JP2000514307A - 増加した標的特異的ｔ▲下ｍ▼を持つ修飾オリゴヌクレオチドを用いた核酸配列の検出および増幅のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、相補的なヌクレオチド塩基配列を有する標的核酸へのオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させる、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに関する。これらの修飾ヌクレオチドは、同一のヌクレオチド塩基配列を有する未修飾オリゴヌクレオチドより早い速度で標的配列にハイブリダイズする。こうした修飾オリゴヌクレオチドは、窒素性塩基に結合する２'-O-メチルリボフラノシル部分を少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、本発明の通りに、優先的にRNA標的に結合するよう修飾してもよい。本発明はまた、これら修飾オリゴヌクレオチドを用いる方法、および当該オリゴヌクレオチドを含むキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 増加した標的特異的Ｔ_Mを持つ修飾オリゴヌクレオチド を用いた核酸配列の検出および増幅のための方法技術分野 本発明は増加した標的親和性を生じる修飾または複数の修飾を持つ一つまたは それ以上のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを使用する、核酸配列を検出 または増幅するための方法および組成物に関している。そのようなオリゴヌクレ オチドは、同一の標的に対して対応する非修飾オリゴヌクレオチドがハイブリダ イズするよりも著しく速い速度で標的核酸にハイブリダイズすることが予想外に にも発見された。その結果、本発明の方法および組成物は、医学的および獣医学 的診断、食品試験および法医学のような核酸ハイブリダイゼーションを用いる応 用に有利である。背景技術 近年、核酸ハイブリダイゼーションは与えられた試料における特定の核酸の存 在を同定、測定および検出する手段としてますます重要になってきた。従って、 例えば、医学診断、環境および食品試験および法医学の分野はすべて、与えられ た生物学的夾雑物または試料中の微生物の存在または不在を試験する迅速で、簡 単なおよび並外れて正確な方法としての核酸ハイブリダイゼーション使用の恩恵 を被ってきた。 ほとんどの核酸ハイブリダイゼーションスキームは共通の特色を持っている。 一つのそのような特色は、定義されたまたは既知のヌクレオチド配列を持ってい る一本鎖核酸プローブ（または変性二本鎖プローブ）の使用である。プローブ分 子はゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのような生物源から誘導されてもよいし、または 原核生物かまたは真核生物宿主細胞またはインビトロで酵素的に合成されてもよ い。現在、普通に使用されるほとんどの核酸プローブは化学合成法を用いて作製 されたオリゴヌクレオチドプローブである（”合成オリゴヌクレオチド”）。一 つのそのような合成法は、成長する、固相に結合されたオリゴヌクレオチド鎖の ５’末端に３’一活性化、保護ヌクレオチドの自動化された連続的付加、続いて 支持体からの完成したオリゴヌクレオチドの切断および脱保護である。例えば、 Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ａｎａｌｏｇｕｅ ｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９１）を参照されたい。 ハイブリダイゼーションプローブとして使用するための合成オリゴヌクレオチ ドは典型的には検出されるべき核酸のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド 配列を持つデオキシリボヌクレオチドである。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは多く の理由により伝統的に好まれている。それらの中の一つはＤＮＡは普通の試料に 暴露された場合に酵素的加水分解に対してより高い安定性を持っていることであ る（種々のＲＮａｓｅが試料のほとんど至る所に存在するため）。ＲＮＡはＤＮ Ａより化学的に安定性が悪いことも知られており、例えば、ＲＮＡ分解は塩基、 重金属の存在により容易に起こる。ＲＮＡと比較して、ＤＮＡはアッセイ条件下 、安定な二次構造をとる傾向は高くない。そのような二次構造は、オリゴヌクレ オチドを分子間ハイブリダイゼーションに利用できなくすることができる。ＲＮ Ａがより好ましいものでないにしても、それにも関わらず、ＲＮＡオリゴヌクレ オチドを使用してもよい。 核酸ハイブリダイゼーションは、相補的ヌクレオチド配列を持つ核酸鎖の対応 する領域と安定なハイブリッドを形成する一本鎖核酸の能力を利用する。そのよ うなハイブリッドは三本鎖構造も知られているが、通常は二本鎖の二重鎖から成 っている。一般的に、ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖は塩基、アデニン（Ａ）、シ トシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）またはイノシ ン（Ｉ）を含むヌクレオチドから形成されている。一本鎖はハイブリダイズして 相補的塩基対間の水素結合により一緒になって保たれた二本鎖構造を形成する。 一般に、ＡはＴまたはＵと水素結合され、一方、ＧまたはＩはＣへ水素結合され る。二本鎖に沿って、ＡＴまたはＡＵ、ＴＡまたはＵＡ、ＧＣまたはＣＧが存在 している。加えて、いくつかの不適正塩基対（例えば、ＡＧ、ＧＵ）が存在する かもしれない。適当なハイブリダイゼーション条件下、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが形成できる。 ”相補的”とは、二つの二本鎖核酸の対応する領域、または同一の一本鎖核酸 の二つの異なった領域の核酸配列が、ストリンジェントハイブリダイゼーション 条件下、一本鎖が一緒になってハイブリダイズして安定な二本鎖水素結合領域と なることを可能にするようなヌクレオチド塩基組成を持っていることを意味して いる。一つの一本鎖領域のヌクレオチドの隣接配列が、他の一本鎖領域のヌクレ オチドの類似の配列と連続した”基準的”水素結合塩基対（ＡがＵまたはＴと対 を作りおよびＣがＧと対を作るような）を形成できる場合、ヌクレオチド配列は ”完全に”相補的である。 いくつかの条件下ではたった一つの塩基が異なった核酸の区別が可能である核 酸ハイブリダイゼーションの極度の特異性は、特定の微生物、与えられた遺伝子 マーカーを運んでいる核酸、組織、生物体液などを含む試料のハイブリダイゼー ションに基づいた開発を可能にしてきた。そのようなアッセイはしばしば他の近 縁種を含む試料中の特定の微生物種に属する核酸の同定を可能にする。核酸ハイ ブリダイゼーションアッセイはまた、ヒト起源試料のＲＦＬＰ（制限断片長多形 ）およびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）試験の法医学的使用のように、種内の ある個体または個体の群を特異的に検出または同定できる。 核酸ハイブリダイゼーション試験における診断道具としてのオリゴヌクレオチ ドの使用には、オリゴヌクレオチドプローブ分子またはプローブおよび標的の両 方に結合されたレポーター基または”標識”の使用がしばしば含まれる（しかし 必ずしも含まれている必要はない）。そのようなレポーター基残基には、例えば 、放射性同位元素、化学発光または蛍光試薬またはオリゴヌクレオチドに結合さ れた酵素が含まれるであろう。標識は、特にプローブが標的核酸にハイブリダイ ズされた場合にプローブを検出可能にするために用いられる。 核酸を用いるアッセイ法の大多数は、非結合プローブからプローブ：被検体ハ イブリッドを分離するために物理的分離工程を利用している。これらのアッセイ 法は”不均一”アッセイと称されている。核酸ハイブリダイゼーションアッセイ において、被検体分子は検出、定量および／または同定が試みられている標的核 酸種である。”ハイブリッド”とは、アッセイおよび／または増幅条件下、分子 間水素結合を生じる相補性領域を持っている、プローブおよび標的核酸のような 二つの一本鎖核酸から成る部分的または完全な二本鎖核酸である。 物理的分離工程を利用するアッセイ法には分離過程にガラス、鉱物またはポリ マー性物質のような固相マトリックスを用いる方法が含まれる。分離は、固相マ トリックスへ優先的にプローブ：被検体複合体を結合し、一方、会合しないプロ ーブ分子を液相に残存させることを必要とする。そのような結合は例えば、ヒド ロキシアパタイトの場合のように非特異的であるものでもよいし、例えば、標的 核酸と、固体保持体上に直接または間接的に固定されている”捕捉”プローブと の配列特異的相互作用による特異的なものであってもよい。そのような場合、洗 浄工程後に固相支持体へ結合されて残存しているプローブの量は、試料中の被検 体の量に比例している。 もしくは、アッセイはハイブリダイズしていないプローブを優先的に結合し、 一方、ハイブリッドを液相に存続して残す必要があるであろう。この場合、洗浄 工程後の液相中のプローブの量が本来の試料の被検体の量に比例している。プロ ーブが核酸またはオリゴヌクレオチドの場合、固体支持体はヒドロキシアパタイ トのような吸着剤、多カチオン性部分分子、疎水性または”逆相”物質、ＤＥＡ Ｅのようなイオン交換物質、ゲル濾過マトリックスまたは一つまたはそれ以上の これらの固相物質の組み合わせを含むことができるが、これらに制限されるわけ ではない。これらの固相支持体は、直接または間接的にプローブ、標的またはそ の両方を捕捉するために一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドまたは他の特 異的結合残基を含んでいるであろう。ゲル濾過、ポリアクリルアミドゲルまたは アガロースゲルのような媒質の場合においては、分離はオリゴヌクレオチドの結 合によるものではなく、それは異なった大きさまたは形の分子の分子ふるい分け により行われている。後者の二つの場合、二本鎖および一本鎖核酸のような異な った大きさまたは形の核酸のゲルを通しての異なった移動を起こす電流をゲルに 与えることにより、電気泳動的に分離が行われるであろう。 不均一アッセイ法では、問題とする被検体を含んでいることが疑われる試料の 添加に先立っての、固相マトリックスへのプローブの結合も行われるであろう。 試料は標識と、所望の核酸（もし、試料混合物中に存在するなら）の標識を起こ すであろう条件下で接触させることができる。固相マトリックスは、プローブお よびマトリックス間に共有結合が形成されるように誘導化または活性化される。 もしくは、プローブは以下の相互作用を含む（制限するわけではない）強力な非 共有結合相互作用によりマトリックスに結合されるであろう：イオン性、疎水性 、逆相、免疫結合、キレート形成および酵素基質。ハイブリッドの形成が可能な 条件下、マトリックス−結合プローブを標識核酸に暴露した後、非結合、標識被 検体を遊離させるために固相マトリックスを洗浄することにより分離工程が達成 される。逆に、被検体を固相マトリックスに結合でき、標識プローブと接触させ 、標識検出の前にマトリックスから過剰の遊離プローブを洗浄することもできる 。 さらに別の型のアッセイ系は”均一アッセイ”と称されている。均一アッセイ は一般的に溶液中で行うことができ、固相分離工程がなく、通常遊離プローブお よび被検体：プローブ間の化学的相違を利用する。均一および不均一様式で使用 できるアッセイ系の例は、Ａｒｎｏｌｄらによる米国特許第５，２８３，１７４ 号に開示されているハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ^TM）であり、 プローブは化学発光残基に結合されており、被検体と接触させ、次に被検体：プ ローブ複合体に結合または連結されている化学発光試薬を変化させることなく、 ハイブリダイズされていないプローブに結合または連結されている化学発光試薬 を変化させる条件下、選択的化学分解または安定性の検出可能な変化を起こさせ る。続いての化学発光反応の開始により、ハイブリッド−会合標識が発光を起こ す。この特許は本出願と共通の所有権を保持しており、特別に本明細書において 援用される。 標識プローブまたは被検体がその非標識類似体との結合を競合する競合アッセ イもまた不均一形式で普通に使用される。どのように系が設計されるかに依存し て、結合標識プローブの量かまたは非結合標識プローブの量を試料中の被検体の 量に相関させることができる。しかしながら、そのようなアッセイはまた、物理 的分離工程を含まない均一形式、または均一および不均一アッセイの両方の要素 を取り込んだ形式においても使用できる。 本明細書に記載したアッセイ法は単に例示のためであり、当業者には既知であ る核酸を用いるアッセイ形式を余す所なく述べていると理解してはならない。 核酸ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドを生きている生物体内の 遺伝子発現を修飾または阻害するための治療薬として用いることを目的とした方 法で利用されてきた。そのような利用の例において、オリゴヌクレオチド”アン チセンス”剤は、ウイルスタンパク質または癌遺伝子のような障害性遺伝子産物 をコードしているｍＲＮＡ種を特異的に標的化することができる。例えば、Ｚａ ｍｅｃｎｉｋ ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，７５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），２８０−２８４（１９７８）；Ｓｔｅｐｈｅｎ ｓｏｎ ａｎｄ Ｚａｍｅｃｎｉｋ，７５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），２８５−２８８（１９７８）；およびＴｙｌｌｉｓ,米国 特許第５，０２３，２４３号を参照されたい。出願人は理論に縛られるのを望ん でいるわけではないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮＡ標的への結合 により生じるＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖はＲＮＡｓｅ（ほとんどの細胞に存在するＲ ＮＡ分解酵素であり、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖に含まれているＲＮＡに特異的であ る）の基質になるであろうと考えられている。このモデルに従うと、標的ＲＮＡ 分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより分解 される。この一般戦略の変法も存在し、例えば、オリゴヌクレオチドは、オリゴ ヌクレオチド上に酵素活性（いわゆるリボザイムと称されるＲＮＡｓｅ活性のよ うな）を与える構造を持っている。例えば、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、ＰＣＴ公開第 ＷＯ９３／１５１９４号を参照されたい。 治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドは主としてインビボで機能するように 設計されているため、そのような薬剤を送達するための処方は正常の細胞機能を 有意に阻害してはならない。従って、インビトロでのオリゴヌクレオチド分解を 防止するために診断試薬にしばしば含まれているであろうヌクレアーゼ阻害剤は インビボでの使用には適していない。このことから、非修飾ＤＮＡよりも高いヌ クレアーゼ耐性を持たせるため、ヌクレオチド結合間で、塩基または糖残基で、 またはこれらの部位を組み合わせた部位で修飾された種々のオリゴヌクレオチド が設計された。 従って、窒素性塩基に修飾を持ついくつものオリゴヌクレオチド誘導体が作製 され、アデノシンの６位アミノ基の水素による置き換えにより得られたプリン； グアノシンの６−ケト酸素の水素による置換により得られた２−アミノプリン、 または硫黄による置換により得られた６−チオグアノシン、およびチミジンの４ −ケト酸素を硫黄または水素で置き換えることによる、各々、４−チオチミジン または４−ヒドロチミジンなどが含まれる。これらすべてのヌクレオチド類似体 がオリゴヌクレオチド合成のための反応体として使用できる。例えば、Ｏｌｉｇ ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃ ａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（前記文献）を参照されたい。他の置換塩基が本分野で 知られている。例えば、Ｃｏｏｋらにより”遺伝子発現を検出および調節するヌ クレアーゼ耐性、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド”と題されたＰＣＴ公開第 ＷＯ９２／０２２５８号（本明細書において援用される）を参照されたい。塩基 修飾ヌクレオチド誘導体はオリゴヌクレオチド合成のために商業的に手に入れる ことができる。 同様に、リボフラノシルまたはデオキシリボフラノシル残基の修飾を持ついく つものヌクレオチド誘導体が報告されている。例えば、Ｃｏｏｋらにより”シク ロブチル アンチセンスオリゴヌクレオチド、作製方法およびその使用”と題さ れたＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１９０２３号；ＭｃＧｅｅらにより”新規２’−Ｏ −アルキルヌクレオシドおよびその製造のためのホスホロアミダイト過程および その使用”と題されたＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０２５０１号；Ｃｏｏｋにより” ギャップを持つ２’−修飾オリゴヌクレオチド”と題されたとＰＣＴ公開第ＷＯ ９３／１３１２１号を参照されたい。これら三つの文献は本明細書において援用 される。 そのような修飾塩基を含んでいるほとんどのオリゴヌクレオチドは、増加した 細胞取り込み、ヌクレアーゼ耐性および／または増加した基質結合性を考慮して 処方された。言い換えると、そのようなオリゴヌクレオチドは治療用遺伝子調節 薬剤として記載されている。 修飾ヌクレオチド残基を持つ核酸は天然にも存在している。従って、型または 起源に依存して、ＲＮＡ中の修飾塩基はメチル化またはジメチル化塩基、脱アミ ノ化塩基、カルボキシル化塩基、チオ化塩基およびこれらの修飾の種々の組み合 わせを持つ塩基を含むことができる。加えて、２’−Ｏ−アルキル化塩基が天然 の核酸として存在することが知られている。Ａｄａｍｓ，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅ ｍ ｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，７，８（１１版、１ ９９３）を参照されたい。発明の要約 本発明は核酸ハイブリダイゼーション技術を用いる診断法および組成物に関す る。出願人は驚いたことに、相補的ヌクレオチド配列を持っている標的核酸への 増加した結合親和性を持つ一つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含むオリゴ ヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドよりも速い速度で標的核酸へハイブ リダイズするであろうことを発見した。本明細書に記載されている発明は、例え ば、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマー、ヘルパーオリ ゴヌクレオチドおよび所望の核酸の捕捉および固定化のためのオリゴヌクレオチ ドとしてのそれらの使用を含む方法においての、オリゴヌクレオチド（全体的ま たは部分的にそのように修飾されている）の使用に注意を引かれた。 本発明はそのように制限されているようにみなされるものではないが、本発明 の特に好適な態様はリボフラノシル（またはデオキシリボフラノシル）残基の２ ’修飾を含むヌクレオチドを持っているオリゴヌクレオチドを利用する診断法に 関している。特に、出願人は合成オリゴヌクレオチドの一部にそのような修飾を 持っているヌクレオチドを取り込むと、核酸ハイブリダイゼーションの速度を大 いに増加でき、ＤＮＡ標的よりもＲＮＡ標的へのそのようなオリゴヌクレオチド の結合が優先される。現在好適な態様では、窒素性塩基へ連結された２’−Ｏ− メチルリボフラノシル残基を持つヌクレオチド類似体を含んでいるオリゴヌクレ オチドを使用している。糖の２’位での他の置換も、本開示を考慮すれば、置換 がハイブリダイゼーションの立体的阻害を起こさない限りは同様の特性を持って いると期待される。 加えて、本発明のもとになった発見を考慮すると、修飾オリゴヌクレオチド： 標的ハイブリッドのＴ_mを増加させる他の修飾も、同様にハイブリダイゼーショ ン速度を増加させるのに寄与することを期待するのは合理的であろう。そのよう な修飾はデオキシリボフラノシルまたはリボフラノシル残基の２’位（または他 の位置）（２’ハライド置換のような）、窒素性塩基上（Ｎ−ジイソブチルアミ ノ メチリデン−５−（１−プロピニル）−２’−デオキシシチジン；シチジン類似 体または５−（１−プロピニル）−２’−デオキシウリジン；チミジン類似体） または連結残基中に起こるであろう。従って、本明細書を通して２’修飾を特に 参考にしていくが、当業者は同一塩基配列の非修飾オリゴヌクレオチドを含んで いるハイブリッドよりも修飾オリゴヌクレオチド：標的ハイブリッドのＴ_mの増 加を導く他の修飾もハイブリダイゼーション動力学に対して同様の性質および効 果を持つと期待されることを理解するであろう。 用語Ｔ_mはその温度で等量の相補的核酸鎖の総数の５０％が二本鎖形で存在し ていることを意味しており、本開示を通して”オリゴヌクレオチドのＴ_m”また は核酸（一本鎖）のＴ_mとは標的との核酸二重鎖中のオリゴヌクレオチドまたは 核酸のＴ_mを意味することが意図されており、ここで核酸は特に指示しない限り オリゴヌクレオチドの塩基配列領域に正確に相補的である塩基配列領域を含んで いる。 修飾オリゴヌクレオチドのＴ_mは同一塩基配列の対応する非修飾オリゴヌクレ オチドのＴ_mよりも高いため、本明細書に記載されている組成物および診断法は 、核酸標的（好適にはＲＮＡ標的）の特異的ハイブリダイゼーションおよび検出 に実際的であるよりも短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にする。与えられた 温度で標的核酸へ特異的に結合する、より短い長さのオリゴヌクレオチドの使用 はさらなる利点を持っている。例えば、より短いオリゴヌクレオチドは一般的に ”不適正”塩基配列領域と完全に相補的である標的を区別するより大きな能力を 持っているであろう。より短いオリゴヌクレオチドはまた、所望しない塩基配列 とは重なりにくいであろう。さらに、より高いＴ_mのため、修飾オリゴヌクレオ チドはそれらの非修飾相対物よりもより高い温度で安定にハイブリダイズできる 。 より高いハイブリダイゼーション温度の使用は速度論的にハイブリダイゼーシ ョン反応を動かし、より低い温度で起こるよりも速いハイブリダイゼーション速 度が得られる。さらに、本発明の方法で使用された修飾オリゴヌクレオチドでは 、温度を上げなくても非修飾相対物よりも速いハイブリダイゼーション速度が得 られた。 速くなったハイブリダイゼーション速度は診断アッセイにおいていくつかの他 の利点を導いた。例えば、本発明に従って実施される診断アッセイは、従来存在 するハイブリダイゼーションアッセイよりも迅速に実施できる。アッセイの結果 が医学処置または他の行動の進行を指示する場合、より速いアッセイ結果は明ら かな予後徴候利点を持っており、より有効な処置が行える。また、標的、特にＲ ＮＡ標的に対する修飾オリゴヌクレオチドのより速いハイブリダイゼーション速 度およびより大きな親和性のため、同一量の信号を達成するためにより低い濃度 のプローブが使用されるであろう。従って、アッセイバックグラウンド（または ”ノイズ”）が低減でき、より低い濃度のプローブは非標的核酸との望ましくな い交差反応を除去するのを助けることができる。加えて、これらのアッセイは多 量の試料で実施してもよく、従ってアッセイの感度が増加する。 従って、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅オリゴヌクレオチド 、試料調製オリゴヌクレオチドおよび／またはヘルパーオリゴヌクレオチドはす べて、標的特異的ハイブリダイゼーションの速度を増加させる利点を持つ修飾塩 基を含むように設計できる。図の簡単な説明 図１は本開示において検出可能化学発光標識として使用されるアクリジニウム エステルのサンプリングのためのＩＵＰＡＣ命名法を提供している。 図２は被検体の検出は最初に被検体のプローブ以外の核酸へのハイブリダイゼ ーションを必要とする配置を示している。この配置に従うと、被検体が非プロー ブ核酸にハイブリダイズされる前は、プローブは被検体かまたは非プローブ核酸 に結合できない。（ボールド体の部分は被検体および非プローブ核酸間の相補的 な領域を示している。）しかしながら、被検体の非プローブ核酸へのハイブリダ イゼーションは、非プローブ核酸のコンフィギュレーションを非プローブ核酸の プローブへのハイブリダイゼーションを十分に可能にするように変化させ、被検 体の検出を可能にする。 図３は２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドプローブとＲＮＡ標的またはＤＮ Ａ標的との融解曲線を示しており（二つの独立した実験）、融解は２６０ｎｍで の光吸光度の増加として示されている（濃色シフト）。 図４は固定したハイブリダイゼーション時間内での、単一濃度の同一塩基配列 アクリジニウムエステル標識デオキシ−または２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオ チドの、種々の量の完全相補的ＲＮＡ標的に対するハイブリダイゼーションを示 している。 図５は固定したハイブリダイゼーション時間内での、種々の濃度の同一塩基配 列アクリジニウムエステル標識デオキシ−または２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレ オチドの、固定した量の完全相補的ＲＮＡ標的に対するハイブリダイゼーション を示している。 図６は種々のハイブリダイゼーション時間内での、固定した濃度の同一塩基配 列アクリジニウムエステル標識デオキシ−または２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレ オチドの、種々の量の完全相補的ＲＮＡ標的に対するハイブリダイゼーションを 示している。 図７はＤＮＡまたは２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドプローブの完全相補 的ＲＮＡ標的に対するハイブリダイゼーションを示している。データは式ｌｎ（ １−Ｈ）＝（ｋ）（Ｃ_Oｔ）に従ってプロットされており、ここでＨはパーセン トハイブリダイゼーション、ｋはハイブリダイゼーション速度定数、Ｃ_Oはプロ ーブの濃度であり、ｔは時間である。発明の詳細な説明 定義 特に指示しない限り、以下の用語は本明細書を通して指示された意味を持って いるであろう。 ”核酸被検体（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｔｅ）”または”被検 体”とは、試料中の検出されるべきと考えられる核酸、または核酸増幅反応の結 果として合成された核酸を意味しており、それは試料中で検出されるべきと考え られた核酸またはそれらの相補体のヌクレオチド塩基配列の少なくとも約２０ヌ クレオチドを含んでいる。 核酸またはオリゴヌクレオチドを”合成する”とは、化学合成または酵素的手 段により核酸を作製することを意味している。ある種の核酸ポリメラーゼ酵素は 、酵素的合成の間に修飾ヌクレオチドを取り込めることが知られている。 ”修飾された”、”修飾されたヌクレオチド”または”修飾”とは、古典的リ ボ−およびデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＵからの目的を持っ た変異体を意味している。本明細書で使用された場合、修飾されたとは古典的ヌ クレオチドの変異体を意味するであろうし、該修飾されたヌクレオチドを含むオ リゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズされた場合、古典的ヌクレオチド を含む同一のオリゴヌクレオチドよりも高い結合効率が該変異体からは得られる 。いくつかの場合、修飾された３’末端を持っているオリゴヌクレオチドが参照 されるであろう。このことは、オリゴヌクレオチドの３’末端が核酸ポリメラー ゼによる３’末端の伸長を阻害または防止する置換を含んでいることを意味して いる。 ”複合された分子（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）”とは、分子お よびオリゴヌクレオチド両方の少なくともいくつかの特性が結合された生成物中 で保持されているようにオリゴヌクレオチドと結合できる分子を意味している。 しばしば、複合された分子はオリゴヌクレオチドに対して新しい物理的または化 学的性質を与えるが、一方、オリゴヌクレオチドは塩基対形成の能力は保持して いる。 ”結合親和性”とは定義された核酸ハイブリダイゼーション条件下、少なくと も部分的に相補的な核酸間の水素結合強度の尺度を意味している。結合親和性の 都合のよい尺度はＴ_mであり、それは該二つの鎖の５０％が二本鎖またはハイブ リダイズされた形で存在する温度である。 ”標識（ｌａｂｅｌ）”とはオリゴヌクレオチドの存在の指標として検出され るレポーター部分を意味しており、それはオリゴヌクレオチドに結合されている 。標識オリゴヌクレオチドが一つまたはそれ以上の他のオリゴヌクレオチドへハ イブリダイズされている場合、標識の存在は同様に他のオリゴヌクレオチドまた は複数のオリゴヌクレオチドの存在の指標となりうる。適したレポーター部分は 本分野ではよく知られており、例えば、放射性同位元素、色素、化学発光物質、 蛍光物質、化学発光および電気化学発光物質、核酸配列、酵素、酵素基質、発色 団およびハプテンが含まれる。 ”核酸アッセイ条件”とは非相補的塩基配列領域間の安定なハイブリッド形成 よりも相補的塩基配列領域間の安定なハイブリッドの優先的な形成のための環境 条件を意味しており、温度および塩濃度を含んでいる。 ”アクリジニウムエステル誘導体（ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ ｄｅ ｒｉｖａｔｉｖｅ）”または”ＡＥ”とは、アクリジニウム環と脱離基をＣ９位 で結合している、標識エステルまたはエステル様結合を持つアクリジニウム環か ら誘導される化学発光性化合物の一群を意味している。脱離基は好適にはアリー ルまたは置換アリール基である。アルキル（例えば、メチル）アルコキシ（例え ば、メトキシ）、アリールおよびハライド（例えば、ＢｒおよびＦ）のような置 換をアクリジニウム環または脱離基の片方または両方に行ってもよい。そのよう なアクリジニウムエステルの例は図１に提供されている。 本発明の方法および組成物は、オリゴヌクレオチドが与えられた標的に対して より高いＴ_mを持つように修飾された一つまたはそれ以上のヌクレオチドを含ん でいるオリゴヌクレオチド（修飾がなければ非修飾オリゴヌクレオチドと比較し ても同一である）は非修飾オリゴヌクレオチドと比較してより速い速度で与えら れた標的にハイブリダイズするであろうという予期されなかった発見の結果であ る。修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度の最大の増加は、ヌ クレオチドの”クラスター”が修飾された場合に起こる。”クラスター”とは少 なくとも約４から５の連続したヌクレオチドがそのように修飾されていることを 意味している。従って、修飾および非修飾ヌクレオチドの混合物を含んでいるオ リゴヌクレオチドも、１００％修飾ヌクレオチドを含んでいるオリゴヌクレオチ ドが標的ハイブリダイゼーション速度を増加させるのと同様に有効である。本発 明の態様は、修飾および非修飾ヌクレオチドの両方を含んでいる”キメラ”オリ ゴヌクレオチドを特色としている。 本明細書の文脈で使用される場合、”標的”核酸とはオリゴヌクレオチドとハ イブリダイズされることが試みられている核酸である。そのような核酸は天然に 存在する核酸（例えば、リボソームＲＮＡ）であってもよいし、ＰＣＲまたは以 下により詳細に説明される転写に基づいた増幅法のような核酸増幅法の生成物（ 即ち、”アンプリコン”）であってもよいし、または他の合成オリゴヌクレオチ ドであってもよい。 従って、本発明は同一塩基配列の非修飾オリゴヌクレオチドよりもオリゴ：標 識ハイブリダイゼーション速度の増加を示す修飾オリゴヌクレオチドを含む診断 法および組成物に関している。 好適な態様において、本発明はデオキシリボフラノシル（またはリボフラノシ ル）環の２’位での修飾を利用している。２’−修飾にはリボフラノシル環の２ ’位での水素またはヒドロキシル以外の基の置換が含まれている。置換の性質に 関わらず、相補的ヌクレオチド塩基配列を持っている一本鎖オリゴヌクレオチド へハイブリダイズする、一つまたはそれ以上のそのようなヌクレオチド修飾を含 んでいるオリゴヌクレオチドの能力を立体的に妨げてはならない。一つの鎖がそ のような修飾を含んでいる、相補的二本鎖核酸のハイブリダイゼーションは、ど ちらの鎖もそのように修飾されていない状態と比較すると著しく増加している。 修飾されたオリゴヌクレオチドが”増加した”または”より大きな”親和性ま たは速度を持っていると呼ばれる場合、修飾されたオリゴヌクレオチドのハイブ リダイゼーション速度または親和性が、同一標的に対する同一の長さおよび塩基 配列の非修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度または結合親和 性よりも大きいことを意味している。 特に好適なオリゴヌクレオチドは２’糖位置がメトキシ基で置換されているも のである。これらの２’−修飾オリゴヌクレオチドはＴ_mおよびハイブリダイゼ ーション速度論の両方に関して、ＲＮＡ標的と同一の配列を持っている（しかし 、ＴはＵで置換されている）ＤＮＡよりもＲＮＡに対する優先性を示した。別の そのようなオリゴヌクレオチドは本分野で既知である。 本明細書に記載したように修飾されたオリゴヌクレオチドに結合された複合体 分子はこれらのオリゴヌクレオチドの標的への結合親和性およびハイブリダイゼ ーション速度をさらに増加させるように機能するであろう。そのような複合体分 子には、例えば、カチオン性アミン、インターカレーティング色素、抗生物質， タンパク質、ペプチド断片および金属イオン錯体が含まれる。普通のカチオン性 アミンとしては、例えば、スペルミンおよびスペルミジン（即ち、ポリアミン） が挙げられる。本分野で知られているインターカレーティング色素には、例えば 、エチジウムブロミド、アクリジンおよびプロフラビンが含まれる。核酸に結合 で きる抗生物質には、例えば、アクチノマイシンおよびネトロプシンが含まれる。 核酸に結合できるタンパク質には、例えば、制限酵素、転写因子およびＤＮＡお よびＲＮＡ修飾酵素が含まれる。核酸に結合できるペプチド断片には、例えば、 ＳＰＫＫ（セリン−プロリン−リジン（アルギニン）−リジン（アルギニン）） モチーフ、ＫＨモチーフまたはＲＧＧ（アルギニン−グリシン−グリシン）ボッ クスモチーフが含まれるであろう。例えば、Ｓｕｚｕｋｉ，ＥＭＢＯＪ，８：７ ９７−８０４（１９８９）；およびＢｕｎｄ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６５ ：６１５−６２１（１９９４）を参照されたい。核酸に結合する金属イオ ン錯体には、例えば、コバルト ヘキサミンおよび１，１０−フェナントロリン −銅が含まれる。例えば、生じたハイブリッドが三つまたはそれ以上の核酸を含 んでいる場合、オリゴヌクレオチドはさらに別の種類の複合体分子を意味してい る。そのようなハイブリッドの例は、標的核酸、標的にハイブリダイズしたオリ ゴヌクレオチドプローブおよびプローブにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチ ド複合体分子から成る三重鎖であろう。複合体分子は、インターカレーション、 グルーブ相互作用、静電結合および水素結合を含む種々の手段により（これらに 制限されるわけではない）オリゴヌクレオチドに結合される。当業者は本発明の 修飾オリゴヌクレオチドに結合できる他の複合体分子を認識するであろう。例え ば、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１ （３） ：１６５−１８７（１９９０）を参照されたい。さらに、複合体分子は、 ヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドを含んでいるオリゴヌクレオチドの合成 前または後にヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドへ結合またはつなぐことが できる。 出願人はまた、標的への修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速 度の観測された増加量は、特に標的がオープンまたは折り畳まれていない構造を 持っている場合、またはヘルパープローブが存在する場合には連続した修飾ヌク レオチドの数を増加させても、必ずしも無限には増加しないことを予想外にも発 見した。そのような状況下では、オリゴヌクレオチド中に実質的に連続した配置 での（即ち、５つの連続したヌクレオチドの内の約４つ）修飾ヌクレオチドの配 置、続いての相補的標的へのハイブリダイゼーションは、与えられた数の修飾ま でのみ、ハイブリダイゼーション速度の増加を生じるであろう。この数を超えた クラスターへの修飾ヌクレオチドの追加は、一般的に、ハイブリダイゼーション 速度を実質的にさらには増加させないであろう。 ２’−Ｏ−メチル−置換ヌクレオチドを用いる現在のところ好適な修飾におい て、約８つの連続した修飾残基のクラスターを持つオリゴヌクレオチドで最適の ハイブリダイゼーション速度が得られている。発見が修飾オリゴヌクレオチドが ハイブリダイゼーション速度を増加させることができるということだとすれば、 この効果がそのような追加が寄与するＴ_mの増加とは必ずしも一致しないことは 予想外のことであった。即ち、速度−至適クラスターサイズを超えた修飾オリゴ ヌクレオチドの追加は引き続いてＴ_mを増加させるであろう。 出願人は理論に縛られるのを望んでいるわけではないが、そのようなクラスタ ーは、律速段階において、オリゴヌクレオチドまたは核酸が水素結合する最初の 領域である”核形成中心”として機能し、続いて残りの塩基の急速な水素結合が 起こることが信じられている。全オリゴヌクレオチドまたは核酸がそのように修 飾されているとしても、最適クラスターサイズを実質的に超えることによりハイ ブリダイゼーション速度を増加させる利点はほとんど得られないようである。 しかしながら、標的の構造が天然には閉じているまたは折り畳まれている場合 、およびヘルパープローブが含まれていない場合、オリゴヌクレオチドおよび標 的間のハイブリダイゼーション速度は一般的に、修飾ヌクレオチドをオリゴヌク レオチドに約４つの連続したヌクレオチドを超えて加えることにより改良される ようである。好適な態様において、構造的に閉じた標的に相補的なオリゴヌクレ オチド中のヌクレオチドの実質的にすべてが修飾されているであろう。 ２つの相補的一本鎖核酸の溶液中ハイブリダイゼーション速度は、核酸の濃度 、ハイブリダイゼーション温度および溶媒溶液の性質（塩濃度のような）のよう な種々の因子に依存している。種々の方法論がハイブリダイゼーション速度を増 加させるために用いられてきたが、それらの大多数は混和しない溶液の乳濁液を 形成させることによる；核酸沈殿剤（例えば、Ｋｏｈｎｅら、米国特許第５，１ ３２，２０７号）または体積排除剤（ポリエチレングリコールのような）を用い ることによる；または核酸鎖濃度を増加させることによるように溶液系を変化さ せ ることを含んでいる。 診断アッセイにおいて後者の方法に付随する問題は、標的核酸が通常非常に少 量しか存在しないことである。従って、核酸濃度を増加させるためには過剰のオ リゴヌクレオチドの使用を必要とし、費用および試薬廃棄物が増加し、およびも しオリゴヌクレオチドが標識されているならば受容できないほどの高いバックグ ラウンドの危険性が生じる。多数の溶媒および試薬（ポリエチレングリコールの ような）の使用を必要とするような他の方法には、過度の試料操作および時間の ような実施上の困難が存在するであろう。 それ故、本発明の一つの側面は、リボフラノシル環の２位に置換を持つヌクレ オチドを含むオリゴヌクレオチド（”２’−修飾オリゴヌクレオチド”、好適に はアルコキシ置換、最も好適にはメトキシ置換）を用いることによるＲＮＡ標的 に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度並びに結合親和性を 増加させるための手段を提供する。これらの特性は、ハイブリダイズする核酸濃 度の同時の増加、ハイブリダイゼーション溶液の性質および組成の変化、Ｈｏｇ ａｎ ＆ Ｍｉｌｌｉｍａｎ、米国特許第５，０３０，５５７号に開示されてい る”ヘルパーオリゴヌクレオチド”の添加、またはハイブリダイゼーション温度 の増加を必要とせずにそのようなオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション の速度および程度を増加させることにより、診断ハイブリダイゼーションアッセ イ様式において、そのようなオリゴヌクレオチドを用いる方法を有用にしている 。米国特許第５，０３０，５５７号は本発明と共通の所有権を保持しており、本 明細書において援用される。それでもなお、本発明の方法は、核酸ハイブリダイ ゼーション速度の増加が都合がよいであろう方法において、一つまたはそれ以上 のこれらの他の方法を補うものとして使用されるであろう。 前に説明したように、本発明のこの側面の利点はＤＮＡよりもＲＮＡに優先し てハイブリダイズする２’−Ｏ−メチル修飾オリゴヌクレオチドの能力に関して いる。この特質はＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドの設計を可能にする。 プローブは、たとえＤＮＡ配列がＲＮＡ標的配列と同一であっても（ただし、Ｔ はＤＮＡ配列においてはＵで置換されている）、ストリンジェント条件下ではＤ ＮＡへ結合する傾向がないように作製できる。そのような特性は、ＲＮＡの特異 的検出が都合がよいであろう多くの異なった形式で使用できる。例えば、特定の ＲＮＡ種（例えば、特異的ｍＲＮＡ種）の転写速度の変化を示すおよび測定する ため、与えられた治療の有効性をモニターするため、ｔＲＮＡまたはｒＲＮＡを これらのＲＮＡ種をコードしている遺伝子に優先して特異的に探査するため、お よび大量の染色体ＤＮＡを含んでいる核酸調製試料中のＲＮＡウイルスを特異的 に検出するために（たとえＤＮＡ調製試料がウイルス配列のＤＮＡ版を含んでい ても）使用できる。 このおよびその他の側面のさらなる利点は、オリゴヌクレオチドがデオキシオ リゴヌクレオチドである標的：オリゴハイブリッドのＴ_mと比べて、２’−修飾 ヌクレオチドのような修飾オリゴヌクレオチドを用いた場合の増加した標的：オ リゴＴ_mである。”標的：オリゴ”とは水素結合した、一本鎖オリゴヌクレオチ ドから成る二本鎖核酸複合体を意味している。標的：オリゴ複合体の安定性はプ ローブ中に含まれている２’−修飾ヌクレオチド残基の数が増すにつれて増加す る。対照的に、ハイブリダイゼーション速度の増加は約８の２’−修飾ヌクレオ チド残基のクラスターを持っている核酸で最適であるようであり、この数以上の 連続的修飾オリゴヌクレオチド残基の追加によっても有意に増加しない。さらに 、少なくとも一つのそのようなクラスターを持っている”キメラ”オリゴヌクレ オチドが、標的に対して全体としてオリゴヌクレオチドのＴ_mを有意に増加させ る必要なしにより速いハイブリダイゼーション速度を持つように設計できた。 増加したＴ_mは核酸二重鎖の加えられた安定性が望まれる診断法に利用される であろう。例えば、より高いハイブリダイゼーション温度がハイブリダイゼーシ ョン速度を促進するために使用できる。より高いＴ_mはまた、これまで実際的で あったオリゴヌクレオチドより実質的に短いオリゴヌクレオチドの使用を可能に し、従ってハイブリダイゼーション並びに前記の他の利点のためのオリゴヌクレ オチド産生に付随する費用を節約することができる。 本発明の他の側面および実施態様において、キメラオリゴヌクレオチドは、標 的核酸に結合するように設計された修飾部分を含んでいてもよく、およびまた固 相−結合オリゴヌクレオチドへ直接または間接的に結合できるデオキシヌクレオ チド部分も含んでいてもよい。例示のためであるが（制限するためではない）、 そのようなオリゴヌクレオチドとは標的核酸に結合するように設計された（例え ば、溶液中で）標的捕捉オリゴヌクレオチドであり、結合した標的核酸を、ビー ズ、マイクスフェアー、アガロースまたはデキストランのようなポリマー性物質 または磁化粒子のような誘導体化固相マトリックスへ連結する。そのようなマト リックスに連結されている誘導体には抗生物質、リガンドまたは捕捉オリゴヌク レオチドまたは中間体オリゴヌクレオチドを結合するように設計されたホモポリ マー管のような特異的ヌクレオチド配列を持つ全体的にまたは部分的に一本鎖の オリゴヌクレオチドが含まれる。結合された標的は次にさらにプローブ（ＲＮＡ 、ＤＮＡまたは修飾）とハイブリダイズでき、標的核酸の存在を検出する前に固 定化標的：プローブ複合体から非結合プローブを洗い流す。 ある種の例においては修飾オリゴヌクレオチドをその標的へハイブリダイズさ せるために温度を上げることが都合がよい。前に説明したように、ハイブリダイ ゼーション温度が所望のハイブリッドのＴ_mよりも十分に低い限り、ハイブリダ イゼーション温度を上げるにつれて、ハイブリダイゼーション速度も増加する。 その非修飾相対物よりも高いＴ_mを持っている修飾オリゴヌクレオチドを用いる 本明細書で特許請求されたハイブリダイゼーション法は非修飾相対物を使用する よりも高い温度で実施できる。そのような場合、修飾物単独に付随する速度増加 は、温度を上げることによりさらに増加される。 以下は本発明の態様の実施例であり、それらに本発明の範囲を制限するものと 理解してはならない。当業者は容易に本明細書に含まれている開示に基づいて追 加の態様を理解するであろう。追加の態様もまた本明細書で結論づける請求の範 囲内に含まれている。修飾核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブ 核酸ハイブリダイゼーションアッセイは検出が考えられている核酸を標的とす る（即ち、実質的に相補的なヌクレオチド塩基配列を持っている）一つまたはそ れ以上の核酸プローブを利用する。しばしば、プローブは、与えられたヌクレオ チド配列を持つように合成的に作製されたオリゴヌクレオチド（約１０から約１ ００ヌクレオチドの間の長さを持つ一本鎖核酸）から成っているであろう。”実 質的に相補的”とは、オリゴが適当な選択的条件下でその標的に結合し、水素結 合した二重鎖を形成することを意味している。 ハイブリダイゼーションアッセイプローブは一般的には検出可能な標識に連結 されるであろうが、プローブは非標識にでき、プローブ：標的ハイブリッドを例 えば、ＵＶ吸光度、ＨＰＬＣクロマトグラフィー、ゲル電気泳動および続いての 核酸ハイブリッドの染色または本分野でよく知られている他の方法により検出で きる。ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、プローブおよび標的は、安定 で特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件下でお互いに接触させる。 生じたハイブリッドは次に非標識ハイブリッドから分離して標識を検出するか、 または、非標識プローブの存在下でハイブリッドの検出を可能にする条件下、標 識が検出できる。 ゲル排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよびハイドロキシア パタイト吸着のような核酸を分離する方法は本分野では既知である。標識ハイブ リッドおよび標識非ハイブリダイズプローブが二重らせん形成のおかげで化学的 に識別できるアッセイ形式が推薦される。特に好適なアッセイ形式はハイブリダ イゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）（Ａｒｎｏｌｄらによる米国特許第５，２ ８３，１７４号を参照されたい）であり、標識非ハイブリダイズプローブは選択 的に検出不可能にでき、一方、ハイブリダイズプローブは相対的に影響を受けな い。従って、この形式における標識の検出は、標識ハイブリッドの指標である。 これらの態様において、本発明はハイブリダイゼーションアッセイにおけるプ ローブとしての修飾オリゴヌクレオチドの使用を含んでいる。一つの実施態様に おいて、同一塩基配列の非修飾オリゴヌクレオチドよりも高い標的特異的Ｔ_mを 持っている修飾オリゴヌクレオチドが、同一塩基配列の非修飾オリゴヌクレオチ ドを用いたアッセイと比較して、アッセイのハイブリダイゼーション速度を増加 させるために使用された。そのようなアッセイ法は、非修飾オリゴヌクレオチド を用いた場合に実行可能であるよりも高いハイブリダイゼーション温度を利用で きる。より高いハイブリダイゼーション温度はさらにハイブリダイゼーション速 度を増加でき、および交差ハイブリダイゼーション（プローブと非標的配列との ハイブリダイゼーション）の量を減少させることができ、それによりアッセイの 特 異性が増加する。 本発明のプローブは、非修飾残基と混合された、約４またはそれ以上の実質的 に連続した修飾ヌクレオチド残基のクラスターから成っているであろう。もしく は、プローブは１００％の修飾残基を含んでいてもよい。好適な実施態様におい て、修飾はリボフラノシルヌクレオチド部分の２’炭素へのアルキル、アルコキ シおよびハライド置換のような２’置換である。特に好適な実施態様において、 置換はメトキシ基である。 ２’−Ｏ−メチル置換を含む特定のプローブ修飾は、ＲＮＡ標的に対して増加 した親和性および増加したハイブリダイゼーション速度を持つが、ＤＮＡ親和性 またはプローブ：ＤＮＡハイブリッド形成の速度にはほとんど影響を与えないオ リゴヌクレオチドを生じさせる。再び、このＲＮＡに対する優先性は、オリゴヌ クレオチドが少なくとも一つの約４から約８の修飾塩基から成るクラスターを持 っている場合に最適であることが観察された。 本明細書で説明したように、修飾されたオリゴヌクレオチドは劇的に増加した ハイブリダイゼーション速度を持っているので、そのような修飾オリゴヌクレオ チドプローブは、標的に対するプローブのハイブリダイゼーション速度を増加さ せる手段としての非標識”ヘルパープローブ”（Ｈｏｇａｎ、上記文献に記載さ れている）を添加する必要なく多くの場合に使用される。しかしながら、いくつ かの場合にはそのような修飾オリゴヌクレオチドおよびヘルパープローブを併せ て使用すると、協力して作用しハイブリダイゼーション速度をさらに速くするこ とが観察された。どちらの場合でも、診断法におけるそのような修飾オリゴヌク レオチドの使用は生物学的被検体のより迅速な同定を導き、順に、例えば、その ような被検体により起こされるまたは示される疾患状態のより有効な処置を導く 。 以下により詳しく説明するように、ＲＮＡ標的に対して優先的親和性を示して いるプローブは同一の配列のＤＮＡよりもＲＮＡ（ただし、ＲＮＡ配列において ＵはＴに置換されている）を特異的に検出するために使用されうることを出願人 は見出した。そのような方法は、例えば、ウイルスゲノムのＤＮＡ版を含んでい る細胞中でのＲＮＡウイルスの特異的検出、または細胞中のＲＮＡ転写レベルの 検出に応用される。 プローブはまた、標的相補的配列並びに追加の標的非相補的配列の両方を含む ようにも考案された。これらの標的非相補的配列は別の機能を持っている。例え ば、この配列は別のオリゴヌクレオチドまたは標的核酸に相補的でありうるし、 またはプロモーター配列および制限部位のような機能的特性を持っていてもよい 。従って、プローブは一つより多い機能を持っていてもよく、そのただ一つが標 的存在の指標として検出されるべきものである。 さらに、標的核酸にハイブリダイズできる少なくとも二つの別々の標的−相補 的配列を持つ少なくとも一つの核酸鎖を持つようにプローブを設計してもよい。 そのようなプローブの例はＨｏｇａｎらによる、米国特許第５，４２４，４１３ および５，４５１，５０３号（これらは本出願と共通した所有権を保持しており 、特に本明細書において援用される）に記載されている。Ｈｏｇａｎらにより開 示されたプローブはさらに、標的とはハイブリダイズしないが、お互いにハイブ リダイズ可能な相補的領域を持つ少なくとも二つの異なったアーム領域を含んで いる。これらのアーム領域は、適したハイブリダイゼーション条件下、それらの 相補的配列がハイブリダイズするために標的の存在を必要にするように設計でき る。従って、プローブの標的相補的配列は相補的アーム領域がお互いにハイブリ ダイズできる前に標的へハイブリダイズしなければならない。生じた構造は分岐 核酸と称されている。 標的に特異的に結合できない他のプローブが設計されるであろう。標的の検出 に有用であるためには、これらのプローブは標的を（直接または間接的に）結合 できる別の核酸とハイブリダイズできなければならない。一つのそのような配置 において、核酸は少なくとも第一のおよび第二の重なり合わないヌクレオチド塩 基配列領域を含むように構築でき、ここで第一のヌクレオチド領域は標的のヌク レオチド塩基配列と相補的であり、および第二のヌクレオチド領域はプローブの ヌクレオチド塩基配列と相補的である。この配置において、核酸の第二のヌクレ オチド領域は、核酸の第一のヌクレオチド領域に標的がハイブリダイズするまで は、プローブとの結合には利用できないであろう。核酸および標的の結合は核酸 のコンフィグレーションを変化させ、核酸の第二のヌクレオチド領域がプローブ と結合するのを可能にする。図２を参照されたい。もちろん、この配置は核酸お よび標的間が間接結合するように修飾でき、一つまたはそれ以上の介在または結 合核酸により達成でき、核酸の第二のヌクレオチド領域をプローブとの結合に利 用可能にするであろう。修飾核酸増幅オリゴヌクレオチド さらに別の態様において、本発明は核酸増幅のために修飾オリゴヌクレオチド プライマー、プロモーター−プライマーおよび／またはスプライス鋳型を用いる 方法、およびそのようなオリゴヌクレオチドから成る組成物を含んでおり、ここ でオリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション速度の増加を起こす少なくとも 一つの修飾塩基のクラスターを含んでいる。 プライマーを用いる増幅法にはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）およびその 変法が含まれる（米国特許第４，６８３，１９５、４，６８３，２０２および４ ，８００，１５９号、欧州特許出願第８６３０２２９８．４、８６３０２２９９ ．２および８７３００２０３．４号および１５５ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ ｚｙｍｏｌｏｇｙ 、３３５−３５０（１９８７）を参照されたい）。ＰＣＲ方法 論は当業者には現在では普通の知識である。 ＰＣＲ反応で使用されるプライマーの一つ内へプロモーター配列を取り込むこ とによりＰＣＲをＲＮＡ転写と結合させ、ＰＣＲ法により増幅後、一本鎖ＲＮＡ の転写のための鋳型として二本鎖ＤＮＡを使用する（例えば、Ｍｕｒａｋａｗａ ら、ＤＮＡ、７：２８７−２９５（１９８８）を参照されたい）。 他の増幅法はＲＮＡ−指向性ＤＮＡ合成およびＤＮＡまたはＲＮＡ標的を増幅 するための転写の多数回サイクルを使用する。例えば、Ｂｕｒｇら、米国特許第 ５，４３７，９９０；８９／１０５０号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＷＯ８８／１０ ３１５号ＤａｖｅｙおよびＭａｌｅｋ，ＥＰＯ公開第０ ３２９ ８２２号；Ｍ ａｌｅｋら、ＷＯ９１／０２８１８号；ＫａｃｉａｎおよびＦｕｌｔｚ、米国特 許第５，４８０，７８３号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、ＷＯ９４／０３４７２号； およびＫａｃｉａｎら、ＷＯ９３／２２４６１号（これらの特許の後ろの三つは 本出願と共通の所有権を保持しており、本明細書で援用される）を参照されたい 。Ｕｒｄｅａら、ＷＯ９１／１０７４６号はＴ７プロモーター配列を用いて信号 増 幅を達成する方法を記載している。 これらの方法の各々は与えられた問題とするヌクレオチド配列にハイブリダイ ズまたは接近できる一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーまたは スプライス鋳型を使用している。プライマーのハイブリダイゼーション後、標的 −相補的核酸鎖は、プロモーター−プライマーまたはプライス鋳型を用いるプラ イマーの３’末端伸長または転写により、酵素的に合成された。ＰＣＲのような いくつかの増幅法において核酸ポリマー化酵素によるプライマー伸長のラウンド は相補的核酸鎖の熱変性により変化させた。Ｋａｃｉａｎ ＆ Ｆｕｌｔｚ（上 記文献）、ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら（上記文献）、Ｋａｃｉａｎら（上記文献）の 方法のような他の方法は等温転写に基づいた増幅法である。 しかしながら、各々の増幅法において、プライマーの非標的配列へのハイブリ ダイゼーションにより起こされる副反応は、標的−特異的反応の感度を減少させ るであろう。これらの競合する”ミスマッチ”は温度を上げることにより減少す るであろう。しかしながら、温度を上げることはまた同様に標的−特異的プライ マー結合の量を減少させるであろう。 従って、本発明のこの態様に従うと、高い標的親和性を持ち、および標的結合 領域に修飾ヌクレオチドを含むプライマーは、上昇させた温度、および従って標 的分子へのハイブリダイゼーションの増加した速度のおかげで、一方、非特異的 プライマー結合により競合する副反応（交差反応性）の程度を減少させたので、 より感度よく検出するおよび少量の標的核酸配列を増幅する核酸増幅法で使用さ れる。好適なオリゴヌクレオチドは少なくとも一つの修飾塩基のクラスターを含 んでいるが、好適なオリゴヌクレオチドにおいてはほとんどすべてのヌクレオチ ドが修飾されている。 別の好適な態様において、修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸が ＲＮＡである核酸増幅反応に使用される。ＫａｃｉａｎおよびＦｕｌｔｚ（上記 文献）を参照されたい。標的は試料中に最初に存在している核酸、または核酸増 幅反応の中間体であってよい。この実施態様においては、２’−Ｏ−メチルヌク レオチドを含んでいるオリゴヌクレオチドのような好適な２’−修飾プライマー の使用は、同一配列のデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、ハイブリッドに 与えられた相対的に高いＴ_mのため、より高いハイブリダイゼーション温度での それらの使用を可能にしている。また、そのような２’−修飾オリゴヌクレオチ ドのＤＮＡよりもＲＮＡに対する優先性のため、試験試料中の非標的ＤＮＡ配列 によるプライマー分子に対する競合もまた減少しているであろう。さらに、同一 （ＵおよびＴが等価であると仮定すると）核酸配列を持つＤＮＡ分子集団の真ん 中にある特異的ＲＮＡ配列が検出されるべきと試みられている応用において、Ｒ ＮＡに対して動力学的および平衡優先性を持っている修飾オリゴヌクレオチドプ ライマーの使用は、試料中のＤＮＡの存在を克服してＲＮＡの特異的増幅を可能 にする。試料加工 本発明により、非修飾類似体と比較して増加した標的特異的ハイブリダイゼー ション動力学および結合親和性を持っている修飾オリゴヌクレオチドは種々のハ イブリダイゼーションアッセイ試料加工方法論において使用されうるであろう。 試料加工（ｓａｍｐｌｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）とは被検体および非−被検 体核酸の識別を可能にするまたは促進する方法を意味している。そのような方法 には、例えば、不均一アッセイにおける液相からの核酸またはオリゴヌクレオチ ドの直接的または間接的固定が含まれる。そのような方法のいくつかでは、その ような固定を生じるには２回またはそれ以上のハイブリダイゼーションが含まれ ているであろう。 例えば、Ｒａｎｋｉら、米国特許第４，４８６，５３９および４，５６３，４ １９号、は標的相補的配列を持つ固相結合核酸および標的核酸の離れた場所に相 補的な標識核酸プローブの使用を含む一工程核酸”サンドイッチ”ハイブリダイ ゼーション法を議論している。Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ、米国特許第４，７５１，１ ７７号は、固体支持体からの固定化オリゴヌクレオチドの漏出に付随するＲａｎ ｋｉ法の感度の問題を克服したと伝えている”仲介物（ｍｅｄｉａｔｏｒ）”ポ リヌクレオチドの使用を含んだ方法を議論している。 他の方法は固定化オリゴヌクレオチド、例えば、ポリＴまたは単純な短い反復 配列のようなホモポリマー管を含んでいるオリゴヌクレオチド、二つまたはそれ 以上の結合オリゴヌクレオチド（その一つは固定化オリゴヌクレオチドへハイブ リダイズでき、その異なった一つは標的に特異的にハイブリダイズできる）を用 いている。各々の結合オリゴヌクレオチドは少なくとも一つの他の結合オリゴヌ クレオチドに結合できる。もし、結合オリゴヌクレオチドが標的または固定化オ リゴヌクレオチドと相補的である配列を含んでいないとすれば、少なくとも二つ の他の結合オリゴヌクレオチドに同時にハイブリダイズできる。固体支持体は、 ニトロセルロース、ポリアクリルアミドまたはデキストランのようなポリマー性 物質、金属製物質または制御孔ガラスを含む物質から成っているであろう。支持 体はシート、膜または粒子のような形で存在していてもよい。更に、固相支持体 は、試料の回収および／または未結合の核酸もしくは他の試料成分の洗浄を容易 にするために、磁気を帯びていても良い。 固定されたオリゴヌクレオチドの固相支持体への結合は、アッセイ段階の間中 、固定されたオリゴヌクレオチドを結合し続けるような方法のいずれを使用して 行ってもよい。更に、固相支持体をアッセイに使用すべき場合、アッセイ条件下 では、非標的オリゴヌクレオチドもしくは核酸の非特異的結合または吸収が本質 的になされないことは重要である。 一般的な固定化法には、核酸またはオリゴヌクレオチドのニトロセルロース、 誘導体化されたセルロースまたはナイロン、および同種の物質への結合がある。 これらの物質のうち後者二つは固定されたオリゴヌクレオチドと共有結合性相互 作用を生成し、前者は疎水的相互作用を介してオリゴ（oligo）と結合する。こ れらの物質を使用する場合、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなタンパク質 を含有するような“遮断”溶液、またはサケ精子ＤＮＡのような“キャリアー” 核酸を使用して、アッセイに使用する前に固相支持体上の残存する結合可能部位 をふさぐことが重要である。 他の固定化法では、例えばＮ−ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）およびそ の誘導体のようなリンカーアームを使用してオリゴヌクレオチドを固相支持体に 結合してもよい。そのような方法における一般的な固相支持体はシリカ、ポリア クリルアミド誘導体、および金属物質であるが、それらに限定されるものではな い。そのような方法においては、リンカーの一方の末端は固相支持体と共有結合 する反応基（アミド基のような）を含有してもよく、一方、リンカーの他の末端 はオリゴヌクレオチドと結合して固定化できるような別の反応基を含有してもよ い。特に好ましい態様では、オリゴヌクレオチドはその３’末端でリンカーと結 合する。好ましくはリンカーは実質的に、固相支持体の表面からある程度離れた 位置に固定されたオリゴヌクレオチドを配置する直鎖の炭化水素である。しかし ながら、キレート化または抗原−抗体複合体のような非共有結合を使用して、固 相支持体にオリゴヌクレオチドを結合してもよい。 後者のアッセイ系の好ましい態様は、二つのカップリングオリゴヌクレオチド を含む：（ｉ）例えば固定されたオリゴ上のポリＴ配列に相補的なポリＡヌクレ オチド配列を有する、固定されたオリゴヌクレオチドに十分相補的であるヌクレ オチド配列を含有する第一のカップリングオリゴヌクレオチド、および（ii）標 的核酸、検出可能な標識されたプローブ、またはその両方に十分相補的なヌクレ オチド配列を含有する第二のカップリングオリゴヌクレオチド。好ましい態様で は、第二のカップリングオリゴヌクレオチドは標的核酸に十分相補的なヌクレオ チド配列を含有する。更に、好ましい態様においてそれぞれのカップリングオリ ゴヌクレオチドは、アッセイ条件下で第一および第二のカップリングオリゴヌク レオチドが互いにハイブリダイズできるような別のヌクレオチド配列を含有する 。しかしながら、一個またはそれ以上の更なるカップリングオリゴヌクレオチド を系に導入し、これらの更なる介在型カップリングオリゴヌクレオチドによって 第一および第二のカップリングオリゴヌクレオチドを間接的に結合させてもよい 。更なるカップリングオリゴヌクレオチドは、アッセイ条件下で、標的核酸、検 出可能な標識オリゴヌクレオチドプローブ、または固定されたオリゴヌクレオチ ドのいずれとも実質上ハイブリダイズできないものである。 使用が容易かつ迅速であるという実用的な利点を有する更に別のアッセイ系は 、捕獲オリゴヌクレオチドに相補的な部分を有する固定されたオリゴヌクレオチ ドを含有してもよい。捕獲オリゴヌクレオチド（捕獲プローブ）は標的とハイブ リダイズできる塩基配列を含有する。また捕獲オリゴヌクレオチドは、標的が結 合するヌクレオチド配列領域内、またはその近傍に結合する、置換された、また は置換されていないアクリジニウムエステルのような標識を有し、これを均一ま た は準均一アッセイ系に使用して、捕獲プローブそのもののような一本鎖の核酸を 検出することなくハイブリッド核酸を特異的に検出してもよい。出願人が好まし いと考える系はＨＰＡ^TMであり、これは上記で検討し、参照により組み込まれる 。ＨＰＡ^TM形式では、標的とハイブリダイズしていない捕獲プローブ上に含有さ れる標識は塩基を添加して加水分解し、一方、標的：捕獲プローブハイブリッド はこれと結合する標識を加水分解から保護する。 この後者のアッセイ系に対する利点は、標的を検出するために、ここに記載す る他の試料処理法におけるような二つの標的特異的ハイブリダイゼーションの事 象（捕獲プローブ：標的、および標識されたプローブ：標的）ではなく、一つの そのような事象（標識された捕獲プローブ：標的）しか必要でないことである。 標識された標的が捕獲される全速度は最も遅くハイブリダイズするプローブによ って制限されるので、アッセイにおけるオリゴヌクレオチドが少ないほどアッセ イは迅速かつ単純となり、最も効果的となる。更に、これらの他のアッセイ系に おいて、捕獲オリゴヌクレオチドに相補的な標的の部分は標的のプローブ結合領 域ほど特異的である必要はない一方、この塩基配列は、捕獲プローブが非標的核 酸で有意に飽和することを防止するのに十分なだけ稀なものでなければならない 。従って、二つの独立した特異的な標的の配列の選択により、そのようなアッセ イが向けられるべき適当な標的を見出す上で制約を受けうる。対照的に、後者の アッセイでは、同一のヌクレオチド配列が標的核酸の固定化および検出に同時に 機能するので、そのような標的配列を一つしか必要としない。 使用するアプローチにかかわらず、アッセイに必要とされる要素は所望の標的 の検出方法である。当業者に知られる多くの選択肢が可能である。そのような選 択肢の一つは標識された核酸プローブを直接使用することである。そのようなプ ローブは、興味のある標的核酸と特異的にハイブリダイズでき、かつ十分相補的 であるヌクレオチド配列領域を有する。標的へのハイブリダイゼーションおよび 標的：プローブハイブリッドの固定化と同時に、結合していないプローブを洗浄 または不活性化し、残存する標識ハイブリッド結合体を検出および／または測定 することができる。 別の選択肢は、検出および核酸増幅の要素を合わせ持つ。そのような系では、 例えば（それに限定されるものではないが）上記のアッセイ法において、標的核 酸を記載したように固定化する。標的核酸の特定の領域とハイブリダイズできる 、プライマー、プロモーター−プライマー、またはスプライス鋳型のような、一 個またはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド（例えばKacianら，国際特許公開WO 93/22461号を参照すること）を、核酸増幅の条件下で（例えば一個またはそれ以 上の核酸ポリメラーゼ、およびリボおよび／またはデオキシリボヌクレオチド三 リン酸の存在下で）固定された標的核酸と接触させてもよい。 生成するポリヌクレオチド鎖（増幅子（amplicon））は、標識されたハイブリ ダイゼーションアッセイプローブと特異的にハイブリダイゼーションさせて検出 するか、または核酸増幅の条件下でポリヌクレオチド鎖を一個またはそれ以上の 更なる増幅オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせて更に増幅するために、直 接利用できるようにすることができる。後者の選択肢を選ぶ場合、所望の水準の 増幅が達成されるまで増幅反応を継続することができ、その後、固定された標的 核酸の少なくとも一部、固定された核酸の少なくとも一部に相補的なポリヌクレ オチド、またはその両方のコピーを含有しうる生成した増幅子を、一個またはそ れ以上の標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出することができ る。標的を固定化する間に増幅反応が行われる場合、増幅子の鋳型として使用す べき標的分子の部分が、標的核酸の固定化に必要なヌクレオチド配列領域を含有 しないことが重要である。いずれかまたは両方のセンスの増幅子を標識されたプ ローブで検出することができるが、好ましい態様では、固定された標的に対して 逆のセンスの、すなわち相補的な増幅子のみを検出する。 臨床粗試料は増幅反応を阻害または干渉する物質を含有しうるので、このよう な不均一系の標的捕獲法は特に有用である。従って、標的核酸をそのような干渉 物質から分離することにより、核酸増幅を可能にするか、またはその感度を向上 することができる。 この固相結合型増幅機構を、上記のものを含む多くのアッセイ系に使用するこ とができる。現在のところ出願人は、標的核酸を固相支持体に間接的に結合する ことができる、上記のような一個またはそれ以上のカップリングオリゴヌクレオ チドを使用するアッセイ系が好ましいと考える。また、固相に結合するオリゴヌ クレオチドの相補的なヌクレオチド配列領域、およびそれにハイブリダイズする ように設計された捕獲オリゴヌクレオチドが少なくとも部分的にホモポリマーで あるか、または単純な繰返しヌクレオチド配列を含有することによって、迅速な ハイブリダイゼーションを促進することも好ましい。更に、または、そのかわり に、固定されたオリゴヌクレオチドおよび捕獲オリゴヌクレオチドのいずれか、 またはその両方のこれらの領域を、本明細書に一致する方法で修飾し、これらの オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーション速度を増加させてもよい。その ような系では、固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする前に、標的 捕獲オリゴヌクレオチドおよび標的核酸を溶液中でハイブリダイズさせるのが好 ましい。現時点での好ましい態様では、固定された標的を洗浄し、核酸増幅条件 下で増幅オリゴヌクレオチド（単数または複数）を固定された標的と接触させ、 そして増幅に次いで標識された増幅子指向性（amplicon-directed）プローブを 添加および検出する。 出願人は、すでに参照により組み込まれたKacian & Fultz（上記）に記載され る転写に基づく増幅法を使用するのが好ましいと考える。この方法に従って、標 的の一部および５’領域に相補的な３’領域を有するプロモーター−プライマー 、および標的の一部と同一のヌクレオチド配列を有するプライマーを標的ＲＮＡ 分子と接触させる。プライマーおよびプロモーター−プライマーにより、標的分 子およびその相補体に存在するセンスの両方を含む、増幅されるべき標的領域の 境界が定められ、従って増幅子の長さと配列が定められる。この好ましい態様で は、増幅オリゴヌクレオチドおよび固定された標的ＲＮＡを、有効量のモロニー マウス白血病ウィルス由来の逆転写酵素およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼの存在下 で、リボヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチド三リン酸、そして必要な塩お よび補助因子と４２℃で接触させる。これらの条件下で、核酸が増幅され、標的 核酸と逆のセンスのＲＮＡ増幅子が主に生成される。その後、例えば標的核酸と 同じセンスのアクリジニウムエステルで標識したハイブリダイゼーションアッセ イプローブを使用して、すでに参照により組み込まれたArnold（上記）に開示さ れるハイブリダイゼーション保護アッセイでこれらの増幅子を検出する。 この好ましい態様では、出願人は、固定されたオリゴヌクレオチドの３’末端 、 標的捕獲オリゴヌクレオチド、およびカップリングオリゴヌクレオチドを“キャ ッピング”または遮断して、それらが核酸ポリメラーゼ活性の鋳型として使用さ れるのを防止または阻害するのが好ましいと考える。キャッピングは、３’デオ キシリボヌクレオチド（コルジセピンのような）、３’，２’−ジデオキシヌク レオチド残基、Arnoldら（上記）に開示されるような非ヌクレオチドリンカー、 アルカン−ジオール修飾、または非相補ヌクレオチド残基の３’末端への添加を 伴ってもよい。 出願人は現在のところ、プライマーを標的に接触させた後に標的を固定化する のが好ましいと考えるが、標的捕獲オリゴヌクレオチドを添加すると同時に標的 核酸およびそれに相補的な少なくとも一個のプライマーを合一すれば、ハイブリ ダイゼーション速度に利点がありうる。出願人は、核酸が固定されている場合に 比較して溶液中の方がより迅速にハイブリダイゼーションを行うことができるの で、標的の固定化の前に溶液中で標的のハイブリダイゼーションを行うのが有利 であると考える。 更に、出願人は、標的と逆のセンスの増幅子を生成および検出するのが好まし いと考えるが、どちらか、または両方のセンスの増幅子を生成および検出しては いけないという理由はない。更に、臨床粗試料中に含有される標的核酸を増幅す る場合、試料中に存在する物質による酵素の阻害および／または核酸の分解を防 止するために、増幅段階に先立って洗浄段階を実施することが重要と考えられる 。 この方法論が、記載したように、または明らかな修飾を伴って、ポリメラーゼ 連鎖反応を含む種々の他の増幅機構に従うことは、当業者に明白であろう。試料処理（ｓａｍｐｌｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）における修飾型オリゴヌクレ オチド 相補的な標的に増加された速度でハイブリダイズすることができる修飾型オリ ゴヌクレオチドを、上記の標的捕獲法を含む核酸ハイブリダイゼーションを使用 する試料処理法に使用してもよい。本明細書の観点から、そのような部分的に、 または完全に修飾されたオリゴヌクレオチドを、これらの系においてハイブリダ イゼーションアッセイプローブまたは増幅オリゴヌクレオチドとして使用しても よいことは明白である。更に、核酸ハイブリダイゼーションを使用する不均一系 アッセイにおいて、標的へのハイブリダイゼーション速度が増加された完全また は部分的修飾型オリゴヌクレオチドを固定されたオリゴヌクレオチド、標的捕獲 オリゴヌクレオチド、そして／または一個またはそれ以上のカップリングオリゴ ヌクレオチドとして使用してもよい。例えばそのような修飾を使用して全アッセ イ時間を短縮するか、またはアッセイのハイブリダイゼーション段階を単一の温 度で行ってもよい。それによって得られる臨床上でのアッセイの時間短縮および 操作の簡便さの利点は当業者に明白であろう。 更に、ＲＮＡまたはＤＮＡのような特定の型の核酸に好適なハイブリダイゼー ション速度および／または平衡を有するようにオリゴヌクレオチドを修飾しても よい。上に開示したように、例えば、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドはＤ ＮＡよりＲＮＡと優先的にハイブリダイズする。従って、２’−Ｏ−メチルヌク レオチドを含有する標的捕獲オリゴヌクレオチドを使用して、オリゴヌクレオチ ドがそのゲノム型にハイブリダイズするのを促進しない条件下で、ｍＲＮＡまた はｒＲＮＡのようなＲＮＡ標的核酸を特異的に捕獲してもよい。更に、２’−Ｏ −メチル修飾型増幅オリゴヌクレオチドおよび／または標識されたプローブを設 計し、それによってＤＮＡよりＲＮＡを上記のような増幅および／または検出の 標的にすることができる。修飾型ヘルパーオリゴヌクレオチド ヘルパーオリゴヌクレオチドはHogan（上記）に記載されている。一般にヘル パーオリゴヌクレオチドは標識されておらず、標識されたハイブリダイゼーショ ンアッセイプローブと共に使用して、二次構造に関係しうる標的ヌクレオチド配 列領域を「開裂（opening up）」し、その結果それらの領域が標識されたプロー ブとハイブリダイゼーションできるようにすることにより、標識されたプローブ のＴｍおよびハイブリダイゼーション速度を増加する。 本明細書の観点から、それに対応する非修飾型のものより速い速度で標的核酸 とハイブリダイズするように修飾されたヘルパーオリゴヌクレオチドの使用によ り、その標的への標識されたプローブのハイブリダイゼーション速度を更に増加 することができることは、当業者に容易に認識される。従って、そのような修飾 型ヘルパーオリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチドの検出のための方 法および組成物は、本発明の範囲に含まれるものである。好ましいヘルパーオリ ゴヌクレオチドは、ＤＮＡよりＲＮＡとより強く結合するような修飾を有する。 好ましい態様では、そのような修飾は少なくとも約４個の２’−Ｏ−メチルヌク レオチドのクラスターを含有する。特に好ましい態様では、そのような修飾は約 ８個の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのクラスターを含有する。診断キット ここに記載される方法はまた、明らかに、そのような方法に使用するために特 別に処方された診断キットを示唆する。これらのキットは、診断用の核酸ハイブ リダイゼーションアッセイに使用されるべきオリゴヌクレオチドを一個またはそ れ以上含有する。これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも一個は、他の点は同 一であるオリゴヌクレオチドより速い速度で標的核酸領域にハイブリダイズする ように設計された、少なくとも約４個の修飾型ヌクレオチドのクラスターを含有 する。 そのような診断キットは、ここに記載されるプローブ、増幅、ヘルパー、およ び試料処理オリゴヌクレオチドを一つまたはいずれの組合せで含有してもよいが 、それらに限定されるものではない。 本発明の好ましい態様では、キットは、少なくとも約４個の隣接する２’−修 飾型ヌクレオチド残基のクラスターを一個またはそれ以上含有する領域を有する 標識されたオリゴヌクレオチドプローブを少なくとも一個含有する。更に好まし い態様では、領域は約８個の２’−修飾型ヌクレオチドのクラスターを一個また はそれ以上含有する。 出願人は現在のところ、非放射性標識としてアクリジニウムエステル誘導体を 使用し、そして２’の修飾としてメトキシ基を添加するのが好ましいと考える。 特に好ましい態様では、少なくとも一個の修飾型オリゴヌクレオチドは、少なく とも約４個の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのクラスターを一個またはそれ以上 含有する。更に好ましくは、少なくとも一個のオリゴヌクレオチドは約８個の２ ’−Ｏ−メチルヌクレオチドのクラスターを一個またはそれ以上含有する。 ここに開示される修飾型オリゴヌクレオチドを一個またはそれ以上含有するキ ットを、本発明の診断用ハイブリダイゼーションアッセイ法のいずれか、または 関連する増幅法に使用するために販売できるかもしれない。そのようなアッセイ では、キットに含有される修飾型オリゴヌクレオチドの少なくとも一個は、標的 核酸とハイブリダイズすることができるプローブとして機能する。修飾型プロー ブが標的核酸を含有する試料と接触すると、プローブは、同一の塩基配列を有す る非修飾型プローブより向上されたハイブリダイゼーションの特性を表す。例え ば、同一のハイブリダイゼーションアッセイ条件下では、標的およびプローブ間 のハイブリダイゼーションの結合の親和性は、標的および非修飾型プローブ間の ハイブリダイゼーションの結合の親和性より大きいであろう。更に、同一のハイ ブリダイゼーションアッセイ条件下では、標的およびプローブ間のハイブリダイ ゼーション速度は、標的および非修飾型プローブ間のハイブリダイゼーション速 度より速い。 プローブのハイブリダイゼーションの特性を更に向上するために、一個または それ以上の共役分子が、好ましくは、少なくとも約４個の修飾型ヌクレオチドの クラスターを含有する領域で、プローブに結合してもよい。また、本発明の診断 用ハイブリダイゼーションアッセイにおいて一個またはそれ以上の修飾型オリゴ ヌクレオチドを使用するための説明書をキットに同封することも考えられる。目的 従って、一個またはそれ以上の修飾型ヌクレオチド、好ましくは約４個または それ以上、より好ましくは約８個の修飾型ヌクレオチドのクラスターを有するプ ローブ分子を利用して、診断用核酸プローブおよびその標的核酸間の結合力およ びハイブリダイゼーション速度の両方を向上するための方法を提供することが、 本発明の目的である。好ましい態様では、修飾はリボフラノシル環の２’修飾を 含有する。最も好ましい態様では、修飾は２’−Ｏ−メチル置換を含有する。 また、オリゴヌクレオチドへの多くの修飾型ヌクレオチドの取り込みによって 、一本鎖オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションの速度を増 加 する方法を提供することも目的である。このようにして達成されるハイブリダイ ゼーション速度の増加は、温度、塩濃度および／または核酸反応物の濃度の上昇 によって達成されるハイブリダイゼーション速度の増加より大きい。 標的の結合率を高め、ＤＮＡより速い速度でＲＮＡとハイブリダイズするよう に修飾されたオリゴヌクレオチドの使用により、ＤＮＡよりＲＮＡを選択的に標 的とする診断法の提供は、本発明の別の目的である。好ましい態様では、そのよ うなヌクレオチドはリボフラノシル環に２’−Ｏ−メチル修飾を含有する。 固定されたオリゴヌクレオチドを使用して直接または間接的に標的核酸を捕獲 する試料処理法の提供は、本発明の更なる目的である。好ましい態様では、その ような方法は、標的核酸と特異的にハイブリダイズすることができ、それによっ てその検出および固定化が可能となるようなオリゴヌクレオチドを一個またはそ れ以上使用する。好ましい態様では、単一の標識されたオリゴヌクレオチドによ り標的の捕獲および検出の両方が行われる。特に好ましい態様では、カップリン グまたは架橋核酸が、固定されたオリゴヌクレオチド、および標的の捕獲および 検出のためのオリゴヌクレオチドの両方に結合する。更なるカップリング核酸が 可能である。試料処理法に使用されるオリゴヌクレオチドの一部または全ては、 標的に特異的なハイブリダイゼーションの速度を増加するような修飾を含有して もよい。 同一部位にハイブリダイズするように設計されたより長い非修飾型オリゴヌク レオチドに比較して、標的に特異的な結合率を向上し、同時に標的および非標的 ヌクレオチド配列間の差を大きくするように修飾された、少なくとも約４個のヌ クレオチド、より好ましくは約８個のヌクレオチドのクラスターを好ましくは少 なくとも１個含有する、約１０から約１００塩基、好ましくは約１０から約１５ 塩基、そしてより好ましくは約１２から約１５塩基の標的特異的オリゴヌクレオ チドの提供は、本発明の更に別の目的である。 オリゴヌクレオチドおよび標的核酸間のハイブリダイゼーション速度を増加す るように機能する修飾型ヌクレオチドを含有する一個またはそれ以上のオリゴヌ クレオチドを含有するキットの提供は、本発明の更なる目的である。本発明のキ ットは、プローブ、増幅、ヘルパー、および試料処理オリゴヌクレオチドをいず れの組合せでも含有しうる。好ましい態様では、これらのキットの修飾型オリゴ ヌクレオチドは、リボフラノシル環に約４個の２’−Ｏ−メチル修飾のクラスタ ーを少なくとも１個含有する。これらの修飾型オリゴヌクレオチドを含有するキ ットは、診断用ハイブリダイゼーションアッセイおよび増幅アッセイの両方の使 用のために供給されてもよい。そのようなキットは、診断用ハイブリダイゼーシ ョンアッセイまたは増幅アッセイのいずれか、または両方における修飾型オリゴ ヌクレオチドの使用を実務者に指導する説明書を更に含有してもよい。 従って、本発明の診断法は、結合の親和性を向上させた修飾型オリゴヌクレオ チドのハイブリダイゼーションの特性を活用するのに特に適合する。これらの方 法をいずれの標的核酸の検出または定量に使用してもよい。好ましい態様では、 標的核酸はＲＮＡである。方法には、修飾型オリゴヌクレオチドの領域と結合し た非修飾型オリゴデオキシ−またはオリゴリボ−ヌクレオチド領域からなる“キ メラの”オリゴヌクレオチドを使用してもよく、または、完全に修飾されたオリ ゴヌクレオチドを利用してもよい。オリゴヌクレオチドは完全に修飾されていな いのが好ましい。領域は標的へのプローブの迅速なハイブリダイゼーションを促 進するようにだけ設計されてもよく、または他の機能を有してもよい。例えば、 キメラのオリゴヌクレオチドをＲＮＡとＤＮＡの両方と結合するように設計して もよい。そのような場合、オリゴヌクレオチドのＲＮＡ結合部位は、ＲＮＡ標的 を優先的に結合するような多くの修飾型ヌクレオチドを含有してもよい。あるい はまた、修飾された残基の領域は、ハイブリダイゼーション速度を増加するため に、少量存在する標的に向けられるように設計してもよい。 本明細書に示されるように、キットを含む本発明の方法および組成物のある態 様では、得られるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの特性、すなわ ちＴｍおよびハイブリダイゼーション速度に影響を及ぼす修飾を１種より多く有 するオリゴヌクレオチドを使用してもよいことは理解されるであろう。そのよう な複数の修飾は、協同で作用してハイブリダイゼーション速度を更に増加するか 、または、得られるオリゴヌクレオチドの、ＲＮＡのような与えられた型の核酸 標的に対する特異性を向上しうる。更にまた、キメラのオリゴヌクレオチドは２ ’−修飾型ヌクレオチドまたは他の修飾を有するヌクレオチドのいずれか、また は その両方を含有する、異なる修飾をされたオリゴヌクレオチドの領域を有するか 、またはそれらの領域からなるものでもよい。 ここに明記する本発明の目的および観点は、本明細書の観点から当業者に明白 である本発明の方法および組成物の目的または観点の網羅的な記載を意図するも のではない。また、上記の説明または後に記載する実施例は、そこに明記する態 様に対する本発明の制限と解釈すべきではない。実施例 特に示さない限り、以下の全ての実施例において、オリゴデオキシリボヌクレ オチド、オリゴリボヌクレオチド、および修飾型オリゴヌクレオチドは標準的な ホスフォルアミダイト化学を利用した当業者に周知の種々の方法を使用して合成 した。例えばCarruthersら，154“酵素学における方法（Methods in Enzymology ）”，287（1987）（これは参照により本明細書の一部としてここに組み込まれ る）を参照されたい。ここで特に記載しない限り、修飾型ヌクレオチドは２’Ｏ −メチル−ヌクレオチドであり、ホスフォルアミダイト類似体として合成に使用 した。出願人はExpedite 8909 DNA Synthesizer（PerSeptive Biosystems社、Fr amingham、マサチューセッツ州）を使用してオリゴヌクレオチドを調製した。 また、特に示さない限り、標識された、と表されるオリゴヌクレオチドはアク リジニウムフェニルエステルを含有する。アクリジニウムフェニルエステル化合 物は四級窒素の中心を有し９位が誘導されてフェニルエステル部分となったアク リジンの誘導体である。しかしながら、フェニル部分以外の脱離基は当業者に周 知のものである。アクリジニウムエステルは過酸化水素と反応して、アクリジニ ウム環のＣ−９炭素を含むジオキセタン環を一時的に生成し、次いで励起された アクリドンを生成する特性を有する。励起されたアクリドンの放射緩和により発 光が生じる。アクリジニウムエステルの合成は、その化学発光標識試薬としての 使用の一般的な説明と同様に、Weeksら，“イムノアッセイにおける高比活性標 識としてのアクリジニウムエステル（Acridinium Esters as High Specific Act ivity Labels in Immunoassays）”，Clin．Chem.，29:1474-1478（1984）に記 載されており、これは参照によりここに組み込まれる。 これらの実施例では、標準的な化学技術を使用して、アクリジニウムエステル 部分に結合する第一級アミンの“リンカーアーム”を有する非ヌクレオチド単量 体単位にアクリジニウムエステルを結合させ、これをオリゴヌクレオチドの化学 合成の際にヌクレオチドの隣接する配列間に挿入するか、またはオリゴヌクレオ チドの末端の位置に配した。Arnoldら，“ヌクレオチドプローブのための非ヌク レオチド結合試薬（Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes ）”，EPO Publication No．EPO 313219（これは本発明と共通の所有権を有し、 参照によりここに組み込まれる）を参照されたい。しかしながら、２’−修飾型 オリゴヌクレオチドのＲＮＡ標的に対する選択性、およびＤＮＡ標的とのハイブ リダイゼーション速度に対する修飾型オリゴヌクレオチドの効果が標識の存在ま たは特性によって決定されないことは理解されるところである。従って、当業者 には、本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドが種々のラベルで標識され てもよく、または、例えば増幅プライマーもしくはヘルパーオリゴヌクレオチド として使用される場合、または捕獲アッセイに使用される場合は、標識されなく てもよいことは認識されるであろう。 当業者に周知の技術を使用して、アクリジニウムエステル誘導体をリンカーア ーム：ハイブリダイゼーションプローブ複合体に結合してもよい。好ましくは、 出願人はNelsonら，“非同位体プローブ技術における化学発光によるアクリジニ ウムエステルの検出（Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence in Non-Isotopic Probe Techniques）”，（Academic Press 1992）、および、A rnoldら，“ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド結合試薬”，EPO Pub lication No．EPO 313219（すでに参照によりここに組み込まれている）に記載 される方法を使用する。 更に、特に示さない限り、全ての標的核酸はＲＮＡである。 しかしながら、ここに開示する本発明の意図から逸脱することなく他の標識を 本発明の方法および組成物に使用してもよいことは、本明細書の観点から当業者 に明白である。実施例１： プローブ：標的ハイブリッドのＴｍに対する２’修飾の効果 種々の量の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有する同一配列のオリゴヌクレ オチドプローブを、それぞれ独立して、完全に相補的に合成した同じ長さのＲＮ Ａ標的とハイブリダイズさせた。プローブの配列はSEQ ID NO:1を有し、標的の 配列はSEQ ID NO:2を有した。これらのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド塩基 配列は以下の通りである： 以下に説明するように、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有しない（プロー ブＡ）、全て２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有する（プローブＢ）、または デオキシ−および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを組み合わせて含有する（プロ ーブＣ，Ｄ、およびＥ）ように、プローブを合成した。プローブＣは、リンカー 結合部位のそれぞれの側に直接隣接する４個の連続したデオキシリボヌクレオチ ドを、そして他の全ての塩基に２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含有し；プ ローブＤはリンカー結合部位のそれぞれの側に直接隣接する４個の連続した２’ −Ｏ−メチルヌクレオチドを、そして他の全ての塩基にデオキシリボヌクレオチ ドを含有し；そして、プローブＥはリンカー結合部位のそれぞれの側に直接隣接 する８個の連続した２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを、そして他の全ての塩基に デオキシリボヌクレオチドを含有する。それぞれのハイブリッドのＴｍは化学発 光法および光学法の両方を使用して測定した。化学発光法 化学発光法を使用して、ＲＮＡ標的約１ｐｍｏｌ、および上記のように“標準 的な”アクリジニウムエステル（４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニル エチル）フェニル−１０−メチルアクリジニウム９−カルボキシレートフルオロ スルフォネート）で標識したそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ０．１ｐｍ ｏｌを、３０μｌのコハク酸リチウム緩衝液（１．５ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレン ジアミン四酢酸）、１．５ｍＭ ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−ア ミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、３１０ｍＭ ラウリル硫 酸リチウム、０．１Ｍ コハク酸リチウム（ｐＨ５．２））中で６０℃、６０分 間、ハイブリダイズさせた。その後、得られた溶液をコハク酸リチウム緩衝液で ５００μｌに希釈し、その５０μｌアリコートを種々の温度で７分間インキュベ ートした。次いでそれぞれの試料を氷上で更に７分間冷却した。１９０ｍＭ Ｎ ａ₂Ｂ₄Ｏ₇（ｐＨ７．６）、７％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ^R Ｘ−１００（ポリオ キシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェノール）、および０．０２％（ｗ／ｖ）ゼラ チンを含有する溶液１５０μｌを添加し、試料を６０℃で１０分間加熱して、ハ イブリダイズしていないプローブ分子と結合したアクリジニウムエステルを加水 分解した。それぞれの試料の残存する（ハイブリッド結合した）化学発光を、LE ADE^R 50 ルミノメーター（MGM Instruments社、Hamden、コネチカット州）を使 用して、０．００１Ｍ ＨＮＯ₃に溶解した０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ₂Ｏ₂を含有す る溶液を自動注入し、次いで０．５〜２秒後に２００μｌの１Ｎ ＮａＯＨを注 入して測定した。生じた発光を２秒間隔で積分した。光学法 光学法を使用して、一組の同一のオリゴヌクレオチドプローブをリンカーアー ムを有するように合成し、アクリジニウムエステルでは標識しなかった。それぞ れのオリゴヌクレオチドプローブ４マイクログラムを、２００ｍＭ 水酸化リチ ウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、３ｍＭ ＥＧＴＡ、１７％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リ チウム、および１９０ｍＭ コハク酸（ｐＨ５．２）を含有するハイブリダイゼ ーション緩衝液３０μｌ中で６０℃、６０分間加熱し、４μｇの相補的なＲＮＡ 標的とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションに次いで、ハイブリダイ ゼーション緩衝液６００μｌを添加し、試料を二分し、マイクロＴｍ分析アクセ サリー（Micro T_m analysis accessory）を装備したBeckman DU640分光光度計で それぞれの試料画分の融解性を測定した。温度は、Ｔ_mに比べて１０℃より多く 低い、または高い温度では毎分１℃、その他の全ての温度では０．２℃間隔で毎 分０．５℃ずつ変化させた。減色度（hypochromaticity）の変化をモニターし、 温度の関数として記録した。結果を以下の表−１に示す。表−１ ｎｄ＝未実施（no data） 表−１に示すように、化学発光および光学法を使用して得られたＴ_mのデータ は互いによく一致した。化学発光法で観測されたＴ_m値がやや低いのは、光学法 に対して化学発光法ではより低い濃度の核酸を使用したためであると考えること ができる。データは、プローブＡの全てのデオキシリボヌクレオチド残基を２’ −Ｏ−メチルヌクレオチドで置換することにより（プローブＢ）、プローブ：Ｒ ＮＡ標的ハイブリッドのＴ_mが約２０．４℃上昇したことを示している。プロー ブＣ、Ｄ、およびＥでは、それぞれ１５℃、４℃、および１１．６℃のＴ_m上昇 を示した。それぞれの２’−Ｏ−メチルヌクレオチド置換のＴ_mに対する効果を 算出することにより、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド：ＲＮＡ標的ハイブ リッドのＴ_mはそのような置換毎に約０．８℃上昇することが明らかとなった。 この効果は、試験した置換数の範囲でほぼ直線的であった。実施例２： プローブ：ｒＲＮＡハイブリッドのＴｍに対する２’−修飾型ヌク レオチドの効果 ３組の異なる長さおよび配列のオリゴヌクレオチドプローブを合成し、それぞ れの組は同一の塩基配列のオリゴヌクレオチドを２個含有させた。プローブＦの 長さは１７塩基で、チミン塩基およびアデニン塩基の間にある部位に結合するア クリジニウムエステル標識を含有する。プローブＧの長さは１８塩基で、同様に 、チミン塩基およびアデニン塩基の間にある部位に結合するアクリジニウムエス テ ル標識を含有する。プローブＨの長さは２０塩基で、チミン塩基およびグアニン 塩基の間にある部位に結合するアクリジニウムエステル標識を含有する。 それぞれの組のプローブは、完全にデオキシリボヌクレオチドからなるオリゴ ヌクレオチドと、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのみを含有する別のオリゴヌク レオチドを含有する。その後、それぞれのプローブを対応するリボソームＲＮＡ にハイブリダイズさせ、生じたハイブリッドのＴ_mを上記の化学発光法で測定し た。結果を以下の表−２に示す。表−２ データは、デオキシリボヌクレオチドの２’−Ｏ−メチルヌクレオチドでの置 換により、生じるプローブ：ＲＮＡ標的ハイブリッドのＴ_mが上昇することを示 し、実施例１の結果が確認された。更に、３個のプローブの修飾型ヌクレオチド 当たりのＴ_m上昇の平均値を計算したところ、それぞれの修飾型ヌクレオチドの 寄与は、修飾型ヌクレオチド当たり０．８℃の上昇であった。実施例３： プローブ：ＤＮＡハイブリッドのＴ_mに対する２’−修飾型ヌクレ オチドの効果 この実施例では、プローブ：ＤＮＡ標的に対する２’−修飾の効果を検討した 。種々の量の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するプローブＩを同じ長さの 完全に相補的なＤＮＡ標的にハイブリダイズさせ、生じたハイブリッドの融解性 を上記の化学発光法で測定した。プローブＩの長さは２９塩基で、チミン塩基お よびグアニン塩基の間にある部位に結合するアクリジニウムエステル標識を含有 す る。 プローブＩは（ｉ）全てデオキシリボヌクレオチド；（ii）全て２’−Ｏ−メ チルヌクレオチド；および（iii）標識結合部位のそれぞれの側に隣接する４個 のデオキシリボヌクレオチド以外は全て２’−Ｏ−メチルヌクレオチド：からな るように設計した。Ｔ_mの測定結果を以下の表−３に示す。表−３ データに示されるように、プローブＪおよびＫにおいてデオキシリボヌクレオ チドを２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換することにより、標識されたプロー ブ：ＤＮＡ標的のＴ_mは２’−Ｏ−メチル残基当たり約０．３℃上昇した。 ３組の異なるオリゴヌクレオチドを使用して同様の試験を行った。それぞれの 組は同一の塩基配列を有する２つのオリゴヌクレオチドを含有し、その一つはデ オキシリボヌクレオチドを含有し、もう一方は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを １００％含有する。プローブＪの長さは１６塩基で、チミン塩基およびアデニン 塩基の間にある部位に結合するアクリジニウムエステル標識を含有する。プロー ブＫの長さは１８塩基で、同様に、チミン塩基およびアデニン塩基の間にある部 位に結合するアクリジニウムエステル標識を含有する。プローブＬの長さは２９ 塩基で、チミン塩基およびグアニン塩基の間にある部位に結合するアクリジニウ ムエステル標識を含有する。 それぞれの場合で、合成ＤＮＡ標的は完全にプローブに相補的とした。結果を 以下の表−４に示す。表−４ 表−３および４に含まれるデータは、２’−Ｏ−メチル置換をプローブに導入 した場合のＤＮＡ標的のＴ_mの増加の程度は、ＲＮＡ標的より有意に少ないこと を示している。実施例４： 異なる型の核酸ハイブリッドの安定度の分析 ＤＮＡ、ＲＮＡ、および２’−Ｏ−メチルヌクレオチド鎖を種々の組合せで含 有するハイブリッドの相対的な安定度を比較するために、SEQ ID NO:1（上記の 実施例１を参照すること）のアクリジニウムエステル標識オリゴヌクレオチドプ ローブを、完全に相補的な塩基配列を有する合成標的にハイブリダイズさせた。 １００％リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、１００％デオキシリボヌクレオチド（Ｄ ＮＡ）、または１００％ ２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するプローブお よび標的の組み合わせを表−５に示した。それぞれの試験したハイブリッドの化 学発光または光学法のいずれかを使用して測定した融解性を以下の表−５に示す 。表中の一より多いデータは独立した重複実験を示す。表−５ ｎｄ＝未実施 従って、この実験は、標識されたプローブ：標的ハイブリッドの安定度は以下 の順に従うことを示している：２’−Ｏ−メチル／２’−Ｏ−メチル ≧ ２’ −Ｏ−メチル／ＲＮＡ ＞ ＲＮＡ／ＲＮＡ ＞ ＤＮＡ／ＤＮＡ ＞ ２’− Ｏ−メチル／ＤＮＡ ＞ ＤＮＡ／ＲＮＡ。実施例５： 安定度を向上した２’−修飾型オリゴ（2'-modified oligo）：Ｒ ＮＡハイブリッドのＲＮＡを特異的に標的とする能力 実施例４に示すように、２’−Ｏ−メチル：ＲＮＡハイブリッドは２’−Ｏ−メ チル：ＤＮＡハイブリッドよりかなり安定度が高い。この安定度の相違を診断ア ッセイに利用して同一配列を有する（しかしＤＮＡ中のチミンはＲＮＡ中ではウ ラシルに置き換わっている）ＤＮＡ分子よりＲＮＡ分子を特異的に検出すること ができることを示すために、以下の実験を実施した。 １００％ ２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるSEQ ID NO:1（上記の実施 例１を参照すること）のアクリジニウムエステル標識オリゴヌクレオチドプロー ブを、完全に相補的な合成ＲＮＡまたはＤＮＡ標的にハイブリダイズさせた。オ リゴヌクレオチドを標識したこと以外は、ハイブリダイゼーションおよびＴ_mの 測定は、実施例１の光学法の項目に記載する通りに実施した。結果を上記の表− ５に示し、図−３に更に図示する。 図−３に示すように、８１．６℃で２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドはＲ ＮＡ標的と検出可能なハイブリッドを形成したが、ＤＮＡ標的とはしなかった。 対照的に、表−５は、同一配列の標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドが同一の ＲＮＡまたはＤＮＡ標的とハイブリダイズする場合、生じるハイブリッドはかな り類似した融解性を有することを示している。 従って、ここに記載する本発明の観点から、容易に決められるハイブリダイゼ ーション条件下でＤＮＡ標的よりＲＮＡ標的を特異的に検出することが可能であ る。非限定的な例として、そのような方法を使用して、アッセイする生体のゲノ ムＤＮＡに存在する同一配列の干渉を受けることなくｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、また はｒＲＮＡのような種々のＲＮＡ類を特異的に検出してもよい。そのような方法 は、特定の遺伝子産物の発現率のモニタリングを含む適用に有用でありうる。２ ’−修飾型オリゴヌクレオチドのこの能力を利用した他の使用は当業者に明白で ある。実施例６： オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度に対する２’− 修飾型ヌクレオチドの効果 ハイブリダイゼーション速度に対する２’−修飾型ヌクレオチドの効果を４つ の異なる方法を用いて例証した。この実施例で使用したプローブ分子は上記のよ うに標準的なアクリジニウムエステルで標識した。 ａ） 第一のアプローチでは、２ｆｍｏｌのSEQ ID NO:1（上記の実施例１を 参照すること）を有するアクリジニウムエステル標識プローブを種々の量の完全 に相補的なＲＮＡ標的と一定時間ハイブリダイズさせ、次いで標識を分別加水分 解（differential hydrolysis）および検出した。ハイブリダイゼーションは本 質 的には実施例１の化学発光法の項目に記載する通りに実施したが、相違点は以下 の通りである。種々の量のＲＮＡ標的を標識されたプローブと６０℃で４５分間 ハイブリダイズさせた。図−４にこの実験結果を示すが、図中、プローブはＤＮ Ａオリゴヌクレオチド（□）または完全に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからな るか（◆）のいずれかである：これらの結果は以下の表−６にも示す。ハイブリ ダイゼーションの程度は相対光度単位（Relative Light Units；ｒｌｕ）で表す が、これはアクリジニウムエステル標識が放射する光子数の測定値である。表−６ 結果は、プローブが非修飾型ヌクレオチドではなく２’−Ｏ−メチルヌクレオ チドを含有する場合、ハイブリダイゼーション速度が標的濃度の関数として有意 に増加することを示している。これは試験した標的濃度の範囲を通して当てはま る。比較のために、これらのデータの初期勾配を使用して、デオキシ−（勾配＝ １．０）および２’−Ｏ−メチル（勾配＝２．５）オリゴヌクレオチドプローブ の相対ハイブリダイゼーション速度を評価した。 ｂ） 第二のアプローチでは、上記ａ）で使用したものと同一の標的の一定量 （２ｆｍｏｌ）を種々の量の完全に相補的なプローブと一定時間ハイブリダイズ させた。図−５にこの実験結果を示すが、図中、プローブはＤＮＡオリゴヌクレ オチド（□）または完全に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるか（◆）のい ずれかである。ハイブリダイゼーションおよび検出段階は、ハイブリダイゼーシ ョン反応を４５分間ではなく３０分間実施した以外は、上記ａ）に記載されるも のと同一である。データを以下の表−７に示す。表−７ ここでも、この実施例の結果は、プローブが非修飾型ヌクレオチドではなく２ ’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有する場合、プローブ濃度の関数であるハイブ リダイゼーション速度は有意に増加することを示している。これらのプロットの 勾配は図−４のものと同様であり、プローブ濃度または標的濃度が多様であるか どうかに関わらず、２’−Ｏ−メチル／ＤＮＡおよびＤＮＡ／ＤＮＡ相互作用間 のハイブリダイゼーション速度の差は同じであった。この実験で、ＤＮＡプロー ブを含有する反応の初期勾配は１．０であり、２’−Ｏ−メチルプローブを含有 する反応のそれは３．１であった。 ｃ） ２’−修飾型オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度増加能 力の第三の例証として、一定量の修飾型または非修飾型プローブのいずれか（１ ｆｍｏｌ）と標的（１００ａｍｏｌ）を種々の時間でハイブリダイズさせた。そ れ以外は、ハイブリダイゼーションおよび検出のプロトコールはｂ）と同様であ る。図−６に結果を示すが、図中、プローブはＤＮＡオリゴヌクレオチド（□） または完全に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるか（◆）のいずれかである 。データを以下の表−８に示す：表−８ ここでも、曲線の初期勾配からハイブリダイゼーションの相対速度を測定する ことができる（デオキシ＝１．０；２’−Ｏ−メチル＝２．２）。この実験では 、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含有する反応の初期勾配は１．０であり、２’− Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドプローブを含有する反応の初期勾配は２．２倍で あった。 ｄ） ２’−修飾型および非修飾型プローブのハイブリダイゼーション速度間 の差を証明するために使用した第四の方法はＣ_oｔ分析である。SEQ ID NO:1（上 記の実施例１を参照すること）のアクリジニウムエステル標識プローブを使用し た。一定量のプローブおよび種々の量の標的（“プローブ過剰”）、または一定 量の標的および種々の量のプローブ（“標的過剰”）のいずれかを６０℃で種々 の時間ハイブリダイズさせた。一定量のプローブまたは標的は０．２５ｆｍｏｌ であり、種々の量のプローブおよび標的は０．２５〜５０ｆｍｏｌの範囲で含有 する。ハイブリダイゼーションは、それ以外は実施例１の化学発光法の項目に記 載した通りである。 １５０μｌの１９０ｍＭ Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇（ｐＨ７．６）、７％（ｖ／ｖ）ＴＲ ＩＴＯＮ(ｒ) Ｘ−１００、および０．０２％（ｗ／ｖ）ゼラチンを試料に添加 し、混合液を６０℃で１０分間加熱して、ハイブリダイズしていないアクリジニ ウムエステルの分別加水分解およびハイブリダイズしたプローブの検出を行った 。上記のようにルミノメーターで化学発光を測定した。最大ハイブリダイゼーシ ョン率は、観測されたｒｌｕ値を、飽和量のプローブまたは標的をハイブリダイ ゼー ション反応に使用した場合に観測される最大ｒｌｕ値で除した比率と定義した。 図−７に示すＣ_oｔプロットでは、ｌｎ（ｌ−Ｈ）の量を標的濃度とハイブリ ダイズ時間の乗数に対してプロットした。Ｈ値は特定標的濃度における特定時間 後のプローブのハイブリダイゼーション率と定義する。 このプロットでは、ＤＮＡおよび２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドプロー ブのハイブリダイゼーションの相対速度は、５０％ハイブリダイゼーションでの Ｃ_oｔの相対速度の逆数で得られる（ｌｎ（１−０．５）；デオキシ＝１．０お よび２’−Ｏ−メチル=２．２）。 これら４方法で測定した、完全にデオキシまたは２’−Ｏ−メチルリボヌクレ オチドからなるアクリジニウムエステル標識プローブの相対ハイブリダイゼーシ ョン速度の概要を表−９に示す。これらの実験から得られたデータは、６０℃で 、完全に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが、相当す るデオキシリボヌクレオチドプローブより２．３倍速くハイブリダイズすること を示している。表−９ 実施例７： ２’−修飾型オリゴヌクレオチドの更なる標的へのハイブリダイゼ ーション速度の分析 これらのハイブリダイゼーション速度の比較を他のプローブおよび標的配列に 拡大するため、上記の実施例２のプローブＨを完全にデオキシまたは２’−Ｏ− メチルヌクレオチドのどちらかからなるように合成し、ヘルパープローブの存在 下でｒＲＮＡにハイブリダイズさせた。実施例６（ｄ）のようにＣ_oｔ分析を実 施した。結果を以下の表−１０に示す。表−１０ この実施例では、完全に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるプローブは同 一配列のデオキシリボヌクレオチドプローブより３．７５倍速くハイブリダイズ した。従って、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するアクリジニウムエステ ル標識プローブによるハイブリダイゼーションの向上は、特定のプローブまたは 標的配列に限定されないと考えられる。実施例８： ２’−修飾型オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度に 対する温度上昇の効果 上記のように、核酸のハイブリダイゼーション速度は温度の上昇により加速さ れる。しかしながら、特に診断アッセイおよび比較的短いオリゴヌクレオチド（ 約１０〜約５０塩基の長さ）を使用する核酸増幅法においては、この加速の利点 は二本鎖型に対する温度上昇による不安定化効果によって相殺されうる。以下に 示すように、ここに記載するように修飾したオリゴヌクレオチドによって提供さ れる二本鎖の安定度の向上は、この不安定化効果を最小限にし、他に可能なもの より高い温度でハイブリダイゼーションを行うことによって、ハイブリダイゼー ション速度を更に増加することができる。従って、修飾型オリゴヌクレオチド およびより高いハイブリダイゼーション温度により、ハイブリダイゼーション速 度に対する協同効果が提供される。 完全に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるSEQ ID NO:1（上記の実施例１ を参照すること）のアクリジニウムエステル標識オリゴヌクレオチドプローブを 、上記のように同一の長さの完全に相補的なＲＮＡ標的とハイブリダイズさせた 。ハイブリダイゼーションおよびＣ_oｔのプロトコールは、ハイブリダイゼーシ ョン温度が６０℃または７０℃のいずれかであった以外は、実施例６（ｄ）に記 載した通りである。以下の表−１１のデータが示すように、２’−Ｏ−メチルオ リゴヌクレオチドの標的へのハイブリダイゼーション温度を６０℃から７０℃に 上昇することにより、ハイブリダイゼーション速度は１．５倍に加速された。表−１１ 実施例９： ２’−修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応速度 への塩濃度増加の影響 また、ハイブリダイゼーション反応速度は、塩濃度の増加によっても加速され る。以下の例は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応 速度への様々な塩、例えばＬｉＣｌ、の濃度の影響について説明している。完全 に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる配列番号１のアタリジニウムエステル −標識プローブ（上記の実施例１を参照のこと）を、実施例６（ｄ）に上記した ように、８０℃で同じ長さの正確に相補的なＲＮＡ標的にハイブリダイズさせ、 そしてＣ_oｔ分析を行った。ハイブリダイゼーションは、２種類の異なる濃度の ＬｉＣｌで行われた。以下の表１２に示したように、ＬｉＣ１の０．５から１． ０Ｍへの塩濃度の増加は、ハイブリダイゼーション反応速度を２．９倍に強化し た。表１２ これらの結果は、ハイブリダイゼーション反応での塩濃度を２倍に増加させる と、修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応速度が２．９倍に増 加することを、示している。実施例１０ ： 塩濃度および温度の上昇によるハイブリダイゼーション反応速度 への組み合わせ影響 ２’−修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応速度へのハイブ リダイゼーション温度および塩濃度を同時に上昇させた影響を証明するために、 以下の反応を行った。アクリジニウムエステル−標識ＤＮＡオリゴヌクレオチド および１００％の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを持つアクリジニウムエステル −標識オリゴヌクレオチド（両方共、配列番号１）（上記実施例１を参照のこと ）は、それぞれ別々に正確に相補的なＲＮＡ標的分子にハイブリダイズさせＣ_o ｔ分析を行った。ハイブリダイゼーション条件は実施例６（ｄ）に記載した条件 に従った。ハイブリダイゼーション温度および塩濃度は以下の表１３に示したと おりである。結果を以下に示す。表１３ データに示しているように、ハイブリダイゼーション温度８０℃および１．０ ＭのＬｉＣｌで行った２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドのその標的へのハイ ブリダイゼーション速度は、温度６０℃および０．５ＭのＬｉＣｌの塩濃度で行 った相当するＤＮＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度より８． ６倍速かった。実施例１１ ： ＲＮＡ、ＤＮＡおよび２’−Ｏ−修飾オリゴヌクレオチドがその 相補的ＤＮＡおよびＲＮＡ標的とハイブリダイズするハイブリダイゼーション速 度の比較 標識されたＲＮＡ、ＤＮＡおよび２’−Ｏ−メチル−含有オリゴヌクレオチド と完全に相補的なＤＮＡおよびＲＮＡ標識との相対ハイブリダイゼーション速度 を、個別的に測定した。速度の測定は、上の実施例６（ｃ）または６（ｄ）のい ずれかに開示された方法に従って行った。標識されたオリゴヌクレオチドは配列 番号１と同一の塩基配列を持つ（上記の実施例１を参照のこと）。結果を以下の 表１４に要約している。表１４ 列１−４に示した実験は、３ｆｍｏｌの標識プローブおよび０．３ｆｍｏｌの 標的を用いて、実施例６（ｃ）に開示した方法に従って、行われた。列５および ６に示した実験は、実施例６（ｄ）に記載した方法を用いて、行われた。一つよ り多い結果を示しているところでは、それぞれの値は、異なる独立的実験に該当 する。 表１４の結果は、デオキシリボヌクレオチド残基を２’−ＯＨ残基（ＲＮＡ） または２’−Ｏ−メチル残基のいずれかで置換すると、ＲＮＡ標的へのプローブ のアフィニティーならびにハイブリダイゼーション反応速度が強められることを 証明している。それとは対照的に、デオキシリボヌクレオチド残基を２’−Ｏ− メチル残基で置換しても、ＤＮＡ標的へのプローブのアフィニティーまたはハイ ブリダイゼーション反応速度は強化されなかった。 表１４に示した結果は、デオキシリボヌクレオチドを２’−Ｏ−メチル残基で 置換すると、プローブのＲＮＡ標的へのアフィニティーおよびハイブリダイゼー ション速度は強化されるが、ＤＮＡ標的へのアフィニティーおよびハイブリダイ ゼーション速度は強化されないことを示している。しかしながら、これらの実験 は、アクリジニウムエステル標識および／またはリンカーが、プローブに付着し たことによって、これらのハイブリダイゼーション速度特性の原因となるかもし れないと言う、可能性を除去するわけではない。アクリジニウムエステル標識お よび／またはリンカーが感知される程度の影響をハイブリダイゼーション速度に 与えないと言うことを示すために、以下の実験を行った。 アクリジニウムエステルで標識され、そしてラベルをプローブに付着させるた めの非ヌクレオチドリンカーを含む、配列番号１のＲＮＡプローブ（上記の実施 例１を参照のこと）は、全体が２’−Ｏ−メチルまたはデオキシリボヌクレオチ ドのいずれかからなる完全に相補的な標的と完全にハイブリダイゼーションさせ ることが可能である。実施例６（ｄ）に記載の方法に従ってハイブリダイゼーシ ョンおよびＣ_oｔ分析を行った。結果を以下の表１５に示している。表１５ これらのデータは、デオキシリボヌクレオチドを２’−Ｏ−メチル残基で置換 すると、アクリジニウムエステルおよび／またはリンカーを欠くオリゴヌクレオ チドのハイブリダイゼーション反応速度が強化されることを、表している。この ように、２’−Ｏ−メチル修飾プローブに認められたハイブリダイゼーション速 度の増加は、標識またはリンカーアームの存在によるものではなく、２’−Ｏ− メチル修飾オリゴヌクレオチド本来の性質によるものである。実施例１２ ： ＤＮＡプローブ混合物および２’−Ｏ−修飾プローブ混合物から のプローブのｒＲＮＡ標的へのハイブリダイゼーションでのヘルパープローブの 影響の比較 Ｈｏｇａｎ（上記）に開示されたように、核酸、特に有意な量の二次構造を持 つ核酸、へのいくつかのプローブのハイブリダイゼーションは、「ヘルパー」プ ローブと称される、さらなるプローブの使用によって促進される。唯一の例では ないが、高度の二次構造を持つ核酸の例として、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ） が挙げられる。ヘルパープローブは、標的領域を覆うであろう二次構造の崩壊を 助けることができる。通常、ヘルパープローブは、プローブ標的配列の近くに位 置するが、好ましくはそれとオーバーラップしない、配列領域を標的とする。実 際には、ヘルパープローブは一般的には標識されておらず、通常、モル大過剰で 用いられる。標識されたプローブハイブリダイゼーションへのヘルパープローブ の使用の影響は、通常、Ｔ_mおよび標識プローブ：標的ハイブリッドのハイブリ ダイゼーション速度の増加として表される。 ２’−修飾オリゴヌクレオチドプローブが、多量の二次構造を含む与えられた 標的領域に向けられた場合のＤＮＡプローブのそれと同様の要求を、ヘルパープ ローブに対しても持つか否かを試験するために、以下の実験を行った。２つのプ ローブ混合物を作成した。それぞれのプローブ混合物は、上記の実施例２のプロ ーブＦ、ＧおよびＨを含んでいた。一つのプローブ混合物のオリゴヌクレオチド は、１００％の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで成り立っており、その他のプロ ーブ混合物のオリゴヌクレオチドは、その全体がデオキシリボヌクレオチドから 成り立っていた。示したように、プローブ混合物は、それぞれ３３、３６、４１ 、３１、２９および４０の塩基の長さを持つ、非標識のＤＮＡヘルパープローブ １、ｂ、ｃ，ｄ，ｅおよびｆを含んでいた。 それぞれのヘルパープローブは、標識プローブの一つの標的部位のすぐ近くに あるｒＲＮＡ塩基配列に向けられた。ハイブリダイゼーションの程度は、上記の ようなハイブリダイゼーション保護アッセイ(hybridization protection assay) （ＨＰＡ^TM）を用いて測定された。結果は、相対光単位(relatibe light units) （ｒｌｕ）として報告される。 以下の表１６に示したように、ヘルパープローブ非存在下では、ＤＮＡプロー ブ混合物は、充分にはｒＲＮＡにハイブリダイズしない。それとは対照的に、Ｄ ＮＡプローブ混合物と同一配列の２’−Ｏ−メチルプローブを用いたプローブ混 合物をヘルパープローブの非存在下でｒＲＮＡにハイブリダイズさせた場合、よ り高い程度のハイブリダイゼーションが認められた。さらに、ヘルパープローブ を両方のプローブ混合物と共に用いた場合に、プローブのそれら標的へのハイブ リダイゼーションは、２’−修飾オリゴヌクレオチドプローブ混合物と共に用い た場合に、より強められた。ＤＮＡプローブのｒＲＮＡへのハイブリダイゼーシ ョンは、ヘルパープローブの存在に強く依存するため、同一の２’−Ｏ−メチル プローブのハイブリダイゼーションが起こらない場合でさえ、２’−Ｏ−メチル プローブは、ＤＮＡプローブがハイブリダイゼーションできない条件下で、リボ ソームＲＮＡのような複雑な構造を持つＲＮＡ分子と効率良くハイブリダイズす ることができる。表１６ さらに、表１６のデータは、２’−修飾オリゴヌクレオチドを用いた場合、プ ローブ結合を容易にするためにヘルパープローブが必要とされないことを、示し ている。実施例１３ ： 単一のＤＮＡプローブおよび単一の２’−飾プローブの、ｒＲＮ Ａ標的へのハイブリダイゼーションにおけるヘルパープローブの影響の比較 実施例１２に記載の実験結果は、実施例１２で同定された６つのヘルパーオリ ゴヌクレオチドの存在下または非存在下のいずれかで、３つの別々の標識プロー ブを用いてもたらされた。本実施例では、完全にデオキシリボ−または２’−Ｏ −メチルヌクレオチドからなる実施例２のプローブＦおよびＨを、示されたヘル パープローブの存在下または非存在下で、標的ｒＲＮＡにハイブリダイズさせた 。ヘルパープローブには、上記実施例１２のａ、ｂ、ｃおよびｄを用いた。表１ ７は、プローブＡのＤＮＡおよび２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドのハイブ リダイゼーションの特徴を示している。表１８は、プローブＨのＤＮＡおよび２ ’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を示している 。示された様々なヘルパープローブとヘルパープローブの組み合わせの存在下ま たは非存在下で、それぞれの標識プローブを、試験した。表１７ 表１８ 表１７および１８は、標識ＤＮＡプローブが、アッセイ条件下でそれらの標的 に効率良くハイブリダイズするために、ヘルパーオリゴヌクレオチドを必要とし ていたことを、示している。さらに、表１８は、２’−修飾オリゴヌクレオチド はヘルパープローブ非存在下でも、付加ヘルパー存在下でＤＮＡオリゴヌクレオ チドが同一の標的にハイブリダイズするより、より高い程度でそれらの標的にハ イブリダイズしたことを、示している。結局、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオ チドは、ヘルパーオリゴヌクレオチド存在下でもより高いハイブリダイゼーショ ン特性を示した。実施例１４ ： ヘルパープローブの存在下および非存在下でのＤＮＡプローブお よび２’−Ｏ−修飾プローブのｒＲＮＡ標的へのハイブリダイゼーション特性へ の、温度の影響の比較 実施例１３に示したデータは、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドが、ヘル パープローブの非存在下で、ｒＲＮＡのように高度に折り畳まれた構造のＲＮＡ 標的にさえ、検出可能な範囲でハイブリダイズすることを示している。しかし、 ヘルパープローブは、複雑な構造のＲＮＡへの２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオ チドのハイブリダイゼーションを加速することができる。ヘルパープローブの効 果をさらに綿密に試験するために、デオキシ−および２’−Ｏ−メチルオリゴヌ クレオチドプローブを、ヘルパー細胞の存在下または非存在下、異なる温度で、 ｒＲＮＡにハイブリダイズさせた。表１９は、上記実施例２のプローブＦのヌク レオチド配列を持つアクリジニウムエステル標識のプローブおよび上記実施例１ ２のヘルパープローブｃおよびｄを用いて行った研究を示している。表２０は、 配列番号１のヌクレオチド配列（上記実施例１を参照のこと）を持つアクリジニ ウムエステルー標識プローブおよびそれぞれ４１および３２の塩基を持つヘルパ ープローブｇおよびｈを用いて行った研究を示している。表１９ 表２０ これらの実験は、６０℃および７５℃で、ヘルパープローブが、２’−Ｏ−メ チルプローブのそれらの標的へのハイブリダイゼーション速度を３．１−４．３ 倍に強めることを示している。実施例１５ ： アクリジニウムエステル標識プローブの加水分解特性への２’− 修飾ヌクレオチドの影響 診断用プローブ分子の性能特性への修飾オリゴヌクレオチドの影響をさらに証 明するために、数多くのさらなる実験を行った。これらの実験は、ＨＰＡ^TM検出 アッセイを用いて出願人の選択した検出方法を基にした。一つのＨＰＡ^TMフォー マットに従って、化学発光アクリジニウムエステルをプローブに付着させ、プロ ーブをアナライト(analyte)にハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの 後、ハイブリダイズしなかったプローブに関連する化学発光を、ホウ酸バッファ ー中で短時間加水分解することによって選択的に破壊する。プローブ：アナライ ト分子は、このプロセスで崩壊されないので、ハイブリダイズしたプローブに残 された化学ルミネセンスは、存在するアナライトを直接測定する。この適用では 、プローブ−アナライトハイブリッド複合体としてよりもハイブリダイズしてい ない場合により速く加水分解される、そのようなアクリジニウムエステル標識プ ローブが好ましい。プローブおよびハイブリッドの加水分解は、擬一次反応であ り、ｔ_1/2値として特徴付けることができる。このｔ_1/2値は、プローブまたはハ イブリッドのいずれかに付着したアクリジニウムエステルの５０％の加水分解に 要する時間であり、分で測定される。このように、大きな差別的加水分解(diffe rential hydrolysis）（ＤＨ）率（ｔ_1/2［ハイブリッド］／ｔ_1/2［プローブ］ ）を示すプローブが、非常に好ましい。 アクリジニウムエステル標識プローブの加水分解特性への修飾オリゴヌクレオ チドの影響を調べるために、異なるヌクレオチド塩基配列を持つそれぞれのセッ トおよび同一のヌクレオチド塩基配列を持つセットのそれぞれのメンバーからな る、４セットのプローブを構築した。それぞれのプローブのセットには、全体が 未修飾のヌクレオチドからなる一つのプローブおよび全体が２’−Ｏ−メチルヌ クレオチドからなるもう一つのプローブが、含まれる。用いられたプローブは、 上記実施例１のプローブＡおよびＢ、ならびに上記実施例２のプローブＦ、Ｇお よびＨであった。完全に相補的なＲＮＡ標的へのそれぞれのプローブのＤＨ率は 、例えば、実施例１のような、上記の方法に従って、測定した。以下の表２１に 示 すように、デオキシ−または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むハイブリダイ ズしなかったプローブは、非常に類似した速度で加水分解された。表２１ 対照的に、３つの配列で、修飾プローブ；標的ハイブリッド−関連標識は、も う一つの同一の未修飾のプローブ：標的ハイブリッドより、加水分解に対してお およそ２倍耐性であった。ある場合、アクリジニウムエステルリンカー周辺にＡ ＴＡＴ配列を含むプローブでは、ＤＨ率は、修飾プローブ：標的ハイブリッド− 関連標識で１．４倍減少した。実施例１６ ： アクリジニウムエステル標識プローブの加水分解特性への２’− 修飾ヌクレオチドの位置的影響 アクリジニウムエステルのＤＨ動性を強めるためには修飾ヌクレオチドが標識 付着部位の近くに位置しなければならないか否かを試験するために、アクリジニ ウムエステルリンカー部位と比較して異なる位置に２’−Ｏ−メチルヌクレオチ ドのクラスターを含む、配列番号１のアクリジニウムエステル−標識プローブを 、 相補的ＲＮＡ標的とハイブリダイズさせた。２’−Ｏ−メチル置換を含むそのよ うなヌクレオチドを、下線によって以下に示している： 以下の表２２に示したように、アクリジニウムエステルリンカー部位のどちら かの側への４つの隣接する２’−Ｏ−メチルヌクレオチドは、アクリジニウムエ ステル−標識プローブのＤＨ動性を、全体が２’−Ｏ−メチルヌクレオチドから なるプローブと同程度に充分に強化することを、測定は示している。表中の一つ より多いデータ点は、独立的に行った重複実験を示している。表２２ 実施例１７： ２’−修飾アクリジニウムエステル−標識プローブの加水分解特 性への温度の影響 上記のように、それらのより高い熱安定性故に、本発明の修飾オリゴヌクレオ チドは未修飾のオリゴヌクレオチドより、より高い温度で標的核酸にハイブリダ イズすることができる。そのようなより高い温度では、ハイブリダイゼーション 速度は、その他の反応の速度と同様に、増加することが期待されるであろう。そ のようなその他の反応の中に、アクリジニウムエステル標識の加水分解速度があ げられる。出願人らの選択した検出方法は、上記の参照に記載され採用されてい るハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ^TM）を用いているため、ハイブ リダイゼーション速度の増加によって授けられた診断アッセイへの恩恵が、この より高い温度でのハイブリッド−関連および非関連のアクリジニウムエステル標 識のＤＨ率の減少によってオフセットされるか否かを決定するために、以下の実 験を行った。 全体が２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるアクリジニウムエステル−標識 プローブを、６０℃、７０℃および８０℃での相補的ＲＮＡ標的にハイブリダイ ズさせた。ハイブリダイゼーション条件は、前記の通りである。 以下の表２３に示したように、７０℃および８０℃での２’−Ｏ−メチルヌク レオチドを含むアクリジニウムエステル−標識プローブは、６０℃でのデオキシ リボヌクレオチドを含むアクリジニウムエステル−標識プローブに匹敵するＤＨ 率を示した。このように、温度を上昇させても、標識の分解によるアッセイ感受 性が検出できる程は減少することなく、本発明の方法および組成物を用いる診断 アッセイに用いることができる。表２３ 実施例１８： 様々なアクリジニウムエステル−標識プローブの加水分解特性へ の２’−修飾ヌクレオチドの影響 検出可能な化学発光標識として標準アクリジニウムエステルを用いて、前述の 実験を行った。標準アクリジニウムエステル以外の標識の差別的加水分解動向が 、 Ｔ_m−強化修飾ヌクレオチドによって強化されるか否かを試験するために、デオ キシ−または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのいずれかを含む配列番号１のプロ ーブを、標準アクリジニウムエステル、ｏ−ｄｉＢｒアクリジニウムエステル、 ２−Ｍｅアクリジニウムエステル、ナフチル−アクリジニウムエステル、ｏ−Ｆ アクリジニウムエステル、２，７−ジイソプロピルアクリジニウムエステル、ま たは１−および３−Ｍｅアクリジニウムエステルの混合物で、同じ様式で同じ位 置を正確に標識し（上記実施例１を参照のこと）、そしてそれらのＤＨ動向を試 験した。 アクリジニウムエステルの例として図１を参照のこと。以下の表２４を要約し ているように、修飾ヌクレオチドプローブを用いると、結果として、試験したア クリジニウムエステル誘導体のすべてのＤＨ率が１．１−６倍まで増加した。表２４ 実施例１９： ハイブリダイゼーション反応速度論とプローブ配列内に含まれる ２’−修飾ヌクレチドの数との間の関係 ハイブリダイゼーション反応速度論とプローブ配列内の２’−Ｏ−メチルヌク レオチドの数との間の関係を試験するために、配列番号１（上記実施例１を参照 のこと）のアクリジニウムエステル標識プローブを合成した。これらの合成プロ ーブは、ＡＥリンカーの両側に増加した量の２’−Ｏ−メチル残基（２’−Ｏ− メチル残基の存在を下線で示す）を含んでいる：結果を以下の表２５に要約している。 表２５ 上に要約したように、片側のアクリジニウムエステルリンカー部位に４つづつ の、８つの２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（プローブＴ）程の少なさでも、ほぼ 全体が２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるプローブ（プローブＶ）と同レベ ルにアクリジニウムエステルプローブのハイブリダイゼーション速度を加速する のに充分であった。これとは対照的に、アクリジニウムエステルリンカー部位の それぞれの側に４つの２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むプローブのＴ_mは、 プローブがさらなる２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むプローブ：標的ハイブ リッドのＴ_mより低い。従って、本発明に従って、そのハイブリダイゼーション 速度、差別的加水分解、および融解特性に関して、アクリジニウムエステル標識 プローブの性能を最適化、または「チューニングする」ことが可能である。例え ば、アクリジニウムエステルリンカー部位のそれぞれの側に４つの２’−Ｏ−メ チルヌクレオチドを含むアクリジニウムエステル標識プローブは、最大に最適化 されたそのハイブリダイゼーション速度および差別的加水分解特性を持つであろ うが、このプローブを含むハイブリッドの融解温度は、わずかな上昇を示すのみ であろう。 実質的に隣接する２’−Ｏ−メチルヌクレオチドは、標識プローブ内のデオキ シリボヌクレオチドと置き換えるために追加されるので、プローブ：標的ハイブ リッドのハイブリダイゼーション速度および差別的加水分解特性は、実質的に一 定のまま残るであろうが、これに対してそのＴ_mは、増加し続けるであろう。プ ローブ：標的ハイブリッドのＴ_mへのプローブの影響を一定量ずつ増加させる能 力は、上記表２５に示すように、それが密接に関係した配列と交差反応しないよ うにプローブの特異性を調整することができる。実施例２０ ： プローブ：標的ハイブリッドのＴｍへのプロピン−修飾の影響 核酸ハイブリダイゼーション技術の診断への応用における、本発明の組成物お よび方法の一般的有用性を説明するために、リボフラノシル部分への２’−修飾 以外の修飾を持つオリゴヌクレオチドを構築したが、それは、その標的へのプロ ーブの結合アフィニティーを増加させる原因ともなった。この実施例では、窒素 含有塩基を修飾した２つのヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを合成した。 具体的には、Ｎ−ジイソブチルアミノメチリデン−５−（１−プロピニル）−２ ’−デオキシシチジン；（シチジン類似体）および５−（１−プロピニル）−２ ’−デオキシウリジン）（チミジン類似体）。これらのヌクレオチド類似体は、 例として、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）で市販され ている。 第一の縮合では、プローブＷおよびＹ内のチミン塩基およびグアニン塩基の間 、 ならびにプローブＸ内の２つのチミン塩基の間に位置する部位に付着したアクリ ジニウムエステル、ならびに２２の塩基を持つプローブ（変化する数のプロピン 修飾ヌクレオチドを含む）を、ヘルパープローブの存在下で標的ｒＲＮＡにハイ ブリダイズし、アクリジニウムエステルハイブリッドのＴ_mへの修飾の影響につ いて試験した。プローブＷは、プロピン修飾を含んでいなかった。プローブＸは 、２つのプロピン修飾を含んでおり、標識付着部位のそれぞれの側に直接隣接し ている。プローブＹは、１１のプロピン修飾を含み、標識付着部位の５’側も直 接隣接した４つの連続修飾を、ならびに標識付着部位から３’側に３、４、６、 ９−１１および１４塩基離れた塩基に位置する７つの修飾を含んでいる。 ハイブリダイゼーションおよびＴｍの測定は、アクリジニウムエステル標識ハ イブリッド検出法を用いて、上記の方法に従って、行われた。以下の表２６に要 約するように、これらのデータは、オリゴヌクレオチドのＴｍは、ＲＮＡ標的に ハイブリダイズした場合に、プロピン−置換ピリミジンでピリミジンのすべてを 置き換えると、平均で１℃上昇した。表２６ 実施例２１： オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション反応速度へのプロピ ン修飾の影響 オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応速度へのプロピン基の影響 を試験するために、実施例２０のプロピン−標識ブローブのＲＮＡへのハイブリ ダイゼーション速度を、実施例６記載の方法に従って、Ｃ_oｔ分析によって、試 験した。以下の表２７に要約するように、２つのプロピレン基を含むプローブ （プローブＷ）は、プロピン基を含まないプローブ（プローブＸ）と同じ速度で ハイブリダイズしたが、これに対して、１１のプロピン基を含むプローブ（プロ ーブＹ）は、１．９倍より速くハイブリダイズした。表２７ これらのデータは、結果としてＴｍを増加させるオリゴヌクレオチドへの修飾 がまた、その標的への修飾されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション速 度を、同一塩基配列の未修飾オリゴヌクレオチドと比較して上昇させる原因とな ることを証明することによって、本発明の普遍性を支えている。さらに、また、 この実施例は、そのような修飾が窒素含有塩基部分ならびに糖部分内にも起こり うることを、示している。当業者らは、そのような修飾もまた、ヌクレオチド内 結合にもた起こりうることを、認識しているであろう。 前述の開示は、本発明の好ましい実施態様について説明しているが、出願人は 、それに限定されるとは思わない。本発明が適用される当業者らは、この開示に かんがみて、さらなる実施態様を理解するであろう。さらなる実施様態もさらに 、この明細書およびそれらの均等物を含む添付請求の範囲内にある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 少なくとも一つの核酸被検体の存在または量を検出する場合に用いるた めの診断用ハイブリダイゼーション検定において第一核酸と第二核酸との間のハ イブリッド形成速度を増加させる方法であって、ここにおいて、該第一核酸の第 一ヌクレオチド塩基配列部分は、選択的ハイブリッド形成条件下において該第二 核酸の第一ヌクレオチド塩基配列部分に対して安定してハイブリッド形成するこ とができ、 （ａ）該ヌクレオチド部分の少なくとも一つを、１個またはそれ以上の修飾ヌ クレオチドを含むように合成して、 （ｉ）該第一核酸と第二核酸との間のハイブリッド形成結合親和性は、該条件 下において、修飾されていない形の該第一核酸と第二核酸との間のハイブリッド 形成結合親和性より大きく、しかも （ii）該第一核酸と第二核酸との間のハイブリッド形成速度は、該条件下にお いて、修飾されていない形の該第一核酸と第二核酸との間のハイブリッド形成速 度より大きいようにし；そして （ｂ）工程（ａ）の該第一核酸および第二核酸を、該ヌクレオチド部分が安定 してハイブリッド形成できるような該条件下において接触させる工程を含む上記 方法。 ２． 前記第一核酸および第二核酸が同じ核酸鎖上に含まれている請求項１に 記載の方法。 ３． 前記ヌクレオチド部分の少なくとも一つが、少なくとも約４個の修飾ヌ クレオチドを有する１個またはそれ以上のクラスターを含む請求項１に記載の方 法。 ４． 前記ヌクレオチド部分の少なくとも一つが、少なくとも約６個の修飾ヌ クレオチドを有する１個またはそれ以上のクラスターを含む請求項１に記載の方 法。 ５． 前記ヌクレオチド部分の少なくとも一つが、少なくとも約８個の修飾ヌ クレオチドを有する１個またはそれ以上のクラスターを含む請求項１に記載の方 法。 ６． 前記ヌクレオチド部分の少なくとも一つに含まれたヌクレオチドが実質 的に全部修飾されている請求項１に記載の方法。 ７． 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、 （ａ）窒素含有塩基に対する修飾； （ｂ）糖残基に対する修飾； （ｃ）リン酸残基に対する修飾； （ｄ）ヌクレオシド間結合に対する修飾；および （ｅ）ヌクレオチド間結合に対する修飾 から成る群より選択される一つの修飾を含む請求項３に記載の方法。 ８． 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、 （ａ）窒素含有塩基に対する修飾； （ｂ）糖残基に対する修飾； （ｃ）リン酸残基に対する修飾； （ｄ）ヌクレオシド間結合に対する修飾；および （ｅ）ヌクレオチド間結合に対する修飾 から成る群より選択される二つの修飾を含む請求項３に記載の方法。 ９． 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、 （ａ）アルキル置換； （ｂ）アルコキシ置換；および （ｃ）ハロゲン化置換 から成る群より選択されるリボフラノシル残基に対する２’−修飾を含む請求項 ３に記載の方法。 １０．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、リボフラノシル残基に対す る２’−Ｏ−メチル置換を含む請求項３に記載の方法。 １１．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、窒素含有塩基に対するプロ ピン置換を含む請求項３に記載の方法。 １２．前記プロピン置換がシチジン類似体に対する請求項１１に記載の方法。 １３．前記プロピン置換がチミジン類似体に対する請求項１１に記載の方法。 １４．前記ヌクレオチド部分の少なくとも一つの前記クラスターの一つまたは それ以上の前記修飾ヌクレオチドそれぞれが、同じ修飾を含んでいる請求項３に 記載の方法。 １５．前記修飾が、リボフラノシル残基に対する２’−Ｏ−メチル置換から成 る請求項１４に記載の方法。 １６．前記核酸の少なくとも一つが、１個またはそれ以上の結合体分子を含む 請求項１に記載の方法。 １７．前記核酸の少なくとも一つが、１個またはそれ以上の結合体分子を含み 、そしてここにおいて、該結合体分子の少なくとも一つが、前記ヌクレオチド部 分の少なくとも一つに含まれた前記クラスターの一つまたはそれ以上の中に位置 した部位で該核酸の少なくとも一つに対して結合している請求項３に記載の方法 。 １８．前記第一核酸の前記第一ヌクレオチド部分が、少なくとも約４個の修飾 ヌクレオチドを有する１個またはそれ以上のクラスターを含む請求項３に記載の 方法。 １９．前記第一核酸がオリゴヌクレオチドプローブを含む請求項１８に記載の 方法。 ２０．前記プローブが、約１０個〜約１００個のヌクレオチド塩基から成る請 求項１９に記載の方法。 ２１．前記プローブが、約１０個〜約１５個のヌクレオチド塩基から成る請求 項１９に記載の方法。 ２２．前記プローブが、約１２個〜約１５個のヌクレオチド塩基から成る請求 項１９に記載の方法。 ２３．前記プローブが、標識を更に含む請求項１９に記載の方法。 ２４．前記標識が、 （ａ）放射性同位体、 （ｂ）酵素、 （ｃ）酵素補助因子、 （ｄ）酵素基質、 （ｅ）色素（ｄｙｅ）、 （ｆ）ハプテン、 （ｇ）化学発光分子、 （ｈ）蛍光分子、 （ｉ）リン光分子、 （ｊ）電気化学発光分子、 （ｋ）発色団および （ｌ）前記条件下において前記第二核酸に対して安定してハイブリッド形成で きないヌクレオチド塩基配列部分 から成る群より選択される請求項２３に記載の方法。 ２５．前記標識が化学発光分子である請求項２４に記載の方法。 ２６．電子励起したＮ−アクリドンの基底状態への復帰の際に前記化学発光分 子が発光する請求項２５に記載の方法。 ２７．前記化学発光分子がアクリジニウムエステル誘導体である請求項２５に 記載の方法。 ２８．前記標識が、前記プローブの前記第一ヌクレオチド部分中に含まれた前 記クラスターの一つの中に位置した部位で該プローブに対して結合している請求 項２３に記載の方法。 ２９．前記第二核酸が前記被検体を含む請求項１９に記載の方法。 ３０．前記被検体がＲＮＡから成る請求項２９に記載の方法。 ３１．前記ＲＮＡが、ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡから成る請求項３０に記載の方 法。 ３２．前記被検体がＤＮＡから成る請求項２９に記載の方法。 ３３．前記ヌクレオチド部分がそれぞれ、少なくとも約４個の修飾ヌクレオチ ドを有する１個またはそれ以上のクラスターを含む請求項３に記載の方法。 ３４．前記ヌクレオチド部分の少なくとも一つの前記クラスターの一つまたは それ以上の前記修飾ヌクレオチドそれぞれが、同じ修飾を含んでいる請求項３３ に記載の方法。 ３５．前記修飾が、リボフラノシル残基に対する２’−Ｏ−メチル置換から成 る請求項３４に記載の方法。 ３６．第一核酸を含む被検体を含有すると考えられる試料中の該被検体の存在 または量を検出する方法であって、 （ａ）第二核酸を含むプローブと該試料を接触させ、ここにおいて、該プロー ブは、選択的ハイブリッド形成条件下において該被検体の第一ヌクレオチド塩基 配列部分に対して安定してハイブリッド形成できる第一ヌクレオチド塩基配列部 分を含有し、そしてここにおいて、該プローブの該第一ヌクレオチド部分は、１ 個またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含み； （ｂ）工程（ａ）の成分に該条件を施して、 （ｉ）該被検体と該プローブとの間のハイブリッド形成結合親和性は、該条件 下において、該被検体と修飾されていない形の該プローブとの間のハイブリッド 形成結合親和性より大きく、しかも （ii）該被検体と該プローブとの間のハイブリッド形成速度は、該条件下にお いて、該被検体と修飾されていない形の該プローブとの間のハイブリッド形成速 度より大きいようにし；そして （ｃ）該試料中の該被検体の存在または量の指標として該被検体に対してハイ ブリッド形成した該プローブを検出する工程を含む上記方法。 ３７．前記プローブの前記第一ヌクレオチド部分が、少なくとも約４個の修飾 ヌクレオチドを有する１個またはそれ以上のクラスターを含む請求項３６に記載 の方法。 ３８．前記プローブの前記第一ヌクレオチド部分が、少なくとも約６個の修飾 ヌクレオチドを有する１個またはそれ以上のクラスターを含む請求項３６に記載 の方法。 ３９．前記プローブの前記第一ヌクレオチド部分が、少なくとも約８個の修飾 ヌクレオチドを有する１個またはそれ以上のクラスターを含む請求項３６に記載 の方法。 ４０．前記プローブの前記第一ヌクレオチド部分中に含まれたヌクレオチドが 実質的に全部修飾されている請求項３６に記載の方法。 ４１．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、 （ａ）窒素含有塩基に対する修飾； （ｂ）糖残基に対する修飾； （ｃ）リン酸残基に対する修飾； （ｄ）ヌクレオシド間結合に対する修飾；および （ｅ）ヌクレオチド間結合に対する修飾 から成る群より選択される一つの修飾を含む請求項３７に記載の方法。 ４２．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、 （ａ）窒素含有塩基に対する修飾； （ｂ）糖残基に対する修飾； （ｃ）リン酸残基に対する修飾； （ｄ）ヌクレオシド間結合に対する修飾；および （ｅ）ヌクレオチド間結合に対する修飾 から成る群より選択される二つの修飾を含む請求項３７に記載の方法。 ４３．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、 （ａ）アルキル置換； （ｂ）アルコキシ置換；および （ｃ）ハロゲン化置換 から成る群より選択されるリボフラノシル残基に対する２’−修飾を含む請求項 ３７に記載の方法。 ４４．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、リボフラノシル残基に対す る２’−Ｏ−メチル置換を含む請求項３７に記載の方法。 ４５．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、窒素含有塩基に対するプロ ピン置換を含む請求項３７に記載の方法。 ４６．前記プロピン置換がシチジン類似体に対する請求項４５に記載の方法。 ４７．前記プロピン置換がチミジン類似体に対する請求項４５に記載の方法。 ４８．前記クラスターの一つまたはそれ以上の前記修飾ヌクレオチドそれぞれ が、同じ修飾を含んでいる請求項３７に記載の方法。 ４９．前記修飾が、リボフラノシル残基に対する２’−Ｏ−メチル置換から成 る請求項４８に記載の方法。 ５０．前記プローブが、１個またはそれ以上の結合体分子を含む請求項３６に 記載の方法。 ５１．前記プローブが、１個またはそれ以上の結合体分子を含み、そしてここ において、該結合体分子の少なくとも一つが、該ブローブの前記第一ヌクレオチ ド部分中に含まれた前記クラスターの一つまたはそれ以上の中に位置した部位で 該プローブに対して結合している請求項３７に記載の方法。 ５２．前記プローブが、約１０個〜約１００個のヌクレオチド塩基から成るオ リゴヌクレオチドである請求項３７に記載の方法。 ５３．前記プローブが、約１０個〜約１５個のヌクレオチド塩基から成るオリ ゴヌクレオチドである請求項３７に記載の方法。 ５４．前記プローブが、約１２個〜約１５個のヌクレオチド塩基から成るオリ ゴヌクレオチドである請求項３７に記載の方法。 ５５．前記プローブが、標識を更に含む請求項３７に記載の方法。 ５６．前記標識が、 （ａ）放射性同位体、 （ｂ）酵素、 （ｃ）酵素補助因子、 （ｄ）酵素基質、 （ｅ）色素、 （ｆ）ハプテン、 （ｇ）化学発光分子、 （ｈ）蛍光分子、 （ｉ）リン光分子、 （ｊ）電気化学発光分子、 （ｋ）発色団および （ｌ）前記条件下において前記被検体に対して安定してハイブリッド形成でき ないヌクレオチド塩基配列部分 から成る群より選択される請求項５５に記載の方法。 ５７．前記標識が化学発光分子である請求項５６に記載の方法。 ５８．電子励起したＮ−アクリドンの基底状態への復帰の際に前記化学発光分 子が発光する請求項５７に記載の方法。 ５９．前記化学発光分子がアクリジニウムエステル誘導体である請求項５７に 記載の方法。 ６０．前記標識が、前記プローブの前記第一ヌクレオチド部分中に含まれた前 記クラスターの一つの中に位置した部位で該プローブに対して結合している請求 項５５に記載の方法。 ６１．前記被検体がＲＮＡから成る請求項３７に記載の方法。 ６２．前記ＲＮＡが、ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡである請求項６１に記載の方法 。 ６３．前記試料がＤＮＡを更に含有する請求項６１に記載の方法。 ６４．前記被検体がＤＮＡから成る請求項３７に記載の方法。 ６５．前記プローブまたは前記被検体が、固体支持体によって直接的にまたは 間接的に固定されている請求項３７かまたは５５に記載の方法。 ６６．前記接触工程が、第三核酸と前記プローブを接触させることを更に含み 、ここにおいて、該第三核酸は、選択的ハイブリッド形成条件下において該プロ ーブの第二ヌクレオチド塩基配列部分に対して安定してハイブリッド形成できる 第一ヌクレオチド塩基配列部分を含有し、 ここにおいて、前記被検体は、該条件下において該第三核酸かまたは該プロー ブの該第二ヌクレオチド部分に対して安定してハイブリッド形成できないし、そ して ここにおいて、該第三核酸は、該条件下において該プローブの該第一ヌクレオ チド部分に対して安定してハイブリッド形成できない請求項３６に記載の方法。 ６７．前記プローブおよび前記第三核酸の前記ヌクレオチド部分の少なくとも 一つが、少なくとも約４個の修飾ヌクレオチドを有する１個またはそれ以上のク ラスターを含む請求項６６に記載の方法。 ６８．前記プローブおよび前記第三核酸の前記ヌクレオチド部分の少なくとも 一つに含まれたヌクレオチドが、実質的に全部修飾されている請求項６６に記載 の方法。 ６９．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、リボフラノシル残基に対す る２’−Ｏ−メチル置換を含む請求項６７に記載の方法。 ７０．前記プローブおよび前記第三核酸の前記ヌクレオチド部分の少なくとも 一つの前記クラスターの一つまたはそれ以上の前記修飾ヌクレオチドそれぞれが 、同じ修飾を含んでいる請求項６７に記載の方法。 ７１．前記修飾が、リボフラノシル残基に対する２’−Ｏ−メチル置換から成 る請求項７０に記載の方法。 ７２．前記プローブおよび前記第三核酸の少なくとも一つが、１個またはそれ 以上の結合体分子を含む請求項６６に記載の方法。 ７３．前記プローブおよび前記第三核酸の少なくとも一つが、１個またはそれ 以上の結合体分子を含み、そしてここにおいて、該結合体分子の少なくとも一つ が、該プローブおよび該第三核酸の前記ヌクレオチド部分の少なくとも一つに含 まれた前記クラスターの一つまたはそれ以上の中に位置した部位で該プローブお よび該第三核酸の少なくとも一つに対して結合している請求項６７に記載の方法 。 ７４．前記プローブが、標識を更に含む請求項６７に記載の方法。 ７５．前記標識が、 （ａ）放射性同位体、 （ｂ）酵素、 （ｃ）酵素補助因子、 （ｄ）酵素基質、 （ｅ）色素、 （ｆ）ハプテン、 （ｇ）化学発光分子、 （ｈ）蛍光分子、 （ｉ）リン光分子、 （ｊ）電気化学発光分子、 （ｋ）発色団および （ｌ）前記条件下において前記被検体かまたは前記第三核酸に対して安定して ハイブリッド形成できないヌクレオチド塩基配列部分 から成る群より選択される請求項７４に記載の方法。 ７６．前記標識が化学発光分子である請求項７５に記載の方法。 ７７．電子励起したＮ−アクリドンの基底状態への復帰の際に前記化学発光分 子が発光する請求項７６に記載の方法。 ７８．前記標識がアクリジニウムエステル誘導体である請求項７６に記載の方 法。 ７９．前記標識が、前記プローブの前記第一ヌクレオチド部分中に含まれた前 記クラスターの一つの中に位置した部位で該プローブに対して結合している請求 項６７に記載の方法。 ８０．前記被検体がＲＮＡから成る請求項６７に記載の方法。 ８１．前記被検体および前記第三核酸の一つが、固体支持体によって直接的に または間接的に固定されている請求項６７かまたは７４に記載の方法。 ８２．前記接触工程が、第三核酸と前記被検体を接触させることを更に含み、 ここにおいて、該第三核酸は、選択的ハイブリッド形成条件下において該被検体 の第二ヌクレオチド塩基配列部分に対して安定してハイブリッド形成できる第一 ヌクレオチド塩基配列部分を含有し、 ここにおいて、前記プローブは、該条件下において該第三核酸かまたは該被検 体の該第二ヌクレオチド部分に対して安定してハイブリッド形成できないし、そ して ここにおいて、該第三核酸は、該条件下において該被検体の該第一ヌクレオチ ド部分に対して安定してハイブリッド形成できない請求項３６に記載の方法。 ８３．前記プローブおよび前記第三核酸の前記ヌクレオチド部分の少なくとも 一つが、少なくとも約４個の修飾ヌクレオチドを有する１個またはそれ以上のク ラスターを含む請求項８２に記載の方法。 ８４．前記プローブおよび前記第三核酸の前記ヌクレオチド部分の少なくとも 一つに含まれたヌクレオチドが、実質的に全部修飾されている請求項８２に記載 の方法。 ８５．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、リボフラノシル残基に対す る２’−Ｏ−メチル置換を含む請求項８３に記載の方法。 ８６．前記プローブおよび前記第三核酸の前記ヌクレオチド部分の少なくとも 一つの前記クラスターの一つまたはそれ以上の前記修飾ヌクレオチドそれぞれが 、 同じ修飾を含んでいる請求項８３に記載の方法。 ８７．前記修飾が、リボフラノシル残基に対する２’−Ｏ−メチル置換から成 る請求項８６に記載の方法。 ８８．前記プローブおよび前記第三核酸の少なくとも一つが、１個またはそれ 以上の結合体分子を含む請求項８２に記載の方法。 ８９．前記プローブおよび前記第三核酸の少なくとも一つが、１個またはそれ 以上の結合体分子を含み、そしてここにおいて、該結合体分子の少なくとも一つ が、該プローブおよび該第三核酸の前記ヌクレオチド部分の少なくとも一つに含 まれた前記クラスターの一つまたはそれ以上の中に位置した部位で該プローブお よび該第三核酸の少なくとも一つに対して結合している請求項８３に記載の方法 。 ９０．前記第三核酸がヘルパープローブである請求項８３に記載の方法。 ９１．前記プローブが、標識を更に含む請求項８３に記載の方法。 ９２．前記標識が、 （ａ）放射性同位体、 （ｂ）酵素、 （ｃ）酵素補助因子、 （ｄ）酵素基質、 （ｅ）色素、 （ｆ）ハプテン、 （ｇ）化学発光分子、 （ｈ）蛍光分子、 （ｉ）リン光分子、 （ｊ）電気化学発光分子、 （ｋ）発色団および （ｌ）前記条件下において前記被検体かまたは前記第三核酸に対して安定して ハイブリッド形成できないヌクレオチド塩基配列部分 から成る群より選択される請求項９１に記載の方法。 ９３．前記標識が化学発光分子である請求項９２に記載の方法。 ９４．電子励起したＮ−アクリドンの基底状態への復帰の際に前記化学発光分 子が発光する請求項９３に記載の方法。 ９５．前記標識がアクリジニウムエステル誘導体である請求項９３に記載の方 法。 ９６．前記標識が、前記プローブの前記第一ヌクレオチド部分中に含まれた前 記クラスターの一つの中に位置した部位で該プローブに対して結合している請求 項９１に記載の方法。 ９７．前記被検体がＲＮＡから成る請求項８３に記載の方法。 ９８．前記プローブおよび前記第三核酸の一つが、固体支持体によって直接的 にまたは間接的に固定されている請求項８３かまたは９１に記載の方法。 ９９．前記接触工程が、前記被検体および前記プローブと第三核酸を接触させ ることを更に含み、ここにおいて、該第三核酸は、 （ａ）選択的ハイブリッド形成条件下において該被検体の第二ヌクレオチド塩 基配列部分に対して安定してハイブリッド形成できる第一ヌクレオチド塩基配列 部分；および （ｂ）選択的ハイブリッド形成条件下において該プローブの第二ヌクレオチド 塩基配列部分に対して安定してハイブリッド形成できる第二ヌクレオチド塩基配 列部分を含有し、 ここにおいて、該被検体は、該条件下において、該プローブの該第二ヌクレオ チド部分かまたは該第三核酸の該第二ヌクレオチド部分に対して安定してハイブ リッド形成できないし、 ここにおいて、該プローブは、該条件下において、該被検体の該第二ヌクレオ チド部分かまたは該第三核酸の該第一ヌクレオチド部分に対して安定してハイブ リッド形成できないし、そして ここにおいて、該第三核酸は、該被検体の該第一ヌクレオチド部分かまたは該 プローブの該第一ヌクレオチド部分に対して安定してハイブリッド形成できない 請求項３６に記載の方法。 １００．前記プローブおよび前記第三核酸の前記ヌクレオチド部分の少なくと も一つが、少なくとも約４個の修飾ヌクレオチドを有する１個またはそれ以上の クラスターを含む請求項９９に記載の方法。 １０１．前記プローブおよび前記第三核酸の前記ヌクレオチド部分の少なくと も一つに含まれたヌクレオチドが、実質的に全部修飾されている請求項９９に記 載の方法。 １０２．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、リボフラノシル残基に対 する２’−Ｏ−メチル置換を含む請求項１００に記載の方法。 １０３．前記プローブおよび前記第三核酸の前記ヌクレオチド部分の少なくと も一つの前記クラスターの一つまたはそれ以上の前記修飾ヌクレオチドそれぞれ が、同じ修飾を含んでいる請求項１００に記載の方法。 １０４．前記修飾が、リボフラノシル残基に対する２’−Ｏ−メチル置換から 成る請求項１０３に記載の方法。 １０５．前記プローブおよび前記第三核酸の少なくとも一つが、１個またはそ れ以上の結合体分子を含む請求項９９に記載の方法。 １０６．前記プローブおよび前記第三核酸の少なくとも一つが、１個またはそ れ以上の結合体分子を含み、そしてここにおいて、該結合体分子の少なくとも一 つが、該プローブおよび該第三核酸の前記ヌクレオチド部分の少なくとも一つに 含まれた前記クラスターの一つまたはそれ以上の中に位置した部位で該プローブ および該第三核酸の少なくとも一つに対して結合している請求項１００に記載の 方法。 １０７．前記プローブが、標識を更に含む請求項１００に記載の方法。 １０８．前記標識が、 （ａ）放射性同位体、 （ｂ）酵素、 （ｃ）酵素補助因子、 （ｄ）酵素基質、 （ｅ）色素、 （ｆ）ハプテン、 （ｇ）化学発光分子、 （ｈ）蛍光分子、 （ｉ）リン光分子、 （ｊ）電気化学発光分子、 （ｋ）発色団および （ｌ）前記条件下において前記被検体かまたは前記第三核酸に対して安定して ハイブリッド形成できないヌクレオチド塩基配列部分 から成る群より選択される請求項１０７に記載の方法。 １０９．前記標識が化学発光分子である請求項１０８に記載の方法。 １１０．電子励起したＮ−アクリドンの基底状態への復帰の際に前記化学発光 分子が発光する請求項１０９に記載の方法。 １１１．前記標識がアクリジニウムエステル誘導体である請求項１０９に記載 の方法。 １１２．前記被検体がＲＮＡから成る請求項１００に記載の方法。 １１３．前記プローブおよび前記第三核酸の一つが、固体支持体によって直接 的にまたは間接的に固定されている請求項１００かまたは１０７に記載の方法。 １１４．前記接触工程が、次の成分、 （ａ）第三核酸と前記プローブ、ここにおいて、該第三核酸は、選択的ハイブ リッド形成条件下において該プローブの第二ヌクレオチド塩基配列部分に対して 安定してハイブリッド形成できる第一ヌクレオチド塩基配列部分を含有する；お よび （ｂ）第四核酸と該第三核酸、ここにおいて、該第四核酸は、選択的ハイブリ ッド形成条件下において該第三核酸の第二ヌクレオチド塩基配列部分に対して安 定してハイブリッド形成できる第一ヌクレオチド塩基配列部分を含有するを接触 させることを更に含み、 ここにおいて、前記被検体は、該条件下において、該プローブ並びに該第三お よび第四核酸の該第二ヌクレオチド部分のいずれに対しても安定してハイブリッ ド形成できないし、 ここにおいて、該プローブは、該条件下において、該第三核酸および該第四核 酸の該第二ヌクレオチド部分のどちらに対しても安定してハイブリッド形成でき ないし、 ここにおいて、該第三核酸は、該条件下において該プローブの該第一ヌクレオ チド部分に対して安定してハイブリッド形成できないし、そして ここにおいて、該第四核酸は、該条件下において該第三核酸の該第一ヌクレオ チド部分に対して安定してハイブリッド形成できない請求項３６に記載の方法。 １１５．前記プローブ並びに前記第三および第四核酸の前記ヌクレオチド部分 の少なくとも一つが、少なくとも約４個の修飾ヌクレオチドを有する１個または それ以上のクラスターを含む請求項１１４に記載の方法。 １１６．前記プローブ並びに前記第三および第四核酸の前記ヌクレオチド部分 の少なくとも一つに含まれたヌクレオチドが、実質的に全部修飾されている請求 項１１４に記載の方法。 １１７．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、リボフラノシル残基に対 する２’−Ｏ−メチル置換を含む請求項１１５に記載の方法。 １１８．前記プローブ並びに前記第三および第四核酸の前記ヌクレオチド部分 の少なくとも一つの前記クラスターの一つまたはそれ以上の前記修飾ヌクレオチ ドそれぞれが、同じ修飾を含んでいる請求項１１５に記載の方法。 １１９．前記修飾が、リボフラノシル残基に対する２’−Ｏ−メチル置換から 成る請求項１１８に記載の方法。 １２０．前記プローブ並びに前記第三および第四核酸の少なくとも一つが、１ 個またはそれ以上の結合体分子を含む請求項１１４に記載の方法。 １２１．前記プローブ並びに前記第三および第四核酸の少なくとも一つが、１ 個またはそれ以上の結合体分子を含み、そしてここにおいて、該結合体分子の少 なくとも一つが、該プローブ並びに該第三および第四核酸の前記ヌクレオチド部 分の少なくとも一つに含まれた前記クラスターの一つまたはそれ以上の中に位置 した部位で該プローブ並びに該第三および第四核酸の少なくとも一つに対して結 合している請求項１１５に記載の方法。 １２２．前記プローブが、標識を更に含む請求項１１５に記載の方法。 １２３．前記標識が、 （ａ）放射性同位体、 （ｂ）酵素、 （ｃ）酵素補助因子、 （ｄ）酵素基質、 （ｅ）色素、 （ｆ）ハプテン、 （ｇ）化学発光分子、 （ｈ）蛍光分子、 （ｉ）リン光分子、 （ｊ）電気化学発光分子、 （ｋ）発色団および （ｌ）前記条件下において前記被検体並びに前記第三および第四核酸のいずれ に対しても安定してハイブリッド形成できないヌクレオチド塩基配列部分から成 る群より選択される請求項１２２に記載の方法。 １２４．前記標識が化学発光分子である請求項１２３に記載の方法。 １２５．電子励起したＮ−アクリドンの基底状態への復帰の際に前記化学発光 分子が発光する請求項１２４に記載の方法。 １２６．前記標識がアクリジニウムエステル誘導体である請求項１２４に記載 の方法。 １２７．前記標識が、前記プローブの前記第一ヌクレオチド部分の前記クラス ターの一つの中に位置した部位で該プローブに対して結合している請求項１２２ に記載の方法。 １２８．前記被検体がＲＮＡから成る請求項１１５に記載の方法。 １２９．前記第四核酸が、固体支持体によって固定されている請求項１１５か または１２２に記載の方法。 １３０．前記接触工程が、次の成分、 （ａ）第三核酸と前記被検体、ここにおいて、該第三核酸は、選択的ハイブリ ッド形成条件下において該被検体の第二ヌクレオチド塩基配列部分に対して安定 してハイブリッド形成できる第一ヌクレオチド塩基配列部分を含有する；および （ｂ）第四核酸と該第三核酸、ここにおいて、該第四核酸は、選択的ハイブリ ッド形成条件下において該第三核酸の第二ヌクレオチド塩基配列部分に対して安 定してハイブリッド形成できる第一ヌクレオチド塩基配列部分を含有する を接触させることを更に含み、 ここにおいて、該被検体は、該条件下において、該第三核酸かまたは該第四核 酸の該第二ヌクレオチド部分に対して安定してハイブリッド形成できないし、 ここにおいて、該プローブは、該条件下において、該被検体並びに該第三およ び該第四核酸の該第二ヌクレオチド部分のいずれに対しても安定してハイブリッ ド形成できないし、 ここにおいて、該第三核酸は、該条件下において、該被検体または該プローブ の該第一ヌクレオチド部分に対して安定してハイブリッド形成できないし、そし て ここにおいて、該第四核酸は、該条件下において該第三核酸の該第一ヌクレオ チド部分に対して安定してハイブリッド形成できない請求項３６に記載の方法。 １３１．前記プローブ並びに前記第三および第四核酸の前記ヌクレオチド部分 の少なくとも一つが、少なくとも約４個の修飾ヌクレオチドを有する１個または それ以上のクラスターを含む請求項１３０に記載の方法。 １３２．前記プローブ並びに前記第三および第四核酸の前記ヌクレオチド部分 の少なくとも一つに含まれたヌクレオチドが、実質的に全部修飾されている請求 項１３０に記載の方法。 １３３．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、リボフラノシル残基に対 する２’−Ｏ−メチル置換を含む請求項１３１に記載の方法。 １３４．前記プローブ並びに前記第三および第四核酸の前記ヌクレオチド部分 の少なくとも一つの前記クラスターの一つまたはそれ以上の前記修飾ヌクレオチ ドそれぞれが、同じ修飾を含んでいる請求項１３１に記載の方法。 １３５．前記修飾がリボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換からな る請求項１３４の方法。 １３６．前記プローブ並びに前記第３及び第４核酸の少なくとも１つが１つ以 上の結合分子を含む請求項１３０の方法。 １３７．前記プローブ並びに前記第３及び第４核酸の少なくとも１つが１つ以 上の結合分子を含み、かつ該結合分子の少なくとも１つが前記プローブ並びに前 記第３及び第４核酸の少なくとも１つに、前記プローブ並びに前記第３及び第４ 核酸の少なくとも１つの前記ヌクレオチド領域に含まれる１つ以上の前記クラス ターの内に位置する部位で結合する請求項１３１の方法。 １３８．前記プローブが標識をさらに含む請求項１３１の方法。 １３９．前記標識が ａ）放射性同位体、 ｂ）酵素、 ｃ）酵素補因子、 ｄ）酵素基質、 ｅ）染料（ｄｙｅ）、 ｆ）ハプテン、 ｇ）化学発光分子、 ｈ）蛍光分子、 ｉ）リン光分子、 ｊ）電気化学発光分子 ｋ）発色団、及び ｌ）前記条件の下で前記分析物（ａｎａｌｙｔｅ）並びに第３及び第４核酸の いずれとも安定にハイブリダイズすることができないヌクレオチド塩基配列領域 、からなる群より選択される請求項１３８の方法。 １４０．前記標識が化学発光分子である請求項１３９の方法。 １４１．電子的に励起したＮ−アクリドンが基底状態に戻る際に前記化学発光 分子により光が放射される請求項１４０の方法。 １４２．前記標識がアクリジニウムエステル誘導体である請求項１４０の方法 。 １４３．前記標識が前記プローブに、前記プローブの前記第１ヌクレオチド領 域の前記クラスターの１つの内に位置する部位で結合する請求項１３８の方法。 １４４．前記分析物がＲＮＡからなる請求項１３１の方法。 １４５．前記第４核酸が固体支持体によって固定化されている請求項１３１又 は１３８のいずれかの方法。 １４６．前記接触工程が、 ａ）前記分析物を第３核酸と接触させ、ここで、該第３核酸は選択的ハイブリ ダイゼーション条件下で前記分析物の第２ヌクレオチド塩基配列領域に安定にハ イブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチド塩基配列領域を含み； ｂ）前記プローブを該第３核酸と接触させ、ここで、該第３核酸は選択的ハイ ブリダイゼーション条件下で前記プローブの第２ヌクレオチド塩基配列領域に安 定にハイブリダイズすることが可能な第２ヌクレオチド塩基配列領域を含み；か つ ｃ）該第３核酸を第４核酸と接触させ、ここで、該第４核酸は選択的ハイブリ ダイゼーション条件下で該第３核酸の第３ヌクレオチド塩基配列領域に安定にハ イブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチド塩基配列領域を含む、 ことをさらに包含する請求項３６の方法であって、 前記分析物は該条件下において前記プローブの該第２ヌクレオチド領域、該第 ３核酸の該第２及び第３ヌクレオチド領域、及び該第４核酸のいずれとも安定に ハイブリダイズすることができず、 前記プローブは該条件下において前記分析物の該第２ヌクレオチド領域、該第 ３核酸の該第１及び第３ヌクレオチド領域、及び該第４核酸のいずれとも安定に ハイブリダイズすることができず、 該第３核酸は該条件下において前記分析物の該第１ヌクレオチド領域又は前記 プローブの該第１ヌクレオチド領域のいずれとも安定にハイブリダイズすること ができず、かつ 該第４核酸は該条件下において該第３核酸の該第１又は第２ヌクレオチド領域 のいずれとも安定にハイブリダイズすることができない方法。 １４７．前記プローブ並びに前記第３及び第４核酸の前記ヌクレオチド領域の 少なくとも１つが少なくとも約４個の修飾ヌクレオチドを有するクラスターを１ つ以上含む請求項１４６の方法。 １４８．前記プローブ並びに前記第３及び第４核酸の前記ヌクレオチド領域の 少なくとも１つに含まれるヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている請求項 １４６の方法。 １４９．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つがリボフラノシル部分に対す る２’−Ｏ−メチル置換を含む請求項１４７の方法。 １５０．前記プローブ並びに前記第３及び第４核酸の前記ヌクレオチド領域の 少なくとも１つの前記クラスターの１つ以上の前記修飾ヌクレオチドの各々が同 じ修飾を有する請求項１４７の方法。 １５１．前記修飾がリボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換からな る請求項１５０の方法。 １５２．前記プローブ並びに前記第３及び第４核酸の少なくとも１つが１つ以 上の結合分子を含む請求項１４６の方法。 １５３．前記プローブ並びに前記第３及び第４核酸の少なくとも１つが１つ以 上の結合分子を含み、かつ該結合分子の少なくとも１つが前記プローブ並びに前 記第３及び第４核酸の少なくとも１つに、前記プローブ並びに前記第３及び第４ 核酸の少なくとも１つの前記ヌクレオチド領域に含まれる１つ以上の前記クラス ターの内に位置する部位で結合する請求項１４７の方法。 １５４．前記プローブが標識をさらに含む請求項１４７の方法。 １５５．前記標識が ａ）放射性同位体、 ｂ）酵素、 ｃ）酵素補因子、 ｄ）酵素基質、 ｅ）染料、 ｆ）ハプテン、 ｇ）化学発光分子、 ｈ）蛍光分子、 ｉ）リン光分子、 ｊ）電気化学発光分子 ｋ）発色団、及び ｌ）前記条件の下で前記分析物並びに第３及び第４核酸のいずれとも安定にハ イブリダイズすることができないヌクレオチド塩基配列領域、 からなる群より選択される請求項１５４の方法。 １５６．前記標識が化学発光分子である請求項１５５の方法。 １５７．電子的に励起したＮ−アクリドンが基底状態に戻る際に前記化学発光 分子により光が放射される請求項１５６の方法。 １５８．前記標識がアクリジニウムエステル誘導体である請求項１５６の方法 。 １５９．前記標識が前記プローブに、前記プローブの前記第１ヌクレオチド領 域の前記クラスターの１つの内に位置する部位で結合する請求項１５４の方法。 １６０．前記分析物がＲＮＡからなる請求項１４７の方法。 １６１．前記第４核酸が固体支持体によって固定化されている請求項１４７又 は１５４のいずれかの方法。 １６２．前記接触工程が、 ａ）前記プローブを第３核酸を含む第１カップリング核酸と接触させ、ここで 、該第１カップリング核酸は選択的ハイブリダイゼーション条件下で前記プロー ブの第２ヌクレオチド塩基配列領域に安定にハイブリダイズすることが可能な第 １ヌクレオチド塩基配列領域を含み； ｂ）第４核酸を含む第２カップリング核酸を第５核酸と接触させ、ここで、該 第５核酸は選択的ハイブリダイゼーション条件下で該第２カップリング核酸の第 １ヌクレオチド塩基配列領域に安定にハイブリダイズすることが可能な第１ヌク レオチド塩基配列領域を含み； 及び、その代わりに、 ｉ）該第１カップリング核酸を該第２カップリング核酸と接触させ、ここで、 該第２カップリング核酸は選択的ハイブリダイゼーション条件下で該第１カップ リング核酸の第２ヌクレオチド塩基配列領域に安定にハイブリダイズすることが 可能な第２ヌクレオチド塩基配列領域を含み；又は、 ｉｉ）該第１及び第２カップリング核酸以外の１つ以上の任意のカップリング 核酸を接触させ、ここで、該任意のカップリング核酸の各々は選択的ハイブリダ イゼーション条件下で少なくとも２つの他のカップリング核酸に安定にハイブリ ダイズすることが可能であり、該他のカップリング核酸の少なくとも１つは該第 １及び第２カップリング核酸の少なくとも１つであってもよく、かつ該他のカッ プリング核酸の各々は該第５核酸及び前記分析物に直接もしくは間接的に結合す る、 ことをさらに包含する請求項３６の方法であって、 前記分析物は該条件下において前記プローブの該第２ヌクレオチド領域、該第 １及び第２カップリング核酸、該第５核酸、並びに該任意のカップリング核酸の いずれとも安定にハイブリダイズすることができず、 前記プローブは該条件下において該第１カップリング核酸の第２ヌクレオチド 領域、該第２カップリング核酸、該第５核酸、並びに該任意のカップリング核酸 のいずれとも安定にハイブリダイズすることができず、 該第第１カップリング核酸は該条件下において該プローブの該第１ヌクレオチ ド領域、該第２カップリング核酸の該第１ヌクレオチド領域、及び該第５核酸の いずれとも安定にハイブリダイズすることができず、 該第２カップリング核酸は該条件下において該第１カップリング核酸の該第１ ヌクレオチド領域に安定にハイブリダイズすることができず、 該第５核酸は該条件下において該第２カップリング核酸の該第２ヌクレオチド 領域又は該任意のカップリング核酸のいずれとも安定にハイブリダイズすること ができず、かつ、 該任意のカップリング核酸は該条件下において該第１もしくは第２カップリン グ核酸のいずれかの該第１ヌクレオチド領域に安定にハイブリダイズすることが ない方法。 １６３．前記プローブ、前記第１及び第２カップリング核酸、前記第５核酸の 前記ヌクレオチド領域、並びに前記任意のカップリング核酸のいずれか１つのヌ クレオチド塩基配列領域の少なくとも１つが少なくとも約４個の修飾ヌクレオチ ドを有するクラスターを１つ以上含む請求項１６２の方法。 １６４．前記プローブ、前記第１及び第２カップリング核酸、前記第５核酸の 前記ヌクレオチド領域、並びに前記任意のカップリング核酸のいずれか１つのヌ クレオチド塩基配列領域の少なくとも１つに含まれるヌクレオチドの実質的に全 てが修飾されている請求項１６２の方法。 １６５．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つがリボフラノシル部分に対す る２’−Ｏ−メチル置換を含む請求項１６３の方法。 １６６．前記プローブ、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸のいずれか の少なくとも１つの前記ヌクレオチド領域の１つ以上の前記クラスターの前記修 飾ヌクレオチドの各々が同じ修飾を有する請求項１６３の方法。 １６７．前記修飾がリボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換からな る請求項１６６の方法。 １６８．前記プローブ、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸のいずれか の少なくとも１つが１つ以上の結合分子を含む請求項１６２の方法。 １６９．前記プローブ、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸のいずれか の少なくとも１つが１つ以上の結合分子を含み、かつ該結合分子の少なくとも１ つが前記プローブ、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸のいずれかの少な くとも１つに、前記プローブ、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸のいず れかの少なくとも１つの前記ヌクレオチド領域に含まれる１つ以上の前記クラス ターの内に位置する部位で結合する請求項１６３の方法。 １７０．前記プローブが標識をさらに含む請求項１６３の方法。 １７１．前記標識が ａ）放射性同位体、 ｂ）酵素、 ｃ）酵素補因子、 ｄ）酵素基質、 ｅ）染料、 ｆ）ハプテン、 ｇ）化学発光分子、 ｈ）蛍光分子、 ｉ）リン光分子、 ｊ）電気化学発光分子 ｋ）発色団、及び ｌ）前記条件の下で前記分析物、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸の いずれとも安定にハイブリダイズすることができないヌクレオチド塩基配列領域 、からなる群より選択される請求項１７０の方法。 １７２．前記標識が化学発光分子である請求項１７１の方法。 １７３．電子的に励起したＮ−アクリドンが基底状態に戻る際に前記化学発光 分子により光が放射される請求項１７２の方法。 １７４．前記標識がアクリジニウムエステル誘導体である請求項１７２の方法 。 １７５．前記標識が前記プローブに、前記プローブの前記第１ヌクレオチド領 域に含まれる前記クラスターの１つの内に位置する部位で結合する請求項１７０ の方法。 １７６．前記分析物がＲＮＡからなる請求項１６３の方法。 １７７．前記第５核酸が固体支持体によって固定化されている請求項１６３又 は１７０のいずれかの方法。 １７８．前記接触工程が、 ａ）前記分析物を第３核酸を含む第１カップリング核酸と接触させ、ここで、 該第１カップリング核酸は選択的ハイブリダイゼーション条件下で前記分析物の 第２ヌクレオチド塩基配列領域に安定にハイブリダイズすることが可能な第１ヌ クレオチド塩基配列領域を含み； ｂ）第４核酸を含む第２カップリング核酸を第５核酸と接触させ、ここで、該 第５核酸は選択的ハイブリダイゼーション条件下で該第２カップリング核酸の第 １ヌクレオチド塩基配列領域に安定にハイブリダイズすることが可能な第１ヌク レオチド塩基配列領域を含み； 及び、その代わりに、 ｉ）該第１カップリング核酸を該第２カップリング核酸と接触させ、ここで、 該第２カップリング核酸は選択的ハイブリダイゼーション条件下で該第１カップ リング核酸の第２ヌクレオチド塩基配列領域に安定にハイブリダイズすることが 可能な第２ヌクレオチド塩基配列領域を含み；又は、 ｉｉ）該第１及び第２カップリング核酸以外の１つ以上の任意のカップリング 核酸を接触させ、ここで、該任意のカップリング核酸の各々は選択的ハイブリダ イゼーション条件下で２つの他のカップリング核酸に安定にハイブリダイズする ことが可能であり、該他のカップリング核酸の少なくとも１つは該第１及び第２ カップリング核酸の少なくとも１つであってもよく、かつ該他のカップリング核 酸の各々は該第５核酸及び前記分析物に直接もしくは間接的に結合する、 ことをさらに包含する請求項３６の方法であって、 前記分析物は該条件下において該第１カップリング核酸の該第２ヌクレオチド 領域、該第２カップリング核酸、該第５核酸、及び該任意のカップリング核酸の いずれとも安定にハイブリダイズすることができず、 前記プローブは該条件下において前記分析物の該第２ヌクレオチド領域、該第 １及び第２カップリング核酸、該第５核酸、並びに該任意のカップリング核酸の いずれとも安定にハイブリダイズすることができず、 該第第１カップリング核酸は該条件下において前記分析物の該第１ヌクレオチ ド領域、該第２カップリング核酸の該第１ヌクレオチド領域、及び該第５核酸の いずれとも安定にハイブリダイズすることができず、 該第２カップリング核酸は該条件下において該第１カップリング核酸の該第１ ヌクレオチド領域に安定にハイブリダイズすることができず、 該第５核酸は該条件下において該第２カップリング核酸の該第２ヌクレオチド 領域又は該任意のカップリング核酸のいずれとも安定にハイブリダイズすること ができず、かつ、 該任意のカップリング核酸は該条件下において該第１もしくは第２カップリン グ核酸のいずれかの該第１ヌクレオチド領域に安定にハイブリダイズすることが ない方法。 １７９．前記プローブ、前記第１及び第２カップリング核酸、前記第５核酸の 前記ヌクレオチド領域、並びに前記任意のカップリング核酸のいずれか１つのヌ クレオチド塩基配列領域の少なくとも１つが少なくとも約４個の修飾ヌクレオチ ドを有するクラスターを１つ以上含む請求項１７８の方法。 １８０．前記プローブ、前記第１及び第２カップリング核酸、前記第５核酸の 前記ヌクレオチド領域、並びに前記任意のカップリング核酸のいずれか１つのヌ クレオチド塩基配列領域の少なくとも１つに含まれるヌクレオチドの実質的に全 てが修飾されている請求項１７８の方法。 １８１．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つがリボフラノシル部分に対す る２’−Ｏ−メチル置換を含む請求項１７９の方法。 １８２．前記プローブ、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸のいずれか の少なくとも１つの前記ヌクレオチド領域の１つ以上の前記クラスターの前記修 飾ヌクレオチドの各々が同じ修飾を有する請求項１７９の方法。 １８３．前記修飾がリボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換からな る請求項１８２の方法。 １８４．前記プローブ、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸のいずれか の少なくとも１つが１つ以上の結合分子を含む請求項１７８の方法。 １８５．前記プローブ、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸のいずれか の少なくとも１つが１つ以上の結合分子を含み、かつ該結合分子の少なくとも１ つが前記プローブ、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸のいずれかの少な くとも１つに、前記プローブ、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸のいず れかの少なくとも１つの前記ヌクレオチド領域に含まれる１つ以上の前記クラス ターの内に位置する部位で結合する請求項１７９の方法。 １８６．前記プローブが標識をさらに含む請求項１７９の方法。 １８７．前記標識が ａ）放射性同位体、 ｂ）酵素、 ｃ）酵素補因子、 ｄ）酵素基質、 ｅ）染料、 ｆ）ハプテン、 ｇ）化学発光分子、 ｈ）蛍光分子、 ｉ）リン光分子、 ｊ）電気化学発光分子 ｋ）発色団、及び ｌ）前記条件の下で前記分析物、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸の いずれとも安定にハイブリダイズすることができないヌクレオチド塩基配列領域 、からなる群より選択される請求項１８６の方法。 １８８．前記標識が化学発光分子である請求項１８７の方法。 １８９．電子的に励起したＮ−アクリドンが基底状態に戻る際に前記化学発光 分子により光が放射される請求項１８８の方法。 １９０．前記標識がアクリジニウムエステル誘導体である請求項１８８の方法 。 １９１．前記標識が前記プローブに、前記プローブの前記第１ヌクレオチド領 域の内に位置する部位で結合する請求項１８６の方法。 １９２．前記分析物がＲＮＡからなる請求項１７９の方法。 １９３．前記第５核酸が固体支持体によって固定化されている請求項１７９又 は１８６のいずれかの方法。 １９４．前記接触工程が、 ａ）前記プローブを第３核酸を含む第１カップリング核酸と接触させ、ここで 、該第１カップリング核酸は選択的ハイブリダイゼーション条件下で前記プロー ブの第２ヌクレオチド塩基配列領域に安定にハイブリダイズすることが可能な第 １ヌクレオチド塩基配列領域を含み； ｂ）前記分析物を該第１カップリング核酸と接触させ、ここで、該第１カップ リング核酸は選択的ハイブリダイゼーション条件下で前記分析物の第２ヌクレオ チド塩基配列領域に安定にハイブリダイズすることが可能な第２ヌクレオチド塩 基配列領域を含み； ｃ）第４核酸を含む第２カップリング核酸を第５核酸と接触させ、ここで、該 第５核酸は選択的ハイブリダイゼーション条件下で該第２カップリング核酸の第 １ヌクレオチド塩基配列領域に安定にハイブリダイズすることが可能な第１ヌク レオチド塩基配列領域を含み； 及び、その代わりに、 ｉ）該第１カップリング核酸を該第２カップリング核酸と接触させ、ここで、 該第２カップリング核酸は選択的ハイブリダイゼーション条件下で該第１カップ リング核酸の第３ヌクレオチド塩基配列領域に安定にハイブリダイズすることが 可能な第２ヌクレオチド塩基配列領域を含み；又は、 ｉｉ）該第１及び第２カップリング核酸以外の１つ以上の任意のカップリング 核酸を接触させ、ここで、該任意のカップリング核酸の各々は選択的ハイブリダ イゼーション条件下で２つの他のカップリング核酸に安定にハイブリダイズする ことが可能であり、該他のカップリング核酸の少なくとも１つは該第１及び第２ カップリング核酸の少なくとも１つであってもよく、かつ該他のカップリング核 酸の各々は該分析物、該プローブ及び該第５核酸に直接もしくは間接的に結合す る、 ことをさらに包含する請求項３６の方法であって、 前記分析物は該条件下において前記プローブの該第２ヌクレオチド領域、該第 １カップリング核酸の該第１及び第３ヌクレオチド領域、該第２カップリング核 酸、該第５核酸、並びに該任意のカップリング核酸のいずれとも安定にハイブリ ダイズすることができず、 前記該プローブは該条件下において前記分析物の該第２ヌクレオチド領域、該 第１カップリング核酸の該第２及び第３ヌクレオチド領域、該第２カップリング 核酸、該第５核酸、並びに該任意のカップリング核酸のいずれとも安定にハイブ リダイズすることができず、 該第第１カップリング核酸は該条件下において前記分析物の該第１ヌクレオチ ド領域、前記プローブの該第１ヌクレオチド領域、該第２カップリング核酸の該 第１ヌクレオチド領域、及び該第５核酸のいずれとも安定にハイブリダイズする ことができず、 該第２カップリング核酸は該条件下において該第１カップリング核酸の該第１ もしくは第２ヌクレオチド領域のいずれにも安定にハイブリダイズすることがで きず、 該第５核酸は該条件下において該第２カッブリング核酸の該第２ヌクレオチド 領域又は該任意のカップリング核酸のいずれにも安定にハイブリダイズすること ができず、かつ、 該任意のカップリング核酸は該条件下において該第１カップリング核酸の該第 １及び第２ヌクレオチド領域並びに該第２カップリング核酸の該第１ヌクレオチ ド領域のいずれにも安定にハイブリダイズすることがない方法。 １９５．前記プローブ、前記第１及び第２カップリング核酸、前記第５核酸の 前記ヌクレオチド領域、並びに前記任意のカップリング核酸のいずれかのヌクレ オチド塩基配列領域の少なくとも１つが少なくとも約４個の修飾ヌクレオチドを 有するクラスターを１つ以上含む請求項１９４の方法。 １９６．前記プローブ、前記第１及び第２カップリング核酸、前記第５核酸の 前記ヌクレオチド領域、並びに前記任意のカップリング核酸のいずれかのヌクレ オチド塩基配列領域の少なくとも１つに含まれるヌクレオチドの実質的に全てが 修飾されている請求項１９４の方法。 １９７．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つがリボフラノシル部分に対す る２’−Ｏ−メチル置換を含む請求項１９５の方法。 １９８．前記プローブ、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸のいずれか の前記ヌクレオチド領域の少なくとも１つの前記１つ以上のクラスターの前記修 飾ヌクレオチドの各々が同じ修飾を有する請求項１９５の方法。 １９９．前記修飾がリボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換からな る請求項１９８の方法。 ２００．前記プローブ、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸のいずれか の少なくとも１つが１つ以上の結合分子を含む請求項１９４の方法。 ２０１．前記プローブ、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸のいずれか の少なくとも１つが１つ以上の結合分子を含み、かつ該結合分子の少なくとも１ つが前記プローブ、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸のいずれかの少な くとも１つに、前記プローブ、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸のいず れかの少なくとも１つの前記ヌクレオチド領域に含まれる１つ以上の前記クラス ターの内に位置する部位で結合する請求項１９５の方法。 ２０２．前記プローブが標識をさらに含む請求項１９５の方法。 ２０３．前記標識が ａ）放射性同位体、 ｂ）酵素、 ｃ）酵素補因子、 ｄ）酵素基質、 ｅ）染料、 ｆ）ハプテン、 ｇ）化学発光分子、 ｈ）蛍光分子、 ｉ）リン光分子、 ｊ）電気化学発光分子 ｋ）発色団、及び ｌ）前記条件の下で前記分析物、前記第５核酸、及び前記カップリング核酸の いずれとも安定にハイブリダイズすることができないヌクレオチド塩基配列領域 、からなる群より選択される請求項２０２の方法。 ２０４．前記標識が化学発光分子である請求項２０３の方法。 ２０５．電子的に励起したＮ−アクリドンが基底状態に戻る際に前記化学発光 分子により光が放射される請求項２０４の方法。 ２０６．前記標識がアクリジニウムエステル誘導体である請求項２０４の方法 。 ２０７．前記標識が前記プローブに、前記プローブの前記第１ヌクレオチド領 域の内に位置する部位で結合する請求項２０２の方法。 ２０８．前記分析物がＲＮＡからなる請求項１９５の方法。 ２０９．前記第５核酸が固体支持体によって固定化されている請求項１９５又 は２０２のいずれかの方法。 ２１０．第１核酸を含む分析物の存在又は量を、該分析物を含むことが疑われ る試料において検出するための方法であって、 ａ）ｉ）該試料を第２核酸と接触させ、ここで、該第２核酸は選択的ハイブリ ダイゼーション条件下で該分析物の第１ヌクレオチド塩基配列領域に安定にハイ ブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチド塩基配列領域を含み；及び ｉｉ）第３核酸を含むプローブを該第２核酸と接触させ、ここで、該第２ 核酸は選択的ハイブリダイゼーション条件下で該プローブの第１ヌクレオチド塩 基配列領域に安定にハイブリダイズすることが可能な第２ヌクレオチド塩基配列 領域を含む工程であって、 該第２核酸は、該第２核酸が該分析物と安定にハイブリダイズする場合を除い て該プローブに安定にハイブリダイズすることができず、 該分析物は該条件下において該プローブ又は該第２核酸の該第２ヌクレオチド 領域のいずれにも安定にハイブリダイズすることができず、 該プローブは該条件下において該第２核酸の該第１ヌクレオチド領域に安定に ハイブリダイズすることができず、 該第２核酸は該条件下において該分析物の該第１ヌクレオチド領域に安定にハ イブリダイズすることができず、かつ 該プローブ及び該第２核酸の該ヌクレオチド領域の少なくとも１つは１つ以上 の修飾ヌクレオチドを含む工程； ｂ）工程ａ）の成分を選択的ハイブリダイゼーション条件に処する工程であっ て、それにより、 該プローブの該第１ヌクレオチド領域及び該第２核酸の該第２ヌクレオチド領 域の少なくとも１つが該修飾ヌクレオチドを１つ以上含む場合には、 ｉ）該プローブと該第２核酸との間のハイブリダイゼーション結合親和性が、 同一のハイブリダイゼーション条件下において、非修飾形態の該プローブと該第 ２核酸との間のハイブリダイゼーション結合親和性よりも大きく、かつ、 ｉｉ）該プローブと該第２核酸との間のハイブリダイゼーション速度が、同一 のハイブリダイゼーション条件下において、非修飾形態の該プローブと該第２核 酸との間のハイブリダイゼーション速度よりも大きく、及び 該第２核酸の該第１ヌクレオチド領域が該修飾ヌクレオチドを１つ以上含む場 合には、 ｉ）該分析物と該第２核酸との間のハイブリダイゼーション結合親和性が、同 一のハイブリダイゼーション条件下において、該分析物と非修飾形態の該第２核 酸との間のハイブリダイゼーション結合親和性よりも大きく、かつ ｉｉ）該分析物と該第２核酸との間のハイブリダイゼーション速度が、同一の ハイブリダイゼーション条件下において、該分析物と非修飾形態の該第２核酸と の間のハイブリダイゼーション速度よりも大きい工程；並びに ｃ）該第２核酸とハイブリダイズした該標識プローブを該試料における該分析 物の存在又は量の指標として検出する工程、 を包含する方法。 ２１１．前記プローブ及び前記第２核酸の前記ヌクレオチド領域の少なくとも １つが少なくとも約４個の修飾ヌクレオチドを有するクラスターを１つ以上含む 請求項２１０の方法。 ２１２．前記プローブ及び前記第２核酸の前記ヌクレオチド領域の少なくとも １つが少なくとも約６個の修飾ヌクレオチドを有するクラスターを１つ以上含む 請求項２１０の方法。 ２１３．前記プローブ及び前記第２核酸の前記ヌクレオチド領域の少なくとも １つが少なくとも約８個の修飾ヌクレオチドを有するクラスターを１つ以上含む 請求項２１０の方法。 ２１４．前記プローブ及び前記第２核酸の前記ヌクレオチド領域の少なくとも １つに含まれるヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている請求項２１０の方 法。 ２１５．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、 ａ）窒素性塩基に対する修飾； ｂ）糖部分に対する修飾； ｃ）リン酸塩部分に対する修飾； ｄ）ヌクレオシド間連結に対する修飾；及び ｅ）ヌクレオチド間連結に対する修飾、 からなる群より選択される修飾を含む請求項２１１の方法。 ２１６． 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、 ａ）窒素性塩基に対する修飾； ｂ）糖部分に対する修飾； ｃ）リン酸塩部分に対する修飾； ｄ）ヌクレオシド間連結に対する修飾；及び ｅ）ヌクレオチド間連結に対する修飾、 からなる群より選択される２つの修飾を含む請求項２１１の方法。 ２１７． 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、 ａ）アルキル置換； ｂ）アルコキシ置換；及び ｃ）ハロゲン化物置換 からなる群より選択される、リボフラノシル部分に対する２’−修飾を含む請求 項２１１の方法。 ２１８．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つがリボフラノシル部分に対す る２’−Ｏ−メチル置換を含む請求項２１１の方法。 ２１９．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが窒素性塩基に対するプロピ ン置換を含む請求項２１１の方法。 ２２０．前記プロピン置換がシチジン類似体に対するものである請求項２１９ の方法。 ２２１．前記プロピン置換がチミジン類似体に対するものである請求項２１９ の方法。 ２２２．前記プローブ及び前記第２核酸の少なくとも１つの前記ヌクレオチド 領域の１つ以上の前記クラスターの前記修飾ヌクレオチドの各々が同じ修飾を有 する請求項２１１の方法。 ２２３．前記修飾がリボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換からな る請求項２２２の方法。 ２２４．前記プローブ及び前記第２核酸の少なくとも１つが１つ以上の結合分 子を含む請求項２１０の方法。 ２２５．前記プローブ及び前記第２核酸の少なくとも１つが１つ以上の結合分 子を含み、かつ該結合分子の少なくとも１つが前記プローブ及び前記第２核酸の 少なくとも１つに、前記プローブ及び前記第２核酸の少なくとも１つの前記ヌク レオチド領域に含まれる１つ以上の前記クラスターの内に位置する部位で結合す る請求項２１１の方法。 ２２６．前記プローブが約１０ないし約１００個のヌクレオチド塩基からなる オリゴヌクレオチドである請求項２１１の方法。 ２２７．前記プローブが約１０ないし約１５個のヌクレオチド塩基からなるオ リゴヌクレオチドである請求項２１１の方法。 ２２８．前記プローブが約１２ないし約１５個のヌクレオチド塩基からなるオ リゴヌクレオチドである請求項２１１の方法。 ２２９．前記プローブが標識をさらに含む請求項２１１の方法。 ２３０．前記標識が ａ）放射性同位体、 ｂ）酵素、 ｃ）酵素補因子、 ｄ）酵素基質、 ｅ）染料、 ｆ）ハプテン、 ｇ）化学発光分子、 ｈ）蛍光分子、 ｉ）リン光分子、 ｊ）電気化学発光分子 ｋ）発色団、及び ｌ）前記条件の下で前記分析物又は前記第２核酸のいずれとも安定にハイブリ ダイズすることができないヌクレオチド塩基配列領域、 からなる群より選択される請求項２２９の方法。 ２３１．前記標識が化学発光分子である請求項２３０の方法。 ２３２．電子的に励起したＮ−アクリドンが基底状態に戻る際に前記化学発光 分子により光が放射される請求項２３１の方法。 ２３３．前記化学発光分子がアクリジニウムエステル誘導体である請求項２３ １の方法。 ２３４．前記標識が前記プローブに、前記プローブの前記第１ヌクレオチド領 域に含まれる前記クラスターの１つの内に位置する部位で結合する請求項２２９ の方法。 ２３５．前記分析物がＲＮＡからなる請求項２１１の方法。 ２３６．前記ＲＮＡがｒＲＮＡ又はｔＲＮＡである請求項２３５の方法。 ２３７．前記試料がＤＮＡをさらに含む請求項２３５の方法。 ２３８．前記分析物がＤＮＡからなる請求項２１１の方法。 ２３９．前記分析物、前記プローブ及び前記第２核酸の少なくとも１つが固体 支持体によって直接又は間接的に固定化されている請求項２１１又は２２９のい ずれかの方法。 ２４０．第１核酸を含む分析物の存在又は量を、該分析物を含むことが疑われ る試料において検出するための方法であって、 ａ）ｉ）該試料を第２核酸を含むプローブと接触させ、ここで、該プローブは 選択的ハイブリダイゼーション条件下で該分析物の第１ヌクレオチド塩基配列領 域に安定にハイブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチド塩基配列領域を含 み； ｉｉ）該分析物を第３核酸と接触させ、ここで、該第３核酸は選択的ハイ ブリダイゼーション条件下で該分析物の第２ヌクレオチド塩基配列領域と安定に ハイブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチト塩基配列領域を含み；かつ ｉｉｉ）該第３核酸を第４核酸と接触させ、ここで、該第４核酸は選択的 ハイブリダイゼーション条件下で該第３核酸の第２ヌクレオチド塩基配列領域に 安定にハイブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチド塩基配列領域を含む工 程であって、 該第３核酸は、該第３核酸が該分析物と安定にハイブリダイズする場合を除い て該第４核酸に安定にハイブリダイズすることができず、 該分析物は該条件下において該第３核酸の該第２ヌクレオチド領域又は該第４ 核酸のいずれにも安定にハイブリダイズすることができず、 該プローブは該条件下において該分析物の該第２ヌクレオチド領域並びに該第 ３及び第４核酸のいずれにも安定にハイブリダイズすることができず、 該第３核酸は該条件下において該分析物の該第１ヌクレオチド領域に安定にハ イブリダイズすることができず、 該第４核酸は該条件下において該第３核酸の該第１ヌクレオチド領域に安定に ハイブリダイズすることができず、かつ 該プローブ並びに該第３及び第４核酸の該ヌクレオチド領域の少なくとも１つ は１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む工程； ｂ）工程ａ）の成分を選択的ハイブリダイゼーション条件に処する工程であっ て、それにより、 該プローブの該第１ヌクレオチド領域が該修飾ヌクレオチドを１つ以上含む場 合には、 ｉ）該分析物と該プローブとの間のハイブリダイゼーション結合親和性が、同 一のハイブリダイゼーション条件下において、該分析物と非修飾形態の該プロー ブとの間のハイブリダイゼーション結合親和性よりも大きく、かつ、 ｉｉ）該分析物と該プローブとの間のハイブリダイゼーション速度が、同一の ハイブリダイゼーション条件下において、該分析物と非修飾形態の該プローブと の間のハイブリダイゼーション速度よりも大きく、 該第３核酸の該第１ヌクレオチド領域が該修飾ヌクレオチドを１つ以上含む場 合には、 ｉ）該分析物と該第３核酸との間のハイブリダイゼーション結合親和性が、同 一のハイブリダイゼーション条件下において、該分析物と非修飾形態の該第３核 酸との間のハイブリダイゼーション結合親和性よりも大きく、かつ ｉｉ）該分析物と該第３核酸との間のハイブリダイゼーション速度が、同一の ハイブリダイゼーション条件下において、該分析物と非修飾形態の該第３核酸と の間のハイブリダイゼーション速度よりも大きく、 該第３核酸の該第２ヌクレオチド領域及び該第４核酸の該第１ヌクレオチド領 域の少なくとも１つが該修飾ヌクレオチドを１つ以上含む場合には、 ｉ）該第３核酸と第４核酸との間のハイブリダイゼーション結合親和性が、同 一のハイブリダイゼーション条件下において、非修飾形態の該第３核酸と第４核 酸との間のハイブリダイゼーション結合親和性よりも大きく、かつ ｉｉ）該第３核酸と第４核酸との間のハイブリダイゼーション速度が、同一の ハイブリダイゼーション条件下において、非修飾形態の該第３核酸と第４核酸と の間のハイブリダイゼーション速度よりも大きい工程；並びに ｃ）該分析物とハイブリダイズした該標識プローブを該試料における該分析物 の存在又は量の指標として検出する工程、 を包含する方法。 ２４１．前記プローブ並びに前記第３及び第４核酸の前記ヌクレオチド領域の 少なくとも１つが少なくとも約４個の修飾ヌクレオチドを有するクラスターを１ つ以上含む請求項２４０の方法。 ２４２．前記プローブ並びに前記第３及び第４核酸の前記ヌクレオチド領域の 少なくとも１つが少なくとも約６個の修飾ヌクレオチドを有するクラスターを１ つ以上含む請求項２４０の方法。 ２４３．前記プローブ並びに前記第３及び第４核酸の前記ヌクレオチド領域の 少なくとも１つが少なくとも約８個の修飾ヌクレオチドを有するクラスターを１ つ以上含む請求項２４０の方法。 ２４４．前記プローブ並びに前記第３及び第４核酸の前記ヌクレオチド領域の 少なくとも１つに含まれるヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている請求項 ２４０の方法。 ２４５．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、 ａ）窒素性塩基に対する修飾； ｂ）糖部分に対する修飾； ｃ）リン酸塩部分に対する修飾； ｄ）ヌクレオシド間連結に対する修飾；及び ｅ）ヌクレオチド間連結に対する修飾、 からなる群より選択される修飾を含む請求項２４１の方法。 ２４６．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、 ａ）窒素性塩基に対する修飾； ｂ）糖部分に対する修飾； ｃ）リン酸塩部分に対する修飾； ｄ）ヌクレオシド間連結に対する修飾；及び ｅ）ヌクレオチド間連結に対する修飾、 からなる群より選択される２つの修飾を含む請求項２４１の方法。 ２４７．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、 ａ）アルキル置換； ｂ）アルコキシ置換；及び ｃ）ハロゲン化物置換 からなる群より選択される、リボフラノシル部分に対する２’−修飾を含む請求 項２４１の方法。 ２４８．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つがリボフラノシル部分に対す る２’−Ｏ−メチル置換を含む請求項２４１の方法。 ２４９．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが窒素性塩基に対するプロピ ン置換を含む請求項２４１の方法。 ２５０．前記プロピン置換がシチジン類似体に対するものである請求項２４９ の方法。 ２５１．前記プロピン置換がチミジン類似体に対するものである請求項２４９ の方法。 ２５２．前記プローブ並びに前記第３及び第４核酸の少なくとも１つの前記ヌ クレオチド領域の１つ以上の前記クラスターの前記修飾ヌクレオチドの各々が同 じ修飾を有する請求項２４１の方法。 ２５３．前記修飾がリボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換からな る請求項２５２の方法。 ２５４．前記プローブ及び前記第３核酸の少なくとも１つが１つ以上の結合分 子を含む請求項２４０の方法。 ２５５．前記プローブ及び前記第３核酸の少なくとも１つが１つ以上の結合分 子を含み、かつ該結合分子の少なくとも１つが前記プローブ並びに前記第３及び 第４核酸の少なくとも１つに、前記プローブ並びに前記第３及び第４核酸の少な くとも１つの前記ヌクレオチド領域に含まれる１つ以上の前記クラスターの内に 位置する部位で結合する請求項２４１の方法。 ２５６．前記プローブが約１０ないし約１００個のヌクレオチド塩基からなる オリゴヌクレオチドである請求項２４１の方法。 ２５７．前記プローブが約１０ないし約１５個のヌクレオチド塩基からなるオ リゴヌクレオチドである請求項２４１の方法。 ２５８．前記プローブが約１２ないし約１５個のヌクレオチド塩基からなるオ リゴヌクレオチドである請求項２４１の方法。 ２５９．前記プローブが標識をさらに含む請求項２４１の方法。 ２６０．前記標識が ａ）放射性同位体、 ｂ）酵素、 ｃ）酵素補因子、 ｄ）酵素基質、 ｅ）染料、 ｆ）ハプテン、 ｇ）化学発光分子、 ｈ）蛍光分子、 ｉ）リン光分子、 ｊ）電気化学発光分子 ｋ）発色団、及び ｌ）前記条件の下で前記分析物並びに前記第３及び第４核酸のいずれとも安定 にハイブリダイズすることができないヌクレオチド塩基配列領域、 からなる群より選択される請求項２５９の方法。 ２６１．前記標識が化学発光分子である請求項２６０の方法。 ２６２．電子的に励起したＮ−アクリドンが基底状態に戻る際に前記化学発光 分子により光が放射される請求項２６１の方法。 ２６３．前記化学発光分子がアクリジニウムエステル誘導体である請求項２６ １の方法。 ２６４．前記標識が前記プローブに、前記プローブの前記第１ヌクレオチド領 域に含まれる前記クラスターの１つの内に位置する部位で結合する請求項２５９ の方法。 ２６５．前記分析物がＲＮＡからなる請求項２４１の方法。 ２６６．前記ＲＮＡがｒＲＮＡ又はｔＲＮＡである請求項２６５の方法。 ２６７．前記試料がＤＮＡをさらに含む請求項２６５の方法。 ２６８．前記分析物がＤＮＡからなる請求項２４１の方法。 ２６９．前記第４核酸が固体支持体によって固定化されている請求項２４１又 は２５９のいずれかの方法。 ２７０．第１核酸を含む分析物の存在又は量を、該分析物を含むことが疑われ る試料において検出するための方法であって、 ａ）ｉ）該試料を第２核酸と接触させ、ここで、該第２核酸は選択的ハイブリ ダイゼーション条件下で該分析物の第１ヌクレオチド塩基配列領域に安定にハイ ブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチド塩基配列領域を含み； ｉｉ）該分析物を第３核酸を含むプローブと接触させ、ここで、該プロー ブは選択的ハイブリダイゼーション条件下で該分析物の第２ヌクレオチド塩基配 列領域と安定にハイブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチド塩基配列領域 を含み；かつ ｉｉｉ）該プローブを該第２核酸と接触させ、ここで、該第２核酸は選択 的ハイブリダイゼーション条件下で該プローブの第２ヌクレオチド塩基配列領域 に安定にハイブリダイズすることが可能な第２ヌクレオチド塩基配列領域を含む 工程であって、 該プローブは、該第２核酸が該分析物と安定にハイブリダイズする場合を除い て該分析物及び該第２核酸に安定にハイブリダイズすることができず、 該分析物は該条件下において該プローブの該第２ヌクレオチド領域又は該第２ 核酸の該第２ヌクレオチド領域のいずれにも安定にハイブリダイズすることがで きず、 該プローブは該条件下において該分析物の該第１ヌクレオチド領域又は該第２ 核酸の該第１ヌクレオチド領域のいずれにも安定にハイブリダイズすることがで きず、 該第２核酸は該条件下において該分析物の該第２ヌクレオチド領域又は該プロ ーブの該第１ヌクレオチド領域のいずれにも安定にハイブリダイズすることがで きず、かつ 該プローブ並びに該第２核酸の該ヌクレオチド領域の少なくとも１つは１つ以 上の修飾ヌクレオチドを含む工程； ｂ）工程ａ）の成分を選択的ハイブリダイゼーション条件に処する工程であっ て、それにより、 該プローブの該第１ヌクレオチド領域が該修飾ヌクレオチドを１つ以上含む場 合には、 ｉ）該分析物と該プローブとの間のハイブリダイゼーション結合親和性が、同 一のハイブリダイゼーション条件下において、該分析物と非修飾形態の該プロー ブとの間のハイブリダイゼーション結合親和性よりも大きく、かつ、 ｉｉ）該分析物と該プローブとの間のハイブリダイゼーション速度が、同一の ハイブリダイゼーション条件下において、該分析物と非修飾形態の該プローブと の間のハイブリダイゼーション速度よりも大きく、 該第２核酸の該第１ヌクレオチド領域が該修飾ヌクレオチドを１つ以上含む場 合には、 ｉ）該分析物と該第２核酸との間のハイブリダイゼーション結合親和性が、同 一のハイブリダイゼーション条件下において、該分析物と非修飾形態の該第２核 酸との間のハイブリダイゼーション結合親和性よりも大きく、かつ ｉｉ）該分析物と該第２核酸との間のハイブリダイゼーション速度が、同一の ハイブリダイゼーション条件下において、該分析物と非修飾形態の該第２核酸と の間のハイブリダイゼーション速度よりも大きく、及び 該プローブの該第２ヌクレオチド領域及び該第２核酸の該第２ヌクレオチド領 域の少なくとも１つが該修飾ヌクレオチドを１つ以上含む場合には、 ｉ）該プローブと第２核酸との間のハイブリダイゼーション結合親和性が、同 一のハイブリダイゼーション条件下において、非修飾形態の該プローブと該第２ 核酸との間のハイブリダイゼーション結合親和性よりも大きく、かつ ｉｉ）該プローブと第２核酸との間のハイブリダイゼーション速度が、同一の ハイブリダイゼーション条件下において、非修飾形態の該プローブと第２核酸と の間のハイブリダイゼーション速度よりも大きい工程；並びに ｃ）該分析物とハイブリダイズした該標識プローブを該試料における該分析物 の存在又は量の指標として検出する工程、 を包含する方法。 ２７１．前記プローブ及び前記第２核酸の前記ヌクレオチド領域の少なくとも １つが少なくとも約４個の修飾ヌクレオチドを有するクラスターを１つ以上含む 請求項２７０の方法。 ２７２．前記プローブ及び前記第２核酸の前記ヌクレオチド領域の少なくとも １つが少なくとも約６個の修飾ヌクレオチドを有するクラスターを１つ以上含む 請求項２７０の方法。 ２７３．前記プローブ及び前記第２核酸の前記ヌクレオチド領域の少なくとも １つが少なくとも約８個の修飾ヌクレオチドを有するクラスターを１つ以上含む 請求項２７０の方法。 ２７４．前記プローブ及び前記第２核酸の前記ヌクレオチド領域の少なくとも １つに含まれるヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている請求項２７０の方 法。 ２７５．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、 ａ）窒素性塩基に対する修飾； ｂ）糖部分に対する修飾； ｃ）リン酸塩部分に対する修飾； ｄ）ヌクレオシド間連結に対する修飾；及び ｅ）ヌクレオチド間連結に対する修飾、 からなる群より選択される修飾を含む請求項２７１の方法。 ２７６．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、 ａ）窒素性塩基に対する修飾； ｂ）糖部分に対する修飾； ｃ）リン酸塩部分に対する修飾； ｄ）ヌクレオシド間連結に対する修飾；及び ｅ）ヌクレオチド間連結に対する修飾、 からなる群より選択される２つの修飾を含む請求項２７１の方法。 ２７７．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、 ａ）アルキル置換； ｂ）アルコキシ置換；及び ｃ）ハロゲン化物置換 からなる群より選択される、リボフラノシル部分に対する２’−修飾を含む請求 項２７１の方法。 ２７８．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つがリボフラノシル部分に対す る２’−Ｏ−メチル置換を含む請求項２７１の方法。 ２７９．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが窒素性塩基に対するプロピ ン置換を含む請求項２７１の方法。 ２８０．前記プロピン置換がシチジン類似体に対するものである請求項２７９ の方法。 ２８１．前記プロピン置換がチミジン類似体に対するものである請求項２７９ の方法。 ２８２．前記プローブ及び前記第２核酸の少なくとも１つの前記ヌクレオチド 領域の１つ以上の前記クラスターの前記修飾ヌクレオチドの各々が同じ修飾を有 する請求項２７１の方法。 ２８３．前記修飾がリボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換からな る請求項２８２の方法。 ２８４．前記プローブ及び前記第２核酸の少なくとも１つが１つ以上の結合分 子を含む請求項２７０の方法。 ２８５．前記プローブ及び前記第２核酸の少なくとも１つが１つ以上の結合分 子を含み、かつ該結合分子の少なくとも１つが前記プローブ及び前記第２核酸の 少なくとも１つに、前記プローブ及び前記第２核酸の少なくとも１つの前記ヌク レオチド領域に含まれる１つ以上の前記クラスターの内に位置する部位で結合す る請求項２７１の方法。 ２８６．前記プローブが約１０ないし約１００個のヌクレオチド塩基からなる オリゴヌクレオチドである請求項２７１の方法。 ２８７．前記プローブが約１０ないし約１５個のヌクレオチド塩基からなるオ リゴヌクレオチドである請求項２７１の方法。 ２８８．前記プローブが約１２ないし約１５個のヌクレオチド塩基からなるオ リゴヌクレオチドである請求項２７１の方法。 ２８９．前記プローブが標識をさらに含む請求項２７１の方法。 ２９０．前記標識が ａ）放射性同位体、 ｂ）酵素、 ｃ）酵素補因子、 ｄ）酵素基質、 ｅ）染料、 ｆ）ハプテン、 ｇ）化学発光分子、 ｈ）蛍光分子、 ｉ）リン光分子、 ｊ）電気化学発光分子 ｋ）発色団、及び ｌ）前記条件の下で前記分析物又は前記第２核酸のいずれとも安定にハイブリ ダイズすることができないヌクレオチド塩基配列領域、 からなる群より選択される請求項２８９の方法。 ２９１．前記標識が化学発光分子である請求項２９０の方法。 ２９２．電子的に励起したＮ−アクリドンが基底状態に戻る際に前記化学発光 分子により光が放射される請求項２９１の方法。 ２９３．前記化学発光分子がアクリジニウムエステル誘導体である請求項２９ １の方法。 ２９４．前記標識が前記プローブに、前記プローブの前記第１ヌクレオチド領 域に含まれる前記クラスターの１つの内に位置する部位で結合する請求項２８９ の方法。 ２９５．前記分析物がＲＮＡからなる請求項２７１の方法。 ２９６．前記ＲＮＡがｒＲＮＡ又はｔＲＮＡである請求項２９５の方法。 ２９７．前記試料がＤＮＡをさらに含む請求項２９５の方法。 ２９８．前記分析物がＤＮＡからなる請求項２７１の方法。 ２９９．前記分析物、前記プローブ及び前記第２核酸の少なくとも１つが固体 支持体によって直接又は間接的に固定化されている請求項２７１又は２８９のい ずれかの方法。 ３００．第１核酸を含む分析物の存在又は量を、該分析物を含むことが疑われ る試料において検出するための方法であって、 ａ）ｉ）該試料を第２核酸を含むプローブと接触させ、ここで、該プローブは 選択的ハイブリダイゼーション条件下で該分析物の第１ヌクレオチド塩基配列領 域に安定にハイブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチド塩基配列領域を含 み； ｉｉ）該プローブを第３核酸と接触させ、ここで、該第３核酸は選択的ハ イブリダイゼーション条件下で該プローブの第２ヌクレオチド塩基配列領域に安 定にハイブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチド塩基配列領域を含み；か つ ｉｉｉ）該第３核酸を第４核酸と接触させ、ここで、該第４核酸は選択的 ハイブリダイゼーション条件下で該第３核酸の第２ヌクレオチド塩基配列領域に 安定にハイブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチド塩基配列領域を含む工 程であって、 該分析物は該条件下において該プローブの該第２ヌクレオチド領域並びに第３ 及び第４核酸のいずれにも安定にハイブリダイズすることができず、 該プローブは該条件下において該第３核酸の該第２ヌクレオチド領域又は該第 ４核酸のいずれにも安定にハイブリダイズすることができず、 該第３核酸は該条件下において該プローブの該第１ヌクレオチド領域に安定に ハイブリダイズすることができず、 該第４核酸は該条件下において該第３核酸の該第１ヌクレオチド領域に安定に ハイブリダイズすることができず、かつ 該第３核酸の該第１ヌクレオチド領域は該条件下において該第４核酸に安定に ハイブリダイズすることができない工程； ｂ）工程ａ）の成分を選択的ハイブリダイゼーション条件に処する工程；及び ｃ）該分析物とハイブリダイズした該プローブを該試料における該分析物の存 在又は量の指標として検出する工程、 を包含する方法。 ３０１．前記プローブが標識をさらに含む請求項３００の方法。 ３０２．前記標識が前記プローブに、前記プローブの前記第１ヌクレオチド領 域内に位置する部位で結合する請求項３０１の方法。 ３０３．前記第４核酸が固体支持体によって固定化されている請求項３００又 は３０１のいずれかの方法。 ３０４．第１核酸を含む分析物の存在又は量を、該分析物を含むことが疑われ る試料において検出するための方法であって、 ａ）ｉ）該試料を第２核酸を含むプローブと接触させ、ここで、該プローブは 選択的ハイブリダイゼーション条件下で該分析物の第１ヌクレオチド塩基配列領 域に安定にハイブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチド塩基配列領域を含 み； ｉｉ）該分析物を第３核酸と接触させ、ここで、該第３核酸は選択的ハイ ブリダイゼーション条件下で該分析物の第２ヌクレオチド塩基配列領域に安定に ハイブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチド塩基配列領域を含み；かつ ｉｉｉ）該第３核酸を第４核酸と接触させ、ここで、該第４核酸は選択的 ハイブリダイゼーション条件下で該第３核酸の第２ヌクレオチド塩基配列領域に 安定にハイブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチド塩基配列領域を含む工 程であって、 該分析物は該条件下において該第３核酸の該第２ヌクレオチド領域又は第４核 酸のいずれにも安定にハイブリダイズすることができず、 該プローブは該条件下において該分析物の該第２ヌクレオチド領域並びに該第 ３及び第４核酸のいずれにも安定にハイブリダイズすることができず、かつ 該第３核酸の該第１ヌクレオチド領域は該条件下において該第４核酸に安定に ハイブリダイズすることができない工程； ｂ）工程ａ）の成分を選択的ハイブリダイゼーション条件に処する工程；及び ｃ）該分析物とハイブリダイズした該プローブを該試料における該分析物の存 在又は量の指標として検出する工程、 を包含する方法。 ３０５．前記プローブが標識をさらに含む請求項３０４の方法。 ３０６．前記標識が前記プローブに、前記プローブの前記第１ヌクレオチド領 域内に位置する部位で結合する請求項３０５の方法。 ３０７．前記第４核酸が固体支持体によって固定化されている請求項３０４又 は３０５のいずれかの方法。 ３０８．第１核酸を含む分析物の存在又は量を、該分析物を含むことが疑われ る試料において検出するための方法であって、 ａ）ｉ）該試料を第２核酸を含むプローブと接触させ、ここで、該プローブは 選択的ハイブリダイゼーション条件下で該分析物の第１ヌクレオチド塩基配列領 域に安定にハイブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチド塩基配列領域を含 み； ｉｉ）該分析物を第３核酸と接触させ、ここで、該第３核酸は選択的ハイ ブリダイゼーション条件下で該分析物の第２ヌクレオチド塩基配列領域に安定に ハイブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチド塩基配列領域を含み； ｉｉｉ）該プローブを該第３核酸と接触させ、ここで、該第３核酸は選択 的ハイブリダイゼーション条件下で該プローブの第２ヌクレオチド塩基配列領域 に安定にハイブリダイズすることが可能な第２ヌクレオチド塩基配列領域を含み ；かつ ｉｖ）該第３核酸を第４核酸と接触させ、ここで、該第４核酸は選択的ハ イブリダイゼーション条件下で該第３核酸の第３ヌクレオチド塩基配列領域に安 定にハイブリダイズすることが可能な第１ヌクレオチド塩基配列領域を含む工程 であって、 該分析物は該条件下において該プローブの該第２ヌクレオチド領域、該第３核 酸の該第２及び第３ヌクレオチド領域、並びに該第４核酸のいずれにも安定にハ イブリダイズすることができず、 該プローブは該条件下において該分析物の該第２ヌクレオチド領域、該第３核 酸の該第１及び第３ヌクレオチド領域、並びに該第４核酸のいずれにも安定にハ イブリダイズすることができず、かつ 該第３核酸の該第１及び第２ヌクレオチド領域は該条件下において該第４核酸 に安定にハイブリダイズすることがない工程； ｂ）工程ａ）の成分を選択的ハイブリダイゼーション条件に処する工程；及び ｃ）該分析物とハイブリダイズした該プローブを該試料における該分析物の存 在又は量の指標として検出する工程、 を包含する方法。 ３０９．前記プローブがさらに標識を含む、請求項３０８の方法。 ３１０．前記標識が、前記プローブの前記の第一のヌクレオチド領域内に位置 する部位で、前記プローブと結合する、請求項３０９の方法。 ３１１．前記の第四の核酸が固体支持体により固定されている、請求項３０８ または３０９の方法。 ３１２．第一の核酸を含む分析物（ａｎａｌｙｔｅ）を含むと思われる試料中 の前記分析物の存在または量を検出する方法であって： ａ）次の構成要素を接触させ： ｉ）前記試料と第二の核酸を含むプローブ、ここで前記プローブは 、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、前記分析物の第一のヌクレオチド塩 基配列領域と安定してハイブリダイズできる第一のヌクレオチド塩基配列領域を 含む； ｉｉ）前記プローブと第三の核酸を含む第一の共役する核酸、ここ で前記の第一の共役する核酸は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、前記 プローブの第二のヌクレオチド塩基配列領域と安定してハイブリダイズできる第 一のヌクレオチド塩基配列領域を含む； ｉｉｉ）第四の核酸を含む第二の共役する核酸と第五の核酸、ここ で第五の核酸は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、前記の第二の共役す る核酸の第一のヌクレオチド塩基配列領域と安定してハイブリダイズできる第一 のヌクレオチド塩基配列領域を含む；および、また別に、 （ａ）前記の第一の共役する核酸と前記の第二の共役する核酸、 ここで前記の第二の共役する核酸は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、 前記の第一の共役する核酸の第二のヌクレオチド塩基配列領域と安定してハイブ リダイズできる第二のヌクレオチド塩基配列領域を含む；または （ｂ）前記の第一および第二の共役する核酸以外の、１つまたは それ以上の所望の共役する核酸、ここで前記の所望の共役する核酸はそれぞれ、 選択的ハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも２つの他の共役する核酸と 安定してハイブリダイスでき、前記の他の共役する核酸の少なくとも１つは、前 記の第一および第二の共役する核酸の少なくとも１つであってもよく、そして前 記の他の共役する核酸のそれぞれは、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、 前記 プローブおよび前記の第五の核酸と直接または間接的に結合する、 ここで前記分析物は、前記条件下で、前記プローブの前記の第二の ヌクレオチド領域、前記の第一および第二の共役する核酸、前記の第五の核酸お よび前記の所望の共役する核酸全てのいずれとも安定してハイブリダイズできず 、 前記プローブは、前記条件下で、前記の第一の共役する核酸の前記 の第二の領域、前記の第二の共役する核酸、前記の第五の核酸、および前記の所 望の共役する核酸全てのいずれとも安定してハイブリダイズできず、 前記の第五の核酸は、前記条件下で、前記の第一の共役する核酸、 前記の第二の共役する核酸の前記の第二のヌクレオチド領域、および前記の所望 の共役する核酸全てのいずれとも安定してハイブリダイズできず、 前記の第一の共役する核酸は、前記条件下で、前記の第二の共役す る核酸の前記の第一のヌクレオチド領域と安定してハイブリダイズできず、そし て 前記の第二の共役する核酸は、前記条件下で、前記の第一の共役す る核酸の前記の第一のヌクレオチド領域と安定してハイブリダイズすることがで きない； ｂ）段階ａ）の構成要素を選択的ハイブリダイゼーション条件にさ らし；そして ｃ）前記分析物とハイブリダイズした前記プローブを検出し、前記 試料中の前記分析物の存在または量の指標とする 段階を含む前記方法。 ３１３．前記プローブが標識を含む、請求項３１２の方法。 ３１４．前記標識が、前記プローブの前記の第一のヌクレオチド領域内に位置 する部位で、前記プローブと結合している、請求項３１３の方法。 ３１５．前記の第五の核酸が固体支持体により固定されている、請求項３１２ または３１３の方法。 ３１６．第一の核酸を含む分析物を含むと思われる試料中の前記分析物の存在 または量を検出する方法であって： ａ）次の構成要素を接触させ： ｉ）前記試料と第二の核酸を含むプローブ、ここで前記プローブは 、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、前記分析物の第一のヌクレオチド塩 基配列領域と安定してハイブリダイズできる第一のヌクレオチド塩基配列領域を 含む； ｉｉ）前記分析物と第三の核酸を含む第一の共役する核酸、ここで 前記の第一の共役する核酸は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、前記分 析物の第二のヌクレオチド塩基配列領域と安定してハイブリダイズできる第一の ヌクレオチド塩基配列領域を含む； ｉｉｉ）第四の核酸を含む第二の共役する核酸と第五の核酸、ここ で前記の第五の核酸は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、前記の第二の 共役する核酸の第一のヌクレオチド塩基配列領域と安定してハイブリダイズでき る第一のヌクレオチド塩基配列領域を含む；および、また別に、 （ａ）前記の第一の共役する核酸と前記の第二の共役する核酸、 ここで前記の第二の共役する核酸は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、 前記の第一の共役する核酸の第二のヌクレオチド塩基配列領域と安定してハイブ リダイズできる第二のヌクレオチド塩基配列領域を含む；または （ｂ）前記の第一および第二の共役する核酸以外の、１つまたは それ以上の所望の共役する核酸、ここで前記の所望の共役する核酸はそれぞれ、 選択的ハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも２つの他の共役する核酸と 安定してハイブリダイスでき、前記の他の共役する核酸の少なくとも１つは、前 記の第一および第二の共役する核酸の少なくとも１つであってもよく、そして前 記の他の共役する核酸のそれぞれは、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、 前記プローブおよび前記の第五の核酸と直接または間接的に結合する、 ここで前記分析物は、前記条件下で、前記の第一の共役する核酸の 前記の第二のヌクレオチド領域、前記の第二の共役する核酸、前記の第五の核酸 、および前記の所望の共役する核酸全てのいずれとも安定してハイブリダイズで きず、 前記プローブは、前記条件下で、前記分析物の前記の第二のヌクレ オチド領域、前記の第一および第二の共役する核酸、前記の第五の核酸、および 前記の所望の共役する核酸全てのいずれとも安定してハイブリダイズできず、 前記の第五の核酸は、前記条件下で、前記の第一の共役する核酸、 前記の第二の共役する核酸の前記の第二のヌクレオチド領域、および前記の所望 の共役する核酸全てのいずれとも安定してハイブリダイズできず、 前記の第一の共役する核酸は、前記条件下で、前記の第二の共役す る核酸の前記の第一のヌクレオチド領域と安定してハイブリダイズできず、そし て 前記の第二の共役する核酸は、前記条件下で、前記の第一の共役す る核酸の前記の第一のヌクレオチド領域と安定してハイブリダイズすることがで きない； ｂ）段階ａ）の構成要素を選択的ハイブリダイゼーション条件にさ らし；そして ｃ）前記分析物とハイブリダイズした前記プローブを検出し、前記 試料中の前記分析物の存在または量の指標とする 段階を含む前記方法。 ３１７．前記プローブがさらに標識を含む、請求項３１６の方法。 ３１８．前記標識が、前記プローブの前記の第一のヌクレオチド領域内に位置 する部位で、前記プローブと結合している、請求項３１７の方法。 ３１９．前記の第五の核酸が固体支持体により固定されている、請求項３１６ または３１７の方法。 ３２０．第一の核酸を含む分析物を含むと思われる試料中の前記分析物の存在 または量を検出する方法であって： ａ）次の構成要素を接触させ： ｉ）前記試料と第二の核酸を含むプローブ、ここで前記プローブは 、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、前記分析物の第一のヌクレオチド塩 基配列領域と安定してハイブリダイズできる第一のヌクレオチド塩基配列領域を 含む； ｉｉ）前記プローブと第三の核酸を含む第一の共役する核酸、ここ で前記の第一の共役する核酸は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、前記 プ ローブの第二のヌクレオチド塩基配列領域と安定してハイブリダイズできる第一 のヌクレオチド塩基配列領域を含む； ｉｉｉ）前記分析物と前記の第一の共役する核酸、ここで前記の第 一の共役する核酸は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、前記分析物の第 二のヌクレオチド塩基配列領域と安定してハイブリダイズできる第二のヌクレオ チド塩基配列領域を含む； ｉｖ）第四の核酸を含む第二の共役する核酸と第五の核酸、ここで 前記の第五の核酸は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、前記の第二の共 役する核酸の第一のヌクレオチド塩基配列領域と安定してハイブリダイズできる 第一のヌクレオチド塩基配列領域を含む；および、また別に、 （ａ）前記の第一の共役する核酸と前記の第二の共役する核酸、こ こで前記の第二の共役する核酸は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、前 記の第一の共役する核酸の第三のヌクレオチド塩基配列領域と安定してハイブリ ダイズできる第二のヌクレオチド塩基配列領域を含む；または （ｂ）前記の第一および第二の共役する核酸以外の、１つまたはそ れ以上の所望の共役する核酸、ここで前記の所望の共役する核酸はそれぞれ、選 択的ハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも２つの他の共役する核酸と安 定してハイブリダイスでき、前記の他の共役する核酸の少なくとも１つは、前記 の第一のおよび第二の共役する核酸の少なくとも１つであってもよく、そして前 記の他の共役する核酸のそれぞれは、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、 前記プローブおよび前記の第五の核酸と直接または間接的に結合する、 ここで前記分析物は、前記条件下で、前記プローブの前記の第二の ヌクレオチド領域、前記の第一の共役する核酸の前記の第一および第三のヌクレ オチド領域、前記の第二の共役する核酸、前記の第五の核酸、および前記の所望 の共役する核酸全てのいずれとも安定してハイブリダイズできず、 前記プローブは、前記条件下で、前記分析物の前記の第二のヌクレ オチド領域、前記の第一の共役する核酸の前記の第二および第三のヌクレオチド 領域、前記の第二の共役する核酸、前記の第五の核酸、および前記の所望の共役 する核酸全てのいずれとも安定してハイブリダイズできず、 前記の第五の核酸は、前記の第一の共役する核酸、前記の第二の共 役する核酸の前記の第二のヌクレオチド領域、および前記の所望の共役する核酸 全てのいずれとも安定してハイブリダイズできず、 前記の第一の共役する核酸は、前記条件下で、前記の第二の共役す る核酸の前記の第二のヌクレオチド領域と安定してハイブリダイズできず、そし て 前記の第二の共役する核酸は、前記の第一の共役する核酸の前記の 第一または第二のヌクレオチド領域どちらとも安定して結合することができない ； ｂ）段階ａ）の構成要素を選択的ハイブリダイゼーション条件にさ らし；そして ｃ）前記分析物とハイブリダイズした前記プローブを検出し、前記 試料中の前記分析物の存在または量の指標とする 段階を含む前記方法。 ３２１．前記プローブがさらに標識を含む、請求項３２０の方法。 ３２２．前記標識が、前記プローブの前記の第一のヌクレオチド領域内に位置 する部位で、前記プローブと結合している、請求項３２１の方法。 ３２３．前記の第五の核酸が固体支持体により固定されている、請求項３２０ または３２１の方法。 ３２４．第一の核酸を含む標的を増幅する方法であって： ａ）前記標的を含むと思われる試料を第二の核酸と接触させ、ここ で前記の第二の核酸は、増幅条件下で、前記標的の第一のヌクレオチド塩基配列 領域と安定してハイブリダイズできる第一のヌクレオチド塩基配列領域を含み、 そして、前記の第二の核酸の前記の第一のヌクレオチド領域は１つまたはそれ以 上の修飾ヌクレオチドを含む； ｂ）段階ａ）の構成要素を ｉ）前記標的および前記の第二の核酸間のハイブリダイゼーション 結合親和性が、前記標的および前記の第二の核酸の未修飾型間のハイブリダイゼ ーション結合親和性よりも大であり、 ｉｉ）前記標的および前記の第二の核酸間のハイブリダイゼーショ ン速度が、前記標的および前記の第二の核酸の未修飾型間のハイブリダイゼーシ ョン速度よりも大である ように前記増幅条件にさらし；そして ｃ）段階ａ）の構成要素を前記増幅条件下でインキュベートし、前 記標的が増幅されるようにする 段階を含む方法。 ３２５．前記の第二の核酸の前記の第一のヌクレオチド領域が、少なくとも約 ４つの修飾ヌクレオチドの集団を１つまたはそれ以上含む、請求項３２４の方法 。 ３２６．前記の第二の核酸の前記の第一のヌクレオチド領域が、少なくとも約 ６つの修飾ヌクレオチドの集団を１つまたはそれ以上含む、請求項３２４の方法 。 ３２７．前記の第二の核酸の前記の第一のヌクレオチド領域が、少なくとも約 ８つの修飾ヌクレオチドの集団を１つまたはそれ以上含む、請求項３２４の方法 。 ３２８．前記の第二の核酸の前記の第一のヌクレオチド領域中に含まれる、実 質的に全てのヌクレオチドが修飾されている、請求項３２４の方法。 ３２９．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが： ａ）窒素性塩基への修飾； ｂ）糖部分への修飾； ｃ）リン酸部分への修飾； ｄ）ヌクレオシド間結合への修飾；および ｅ）ヌクレオチド間結合への修飾 からなる群より選択される修飾を１つ含む、請求項３２５の方法。 ３３０．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが： ａ）窒素性塩基への修飾； ｂ）糖部分への修飾； ｃ）リン酸部分への修飾； ｄ）ヌクレオシド間結合への修飾；および ｅ）ヌクレオチド間結合への修飾 からなる群より選択される修飾を２つ含む、請求項３２５の方法。 ３３１．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが： ａ）アルキル置換； ｂ）アルコキシ置換；および ｃ）ハロゲン化置換 からなる群より選択される、リボフラノシル部分への２'修飾を含む、請求項３ ２５の方法。 ３３２．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、リボフラノシル部分への ２'-O-メチル置換を含む、請求項３２５の方法。 ３３３．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、窒素性塩基部分へのプロ ピン置換を含む、請求項３２５の方法。 ３３４．前記プロピン置換がシチジン類似体（analog）へのものである、請求 項３３３の方法。 ３３５．前記プロピン置換がチミジン類似体へのものである、請求項３３３の 方法。 ３３６．前記の第二の核酸の前記の第一のヌクレオチド領域の、１つまたはそ れ以上の前記集団の前記修飾ヌクレオチドのそれぞれが、同じ修飾を含む、請求 項３２５の方法。 ３３７．前記修飾がリボフラノシル部分への２'-O-メチル置換からなる、請求 項３３６の方法。 ３３８．前記の第二の核酸が１つまたはそれ以上の結合体分子を含む、請求項 ３２４の方法。 ３３９．前記の第二の核酸が、１つまたはそれ以上の結合体分子を含み、そし て前記結合体分子の少なくとも１つが、前記の第二の核酸の前記の第一のヌクレ オチド領域中に含まれる、１つまたはそれ以上の前記集団内に位置する部位で、 前記の第二の核酸と結合している、請求項３２５の方法。 ３４０．前記接触段階がさらに、前記の第二の核酸をヌクレオチド三リン酸お よび少なくとも１つの核酸ポリメラーゼと接触させることを含む、請求項３２５ の方法。 ３４１．前記の第二の核酸が、少なくとも１つの前記ポリメラーゼにより、３ '末端に付加されたヌクレオチド塩基を有することが可能である、請求項３４０ の方法。 ３４２．前記接触段階がさらに、前記標的を第三の核酸と接触させることを含 む、請求項３２５または３４１の方法であって、前記の第三の核酸は、選択的ハ イブリダイゼーション条件下で、前記標的の第二のヌクレオチド塩基配列領域と 安定してハイブリダイズできる第一のヌクレオチド塩基配列領域を含み、 前記の第二の核酸は、前記ハイブリダイゼーション条件下で、前記 標的の前記の第二のヌクレオチド領域または前記の第三の核酸のどちらとも安定 してハイブリダイズできず、そして 前記の第三の核酸は、前記条件下で、前記標的の前記の第一のヌク レオチド領域と安定してハイブリダイズできない、 前記方法。 ３４３．前記条件下で、前記の第三の核酸および前記標的間の安定したハイブ リッド形成が、前記標的の増幅を減少させ、または妨げる、請求項３４２の方法 。 ３４４．前記標的の前記の第一および第二のヌクレオチド領域が、実質的に同 じヌクレオチド領域を構成する、請求項３４２の方法。 ３４５．前記の第三の核酸の前記の第一のヌクレオチド領域が、１つまたはそ れ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項３４２の方法。 ３４６．前記の第三の核酸の前記の第一のヌクレオチド領域が、少なくとも約 ４つの修飾ヌクレオチドの集団を１つまたはそれ以上含む、請求項３４２の方法 。 ３４７．前記の第三の核酸の前記の第一のヌクレオチド領域中に含まれる、実 質的に全てのヌクレオチドが修飾されている、請求項３４２の方法。 ３４８．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、リボフラノシル部分への ２'-O-メチル置換を含む、請求項３４７の方法。 ３４９．１つまたはそれ以上の前記集団の前記修飾ヌクレオチドのそれぞれが 。同じ修飾を含む、請求項３４７の方法。 ３５０．前記修飾がリボフラノシル部分への２'-O-メチル置換からなる、請求 項３４９の方法。 ３５１．前記の第二および第三の核酸の少なくとも１つが、１つまたはそれ以 上の結合体分子を含む、請求項３４２の方法。 ３５２．前記の第二および第三の核酸の少なくとも１つが、１つまたはそれ以 上の結合体分子を含み、そして前記結合体分子の少なくとも１つが、前記の第二 の核酸の前記の第一のヌクレオチド領域、および前記の第三の核酸の前記の第一 のヌクレオチド領域の少なくとも１つの中に含まれる、１つまたはそれ以上の前 記集団内に位置する部位で、前記の第二および第三の核酸の少なくとも１つと結 合している、請求項３４６の方法。 ３５３．前記の第二の核酸が、前記条件下で、前記標的と安定してハイブリダ イズできない５'ヌクレオチド塩基配列領域を含む、請求項３４２の方法。 ３５４．前記標的および前記の第二および第三の核酸のいずれも、直接または 間接的に、固体支持体により固定されている、請求項３５３の方法。 ３５５．核酸分析物を含んでいると思われる試料中の前記分析物の存在または 量の検出に使用する核酸プローブを含むキットであって、前記プローブが選択的 ハイブリダイゼーション条件下で、前記分析物の第一のヌクレオチド塩基配列領 域と安定してハイブリダイズできる第一のヌクレオチド塩基配列領域を含み、そ して前記プローブの前記の第一のヌクレオチド領域が、少なくとも約４つの修飾 ヌクレオチド塩基を含む、 ａ）前記条件下で、前記分析物および前記プローブ間のハイブリダ イゼーション結合親和性が、前記分析物および前記プローブの未修飾型間のハイ ブリダイゼーション結合親和性より大であり、 ｂ）前記条件下で、前記分析物および前記プローブ間のハイブリダ イゼーション速度が、前記分析物および前記プローブの未修飾型間のハイブリダ イゼーション速度より大である ような前記キット。 ３５６．前記プローブの前記の第一のヌクレオチド領域が、少なくとも約６つ の修飾ヌクレオチドの集団を１つまたはそれ以上含む、請求項３５５のキット。 ３５７．前記プローブの前記の第一のヌクレオチド領域が、少なくとも約８つ の修飾ヌクレオチドの集団を１つまたはそれ以上含む、請求項３５５のキット。 ３５８．前記プローブの前記の第一のヌクレオチド領域中に含まれる、実質的 に全てのヌクレオチドが修飾されている、請求項３５５のキット。 ３５９．前記修飾ヌクレオチド塩基の少なくとも１つが： ａ）窒素性塩基への修飾； ｂ）糖部分への修飾； ｃ）リン酸部分への修飾； ｄ）ヌクレオシド間結合への修飾；および ｅ）ヌクレオチド間結合部分への修飾 からなる群より選択される修飾を１つ含む、請求項３５５のキット。 ３６０．前記修飾ヌクレオチド塩基の少なくとも１つが： ａ）窒素性塩基への修飾； ｂ）糖部分への修飾； ｃ）リン酸部分への修飾； ｄ）ヌクレオチド間結合への修飾；および ｅ）ヌクレオチド間結合部分への修飾 からなる群より選択される修飾を２つ含む、請求項３５５のキット。 ３６１．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが： ａ）アルキル置換； ｂ）アルコキシ置換；および ｃ）ハロゲン化置換 からなる群より選択される、リボフラノシル部分への２'修飾を含む、請求項３ ５５のキット。 ３６２．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、リボフラノシル部分への ２'-O-メチル置換を含む、請求項３５５のキット。 ３６３．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、窒素性塩基部分へのプロ ピン置換を含む、請求項３５５のキット。 ３６４．前記プロピン置換がシチジン類似体へのものである、請求項３６３の キット。 ３６５．前記プロピン置換がチミジン類似体へのものである、請求項３６３の キット。 ３６６．前記プローブが１つまたはそれ以上の結合体分子を含み、そして前記 結合体分子の少なくとも１つが、前記プローブの前記の第一のヌクレオチド領域 中に含まれる１つまたはそれ以上の前記集団内に位置する部位で、前記プローブ と結合している、請求項３５５のキット。 ３６７．前記プローブが約１０から約１００ヌクレオチドからなる、請求項３ ５５のキット。 ３６８．前記プローブが約１０から約１５ヌクレオチドからなる、請求項３５ ５のキット。 ３６９．前記プローブが約１２から約１５ヌクレオチドからなる、請求項３５ ５のキット。 ３７０．前記プローブがさらに標識を含む、請求項３５５のキット。 ３７１．前記標識が： ａ）放射性同位元素、 ｂ）酵素、 ｃ）酵素補因子、 ｄ）酵素基質、 ｅ）色素、 ｆ）ハプテン、 ｇ）化学発光分子、 ｈ）蛍光化学発光分子、 ｉ）りん光分子、 ｊ）電気化学発光分子、 ｋ）発色団、および ｌ）前記条件下で、前記分析物と安定してハイブリダイズできない 塩基配列領域 からなる群より選択される、請求項３７０のキット。 ３７２．前記標識が化学発光分子である、請求項３７１のキット。 ３７３．電子的に励起したN-アクリドーン（N-acridone）が基底状態に戻る際 、前記化学発光分子から光が放出される、請求項３７２のキット。 ３７４．前記標識が、アクリジニウムエステル誘導体である、請求項３７２の キット。 ３７５．さらに固体支持体を含む、請求項３５５または３７０のキット。 ３７６．前記プローブが、前記固体支持体により、直接または間接的に固定さ れている、請求項３７５のキット。 ３７７．さらに１つまたはそれ以上の核酸コントロールを含む、請求項３５５ または３７０のキット。 ３７８．さらに１つまたはそれ以上のハイブリダイゼーション試薬を含む、請 求項３５５または３７０のキット。 ３７９．第二の核酸を含む分析物を含むと思われる試料中の前記分析物を増幅 できる第一の核酸を含むキットであって、前記の第一の核酸が、増幅条件下で、 前記分析物の第二のヌクレオチド塩基配列と安定してハイブリダイズできる第一 のヌクレオチド塩基配列を含み、前記の第一の核酸の前記の第一のヌクレオチド 領域が、少なくとも約４つの修飾ヌクレオチドを含む、 ａ）前記条件下で、前記分析物および前記の第一の核酸間のハイブ リダイゼーション親和性が、前記分析物および前記の第一の核酸の未修飾型間の ハイブリダイゼーション親和性よりも大であり、 ｂ）前記条件下で、前記分析物および前記の第一の核酸間のハイブ リダイゼーション速度が、前記分析物および前記の第一の核酸の未修飾型間のハ イブリダイゼーション速度よりも大である ような前記キット。 ３８０．前記の第一の核酸の前記の第一のヌクレオチド領域が、少なくとも約 ６つの修飾ヌクレオチドの集団を１つまたはそれ以上含む、請求項３７９のキッ ト。 ３８１．前記の第一の核酸の前記の第一のヌクレオチド領域が、少なくとも約 ８つの修飾ヌクレオチドの集団を１つまたはそれ以上含む、請求項３７９のキッ ト。 ３８２．前記の第一の核酸の前記の第一のヌクレオチド領域中に含まれる、実 質的に全てのヌクレオチドが修飾されている、請求項３７９のキット。 ３８３．前記修飾ヌクレオチド塩基の少なくとも１つが： ａ）窒素性塩基への修飾； ｂ）糖部分への修飾； ｃ）リン酸部分への修飾； ｄ）ヌクレオシド間結合への修飾；および ｅ）ヌクレオチド間結合部分への修飾 からなる群より選択される修飾を１つ含む、請求項３７９のキット。 ３８４．前記修飾ヌクレオチド塩基の少なくとも１つが： ａ）窒素性塩基への修飾； ｂ）糖部分への修飾； ｃ）リン酸部分への修飾； ｄ）ヌクレオシド間結合への修飾；および ｅ）ヌクレオチド間結合部分への修飾 からなる群より選択される修飾を２つ含む、請求項３７９のキット。 ３８５．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが： ａ）アルキル置換； ｂ）アルコキシ置換；および ｃ）ハロゲン化置換 からなる群より選択される、リボフラノシル部分への２'修飾を含む、請求項３ ７９のキット。 ３８６．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、リボフラノシル部分への ２'-O-メチル置換を含む、請求項３７９のキット。 ３８７．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、窒素性塩基へのプロピン 置換を含む、請求項３７９のキット。 ３８８．前記プロピン置換がシチジン類似体へのものである、請求項３８７の キット。 ３８９．前記プロピン置換がチミジン類似体へのものである、請求項３８７の キット。 ３９０．前記の第一の核酸がさらに１つまたはそれ以上の結合体分子を含み、 そして前記結合体分子が、前記の第一の核酸の前記の第一のヌクレオチド領域中 に含まれる１つまたはそれ以上の前記集団内に位置する部位で、前記の第一の核 酸と結合する、請求項３７９のキット。 ３９１．さらに固体支持体を含む、請求項３７９のキット。 ３９２．前記の第一の核酸が、前記固体支持体により、直接または間接的に固 定されている、請求項３９１のキット。 ３９３．さらに、ヌクレオチド三リン酸および少なくとも１つの核酸ポリメラ ーゼを含む、請求項３９２のキット。 ３９４．前記の第一の核酸が、少なくとも１つの前記の核酸ポリメラーゼによ り、３'末端に付加されるヌクレオチド塩基を有することが可能である、請求項 ３９３のキット。 ３９５．さらに１つまたはそれ以上の増幅試薬を含む、請求項３７９のキット 。 ３９６．さらに第三の核酸を含む請求項３７９のキットであって、前記分析物 が選択的ハイブリダイゼーション条件下で、前記の第三の核酸と安定してハイブ リダイズできるように、前記の第三の核酸が、前記分析物の第二のヌクレオチド 塩基配列領域と安定してハイブリダイズできる第一のヌクレオチド塩基配列領域 を含み、 前記の第一のオリゴヌクレオチドが、前記ハイブリダイゼーション 条件下で、前記分析物の前記の第二のヌクレオチド領域または前記の第三の核酸 のいずれとも安定してハイブリダイズできず、 前記の第三の核酸が、前記ハイブリダイゼーション条件下で、前記 分析物の前記の第一のヌクレオチド領域と安定してハイブリダイズできない 前記キット。 ３９７．前記条件下での、前記の第三の核酸および前記分析物間の安定したハ イブリッドの形成が、前記分析物の増幅を減少させ、または妨げる、請求項３９ ６のキット。 ３９８．前記分析物の前記の第一および第二のヌクレオチド領域が、実質的に 同じヌクレオチド領域を構成する、請求項３９６のキット。 ３９９．さらに１つまたはそれ以上のハイブリダイゼーション試薬を含む、請 求項３９６のキット。 ４００．少なくとも約４つの修飾ヌクレオチドの集団を１つまたはそれ以上含 むヌクレオチド塩基配列領域を含む核酸プローブであって、前記ヌクレオチド領 域中に含まれる前記集団の１つの中に位置する部位で、前記プローブと結合する 標識を少なくとも１つ含む、前記プローブ。 ４０１．前記プローブの前記ヌクレオチド領域が、少なくとも約６つの修飾ヌ クレオチドの集団を１つまたはそれ以上含む、請求項４００のプローブ。 ４０２．前記プローブの前記ヌクレオチド領域が、少なくとも約８つの修飾ヌ クレオチドの集団を１つまたはそれ以上含む、請求項４００のプローブ。 ４０３．前記プローブの前記ヌクレオチド領域中に含まれる、実質的に全ての ヌクレオチドが修飾されている、請求項４００のプローブ。 ４０４．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが： ａ）窒素性塩基への修飾； ｂ）糖部分への修飾； ｃ）リン酸部分への修飾； ｄ）ヌクレオシド間結合への修飾；および ｅ）ヌクレオチド間結合への修飾 からなる群より選択される修飾を１つ含む、請求項４００のプローブ。 ４０５．前記修飾ヌクレオチド塩基の少なくとも１つが： ａ）窒素性塩基への修飾； ｂ）糖部分への修飾； ｃ）リン酸部分への修飾； ｄ）ヌクレオシド間結合への修飾；および ｅ）ヌクレオチド間結合への修飾 からなる群より選択される修飾を２つ含む、請求項４００のプローブ。 ４０６．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが： ａ）アルキル置換； ｂ）アルコキシ置換；および ｃ）ハロゲン化置換 からなる群より選択される、リボフラノシル部分への２'修飾を含む、請求項４ ００のプローブ。 ４０７．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、リボフラノシル部分への ２'-O-メチル置換を含む、請求項４００のプローブ。 ４０８．前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、窒素性塩基へのプロピン 置換を含む、請求項４００のプローブ。 ４０９．前記プロピン置換がシチジン類似体へのものである、請求項４０８の プローブ。 ４１０．前記プロピン置換がチミジン類似体へのものである、請求項４０８の プローブ。 ４１１．１つまたはそれ以上の前記集団の、前記修飾ヌクレオチドのそれぞれ が、同じ修飾を含む、請求項４００のプローブ。 ４１２．前記修飾がリボフラノシル部分への２'-O-メチル置換からなる、請求 項４１１のプローブ。 ４１３．前記プローブが、１つまたはそれ以上の結合体分子を含み、そして前 記結合体分子の少なくとも１つが、前記プローブの前記ヌクレオチド領域中に含 まれる１つまたはそれ以上の前記集団内に位置する部位で、前記プローブと結合 している、請求項４００のプローブ。 ４１４．前記プローブが約１０から約１００ヌクレオチド塩基からなるオリゴ ヌクレオチドである、請求項４００のプローブ。 ４１５．前記プローブが約１０から約１５ヌクレオチド塩基からなるオリゴヌ クレオチドである、請求項４００のプローブ。 ４１６．前記プローブが約１２から約１５ヌクレオチド塩基からなるオリゴヌ クレオチドである、請求項４００のプローブ。 ４１７．前記プローブがさらに標識を含む、請求項４００のプローブ。 ４１８．前記標識が： ａ）放射性同位元素、 ｂ）酵素、 ｃ）酵素補因子、 ｄ）酵素基質、 ｅ）色素、 ｆ）ハプテン、 ｇ）化学発光分子、 ｈ）蛍光化学発光分子、 ｉ）りん光分子、 ｊ）電気化学発光分子、 ｋ）発色団、および ｌ）前記条件下で、前記分析物と安定してハイブリダイズできない ヌクレオチド塩基配列領域 からなる群より選択される、請求項４１７のプローブ。 ４１９．前記標識が化学発光分子である、請求項４１８のプローブ。 ４２０．電子的に励起したN-アクリドーンが基底状態に戻る際、前記化学発光 分子から光が放出される、請求項４１９のプローブ。 ４２１．前記化学発光分子が、アクリジニウムエステル誘導体である、請求項 ４１９のプローブ。