CN115917010A - 结直肠癌的早期检测、预测治疗反应和预后之方法 - Google Patents
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Abstract
本揭示揭露用于结直肠癌之早期检测、预测治疗反应及预后的新颖表观遗传生物标记物集合。表观遗传生物标记物的异常甲基化可在结直肠癌患者的肿瘤组织及血浆样品中检测到，但在正常个体中检测不到。本揭示亦揭露本文所用之引子及探针。
Description
优先权
本申请主张2020年4月29日提交的美国临时专利申请号63/017,309的优先权。上述申请的全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请包含一个序列表，该表已以ASCII格式的电子方式提交，并在此通过引用纳入其全部内容。所述ASCII副本创建于2021年4月29日，名为G4590-08300PCT_SeqListing.txt，大小为4千字节。
技术领域
本揭示关于用于预测结直肠癌之风险或易感性的表观遗传生物标记物。特定言之，本揭示提供一种基于基因生物标记物之甲基化状态对结直肠癌进行早期检测、预测治疗反应及预后的方法。
背景技术
癌症为涉及异常细胞生长、具有侵入或扩散至身体其他部分之潜能的一组疾病且为全世界死亡之主要原因。
甲基化DNA已作为大部分肿瘤类型之组织中的一类潜在生物标记物加以研究。在许多情况下，DNA甲基转移酶将甲基添加至胞嘧啶-磷酸酯-鸟嘌呤(CpG)岛位点处的DNA，以便对基因表现进行表观遗传控制。
US 20210003575关于BMW Rep蛋白用作结肠癌生物标记物的用途。US20200291479提供藉由测定癌症组织中之miR-133a含量来评估化学疗法(诸如奥沙利铂疗法)在结直肠癌患者中之有效性可能性以及其生存前景的方法。US 20200377959揭示一种检测(例如筛检)结直肠癌的方法，所述方法包含：测定人类个体之脱氧核糖核酸(DNA)中之以下中之每一者的甲基化状态：(a)基因ZNF132内的甲基化基因座；(b)基因ADAMTS2内的第一甲基化基因座；及(c)基因ADAMTS2内的第二甲基化基因座；以及基于所述所测定之甲基化状态诊断所述人类个体的结直肠癌。
然而，当前检测结直肠癌的技术不令人满意。
发明内容
本揭示揭露用于结直肠癌之早期检测、预测治疗反应及预后的一或多种新颖表观遗传生物标记物。表观遗传生物标记物的异常甲基化在癌症患者的肿瘤组织及血浆样品中检测到，但在正常个体中检测不到。本揭示亦揭露本文所用之引子及探针。
在一个实施例中，本揭示提供一种检测个体之甲基化状态的方法，所述个体需要检测结直肠癌易感性或需要预测结直肠癌之可能性、治疗反应、预后或复发，所述方法包含(a)提供来自个体的生物样品，及(b)测定所述生物样品中之包含TMEM240或其片段或MROH6或其片段之标靶DNA序列的甲基化状态；其中所述个体之标靶DNA序列存在高甲基化或低甲基化指示结直肠癌且/或指示结直肠癌之易感性、可能性、不良治疗反应、不良预后或复发。
在一个实施例中，本揭示提供一种检测个体之结直肠癌之易感性或预测个体之结直肠癌之可能性、治疗反应、预后或复发的方法，其包含(a)提供来自个体的生物样品，及(b)测定所述生物样品中之包含TMEM240或其片段或MROH6或其片段之标靶DNA序列的甲基化状态，其中所述个体之标靶DNA序列存在高甲基化或低甲基化指示结直肠癌之易感性、可能性、不良治疗反应、不良预后或复发。
在一些实施例中，使用标靶DNA序列甲基化特异性探针或标靶DNA序列甲基化特异性引子分析生物样品中之标靶DNA序列及对照DNA序列的甲基化状态。
在一个实施例中，个体之标靶DNA序列存在高甲基化或低甲基化是藉由比较标靶DNA序列之甲基化状态与对照DNA序列之甲基化状态来测定。在一些实施例中，本揭示提供一种检测个体之结直肠癌易感性或预测个体之结直肠癌可能性、治疗反应、预后或复发的方法，其包含(a)提供来自个体之生物样品，所述生物样品包含含有TMEM240或其片段或MROH6或其片段的标靶DNA序列；及(b)使用标靶DNA序列甲基化特异性探针或标靶DNA序列甲基化特异性引子测定所述生物样品中之标靶DNA序列及对照DNA序列的甲基化状态；(c)量测标靶DNA序列相较于对照DNA序列的相对甲基化状态；(d)当相对甲基化状态存在高甲基化或低甲基化时，鉴别出所述个体具有结直肠癌之易感性、可能性、不良治疗反应、不良预后或复发。在一些实施例中，当TMEM240或其片段之甲基化状态比对照DNA序列之甲基化状态高约30倍、约32倍、约34倍、约35倍、约36倍、约37倍、约38倍、约39倍或约40倍时，指示本文所述之高甲基化。在另一实施例中，TMEM240或其片段之甲基化状态比对照DNA序列之甲基化状态高或低约37.5倍指示结直肠癌。在一些实施例中，当MROH6或其片段之甲基化状态比对照DNA序列之甲基化状态高约35倍、约37倍、约39倍、约40倍、约41倍、约42倍、约43倍、约44倍、约45倍、约46倍、约47倍或约48倍时，指示本文所述之高甲基化。在另一实施例中，MROH6或其片段之甲基化状态比对照DNA序列之甲基化状态高或低约44倍指示结直肠癌。在另一实施例中，对照DNA序列存在于正常组织中。
在一些实施例中，本文所述之生物样品为组织、细胞、血液、尿液、血清、血浆、粪便、腹水、痰、唾液、胃液、胆汁或口腔黏膜。
在一些实施例中，藉由聚合酶链反应、核酸定序(诸如亚硫酸氢盐定序或焦磷酸定序)、亚硫酸氢盐转化、质谱、甲基化特异性核酸酶、基于质量之分离、标靶捕捉或微数组来检测甲基化状态。在一个特定实施例中，藉由聚合酶链反应检测甲基化状态。
在一些实施例中，当用于测定人类个体中之TMEM240或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值小于40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50时，指示高甲基化。在一些实施例中，当用于测定人类个体中之MROH6或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值小于35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45时，指示高甲基化。在本揭示之一个优选实施例中，当用于测定人类个体中之TMEM240或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值小于45时，指示高甲基化；或当用于测定人类个体中之MROH6或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值小于40时，指示高甲基化。
在一些实施例中，本文所述之方法用于检测需要检测结直肠癌之人类个体中的甲基化状态。
用于测定TMEM240或其片段中之甲基化的标靶DNA序列甲基化特异性引子之某些实施例与选自由SEQ ID NO:1、2或3组成之群的序列具有约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高百分比的一致性。用于测定TMEM240或其片段之甲基化的标靶DNA序列甲基化特异性探针之某些实施例与选自由SEQ ID NO:4组成之群的序列具有约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高百分比的一致性。在一些实施例中，用于测定MROH6或其片段之甲基化的标靶DNA序列甲基化特异性引子具有与SEQ ID NO:5或6至少85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％一致的序列。在一些实施例中，用于测定MROH6或其片段之甲基化的标靶DNA序列甲基化特异性探针具有与SEQ ID NO:7至少85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％一致的序列。在一些实施例中，用于测定TMEM240或其片段之甲基化的标靶DNA序列甲基化特异性探针具有与选自由SEQ ID NO:1、2及3组成之群的序列至少85％一致的序列。在一些实施例中，用于TMEM240或其片段的标靶DNA序列甲基化特异性探针与SEQ ID NO:4之序列具有约85％一致性。在一些实施例中，用于MROH6或其片段的标靶DNA序列甲基化特异性引子与选自由SEQ IDNO:5及6组成之群的序列具有约85％一致性。在一些实施例中，用于MROH6或其片段的标靶DNA序列甲基化特异性探针与SEQ ID NO:7之序列具有约85％一致性。
在另一实施例中，标靶DNA序列进一步包含一或多种选自由以下组成之群的DNA序列：BEND5或其片段及SMAD3或其片段，或其任何组合。
本文所述之标靶DNA序列的某些实施例包括DNA序列之以下组合中的任一者：TMEM240或其片段与MROH6或其片段；TMEM240或其片段、MROH6或其片段与BEND5或其片段；TMEM240或其片段、MROH6或其片段、BEND5或其片段与SMAD3或其片段；TMEM240或其片段、BEND5或其片段与SMAD3或其片段；TMEM240或其片段、MROH6或其片段与SMAD3或其片段；MROH6或其片段与BEND5或其片段；以及MROH6或其片段、BEND5或其片段与SMAD3或其片段。在另一实施例中，标靶DNA序列包含TMEM240或其片段与MROH6或其片段。
在一些实施例中，甲基化状态是藉由聚合酶链反应测定，且当用于测定人类个体中之BEND5或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值小于41、42、43、44、45、46、47、48、49或50时，指示高甲基化。在一些实施例中，甲基化状态是藉由聚合酶链反应测定，且当用于测定人类个体中之SMAD3或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值高于30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40时，指示低甲基化。在本揭示之一些实施例中，当用于测定人类个体中之BEND5或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值小于45时，指示高甲基化。在一些实施例中，当用于测定人类个体中之SMAD3或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值高于45时，指示低甲基化。
在本揭示之一些实施例中，所述方法进一步包含若各基因或其片段存在高甲基化或低甲基化则定义分数为1且若各基因或其片段缺乏高甲基化或低甲基化则定义分数为0以及将分数求和的步骤。
在本揭示之一些实施例中，方法进一步包含：
若TMEM240或其片段之Ct值小于45，则定义TMEM240之分数为1；若TMEM240或其片段之Ct值高于或等于45，则定义TMEM240之分数为0；
若MROH6或其片段之Ct值小于40，则定义MROH6之分数为1；若MROH6或其片段之Ct值高于或等于45，则定义MROH6之分数为0；
若BEND5或其片段之Ct值小于45，则定义BEND5之分数为1，且将分数求和；若BEND5或其片段之Ct值高于或等于45，则定义BEND5之分数为0；或
若SMAD3或其片段之Ct值高于45，则定义SMAD3之分数为1；若SMAD3或其片段之Ct值小于或等于45，则定义SMAD3之分数为0；以及
将TMEM240、MROH6、BEND5及SMAD3的分数求和。
在本揭示之一些实施例中，若TMEM240、MROH6与BEND5之分数总和高于0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25，则向个体指示结直肠癌之易感性、可能性、不良治疗反应、不良预后或复发。在本揭示之一些实施例中，若TMEM240、MROH6与BEND5之分数总和高于0.20，则向个体指示结直肠癌之易感性、可能性、不良治疗反应、不良预后或复发。
在一些实施例中，如本文所述的标靶DNA序列甲基化特异性探针或标靶DNA序列甲基化特异性引子或其任何组合进一步用于测定以下一或多种DNA序列或其任何组合的甲基化状态：BEND5或其片段及SMAD3或其片段。
在一些实施例中，用于本文所述之BEND5或其片段的标靶DNA序列甲基化特异性引子具有与SEQ ID NO:8、9、10或11至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些其他实施例中，用于BEND5或其片段的标靶DNA序列甲基化特异性引子具有SEQ ID NO:8、9、10或11之序列。用于BEND5或其片段的标靶DNA序列甲基化特异性探针具有与SEQ IDNO:12或13至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在另一实施例中，用于BEND5或其片段的标靶DNA序列甲基化特异性探针具有SEQ ID NO:12或13的序列。
在一些实施例中，用于本文所述之SMAD3或其片段的标靶DNA序列甲基化特异性引子具有与SEQ ID NO:14或15至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些其他实施例中，用于SMAD3或其片段的标靶DNA序列甲基化特异性引子具有SEQ ID NO:14或15之序列。用于SMAD3或其片段的标靶DNA序列甲基化特异性探针具有与SEQ ID NO:16至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在另一实施例中，用于SMAD3或其片段的标靶DNA序列甲基化特异性探针具有SEQ ID NO:16的序列。
在另一实施例中，测定甲基化状态进一步包含藉由加权总和分数分析量测特异性及灵敏性的步骤。在一些其他实施例中，测定标靶TMEM240、MROH6、BEND5与SMAD3或其片段之组合的甲基化状态具有约100％灵敏度及约100％特异性及约100％准确度。
在另一实施例中，本文所述之方法进一步包含将抗结直肠癌药剂投与个体的步骤。
本揭示提供一种检测个体之结直肠癌之易感性或预测个体之结直肠癌之可能性、治疗反应、预后或复发的方法，其包含(a)提供来自个体的生物样品，及(b)测定所述生物样品中之包含TMEM240或其片段或MROH6或其片段之标靶DNA序列的甲基化状态，其中所述个体之标靶DNA序列存在高甲基化或低甲基化指示结直肠癌之易感性、可能性、不良治疗反应、不良预后或复发。
在本揭示之一些实施例中，所述方法包含使用序列与SEQ ID NO:1、2或3至少85％一致的标靶DNA序列甲基化特异性引子或序列与SEQ ID NO:4至少85％一致的标靶DNA序列甲基化特异性探针测定TMEM240或其片段的甲基化状态，及使用序列与SEQ ID NO:5或6至少85％同源的MROH6甲基化特异性引子或序列与SEQ ID NO:7至少85％同源的MROH6序列甲基化特异性探针测定MROH6或其片段的甲基化状态。
在本揭示之一些实施例中，标靶DNA序列进一步包含一或多种选自由以下组成之群的DNA序列：BEND5或其片段及SMAD3或其片段，或其任何组合。
本揭示提供一种经分离之核酸分子，其具有选自由SEQ ID No:1至16组成之群的序列。
本揭示亦提供一种套组，用于检测个体之结直肠癌之易感性或预测个体之结直肠癌之可能性、治疗反应、预后或复发，所述套组包含用于分析如本文所述之标靶DNA序列之甲基化状态的经分离之核酸分子。套组可以进一步包含亚硫酸氢钠及用于完整靶基因扩增的接附子，以及聚核苷酸(例如作为可检测标记之聚核苷酸)以定量如本文所述之标靶DNA序列中甲基化及/或未甲基化胞嘧啶残基的存在。另外，套组可进一步包含用于完整标靶序列或基因扩增的甲基化感测限制酶。
本揭示提供用于检测TMEM240或其片段之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性引子对，其包含SEQ ID NO:1及2或与其具有至少85％一致性的序列；或SEQ ID NO:1及3或与其具有至少85％一致性的序列。本揭示提供用于检测TMEM240或其片段之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性探针，其包含SEQ ID NO:4或与其具有至少85％一致性的序列。
本揭示提供用于检测MROH6或其片段之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性引子对，其包含SEQ ID NO:5及6或与其具有至少85％一致性的序列。本揭示提供用于检测MROH6或其片段之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性探针，其包含SEQ ID NO:7或与其具有至少85％一致性的序列。
本揭示提供用于检测BEND5或其片段之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性引子对，其包含SEQ ID NO:8及9或与其具有至少85％一致性的序列；或SEQ ID NO:10及11或与其具有至少85％一致性的序列。本揭示提供用于检测BEND5或其片段之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性探针，其包含SEQ ID NO:12或13或与其具有至少85％一致性的序列。
本揭示提供用于检测SMAD3或其片段之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性引子对，其包含SEQ ID NO:14及15或与其具有至少85％一致性的序列。本揭示提供用于检测SMAD3或其片段之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性探针，其包含SEQ ID NO:16或与其具有至少85％一致性的序列。
本揭示亦揭示一种套组，用于检测个体之结直肠癌之易感性或预测个体之结直肠癌之可能性、治疗反应、预后或复发，所述套组包含标靶DNA序列甲基化特异性引子对，用于检测包含TMEM240或其片段及MROH6或其片段之标靶DNA序列的甲基化状态。在本揭示的一个实施例中，套组进一步包含标靶DNA序列甲基化特异性探针，用于检测包含TMEM240或其片段及MROH6或其片段之标靶DNA序列的甲基化状态。
在一些实施例中，套组进一步包含一或多种标靶DNA序列甲基化特异性引子对，该引子对用于检测BEND5或其片段或SMAD3或其片段或其任何组合的甲基化状态。在一些实施例中，套组进一步包含一或多种标靶DNA序列甲基化特异性探针，所述探针用于检测BEND5或其片段或SMAD3或其片段或其任何组合的甲基化状态。
图式简单说明
图1A至H分别显示基因之靶核酸及启动子、外显子及基因本体区之甲基化状态在肿瘤组织与相邻正常组织之间之差异的热图(A：中国台湾样品之TMEM240；B：中国台湾样品之MROH6；C：中国台湾样品之BEND5；D：中国台湾样品之SMAD3；E：TCGA样品之TMEM240；F：TCGA样品之MROH6；G：TCGA样品之BEND5；H：TCGA样品之SMAD3)。
图2A至E显示健康个体与结直肠癌患者之血浆样品中之靶基因之表观遗传生物标记物的甲基化状态在早期检测时的差异(A：TMEM240；B：MROH6；C：BEND5；D：SMAD3；E：TMEM240、MROH6及BEND5的DNA甲基化水平)。
图3显示健康个体及结直肠癌患者之血浆样品中之靶基因之表观遗传生物标记物的DNA甲基化水平(分数)总和。
图4显示接收者操作特征(ROC)曲线分析，其展现结直肠癌患者及健康个体中之靶基因之表观遗传生物标记物甲基化状态的早期检测。
具体实施方式
实施方式
应了解，本揭示不限于本文所述之特定材料及方法。亦应了解，本文所用之术语仅出于描述特定实施例之目的且不意欲限制本揭示之范畴，本揭示之范畴将仅由所附申请专利范围限制。
必须注意，除非上下文另外明确指明，否则如本说明书及随附申请专利范围中所用，单数形式“一(a/an)”及“所述(the)”包括多数个提及物。因此，举例而言，提及“生物标记物”包括两种或更多种生物标记物之混合物，及其类似物。
如本文所用，术语“AUC”为曲线下面积之缩写。特定而言，其指接收者操作特征(ROC)曲线下面积。ROC曲线为诊断测试中之不同可能分界点之真阳性率相对于假阳性率的图。其显示灵敏度与特异性之间的折衷，此视所选分界点而定(灵敏度的任何增加将伴随着特异性的降低)。ROC曲线下面积(AUC)为诊断测试准确度的量度(面积愈大则愈佳，最优选值为1，随机测试的ROC曲线位于对角在线，面积为0.5；参见：J.P.Egan.Signal DetectionTheory and ROC Analysis,Academic Press,New York,1975)。
术语“生物样品”指自个体分离的组织、细胞或体液样品，包括(但不限于)例如血液、白血球层、血浆、血清、血细胞(例如周边血液单核细胞(PBMC)、杆状细胞、嗜中性球、后骨髓球、单核球或T细胞)、粪便物质、尿液、骨髓、胆汁、粪便、腹水、痰、脊髓液、淋巴液、皮肤样品、皮肤、呼吸道、肠道及泌尿生殖道之外部分泌物、泪液、唾液、乳汁、器官、切片，以及活体外细胞培养成分之样品，包括(但不限于)细胞及组织(例如重组细胞及细胞组分)在培养基中生长而得到的条件培养基。
术语“生物标记物”指相较于获自对照个体(例如诊断呈阴性或癌症没有检测到的个人、正常或健康个体)之类似样品，存在于获自人类癌症患者之样品中的核酸分子。生物标记物可为可检测及/或定量的核酸、核酸片段、聚核苷酸或寡核苷酸。生物标记物包括包含来自基因之核苷酸序列的聚核苷酸。
如本文所用，术语“CpG岛”指相对于基因体之其余部分，基因体中富含GC之DNA片段。典型地，此等区域中的GC含量为50％或更大，其延及数百个碱基对且有时数千个。此等区域通常标记基因的5'端。
如本文所用，术语癌症的“早期检测”指在转移之前发现癌症的可能性。优选地，其指在观测到样品组织或细胞发生形态变化之前，发现癌症的可能性。
如本文所用，术语“检测(detect)”、“检测(detecting)”或“检测(detection)”可描述发现或辨别可检测地标记之组合物的一般行为，或对可检测地标记之组合物的具体观测。
术语“基因”指一种核酸(例如DNA)序列，其包含为了产生多肽、前驱体或RNA(例如非编码RNA，诸如核糖体RNA、转移RNA、剪接体RNA、微RNA)而必需的编码序列。多肽或非编码RNA可由全长编码序列编码或由编码序列之任何部分编码，只要保留全长多肽或多肽片段之所需活性或功能特性(例如酶活性、配位体结合、信号转导、免疫原性等)。因此，基因可以包括或排除启动子序列、终止子、转译调控序列(诸如核糖体结合位点及内部核糖体进入位点)、增强子、静默子、隔离子、边界组件、复制起点、基质连接位点及基因座控制区。术语亦涵盖结构基因之编码区及定位于5'与3'端、与编码区邻接的序列，其在任一端的距离为约1kb或更长，使得基因在长度上对应于全长mRNA。术语“基因”进一步包括基因的cDNA与基因体形式。
如本文所用，术语“启动子”指通常位于基因上游(朝向基因之5'区)且为起始及驱动基因转录所需之DNA区域。启动子可容许其控制之基因适当活化或抑制。启动子可含有被转录因子识别之特异性序列。此等因子可结合至启动子DNA序列，引起RNA聚合酶(由基因编码区合成RNA之酶)募集。启动子通常指定位于基因上游之所有基因调控组件，包括上游启动子、5'UTR、内含子及前导序列。
术语“外显子”指成熟RNA产物中所呈现之断裂基因中的任何区段。术语“内含子”指DNA中之任何区段，其已转录，但藉由与其任一侧之外显子剪接在一起而自转录物内移除。就操作而言，外显子序列存在于基因的mRNA序列中。就操作而言，内含子序列为处于基因之基因体DNA内的介入序列，其被外显子序列夹持且通常在其5'及3'边界处具有GT及AG剪接共同序列。
如本文所用，术语“同源性”指第一序列与第二序列共享一定程度的序列一致性，但其序列与第二序列的序列不一致。举例而言，包含突变基因之野生型序列的聚核苷酸与突变基因的序列同源且不一致。在一些实施例中，两个序列之间的同源程度足以允许在适当的严格条件下其间发生同源重组。
用于测定核酸及氨基酸序列一致性的技术包括测定基因之mRNA的核苷酸序列及/或测定由其编码的氨基酸序列，以及将此等序列与第二核苷酸或氨基酸序列比较。亦可以此方式测定基因体序列且比较。一般而言，一致性分别指两个聚核苷酸或多肽序列的核苷酸相对于核苷酸或氨基酸相对于氨基酸精确对应关系。两个或更多个序列(聚核苷酸或氨基酸)可藉由测定其一致性百分比来比较。两个序列(不论核酸或氨基酸序列)之一致性百分比为两个比对序列之间精确匹配的数目除以较短序列之长度且乘以100。
在一些实施例中，聚核苷酸之间的序列相似程度可如下测定：使聚核苷酸在允许同源区域之间形成稳定双螺旋体的条件下杂交，随后用单股特异性核酸酶消化，且对所消化的片段进行尺寸测定。两个核酸或两个多肽序列当所述序列在分子的限定长度上展现至少约70％-75％、优选80％-82％、更优选85％-90％、甚至更优选92％、仍更优选95％且最优选98％序列一致性(如使用上述方法所测定)时，基本上彼此同源。如本文所用，基本上同源亦指显示与指定DNA或多肽序列完全一致的序列。基本上同源的DNA序列可在南方杂交实验中、在例如严格条件(如针对所述特定系统所定义)下鉴别。参见例如Sambrook等人，同上；Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach,编者B.D.Hames及S.J.Higgins,(1985)Oxford；Washington,D.C.；IRL Press)。
如本文所用，术语“预测”指患者将对药物或一组药物有利地或不利地反应的可能性以及彼等反应之程度。因此，治疗预测因素为与个别患者对特定疗法之反应有关、与预后无关的变数。
如本文所用，术语“甲基化”指甲基的存在，所述甲基藉由DNA甲基转移酶之作用而添加至核酸区域(例如基因体DNA)中之一或多个胞嘧啶碱基中。
术语核酸分子之“甲基化状态”指核酸分子中存在或不存在一或多个甲基化核苷酸碱基。举例而言，含有甲基化胞嘧啶之核酸分子视为甲基化(亦即，核酸分子之甲基化状态为甲基化)。不含有任何甲基化核苷酸之核酸分子视为未甲基化。
术语“高甲基化”指对应于以下的平均甲基化状态：相对于正常对照DNA样品内之相应CpG二核苷酸处发现之核酸分子甲基化核苷酸碱基的量，测试DNA样品之DNA序列内之一个或多数个CpG二核苷酸处之核酸分子甲基化核苷酸碱基的存在增加。
术语“低甲基化”指对应于以下的平均甲基化状态：相对于正常对照DNA样品内之相应CpG二核苷酸处发现之核酸分子甲基化核苷酸碱基的量，测试DNA样品之DNA序列内之一个或多数个CpG二核苷酸处之核酸分子甲基化核苷酸碱基的存在减少。
术语“Ct值”为临限值循环的缩写且定义为PCR产物超出检测临限值时的循环次数计算值。
术语“个体”指人类。
术语“易感性”指身体的体格或状况使得组织以特定方式对某些外来刺激作出反应且因此倾向于使个体比平常更易罹患某些疾病。
术语“靶点”或“标靶序列”指界定结合分子将结合之核酸之一部分的核酸序列，前提为存在足以供结合发生的条件。
术语“风险”指估计在某一时段期间(诸如在接下来的10年内)或在个体之寿命期间染上疾病的概率。
如本文所用，术语“预后”通常指临床病状或疾病之可能病程及结果的预测。通常藉由评价疾病之因素或症状来进行患者之预后，疾病之因素或症状指示疾病之有利或不利病程或结果。
术语“加权总和分数”指藉由将包括所有目标在内之分数个别地加权以强调不同目标之重要性来对每种可能替代例评分。
如本文所用，术语“核酸分子”(或“核酸”或“聚核苷酸”)可指聚合物形式的核苷酸，其可包括RNA、cDNA、基因体DNA及合成形式之有义股与反义股，以及上述者的混合聚合物。核苷酸可指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸，或任一类型核苷酸之修饰形式。如本文所用，“核酸分子”与“核酸”及“聚核苷酸”同义。除非另外说明，否则核酸分子的长度通常为至少10个碱基。所述术语可指长度不确定之RNA或DNA分子。所述术语包括单股及双股形式之DNA。核酸分子可包括天然存在之核苷酸或/与经修饰之核苷酸，所述核苷酸藉由天然存在及/或非天然存在之核苷酸键联连接在一起。
癌症的特征为一或多个基因突变或修饰引起的细胞生长异常，其导致细胞增殖与细胞死亡之平衡失调。在许多疾病过程(诸如癌症)中，基因启动子CpG岛获取异常高甲基化，引起转录静默，所述转录静默可在细胞分裂后遗传给子细胞。癌症中造成静默之DNA甲基化典型地发生于CpG岛中的多个CpG位点，所述CpG位点存在于蛋白质编码基因之启动子中。DNA甲基化之变化已被当作癌症发展的重要组成部分。DNA甲基化图谱分析提供的临床灵敏度及动态范围高于其他癌症检测。因此，本揭示提供一种用于结直肠癌之早期预测、治疗反应及预后或复发监测的方法及套组。
在本揭示中，量测生物样品中之标靶DNA序列或其片段的甲基化状态以检测结直肠癌或检测人类个体之结直肠癌之易感性或预测人类个体之结直肠癌的治疗反应、预后或复发。在其他实施例中，量测生物样品中之包含TMEM240或其片段或MROH6或其片段之标靶DNA序列的甲基化状态以检测人类个体之结直肠癌或检测人类个体之结直肠癌之易感性或预测人类个体之结直肠癌的治疗反应、预后或复发。在另一实施例中，进一步量测BEND5或其片段或SMAD3或其片段的甲基化状态。
TMEM240编码脑及小脑中所发现之含跨膜域蛋白质跨膜蛋白240。发现TMEM240之突变导致脊髓小脑共济失调21(SCA21)伴智力迟钝、重度认知障碍，及运动功能减退型及运动过度型运动障碍。在一个优选实施例中，标靶DNA序列包含TMEM240之启动子及外显子1区域。
MROH6基因编码大师热(maestro heat)样重复家族成员6。与MROH6相关之疾病包括非症候群智能障碍及常染色体隐性非症候群智能障碍。
BEND5基因编码充当转录抑制因子的含BEN域因子5。在一个优选实施例中，标靶DNA序列包含BEND5之启动子及外显子1区域。
SMAD3基因编码与转型生长因子-β有关的SMAD家族成员3。在一个优选实施例中，标靶DNA序列包含SMAD3之启动子区域。
在一些实施例中，甲基化包含胞嘧啶甲基化位点。在一些情况下，胞嘧啶甲基化包含5-甲基胞嘧啶(5-mCyt)及5-羟甲基胞嘧啶。在一些情况下，胞嘧啶甲基化位点存在于CpG二核苷酸模体中。在其他情况下，胞嘧啶甲基化位点存在于其中有腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的CHG或CHH模体中。在一些情况下，一或多个CpG二核苷酸模体或CpG位点形成CpG岛(富含CpG二核苷酸的短DNA序列)。在一些情况下，CpG岛典型地、但非总是具有约0.2至约1kb之间的长度。在一些情况下，甲基化包含CpG岛甲基化。
在一些实施例中，藉由以下来分析甲基化状态：甲基化特异性酶消化；亚硫酸氢盐定序；选自启动子甲基化、CpG岛甲基化、MSP、HeavyMethyl、MethyLight及Ms-SNuPE之分析；及依赖于检测扩增之DNA的其他方法。术语“MethyLightTM”指基于荧光之实时PCR技术。MethylLight描述于Eads等人,Cancer Res.59:2302-2306,1999中，所述文献以引用的方式并入本文中。
术语“HeavyMethyl”分析指一种分析，其中涵盖扩增引子之间之CpG位置或被扩增引子涵盖的甲基化特异性阻断探针(在本文中亦称为阻断剂)能够实现核酸样品的甲基化特异性选择性扩增。
术语“Ms-SNuPE”指甲基化敏感性单核苷酸引子延长(Methylation-sensitiveSingle Nucleotide Primer Extension)。MsSNuPE描述于Gonzalgo及Jones,NucleicAcids Res.25:2529-2531,1997中，所述文献以引用的方式并入本文中。
术语“MSP”指甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR)。MSP描述于Herman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821-9826,1996及美国专利第5,786,146号中，所述文献各自以引用的方式并入本文中。
DNA之亚硫酸氢盐修饰为评估CpG甲基化状态的一种方法。5-甲基胞嘧啶为真核细胞DNA中最频繁的共价碱基修饰。然而，5-甲基胞嘧啶位置不能直接藉由定序或杂交方法鉴别，原因在于5-甲基胞嘧啶具有与胞嘧啶相同的碱基配对行为。此外，5-甲基胞嘧啶携带的表观遗传信息在例如PCR扩增期间完全丢失。亚硫酸氢盐定序为一种分析DNA中是否存在5-甲基胞嘧啶的方法，其基于亚硫酸氢盐与胞嘧啶的特定反应，随后在碱水解后，胞嘧啶转化为尿嘧啶，尿嘧啶的碱基配对行为对应于胸腺嘧啶。然而，5-甲基胞嘧啶在前述条件下保持不被修饰。因此，原始DNA的转化方式使得最初因杂交行为而与胞嘧啶无法区分的甲基胞嘧啶可作为唯一剩余的胞嘧啶，可使用分子生物学技术(例如扩增及杂交，或定序)检测到。
在一个实施例中，藉由聚合酶链反应、核酸定序(诸如亚硫酸氢盐定序或焦磷酸定序)、亚硫酸氢盐转化、质谱、甲基化特异性核酸酶、基于质量之分离、标靶捕捉或微数组来检测甲基化状态。在一个实施例中，藉由使用引子扩增靶基因之甲基化CpG来检测甲基化状态。在另一实施例中，藉由PCR、甲基化特异性PCR(MSP)、实时甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR(QMSP)、使用甲基化DNA特异性结合蛋白之PCR或定量PCR来检测甲基化。
在本揭示之一个实施例中，可以使用能够扩增本文所述基因之甲基化CpG的标靶DNA序列甲基化特异性引子。标靶DNA序列甲基化特异性引子在与基因之甲基化CpG杂交的区域中包含至少一或多个CpG二核苷酸。特定言之，用于扩增基因之甲基化CpG的标靶DNA序列甲基化特异性引子包含与选自由如表1中所示之以下序列组成之群之序列具有约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高百分比之同源性的序列。
在本揭示之一个实施例中，可以使用能够与本文所述基因之甲基化CpG杂交的标靶DNA序列甲基化特异性探针。能够与基因之甲基化CpG杂交的标靶DNA序列甲基化特异性探针在与基因之甲基化CpG杂交的区域中包含至少一或多个CpG二核苷酸。特定而言，探针可包含与选自由如表1中所示之以下序列组成之群的序列具有约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高百分比之同源性的序列。
表1
在一个实施例中，检测标靶DNA序列的甲基化状态包含相对于靶基因的正常状态，标靶DNA序列中存在高甲基化。
在一些实施例中，生物样品为怀疑患有结直肠癌之人类个体或待检测之人类个体的组织、细胞、血液、尿液、血清、血浆、粪便、腹水、痰、唾液、胃液、胆汁或口腔黏膜。
如本文所用，术语“需要检测癌症者”指已接受初始诊断(例如显示肿块或增加之生物标记物含量的CT扫描)、但其癌症分期或指示癌症之甲基化基因之存在或不存在未知的个体。所述术语进一步包括曾经患有癌症的人(例如缓解的个体)。
在一些实施例中，正确预测状态的检测测试是按照分析的灵敏度、分析的特异性或接收者操作特征(ROC)曲线下面积(AUC)量测。举例而言，ROC曲线下面积愈大，则测试之预测值愈准确或愈有效。
在一个实施例中，量测加权总和分数以测定核酸序列及基因中之甲基化状态作为指标。就多种决策准则而言，加权总和模型(weighted sum model，WSM)为已知用于评价多个替代例的最优选及最简单多准则决策分析(MCDA)/多准则决策方法。根据本揭示，加权总和分数分析显示，与对照相比，TMEM240、MROH6、BEND5与SMAD3之组合显示约100％的灵敏度及约96％的特异性。
在一些实施例中，本文所揭示之一或多种生物标记物在不同样品中显示至少p<0.05的统计学差异。使用此等生物标记物的检测测试可显示至少0.9的AUC。
在一些实施例中，本文所述之DNA序列中之表观遗传生物标记物的高甲基化状态与“不良”预后相关或与个体将可能对药物或一组药物有不利反应的可能性相关，其导致癌症恶化及/或一或多种治疗剂之难治性。在一些情况下，“不良”预后指个体对药物或一组药物将无反应而导致癌症恶化的可能性。在一些情况下，“不良”预后指个体生存期少于5年至少于1个月。在一些情况下，“不良”预后指个体之生存期，其中在治疗后，个体之生存期为少于5年至少于1个月。在一些情况下，“不良”预后进一步指个体将产生一或多种药物难治之癌症的可能性。
在一些实施例中，本揭示提供具有选自由SEQ ID No:1至16组成之群之序列的经分离之核酸分子。
在一些实施例中，本揭示提供一种套组，用于检测需要检测结直肠癌之易感性之人类个体的甲基化状态，或用于预测人类个体之结直肠癌之可能性、治疗反应、预后或复发，所述套组包含具有选自由SEQ ID No:1至4或5至7组成之群之序列的经分离之核酸分子，用于分析包含TMEM240或其片段或MROH6或其片段之标靶DNA序列的甲基化状态。
在本揭示的一些优选实施例中，标靶DNA序列进一步包含一或多种选自由BEND5或其片段及SMAD3或其片段或其任何组合组成之群的DNA序列，且套组进一步包含具有选自由SEQ ID No:8至16组成之群之序列的经分离之核酸分子，用于分析标靶DNA序列的甲基化状态。
在一些情况下，套组包含用于检测或量测一或多种标靶DNA序列之甲基化状态/水平的多数个标靶DNA序列甲基化特异性引子或标靶DNA序列甲基化特异性探针。在一些情况下，此类套组包含与本文所述之至少一种甲基化生物标记物序列杂交的至少一种聚核苷酸及至少一种用于检测基因甲基化的试剂。用于检测甲基化的试剂包括例如硫酸氢钠、为了与作为标记物序列产物的序列杂交而设计的聚核苷酸(若所述标记物序列未发生甲基化(例如含有至少一种C-U转化))，及/或甲基化敏感性或甲基化依赖性限制酶。在一些情况下，套组以经调适可用于分析中之分析设备形式提供固体载体。在一些情况下，套组进一步在套组中包含视情况连接至聚核苷酸(例如探针)的可侦测标记。在一些实施例中，套组进一步包含获得如本文中所述之加权总和分数的处理单元。
视情况，套组中亦包括能够与扩增部分杂交的一或多种可检测地标记之多肽。在一些实施例中，套组包含足以扩增本文所述之标靶DNA序列的引子，且视情况包括能够与各扩增DNA区域或其一部分杂交的可检测地标记之聚核苷酸。套组进一步可包含甲基化依赖性或甲基化敏感性限制酶及/或亚硫酸氢钠。
在一些实施例中，套组包含亚硫酸氢钠、用于扩增完整靶基因的引子及接附子，以及聚核苷酸(例如可检测地标记的聚核苷酸)以定量至少一个胞嘧啶之已转化甲基化序列及或已转化未甲基化序列在本文所述之表观遗传生物标记物之DNA区域中的存在。
在一些实施例中，套组包含甲基化感测限制酶、用于扩增完整靶基因的引子及接附子，以及聚核苷酸以定量本文所述之表观遗传标记物之DNA区域之至少一部分的复本数目。在一些实施例中，套组包含甲基化结合部分及一或多个聚核苷酸以定量本文所述之标记物之DNA区域之至少一部分的复本数目。
本文所述及主张之揭示具有多种属性及实施例，包括(但不限于)此实施方式中阐明或描述或提及的彼等属性及实施例。不希望为无所不包的且本文所述及主张的揭示不限于或不局限于此实施方式中所鉴别的特征或实施例，所述特征或实施例仅为了说明而非限制之目的包括在内。一般熟习此项技术者容易认识到，多种组分及参数可在一定程度上加以改变或修改或替代已知等效物，而不悖离本揭示之范畴。应了解，此类润饰及等效物并入本文中，如同个别地阐述一般。本揭示亦包括本说明书中个别地或共同地提及或指示之所有步骤、特征、组合物及化合物，以及所述步骤或特征中之任何两者或多者的任何及所有组合。
尽管本揭示已藉由例示性实施例描述，但熟习此项技术者可提出各种变化及修改。希望本揭示涵盖属于随附申请专利范围之范畴内的此类变化及修改。
实例
材料及方法
样品制备
使用ETDA-K2管及专门为了活体外诊断性ccfDNA测试而设计的PAXgene血液ccfDNA(循环游离DNA)管(Qiagen,Hilden,德国，768165)收集血液样品。使用ETDA-K2管(BD,Plymouth,UK,367525)收集的样品立即在4℃下以2000×g离心10分钟。在2小时内，将来自各样品之上清液转移至新离心管中且在4℃下以6000×g离心30分钟且随后在-80℃下储存。使用PAXgene血液ccfDNA管收集的样品在室温(15-25℃)下保持直至3天内使用，且随后在4℃下以2000×g离心10分钟，随后在4℃下以6000×g离心30分钟用于分离血浆。将各样品之血浆分成1.6mL等分试样且立即在-80℃下冷冻直至进一步使用。
癌症基因体图谱入口(Cancer Genome Atlas Portal)
西方群组数据是基于由癌症基因体图谱(TCGA)研究网络自基因体数据共享(Genomic Data Commons，GDC)数据入口产生的数据。癌症基因体图谱(TCGA)为国家癌症研究所(NCI)与国家人类基因体研究所(NHGRI)之间的合作，其已产生33种癌症类型之关键基因体变化的综合多维图谱。包含超过两千兆字节之基因体数据的TCGA数据集现可向癌症研究社群接取以改良癌症的预防、诊断及治疗。
基因体DNA提取
使用QIAamp DNA小型套组(Qiagen,Bonn,德国，目录号51306)，根据制造商说明书自同一患者的匹配原发性肿瘤与邻近结直肠组织对提取基因体DNA。DNA定量之后，藉由使用NanoDrop ND-1000光谱亮度计(NanoDrop Technologies Inc,Wilmington,DE,USA)量测A260/A280比率(范围1.8至2.0)来验证纯度。
循环游离DNA提取手册
使用MagMAX游离DNA分离套组(Thermo Fisher Scientific,Austin,TX,USA)或捕捉型cfDNA血清/血浆套组(CatchGene,中国台湾新台北市)，根据制造商推荐的方案，自血浆样品提取循环游离DNA(cfDNA)。ccfDNA样品具有140与200bp之间的清晰片段尺寸峰。DNA分离套组提供最高产量及低分子量溶离份。立即在2小时内自10mL周边血液分离出血浆。DNA定量之后，藉由使用NanoDrop ND-1000光谱亮度计(NanoDrop Technologies,Inc.,Wilmington,DE,USA)量测A260/A280比率(范围1.8至2.0)来验证纯度。
藉由KingFisherTMDuo Prime进行的自动化循环游离DNA提取及亚硫酸氢盐转化
在KingFisherTMDuo Prime纯化系统(ThermoFisher Scientific,新加坡)上，根据制造商说明书应用自动化方法进行ccfDNA提取及亚硫酸氢盐转化。此方法使得至多六个样品之基于磁珠的DNA提取同时自动操作。如随MagMAXTM游离DNA分离套组(ThermoFisherScientific,Austin,TX,USA,A29319)供应的说明书手册中所述调整工作流程。自1.6mL血浆中提取ccfDNA且在60μL分子生物学级水(Corning,NY,USA,46-000-CM)中溶离。亦在此机器上进行亚硫酸氢盐转化清除用于半自动化分析。利用随EZ-96DNA甲基化-LightningTMMagPrep套组(Zymo Research,Irvine,CA,USA,D5046)供应的说明书手册，开发用于亚硫酸氢盐转化清除的自动化方案。利用自动化方法之后，将所提取的ccfDNA与亚硫酸氢钠(6M)及氢醌(10mM)一起在60℃培育箱中培育30分钟。吾等使用60μL ccfDNA用于亚硫酸氢盐转化，且将亚硫酸氢盐转化的ccfDNA在100μL分子生物学级水中溶离。使用24深孔盘(ThermoFisher Scientific,Vantaa,Finland,95040470)执行自动化样品方法。立即使用经亚硫酸氢盐转化的所溶离ccfDNA进行甲基化特异性实时PCR。
使用LabTurbo 24C自动化提取循环游离DNA
使用LabTurbo 24Compact系统(Taigen Bioscience Co.，中国台湾台北)，根据制造商说明书执行自动化ccfDNA提取方法。工作流程遵循随着Labturbo循环DNA小型套组(目录号AIOLCD1600，Taigen Bioscience Co.，中国台湾台北)供应的说明书手册，其中对至多24个样品同时执行基于真空之全自动化DNA提取。自1.6mL血浆中提取ccfDNA且在60μL分子生物学级水(46-000-CM,Corning,NY,USA)中溶离。
用于全基因体甲基化分析的MethylationEPIC BeadChip数组
MethylationEPIC BeadChip(EPIC)数组涵盖850,000个CpG位点，包括>90％的CpG及HM450的99％ Refseq基因及额外413,743个CpG。EPIC数组已与用于血液样品的450K平台比较验证。使用
MethylationEPIC BeadChip数组(Illumina,San Diego,CA,USA)执行全基因体甲基化分析。使用EpiTect Fast DNA亚硫酸氢盐套组(QIAGEN,Bonn,德国，目录号59826)，根据制造商说明书，对500ng DNA执行亚硫酸氢盐转化。藉由确定甲基化信号强度相对于甲基化与未甲基化信号输出总和之比率，将各CpG位点的甲基化分数呈现为0(未甲基化)至1(完全甲基化)范围内的“β”值。使用GenomeStudio甲基化模块2011.1版，分析Infinium MethylationEPIC BeadChip资料。Infinium MethylationEPIC BeadChip使用Infinium I与Infinium II分析。Infinium I分析设计是每个CpG基因座使用2种珠粒类型：甲基化及未甲基化状态各使用1种。Infinium II设计是使用1种珠粒类型，其中甲基化状态是在杂交之后的单碱基延长步骤测定(右图)。使用heatmapper软件，利用热图使靶基因的不同甲基化CpG热图可视化。使用梯度尺度热图使DNA甲基化水平自低向高可视化。
基于探针的定量甲基化特异性PCR(qMSP)
根据制造商推荐的方案对DNA进行亚硫酸氢盐转化之后，使用TaqMan定量甲基化特异性PCR(qMSP)联合LightCycler 96(Roche Applied Science,Penzberg,德国)来量测TMEM240、MROH6、BEND5及SMAD3之DNA甲基化水平。使用SensiFASTTM探针No-ROX套组(Bioline，英国伦敦，目录号BIO-86020)与候选基因的特异性引子及甲基-TaqMan探针执行qMSP。使用LightCycler相对定量软件(1.5版，Roche Applied Science)获得相对于对照组校准的标准化DNA甲基化值。β肌动蛋白(ACTB)基因用作甲基化非依赖性DNA对照。ACTB基因的引子/探针经设计不含CpG位点(作为输入DNA的对照)。候选基因的引子/探针是在其甲基化启动子区域上设计，尤其在正常组织与肿瘤组织之间经鉴别有差异的区域上设计。根据定序结果，仅当所有CpG位点甲基化时，可进行成功的PCR反应。当结直肠肿瘤中之甲基化水平(相对于ACTB基因)比成对的正常结直肠组织样品高至少2倍时，靶基因视为高甲基化。候选基因甲基化最终产物的特异性是藉由亚硫酸氢盐定序确认。用于qMSP的引子及探针列于表1中。
统计学分析
使用SPSS(IBM,Armonk,NY,USA)执行皮尔森卡方检验(Pearson's chi-squaredtest)、曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)、威尔科克森检验(Wilcoxon test)及斯皮尔曼秩相关分析(Spearman's rank correlation analyses)。皮尔森卡方检验用于按照候选基因甲基化、RNA表现及其他临床数据对结直肠癌患者进行比较。成对样本威尔科克森检验及t检验用于对肿瘤与匹配相邻正常组织之间、不同癌症类型之间的DNA甲基化差异以及结直肠癌患者在手术治疗之间的候选ccfDNA甲基化差异进行比较。斯皮尔曼秩相关是用于分析肿瘤及血浆样品的甲基化水平。
为了评估多种生物标记物，当使用所建议的基因生物标记物时，利用康氏非参数逐步分类方法(Kang's nonparametric stepwise classification method)评价鉴别结直肠癌患者的准确度。除准确度之外，亦报导用于评价分类的其他常用量度，诸如接收者操作特征曲线下面积(AUC)、灵敏度、特异性、假阳性率及假阴性率。
实例1：结直肠癌组织中之标靶DNA序列的甲基化状态
基于Illumina甲基化450K数组之数据的β值由癌症基因体图谱(TCGA)研究网络产生。当正常组织的β值小于0.15时，选择靶核酸及基因；Δβ值(肿瘤的值减去正常组织的值)高于0.5或低于0.25。标靶DNA序列的甲基化状态Δβ值(T)显示于表2中。
表2
| MROH6 | TMEM240 | BEND5 | SMAD3 | |
| 结直肠癌 | 0.50 | 0.73 | 0.53 | 0.09 |
β值(T)，肿瘤组织甲基化状态；β值(T)≥0.5将按照高甲基化生物标记物计算且β值(T)≤0.25将按照低甲基化生物标记物计算。
图1显示靶核酸及基因之甲基化状态(β值)在肿瘤组织与相邻正常组织(n＝97)之间的差异。根据基于Illumina甲基化450K数组的数据，较深颜色指示甲基化状态较高的组织。
实例2：健康个体及结直肠癌患者之血浆样品中之靶基因之表观遗传生物标记物甲基化状态的早期检测
自血浆提取循环游离DNA。简言之，立即自10mL周边血液中分离出3.5mL血浆。在从获自结直肠癌患者及健康个体的血浆中提取循环游离DNA(cfDNA)之后，藉由亚硫酸氢盐转化执行cfDNA。基于探针之甲基化特异性实时PCR(qMSP)用于cfDNA甲基化分析。
根据以下准则处理获自qMSP分析的数据。若qMSP之Ct值就循环甲基化TMEM240基因而言小于45个循环，就循环甲基化MROH6基因而言小于40个循环，就循环甲基化BEND5而言小于45个循环，就循环甲基化SMAD3而言高于45个循环，则分数分别定义为1。否则，分数定义为0。
TMEM240、MROH6及BEND5之qMSP总分平均值高于0.2，人类个体定义为CRC患者。
图2显示健康个体及结直肠癌患者之血浆样品中之靶基因之表观遗传生物标记物甲基化状态的早期检测差异。图3显示健康个体及结直肠癌患者之血浆样品中之靶基因之表观遗传生物标记物的DNA甲基化水平(分数)总和。另外，如图4中所示的接收者操作特征(ROC)曲线分析指示结直肠癌患者及健康个体中之靶基因之表观遗传生物标记物甲基化状态的早期检测。
【序列表】
<110> 臺北醫學大學(TAIPEI MEDICAL UNIVERSITY)
<120> 結直腸癌的早期檢測、預測治療反應和預後之方法
<130> none
<140> US 63/017,309
<141> 2021-04-29
<160> 16
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 1
tttagaatta tgaagattat ggtgttc 27
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 2
aaaactcaac atcgaaccga 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 3
cgaccccgcc cgatatccat aa 22
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<400> 4
tttagaatta tgaagattat ggtgttc 27
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 5
ggtgagtttt tgatttgtaa ttgtc 25
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 6
atctcgtacc gctactacta cgc 23
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<400> 7
gtcgggggtt gttgatttta gtagcgtt 28
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 8
gtttgggttt tggggagtc 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 9
gatcgaacaa ctcaacccg 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 10
gtttttgtgc ggtttttgga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 11
aaccgcgaac gaaaactaaa 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<400> 12
cgaaaataaa aatccgacga 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<400> 13
ttgttacgcg ttgttcgtgt 20
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 14
gaataaggtc gttagttatt atcgt 25
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 15
aatcaaatct acccgaatcg aa 22
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<400> 16
gaaagaaaga aagaaagtaa attttatttt taagcg 36
Claims (24)
1.一种检测个体之结直肠癌之易感性或预测个体之结直肠癌之可能性、治疗反应、预后或复发的方法，其包含(a)提供来自所述个体的生物样品，及(b)测定所述生物样品中之包含TMEM240或其片段或MROH6或其片段之标靶DNA序列的甲基化状态，其中由所述个体之所述标靶DNA序列存在高甲基化或低甲基化指示结直肠癌之易感性、可能性、不良治疗反应、不良预后或复发。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述生物样品为组织、细胞、血液、尿液、血清、血浆、粪便、腹水、痰、唾液、胃液、胆汁或口腔黏膜。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包含若各基因或其片段存在高甲基化或低甲基化则定义分数为1且若各基因或其片段缺乏高甲基化或低甲基化则定义分数为0以及将所述分数求和的步骤。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述个体之所述标靶DNA序列之高甲基化或低甲基化的存在是藉由比较所述标靶DNA序列之甲基化状态与对照DNA序列之甲基化状态来确定。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述甲基化状态是藉由聚合酶链反应测定。
6.如权利要求5所述的方法，其中当用于测定所述人类个体中之TMEM240或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值小于50时，指示高甲基化；或当用于测定所述人类个体中之MROH6或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值小于45时，指示高甲基化。
7.如权利要求5所述的方法，其中当用于测定所述人类个体中之TMEM240或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值小于45时，指示高甲基化；或当用于测定所述人类个体中之MROH6或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值小于40时，指示高甲基化。
8.如权利要求1所述的方法，其中使用针对TMEM240或其片段或MROH6或其片段的标靶DNA序列甲基化特异性引子测定甲基化，其中针对TMEM240或其片段的所述标靶DNA序列甲基化特异性引子与选自由SEQ ID NO:1、2及3组成之群之序列具有约85％一致性；且针对MROH6或其片段的所述标靶DNA序列甲基化特异性引子与选自由SEQ ID NO:5及6组成之群的序列具有约85％一致性。
9.如权利要求1所述的方法，其中使用针对TMEM240或其片段或MROH6或其片段的标靶DNA序列甲基化特异性探针测定甲基化，其中针对TMEM240或其片段的所述标靶DNA序列甲基化特异性探针与SEQ ID NO:4之序列具有约85％一致性；且针对MROH6或其片段的所述标靶DNA序列甲基化特异性探针与SEQ ID NO:7之序列具有约85％一致性。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述标靶DNA序列进一步包含一或多种选自由以下组成之群的DNA序列：BEND5或其片段及SMAD3或其片段，或其任何组合。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述标靶DNA序列包含DNA序列之以下组合中的任一者：TMEM240或其片段与MROH6或其片段；TMEM240或其片段、MROH6或其片段与BEND5或其片段；TMEM240或其片段、MROH6或其片段、BEND5或其片段与SMAD3或其片段；TMEM240或其片段、BEND5或其片段与SMAD3或其片段；TMEM240或其片段、MROH6或其片段与SMAD3或其片段；MROH6或其片段与BEND5或其片段；以及MROH6或其片段、BEND5或其片段与SMAD3或其片段。
12.如权利要求10或11所述的之方法，其中藉由聚合酶链反应测定甲基化状态，且当用于测定所述人类个体中之BEND5或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值小于50时，指示高甲基化；或当用于测定所述人类个体中之SMAD3或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值高于40时，指示低甲基化。
13.如权利要求10或11所述的方法，其中藉由聚合酶链反应测定甲基化状态，且当用于测定所述人类个体中之BEND5或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值小于45时，指示高甲基化；或当用于测定所述人类个体中之SMAD3或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值高于45时，指示低甲基化。
14.如权利要求10或11所述的方法，其中使用BEND5或其片段或SMAD3或其片段或其组合的标靶DNA序列甲基化特异性引子测定甲基化，其中针对BEND5或其片段的所述标靶DNA序列甲基化特异性引子与选自由SEQ ID NO:8至11组成之群之序列具有约85％一致性；且针对SMAD3或其片段的所述标靶DNA序列甲基化特异性引子与选自由SEQ ID NO:14至15组成之群的序列具有约85％一致性。
15.如权利要求10或11所述的方法，其中使用针对BEND5或其片段或SMAD3或其片段或其组合的标靶DNA序列甲基化特异性探针测定甲基化，其中针对BEND5或其片段的所述标靶DNA序列甲基化特异性探针与选自由SEQ ID NO:12至13组成之群的序列具有约85％一致性；且针对SMAD3或其片段的所述标靶DNA序列甲基化特异性探针与SEQ ID NO:16之序列具有约85％一致性。
16.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中测定甲基化状态进一步包含藉由加权总和分数分析来量测特异性及灵敏度的步骤。
17.一种经分离之核酸分子，其具有选自由SEQ ID No:1至16组成之群的序列。
18.一种套组，用于检测个体之结直肠癌之易感性或预测个体之结直肠癌之可能性、治疗反应、预后或复发，所述套组包含用于检测包含TMEM240或其片段或MROH6或其片段之标靶DNA序列之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性引子对。
19.如权利要求18所述的套组，其进一步包含用于检测包含TMEM240或其片段或MROH6或其片段之标靶DNA序列之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性探针。
20.如权利要求18所述的套组，其中针对TMEM240或其片段的所述标靶DNA序列甲基化特异性引子对包含SEQ ID NO:1及2或1及3；且针对MROH6或其片段的所述标靶DNA序列甲基化特异性引子对包含SEQ ID NO:5及6。
21.如权利要求19所述的套组，其中针对TMEM240或其片段的所述标靶DNA序列甲基化特异性探针包含SEQ ID NO:4；且针对MROH6或其片段的所述标靶DNA序列甲基化特异性探针包含SEQ ID NO:7。
22.如权利要求18至21中任一项所述的套组，其中所述标靶DNA序列进一步包含BEND5或其片段或SMAD3或其片段，且所述套组进一步包含一或多种用于检测BEND5或其片段或SMAD3或其片段或其任何组合之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性引子对。
23.如权利要求22所述的套组，其中针对BEND5或其片段的所述标靶DNA序列甲基化特异性引子对包含SEQ ID No.8及9或10及11；针对SMAD3或其片段的所述标靶DNA序列甲基化特异性引子对包含SEQ ID No.14及15。
24.如权利要求22所述的套组，其中所述套组进一步包含一或多种用于检测BEND5或其片段或SMAD3或其片段或其任何组合之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性探针，其中针对BEND5或其片段的所述标靶DNA序列甲基化特异性探针包含SEQ ID NO:12或13；且针对SMAD6或其片段的所述标靶DNA序列甲基化特异性探针包含SEQ ID NO:16。
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