化。
在一些實施例中，本文所述之方法係用於檢測需要檢測結直腸癌之人類個體中的甲基化狀態。
用於測定TMEM240 或其片段中之甲基化的標靶DNA序列甲基化特異性引子之某些實施例與選自由SEQ ID NO: 1、2或3組成之群的序列具有約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高百分比的一致性。用於測定TMEM240 或其片段之甲基化的標靶DNA序列甲基化特異性探針之某些實施例與選自由SEQ ID NO: 4組成之群的序列具有約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高百分比的一致性。在一些實施例中，用於測定MROH6 或其片段之甲基化的標靶DNA序列甲基化特異性引子具有與SEQ ID NO: 5或6至少85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%一致的序列。在一些實施例中，用於測定MROH6 或其片段之甲基化的標靶DNA序列甲基化特異性探針具有與SEQ ID NO: 7至少85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%一致的序列。在一些實施例中，用於測定TMEM240 或其片段之甲基化的標靶DNA序列甲基化特異性探針具有與選自由SEQ ID NO: 1、2及3組成之群的序列至少85%一致的序列。在一些實施例中，用於TMEM240 或其片段的標靶DNA序列甲基化特異性探針與SEQ ID NO: 4之序列具有約85%一致性。在一些實施例中，用於MROH6 或其片段的標靶DNA序列甲基化特異性引子與選自由SEQ ID NO: 5及6組成之群的序列具有約85%一致性。在一些實施例中，用於MROH6 或其片段的標靶DNA序列甲基化特異性探針與SEQ ID NO: 7之序列具有約85%一致性。
在另一實施例中，標靶DNA序列進一步包含一或多種選自由以下組成之群的DNA序列：BEND5 或其片段及SMAD3 或其片段，或其任何組合。
本文所述之標靶DNA序列的某些實施例包括DNA序列之以下組合中的任一者：TMEM240 或其片段與MROH6 或其片段；TMEM240 或其片段、MROH6 或其片段與BEND5 或其片段；TMEM240 或其片段、MROH6 或其片段、BEND5 或其片段與SMAD3 或其片段；TMEM240 或其片段、BEND5 或其片段與SMAD3 或其片段；TMEM240 或其片段、MROH6 或其片段與SMAD3 或其片段；MROH6 或其片段與BEND5 或其片段；以及MROH6 或其片段、BEND5 或其片段與SMAD3 或其片段。在另一實施例中，標靶DNA序列包含TMEM240 或其片段與MROH6 或其片段。
在一些實施例中，甲基化狀態係藉由聚合酶鏈反應測定，且當用於測定人類個體中之BEND5 或其片段之甲基化狀態的聚合酶鏈反應Ct 值小於41、42、43、44、45、46、47、48、49或50時，指示高甲基化。在一些實施例中，甲基化狀態係藉由聚合酶鏈反應測定，且當用於測定人類個體中之SMAD3 或其片段之甲基化狀態的聚合酶鏈反應Ct 值高於30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40時，指示低甲基化。在本發明之一些實施例中，當用於測定人類個體中之BEND5 或其片段之甲基化狀態的聚合酶鏈反應Ct 值小於45時，指示高甲基化。在一些實施例中，當用於測定人類個體中之SMAD3 或其片段之甲基化狀態的聚合酶鏈反應Ct 值高於45時，指示低甲基化。
在本發明之一些實施例中，該方法進一步包含若各基因或其片段存在高甲基化或低甲基化則定義分數為1且若各基因或其片段缺乏高甲基化或低甲基化則定義分數為0以及將分數求和的步驟。
在本發明之一些實施例中，方法進一步包含： 若TMEM240 或其片段之Ct 值小於45，則定義TMEM240 之 分數為1；若TMEM240 或其片段之Ct 值高於或等於45，則定義TMEM240 之 分數為0； 若MROH6 或其片段之Ct 值小於40，則定義MROH6 之 分數為1；若MROH6 或其片段之Ct 值高於或等於45，則定義MROH6 之 分數為0； 若BEND5 或其片段之Ct 值小於45，則定義BEND5 之分數為1，且將分數求和；若BEND5 或其片段之Ct 值高於或等於45，則定義BEND5 之分數為0；或 若SMAD3 或其片段之Ct 值高於45，則定義SMAD3 之分數為1；若SMAD3 或其片段之Ct 值小於或等於45，則定義SMAD3 之分數為0；以及 將TMEM240 、MROH6 、BEND5 及SMAD3 的分數求和。
在本發明之一些實施例中，若TMEM240 、MROH6 與BEND5 之分數總和高於0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25，則向個體指示結直腸癌之易感性、可能性、不良治療反應、不良預後或復發。在本發明之一些實施例中，若TMEM240 、MROH6 與BEND5 之分數總和高於0.20，則向個體指示結直腸癌之易感性、可能性、不良治療反應、不良預後或復發。
在一些實施例中，如本文所述的標靶DNA序列甲基化特異性探針或標靶DNA序列甲基化特異性引子或其任何組合進一步用於測定以下一或多種DNA序列或其任何組合的甲基化狀態：BEND5 或其片段及SMAD3 或其片段。
在一些實施例中，用於本文所述之BEND5 或其片段的標靶DNA序列甲基化特異性引子具有與SEQ ID NO: 8、9、10或11至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列。在一些其他實施例中，用於BEND5 或其片段的標靶DNA序列甲基化特異性引子具有SEQ ID NO: 8、9、10或11之序列。用於BEND5 或其片段的標靶DNA序列甲基化特異性探針具有與SEQ ID NO: 12或13至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列。在另一實施例中，用於BEND5 或其片段的標靶DNA序列甲基化特異性探針具有SEQ ID NO: 12或13的序列。
在一些實施例中，用於本文所述之SMAD3 或其片段的標靶DNA序列甲基化特異性引子具有與SEQ ID NO: 14或15至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列。在一些其他實施例中，用於SMAD3 或其片段的標靶DNA序列甲基化特異性引子具有SEQ ID NO: 14或15之序列。用於SMAD3 或其片段的標靶DNA序列甲基化特異性探針具有與SEQ ID NO: 16至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列。在另一實施例中，用於SMAD6 或其片段的標靶DNA序列甲基化特異性探針具有SEQ ID NO: 16的序列。
在另一實施例中，測定甲基化狀態進一步包含藉由加權總和分數分析量測特異性及靈敏性的步驟。在一些其他實施例中，測定標靶TMEM240 、MROH6 、BEND5 與SMAD3 或其片段或標靶TMEM240 、MROH6 、BEND5 與SMAD3 或其片段之組合的甲基化狀態具有約100%靈敏度及約100%特異性及約100%準確度。
在另一實施例中，本文所述之方法進一步包含將抗結直腸癌藥劑投與個體的步驟。
本發明提供一種檢測個體之結直腸癌之易感性或預測個體之結直腸癌之可能性、治療反應、預後或復發的方法，其包含(a)提供來自個體的生物樣品，及(b)測定該生物樣品中之包含TMEM240 或其片段或MROH6 或其片段之標靶DNA序列的甲基化狀態，其中該個體之標靶DNA序列存在高甲基化或低甲基化指示結直腸癌之易感性、可能性、不良治療反應、不良預後或復發。
在本發明之一些實施例中，該方法包含使用序列與SEQ ID NO: 1、2或3至少85%一致的標靶DNA序列甲基化特異性引子或序列與SEQ ID NO: 4至少85%一致的標靶DNA序列甲基化特異性探針測定TMEM240 或其片段的甲基化狀態，及使用序列與SEQ ID NO: 5或6至少85%同源的MROH6 甲基化特異性引子或序列與SEQ ID NO: 7至少85%同源的MROH6 序列甲基化特異性探針測定MROH6 或其片段的甲基化狀態。
在本發明之一些實施例中，標靶DNA序列進一步包含一或多種選自由以下組成之群的DNA序列：BEND5 或其片段及SMAD3 或其片段，或其任何組合。
本發明提供一種經分離之核酸分子，其具有選自由SEQ ID No: 1至16組成之群的序列。
本發明亦提供一種套組，用於檢測個體之結直腸癌之易感性或預測個體之結直腸癌之可能性、治療反應、預後或復發，該套組包含用於分析如本文所述之標靶DNA序列之甲基化狀態的經分離之核酸分子。套組可以進一步包含亞硫酸氫鈉及用於完整靶基因擴增的接附子，以及聚核苷酸(例如作為可檢測標記之聚核苷酸)以定量如本文所述之標靶DNA序列中甲基化及/或未甲基化胞嘧啶殘基的存在。另外，套組可進一步包含用於完整標靶序列或基因擴增的甲基化感測限制酶。
本發明提供用於檢測TMEM240 或其片段之甲基化狀態的標靶DNA序列甲基化特異性引子對，其包含SEQ ID NO: 1及2或與其具有至少85%一致性的序列；或SEQ ID NO: 1及3或與其具有至少85%一致性的序列。本發明提供用於檢測TMEM240 或其片段之甲基化狀態的標靶DNA序列甲基化特異性探針，其包含SEQ ID NO: 4或與其具有至少85%一致性的序列。
本發明提供用於檢測MROH6 或其片段之甲基化狀態的標靶DNA序列甲基化特異性引子對，其包含SEQ ID NO: 5及6或與其具有至少85%一致性的序列。本發明提供用於檢測MROH6 或其片段之甲基化狀態的標靶DNA序列甲基化特異性探針，其包含SEQ ID NO: 7或與其具有至少85%一致性的序列。
本發明提供用於檢測BEND5 或其片段之甲基化狀態的標靶DNA序列甲基化特異性引子對，其包含SEQ ID NO: 8及9或與其具有至少85%一致性的序列；或SEQ ID NO: 10及11或與其具有至少85%一致性的序列。本發明提供用於檢測BEND5 或其片段之甲基化狀態的標靶DNA序列甲基化特異性探針，其包含SEQ ID NO: 12或13或與其具有至少85%一致性的序列。
本發明提供用於檢測SMAD3 或其片段之甲基化狀態的標靶DNA序列甲基化特異性引子對，其包含SEQ ID NO: 14及15或與其具有至少85%一致性的序列。本發明提供用於檢測SMAD3 或其片段之甲基化狀態的標靶DNA序列甲基化特異性探針，其包含SEQ ID NO: 16或與其具有至少85%一致性的序列。
本發明亦揭示一種套組，用於檢測個體之結直腸癌之易感性或預測個體之結直腸癌之可能性、治療反應、預後或復發，該套組包含標靶DNA序列甲基化特異性引子對，用於檢測包含TMEM240 或其片段及MROH6 或其片段之標靶DNA序列的甲基化狀態。在本發明的一個實施例中，套組進一步包含標靶DNA序列甲基化特異性探針，用於檢測包含TMEM240 或其片段及MROH6 或其片段之標靶DNA序列的甲基化狀態。
在一些實施例中，套組進一步包含一或多種標靶DNA序列甲基化特異性引子對，該等引子對用於檢測BEND5 或其片段或SMAD3 或其片段或其任何組合的甲基化狀態。在一些實施例中，套組進一步包含一或多種標靶DNA序列甲基化特異性探針，該等探針用於檢測BEND5 或其片段或SMAD3 或其片段或其任何組合的甲基化狀態。
應瞭解，本發明不限於本文所述之特定材料及方法。亦應瞭解，本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的且不意欲限制本發明之範疇，本發明之範疇將僅由所附申請專利範圍限制。
必須注意，除非上下文另外明確指明，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個提及物。因此，舉例而言，提及「生物標記物」包括兩種或更多種生物標記物之混合物，及其類似物。
如本文所用，術語「AUC」為曲線下面積之縮寫。特定而言，其係指接收者操作特徵(ROC)曲線下面積。ROC曲線為診斷測試中之不同可能分界點之真陽性率相對於假陽性率的圖。其顯示靈敏度與特異性之間的折衷，此視所選分界點而定(靈敏度的任何增加將伴隨著特異性的降低)。ROC曲線下面積(AUC)為診斷測試準確度的量度(面積愈大則愈佳，最佳值為1，隨機測試的ROC曲線位於對角線上，面積為0.5；參見：J. P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York, 1975)。
術語「生物樣品」係指自個體分離的組織、細胞或體液樣品，包括(但不限於)例如血液、白血球層、血漿、血清、血細胞(例如周邊血液單核細胞(PBMC)、桿狀細胞、嗜中性球、後骨髓球、單核球或T細胞)、糞便物質、尿液、骨髓、膽汁、糞便、腹水、痰、脊髓液、淋巴液、皮膚樣品、皮膚、呼吸道、腸道及泌尿生殖道之外部分泌物、淚液、唾液、乳汁、器官、切片，以及活體外細胞培養成分之樣品，包括(但不限於)細胞及組織(例如重組細胞及細胞組分)在培養基中生長而得到的條件培養基。
術語「生物標記物」係指相較於獲自對照個體(例如診斷呈陰性或癌症沒有檢測到的個人、正常或健康個體)之類似樣品，存在於獲自人類癌症患者之樣品中的核酸分子。生物標記物可為可檢測及/或定量的核酸、核酸片段、聚核苷酸或寡核苷酸。生物標記物包括包含來自基因之核苷酸序列的聚核苷酸。
如本文所用，術語「CpG島」係指相對於基因體之其餘部分，基因體中富含GC之DNA片段。典型地，此等區域中的GC含量為50%或更大，其延及數百個鹼基對且有時數千個。此等區域通常標記基因的5'端。
如本文所用，術語癌症的「早期檢測」係指在轉移之前發現癌症的可能性。較佳地，其係指在觀測到樣品組織或細胞發生形態變化之前，發現癌症的可能性。
如本文所用，術語「檢測(detect)」、「檢測(detecting)」或「檢測(detection)」可描述發現或辨別可檢測地標記之組合物的一般行為，或對可檢測地標記之組合物的具體觀測。
術語「基因」係指一種核酸(例如DNA)序列，其包含為了產生多肽、前驅體或RNA (例如非編碼RNA，諸如核糖體RNA、轉移RNA、剪接體RNA、微RNA)而必需的編碼序列。多肽或非編碼RNA可由全長編碼序列編碼或由編碼序列之任何部分編碼，只要保留全長多肽或多肽片段之所需活性或功能特性(例如酶活性、配位體結合、信號轉導、免疫原性等)。因此，基因可以包括或排除啟動子序列、終止子、轉譯調控序列(諸如核糖體結合位點及內部核糖體進入位點)、增強子、靜默子、隔離子、邊界元件、複製起點、基質連接位點及基因座控制區。術語亦涵蓋結構基因之編碼區及定位於5'與3'端、與編碼區鄰接的序列，其在任一端的距離為約1 kb或更長，使得基因在長度上對應於全長mRNA。術語「基因」進一步包括基因的cDNA與基因體形式。
如本文所用，術語「啟動子」係指通常位於基因上游(朝向基因之5'區)且為起始及驅動基因轉錄所需之DNA區域。啟動子可容許其控制之基因適當活化或抑制。啟動子可含有被轉錄因子識別之特異性序列。此等因子可結合至啟動子DNA序列，引起RNA聚合酶(由基因編碼區合成RNA之酶)募集。啟動子通常係指定位於基因上游之所有基因調控元件，包括上游啟動子、5' UTR、內含子及前導序列。
術語「外顯子」係指成熟RNA產物中所呈現之斷裂基因中的任何區段。術語「內含子」係指DNA中之任何區段，其已轉錄，但藉由與其任一側之外顯子剪接在一起而自轉錄物內移除。就操作而言，外顯子序列存在於基因的mRNA序列中。就操作而言，內含子序列為處於基因之基因體DNA內的介入序列，其被外顯子序列夾持且通常在其5'及3'邊界處具有GT及AG剪接共同序列。
如本文所用，術語「同源性」係指第一序列與第二序列共享一定程度的序列一致性，但其序列與第二序列的序列不一致。舉例而言，包含突變基因之野生型序列的聚核苷酸與突變基因的序列同源且不一致。在一些實施例中，兩個序列之間的同源程度足以允許在適當的嚴格條件下其間發生同源重組。
用於測定核酸及胺基酸序列一致性的技術包括測定基因之mRNA的核苷酸序列及/或測定由其編碼的胺基酸序列，以及將此等序列與第二核苷酸或胺基酸序列比較。亦可以此方式測定基因體序列且比較。一般而言，一致性分別指兩個聚核苷酸或多肽序列的核苷酸相對於核苷酸或胺基酸相對於胺基酸精確對應關係。兩個或更多個序列(聚核苷酸或胺基酸)可藉由測定其一致性百分比來比較。兩個序列(不論核酸或胺基酸序列)之一致性百分比為兩個比對序列之間精確匹配的數目除以較短序列之長度且乘以100。
在一些實施例中，聚核苷酸之間的序列相似程度可如下測定：使聚核苷酸在允許同源區域之間形成穩定雙螺旋體的條件下雜交，隨後用單股特異性核酸酶消化，且對所消化的片段進行尺寸測定。兩個核酸或兩個多肽序列當該等序列在分子的限定長度上展現至少約70%-75%、較佳80%-82%、更佳85%-90%、甚至更佳92%、仍更佳95%且最佳98%序列一致性(如使用上述方法所測定)時，基本上彼此同源。如本文所用，基本上同源亦指顯示與指定DNA或多肽序列完全一致的序列。基本上同源的DNA序列可在南方雜交實驗中、在例如嚴格條件(如針對該特定系統所定義)下鑑別。參見例如Sambrook等人，同上; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, 編者B. D. Hames及S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, D.C.; IRL Press)。
如本文所用，術語「預測」係指患者將對藥物或一組藥物有利地或不利地反應的可能性以及彼等反應之程度。因此，治療預測因素為與個別患者對特定療法之反應有關、與預後無關的變數。
如本文所用，術語「甲基化」係指甲基的存在，該甲基係藉由DNA甲基轉移酶之作用而添加至核酸區域(例如基因體DNA)中之一或多個胞嘧啶鹼基中。
術語核酸分子之「甲基化狀態」係指核酸分子中存在或不存在一或多個甲基化核苷酸鹼基。舉例而言，含有甲基化胞嘧啶之核酸分子視為甲基化(亦即，核酸分子之甲基化狀態為甲基化)。不含有任何甲基化核苷酸之核酸分子視為未甲基化。
術語「高甲基化」係指對應於以下的平均甲基化狀態：相對於正常對照DNA樣品內之相應CpG二核苷酸處發現之核酸分子甲基化核苷酸鹼基的量，測試DNA樣品之DNA序列內之一個或複數個CpG二核苷酸處之核酸分子甲基化核苷酸鹼基的存在增加。
術語「低甲基化」係指對應於以下的平均甲基化狀態：相對於正常對照DNA樣品內之相應CpG二核苷酸處發現之核酸分子甲基化核苷酸鹼基的量，測試DNA樣品之DNA序列內之一個或複數個CpG二核苷酸處之核酸分子甲基化核苷酸鹼基的存在減少。
術語「Ct 值」為臨限值循環的縮寫且定義為PCR產物超出檢測臨限值時的循環次數計算值。
術語「個體」係指人類。
術語「易感性」係指身體的體格或狀況使得組織以特定方式對某些外來刺激作出反應且因此傾向於使個體比平常更易罹患某些疾病。
術語「靶點」或「標靶序列」係指界定結合分子將結合之核酸之一部分的核酸序列，前提為存在足以供結合發生的條件。
術語「風險」係指估計在某一時段期間(諸如在接下來的10年內)或在個體之壽命期間染上疾病的概率。
如本文所用，術語「預後」通常係指臨床病狀或疾病之可能病程及結果的預測。通常藉由評價疾病之因素或症狀來進行患者之預後，疾病之因素或症狀指示疾病之有利或不利病程或結果。
術語「加權總和分數」係指藉由將包括所有目標在內之分數個別地加權以強調不同目標之重要性來對每種可能替代例評分。
如本文所用，術語「核酸分子」(或「核酸」或「聚核苷酸」)可指聚合物形式的核苷酸，其可包括RNA、cDNA、基因體DNA及合成形式之有義股與反義股，以及上述者的混合聚合物。核苷酸可指核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸，或任一類型核苷酸之修飾形式。如本文所用，「核酸分子」與「核酸」及「聚核苷酸」同義。除非另外說明，否則核酸分子的長度通常為至少10個鹼基。該術語可指長度不確定之RNA或DNA分子。該術語包括單股及雙股形式之DNA。核酸分子可包括天然存在之核苷酸或/與經修飾之核苷酸，該等核苷酸藉由天然存在及/或非天然存在之核苷酸鍵聯連接在一起。
癌症的特徵為一或多個基因突變或修飾引起的細胞生長異常，其導致細胞增殖與細胞死亡之平衡失調。在許多疾病過程(諸如癌症)中，基因啟動子CpG島獲取異常高甲基化，引起轉錄靜默，該轉錄靜默可在細胞分裂後遺傳給子細胞。癌症中造成靜默之DNA甲基化典型地發生於CpG島中的多個CpG位點，該等CpG位點存在於蛋白質編碼基因之啟動子中。DNA甲基化之變化已被當作癌症發展的重要組成部分。DNA甲基化圖譜分析提供的臨床靈敏度及動態範圍高於其他癌症檢測。因此，本發明提供一種用於結直腸癌之早期預測、治療反應及預後或復發監測的方法及套組。
在本發明中，量測生物樣品中之標靶DNA序列或其片段的甲基化狀態以檢測結直腸癌或檢測人類個體之結直腸癌之易感性或預測人類個體之結直腸癌的治療反應、預後或復發。在其他實施例中，量測生物樣品中之包含TMEM240 或其片段或MROH6 或其片段之標靶DNA序列的甲基化狀態以檢測人類個體之結直腸癌或檢測人類個體之結直腸癌之易感性或預測人類個體之結直腸癌的治療反應、預後或復發。在另一實施例中，進一步量測BEND5 或其片段或SMAD3 或其片段的甲基化狀態。
TMEM240 編碼腦及小腦中所發現之含跨膜域蛋白質跨膜蛋白240。發現TMEM240 之突變導致脊髓小腦共濟失調21 (SCA21)伴智力遲鈍、重度認知障礙，及運動功能減退型及運動過度型運動障礙。在一個較佳實施例中，標靶DNA序列包含TMEM240 之啟動子及外顯子1區域。
MROH6 基因編碼大師熱(maestro heat)樣重複家族成員6。與MROH6相關之疾病包括非症候群智能障礙及常染色體隱性非症候群智能障礙。
BEND5 基因編碼充當轉錄抑制因子的含BEN域因子5。在一個較佳實施例中，標靶DNA序列包含BEND5 之啟動子及外顯子1區域。
SMAD3 基因編碼與轉型生長因子-β有關的SMAD家族成員3。在一個較佳實施例中，標靶DNA序列包含SMAD3 之啟動子區域。
在一些實施例中，甲基化包含胞嘧啶甲基化位點。在一些情況下，胞嘧啶甲基化包含5-甲基胞嘧啶(5-mCyt)及5-羥甲基胞嘧啶。在一些情況下，胞嘧啶甲基化位點存在於CpG二核苷酸模體中。在其他情況下，胞嘧啶甲基化位點存在於其中有腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的CHG或CHH模體中。在一些情況下，一或多個CpG二核苷酸模體或CpG位點形成CpG島(富含CpG二核苷酸的短DNA序列)。在一些情況下，CpG島典型地、但非總是具有約0.2至約1 kb之間的長度。在一些情況下，甲基化包含CpG島甲基化。
在一些實施例中，藉由以下來分析甲基化狀態：甲基化特異性酶消化；亞硫酸氫鹽定序；選自啟動子甲基化、CpG島甲基化、MSP、HeavyMethyl、MethyLight及Ms-SNuPE之分析；及依賴於檢測擴增之DNA的其他方法。術語「MethyLight™」係指基於螢光之即時PCR技術。MethylLight描述於Eads等人, Cancer Res. 59:2302-2306, 1999中，該文獻以引用的方式併入本文中。
術語「HeavyMethyl」分析係指一種分析，其中涵蓋擴增引子之間之CpG位置或被擴增引子涵蓋的甲基化特異性阻斷探針(在本文中亦稱為阻斷劑)能夠實現核酸樣品的甲基化特異性選擇性擴增。
術語「Ms-SNuPE」係指甲基化敏感性單核苷酸引子延長(Methylation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension)。MsSNuPE描述於Gonzalgo及Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997中，該文獻以引用的方式併入本文中。
術語「MSP」係指甲基化特異性PCR(Methylation-specific PCR)。MSP描述於Herman等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996及美國專利第5,786,146號中，該等文獻各自以引用的方式併入本文中。
DNA之亞硫酸氫鹽修飾為評估CpG甲基化狀態的一種方法。5-甲基胞嘧啶為真核細胞DNA中最頻繁的共價鹼基修飾。然而，5-甲基胞嘧啶位置不能直接藉由定序或雜交方法鑑別，原因在於5-甲基胞嘧啶具有與胞嘧啶相同的鹼基配對行為。此外，5-甲基胞嘧啶攜帶的表觀遺傳資訊在例如PCR擴增期間完全丟失。亞硫酸氫鹽定序為一種分析DNA中是否存在5-甲基胞嘧啶的方法，其基於亞硫酸氫鹽與胞嘧啶的特定反應，隨後在鹼水解後，胞嘧啶轉化為尿嘧啶，尿嘧啶的鹼基配對行為對應於胸腺嘧啶。然而，5-甲基胞嘧啶在前述條件下保持不被修飾。因此，原始DNA的轉化方式使得最初因雜交行為而與胞嘧啶無法區分的甲基胞嘧啶可作為唯一剩餘的胞嘧啶，可使用分子生物學技術(例如擴增及雜交，或定序)檢測到。
在一個實施例中，藉由聚合酶鏈反應、核酸定序(諸如亞硫酸氫鹽定序或焦磷酸定序)、亞硫酸氫鹽轉化、質譜、甲基化特異性核酸酶、基於質量之分離、標靶捕捉或微陣列來檢測甲基化狀態。在一個實施例中，藉由使用引子擴增靶基因之甲基化CpG來檢測甲基化狀態。在另一實施例中，藉由PCR、甲基化特異性PCR (MSP)、即時甲基化特異性PCR、定量甲基化特異性PCR (QMSP)、使用甲基化DNA特異性結合蛋白之PCR或定量PCR來檢測甲基化。
在本發明之一個實施例中，可以使用能夠擴增本文所述基因之甲基化CpG的標靶DNA序列甲基化特異性引子。標靶DNA序列甲基化特異性引子在與基因之甲基化CpG雜交的區域中包含至少一或多個CpG二核苷酸。特定言之，用於擴增基因之甲基化CpG的標靶DNA序列甲基化特異性引子包含與選自由如表1中所示之以下序列組成之群之序列具有約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高百分比之同源性的序列。
在本發明之一個實施例中，可以使用能夠與本文所述基因之甲基化CpG雜交的標靶DNA序列甲基化特異性探針。能夠與基因之甲基化CpG雜交的標靶DNA序列甲基化特異性探針在與基因之甲基化CpG雜交的區域中包含至少一或多個CpG二核苷酸。特定而言，探針可包含與選自由如表1中所示之以下序列組成之群的序列具有約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高百分比之同源性的序列。
表1
SEQ ID NO. 引子或探針 序列
1 TMEM240-qMSP-F TTTAGAATTATGAAGATTATGGTGTTC
2 TMEM240-qMSP-R AAAACTCAACATCGAACCGA
3 TMEM240-qMSP-R2 CGACCCCGCCCGATATCCATAA
4 TMEM240-qMSP-探針 TTTAGAATTATGAAGATTATGGTGTTC
5 MROH6-qMSP-F2 GGTGAGTTTTTGATTTGTAATTGTC
6 MROH6-qMSP-R ATCTCGTACCGCTACTACTACGC
7 MROH6-qMSP-探針 GTCGGGGGTTGTTGATTTTAGTAGCGTT
8 BEND5-qMSP-F2 GTTTGGGTTTTGGGGAGTC
9 BEND5-qMSP-R GATCGAACAACTCAACCCG
10 BEND5-正向引子 GTT TTT GTG CGG TTT TTG GA
11 BEND5-反向引子 AAC CGC GAA CGA AAA CTA AA
12 BEND5-qMSP-探針 CGAAAATAAAAATCCGACGA
13 BEND5-探針 TT GTT ACG CG TTG TTC GTG T
14 SMAD3-qMSP-F GAATAAGGTCGTTAGTTATTATCGT
15 SMAD3-qMSP-R AATCAAATCTACCCGAATCGAA
16 SMAD3-qMSP-探針 GAAAGAAAGAAAGAAAGTAAATTTTATTTTTAAGCG
在一個實施例中，檢測標靶DNA序列的甲基化狀態包含相對於靶基因的正常狀態，標靶DNA序列中存在高甲基化。
在一些實施例中，生物樣品為懷疑患有結直腸癌之人類個體或待檢測之人類個體的組織、細胞、血液、尿液、血清、血漿、糞便、腹水、痰、唾液、胃液、膽汁或口腔黏膜。
如本文所用，術語「需要檢測癌症者」係指已接受初始診斷(例如顯示腫塊或增加之生物標記物含量的CT掃描)、但其癌症分期或指示癌症之甲基化基因之存在或不存在未知的個體。該術語進一步包括曾經患有癌症的人(例如緩解的個體)。
在一些實施例中，正確預測狀態的檢測測試係按照分析的靈敏度、分析的特異性或接收者操作特徵(ROC)曲線下面積(AUC)量測。舉例而言，ROC曲線下面積愈大，則測試之預測值愈準確或愈有效。
在一個實施例中，量測加權總和分數以測定核酸序列及基因中之甲基化狀態作為指標。就多種決策準則而言，加權總和模型(weighted sum model，WSM)為已知用於評價多個替代例的最佳及最簡單多準則決策分析(MCDA)/多準則決策方法。根據本發明，加權總和分數分析顯示，與對照相比，TMEM240 、MROH6 、BEND5 與SMAD3 之組合顯示約100%的靈敏度及約96%的特異性。
在一些實施例中，本文所揭示之一或多種生物標記物在不同樣品中顯示至少p＜0.05的統計學差異。使用此等生物標記物的檢測測試可顯示至少0.9的AUC。
在一些實施例中，本文所述之DNA序列中之表觀遺傳生物標記物的高甲基化狀態與「不良」預後相關或與個體將可能對藥物或一組藥物有不利反應的可能性相關，其導致癌症惡化及/或一或多種治療劑之難治性。在一些情況下，「不良」預後係指個體對藥物或一組藥物將無反應而導致癌症惡化的可能性。在一些情況下，「不良」預後係指個體生存期少於5年至少於1個月。在一些情況下，「不良」預後係指個體之生存期，其中在治療後，個體之生存期為少於5年至少於1個月。在一些情況下，「不良」預後進一步指個體將產生一或多種藥物難治之癌症的可能性。
在一些實施例中，本發明提供具有選自由SEQ ID No: 1至16組成之群之序列的經分離之核酸分子。
在一些實施例中，本發明提供一種套組，用於檢測需要檢測結直腸癌之易感性之人類個體的甲基化狀態，或用於預測人類個體之結直腸癌之可能性、治療反應、預後或復發，該套組包含具有選自由SEQ ID No: 1至4或5至7組成之群之序列的經分離之核酸分子，用於分析包含TMEM240 或其片段或MROH6 或其片段之標靶DNA序列的甲基化狀態。
在本發明的一些較佳實施例中，標靶DNA序列進一步包含一或多種選自由BEND5 或其片段及SMAD3 或其片段或其任何組合組成之群的DNA序列，且套組進一步包含具有選自由SEQ ID No: 8至16組成之群之序列的經分離之核酸分子，用於分析標靶DNA序列的甲基化狀態。
在一些情況下，套組包含用於檢測或量測一或多種標靶DNA序列之甲基化狀態/水準的複數個標靶DNA序列甲基化特異性引子或標靶DNA序列甲基化特異性探針。在一些情況下，此類套組包含與本文所述之至少一種甲基化生物標記物序列雜交的至少一種聚核苷酸及至少一種用於檢測基因甲基化的試劑。用於檢測甲基化的試劑包括例如硫酸氫鈉、為了與作為標記物序列產物的序列雜交而設計的聚核苷酸(若該標記物序列未發生甲基化(例如含有至少一種C-U轉化))，及/或甲基化敏感性或甲基化依賴性限制酶。在一些情況下，套組以經調適可用於分析中之分析設備形式提供固體載體。在一些情況下，套組進一步在套組中包含視情況連接至聚核苷酸(例如探針)的可偵測標記。在一些實施例中，套組進一步包含獲得如本文中所述之加權總和分數的處理單元。
視情況，套組中亦包括能夠與擴增部分雜交的一或多種可檢測地標記之多肽。在一些實施例中，套組包含足以擴增本文所述之標靶DNA序列的引子，且視情況包括能夠與各擴增DNA區域或其一部分雜交的可檢測地標記之聚核苷酸。套組進一步可包含甲基化依賴性或甲基化敏感性限制酶及/或亞硫酸氫鈉。
在一些實施例中，套組包含亞硫酸氫鈉、用於擴增完整靶基因的引子及接附子，以及聚核苷酸(例如可檢測地標記的聚核苷酸)以定量至少一個胞嘧啶之已轉化甲基化序列及或已轉化未甲基化序列在本文所述之表觀遺傳生物標記物之DNA區域中的存在。
在一些實施例中，套組包含甲基化感測限制酶、用於擴增完整靶基因的引子及接附子，以及聚核苷酸以定量本文所述之表觀遺傳標記物之DNA區域之至少一部分的複本數目。在一些實施例中，套組包含甲基化結合部分及一或多個聚核苷酸以定量本文所述之標記物之DNA區域之至少一部分的複本數目。
本文所述及主張之發明具有多種屬性及實施例，包括(但不限於)此實施方式中闡明或描述或提及的彼等屬性及實施例。不希望為無所不包的且本文所述及主張的發明不限於或不侷限於此實施方式中所鑑別的特徵或實施例，該等特徵或實施例僅為了說明而非限制之目的包括在內。一般熟習此項技術者容易認識到，多種組分及參數可在一定程度上加以改變或修改或替代已知等效物，而不悖離本發明之範疇。應瞭解，此類潤飾及等效物併入本文中，如同個別地闡述一般。本發明亦包括本說明書中個別地或共同地提及或指示之所有步驟、特徵、組合物及化合物，以及該等步驟或特徵中之任何兩者或多者的任何及所有組合。
儘管本發明已藉由例示性實施例描述，但熟習此項技術者可提出各種變化及修改。希望本發明涵蓋屬於隨附申請專利範圍之範疇內的此類變化及修改。實例
材料及方法
樣品製備
使用ETDA-K2管及專門為了活體外診斷性ccfDNA測試而設計的PAXgene血液ccfDNA(循環游離DNA)管(Qiagen, Hilden, 德國，768165)收集血液樣品。使用ETDA-K2管(BD, Plymouth, UK, 367525)收集的樣品立即在4℃下以2000×g離心10分鐘。在2小時內，將來自各樣品之上清液轉移至新離心管中且在4℃下以6000×g離心30分鐘且隨後在-80℃下儲存。使用PAXgene血液ccfDNA管收集的樣品在室溫(15-25℃)下保持直至3天內使用，且隨後在4℃下以2000×g離心10分鐘，隨後在4℃下以6000×g離心30分鐘用於分離血漿。將各樣品之血漿分成1.6 mL等分試樣且立即在-80℃下冷凍直至進一步使用。
癌症基因體圖譜入口 ( Cancer Genome Atlas Portal )
西方群組資料係基於由癌症基因體圖譜(TCGA)研究網路自基因體資料共享(Genomic Data Commons，GDC)資料入口產生的資料。癌症基因體圖譜(TCGA)為國家癌症研究所(NCI)與國家人類基因體研究所(NHGRI)之間的合作，其已產生33種癌症類型之關鍵基因體變化的綜合多維圖譜。包含超過兩千兆位元組之基因體資料的TCGA資料集現可向癌症研究社群接取以改良癌症的預防、診斷及治療。
基因體 DNA 提取
使用QIAamp DNA小型套組(Qiagen, Bonn, 德國，目錄號51306)，根據製造商說明書自同一患者的匹配原發性腫瘤與鄰近結直腸組織對提取基因體DNA。DNA定量之後，藉由使用NanoDrop ND-1000光譜光度計(NanoDrop Technologies Inc, Wilmington, DE, USA)量測A260/A280比率(範圍1.8至2.0)來驗證純度。
循環游離 DNA 提取手冊
使用MagMAX游離DNA分離套組(Thermo Fisher Scientific, Austin, TX, USA)或捕捉型cfDNA血清/血漿套組(CatchGene, 臺灣新臺北市, R.O.C.)，根據製造商推薦的方案，自血漿樣品提取循環游離DNA(cfDNA)。ccfDNA樣品具有140與200 bp之間的清晰片段尺寸峰。DNA分離套組提供最高產量及低分子量溶離份。立即在2小時內自10 mL周邊血液分離出血漿。DNA定量之後，藉由使用NanoDrop ND-1000光譜光度計(NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA)量測A260/A280比率(範圍1.8至2.0)來驗證純度。
藉由 KingFisher™ Duo Prime 進行的 自動化循環游離 DNA 提取及亞硫酸氫鹽轉化
在KingFisher™ Duo Prime純化系統(ThermoFisher Scientific, 新加坡)上，根據製造商說明書應用自動化方法進行ccfDNA提取及亞硫酸氫鹽轉化。此方法使得至多六個樣品之基於磁珠的DNA提取同時自動操作。如隨MagMAX™游離DNA分離套組(ThermoFisher Scientific, Austin, TX, USA, A29319)供應的說明書手冊中所述調整工作流程。自1.6 mL血漿中提取ccfDNA且在60 µL分子生物學級水(Corning, NY, USA, 46-000-CM)中溶離。亦在此機器上進行亞硫酸氫鹽轉化清除用於半自動化分析。利用隨EZ-96 DNA甲基化-Lightning™ MagPrep套組(Zymo Research, Irvine, CA, USA, D5046)供應的說明書手冊，開發用於亞硫酸氫鹽轉化清除的自動化方案。利用自動化方法之後，將所提取的ccfDNA與亞硫酸氫鈉(6 M)及氫醌(10 mM)一起在60℃培育箱中培育30分鐘。吾等使用60 µL ccfDNA用於亞硫酸氫鹽轉化，且將亞硫酸氫鹽轉化的ccfDNA在100 µL分子生物學級水中溶離。使用24深孔盤(ThermoFisher Scientific, Vantaa, Finland, 95040470)執行自動化樣品方法。立即使用經亞硫酸氫鹽轉化的所溶離ccfDNA進行甲基化特異性即時PCR。
使用 LabTurbo 24C 自動化提取循環游離 DNA
使用LabTurbo 24 Compact系統(Taigen Bioscience Co.，臺灣臺北)，根據製造商說明書執行自動化ccfDNA提取方法。工作流程遵循隨著Labturbo循環DNA小型套組(目錄號AIOLCD1600，Taigen Bioscience Co.，臺灣臺北)供應的說明書手冊，其中對至多24個樣品同時執行基於真空之全自動化DNA提取。自1.6 mL血漿中提取ccfDNA且在60 µL分子生物學級水(46-000-CM, Corning, NY, USA)中溶離。
用於全基因體甲基化分析的 MethylationEPIC BeadChip 陣列
MethylationEPIC BeadChip (EPIC)陣列涵蓋850,000個CpG位點，包括＞90%的CpG及HM450的99% Refseq基因及額外413,743個CpG。EPIC陣列已與用於血液樣品的450K平台比較驗證。使用Infinium® MethylationEPIC BeadChip陣列(Illumina, San Diego, CA, USA)執行全基因體甲基化分析。使用EpiTect Fast DNA亞硫酸氫鹽套組(QIAGEN, Bonn, 德國，目錄號59826)，根據製造商說明書，對500 ng DNA執行亞硫酸氫鹽轉化。藉由確定甲基化信號強度相對於甲基化與未甲基化信號輸出總和之比率，將各CpG位點的甲基化分數呈現為0 (未甲基化)至1 (完全甲基化)範圍內的「β」值。使用GenomeStudio甲基化模組2011.1版，分析Infinium MethylationEPIC BeadChip資料。Infinium MethylationEPIC BeadChip使用Infinium I與Infinium II分析。Infinium I分析設計係每個CpG基因座使用2種珠粒類型：甲基化及未甲基化狀態各使用1種。Infinium II設計係使用1種珠粒類型，其中甲基化狀態係在雜交之後的單鹼基延長步驟測定(右圖)。使用heatmapper軟體，利用熱圖使靶基因的不同甲基化CpG熱圖可視化。使用梯度尺度熱圖使DNA甲基化水準自低向高可視化。
基於探針的定量甲基化特異性 PCR ( qMSP )
根據製造商推薦的方案對DNA進行亞硫酸氫鹽轉化之後，使用TaqMan定量甲基化特異性PCR (qMSP)聯合LightCycler 96 (Roche Applied Science, Penzberg, 德國)來量測TMEM240 、MROH6 、BEND5 及SMAD3 之DNA甲基化水準。使用SensiFAST™探針No-ROX套組(Bioline，英國倫敦，目錄號BIO-86020)與候選基因的特異性引子及甲基-TaqMan探針執行qMSP。使用LightCycler相對定量軟體(1.5版，Roche Applied Science)獲得相對於對照組校準的標準化DNA甲基化值。β肌動蛋白(ACTB)基因用作甲基化非依賴性DNA對照。ACTB基因的引子/探針經設計不含CpG位點(作為輸入DNA的對照)。候選基因的引子/探針係在其甲基化啟動子區域上設計，尤其在正常組織與腫瘤組織之間經鑑別有差異的區域上設計。根據定序結果，僅當所有CpG位點甲基化時，可進行成功的PCR反應。當結直腸腫瘤中之甲基化水準(相對於ACTB基因)比成對的正常結直腸組織樣品高至少2倍時，靶基因視為高甲基化。候選基因甲基化最終產物的特異性係藉由亞硫酸氫鹽定序確認。用於qMSP的引子及探針列於表1中。
統計學分析
使用SPSS (IBM, Armonk, NY, USA)執行皮爾森卡方檢驗(Pearson's chi-squared test)、曼-惠特尼U檢驗(Mann-Whitney U test)、威爾科克森檢驗(Wilcoxon test)及斯皮爾曼秩相關分析(Spearman's rank correlation analyses)。皮爾森卡方檢驗用於按照候選基因甲基化、RNA表現及其他臨床資料對結直腸癌患者進行比較。成對樣本威爾科克森檢驗及t檢驗用於對腫瘤與匹配相鄰正常組織之間、不同癌症類型之間的DNA甲基化差異以及結直腸癌患者在手術治療之間的候選ccfDNA甲基化差異進行比較。斯皮爾曼秩相關係用於分析腫瘤及血漿樣品的甲基化水準。
為了評估多種生物標記物，當使用所建議的基因生物標記物時，利用康氏非參數逐步分類方法(Kang's nonparametric stepwise classification method)評價鑑別結直腸癌患者的準確度。除準確度之外，亦報導用於評價分類的其他常用量度，諸如接收者操作特徵曲線下面積(AUC)、靈敏度、特異性、假陽性率及假陰性率。實例 1 ： 結直腸癌組織中之標靶 DNA 序列的甲基化狀態
基於Illumina甲基化450K陣列之資料的β值由癌症基因體圖譜(TCGA)研究網路產生。當正常組織的β值小於0.15時，選擇靶核酸及基因；∆β值(腫瘤的值減去正常組織的值)高於0.5或低於0.25。標靶DNA序列的甲基化狀態∆β值(T)顯示於表2中。
表2
   MROH6 TMEM240 BEND5 SMAD3
結直腸癌 0.50 0.73 0.53 0.09
β值(T)，腫瘤組織甲基化狀態；β值(T)≥0.5將按照高甲基化生物標記物計算且β值(T)≤0.25將按照低甲基化生物標記物計算。
圖1顯示靶核酸及基因之甲基化狀態(β值)在腫瘤組織與相鄰正常組織(n=97)之間的差異。根據基於Illumina甲基化450K陣列的資料，較深顏色指示甲基化狀態較高的組織。
實例 2 ： 健康個體及結直腸癌患者之血漿樣品中之靶基因之表觀遺傳生物標記物甲基化狀態的早期檢測
自血漿提取循環游離DNA。簡言之，立即自10 mL周邊血液中分離出3.5 mL血漿。在從獲自結直腸癌患者及健康個體的血漿中提取循環游離DNA (cfDNA)之後，藉由亞硫酸氫鹽轉化執行cfDNA。基於探針之甲基化特異性即時PCR (qMSP)用於cfDNA甲基化分析。
根據以下準則處理獲自qMSP分析的資料。若qMSP之Ct 值就循環甲基化TMEM240 基因而言小於45個循環，就循環甲基化MROH6 基因而言小於40個循環，就循環甲基化BEND5 而言小於45個循環，就循環甲基化SMAD6 而言高於45個循環，則分數分別定義為1。否則，分數定義為0。
TMEM240 、MROH6 及BEND5 之qMSP總分平均值高於0.2，人類個體定義為CRC患者。
圖2顯示健康個體及結直腸癌患者之血漿樣品中之靶基因之表觀遺傳生物標記物甲基化狀態的早期檢測差異。圖3顯示健康個體及結直腸癌患者之血漿樣品中之靶基因之表觀遺傳生物標記物的DNA甲基化水準(分數)總和。另外，如圖4中所示的接收者操作特徵(ROC)曲線分析指示結直腸癌患者及健康個體中之靶基因之表觀遺傳生物標記物甲基化狀態的早期檢測。
圖1 A至H分別顯示基因之靶核酸及啟動子、外顯子及基因本體區之甲基化狀態在腫瘤組織與相鄰正常組織之間之差異的熱圖(A：臺灣樣品之TMEM240；B：臺灣樣品之MROH6；C：臺灣樣品之BEND5；D：臺灣樣品之SMAD3；E：TCGA樣品之TMEM240；F：TCGA樣品之MRTH6；G：TCGA樣品之BEND5；H：TCGA樣品之SMAD3)。
圖2 A至E顯示健康個體與結直腸癌患者之血漿樣品中之靶基因之表觀遺傳生物標記物的甲基化狀態在早期檢測時的差異(A：TMEM240；B：MROH6；C：BEND5；D：SMAD3；E：TMEM240、MROH6及BEND5的DNA甲基化水準)。
圖3顯示健康個體及結直腸癌患者之血漿樣品中之靶基因之表觀遺傳生物標記物的DNA甲基化水準(分數)總和。
圖4顯示接收者操作特徵(ROC)曲線分析，其展現結直腸癌患者及健康個體中之靶基因之表觀遺傳生物標記物甲基化狀態的早期檢測。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005

Claims (24)

  1. 一種檢測個體之結直腸癌之易感性或預測個體之結直腸癌之可能性、治療反應、預後或復發的方法，其包含(a)提供來自該個體的生物樣品，及(b)測定該生物樣品中之包含TMEM240 或其片段或MROH6 或其片段之標靶DNA序列的甲基化狀態，其中由該個體之該標靶DNA序列存在高甲基化或低甲基化指示結直腸癌之易感性、可能性、不良治療反應、不良預後或復發。
  2. 如請求項1之方法，其中該生物樣品為組織、細胞、血液、尿液、血清、血漿、糞便、腹水、痰、唾液、胃液、膽汁或口腔黏膜。
  3. 如請求項1之方法，其中該方法進一步包含若各基因或其片段存在高甲基化或低甲基化則定義分數為1且若各基因或其片段缺乏高甲基化或低甲基化則定義分數為0以及將該分數求和的步驟。
  4. 如請求項1之方法，其中該個體之該標靶DNA序列之高甲基化或低甲基化的存在係藉由比較該標靶DNA序列之甲基化狀態與對照DNA序列之甲基化狀態來確定。
  5. 如請求項1之方法，其中該甲基化狀態係藉由聚合酶鏈反應測定。
  6. 如請求項5之方法，其中當用於測定該人類個體中之TMEM240 或其片段之甲基化狀態的聚合酶鏈反應Ct 值小於50時，指示高甲基化；或當用於測定該人類個體中之MROH6 或其片段之甲基化狀態的聚合酶鏈反應Ct 值小於45時，指示高甲基化。
  7. 如請求項5之方法，其中當用於測定該人類個體中之TMEM240 或其片段之甲基化狀態的聚合酶鏈反應Ct 值小於45時，指示高甲基化；或當用於測定該人類個體中之MROH6 或其片段之甲基化狀態的聚合酶鏈反應Ct 值小於40時，指示高甲基化。
  8. 如請求項1之方法，其中使用針對TMEM240 或其片段或MROH6 或其片段的標靶DNA序列甲基化特異性引子測定甲基化，其中針對TMEM240 或其片段的該標靶DNA序列甲基化特異性引子與選自由SEQ ID NO: 1、2及3組成之群之序列具有約85%一致性；且針對MROH6 或其片段的該標靶DNA序列甲基化特異性引子與選自由SEQ ID NO: 5及6組成之群的序列具有約85%一致性。
  9. 如請求項1之方法，其中使用針對TMEM240 或其片段或MROH6 或其片段的標靶DNA序列甲基化特異性探針測定甲基化，其中針對TMEM240 或其片段的該標靶DNA序列甲基化特異性探針與SEQ ID NO: 4之序列具有約85%一致性；且針對MROH6 或其片段的該標靶DNA序列甲基化特異性探針與SEQ ID NO: 7之序列具有約85%一致性。
  10. 如請求項1之方法，其中該標靶DNA序列進一步包含一或多種選自由以下組成之群的DNA序列：BEND5 或其片段及SMAD3 或其片段，或其任何組合。
  11. 如請求項10之方法，其中該標靶DNA序列包含DNA序列之以下組合中的任一者：TMEM240 或其片段與MROH6 或其片段；TMEM240 或其片段、MROH6 或其片段與BEND5 或其片段；TMEM240 或其片段、MROH6 或其片段、BEND5 或其片段與SMAD3 或其片段；TMEM240 或其片段、BEND5 或其片段與SMAD3 或其片段；TMEM240 或其片段、MROH6 或其片段與SMAD3 或其片段；MROH6 或其片段與BEND5 或其片段；以及MROH6 或其片段、BEND5 或其片段與SMAD3 或其片段。
  12. 如請求項10或11之方法，其中藉由聚合酶鏈反應測定甲基化狀態，且當用於測定該人類個體中之BEND5 或其片段之甲基化狀態的聚合酶鏈反應Ct 值小於50時，指示高甲基化；或當用於測定該人類個體中之SMAD3 或其片段之甲基化狀態的聚合酶鏈反應Ct 值高於40時，指示低甲基化。
  13. 如請求項10或11之方法，其中藉由聚合酶鏈反應測定甲基化狀態，且當用於測定該人類個體中之BEND5 或其片段之甲基化狀態的聚合酶鏈反應Ct 值小於45時，指示高甲基化；或當用於測定該人類個體中之SMAD3 或其片段之甲基化狀態的聚合酶鏈反應Ct 值高於45時，指示低甲基化。
  14. 如請求項10或11之方法，其中使用BEND5 或其片段或SMAD3 或其片段或其組合的標靶DNA序列甲基化特異性引子測定甲基化，其中針對BEND5 或其片段的該標靶DNA序列甲基化特異性引子與選自由SEQ ID NO: 8至11組成之群之序列具有約85%一致性；且針對SMAD3 或其片段的該標靶DNA序列甲基化特異性引子與選自由SEQ ID NO: 14至15組成之群的序列具有約85%一致性。
  15. 如請求項10或11之方法，其中使用針對BEND5 或其片段或SMAD3 或其片段或其組合的標靶DNA序列甲基化特異性探針測定甲基化，其中針對BEND5 或其片段的該標靶DNA序列甲基化特異性探針與選自由SEQ ID NO: 12至13組成之群的序列具有約85%一致性；且針對SMAD3 或其片段的該標靶DNA序列甲基化特異性探針與SEQ ID NO: 16之序列具有約85%一致性。
  16. 如請求項1至11中任一項之方法，其中測定甲基化狀態進一步包含藉由加權總和分數分析來量測特異性及靈敏度的步驟。
  17. 一種經分離之核酸分子，其具有選自由SEQ ID No: 1至16組成之群的序列。
  18. 一種套組，用於檢測個體之結直腸癌之易感性或預測個體之結直腸癌之可能性、治療反應、預後或復發，該套組包含用於檢測包含TMEM240 或其片段或MROH6 或其片段之標靶DNA序列之甲基化狀態的標靶DNA序列甲基化特異性引子對。
  19. 如請求項18之套組，其進一步包含用於檢測包含TMEM240 或其片段或MROH6 或其片段之標靶DNA序列之甲基化狀態的標靶DNA序列甲基化特異性探針。
  20. 如請求項18之套組，其中針對TMEM240 或其片段的該標靶DNA序列甲基化特異性引子對包含SEQ ID NO: 1及2或1及3；且針對MROH6 或其片段的該標靶DNA序列甲基化特異性引子對包含SEQ ID NO: 5及6。
  21. 如請求項19之套組，其中針對TMEM240 或其片段的該標靶DNA序列甲基化特異性探針包含SEQ ID NO: 4；且針對MROH6 或其片段的該標靶DNA序列甲基化特異性探針包含SEQ ID NO: 7。
  22. 如請求項18至21中任一項之套組，其中該標靶DNA序列進一步包含BEND5 或其片段或SMAD3 或其片段，且該套組進一步包含一或多種用於檢測BEND5 或其片段或SMAD3 或其片段或其任何組合之甲基化狀態的標靶DNA序列甲基化特異性引子對。
  23. 如請求項22之套組，其中針對BEND5 或其片段的該標靶DNA序列甲基化特異性引子對包含SEQ ID No. 8及9或10及11；針對SMAD3 或其片段的該標靶DNA序列甲基化特異性引子對包含SEQ ID No. 14及15。
  24. 如請求項22之套組，其中該套組進一步包含一或多種用於檢測BEND5 或其片段或SMAD3 或其片段或其任何組合之甲基化狀態的標靶DNA序列甲基化特異性探針，其中針對BEND5 或其片段的該標靶DNA序列甲基化特異性探針包含SEQ ID NO: 12或13；且針對SMAD6 或其片段的該標靶DNA序列甲基化特異性探針包含SEQ ID NO: 16。
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