ES2427853T3 - Procedimiento para detectar cáncer de próstata en una muestra - Google Patents
Procedimiento para detectar cáncer de próstata en una muestra Download PDFInfo
- Publication number
- ES2427853T3 ES2427853T3 ES04709177T ES04709177T ES2427853T3 ES 2427853 T3 ES2427853 T3 ES 2427853T3 ES 04709177 T ES04709177 T ES 04709177T ES 04709177 T ES04709177 T ES 04709177T ES 2427853 T3 ES2427853 T3 ES 2427853T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- prostate
- nucleic acid
- pca3
- specific
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 194
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 140
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 138
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 217
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 166
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 166
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 138
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 138
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 119
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims abstract description 105
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 60
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 108091033411 PCA3 Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 38
- 210000005267 prostate cell Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 28
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 26
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 222
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 76
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 claims description 52
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 47
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 44
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 38
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 38
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 38
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 37
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 36
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 24
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 23
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 17
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 16
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 16
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 claims description 13
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 claims description 13
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 claims description 13
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 claims description 13
- 108091036255 PCGEM1 Proteins 0.000 claims description 13
- 102100038103 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 4 Human genes 0.000 claims description 13
- 108010058716 transglutaminase 4 Proteins 0.000 claims description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 12
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 12
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 8
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 8
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims description 8
- 101710176220 Kallikrein-2 Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 239000000049 pigment Substances 0.000 claims description 3
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 claims description 2
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 claims description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 2
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000057032 Tissue Kallikreins Human genes 0.000 claims 4
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 claims 4
- 208000003837 Second Primary Neoplasms Diseases 0.000 abstract 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 102
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 75
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 64
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 63
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 16
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 15
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 15
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 13
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 102100038356 Kallikrein-2 Human genes 0.000 description 11
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 101000605528 Homo sapiens Kallikrein-2 Proteins 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 9
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 8
- -1 ribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 206010004446 Benign prostatic hyperplasia Diseases 0.000 description 7
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 7
- 208000004403 Prostatic Hyperplasia Diseases 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 7
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 5
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 4
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 4
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000003066 decision tree Methods 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 239000006226 wash reagent Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- KWADUASJUMATIK-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-x-rhodamine n-succinimidyl ester Chemical compound C1=C(C=2C3=CC=4CCCN5CCCC(C=45)=C3OC3=C4C5=[N+](CCC4)CCCC5=CC3=2)C(C(=O)[O-])=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O KWADUASJUMATIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein succinimidyl ester Chemical compound C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- 229920000178 Acrylic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000004925 Acrylic resin Substances 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 206010050662 Prostate infection Diseases 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000028391 RNA cap binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000106 RNA cap binding Proteins 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000220259 Raphanus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 206010046555 Urinary retention Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O acridine;hydron Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3[NH+]=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical group 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000013188 needle biopsy Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007826 nucleic acid assay Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000000505 pernicious effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- JFINOWIINSTUNY-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-3-ylmethanesulfonamide Chemical compound NS(=O)(=O)CC1CCNC1 JFINOWIINSTUNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000000545 stagnation point adsorption reflectometry Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 108010057210 telomerase RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Un procedimiento in vitro para detectar cáncer de próstata en una muestra de orina de un paciente humano, quecomprende: (a) realizar un ensayo de amplificación del ARN in vitro con dicha muestra que comprende al menos una célula depróstata o extracto de ácido nucleico de la misma, usando un primer par de cebadores específico de una secuenciade ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata; (b) realizar un segundo ensayo de amplificación del ARN in vitro con dicha muestra que comprende al menos unacélula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma, usando un segundo par de cebadores específico de unasegunda secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata; y (c) detectar dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata y dicha secuencia de ácidonucleico específica de la próstata; en el que la detección de dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata o unincremento del nivel del mismo en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales secorrelaciona con un riesgo de desarrollar cáncer de próstata o una presencia de cáncer de próstata en dichopaciente; y en el que una ausencia de detección de dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer depróstata o detección de un menor nivel del mismo en comparación con la cantidad presente en las muestras controlnormales y la detección de dicha segunda secuencia de ácido nucleico específica de próstata se correlaciona conuna ausencia de cáncer de próstata o un menor riesgo de desarrollar el mismo.
Description
Procedimiento para detectar cáncer de próstata en una muestra
La presente invención se refiere a cáncer de próstata. Más específicamente, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para detectar cáncer de próstata en una muestra de un paciente detectando un ARN codificado por el gen PCA3 del antígeno de cáncer de próstata.
Durante la última década, el cáncer de próstata se ha convertido en la neoplasia maligna diagnosticada con más frecuencia en varones y la segunda causa más importante de muerte por cáncer en varones de la población
15 occidental, tras el cáncer de pulmón.
La detección y el tratamiento tempranos del cáncer de próstata antes de que se haya propagado desde la glándula prostática reducen la mortalidad de la enfermedad. Esto es especialmente cierto para varones jóvenes, que tienen mayor riesgo de morir por esta neoplasia maligna perniciosa pero de crecimiento lento. Esta comprensión ha estimulado los intentos cada vez mayores de realizar un diagnóstico y tratamiento tempranos. De hecho, la Sociedad Americana del Cáncer y la Asociación Americana de Urología recomiendan que la población masculina en general se someta a una prueba de cribado anual para cáncer de próstata comenzando a los 50 años de edad. La edad recomendada para el cribado se reduce a los 40 años para varones con antecedentes familiares de cáncer de próstata u otros factores de riesgo.
25 Con este interés creciente en el cribado del cáncer de próstata, se están examinando de manera rutinaria más varones que nunca antes en busca de cáncer de próstata. No es sorprendente que esta práctica haya incrementado la detección temprana del inicio de la enfermedad, tal como se refleja por un incremento evidente de la incidencia del cáncer de próstata y una disminución de la edad media aparente de diagnóstico. La esperanza clínica es que la detección temprana del cáncer de próstata antes de que exista metástasis reducirá la tasa de mortalidad global. Los contribuyentes de la asistencia sanitaria desean el cribado y la detección tempranos para que esto se traduzca en una reducción de la carga de la asistencia sanitaria, ya que el tratamiento temprano puede ser menos radical, más eficaz y por lo tanto, proporcionarse a un coste menor por cada paciente tratado. La clave para llevar a cabo este objetivo sigue siendo proporcionar mejores herramientas para el diagnóstico diferencial.
35 El cribado del cáncer de próstata implica actualmente tanto la palpación de la próstata mediante tacto rectal (TR) como el análisis de los niveles plasmáticos del antígeno específico de próstata (PSA/hK3/hKLK3). El PSA es una serín proteasa producida por el epitelio prostático que se secreta normalmente en el líquido seminal para licuarlo. La alteración de la integridad anatómica de la glándula prostática puede afectar a las barreras celulares que limitan normalmente el PSA al interior del sistema de conductos de la próstata, lo que permite que se disperse a la sangre o la orina. Varias afecciones pueden dar como resultado el escape del PSA a la sangre. Estas incluyen la inflamación de la próstata, retención urinaria, infección de la próstata, hiperplasia prostática benigna (HPB) y cáncer de próstata. La manipulación física de la próstata también puede incrementar los niveles séricos de PSA, pero un estímulo suave, tal como un tacto rectal (TR), normalmente no incrementa los niveles de PSA sérico. Por lo tanto no es
45 sorprendente que el cribado del PSA sérico como indicador del cáncer de próstata no tenga un valor predictivo absoluto.
A pesar del hecho de que la medida de los niveles sanguíneos de PSA puede ser el resultado de una diversidad de causas diferentes, aun así es la base del cribado primario del cáncer de próstata. La determinación del PSA total (tPSA) como ensayo diagnóstico para predecir el cáncer de próstata se lleva utilizando desde 1991. Niveles de 4 ng/ml o mayores en suero sanguíneo se consideran anormales y con valor pronóstico de cáncer de próstata. Sin embargo, la sensibilidad de tales niveles elevados de tPSA es solamente del 79%; por lo que se deja sin detectar un 21% de pacientes con cáncer de próstata. La especificidad para todos los valores de tPSA de 4 ng/ml o más es muy escasa. Además, se ha informado que las estimaciones de la especificidad para niveles de tPSA > 4,0 ng/ml están
55 en el intervalo del 20% al 59%, con una media de alrededor del 33%. La gran mayoría de falsos positivos se demuestra finalmente que son hiperplasias prostáticas benignas (HPB). La especificidad es la más baja para el tPSA moderadamente elevado, en la denominada zona gris de 4 a 10 ng/ml. Este nivel bajo de especificidad da como resultado otros procedimientos de diagnóstico más invasivos y costosos, tales como ultrasonido transrectal y biopsias de próstata. Tales pruebas son innecesarias, además de muy traumáticas para el paciente. Tampoco se debería subestimar el impacto psicológico de haber recibido un diagnóstico positivo hasta que se demuestra que es un falso positivo. En consecuencia, se han realizado esfuerzos para mejorar la sensibilidad de la detección de PSA, como investigar otras fuentes de muestras, por ejemplo eyaculados o lavados uretrales inmediatamente después de la eyaculación (Clements y col., T. Urol. 161 (199), 1337-1343).
65 Debido a las desventajas del tPSA, la investigación se ha centrado en intentar desarrollar derivados de PSA para incrementar la sensibilidad y la especificidad de esta aproximación de diagnóstico general.
Una modificación es el PSA libre (fPSA), que fue aprobado por la FDA en 1998. El PSA en el suero se puede hallar sin unir o en forma de complejo con inhibidores de proteasas circulantes, de manera más habitual con la alfa-1antitripsina (ACT). Los médicos han demostrado que la proporción de PSA unido a ACT era significativamente
5 mayor en varones con cáncer de próstata que en varones sin afectación, o en aquellos con HPB. Como guía, si el 25% o menos del PSA total está libre, esto es un indicador de un posible cáncer de próstata. El análisis del fPSA se aprobó para el uso en varones con niveles de tPSA de 4 a 10 ng/ml. Así, el análisis de fPSA se situó para mejorar la especificidad respecto a la del tPSA solo. Sin embargo, la capacidad de predicción del análisis de fPSA no es tan buena en personas con niveles de tPSA realmente bajos o realmente altos. El tPSA muy bajo, independientemente del fPSA medido, tiene valor predictivo de no tener cáncer, mientras lo contrario es cierto con niveles muy elevados de tPSA. La utilidad diagnóstica del fPSA es relativamente limitada, ya que puede estar asociada a la HPB o al cáncer de próstata. Se ha demostrado que el uso de fPSA en combinación con tPSA reduce el número de biopsias innecesarias en alrededor de un 20%.
15 Claramente, la biopsia de próstata es el método de referencia para confirmar el cáncer de próstata. Sin embargo, incluso una biopsia no es segura al 100%. El método de referencia es la biopsia sextante, en la que la recogida de muestras de tejido se guía mediante ultrasonido transrectal. Seis muestras no suelen ser suficientes para detectar el cáncer y es necesario un segundo procedimiento de biopsia o más de seis muestras.
A pesar de las mejoras en el cribado del cáncer de próstata que han surgido en los últimos diez años, sigue existiendo una gran necesidad insatisfecha en cuanto a la sensibilidad y la especificidad del diagnóstico, incluso cuando estas herramientas se usan en combinación. Uniendo esto a la gran incidencia del cáncer de próstata y a la importancia de una detección temprana y precisa, la potencial utilidad de una auténtica herramienta de diagnóstico diferencial es muy significativa.
25 Hace unos años se descubrió un nuevo marcador de cáncer de próstata, PCA3, mediante un análisis de expresión diferencial destinado a destacar los genes asociados al desarrollo de cáncer de próstata (véase, por ejemplo, el documento WO 98/45420). El PCA3 se localiza en el cromosoma 9 y está compuesto por cuatro exones. Codifica al menos cuatro tránscritos diferentes que se generan mediante corte y empalme alternativo y poliadenilación. Mediante análisis RT-PCR, se descubrió que la expresión de PCA3 se limitaba a la próstata y no existía en ninguno de los demás tejidos analizados, entre los que se incluyen testículos, ovarios, mamas y vejiga. El análisis de transferencia de tipo Northern demostró que PCA3 se expresa de manera elevada en la gran mayoría de cánceres de próstata examinados (47 de 50), mientras que no se detecta expresión, o se detecta una expresión muy baja, en la HPB o en las células de próstata normales de los mismos pacientes [Cancer Res 1 de diciembre de 1999; 59 (23):
35 5975-9]. Además, un estudio reciente en el que se compara el rendimiento clínico de la ARN telomerasa RT y la detección de ARN de PCA3 en el caso del cáncer de próstata demostró que el gen de PCA3 se puede considerar un marcador mejor (Cancer Res 1 de mayo de 2002; 62 (9): 2695-8).
El gen de PCA3 está compuesto por 4 exones (e1-e4) y 3 intrones (i1-i3). Aunque parece reconocerse al PCA3 como el mejor marcador de cáncer de próstata identificado hasta ahora, esta especificidad se ha rebatido en la bibliografía. Por ejemplo, Gandini y col., 2003, reivindican que la expresión específica de próstata de PCA3 se limita a la del exón 4 del gen de PCA3. No obstante, los solicitantes han demostrado en una solicitud de patente reciente que este no es el caso (solicitud de patente CA 2.432.365).
45 A la vista del hecho de que el cáncer de próstata avanzado sigue siendo una enfermedad potencialmente mortal que afecta a una proporción muy significativa de la población masculina, sigue existiendo la necesidad de proporcionar procedimientos y kits para detección del cáncer de próstata más específicos, selectivos y rápidos.
La presente divulgación busca satisfacer estas y otras necesidades.
La presente invención se refiere a las formas de realización según se definen en las reivindicaciones. Se divulgan procedimientos de diagnóstico y kits para detectar el cáncer de próstata que sean más específicos y selectivos que
55 los procedimientos y kits de la técnica anterior.
La presente divulgación se refiere a un procedimiento para detectar cáncer de próstata en un paciente y especialmente en una muestra de orina del mismo detectando un ARN codificado por el gen PCA3.
La divulgación también se refiere a un procedimiento para diagnosticar la presencia o la predisposición a desarrollar cáncer de próstata en un paciente. También se divulga un procedimiento para monitorizar la progresión del cáncer de próstata en un paciente.
En una realización concreta, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para detectar cáncer de próstata
65 en muestras de orina detectando la presencia de ARN codificado por el gen PCA3. En una realización, el ARN codificado por el gen PCA3 se detecta usando un procedimiento de amplificación que amplifica de forma simultánea una segunda secuencia de ácido nucleico específica de la próstata también contenida en la muestra.
Específicamente, la invención se refiere a un procedimiento in vitro para la detección de cáncer de próstata en una muestra de orina de un paciente humano, que comprende: 5
- (a)
- realizar un ensayo de amplificación del ARN in vitro con dicha muestra que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma usando un primer par de cebadores específico de una secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata;
- (b)
- realizar un segundo ensayo de amplificación del ARN in vitro con dicha muestra que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma usando un segundo par de cebadores específico de una segunda secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata; y
(c) detectar dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata y dicha secuencia de ácido 15 nucleico específica de la próstata;
en el que la detección de dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata o un mayor nivel de la misma en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales se correlaciona con un riesgo de desarrollar cáncer de próstata o una presencia de cáncer de próstata en dicho paciente; y en el que una ausencia de detección de dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata o la detección de un nivel más bajo de la misma en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales y la detección de dicha segunda secuencia de ácido nucleico específica de cáncer de próstata se correlaciona con una ausencia de cáncer de próstata o un menor riesgo de desarrollar el mismo.
25 En una realización concreta adicional divulgada en el presente documento, el segundo marcador específico de próstata amplificado se selecciona del grupo que consiste en ARNm de PSA, calicreína 2 humana (hK2/KLK2), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), transglutaminasa 4, fosfatasa ácida o ARN de PCGEM1.
En otra realización divulgada en el presente documento, el ARN se detecta usando un procedimiento de amplificación del ARN. En una realización adicional, el procedimiento de amplificación del ARN está acoplado a detección en tiempo real de los productos amplificados usando sondas específicas de fluorescencia. En una realización adicional más, el procedimiento de amplificación es PCR. En una realización adicional, la PCR es PCR en tiempo real o un procedimiento relacionado que permite una detección en tiempo real de los productos amplificados.
35 Por tanto, la invención también está dirigida a un procedimiento de amplificación de ARN in vitro para determinar una predisposición a desarrollar cáncer de próstata o una presencia de cáncer de próstata en un paciente, que comprende:
(a) poner en contacto una muestra de orina de dicho paciente que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma con al menos un oligonucleótido que hibrida con un ARNm de PCA3 específico de cáncer de próstata seleccionado del grupo que consiste en:
(i) un polinucleótido de acuerdo con las SEC ID Nº 9, 10 o 13. 45
(ii) una secuencia de polinucleótido que hibrida en condiciones de rigurosidad elevada con la secuencia de polinucleótidos de (i); y
(iii) una secuencia de polinucleótidos completamente complementaria a la de (i) o (ii);
(b) poner en contacto dicha muestra de orina de dicho paciente que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma con al menos un oligonucleótido que hibrida con un segundo ARNm específico de próstata;
55 (c) detectar en dicha muestra de orina la cantidad de dicho PCA3 y dichos segundos polinucleótidos específicos de próstata; y
(d) comparar la cantidad de dicho polinucleótido de PCA3 que hibrida con el oligonucleótido con un valor de corte predeterminado, validando dicha detección de PCA3 con dicha detección de dichos segundos polinucleótidos específicos de próstata y de este modo, determinar la presencia o ausencia de cáncer de próstata en la muestra de orina o extracto de la misma.
La invención se refiere además a un procedimiento in vitro de monitorizar una variación en el tiempo en el nivel de un ARNm de PCA3 asociado con cáncer de próstata en un paciente, que comprende:
(a) poner en contacto una muestra de orina de dicho paciente que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma con al menos un oligonucleótido que hibrida con dicho ARNm de PCA3 asociado con el cáncer de próstata seleccionado del grupo que consiste en:
(i) un polinucleótido de acuerdo con las SEC ID Nº 9, 10 o 13.
5
(ii) una secuencia de polinucleótidos que hibrida en condiciones de rigurosidad elevada con la secuencia de nucleótidos de (i); y
(iii) una secuencia de polinucleótidos completamente complementaria a la de (i) o (ii);
(b) poner en contacto dicha muestra de orina de dicho paciente que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma con al menos un oligonucleótido que hibrida con un segundo ARNm específico de próstata;
15 (c) detectar en dicha muestra de orina las cantidades de dicho ARNm de PCA3 y dicho segundo ARNm específico de próstata;
- (d)
- repetir las etapas (a) y (b) usando una muestra de orina del paciente que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma del paciente en un punto de tiempo posterior; y
- (e)
- comparar la cantidad de dicho ARNm de PCA3 detectado en la etapa (d) con la cantidad de ARNm de PCA3 detectado en la etapa (c) y de este modo monitorizar la variación en el tiempo en el nivel de dicho ARNm de PCA3 asociado con el cáncer de próstata en el paciente,
25 en el que una ausencia de detección de dicho ARNm de PCA3 se valida mediante la detección de dicho ARNm de PCA3 específico de próstata en dicha muestra de orina.
En una realización relacionada, el ARN codificado por el gen de PCA3 se detecta en un extracto de ácido nucleico mediante un procedimiento de amplificación de ARN in vitro denominado Amplificación Basada en Ácido Nucleico (NASBA). Por supuesto, se conocen otros procedimientos de amplificación de ARN y los presentes procedimientos y kits presentes no se limitan a la NASBA. Ejemplos no limitantes de tales procedimientos de amplificación de ARN incluyen la amplificación mediada por transcriptasa (TMA), la amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) y la reacción en cadena de la ligasa (LCR).
35 En una realización adicional, los productos amplificados se detectan en una fase homogénea mediante el uso de una sonda fluorescente. En una realización, se usa el abordaje con balizas moleculares. En otra realización, el producto se detecta en fase sólida mediante el uso de un procedimiento fluorescente o colorimétrico. Por tanto, debe entenderse que se pueden usar numerosos procedimientos fluorescentes, colorimétricos o enzimáticos de acuerdo con la presente divulgación para detectar y/o cuantificar los ARN. También se pueden usar otros tipos de sondas y cebadores marcados u otros tipos de procedimientos de detección de acuerdo con la presente divulgación (por ejemplo, ensayos de hibridación tales como transferencias de tipo Northern, transferencias de manchas o transferencias de ranuras y sondas y cebadores marcados radiactivamente).
En una realización, el ARN codificado por el gen PCA3 se obtiene de una célula contenida en una muestra de orina 45 evacuada del paciente.
En otra realización, la muestra de orina se obtiene después de un tacto rectal (TR). Por supuesto, se debería entender que los presentes procedimientos y kits también se podrían usar con una muestra de orina obtenida sin tacto rectal o en otros tipos de muestras tales como esperma u orina y esperma mezclados (por ejemplo, primera muestra de orina tras una eyaculación), con tal de que el procedimiento de amplificación y/o el procedimiento de detección sean lo suficientemente sensibles como para detectar los marcadores seleccionados como objetivo (PCA3 y el segundo marcador). Los experimentos demostraron que los procedimientos y kits descritos en el presente documento también se pueden llevar a cabo con estos tipos de muestras. Otras muestras que se pueden usar incluyen sangre o suero.
55 En una realización, las células recogidas de la muestra de orina se recolectan y se lleva a cabo una extracción de ácido nucleico total. En una realización concreta, la extracción de ácido nucleico total se lleva a cabo usando un procedimiento de bandas en fase sólida con esferas de sílice como describieron BOOM y col., (1990, J. Clin. Microbiol. 28: 495-503). En otra realización, los ácidos nucleicos se purifican usando otro procedimiento de captura del objetivo (véase más adelante). Por supuesto, se debería entender que existen numerosos procedimientos de extracción y purificación de ácidos nucleicos y por tanto, que se podrían usar otros procedimientos de acuerdo con la presente divulgación. Ejemplos no limitantes incluyen un procedimiento de extracción con fenol/cloroformo y el procedimiento de purificación por captura del objetivo (véase más adelante). Se describen otros procedimientos de este tipo en los libros de texto a los que se hace referencia en el presente documento. También debe reconocerse
65 que en la técnica se conocen bien numerosos procedimientos para estabilizar o proteger las células de próstata contenidas en la muestra de orina o en otra muestra, así como para estabilizar o proteger el ARN presente en estas células.
En otra realización, los procedimientos de la presente divulgación se llevan a cabo usando una muestra en bruto, no purificada o semipurificada.
5 En una realización concreta, la presente divulgación también se refiere a un kit de diagnóstico de cáncer de próstata para detectar la presencia de ácido nucleico de PCA3 en una muestra. Este kit generalmente comprende un primer medio contenedor que tiene dispuesta en el mismo al menos una sonda oligonucleotídica y/o cebador que hibrida con un ácido nucleico de PCA3 (por ejemplo, ARN de PCA3) y un segundo medio contenedor que contiene al menos otro cebador oligonucleotídico y/o sonda que hibrida con la segunda secuencia específica de próstata mencionada anteriormente. En otra realización, un tercer medio contenedor contiene una sonda que hibrida específicamente con el producto de amplificación de PCA3. En una realización preferida, el kit además incluye otros contenderos que comprenden componentes adicionales tales como un oligonucleótido o un cebador adicional y/o uno o más de los siguientes: tampones, reactivos a usar en el ensayo (por ejemplo, reactivos de lavado, polimerasas, controles
15 internos (CI) u otros) y reactivos capaces de detectar la presencia de una o más sondas de ácido nucleico /cebadores. Por supuesto, son posibles numerosas realizaciones de los kits divulgados en el presente documento. Por ejemplo, los diferentes medios contenedores se pueden dividir en reactivos de amplificación y reactivos de detección. En una realización de este tipo, un primer medio contenedor contiene reactivos de amplificación o de hibridación específicos de los ácidos nucleicos diana divulgados en el presente documento (por ejemplo, PCA 3, segundos ácidos nucleicos específicos de próstata y de control interno) y el segundo medio contenedor contiene reactivos de detección. Como alternativa, los reactivos de detección y los reactivos de amplificación pueden estar contenidos en el mismo medio contenedor.
De acuerdo con esto, la invención abarca el uso de un kit para evaluar la presencia de cáncer de próstata en un
25 paciente o evaluar el riesgo de dicho paciente de desarrollar dicho cáncer analizando una muestra de orina de dicho paciente, en el que dicho kit comprende:
- (a)
- un primer par de cebadores para amplificar el ARNm de PCA3 específico de cáncer de próstata asociado con el cáncer de próstata de dicha muestra que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma;
- (b)
- un segundo de cebadores para amplificar un segundo ARNm específico de cáncer de próstata; y
(c) reactivos que permiten una detección de dicho PCA3 y dichos segundos productos de amplificación del ácido 35 nucleico específico de próstata cuando está presente dicho PCA3 y/o dicho ARNm específico de próstata,
en el que dicho uso permite una correlación de una detección de dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata o un mayor nivel de la misma en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales se correlaciona con un riesgo de desarrollar cáncer de próstata o una presencia de cáncer de próstata en dicho paciente; y una correlación de una ausencia de detección de dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 o la detección de un nivel más bajo de la misma en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales y la detección de dicha segunda secuencia de ácido nucleico específica de cáncer de próstata con una ausencia de cáncer de próstata o un menor riesgo de desarrollar el mismo.
45 La invención abarca además el uso de un kit de diagnóstico para la detección de cáncer de próstata en un paciente
- o evaluar el riesgo de dicho paciente de desarrollar dicho cáncer analizando una muestra de orina de dicho paciente, en el que dicho kit de diagnóstico comprende:
- (a)
- al menos un contenedor que tiene dispuesto en el mismo al menos una sonda oligonucleotídica o cebador que hibrida con un ARNm de PCA3 específico de cáncer de próstata de dicha muestra seleccionado del grupo que consiste en:
- (i)
- una secuencia de polinucleótidos de PCA3 de acuerdo con las SEC ID Nº 9, 10 o 13.
55 (ii) una secuencia de polinucleótidos que es completamente complementaria a la de (i); y
(iii) una secuencia de polinucleótidos que hibrida en condiciones de rigurosidad elevada con (i) o (ii);
- (b)
- al menos una sonda oligonucleotídica o cebador que hibrida con un segundo ARNm específico de próstata o complementario del mismo de dicha muestra; y
- (c)
- reactivos que permiten una detección de dicho ARNm de PCA3 y de dicho segundo ARNm específico de próstata cuando está presente dicho ARNm de PCA3 y/o dicho ARNm específico de próstata,
65 en el que una ausencia de detección de dicho ARNm de PCA3 o detección de un menor nivel del mismo en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales y una presencia de dicho segundo ARNm específico de próstata valida una ausencia de cáncer de próstata o un menor riesgo de desarrollar el mismo en dicho paciente.
La presente divulgación se refiere además a un kit de diagnóstico de cáncer de próstata para detectar la presencia
5 de ácido nucleico de PCA3 en una muestra. Este kit generalmente comprende un primer medio contenedor que tiene dispuesta en el mismo al menos una sonda oligonucleotídica y/o cebador que hibrida con un ARNm de PCA3 y un segundo medio contenedor que contiene al menos otro cebador oligonucleotídico y/o sonda que hibrida con el ARNm de la segunda secuencia específica de próstata. En otra realización, un tercer medio contenedor contiene una sonda que hibrida específicamente con el producto de amplificación de PCA3. En otra realización más, un cuarto medio contenedor contiene una sonda que hibrida específicamente con el segundo ARNm específico de próstata. En una realización preferida, el kit además incluye otros contenedores que comprenden componentes adicionales tales como un oligonucleótido o un cebador adicional (por ejemplo, para control interno) y/o uno o más de los siguientes: tampones, reactivos a usar en el ensayo (por ejemplo, reactivos de lavado, polimerasas, ácido nucleico control interno o células u otros) y reactivos capaces de detectar la presencia de una o más
15 sondas/cebadores de ácido nucleico unido. Por supuesto, la separación o ensamblaje de los reactivos en el mismo o diferente medio contenedor está dirigida por los tipos de procedimientos de extracción, amplificación o hibridación y los procedimientos de detección usados, así como por otros parámetros, incluidos estabilidad, necesidad de conservación etc.
La presente divulgación abarca múltiples procedimientos y kits. Por ejemplo, la detección y/o amplificación de la secuencia de ácido nucleico de PCA3 no tiene que ser idéntica a la del segundo polinucleótido específico de próstata u otras secuencias objetivo. Por tanto, por ejemplo, un procedimiento o kit que se basara en ARN para PCA3 podría basarse en ADN para el segundo marcador de próstata o para otras secuencias objetivo.
25 Un experto en la técnica debería entender que se pueden usar numerosos métodos estadísticos en el contexto de la presente divulgación para determinar si el ensayo es positivo o negativo. El árbol de decisión usado es solo un ejemplo no limitante de dicho método estadístico.
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos y la nomenclatura usados en el presente documento tienen el mismo significado que un experto en la técnica a la que la presente divulgación pertenece entiende habitualmente. Las definiciones entendidas habitualmente de términos de biología molecular se pueden hallar, por ejemplo, en el Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2ª ed. (Singleton y col., 1994, John Wiley & Sons, Nueva York, NY) o The Harper Collins Dictionary of Biology (Hale & Marham, 1991, Harper Perennial, Nueva York, NY), Rieger y col., Glossary of genetics: Classical and molecular, 5ª edición, Springer-Verlag, Nueva
35 York, 1991; Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 4ª edición, Garland Science, Nueva York, 2002; y Lewin, Genes VII, Oxford University Press, Nueva York, 2000. En general, los procedimientos de biología molecular y similares son procedimientos habituales usados en la técnica. Tales técnicas convencionales se pueden hallar en manuales de referencia tales como, por ejemplo, Sambrook y col. (2000, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratories); y Ausubel y col. (1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New-York).
En la presente descripción se usan ampliamente una serie de términos. Con el fin de proporcionar una comprensión clara y coherente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluido el alcance a dar a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones.
Las secuencias de nucleótidos se presentan en el presente documento mediante una sola hebra en dirección 5’ a 3’, de izquierda a derecha, usando los símbolos de nucleótidos de una letra como se usan habitualmente en la técnica y de acuerdo con las recomendaciones de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB.
La presente descripción se refiere a una serie de términos de tecnología de ADN recombinante (ADNr) usados de forma rutinaria. No obstante, a efectos de claridad y de consistencia se proporcionan definiciones de determinados ejemplos de dichos términos de ADNr.
55 Como se usa en el presente documento, “molécula de ácido nucleico” o “polinucleótidos” hace referencia un polímero de nucleótidos. Ejemplos no limitantes de la misma incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, ADN genómico, ADNc), de ARN (por ejemplo, ARNm) y quimeras de los mismos. La molécula de ácido nucleico se puede obtener mediante técnicas de clonación o se pueden sintetizar. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario (hebra codificante o hebra no codificante [antisentido]). El ácido ribonucleico (ARN) y el ácido desoxirribonucleico (ADN) convencionales se incluyen en la expresión “ácido nucleico” y los polinucleótidos son análogos de los mismos. Una estructura de ácido nucleico puede comprender varios enlaces conocidos en la técnica, incluidos uno o más de enlaces azúcar-fosfodiéster, enlaces péptido-ácido nucleico (denominados “ácidos nucleicos peptídicos" (PNA); Hydig-Hielsen y col., publicación internacional de PCR WO 95/32305), enlaces fosforotioato, enlaces
65 metilfosfonato o combinaciones de los mismos. Los restos de azúcar del ácido nucleico pueden ser ribosa o desoxirribosa o compuestos similares que tienen sustituciones conocidas, por ejemplo sustituciones 2’-metoxi (que
contienen un resto 2’-O-metilribofuranosilo; véase PCT nº WO 98/02582) y/o sustituciones de haluro en 2’. Las bases nitrogenadas pueden ser bases convencionales (A, G, C, T, U), análogos conocidos de las mismas (por ejemplo, inosina u otras; véase The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams y col., ed., 11th ed., 1992), o derivados conocidos de bases púricas o pirimidínicas (véase, Cook, publicación internacional de PCT WO 93/13121) 5 o residuos “abásicos” en los que la estructura incluye bases no nitrogenadas de uno o más residuos (Arnold y col., patente de EE.UU. nº 5,585,481). Un ácido nucleico puede comprender únicamente azúcares convencionales, bases y enlaces, como se encuentran en el ARN y el ADN, o pueden incluir componentes y sustituciones convencionales (por ejemplo, bases convencionales unidas mediante una estructura metoxi, o un ácido nucleico que incluye bases convencionales y uno o más análogos de bases). La terminología “ácido nucleico de PCA3” o “polinucleótidos de
10 PCA3” hace referencia a una secuencia de ácido nucleico de PCA3 nativo. En una realización, el ácido nucleico de PCA3 tiene la secuencia establecida en las SEC ID Nº 9, 10 y 13. En otra realización, el ácido nucleico de PCA3 codifica una proteína PCA3. En una realización adicional, el ácido nucleico de PCA3 es una secuencia de ácido nucleico no codificante. En otra realización más, la secuencia de PCA3 a la que están dirigidas las secuencias de PCA3 abarcadas por la presente invención es una secuencia de PCA3 natural hallada en una muestra de paciente.
15 La expresión “ADN recombinante” como se conoce en la técnica hace referencia a una molécula de ADN resultante del conjunto de segmentos de ADN. Normalmente, a esto se le denomina ingeniería genética. Lo mismo es cierto para “ácido nucleico recombinante”.
20 La expresión “segmento de ADN” se usa en el presente documento para hacer referencia una molécula que comprende un tramo lineal o secuencia de nucleótidos. Esta secuencia, cuando se lee de acuerdo con el código genético (por ejemplo, un marco de lectura abierto u ORD) puede codificar un tramo o secuencia lineal de aminoácidos a la que se puede hacer referencia como polipéptido, proteína, fragmento de proteína y similares.
25 La terminología, “par de amplificación” o “par de cebadores” hace referencia en el presente documento a un par de oligonucleótidos (oligos) de la presente invención, que se seleccionan para usar juntos en la amplificación de una secuencia determinada de ácido nucleico mediante uno de una serie de tipos de procedimientos de amplificación.
“Amplificación” se refiere a cualquier procedimiento in vitro para obtener múltiples copias (“amplicones”) de una
30 secuencia de ácido nucleico diana o su complementaria o fragmentos de la misma. Amplificación in vitro hace referencia a la producción de un ácido nucleico amplificado que puede contener menos que la secuencia de la región diana completa o su complementaria. Los procedimientos de amplificación in vitro conocidos incluyen, por ejemplo, amplificación mediada por transcripción, amplificación mediada por replicasa, amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación mediante reacción en cadena de la ligasa (LCR) y
35 amplificación por desplazamiento de hebra (SDA). La amplificación mediada por replicasa usa moléculas de ARN autorreplicantes y una replicasa tal como la Qβ-replicase (p.ej., Kramer y col., patente de EE.UU. nº 4.786.600). La amplificación por PCR es bien conocida y usa ADN polimerasa, cebadores y ciclado térmico para sintetizar múltiples copias de las dos hebras complementarias de ADN o ADNc (por ejemplo, Mullis y col., las patentes de EE.UU. nº 4.683.195, nº 4.683.202 y nº 4.800.159). La amplificación por LCR usa al menos cuatro oligonucleótidos distintos
40 para amplificar una diana y su hebra complementaria usando múltiples ciclos de hibridación, ligación y desnaturalización (por ejemplo, publicación de la solicitud de patente EP nº 0320308). La SDA es un procedimiento en el que un cebador contiene un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción que permite que la endonucleasa haga una muesca en una hebra de un ADN dúplex hemimodificado que incluye la secuencia diana, seguido de amplificación en una serie de etapas de desplazamiento de hebra y extensión por cebador (por ejemplo,
45 Walker y col., patente de EE.UU. nº 5.422.252). Otro procedimiento de amplificación por desplazamiento de hebra conocido no requiere la rotura por la endonucleasa (Dattagupta y col., patente de EE.UU. nº 6.087.133). La amplificación mediada por transcripción se usa en la presente divulgación. Los expertos en la técnica entenderán que las secuencias de cebadores oligonucleotídicos divulgadas en el presente documento pueden usarse fácilmente en cualquier procedimiento de amplificación in vitro basado en la extensión del cebador mediante una polimerasa
50 (véanse, en general, Kwoh y col., 1990, Am. Biotechnol. Lab. 8:14-25 y Kwoh y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177; Lizardi y col., 1988, BioTechnology 6:1197-1202; Malek y col., 1994, Methods Mol. Biol., 28:253-260; y Sambrook y col., 2000, Molecular Cloning -A Laboratory Manual, Third Edition, CSH Laboratories). Como se conoce habitualmente en la técnica, los oligos están diseñados para unirse a una secuencia complementaria en condiciones seleccionadas.
55 Como se usa en el presente documento, la expresión “fisiológicamente relevante” quiere decir que describe interacciones que pueden modular una función que es fisiológicamente relevante. La presente divulgación abarca, por ejemplo, la transcripción de un gen en su entorno natural. Por supuesto, una unión de una proteína a PCA3 también se puede considerar una función fisiológicamente relevante si esta unión se produce en un entorno natural.
60 La expresión molécula o secuencia de "ADN" (así como, en ocasiones, el término "oligonucleótido") hace referencia a una molécula comprendida generalmente por los desoxirribonucleótidos adenina (A), guanina (G), timina (T) y/o citosina (C). En el "ARN”, T está sustituido por uracilo (U). Como se usa en el presente documento, secuencias concretas de ADN o ARN pueden describirse de acuerdo con el consenso normal de proporcionar únicamente la
65 secuencia en la dirección 5’ a 3’.
Electroforesis en gel de agarosa. La técnica utilizada más habitualmente (aunque no la única) para el fraccionamiento de ADN bicatenario es la electroforesis en gel de agarosa. El principio de este procedimiento es que las moléculas de ADN migran a través del gel como si fuera un tamiz que retrasa el movimiento de las moléculas más grandes en mayor medida y el movimiento de las moléculas más pequeñas en menor medida. Obsérvese que
5 cuanto menor es el fragmento de ADN, mayor es la movilidad en la electroforesis en el gel de agarosa.
Los fragmentos de ADN fraccionados mediante la electroforesis en gel de agarosa se pueden visualizar directamente mediante un procedimiento de tinción si el número de fragmentos incluidos en el patrón es pequeño. Para visualizar un grupo pequeño de estos fragmentos, se puede aplicar una metodología denominada procedimiento de hibridación (por ejemplo, hibridación de tipo Southern).
“Hibridación de ácido nucleico” se refiere en general a la hibridación de dos moléculas de ácido nucleico monocatenarias que tienen secuencias de bases complementarias que, en las condiciones adecuadas, formarán una estructura bicatenaria favorecida termodinámicamente. Ejemplos de condiciones de hibridación se pueden 15 encontrar en los dos manuales de laboratorio a los que se ha hecho referencia anteriormente (Sambrook y col., 2000, ant. y Ausubel y col., 1994, ant.) y son conocidas habitualmente en la técnica. En este caso de una hibridación en un filtro de nitrocelulosa (o un soporte de este tipo como nylon), como, por ejemplo, en el bien conocido procedimiento de transferencia de tipo Southern, un filtro de nitrocelulosa se puede incubar durante la noche a 65°C con una sonda marcada en una solución que contiene niveles altos de sales (6 x SSC o 5 x SSPE), 5 x solución de Denhardt, 0,5% de SDS y 100 μg/ml de ADN transportador desnaturalizado (p.ej., ADN de esperma de salmón). La sonda de unión inespecífica se puede lavar del filtro mediante varios lavados en 0,2 x SSC/0,1% de SDS a una temperatura que se selecciona a la vista de la rigurosidad deseada: temperatura ambiental (baja rigurosidad), 42ºC (rigurosidad moderada) o 65ºC (rigurosidad alta). La concentración de sal y SDS de las soluciones de lavado también se pueden ajustar para acomodarla a la rigurosidad deseada. La temperatura seleccionada y la
25 concentración de sal se basa en la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de ADN. Por supuesto, los híbridos de ARN-ADN también se pueden formar y detectar. En estos casos, las condiciones de hibridación y lavado se pueden adaptar de acuerdo con procedimientos bien conocidos por el experto en la técnica. Preferentemente se usarán condiciones rigurosas (Sambrook y col., 2000, ant.). También se pueden usar otros protocolos o kits de hibridación disponibles comercialmente (por ejemplo, ExpressHyb™ de BD Biosciences Clonetech) usando diferentes soluciones de hibridación y lavado como es bien conocido en la técnica.
Con una "sonda" se quiere incluir un oligómero de ácido nucleico que hibrida específicamente con una secuencia objetivo en un ácido nucleico o su complementaria en condiciones que estimulan la hibridación, de modo que se permite la detección de la secuencia objetivo o de su ácido nucleico amplificado. La detección puede ser directa (es
35 decir, resultante de una sonda que hibrida directamente con la secuencia objetivo o amplificada) o indirecta (es decir, resultante de una sonda que hibrida con una estructura molecular intermedia que une la sonda a la secuencia objetivo o amplificada). Generalmente, un “objetivo” de una sonda hace referencia a una secuencia dentro de una secuencia de ácido nucleico amplificada (es decir, un subconjunto de la secuencia amplificada) que hibrida específicamente con al menos una porción de la secuencia de la sonda mediante puentes de hidrógeno convencionales o “apareamiento de bases”. Las secuencias que son “suficientemente complementarias” permiten una hibridación estable de una secuencia de una sonda con una secuencia objetivo, incluso si las dos secuencias no son completamente complementarias. Una sonda puede estar marcada o no marcada.
Mediante “suficientemente complementaria” se quiere decir una secuencia de bases de ácido nucleico contiguas que
45 es capaz de hibridar con otra secuencia mediante puentes de hidrógeno ente una serie de bases complementarias. Las secuencias de bases complementarias pueden ser complementarias en cada posición de la secuencia usando apareamiento de bases convencional (por ejemplo, apareamiento G:C, A:T o A:U) o pueden contener uno o más residuos (incluidos residuos abásicos) que no son complementarios usando apareamiento de bases convencional pero que permiten que toda la secuencia hibride específicamente con otra secuencia de bases en condiciones de hibridación adecuadas. Las bases contiguas de un oligómero son, al menos, aproximadamente un 80% (81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%), más preferentemente al menos aproximadamente un 90% complementarias de la secuencia con la que el oligómero hibrida específicamente. Las condiciones de hibridación adecuadas son bien conocidas para el experto en la técnica, se pueden predecir fácilmente en base a la composición de la secuencia y las condiciones o se pueden determinar empíricamente
55 usando análisis de rutina (véase Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) en §§ 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 y 11.47-11.57, particularmente a §§ 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 y 11.55-11.57).
Las secuencias de ácido nucleico se pueden detectar usando hibridación con una secuencia complementaria (por ejemplo, sondas oligonucleotídicas) (véanse las patentes de EE.UU. nº 5.503.980 (Cantor), nº 5.202.231 (Drmanac y col.), nº 5.149.625 (Church y col.), nº 5.112.736 (Caldwell y col.), nº 5.068.176 (Vijg y col.) y nº 5.002.867 (Macevicz)). Los procedimientos de detección de hibridación pueden usar una matriz de sondas (por ejemplo, en un chip de ADN) para proporcionar información de la secuencia sobre el ácido nucleico objetivo que hibrida de forma selectiva con una secuencia de la sonda exactamente complementaria en un conjunto de cuatro secuencias de
65 sonda relacionadas que difieren en un nucleótido (véanse las patentes de EE.UU. nº 5.837.832 y nº 5.861.242 (Chee y col.)).
Una etapa de detección puede usar cualquiera de diversos procedimientos conocidos para detectar la presencia de ácido nucleico mediante hibridación con una sonda oligonucleotídica. Un ejemplo específico de una etapa de detección usa un procedimiento de detección homogéneo como el descrito con detalle anteriormente en Arnold y col. 5 Clinical Chemistry 35: 1588-1594 (1989) y patentes de EE.UU. nº 5.658.737 (Nelson y col.), y nº 5.118.801 y nº
5.312.728 (Lizardi y col.).
Los tipos de procedimientos de detección en los que se pueden usar las sondas incluyen transferencias Southern (detección de ADN), transferencias puntuales o de tipo ranura (ADN, ARN) y transferencias Northern (detección de ARN). También se podrían usar proteínas marcadas para detectar una secuencia de ácido nucleico concreta a la que se une. Guichet y col., 1997, Nature 385 (6616): 548-552; y Schwartz y col., 2001, EMBO 20 (3): 510-519. Otros procedimientos de detección incluyen kits que contienen reactivos divulgados en el presente documento en un contexto de tira reactiva y similares. Por supuesto, podría ser preferible usar un procedimiento de detección que se pueda automatizar. Un ejemplo no limitante del mismo incluye un chip u otro soporte que comprende una o más (por
15 ejemplo, una matriz) de sondas diferentes.
Un “marcador” hace referencia a un resto molecular o compuesto que se puede detectar o que puede conducir a una señal detectable. Un marcador se une, directa o indirectamente, a una sonda de ácido nucleico o al ácido nucleico que se va a detectar (por ejemplo, una secuencia amplificada). El marcaje directo se puede producir mediante enlaces o interacciones que unen el marcador al ácido nucleico (por ejemplo, enlaces covalentes o interacciones no covalentes), mientras que el marcaje indirecto puede producir mediante un “ligador” o resto de unión, tal como oligonucleótido(s) adicionales, que está directa o indirectamente marcado. Los restos de unión pueden amplificar una señal detectable. Los marcadores pueden incluir cualquier resto detectable (por ejemplo, un radionúclidos, ligando tal como biotina o avidina, enzima o sustrato enzimático, grupo reactivo, cromóforo, tal como un pigmento o
25 partícula coloreada, compuesto luminiscente incluyendo un compuesto bioluminiscente, fosforescente o quimioluminiscente y compuesto fluorescente). Preferentemente, el marcador en una sonda marcada es detectable en un sistema de ensayo homogéneo, es decir en una mezcla, el marcador unido exhibe un cambio detectable comparado con un marcador no unido.
Se conocen otros procedimientos de marcado de ácidos nucleicos, de modo que un marcador se une a una hebra de ácido nucleico cuando se fragmenta, lo que es útil para marcar ácidos nucleicos a detectar mediante hibridación con una matriz de sondas de ADN inmovilizadas (por ejemplo, véase la PCT nº PCT/IB99/02073).
Un “marcador detectable homogéneo” hace referencia a un marcador cuya presencia se puede detectar de un modo
35 homogéneo en base a si la sonda marcada está hibridada con una secuencia objetivo. Un marcador detectable homogéneo se puede detectar sin eliminar físicamente las formas hibridadas de las no hibridadas de la sonda marcada. Los marcadores detectables homogéneos y los procedimientos para detectarlos se han descrito con detalle en otros lugares (por ejemplo, véanse las patentes de EE. UU. nº 5.283.174, 5.656.207 y 5.658.737).
Como se usa en el presente documento, “oligonucleótidos” u “oligos” definen una molécula que tiene dos o más nucleótidos (ribo o desoxirribonucleótidos). El tamaño del oligo vendrá dictado por la situación concreta y en última instancia, por el uso concreto del mismo y el experto en la técnica loe adaptará en consecuencia. Un oligonucleótido se puede sintetizar químicamente o derivar mediante clonación de acuerdo con procedimientos bien conocidos. Aunque normalmente están en forma monocatenaria, pueden estar en forma bicatenaria e incluso contener una
45 “región reguladora”. Pueden contener nucleótidos raros naturales o sintéticos. Pueden estar diseñados para potenciar un criterio elegido como, por ejemplo, la estabilidad.
Como se usa en el presente documento, un “cebador” define un oligonucleótido que es capaz de hibridar con una secuencia objetivo, de modo que crea una región bicatenaria que puede servir como punto de iniciación para la síntesis de ácido nucleico en las condiciones adecuadas. Los cebadores pueden estar diseñados para, por ejemplo, ser específicos de ciertos alelos para usar en un sistema de amplificación específico de alelo. Por ejemplo, un cebador puede estar diseñado de forma que sea complementario de un ARN corto de PCA3 que está asociado con un estado maligno de la próstata, mientras que un ARN largo de PCA3 está asociado con un estado no maligno (benigno) de la misma (PCT/CA00/01154 publicado con el nº WO 01/23550). La región 5’ del cebador puede ser no
55 complementaria de la secuencia de ácido nucleico objetivo e incluir bases adicionales, tales como una secuencia promotor (que se denomina “cebador del promotor”). Los expertos en la técnica apreciarán que cualquier oligómero que puede funcionar como cebador se puede modificar para que incluya una secuencia promotora en 5’ y por tanto, funcionar como un cebador de promotor. De un modo similar, cualquier cebador de promotor puede servir como cebador, con independencia de su secuencia promotor funcional. Por supuesto, el diseño de un dejador de una secuencia de ácido nucleico conocida es bien conocido en la técnica. En cuanto a los oligos, puede comprender una serie de tipos de diferentes nucleótidos.
Amplificación asociada con la transcripción. La amplificación de una secuencia de ácido nucleico objetivo usando al menos dos cebadores se puede conseguir usando varios procedimientos de amplificación de ácido nucleico 65 conocidos, pero, preferentemente, usa una reacción de amplificación asociada con la transcripción que es sustancialmente isotérmica. Usando dicho procedimiento de amplificación in vitro se producen muchas hebras de ácido nucleico a partir de una sola copia de ácido nucleico objetivo, de modo que permite la detección del objetivo en la muestra mediante la unión específica de las secuencias amplificadas a una o más sondas de detección. Los procedimientos de amplificación asociada con la transcripción se han descrito con detalle en otros lugares (por ejemplo, las patentes de EE. UU. nº 5.399.491 y 5.554.516)). Brevemente, la amplificación asociada con la 5 transcripción usa dos tipos de cebadores (siendo uno un cebador de promotor porque contiene una secuencia promotor para una ARN polimerasa), dos actividades enzimáticas (una transcriptasa inversa (RT) y una ARN polimerasa), sustratos (desoxirribonucleósido trifosfatos, ribonucleótido trifosfatos) y sales y tampones adecuados en solución para producir múltiples tránscritos de ARN a partir de un molde de ácido nucleico. Inicialmente, un cebador promotor hibrida específicamente con una secuencia objetivo (por ejemplo, ARN) y la transcriptasa inversa crea una primera hebra de ADN complementaria (ADNc) mediante extensión desde el extremo 3' del cebador promotor. El ADNc se hace disponible para hibridación con el segundo cebador mediante cualquiera de diversos procedimientos, tales como mediante desnaturalización del dúplex objetivo-ADNc o usando actividad RNasa H suministrada mediante la RT que degrada el ARN en un dúplex de ADN:ARN. Un segundo cebador se une al ADNc y se sintetiza una nueva hebra de ADN desde el extremo del segundo cebador usando la actividad RT para crear un ADN
15 bicatenario (dsADN) que tiene una secuencia promotora funcional en un extremo. Una ARN polimerasa se une a la secuencia promotora del dsADN y la transcripción produce múltiples tránscritos (“amplicones”), Los amplicones se usan en etapas o ciclos posteriores del procedimiento de amplificación asociada con la transcripción sirviendo como un molde nuevo para la replicación, de modo que se generan muchas copias del ácido nucleico amplificado (es decir, a partir de cada molde se sintetizan aproximadamente 100 a 3.000 copias de ARN).
NASBA. La amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) se puede llevar a cabo de acuerdo con técnicas conocidas (Malek y col. Methods Mol Biol, 28: 253-260). En una realización, la amplificación NASBA comienza con la hibridación de un cebador antisentido P1 (que contiene el promotor de la ARN polimerasa de T7) o el ARNm objetivo. Después, la transcriptasa inversa (RTasa) sintetiza una hebra de ADN complementario. El híbrido 25 bicatenario ADN/ARN es reconocido por la RNasa H que digiere la hebra de ARN, dejando una molécula de ADN monocatenaria a la que se puede unir el cebador sentido P2. P2 sirve como ancla para la RTasa que sintetiza una segunda hebra de ADN. El ADN bicatenario resultante tiene un promotor de ARN polimerasa de T7 funcional reconocido por la respectiva enzima. La reacción NASBA puede ahora entrar en la fase se amplificación cíclica que comprende seis etapas: (1) Síntesis de moléculas cortas de ARN monocatenario antisentido (de 101 a 103 copias por molde de ADN) mediante la ARN polimerasa de T7; (2) hibridación del cebador P2 con estas moléculas de ARN; (3) síntesis de una hebra de ADN complementario por la RTasa; (4) digestión de la hebra de ARN en el híbrido de ADN/ARN; (5) hibridación del cebador P1 con el ADN monocatenario; y (6) generación de moléculas de ADN bicatenario por la RTasa. Dado que la reacción NASBA es isotérmica (41ºC), es posible la amplificación específica del ssARN si se evita la desnaturalización del dsADN en el procedimiento de preparación de la muestra. Por tanto,
35 es posible coger el ARN en un fondo de dsADN sin obtener resultados falsos positivos causados por el dsADN genómico.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La reacción en cadena de la polimerasa se puede realizar de acuerdo con técnicas conocidas. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.683.195, nº 4.683.202, nº 4.800.159 y nº
4.965.188 (cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia). En general, la PCR implica un tratamiento de una muestra de ácido nucleico (por ejemplo, en presencia de una ADN polimerasa termoestable) en condiciones de hibridación, con un cebador oligonucleotídico para cada hebra de la secuencia específica a detectar. Un producto de extensión de cada cebador que se sintetiza es complementario a cada una de las dos hebras de ácido nucleico, con los cebadores suficientemente complementarios a cada hebra de la secuencia
45 específica con la que hibridar. El producto de extensión sintetizado de cada cebador también puede servir como molde para la síntesis posterior de los productos de extensión usando los mismos cebadores. Tras un número suficiente de rondas de síntesis de los productos de extensión se analiza la muestra para evaluar si están presentes la secuencia o las secuencias que se van a detectar. La detección de la secuencia amplificada se puede llevar a cabo mediante visualización tras tinción con EtBe del ADN después de la electroforesis en gel o usando un marcador detectable de acuerdo con técnicas conocidas y similares. Para una revisión de las técnicas de PCR (véanse los protocolos de PCR, A Guide to Methods and Amplifications, Michael y col. Eds, Acad. Press, 1990).
La reacción en cadena de la ligasa (LCR) se puede realizar de acuerdo con técnicas conocidas (Weiss, 1991, Science 254:1292). Un experto en la técnica puede llevar a cabo la adaptación del protocolo para satisfacer las
55 necesidades deseadas. También se lleva a cabo la amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) de acuerdo con técnicas conocidas o adaptaciones de las mismas para satisfacer las necesidades concretas (Walker y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396; and ibid., 1992, Nucleic Acids Res. 20:1691-1696).
Captura del objetivo. En una realización, la captura del objetivo está incluida en el procedimiento para incrementar la concentración o la pureza del ácido nucleico objetivo antes de la amplificación in vitro. Preferentemente, la captura del objetivo implica un procedimiento relativamente simple de hibridar y aislar el ácido nucleico objetivo, como se describe con detalle en otros lugares (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 6.110.678, nº 6.280.952 y nº 6.534.273). En términos generales, la captura del objetivo se puede dividir en dos familias, específica de secuencia y no específica de secuencia. En un procedimiento no específico se usa un reactivo (por ejemplo, esferas de sílice) 65 para capturar ácidos nucleicos de forma no específica. En el procedimiento específico de secuencia, un oligonucleótido unido a un soporte sólido se pone en contacto con una mezcla que contiene el ácido nucleico
objetivo en condiciones de hibridación adecuadas para permitir que el ácido nucleico objetivo se una al soporte sólido para permitir la purificación del objetivo de otros componentes de la muestra. La captura del objetivo se puede ser el resultado de la hibridación directa entre el ácido nucleico objetivo y un oligonucleótido unido al soporte sólido pero, preferentemente, es el resultado de la hibridación indirecta con un oligonucleótido que forma un complejo de
5 hibridación que une el ácido nucleico objetivo al oligonucleótido sobre el soporte sólido. Preferentemente, el soporte sólido es una partícula que se puede separar de la solución, más preferentemente una partícula paramagnética que se puede recuperar aplicando un campo magnético al vaso. Después de la separación, el ácido nucleico objetivo unido al soporte sólido se lava y amplifica cuando la secuencia objetivo se pone en contacto con los cebadores, sustratos y enzimas adecuados en una reacción de amplificación in vitro.
En general, las secuencias oligoméricas de captura incluyen una secuencia que se une específicamente a la secuencia objetivo, cuando el procedimiento de captura es, de hecho, específico y una secuencia “cola” que une el complejo a una secuencia inmovilizada mediante hibridación. Es decir, el oligómero de captura incluye una secuencia que se une específicamente a su PCA3 o a otra secuencia objetivo marcador específico de la próstata
15 (por ejemplo, PSA, hK2/KLK2, PMSA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida, PCGEM1) y una secuencia cola en 3’ unida covalentemente (por ejemplo, un homopolímero complementario a una secuencia homopolimérica inmovilizada). La secuencia cola que tiene una longitud de, por ejemplo, 5 a 50 nucleótidos, hibrida con la secuencia inmovilizada para unir el complejo que contiene el objetivo al soporte sólido y de este modo, purificar el ácido nucleico objetivo hibridado de otros componentes de la muestra. Un oligómero de captura puede usar cualquier enlace de la estructura, pero algunas realizaciones incluyen uno o más enlaces 2'-metoxi. Por supuesto, otros procedimientos de captura son bien conocidos en la técnica. El procedimiento de captura en la estructura del capuchón (Edery y col., 1988, gene 74 (2): 517-525, US 5.219.989) o el procedimiento basado en sílice son dos ejemplos no limitantes de los procedimientos de captura.
25 Una “sonda inmovilizada” o “ácido nucleico inmovilizado” hace referencia a un ácido nucleico que une, directa o indirectamente, un oligómero de captura a un soporte sólido. Una sonda inmovilizada es un oligómero unido a un soporte sólido que facilita la separación de la secuencia objetivo unida del material no unido en una muestra. Se puede usar cualquier soporte sólido conocido, tal como matrices y partículas libres en solución, hecho de cualquier material conocido (por ejemplo, nitrocelulosa, nylon, cristal, poliacrilato, polímeros mixtos, poliestireno, polipropilensilano y partículas metálicas, preferentemente partículas paramagnéticas). Los soportes preferidos son esferas paramagnéticas monodispersas (es decir, de tamaño uniforme ± aproximadamente 5%), de modo que proporcionan resultados consistentes, a las que una sonda inmovilizada se une de forma estable directamente (por ejemplo, mediante un enlace covalente directo, quelación o interacción iónica) o indirectamente (por ejemplo, mediante uno o más ligadores), que permiten la hibridación con otro ácido nucleico en solución.
35 El término “alelo” define una forma alternativa de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma.
Gen. Una secuencia de ADN generalmente relacionada pero no necesariamente relacionada con una única cadena polipeptídica o proteína y tal como se usa en el presente documento, incluye las regiones en 5’ y 3’ sin traducir. El polipéptido puede estar codificado por una secuencia de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificante, con tal de que se mantenga la actividad funcional de la proteína.
ADN Complementario (ADNc). Moléculas de ácido nucleico recombinantes sintetizadas mediante transcripción inversa del ARN mensajero ("ARN").
45 Gen Estructural. Una secuencia de ADN que se transcribe a ARN que después se traduce a una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico.
Como se sabe habitualmente, una “mutación” es un cambio detectable en el material genético que se puede transmitir a una célula hija. Como es bien conocido, una mutación puede ser, por ejemplo, un cambio detectable en uno o más desoxirribonucleótidos. Por ejemplo, los nucleótidos se pueden añadir, delecionar, sustituir o invertir o transponer a una posición nueva. Existen mutaciones espontáneas y mutaciones inducidas experimentalmente. Un polipéptido mutante puede estar codificado a partir de esta molécula de ácido nucleico mutante.
55 Como se usa en el presente documento, el término “purificado” se refiere a una molécula (por ejemplo, ácido nucleico) que se ha separado de un componente de la composición en la que estaba originalmente presente. Por tanto, por ejemplo, un “ácido nucleico purificado” se ha purificado hasta un nivel en el que no se encuentra en la naturaleza. Una molécula “sustancialmente pura” es una molécula que no se encuentra en la mayoría de los demás componentes (por ejemplo, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100% libre de contaminantes) Por el contrario, el término “en bruto” significa moléculas que no se han separado de los componentes de la composición original en la que estaba presente. Por brevedad, las unidades (por ejemplo, 66, 67...81, 82, ...91, 92%....) no se han citado específicamente, pero, no obstante, se consideran dentro del alcance de la presente divulgación.
Como se usa en el presente documento, “marcador específico de próstata” se refiere a cualquier molécula cuya
65 presencia en la muestra indica que dicha muestra contiene células de próstata (o un marcador de las mismas). Por tanto, una “secuencia específica de próstata” hace referencia a una secuencia de ácido nucleico o de proteína que se encuentra específicamente en células de próstata y normalmente no en otros tejidos que puedan “contaminar” una muestra concreta. Por seguridad, cuando se usa una muestra de orina, el segundo marcador específico de próstata de acuerdo con la presente invención no tiene que expresarse únicamente en la próstata. De hecho, los marcadores que se expresan únicamente en un órgano o tejido son muy raros. No obstante, si el segundo marcador
5 específico de próstata se expresa en un tejido no prostático, esta expresión en el tejido no prostático no alterará la especificidad de este segundo marcador siempre que se produzca en células de tejidos u órganos que normalmente no están presentes en la muestra de orina. Por tanto, cuando la muestra es orina, este segundo marcador específico de próstata normalmente no se expresa en otros tipos de células (por ejemplo, las células del sistema del tracto urinario) que se van a encontrar en la muestra de orina.
Muestra control. Con la expresión “muestra control” o “muestra normal” se quiere decir una muestra que no contiene un cáncer específicamente elegido. En una realización concreta, la muestra control no contiene cáncer de próstata o es indicativa de la ausenta de cáncer de próstata. Las muestras control se pueden obtener de pacientes/individuos no afectados por cáncer de próstata. También se pueden usar otros tipos de muestras control. Por ejemplo, se
15 puede usar un marcador específico de próstata para garantizar que la muestra contenga células específicas de próstata (este marcador generalmente se describe en el presente documento como el segundo marcador específico de próstata). En un aspecto relacionado, una reacción control puede estar diseñado para controlar el propio procedimiento (por ejemplo, la extracción celular, la captura, la reacción de amplificación o el procedimiento de detección, el número de células presentes en la muestra, una combinación de los mismos o cualquier etapa que pueda monitorizarse para validar positivamente que la ausencia de una señal (por ejemplo, la ausencia de la señal de PCA3) no es el resultado de un defecto en una o más de las etapas).
Valor de corte. El valor de corte para la predisposición o presencia del cáncer de próstata se define en una población de pacientes sin cáncer de próstata como la señal media de polinucleótidos, polipéptidos o fragmentos de los
25 mismos de PCA3 (u otro antígeno de cáncer de próstata) más n desviaciones estándar (o la señal media promedio de la misma). Los valores de corte indicativos de la presencia o predisposición a desarrollar cáncer de próstata pueden ser los mismos o, como alternativa, pueden ser valores diferentes.
Variante. El término “variante” hace referencia en el presente documento a una proteína o molécula de ácido nucleico que es sustancialmente similar en estructura y actividad biológica a la proteína o ácido nucleico divulgados en el presente documento, para mantener al menos una de sus actividades biológicas. Por tanto, siempre que dos moléculas posean una actividad común y que puedan sustituirse entre sí, se consideran variantes como se usa ese término en el presente documento, incluso si la composición, o la estructura secundaria, terciara o cuaternaria de una molécula no es idéntica a la que se encuentra en la otra, o si la secuencia de aminoácidos o la secuencia de
35 nucleótidos no es idéntica.
Con una “muestra biológica” o “muestra de un paciente” se quiere incluir cualquier tejido o material derivado de un ser humano vivo o muerto que puede contener el ácido nucleico objetivo de PCA3 y el segundo marcador específico de próstata. Las muestras incluyen, por ejemplo, cualquier tejido o material que puede contener células específicas para el objetivo PCA3 (o segundo marcador específico), tal como sangre periférica, plasma o suero, tejido de biopsia, tejido gastrointestinal, médula ósea, orina, heces, semen u otros fluidos corporales, tejidos o materiales, pero, preferentemente, es una muestra de orina tras un tacto rectal (u otros medios que aumentan el contenido de las células de próstata en orina). La muestra biológica se puede tratar para romper físicamente la estructura tisular o celular, de modo que libera los componentes intracelulares en una solución que puede contener además enzimas,
45 tampones, sales, detergentes y similares, que se usan para preparar la muestra para análisis.
La figura 1 muestra la estructura del gen de PCA3 y la localización de los oligonucleótidos y sondas para amplificación de ARN in vitro y la detección del producto amplificado.
Panel A. Zona objetivo del cebador de PCA3 sentido (SEC ID Nº 4); Panel B. Zona objetivo de la baliza molecular de PCA3 (SEC ID Nº 6); y Panel C. Zona objetivo del cebador de PCA3 antisentido (SEC ID Nº 3).
55 La figura 2 muestra un árbol de decisiones usado para calcular la positividad del procedimiento en un paciente con niveles de PSA total en sangre por debajo de 4 ng/ml.
La figura 3 muestra un árbol de decisiones usado para calcular la positividad del procedimiento en un paciente con niveles de PSA total en sangre entre 4-10 ng/ml.
La figura 4 muestra un árbol de decisiones usado para calcular la positividad del procedimiento en un paciente con niveles de PSA total en sangre por encima de 10 ng/ml.
65 A efectos de claridad de la divulgación, la descripción detallada se divide en las subsecciones siguientes: I. Procedimiento para evaluar la presencia de cáncer de próstata en una muestra mediante la detección de ácido nucleico de PCA3.
5 II. Síntesis de ácido nucleico.
III. Sondas y cebadores.
IV. Kit para detectar la presencia de ácido nucleico de PCA3 en una muestra.
1. Procedimiento para evaluar la presencia de cáncer de próstata en una muestra mediante la detección de ácido nucleico de PCA3
En el presente documento se divulgan procedimientos para detectar la presencia de ácido nucleico de PCA3 junto
15 con un segundo marcador específico de próstata (por ejemplo, PSA, hK2/KLK2, PSMA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida, PCGEM1) en una muestra biológica así como procedimientos para medir el nivel de un ácido de PCA3 en la muestra. Dichos procedimientos son útiles para el diagnóstico de cáncer de próstata asociado con la sobreexpresión de PCA3.
La predisposición a desarrollar cáncer de próstata o la presencia de dicho cáncer se puede detectar en base a la presencia de una cantidad elevada de ácido nucleico de PCA3 en una muestra biológica (por ejemplo, orina) de un paciente. Se pueden usar cebadores polinucleotídicos y sondas para detectar el nivel de ARN de PCA3 presente, que es indicativo de la predisposición, presencia o ausencia de cáncer de próstata. En general, la cantidad elevada de ácido nucleico de PCA3 (por ejemplo, ARN, de PCA3 o fragmentos del mismo) en una muestra en comparación
25 con la cantidad presente en muestras control normales (o un valor de corte determinado) indica que la muestra contiene cáncer de próstata o es susceptible a desarrollar cáncer de próstata. En una realización, la detección de un segundo marcador específico de próstata también se realiza para servir como control de la presencia de células específicas de próstata en la muestra, así como para validar también los resultados de la detección de PCA3 (por ejemplo, resultado negativo obtenido con la detección de PCA3).
Por supuesto, se pueden usar numerosos marcadores específicos de próstata diferentes siempre que puedan servir como control para el ARN de próstata. Ejemplos no limitantes de dichos marcadores específicos de próstata incluyen PSA (SEC ID Nº 11) y otros miembros de la familia de la calicreína. Además y como se ha descrito anteriormente, también se pueden usar marcadores tales como hK2/KLK2, PSMA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida, PCGEM1
35 de acuerdo con la presente divulgación.
Un ejemplo no limitante de un procedimiento para detectar ácido nucleico de PCA3 (por ejemplo, ARMm de PCA3) en una muestra biológica es mediante (1) poner en contacto una muestra biológica con al menos una sonda oligonucleotídica o cebador que hibrida con un polinucleótido de PCA3; y (2) detectar en la muestra biológica un nivel de oligonucleótido (es decir, sonda(s) o cebador(es) que hibridan con el polinucleótido de PCA3. La muestra también se analiza para detectar la presencia del segundo marcador específico de próstata (por ejemplo, PSA, hK2/KLK2, PSMA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida, ARNm de PCGEM1 o fragmentos del mismo) para controlar la presencia de células de próstata en la muestra (o su número), así como para controlar además un resultado negativo o positivo obtenido con la detección de PCA3. El segundo marcador específico de próstata también puede
45 ser un ARN de PCA3 específico de próstata que no está asociado con el cáncer de próstata pero se expresa en las células de próstata. La cantidad de polinucleótido de PCA3 detectada se puede comparar con un valor de corte predeterminado y a partir de esto, se determina la predisposición, presencia o ausencia de un cáncer de próstata en el paciente.
En un aspecto relacionado, los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden usar para monitorizar la progresión del cáncer de próstata en un paciente. En esta realización concreta, los ensayos descritos anteriormente se realizan en el tiempo y se evalúa la variación en el nivel de ácido nucleico de PCA3 y de otro marcador específico de próstata (por ejemplo, ARNm de PSA) presente en la muestra (por ejemplo, muestra de orina). En general, el cáncer de próstata se considera en progresión cuando el nivel relativo (es decir, en relación
55 con la cantidad de células o componentes celulares (por ejemplo, proteína o ácidos nucleicos presentes en los mismos) del ácido nucleico de PCA3 detectado aumenta con el tiempo. En contraste, un cáncer no se considera en progresión cuando el nivel relativo de ácido nucleico de PCA3 disminuye o permanece constante en el tiempo.
Un experto en la técnica puede seleccionar los cebadores de ácido nucleico de acuerdo con técnicas conocidas en la materia como se han descrito anteriormente. Las muestras que se van a analizar incluyen, aunque sin limitaciones, muestras de ARN de tejido humano.
En un aspecto relacionado, es posible verificar la eficiencia de la amplificación y/o la detección del ácido nucleico únicamente realizando reacción(es) de control externo usando ácidos nucleicos objetivo control altamente 65 purificados añadidos a la mezcla de reacción de amplificación y/o detección. Como alternativa, la eficiencia de la recuperación del ácido nucleico de las células y/u orgánulos, el nivel de inhibición de la amplificación y/o detección del ácido nucleico (si hay) se pueden verificar y estimar añadiendo a cada muestra de ensayo células u orgánulos control (por ejemplo, un número definido de células de una línea celular de cáncer de próstata que expresa PCA3 y un segundo marcador) por comparación con reacción(es) control externas. Para verificar la eficiencia de amas, preparación de la muestra y amplificación y/o detección, dichas reacción(es) control externas se pueden realizar 5 usando una muestra de ensayo de referencia o una muestra blanco enriquecida con células, orgánulos y/o partículas virales portadoras de la o las secuencias del ácido nucleico control. Por ejemplo, una señal de las secuencias control interno (CI) presente en las células, virus y/u orgánulos añadidos a cada muestra de ensayo que es menor que la señal observada con la(s) reacción(es) control externas se puede explicar mediante lisis incompleta y/o inhibición de los procesos de amplificación y/o detección para una muestra de ensayo dada. Por otro lado, una señal de las secuencias CI que es similar a la señal observada con la(s) reacción(es) control externas confirmaría que la preparación de la muestra, incluida la lisis celular, es eficiente y que no hay una inhibición significativa de los procesos de amplificación y/o detección para una muestra de ensayo dada. Como alternativa, la verificación de la eficiencia de la preparación de la muestra solo se puede realizar usando control(es) externo(s) analizados mediante otros procedimientos aparte del análisis de ácido nucleico (por ejemplo, análisis usando microscopia, espectrometría
15 de masas o ensayos inmunológicos).
Por tanto, en una realización concreta, los procedimientos divulgados en el presente documento usan ácidos nucleicos purificados, células de próstata o partículas virales que contienen secuencias de ácido nucleico que sirven cono objetivos para un control interno (CI) en ensayos de ácido nucleico para verificar la eficiencia de la lisis celular y de la preparación de la muestra, así como el rendimiento de la amplificación y/o detección del ácido nucleico. Más ampliamente, el CI sirve para verificar cualquier etapa escogida del procedimiento divulgado en el presente documento.
El CI en la PCR o técnicas de amplificación relacionadas puede ser ADN plasmídico altamente purificado,
25 superenrrollado o linealizado mediante digestión con una endonucleasa de restricción y repurificado. Los moldes de CI superenrrollado se amplifican con mucha menos eficiencia (aproximadamente 100 veces) y de un modo menos reproducible que los moldes de CI de ácido nucleico repurificado. En consecuencia, los controles CI para amplificación y detección se realizan, preferentemente, con moldes de ácido nucleico CO linealizados y repurificados cuando se usan estos tipos de CI.
Los ácidos nucleicos, células y/u orgánulos se incorporan en cada muestra de ensayo a la concentración adecuada para obtener una amplificación/detección eficiente y reproducible del CI, en base a las pruebas realizadas durante la optimización del ensayo. El número óptimo de células control añadidas, que depende del ensayo, es, preferentemente, el número mínimo de células que permite una señal de detección de CI altamente reproducible sin
35 que tenga ningún efecto perjudicial significativo sobre la amplificación y/o detección de los otros objetivos genéticos del ensayo basado en ácido nucleico. Una muestra a la que se añaden los ácidos nucleicos linealizados purificados, partículas virales u orgánulos generalmente se denomina una “muestra enriquecida”.
En ciertas realizaciones, la cantidad de ARNm se puede detectar mediante un ensayo basado en RT-PCR. En la RT-PCR, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se aplica junto con transcripción inversa. En dicho ensayo se pueden usar al menos dos cebadores oligonucleotídicos para amplificar una porción de ADNc de PCA3 derivado de una muestra biológica, en el que al menos un oligonucleótido es específico (es decir, hibrida) de un ARN de PCA3. El ADNc amplificado se puede separar después y detectar usando técnicas que son bien conocidas en la técnica, tal como electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. La amplificación se puede realizar con muestras
45 biológicas tomadas de un paciente de ensayo y un individuo que no está afectado por cáncer de próstata (muestra control) o usando otros tipos de muestras control. La reacción de amplificación se puede realizar en varias diluciones de ADNc (o directamente en varias diluciones de la muestra biológica), por ejemplo dos órdenes de magnitud. Un valor por encima de un valor de corte predeterminado es indicativo de la presencia o predisposición a desarrollar cáncer de próstata. En general, la expresión elevada de ácido nucleico de PCA3 en una muestra biológica en comparación con las muestras control indica la presencia o la predisposición a desarrollar cáncer de próstata.
En realizaciones adicionales, el ARN de PCA3 se detecta en un extracto de ácido nucleico de una muestra biológica mediante un procedimiento de amplificación de ARN in vitro denominado Amplificación Basada en Ácido Nucleico (NASBA). También se pueden usar otros procedimientos de amplificación de ARN, bien conocidos en la técnica e
55 incluyen amplificación mediada por transcriptasa (TMA), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), el sistema replicasa Qβ y reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véanse, en general, Kwoh y col., 1990, Am. Biotechnol. Lab. 8:14-25 y Kwoh y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177; Lizardi y col., 1988, BioTechnology 6:1197-1202; Malek y col., 1994, Methods Mol. Biol., 28:253-260; and Sambrook y col., 2000, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Third Edition, CSH Laboratories).
La amplificación y/o detección de secuencias de ARN de PCA3 específicas de cáncer de próstata y del marcador específico de próstata se pueden llevar a cabo de forma simultánea (por ejemplo, ensayos de amplificación en tiempo real multiplexado).
65 Como alternativa, las sondas oligonucleotídicas que hibridan específicamente en condiciones rigurosas con un ácido nucleico de PCA3 se pueden usar en un ensayo de hibridación de ácido nucleico (por ejemplo, transferencias de tipo Southern y Northern, transferencia de puntos, transferencia de ranuras, hibridación in situ y similares) para determinar la presencia y/o cantidad de polinucleótido de PCA3 específico de cáncer de próstata en una muestra biológica.
5 Como alternativa, os oligonucleótidos y los cebadores podrían diseñarse para una secuencia directa y evaluar la presencia de secuencias de PCA3 específicas de cáncer de próstata en la muestra del paciente tras una etapa de amplificación. Los procedimientos diagnósticos en base a la secuenciación se pueden automatizar y están abarcados dentro de la presente divulgación.
I. Síntesis de ácido nucleico
El ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) para poner en práctica los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden obtener de acuerdo con procedimientos bien conocidos.
15 Con las moléculas de ácido nucleico aisladas divulgadas en el presente documento se pretende incluir las obtenidas mediante clonación así como las sintetizadas químicamente. De un modo similar, se puede sintetizar un oligómero que corresponde a la molécula de ácido nucleico, o a cada uno de los fragmentos divididos. Dichos oligonucleótidos sintéticos se pueden preparar, por ejemplo, mediante el método de triéster de Matteucci y col., J. Am. Chem. Soc.
103: 3185-3191 (1981) o mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado.
Se puede obtener un oligonucleótido de manera sintética o mediante clonación. Si es necesario, los extremos 5' de los oligómeros se pueden fosforilar mediante el uso de la polinucleótido cinasa de T4. El tratamiento con cinasa de las cadenas simples antes de la hibridación o del marcaje se puede llevar a cabo mediante el uso de un exceso de la enzima. Si el tratamiento con cinasa es para el marcaje de la sonda, el ATP puede contener radioisótopos de
25 actividad muy específica. Después, el oligómero de ADN se puede someter a hibridación y ligadura con una ligasa de T4 o similar. Por supuesto, el marcaje de una secuencia de ácido nucleico se puede realizar mediante otros procedimientos conocidos en la técnica.
II. Sondas y cebadores
La presente invención se refiere a un ácido nucleico para la detección específica, en una muestra, de la presencia de secuencias de ácido nucleico de PCA3 que están asociadas al cáncer de próstata, que comprenden las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas o al menos un fragmento de las mismas que se une en condiciones rigurosas al ácido nucleico de PCA3.
35 En una realización preferida, la presente divulgación se refiere a oligos dirigidos específicamente y permiten la amplificación (es decir, cebadores) de secuencias de ARN de PCA3 asociadas al cáncer de próstata
En otra realización se puede detectar ARN de PCA3 usando una sonda específica en un ensayo de hibridación (por ejemplo, transferencia de tipo Northern, transferencia de puntos, transferencia de ranuras y similares).
Las sondas o cebadores oligonucleotídicos como se divulgan en el presente documento pueden tener cualquier longitud adecuada dependiendo del formato de ensayo concreto y de las necesidades concretas y secuencias objetivo empleadas. En una realización preferida, las sondas o cebadores oligonucleotídicos tienen una longitud de 45 al menos 10 nucleótidos (preferentemente, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32...) y se pueden adaptar para que sean especialmente adecuados para un sistema de amplificación de ácido nucleico escogido. Las sondas y cebadores más largos también están dentro del alcance de la presente divulgación son bien conocidos en la técnica. Los cebadores que tienen una longitud de más de 30, más de 40, más de 50 nucleótidos y las sondas que tienen una longitud de más de 100, más de 200, más de 300, más de 500, más de 800 y más de 1.000 nucleótidos también están abarcados por la presente divulgación. Por supuesto, cebadores más largos tuenen la desventaja de ser más caros y por tanto, los cebadores que tienen una longitud de entre 12 y 30 nucleótidos y normalmente están diseñados y se usan en la técnica. Como se conoce en la técnica, las sondas que tienen una longitud que varía de 10 a más de 2.000 nucleótidos se pueden usar en los procedimientos de la presente divulgación. En cuanto al % de identidad descrito anteriormente, los tamaños de las sondas y cebadores no 55 descritos específicamente (por ejemplo, 16, 17, 31, 24, 39, 350, 450, 550, 900, 1.240 nucleótidos) también entran dentro del alcance de la presente divulgación. En una realización, las sondas o cebadores oligonucleotídicos divulgados en el presente documento hibridan específicamente con un ARN de PCA3 (o su secuencia complementaria). Más preferentemente, los cebadores y sondas se escogerán para detectar un ARN de PCA3 que está asociado con el cáncer de próstata. En una realización, las sondas y los cebadores usados en los procedimientos divulgados no hibridan con el gen de PCA3 (es decir, permiten el gen de distinción y el PCA3 expresado). Otros cebadores de la presente invención son específicos para un segundo marcador específico de próstata tal como PSA (SEC ID Nº 11). Por supuesto, también se pueden usar otras variantes bien conocidas en la técnica (patentes de EE.UU. 6.479.263 y 5.674.682) como segundo marcador específico de próstata. Dadas las similitudes estructurales y de secuencia del gen de PSA con otros miembros de la familia del gen de la calicreína, la 65 selección adecuada de las secuencias de PSA para servir como sondas o cebadores específicos de PSA es crucial para los procedimientos de amplificación y/o detección de ácidos nucleicos específicos de PSA. Ejemplos de
cebadores adecuados para PSA, hK2/KLK2, PSMA, amplificación y detección (por ejemplo, la patente de EE.UU. 6.551.778) son bien conocidos en la técnica, así como para transglutaminasa 4, fosfatasa ácida y PCGEM1. En una realización, el oligonucleótido de PSA puede también hibridar con otros miembros de la familia de la calicreína, tal como calicreína 2 (hK2/hKLK2). Un ejemplo de este oligonucleótido es la SEC ID Nº 12.
5 Como se sabe habitualmente en la técnica, las sondas y cebadores de oligonucleótidos se pueden diseñar teniendo en cuenta el punto de fusión de la hibridación de los mismos con su secuencia objetivo (véase más adelante y en Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2ª Edición, CSH Laboratories; Ausubel y col., 1994, en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., N.Y.).
Para permitir la hibridación en las condiciones de ensayo de la presente divulgación, los cebadores y sondas oligonucleotídicos deberían comprender una secuencia de oligonucleótidos que tiene una identidad de al menos 70% (al menos 71%, 72%, 73%, 74%), preferentemente al menos 75% (75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%) y más preferentemente, al menos 90% (90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 15 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) con una porción de un polinucleótido de PCA3. Las sondas y cebadores divulgados en el presente documento son los que hibridan con la secuencia de ácido nucleico de PICA3 (por ejemplo, ADNc o ARNm) en condiciones de hibridación rigurosas y los que hibridan con homólogos del gen de PCA3 en condiciones al menos moderadamente rigurosas. En ciertas realizaciones, las sondas y cebadores como se divulga en al presente documento tienen una identidad de secuencia completa con la secuencia del gen de PCA3 (por ejemplo, ADNc o ARNm). No obstante, las sondas y los cebadores que difieren de la secuencia del gen de PCA3 nativo que conserva la capacidad de hibridar con la secuencia del gen de PCA3 nativo en condiciones rigurosas también se pueden usar en los procedimientos divulgados. Debe entenderse que otras sondas y cebadores podrían diseñarse con facilidad y usarse en los procedimientos divulgados basados en la secuencia de ácido nucleico de PCA3 divulgada en el presente documento (SEC ID Nº 9, 10 y 13) usando procedimientos de
25 alineación por ordenador y de análisis de secuencia conocidos en la técnica (véase Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, editado por by Cold Spring Harbor Laboratory, 2000).
Por ejemplo, un cebador puede estar diseñado de forma que sea complementario de un ARN corto de PCA3 que está asociado con un estado maligno del cáncer de próstata, mientras que un ARN largo de PCA3 está asociado con un estado no maligno (benigno) de la misma (PCT/CA00/01154 publicado con el nº WO 01/23550). De acuerdo con la presente divulgación, el uso de tal cebador con los otros reactivos necesarios dría lugar a un producto de amplificación únicamente cuando en la muestra está presente un ARN corto de PCA3 (por ejemplo, SEC ID Nº 8) asociado con el cáncer de próstata. El PCA3 más largo (por ejemplo, SEC ID Nº 7) no daría lugar a un amplicón. Por supuesto, la amplificación podría diseñarse para amplificar un ARNm de PCA3 corto y largo. En dicho formato, el
35 ARNm de PCA3 largo podría usarse como el segundo marcador específico de próstata.
En una realización como se ha descrito anteriormente, la cuantificación de los productos de amplificación de PCA3 corto frente a largo podría llevarse a cabo con la detección de otro marcador específico de próstata para que sirva como prueba de diagnóstico molecular para el cáncer de próstata. En otra realización, los pares de cebadores (o sondas) específicos de PCA3 podrían diseñarse para evitar la detección del gen de PCA3 o de ARN de PCA3 no sometido a corte y empalme. Por ejemplo, las secuencias de los cebadores que se van a usar en los procedimientos divulgados podrían abarcar dos exones contiguos de modo que no pueda hibridar con una unión exón/intrón del gen de PCA3. El producto de amplificación obtenido mediante el uso de dicho cebador no tendría intrones entre dos exones escogidos (para ejemplos de dichos cebadores y sondas, véanse las tablas 1 y 2 más adelante). Por tanto,
45 las variantes no sometidas a corte y empalme y el ADN genómico no se amplificaría. El experto en la técnica reconocerá que se pueden diseñar numerosas sondas y se pueden usar de acuerdo con una serie de realizaciones divulgadas en el presente documento. Dichas pruebas se pueden adaptar usando la secuencia de PCA3 y la del segundo marcador específico de próstata. Por supuesto, se puede diseñar un par de cebadores (y sondas) diferente de cualquier parte de las secuencias de PCA3 (SEC ID Nº 7, 8, 9, 10 and 13) así como de la secuencia de PSA (número de acceso en genbank M27274, SEC ID Nº 11) o cualquier otro segundo marcador específico de próstata escogido (p.ej., KLK2 (número de acceso en genbank NM005551), PSMA (número de acceso en genbank BC025672), transglutaminasa 4 (número de acceso en genbank BC007003), fosfatasa ácida (número de acceso en genbank BC016344), PCGEM 1 (número de acceso en genbank AF223389)).
55 Las sondas de la divulgación se pueden usar con estructuras de azúcar-fosfato naturales, así como estructuras modificadas, incluidas fosforotioatos, ditionatos, fosfonatos de alquilo y α-nucleótidos y similares. En general, Miller, 1988, Ann. Reports Med. Chem. 23:295 and Moran y col., 1987, Nucleic Acids Res., 14:5019. enseñan estructuras de azúcar-fosfato modificadas. Las sondas divulgadas en el presente documento se pueden construir con ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) y preferentemente, con ADN.
Aunque la presente divulgación no depende específicamente del uso de un marcador para la detección de una secuencia de ácido nucleico concreta, dicho marcador podría ser beneficios, incrementando la sensibilidad de la detección. Además, permite la automatización. Las sondas se pueden marcar de acuerdo con numerosos procedimientos bien conocidos (Sambrook y col., 2000, ant.). Ejemplos no limitantes de marcadores y marcajes 65 detectables incluyen 3H, 14C, 32P y 35S, ligandos, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y anticuerpos. Otros marcadores detectables para usar con sondas, que pueden permitir un incremento de la sensibilidad del
procedimiento de la invención, incluyen biotina y radionucleótidos. Para el experto en la técnica será evidente que la elección de un marcador concreto dicta la madera en la que está unido a la sonda.
Como se sabe habitualmente, los nucleótidos radioactivos se pueden incorporar en las sondas de la invención
5 mediante varios procedimientos. Ejemplos no limitantes de los mismos incluyen el tratamiento con cinasas de los extremos 5’ de las sondas usando 32P ATP y polinucleótido cinasa, usando el fragmento Klenow de Pol I de E. coli en presencia del dNTP radioactivo (por ejemplo, sonda de ADN marcado de forma uniforme usando cebadores oligonucleotídicos aleatorios), usando el sistema SP6/T7 para transcribir un segmento de ADN en presencia de uno
o más NTP radioactivos y similares.
En una realización, el marcador usado en un ensayo de detección homogéneo es un compuesto quimioluminiscente (por ejemplo, patentes de EE.UU. nº 5.656.207, nº 5.658.737 y nº 5.639.604), más preferentemente un compuesto de éster de acridinio ("EA”) tal como EA estándar derivados de los mismos. Procedimientos de unión de marcadores a ácidos nucleicos y la detección de marcadores son bien conocidos (por ejemplo, véanse Sambrook y col., 15 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, NY, 1989), Chapt 10 (1993) y las patentes de EE.UU. nº 5.658.737, nº 5.656.207, nº 5.547.842, nº 5.283.174 y nº
4.581.333. y la solicitud de patente europea nº 0747706). Los procedimientos preferidos de marcar una sonda con un compuesto EA unido a través de un ligador se han descrito anteriormente con detalle (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.639.604, ejemplo 8).
La amplificación de una secuencia de ácido nucleico seleccionada, u objetivo, se puede llevar a cabo mediante numerosos procedimientos adecuados. Véase, en general, Kwoh y col., 1990, Am. Biotechnol. Lab. 8: 14-25. Se han descrito numerosas técnicas de amplificación y se pueden adaptar fácilmente para adaptarlas a las necesidades concretas de un experto en la técnica. Ejemplos no limitantes de técnicas de amplificación incluyen la reacción en
25 cadena de la polimerasa (PCR, RT PCR...), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), la amplificación basada en transcripción, el sistema replicasa Qβ y NASBA (Kwoh y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177; Lizardi y col., 1988, BioTechnology 6: 1197-1202; Malek y col., 1994, Methods Mol. Biol., 28: 253-260; and Sambrook y col., 2000, ant.). Otros ejemplos no limitantes de procedimientos de amplificación incluyen la amplificación en círculo rodante (RCA), la amplificación mediada por señal de tecnología de ARN (SMART), la reacción de amplificación compleja por división (SCAR), la amplificación del promotor dividido de ARN (SPAR).
Ejemplos no limitantes de procedimientos adecuados para detectar la presencia de los productos amplificados incluyen los siguientes: gel de agarosa o poliacrilamida, adición de pigmento de marcaje de ADN en la reacción de 35 amplificación (tal como bromuro de etidio, picoverde, verde SYBER etc.) y detección con un aparato adecuado (en la mayoría de los casos un fluorómetro). Otros procedimientos adecuados incluyen reacción de secuenciación (manual
o automático), análisis de restricción (siempre que los sitios de restricción se crearan en las secuencias amplificadas) o cualquier procedimiento que implica hibridación con una sonda específica de secuencia (transferencia de tipo Southern o Northern, sondas TaqMan™, balizas moleculares y similares). Por supuesto, otros procedimientos de amplificación están abarcados por la presente divulgación. Las balizas moleculares se ponen de ejemplo en el presente documento como un procedimiento para detectar los productos amplificados de acuerdo con la presente divulgación (véase más adelante).
Por supuesto, en alguna realización, se puede realizar la detección directa (por ejemplo, secuenciación) de
45 secuencias de PCA3 específicas de cáncer así como la de otro marcador específico de la próstata en una muestra usando sondas o cebadores específicos.
En una realización, la presente divulgación ha aprovechado los avances tecnológicos en procedimientos para detectar e identificar los ácidos nucleicos. Por tanto, la presente divulgación es adecuada para la detección mediante una de estas herramientas denominadas balizas moleculares.
Las balizas moleculares son sondas/cebadores de hibridación oligonucleotídicos monocatenarios que forman estructuras tallo-bucle. El bucle contiene una secuencia de la sonda que es complementaria de una secuencia objetivo y el tallo está formado por la hibridación de las secuencias del brazo complementario que se localizan en 55 ambos lados de la secuencia de la sonda/cebador. Un fluoróforo está unido covalentemente al extremo de un brazo y un inactivador está unido covalentemente al extremo del otro brazo. Las balizas moleculares no son fluorescentes cuando están libres en solución. No obstante, cuando hibridan con una hebra de ácido nucleico que contiene una secuencia objetivo sufren un cambio conformacional que les permiten brillar (véanse las patentes de EE.UU.
5.925.517 y 6.037.130). Las balizas moleculares se pueden usar como sondas/cebadores detectores de amplicón en ensayos diagnósticos. Dado que las balizas moleculares no hibridadas son oscuras, no es necesario aislar los híbridos sonda-objetivo para determinar, por ejemplo, el número de amplicones sintetizados durante un ensayo. Por tanto, las balizas moleculares simplifican las manipulaciones que a menudo se requieren cuando se usan medios tradicionales de detección e identificación.
65 Usando diferentes fluoróforos coloreados, las balizas moleculares también se pueden usar en ensayos de amplificación multiplexada tal como ensayos que están dirigidos a la amplificación y detección simultáneas de ácido
nucleico de PCA3 y del segundo ácido nucleico específico de próstata (por ejemplo, PSA, hK2/KLK2, PSMA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida y PCGEM1). El diseño de las sondas/cebadores balizas moleculares es bien conocido en la técnica y comercialmente existen software dedicados a ayudar a su diseño (por ejemplo, Beacon designer de Premier Biosoft International). Las sondas/cebadores de balizas moleculares se pueden usar para en 5 varios ensayos de hibridación y amplificación (por ejemplo, NASBA y PCR).
De acuerdo con una realización de la presente divulgación, el producto amplificado puede detectarse directamente usando balizas moleculares como cebadores para el ensayo de amplificación (por ejemplo, ensayos NASBA multiplexada en tiempo real o PCR) o indirectamente usando, dentro de los sitios de unión del par de cebadores, una 10 sonda baliza molecular de 18 a 25 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25), que hibrida específicamente con el producto de amplificación. Se prefieren las sondas o cebadores balizas moleculares que tienen una longitud comprendida entre 18 y 25 nucleótidos cuando se usan de acuerdo con la presente divulgación (Tyagi y col., 1996, Nature Biotechnol. 14: 303-308). Fragmentos más cortos podrían dar como resultado una señal menos fluorescente, mientras que fragmentos más largos no aumentan significativamente la señal. Por supuesto, no
15 obstante podrían usarse sondas y cebadores más cortos o más largos.
Ejemplos de cebadores de ácido nucleico que pueden derivar de secuencias de ARN de PCA3 se muestran a continuación en la tabla 1:
20 TABLA 1: Cebadores de ácido nucleico Tamaño (nº de bases) Nucleótidos Exón 1 98 1-98 de la SEC ID Nº 9 Exón 2 165 99-263 de la SEC ID Nº 9 Exón 3 183 264-446 de la SEC ID Nº 9 Exón 4a 539 447-985 de la SEC ID Nº 9 Exón 4b 1052 986-2037 de la SEC ID Nº 9 Exón 1 120 1-120 de la SEC ID Nº 10 Exón 2 165 121-285 de la SEC ID Nº 10 Exón 3 183 286-468 de la SEC ID Nº 10 Exón 4a 539 469-1007 de la SEC ID Nº 10 Exón 4b 1059 1008-2066 de la SEC ID Nº 10 Exón 4c 556 2067-2622 de la SEC ID Nº 10 Exón 4d 960 2623-3582 de la SEC ID Nº 10 Unión del exón 1 20 89-108 de la SEC ID Nº 9 Unión del exón 1 20 109-128 de la SEC ID Nº 10 Unión del exón 2 20 252-271 de la SEC ID Nº 9 Unión del exón 2 20 274-293 de la SEC ID Nº 10 Unión del exón 3 20 435-454 de la SEC ID Nº 9 Unión del exón 3 20 457-476 de la SEC ID Nº 10 Unión del exón 4 20 974-993 de la SEC ID Nº 9 Unión del exón 4 20 996-1015 de la SEC ID Nº 10 Unión del exón 5 20 2055-2074 de la SEC ID Nº 10 Unión del exón 6 20 2611-2630 de la SEC ID Nº 10
Debe entenderse que las secuencias y los tamaños de los cebadores indicados en la tabla 1 son arbitrarios y que se pueden diseñar una multitud de otras secuencias que se pueden usar de acuerdo con la presente divulgación.
25 Aunque la presente divulgación se puede llevar a cabo sin el uso de una sonda dirigida a secuencias de PCA3, tal como las uniones de exón de PCA3 de acuerdo con la presente invención, dichas sondas pueden añadir una especificidad adicional a los procedimientos y kits divulgados en el presente documento. Ejemplos de sondas de ácido nucleico específicos que se pueden usar de acuerdo con la presente divulgación (y se pueden diseñar en base a las secuencias exónicas mostradas en la tabla 1) se exponen en la tabla 2, a continuación:
TABLA 2: Sondas de ácido nucleico
Tamaño (nº de bases) Nucleótidos
Sonda 1 20 1-20 de la SEC ID Nº 9
Sonda 2 30 1-30 de la SEC ID Nº 9
Sonda 3 40 1-40 de la SEC ID Nº 9
Sonda 4 20 1-20 de la SEC ID Nº 10
Sonda 5 30 1-30 de la SEC ID Nº 10
Sonda 6 40 1-40 de la SEC ID Nº 10
Sonda 7 20 89-108 de la SEC ID Nº 9
Sonda 8 30 114-143 de la SEC ID Nº 10
Sonda 9 30 257-286 de la SEC ID Nº 9
Sonda 10 20 284-303 de la SEC ID Nº 10
Sonda 11 20 274-293 de la SEC ID Nº 9
Por supuesto, como entenderá el experto en la técnica, se pueden diseñar una multitud de sondas adicionales a partir de la misma o de otra región de la SEC ID Nº 9, así como a partir de las SEC ID Nº 10 y 13 y otras secuencias
5 de la presente divulgación, estén dirigidas a uniones exónicas o no. Quedará claro que los tamaños de las sondas indicados en la tabla 2 son arbitrarios y que se puede diseñar una multitud de otras secuencias que se pueden usar de acuerdo con la presente divulgación.
El experto en la técnica reconocerá fácilmente que las secuencias de ácido nucleico divulgadas en el presente
10 documento (por ejemplo, sondas y cebadores) se pueden incorporar en uno cualquiera de los formatos del kit establecidos que son bien conocidos en la técnica.
En una realización del procedimiento descrito anteriormente, una sonda de ácido nucleico se inmoviliza en un soporte sólido. Entre los ejemplos de dichos soportes sólidos se incluyen plásticos tales como policarbonatos,
15 carbohidratos complejos tales como agarosa y sefarosa y resinas acrílicas, tales como esferas de poliacrilamida y de látex. En la técnica se conocen bien las técnicas para introducir acoplas las sondas de ácido nucleico a dichos soportes sólidos.
Las muestras de ensayo adecuadas para los procedimientos con sondas de ácido nucleico de la presente
20 divulgación incluyen, por ejemplo, células o extractos de ácido nucleico de células, o fluidos biológicos (por ejemplo, orina). La muestra usada en los procedimientos descritos anteriormente variarán según el formato del ensayo, el procedimiento de detección y la naturaleza de los tejidos, células o extractos que se van a analizar. En la técnica se conocen bien los procedimientos para preparar extractos de ácido nucleico de células y pueden adaptase con facilidad con el fin de obtener una muestra que sea compatible con el procedimiento usado. Preferentemente, la
25 muestra es una muestra de orina. Cuando se usa la muestra de orina, deberá contener al menos una célula de próstata con el fin de permitir la identificación del marcador específico de próstata de la presente invención. De hecho, suponiendo que la semivida del ARNm de PCA3 en una muestra biológica sin tratar no es adecuada para permitir fácilmente la conservación de la integridad de su secuencia, la muestra recogida, sea de orina o de otro tipo, debería, antes de someterla a un tratamiento, contener al menos una célula de próstata. Se reconocerá que el
30 número de células en la muestra tendrán un impacto sobre la validación del ensayo y sobre el nivel relativo del PCA3 medido (o segundo marcador específico de próstata).
III. Kit para detectar la presencia de ácido nucleico de PCA3 en una muestra
35 En el presente documento también se divulga un kit para diagnosticar cáncer de próstata que sea sensible y específico (es decir, que disminuya el número de falsos positivos). Dicho kit generalmente comprende un primer medio contenedor que tiene dispuestos en su interior al menos una sonda o cebador oligonucleótido que hibrida con una secuencia de ácido nucleico de PCA3 específico de cáncer de próstata. En el presente documento también se divulga un kit que además comprende un segundo medio contenedor sondas o cebadores oligonucleotídicos que
40 son específicos de un segundo marcador específico de próstata, de modo que se valida un resultado negativo con PCA3.
En una realización concreta de la presente invención, este kit (E) comprende un primer par que permite la amplificación de PSA, hK2/KLK2, PSMA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida y PCGEM1). Por supuesto, la presente
45 divulgación también abarca el uso de un tercer marcador específico de próstata.
Los oligonucleótidos (sondas o cebadores) del kit se pueden usar en, por ejemplo, un ensayo NASBA, PCR o de hibridación. Los ensayos de amplificación se pueden adaptar para la detección en tiempo real de múltiples productos de amplificación (es decir, ensayos de amplificación en tiempo real multiplexados).
En una realización concreta relacionada, el kit además incluye otros contenedores que comprenden componentes
5 tales como oligonucleótido o un cebador adicional y/o uno o más de los siguientes: tampones, reactivos a usar en el ensayo (por ejemplo, reactivos de lavado, polimerasas u otros) y reactivos capaces de detectar la presencia de sondas o cebadores de ácido nucleico unido. Ejemplos de reactivos de detección incluyen, entre otros, sondas marcadas radiactivamente, sondas marcadas enzimáticamente (peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina) y sondas marcadas por afinidad (biotina, avidina o estreptavidina). En una realización, los reactivos de detección son sondas
10 balizas moleculares que hibridan específicamente con los productos de amplificación. En otra realización, los reactivos de detección son compuestos quimioluminiscentes tales como éster de acridinio (EA).
Por ejemplo, un kit compartimentalizado de acuerdo con la presente divulgación incluye cualquier kit en el que los reactivos están contenidos en contenedores separados. Dichos contenedores incluyen contenedores pequeños de 15 vidrio, contenedores de plástico o tiras de plástico o papel. Dichos contenedores permiten la eficiente transferencia de reactivos de un compartimento a otro compartimento de modo que las muestras y los reactivos no sufren contaminación cruzada y los agentes o soluciones de cada contenedor pueden añadirse de un modo cuantitativo de un compartimento a otro. Dichos contenedores incluirán un contenedor que aceptará la muestra de ensayo (por ejemplo, un extracto de ARN de una muestra biológica o de células), un contenedor que contiene los cebadores 20 usados en el ensayo, contenedores que contienen enzimas, contenedores que contienen reactivos de lavado y contenedores que contienen los reactivos usados para detectar los productos de extensión. Como se ha mencionado anteriormente, un experto en la técnica a la que pertenece la presente divulgación puede adaptar la separación o combinación de los reactivos de acuerdo con el tipo de kit que se prefiere (por ejemplo, un kit de diagnóstico basado en procedimientos de amplificación o hibridación o ambos), los tipos de reactivos usados y su
25 estabilizada u otras propiedades intrínsecas. En una realización, un contenedor contiene los reactivos de amplificación y un contenedor aparte contiene el reactivo de detección. En otra realización, los reactivos de amplificación y detección están contenidos en el mismo contenedor.
Los kits también pueden contener oligonucleótidos que sirven como oligómeros de captura para purificar los ácidos
30 nucleicos objetivo de una muestra. Ejemplos de oligómeros de captura tienen secuencias de al menos 15 nucleótidos complementarios de una porción del ácido nucleico objetivo de PCA3. Las realizaciones de los oligómeros de captura pueden tener bases adicionales unidas en un extremo 3’ o 5’ de la secuencia que es complementaria a la secuencia objetivo de PCA3 que puede actuar funcionalmente en una etapa de hibridación para capturar el ácido nucleico objetivo. Dichas secuencias adicionales son, preferentemente, una secuencia de cola
35 homopolimérica, tal como una secuencia de poli-A o de poli-T, aunque otras realizaciones de secuencias de cola están incluidas en los oligómeros de captura divulgados en el presente documento. En una realización, se puede usar la proteína de unión CAP (por ejemplo, eIF4G-4E) o parte de la misma para capturar los ARNm que contienen la estructura de CAP (Edery y col., 1987, Gene 74 (2): 517-525). En otra realización se usa un reactivo de captura no específico (por ejemplo, esferas de sílice).
40 Kits útiles para poner en práctica los procedimientos divulgados en el presente documento pueden incluir los que incluyen cualquier oligonucleótido de amplificación y/o sondas de detección divulgados en el presente documento que se envasan en combinación. Los kits también pueden incluir oligómeros de captura para purificar el ácido nucleico objetivo de PCA3 de una muestra, cuyos oligómeros de captura pueden envasarse en combinación con los
45 oligonucleótidos de amplificación y/o las sondas de detección.
En una realización adicional, las células contenidas en muestras de orina miccionadas obtenidas tras un tacto rectal atento se recogen y se lisan en un tampón de lisis. Se extraen los ácidos nucleicos (por ejemplo, del lisado mediante extracción en fase sólida en, por ejemplo, esferas de sílice). La detección de la presencia de ARN codificado por el
50 gen de PCA3 en el extracto de ácido nucleico se realiza mediante una amplificación de ARN específica in vitro acoplada a detección en tiempo real de productos amplificados mediante sondas específicas de fluorescencia. En este procedimiento, de forma simultánea a la amplificación del ARN específico de cáncer de próstata de PCA3 se produce la amplificación del segundo marcador específico de próstata (tal como el ARN de PSA) como control de la presencia en la muestra de orina de células de próstata.
55 Los procedimientos de cribado y de diagnóstico divulgados en el presente documento no requieren que se detecte la totalidad de la secuencia de ARN de PCA3. En su lugar, solo es necesario detectar un fragmento o longitud de ácido nucleico que sea suficiente para detectar la presencia del ácido nucleico de PCA3 de un individuo normal o afectado, la ausencia de dicho ácido nucleico o una estructura alterada de dicho ácido nucleico (tal como un patrón de corte y
60 empalme aberrante). Con este fin, se usa cualquiera de las sondas o cebadores como se han descrito anteriormente y se pueden diseñar muchas más según lo convencionalmente conocido en la técnica en base a las secuencias descritas en el presente documento y otras conocidas en la técnica.
Debe entenderse que aunque la siguiente discusión está dirigida específicamente a pacientes humanos, las 65 enseñanzas también son aplicables a cualquier animal que exprese PCA3.
Los procedimientos de diagnóstico y cribado divulgados en el presente documento son especialmente útiles para un paciente que se sospecha que está en riesgo de desarrollar una enfermedad asociada con una alteración del nivel de expresión de PCA3 según los antecedentes familiares o para un paciente en el que se desee diagnosticar una enfermedad relacionada con PCA3 (por ejemplo, cáncer de próstata). Los procedimientos divulgados en el presente
5 documento también se pueden usar para monitorizar la progresión del cáncer de próstata en un paciente como se ha descrito anteriormente.
10 Rendimiento clínico usando una realización ilustrativa de los procedimientos divulgados en el presente documento
Estimando el rendimiento clínico del procedimiento se realizó un estudio piloto con 517 pacientes en los que se han programado biopsias con aguja guiadas por ultrasonidos procedentes de cinco centros médicos universitarios ubicados en Montreal y Quebec (Canadá) entre septiembre de 2001 y junio de 2202. Cada muestra se procesó
15 usando las etapas siguientes:
Obtención de muestras
Tras un tacto rectal atento se obtuvieron los primeros 20 a 30 ml de orina miccionada en contendores de plástico de 20 80 ml (el paciente orina directamente en el contenedor estéril).
Inmediatamente se añadió un volumen igual de tampón de muestras (fosfato 0,1M (Na2HPO4 0,06M, NaH2PO4 0,04M) NaCl 0,3M , pH 7,0) y la solución se mezcló mediante inversión.
25 Si no se procesa inmediatamente, las muestras se refrigeraron entre 2-8ºC durante hasta tres días hasta su posterior procesamiento. En vista de la etapa de recuperación de células deberá evitarse la congelación.
Recuperación de células
30 La muestra se mezcló mediante inversión y el contenedor se golpeó suavemente sobre la bancada con el fin de desprender las células de las paredes internas del mismo. Después se transfirió la muestra a uno o dos (en caso necesario) tubos cónicos de polipropileno (40 ml/tubo).
Las células se sedimentaron mediante centrifugación en una centrífuga de mesa a 1.400 g durante 15 minutos. Por 35 último, se decantó el sobrenadante y las células se lisaron de inmediato.
Lisis celular
Al sedimento celular de la orina se añadieron 400 μl de tampón de lisis (GuSCN 4,68M, EDTA 20Mm, 1,2% de Triton 40 X-100™, Tris-HCl 46 mM, pH 7,2).
Después, el sedimento celular se agitó en vórtex enérgicamente durante 20 segundos con el fin de lisar las células. Es importante asegurarse de que no queda nada de materia particulada. El lisado era transparente y no demasiado viscoso.
45 El lisado se transfirió a microtubos de 1,5 ml y se agitó en vórtex durante 30 segundos.
Ahora, si se desea, las células lisadas se pueden almacenar a :-70°C de forma indefinida.
50 Extracción de ácido nucleico
La suspensión de sílice (60 g de sílice ±80% de tamaño de partícula de 1-5 μm, añadir agua MilliQ a un volumen final de 500 ml) primero se agitó en vórtex enérgicamente durante 30 segundos hasta que se obtuvo una suspensión homogénea opaca.
55 Después, inmediatamente se extrajeron 200 μl de la suspensión y se añadieron a la muestra lisada. A continuación, se agitaron en vórtex enérgicamente todos los tubos durante 15 segundos uniendo los ácidos nucleicos a la sílice.
En una gradilla de tubos de ensayo se preparó una serie de columnas de Microspin™ Columns identificando cada 60 unidad de filtro con el número adecuado de paciente.
El contenido de cada microtubo que contiene las células lisadas y la sílice se transfirieron a la unidad de filtro de membrana de una columna Microspin™. Facilitando la transferencia de la materia particulada, el microtubos se agitó en vórtex brevemente (aproximadamente 5 segundos) con el fin de resuspender el contenido. Se realizó lo mismo
65 antes de la transferencia. Las puntas se cambiaron entre muestras.
Las columnas Microspin™ se centrifugaron en una microcentrífuga no refrigerada a 10.000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente (18ºC-25ºC). El filtro de membrana retuvo los ácidos nucleicos unidos a sílice, mientras que otros componentes celulares permanecieron en el flujo.
5 Entretanto se preparó una serie de microtubos de 2 ml correspondientes al número de columnas Microspin™.
Las unidades de filtro de membrana que contenían la sílice se transfirieron a nuevos microtubos de 2 ml. A cada unidad de filtro de membrana se añadieron 500 μl de tampón de lavado (GuSCN 5,3M, Tris-HCl 52 mM, pH 6,4) Después, las columnas Microspin™ se centrifugaron en una microcentrífuga no refrigerada a 10.000 rpm durante 5
10 minutos a temperatura ambiente.
En una gradilla de tubos de ensayo se preparó una serie nueva de microtubos de 2 ml.
Las unidades de filtro de membrana con la sílice se transfirieron a nuevos microtubos de 2 ml. A las unidades de 15 filtro de membrana se añadieron 600 μl de etanol al 70%. Después, las columnas Microspin™ se centrifugaron en una microcentrífuga no refrigerada a 10.000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
En una gradilla de tubos de ensayo se preparó una serie nueva de microtubos de 2 ml.
20 Las unidades de filtro de membrana con la sílice se transfirieron a nuevos microtubos de 2 ml. Desechar los microtubos que contienen el flujo continuo.
La unidad de filtro de membrana que contiene microtubos se transfirieron a continuación a un bloque de calentamiento a 65°C ± 1°C instalado en una campana de humos.
25 Todos los tubos se abrieron cuidadosamente garantizando la evaporación y se incubaron durante aproximadamente 10 minutos secando la sílice.
A cada unidad de filtro de membrana se añadieron 200 μl de tampón de elución (agua sin DNasa/RNasa)
30 Después, las unidades de filtro de membrana se centrifugaron en una microcentrífuga a 10.000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Las etapas de elución se repitieron una vez obteniendo un segundo eluato. Estas etapas eluyen ácidos nucleicos de 35 la sílice y los concentran en el flujo continuo.
Se extrajeron las unidades de microfiltro y se conservaron los dos microtubos que contenían la elución con ácido nucleico.
40 Para cada eluato, tres alícuotas de ≅ 50 μl de ácidos nucleicos se almacenaron a :-70°C
Amplificación y detección de ARN in vitro
La muestra del eluato de ácido nucleico a analizar se descongeló primero en hielo. La mezcla de la reacción se 45 preparó después de acuerdo con el número de reacciones a realizar. Cada muestra se realizó al menos por duplicado.
10 μl de la mezcla de reacción se distribuyó en microtubos identificados [Tris-HCl 80mM, pH 8,5, MgCl2 24mM, KCI 180mM, DTT 10mM, 2mM de cada dNTP, 4mM de rATP, rUTP, CTP, rGTP 3mM, ITP 1 mM, 30% de DMSO, 3% de
50 sacarosa, 1% de D-Manitol, 1% de Dextrano T-40, cebadores de PSA 208nM (N2psaP1 B, SEC ID Nº 1 y N2psaP2B, SEC ID Nº 2), cebadores de PCA-3 417nM (NOpcaP1A, SEC ID Nº 3 y N0pcaP2B, SEC ID Nº 4), baliza de PSA 84nM (BpsaRD-4, SEC ID N1 5), baliza de PCA-3 166nM (BpcaFD-4, SEC ID Nº 6).
A cada tubo se añadieron 5 μl del eluato de la muestra con ácido nucleico y se mezclaron.
55 Los tubos se colocaron en un a thermocycler™, se calentaron a 65°C ± 1 °C durante un periodo de 5 minutos y después, la temperatura se mantuvo a 41ºC. Tras 5 minutos a 41ºC, los tubos se recuperaron y centrifugaron brevemente con el fin de eliminar las gotas de condensación de las tapas.
60 Las siguientes etapas se llevaron a cabo mejor rápidamente y la temperatura del tubo se mantuvo, preferentemente, a 41ºC.
Después, a cada tubo se añadieron rápidamente 5 μl de la mezcla de enzimas (sorbitol 375mM, 0,105 μg/μl de BSA, 0,08 unidades de Rnasa H, 32,0 unidades de ARN polimerasa de T7, 6,4 unidades de AMV-RT) y los tubos se 65 mezclaron suavemente.
Los tubos se volvieron a colocar en el incubador EasyQ™. Cuando el último tubo se hubo colocado, el incubador se mantuvo a una temperatura de 41°C ± 0,5°C durante 5 minutos.
5 Después, se centrifugaron los tubos brevemente. Rápidamente, todos los tubos de transfirieron a un espectrofluorímetro con termostato para la amplificación de ARN in vitro y detección del producto amplificado en tiempo real con las características siguientes: (1) la fuente de luz fue una lámpara halógena de cuarzo, (2) el filtro usado para la fluorescencia ROX (6-carboxi-x-rodamina-N-succinimidil-ester) a 550-620 nm y para FAM (6carboxifluoresceína N-hidroxisuccinimida éster) fue a 485-530 nm , (3) el tiempo de integración de la fluorescencia
10 por tubo fue de 20 ms; y (4) la emisión de ROX y FAM se leyó cada 30 s y el bloqueo del tubo de fijó a la temperatura de 41°C ± 1°C.
Resultados
15 Los datos de fluorescencia generados durante las dos horas de amplificación se sometieron a ajustes siguiendo el abordaje de Brown [Computer Methods and Programs in Biomedicine 65 (2001) 191-200].
Según la proporción de corte del PSA (fluo máx/fluo mín) de 1,3, de los 517 pacientes que se han analizado, 443 tenían cantidades adecuadas de células de próstata en la orina. 20 En esta población de pacientes, el 34% (151/443) tenía cáncer de próstata confirmado mediante histología.
TABLA 3: Biopsias positivas frente a las categorías de tPSA
- tPSA
- Porcentaje de pacientes Biopsias positivas
- < 4 ng/ml
- 21 % (n=94) 20% (n=19)
- 4-10 ng/ml
- 55% (n=243) 35% (n=85)
- > 10 ng/ml
- 24% (n=106) 44%(n=47)
25 La especificidad clínica (Sp) y la sensibilidad (Se) del procedimiento se ha estimado tras una clasificación estructurada en árbol usando el software S-plus™ [Insightful Corporation, Seattle, WA, USA] a partir de los datos en bruto del fluorímetro. Se han definido tres árboles estructurados para los tres tipos de pacientes definidos como un PSA en sangre total (tPSA) por debajo de 4 ng/ml, entre 4-10 ng/ml y por encima de 10 ng/ml (véanse las Figuras 2 4 y la tabla 4.
30 TABLA 4: Sensibilidad y especificidad del procedimiento
- tPSA
- Número % de Se % de Sp
- < 4 ng/ml
- 94 74 (14/19) 91 (68/75)
- 4-10 ng/ml
- 243 59 (50/85) 91 (144/158)
- > 10 ng/ml
- 106 79 (37/47) 80 (47/59)
- Global
- 443 67 (101/151) 89 (259/292)
TABLA 5: Rendimiento del procedimiento frente al tPSA total y al fPSA libre
- % de Se
- % de Sp
- tPSA � 2,5 ng/ml
- 100% (58/58) 6% (5/88)
- tPSA � 4,0 ng/ml
- 88% (51/58) 15% (13/88)
- FPSA/tPSA : 0,15
- 72% (42/58) 56% (49/88)
- FPSA/tPSA : 0,13
- 66% (38/58) 67% (59/88)
- uPM3™
- 64% (37/58) 91 % (80/88)
146/443 pacientes con fPSA disponible
35 El estudio demostró que el procedimiento tiene un valor predictivo positivo (VPP) del 75% en comparación con el PSA total (4,0 ng/ml) con un VPP de solo el 38%. El valor predictivo negativo del procedimiento es del 84% en comparación con el 81% para tPSA. La precisión global del procedimiento es del 81% en comparación con una precisión del 47% para tPSA.
<110>. DIAGNOCURE INC.
<120> PROCEDIMIENTO PARA DETECTAR CÁNCER DE PRÓSTATA EN UNA MUESTRA DE ORINA
<130> 11957.81
5 <150> US 60/445.436
<151> 7-2-2003
<160> 13
<170> PatentIn versión 3.2
<210> 1 10 <211> 47
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
aattctaata cgactcacta tagggaggat gaaacaggct gtgccga 47 15 <210> 2
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2 20 agcattccca accctggcag 20
<210> 3
<211> 45
<212> ADN
<213> Homo sapiens
25 <400> 3 aattctaata cgactcacta tagggcctgc ccatccttta aggaa 45
<210> 4
<211> 20
<212> ADN 30 <213> Homo sapiens
<400> 4
caggaagcac aaaaggaagc 20
<210> 5
<211> 26 35 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1) 40 <223> n = ROX
<220>
<221> misc_feature
<222> (26) .. (26)
<223> n = DABCYL
45 <400> 5 ncccagtctg cggcggtgtt ctgggn 26
<210> 6
<211> 30
<212> ADN 50 <213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n = FAM 55 <220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n = DABCYL
<400> 6 60 ncgcttgtga gggaaggaca ttagaagcgn 30
<210> 7
<211> 506
<212> ADN
<213> Homo sapiens 65 <400> 7
<210> 8
<211> 278
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 2037 10 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1472)..(1472) 15 <223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1517)..(1517)
<223> n es a, c, g, o t 20 <220>
<221> misc_feature
<222> (1563)..(1563)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 9
<210> 10
<211> 3582
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 10
<210> 11
<211> 7130
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 11
- <210> 12
- <211> 20
- <212> ADN
- 5
- <213> Homo sapiens
- <400> 12
- agcattccca accctggcag
- 20
- <210> 13
- <211> 3923
- 10
- <212> ADN
- <213> Homo sapiens
- <400> 13
Claims (35)
- REIVINDICACIONES1. Un procedimiento in vitro para detectar cáncer de próstata en una muestra de orina de un paciente humano, quecomprende: 5
- (a)
- realizar un ensayo de amplificación del ARN in vitro con dicha muestra que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma, usando un primer par de cebadores específico de una secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata;
- (b)
- realizar un segundo ensayo de amplificación del ARN in vitro con dicha muestra que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma, usando un segundo par de cebadores específico de una segunda secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata; y
(c) detectar dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata y dicha secuencia de ácido 15 nucleico específica de la próstata;en el que la detección de dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata o un incremento del nivel del mismo en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales se correlaciona con un riesgo de desarrollar cáncer de próstata o una presencia de cáncer de próstata en dicho paciente; yen el que una ausencia de detección de dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 específica de cáncer de próstata o detección de un menor nivel del mismo en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales y la detección de dicha segunda secuencia de ácido nucleico específica de próstata se correlaciona con25 una ausencia de cáncer de próstata o un menor riesgo de desarrollar el mismo. -
- 2.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha amplificación de ARN se lleva a cabo en tiempo real.
-
- 3.
- El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha detección se realiza mediante detección por fluorescencia, quimioluminiscencia o colorimetría.
-
- 4.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho segundo ácido nucleico específico de próstata se selecciona del grupo que consiste en: ácido nucleico de PSA, calicreína humana 2, PSMA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida y PCGEM1.
-
- 5.
- El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho ácido nucleico específico de próstata es ácido nucleico de PSA.
-
- 6.
- El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho ácido nucleico de PSA hibrida con la calicreína humana 2.
-
- 7.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dichos primeros y segundos pares de cebadores son específicos del ARNm de PCA3 y secuencias de ARNm específicas de próstata, respectivamente.
- 8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho ensayo de amplificación de ARN 45 se selecciona del grupo que consiste en:
- (a)
- amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA);
- (b)
- reacción en cadena de la polimerasa (PCR);
- (c)
- ensayo de amplificación mediada por transcripción (TMA); y
- (d)
- reacción en cadena de la ligasa.
55 9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha amplificación de PCA3 y dicho segundo ácido nucleico específico de próstata se realiza de forma simultánea. -
- 10.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha amplificación de PCA3 se lleva a cabo usando un par de cebadores compuesto por las SEC ID Nº 3 y 4.
-
- 11.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha detección de PCA3 se lleva a cabo usando una baliza molecular.
- 12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicha baliza tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 6. 65
-
- 13.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en el que dicha amplificación de PSA se lleva
a cabo usando un par de cebadores compuesto por las SEC ID Nº 1 y 2. -
- 14.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, en el que dicha detección de PSA se lleva a
cabo usando una baliza molecular de PSA. 5 -
- 15.
- El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicha baliza de PSA tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 5.
-
- 16.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en el que dicha amplificación simultánea se lleva a cabo en un contenedor.
-
- 17.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, en el que dicha detección de PSA se lleva a cabo usando un marcador quimioluminiscente en un procedimiento de detección homogéneo.
15 18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicho material quimioluminiscente es éster de acridinio. -
- 19.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que dicho ARN se extrae de dicha al menos una célula de próstata.
-
- 20.
- El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicho ARN se extrae usando:
(a) un procedimiento de purificación a base de sílice; o(b) un procedimiento de captura objetivo. 25 -
- 21.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que dicha muestra de orina es una muestra de orina miccionada de un paciente que tiene un mayor número de células de próstata en la misma.
-
- 22.
- El uso de un kit para evaluar la presencia de cáncer de próstata en un paciente o evaluar el riesgo de dicho paciente de desarrollar dicho cáncer analizando una muestra de orina de dicho paciente, en el que dicho kit comprende:
(a) un primer par de cebadores para amplificar un ARNm de PCA3 específico de cáncer de próstata asociado con elcáncer de próstata de dicha muestra que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico 35 de la misma;- (b)
- un segundo par de cebadores para amplificar un segundo ARNm específico de cáncer de próstata; y
- (c)
- reactivos que permiten una detección de dicho PCA3 y dichos segundos productos de amplificación del ácido nucleico específico de próstata cuando está presente dicho PCA3 y/o dicho ARNm específico de próstata;
en el que dicho uso permite:una correlación de una detección de dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 o un nivel incrementado del mismo 45 en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales se correlaciona con un riesgo de desarrollar cáncer de próstata o una presencia de cáncer de próstata en dicho paciente; yuna correlación de una ausencia de detección de dicha secuencia de ácido nucleico de PCA3 o detección de un menor nivel del mismo en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales y la detección de dicha segunda secuencia de ácido nucleico específica de próstata, con una ausencia de cáncer de próstata o un menor riesgo de desarrollar el mismo. - 23. El uso de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho ARNm específico de próstata se selecciona del grupoque consiste en: ARNm de PSA, calicreína humana 2, PSMA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida y PCGEM1. 55
- 24. Un procedimiento de amplificación de ARN in vitro para determinar una predisposición a desarrollar cáncer de próstata o una presencia de cáncer de próstata en un paciente, que comprende:
- (a)
- poner en contacto una muestra de orina de dicho paciente que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma con al menos un oligonucleótido que hibrida con un ARNm de PCA3 específico de cáncer de próstata seleccionado del grupo que consiste en:
- (i)
- un polinucleótido de acuerdo con las SEC ID Nº 9, 10 o 13.
65 (ii) una secuencia de polinucleótido que hibrida en condiciones de rigurosidad elevada con la secuencia de polinucleótidos de (i); y(iii) una secuencia de polinucleótidos completamente complementaria a la de (i) o (ii);(b) poner en contacto dicha muestra de orina de dicho paciente que comprende al menos una célula de próstata o5 extracto de ácido nucleico de la misma con al menos un oligonucleótido que hibrida con un segundo ARNm específico de próstata;- (c)
- detectar en dicha muestra de orina la cantidad de dicho PCA3 y dichos segundos polinucleótidos específicos de próstata; y
- (d)
- comparar la cantidad de dicho polinucleótido de PCA3 que hibrida con el oligonucleótido con un valor de corte predeterminado, validando dicha detección de PCA3 con dicha detección de dichos segundos polinucleótidos específicos de próstata y de este modo, determinar la presencia o ausencia de cáncer de próstata en la muestra de orina o extracto de la misma.
-
- 25.
- El procedimiento de la reivindicación 24, en el que dicho ARNm específico de próstata se selecciona del grupo que consiste en: ARNm de PSA, calicreína humana 2, PSMA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida y PCGEM1 y un ARNm de PCA3 específico de próstata que no está asociado con el cáncer de próstata.
-
- 26.
- El uso de acuerdo con la reivindicación 22 o 23, en el que:
(a) dicho ARNm de PCA3 y dicho segundo ARNm específico de próstata se amplifican de forma simultánea en el mismo contenedor;25 (b) la detección de dicho ácido nucleico de PCA3 y dicho segundo ácido nucleico específico de próstata se realiza en el mismo contenedor; o(c) una combinación de (a) y (b). - 27. El uso de acuerdo con la reivindicación 22, 23 o 26, en el que dicho kit comprende además un control interno (CI), así como un cebador y/o una sonda y/o un reactivo para la amplificación y/o hibridación y/o detección de dicho control interno.
- 28. El uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que dicho control interno (CI) se selecciona del grupo que 35 consiste en:
- (a)
- ácido nucleico purificado;
- (b)
- células;
- (c)
- partículas virales que contienen ácidos nucleicos objetivos; y
- (d)
- orgánulos. 45 29. El uso de acuerdo con la reivindicación 27 o 28, en el que la detección de dicho ácido nucleico de control interno
(CI) de dicho PCA3 y de dicho segundo ácido nucleico específico de próstata es diferente. - 30. El procedimiento de la reivindicación 24 o 25, en el que la cantidad de dicho polinucleótido de PCA3 y de dicho segundo polinucleótido específico de próstata se determina usando un ensayo seleccionado del grupo que consiste en:(a) un ensayo de amplificación; y
- (b)
- un ensayo de hibridación. 55
- 31. El procedimiento de la reivindicación 24, 25 o 30, en el que la cantidad de dicho polinucleótido de PCA3 y de dicho segundo polinucleótido específico de próstata se determina usando un ensayo seleccionado del grupo que consiste en:
- (a)
- reacción en cadena de la polimerasa (PCR);
- (b)
- amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA);
- (c)
- amplificación mediada por transcripción (TMA); y 65
(d) reacción en cadena de la ligasa (LCR). - 32. Un procedimiento in vitro de monitorizar una variación en el tiempo en el nivel de un ARNm de PCA3 asociado con cáncer de próstata en un paciente, que comprende:5 (a) poner en contacto una muestra de orina de dicho paciente que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma con al menos un oligonucleótido que hibrida con dicho ARNm de PCA3 asociado con el cáncer de próstata seleccionado del grupo que consiste en:
- (i)
- un polinucleótido de acuerdo con las SEC ID Nº 9, 10 o 13.
- (ii)
- una secuencia de polinucleótidos que hibrida en condiciones de rigurosidad elevada con la secuencia de nucleótidos de (i); y
(iii) una secuencia de polinucleótidos completamente complementaria a la de (i) o (ii); 15- (b)
- poner en contacto dicha muestra de orina de dicho paciente que comprende al menos una célula de próstata o extracto de ácido nucleico de la misma con al menos un oligonucleótido que hibrida con un segundo ARNm específico de próstata;
- (c)
- detectar en dicha muestra de orina las cantidades de dicho ARNm de PCA3 y dicho segundo ARNm específico de próstata;
- (d)
- repetir las etapas (a) y (b) usando una muestra de orina del paciente que comprende al menos una célula de
próstata o extracto de ácido nucleico de la misma del paciente en un punto de tiempo posterior; y 25(e) comparar la cantidad de dicho ARNm de PCA3 detectado en la etapa (d) con la cantidad de ARNm de PCA3 detectado en la etapa (c) y de este modo monitorizar la variación en el tiempo en el nivel de dicho ARNm de PCA3 asociado con el cáncer de próstata en el paciente,en el que una ausencia de detección de dicho ARNm de PCA3 se valida mediante la detección de dicho ARNm de PCA3 específico de próstata en dicha muestra de orina. - 33. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que dicho segundo ARNm específico de próstata se seleccionadel grupo que consiste en: 35
- (a)
- ARNm de PSA, calicreína humana 2, PSMA, transglutaminasa 4, fosfatasa ácida y PCGEM1 y un ARNm de PCA3 específico de próstata que no está asociado con el cáncer de próstata; y
- (b)
- un ARNm de PSA que también es hibridable con otros miembros de la familia de la calicreína.
- 34. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, 24, 25 y 30 a 33, en el que la muestra de orina o extracto de la misma está enriquecida con un control interno (CI) seleccionado del grupo que consiste en:(a) ácido nucleico purificado; 45
- (b)
- células;
- (c)
- partículas virales que contienen ácidos nucleicos objetivos; y
- (d)
- orgánulos.
- 35. El uso de un kit de diagnóstico para la detección de cáncer de próstata en un paciente o para evaluar el riesgo de dicho paciente de desarrollar dicho cáncer analizando una muestra de orina de dicho paciente, en el que dicho kit de diagnóstico comprende:
- (a)
- al menos un contenedor que tiene dispuesto en el mismo al menos una sonda oligonucleotídica o cebador que hibrida con un ARNm de PCA3 específico de cáncer de próstata de dicha muestra seleccionado del grupo que consiste en:
- (i)
- una secuencia de polinucleótidos de PCA3 de acuerdo con las SEC ID Nº 9, 10 o 13;
- (ii)
- una secuencia de polinucleótidos que es completamente complementaria a la de (i); y
(iii) una secuencia de polinucleótidos que hibrida en condiciones de rigurosidad elevada con (i) o (ii); 65- (b)
- al menos una sonda oligonucleotídica o cebador que hibrida con un segundo ARNm específico de próstata o
complementario del mismo de dicha muestra; y- (c)
- reactivos que permiten una detección de dicho ARNm de PCA3 y de dicho segundo ARNm específico de próstata cuando está presente dicho ARNm de PCA3 y/o dicho ARNm específico de próstata;
5 en el que una ausencia de detección de dicho ARNm de PCA3 o detección de un menor nivel del mismo en comparación con la cantidad presente en las muestras control normales y una presencia de dicho segundo ARNm específico de próstata valida una ausencia de cáncer de próstata o un menor riesgo de desarrollar el mismo en dicho paciente. - 36. El uso de acuerdo con la reivindicación 35, en el que dicho reactivo de detección comprende un grupo indicadoro marcador seleccionado del grupo que consiste en:
- (a)
- radioisótopos; 15
(b) enzimas;- (c)
- grupos fluorescentes; 20 (d) biotina;
(e) grupos quimioluminiscentes; y- (f)
- partículas de pigmento. 25
-
- 37.
- El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dicha muestra de orina que tiene un número incrementado de células de próstata es una muestra de orina de un tacto rectal.
-
- 38.
- El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dicha muestra de orina contiene esperma.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US44543603P | 2003-02-07 | 2003-02-07 | |
US445436P | 2003-02-07 | ||
PCT/CA2004/000170 WO2004070056A2 (en) | 2003-02-07 | 2004-02-09 | Method to detect prostate cancer in a sample |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2427853T3 true ES2427853T3 (es) | 2013-11-04 |
Family
ID=32850986
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES04709177T Expired - Lifetime ES2427853T3 (es) | 2003-02-07 | 2004-02-09 | Procedimiento para detectar cáncer de próstata en una muestra |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US20050282170A1 (es) |
EP (1) | EP1592809B1 (es) |
JP (1) | JP4824540B2 (es) |
AU (2) | AU2004209578A1 (es) |
CA (1) | CA2513780C (es) |
ES (1) | ES2427853T3 (es) |
WO (1) | WO2004070056A2 (es) |
Families Citing this family (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2286304C (en) | 1997-04-10 | 2007-08-07 | Diagnocure Inc. | Pca3, pca3 genes, and methods of use |
JP4495349B2 (ja) * | 1999-01-28 | 2010-07-07 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | 癌の遺伝マーカーを生物学的サンプルにおいて検出するための核酸配列 |
ES2260059T3 (es) * | 1999-09-29 | 2006-11-01 | Diagnocure Inc. | Rna mensajero del pca3 en tejidos benignos y malignos de prostata. |
WO2004070056A2 (en) | 2003-02-07 | 2004-08-19 | Diagnocure Inc. | Method to detect prostate cancer in a sample |
CA2432365A1 (en) * | 2003-06-30 | 2004-12-30 | Jack A. Schalken | Specific method of prostate cancer detection based on pca3, and kits therefore |
CA2502549C (en) * | 2004-04-23 | 2016-02-16 | Becton, Dickinson And Company | Use of an extraction control in a method of extracting nucleic acids |
US11105808B2 (en) | 2004-11-12 | 2021-08-31 | Health Discovery Corporation | Methods for screening, predicting and monitoring prostate cancer |
CA2491067A1 (en) * | 2004-12-24 | 2006-06-24 | Stichting Katholieke Universiteit | Mrna rations in urinary sediments and/or urine as a prognostic marker for prostate cancer |
EP1909108B1 (en) | 2005-03-10 | 2019-05-29 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods to perform assays for detecting or quantifiying analytes |
EP1861721B1 (en) | 2005-03-10 | 2017-05-03 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods to perform assays for detecting or quantifying analytes within samples |
AU2006291054B2 (en) | 2005-09-12 | 2011-10-13 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Recurrent gene fusions in prostate cancer |
US9957569B2 (en) | 2005-09-12 | 2018-05-01 | The Regents Of The University Of Michigan | Recurrent gene fusions in prostate cancer |
EP2461163A3 (en) * | 2007-03-20 | 2012-09-26 | Becton, Dickinson and Company | Assays using surface-enhanced raman spectroscopy (sers)-active particles |
AU2008275303B2 (en) | 2007-07-06 | 2012-05-03 | The Regents Of The University Of Michigan | MIPOL1-ETV1 gene rearrangements |
GB2465088C (en) * | 2008-10-30 | 2016-01-27 | Caris Mpi Inc | miRNA expression in the characterisation and classification of cancer |
CA2774349C (en) | 2009-09-17 | 2019-03-19 | The Regents Of The University Of Michigan | Recurrent gene fusions in prostate cancer |
US9315802B2 (en) * | 2009-12-30 | 2016-04-19 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | RNA isolation from soluble urine fractions |
EP2407555A1 (en) | 2010-07-14 | 2012-01-18 | Fundació Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d'Hebron, Fundació Privada | Methods and kits for the diagnosis of prostate cancer |
EP2407554A1 (en) | 2010-07-14 | 2012-01-18 | Fundacio Institut de Recerca de l'Hospital Universitari Vall d'Hebron | Methods and kits for the diagnosis of prostate cancer |
DK3147373T3 (da) | 2010-07-27 | 2019-08-12 | Genomic Health Inc | Fremgangsmåde til anvendelse af genekspression til at bestemme prognosen for prostatacancer |
US8945556B2 (en) | 2010-11-19 | 2015-02-03 | The Regents Of The University Of Michigan | RAF gene fusions |
US9663781B2 (en) | 2010-12-30 | 2017-05-30 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Diagnosis of prostate cancer |
US9977033B2 (en) | 2012-09-11 | 2018-05-22 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Methods for assessing cancer recurrence |
WO2014110230A2 (en) * | 2013-01-09 | 2014-07-17 | Health Research, Inc. | Methods for diagnosing cancer based on small nucleolar rna hbii-52 |
CN104878077A (zh) * | 2014-02-28 | 2015-09-02 | 谭巍 | PCA3 mRNA/ACPP mRNA RT-PCR检测引物及检测试剂盒 |
PT3123381T (pt) * | 2014-03-28 | 2023-12-22 | Opko Diagnostics Llc | Composições e métodos relacionados com o diagnóstico de cancro da próstata |
EP3318878A3 (en) | 2015-03-27 | 2018-07-11 | Opko Diagnostics, LLC | Prostate antigen standards and uses thereof |
US11913076B2 (en) * | 2017-05-12 | 2024-02-27 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Prostate cancer gene profiles and methods of using the same |
CN108441557A (zh) * | 2018-01-31 | 2018-08-24 | 广州瑞博奥生物科技有限公司 | Pca3和psa基因检测试剂盒及其应用 |
CN110423797A (zh) * | 2019-07-11 | 2019-11-08 | 杨海涛 | 一种前列腺癌pca3基因双重实时pcr的引物、方法及试剂盒 |
Family Cites Families (99)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2422956A1 (fr) * | 1978-04-13 | 1979-11-09 | Pasteur Institut | Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4690890A (en) | 1984-04-04 | 1987-09-01 | Cetus Corporation | Process for simultaneously detecting multiple antigens using dual sandwich immunometric assay |
US4786600A (en) * | 1984-05-25 | 1988-11-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Autocatalytic replication of recombinant RNA |
JPS6147500A (ja) | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
EP0173494A3 (en) | 1984-08-27 | 1987-11-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chimeric receptors by dna splicing and expression |
GB8422238D0 (en) | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
JPS61134325A (ja) | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 |
US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4965188A (en) * | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
JPS63501765A (ja) | 1985-11-01 | 1988-07-21 | インタ−ナショナル、ジェネティック、エンジニアリング インコ−ポレ−テッド | 抗体遺伝子のモジュ−ル組立体、それにより産生された抗体及び用途 |
US4800159A (en) * | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
US4851331A (en) | 1986-05-16 | 1989-07-25 | Allied Corporation | Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase |
FR2602592B1 (fr) | 1986-08-06 | 1989-06-30 | Alain Baret | Utilisation du systeme enzymatique xanthine-oxydase en immuno-analyse, procedes de dosage correspondants et coffrets de reactifs necessaires pour la mise en oeuvre de ces procedes. |
US5541308A (en) * | 1986-11-24 | 1996-07-30 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms |
US5202231A (en) * | 1987-04-01 | 1993-04-13 | Drmanac Radoje T | Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes |
US5149625A (en) * | 1987-08-11 | 1992-09-22 | President And Fellows Of Harvard College | Multiplex analysis of DNA |
US5639604A (en) * | 1987-09-21 | 1997-06-17 | Gen-Probe Incorporated | Homogeneous protection assay |
US5585481A (en) * | 1987-09-21 | 1996-12-17 | Gen-Probe Incorporated | Linking reagents for nucleotide probes |
US5283174A (en) * | 1987-09-21 | 1994-02-01 | Gen-Probe, Incorporated | Homogenous protection assay |
CA1323293C (en) | 1987-12-11 | 1993-10-19 | Keith C. Backman | Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization |
JPH01153989A (ja) | 1987-12-11 | 1989-06-16 | Nec Corp | フェーズドアレイレーダ装置 |
US5002867A (en) | 1988-04-25 | 1991-03-26 | Macevicz Stephen C | Nucleic acid sequence determination by multiple mixed oligonucleotide probes |
NL8801147A (nl) | 1988-05-02 | 1989-12-01 | Tno | Werkwijze voor het detecteren van genetische variatie, en daarvoor geschikte kit. |
DK167254B1 (da) | 1988-07-21 | 1993-09-27 | Hartmann As Brdr | Fremgangsmaade til fremstilling af formede genstande af et fluidiseret cellulosefibermateriale |
US5183949A (en) | 1988-09-22 | 1993-02-02 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Rabbit model for diagnosing and testing vaccines or therapeutic agents against aids |
US5118801A (en) | 1988-09-30 | 1992-06-02 | The Public Health Research Institute | Nucleic acid process containing improved molecular switch |
US5219989A (en) * | 1988-12-13 | 1993-06-15 | Mcgill University | Bifunctional protein for the isolation of capped mRNA |
US5082670A (en) | 1988-12-15 | 1992-01-21 | The Regents Of The University Of California | Method of grafting genetically modified cells to treat defects, disease or damage or the central nervous system |
US5175383A (en) | 1989-02-17 | 1992-12-29 | President And Fellows Of Harvard College | Animal model for benign prostatic disease |
US5112736A (en) * | 1989-06-14 | 1992-05-12 | University Of Utah | Dna sequencing using fluorescence background electroblotting membrane |
US5656207A (en) * | 1989-06-24 | 1997-08-12 | Gen Probe Incorporated | Detecting or quantifying multiple analytes using labelling techniques |
US5174986A (en) | 1989-07-05 | 1992-12-29 | Genpharm International, Inc. | Method for determining oncogenic potential of a chemical compound |
CA2020958C (en) * | 1989-07-11 | 2005-01-11 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification methods |
IE911869A1 (en) | 1990-06-01 | 1991-12-04 | Regeneron Pharma | A family of map2 protein kinases |
AU662906B2 (en) | 1991-06-26 | 1995-09-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods for detection of carcinoma metastases by nucleic acid amplification |
GB9113736D0 (en) | 1991-06-26 | 1991-08-14 | Greentrac Ltd | Improvements in or relating to injection apparatus for injecting slurry into the ground |
CA2082411A1 (en) | 1991-06-28 | 1992-12-29 | Robert D. Rosenberg | Localized oligonucleotide therapy |
AU2468992A (en) | 1991-08-16 | 1993-03-16 | General Hospital Corporation, The | Method of gene delivery to post-mitotic cells |
JP3425976B2 (ja) | 1991-10-17 | 2003-07-14 | 真作 森 | 周波数変換回路 |
AU3129993A (en) | 1991-11-08 | 1993-06-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Localized oligonucleotide therapy |
JPH07502650A (ja) | 1991-12-16 | 1995-03-23 | イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | ストレプトミセスにおけるP450soyおよびフェレドキシン−soyの構成性発現、および組み換え体生物による化学物質の生物変換 |
EP0618925B2 (en) | 1991-12-24 | 2012-04-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides |
CA2135073C (en) * | 1992-05-06 | 2002-11-19 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit |
US5674682A (en) * | 1992-10-29 | 1997-10-07 | Thomas Jefferson University | Nucleic acid primers for detecting micrometastasis of prostate cancer |
US5220880A (en) | 1992-11-02 | 1993-06-22 | Lance Alworth | Method and apparatus for maintaining live fish during transportation and storage |
ES2276390T3 (es) | 1992-11-05 | 2007-06-16 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Antigeno de membrana especifico de la prostata. |
US5503980A (en) * | 1992-11-06 | 1996-04-02 | Trustees Of Boston University | Positional sequencing by hybridization |
US5773705A (en) | 1992-12-31 | 1998-06-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Ubiquitin fusion protein system for protein production in plants |
AU685080B2 (en) | 1993-01-07 | 1998-01-15 | Thomas Jefferson University | Antisense inhibition of C-MYC to modulate the proliferation of smooth muscle cells |
US5422252A (en) * | 1993-06-04 | 1995-06-06 | Becton, Dickinson And Company | Simultaneous amplification of multiple targets |
US5837832A (en) | 1993-06-25 | 1998-11-17 | Affymetrix, Inc. | Arrays of nucleic acid probes on biological chips |
US5861242A (en) | 1993-06-25 | 1999-01-19 | Affymetrix, Inc. | Array of nucleic acid probes on biological chips for diagnosis of HIV and methods of using the same |
US6323184B1 (en) | 1993-10-15 | 2001-11-27 | Thomas Jefferson University | Arteriovenous and venous graft treatments: methods and compositions |
US5925517A (en) * | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
CA2185239C (en) | 1994-03-16 | 2002-12-17 | Nanibhushan Dattagupta | Isothermal strand displacement nucleic acid amplification |
WO1995028498A1 (en) | 1994-04-15 | 1995-10-26 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for molecular staging of prostate cancer |
US6169169B1 (en) | 1994-05-19 | 2001-01-02 | Dako A/S | PNA probes for detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis |
WO1996011266A2 (en) | 1994-10-05 | 1996-04-18 | Amgen Inc. | Method for inhibiting smooth muscle cell proliferation and oligonucleotides for use therein |
DE69535240T2 (de) | 1994-10-28 | 2007-06-06 | Gen-Probe Inc., San Diego | Zusammensetzungen und Verfahren für die gleichzeitige Detektion und Quantifizierung von einer Mehrheit spezifischer Nuklein Säure Sequenzen |
DE4439684C1 (de) | 1994-11-07 | 1996-05-09 | Delphi Automotive Systems Gmbh | Elektrische Steckverbindung |
US5919652A (en) | 1994-11-09 | 1999-07-06 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acid molecules comprising the prostate specific antigen (PSA) promoter and uses thereof |
DE19513152A1 (de) | 1995-04-07 | 1996-10-10 | Bundesrep Deutschland | Verwendung eines "Immundefizienzvirus-supprimierenden Lymphokins (ISL)" zur Hemmung der Virusvermehrung, insbesondere von Retroviren |
US5731148A (en) | 1995-06-07 | 1998-03-24 | Gen-Probe Incorporated | Adduct protection assay |
CA2260749A1 (en) | 1996-07-16 | 1998-01-22 | Gen-Probe Incorporated | Methods for detecting rna analytes using modified probes |
US6479263B1 (en) | 1996-11-14 | 2002-11-12 | Baylor College Of Medicine | Method for detection of micrometastatic prostate cancer |
US6465611B1 (en) | 1997-02-25 | 2002-10-15 | Corixa Corporation | Compounds for immunotherapy of prostate cancer and methods for their use |
US6395278B1 (en) | 1997-02-25 | 2002-05-28 | Corixa Corporation | Prostate specific fusion protein compositions |
US6800746B2 (en) | 1997-02-25 | 2004-10-05 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer |
NZ337446A (en) | 1997-02-25 | 2001-02-23 | Corixa Corp | Immunogenic portions of a prostate protein and their use in immunotherapy of prostate cancer and methods for their use |
US6261562B1 (en) | 1997-02-25 | 2001-07-17 | Corixa Corporation | Compounds for immunotherapy of prostate cancer and methods for their use |
CA2286304C (en) * | 1997-04-10 | 2007-08-07 | Diagnocure Inc. | Pca3, pca3 genes, and methods of use |
US6534273B2 (en) * | 1997-05-02 | 2003-03-18 | Gen-Probe Incorporated | Two-step hybridization and capture of a polynucleotide |
CA2287570C (en) * | 1997-05-02 | 2008-10-28 | Gen-Probe Incorporated | Two-step hybridization and capture of a polynucleotide |
EP1634966B1 (en) * | 1997-05-30 | 2010-11-03 | TrovaGene, Inc. | Methods for detection of nucleic acid sequences in urine |
US20020035244A1 (en) | 1997-09-09 | 2002-03-21 | Maurice Cohen | Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate |
KR20010083111A (ko) | 1998-07-14 | 2001-08-31 | 길리스 스티브 | 전립선암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법 |
US6037130A (en) | 1998-07-28 | 2000-03-14 | The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. | Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits |
JP4495349B2 (ja) * | 1999-01-28 | 2010-07-07 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | 癌の遺伝マーカーを生物学的サンプルにおいて検出するための核酸配列 |
FI990382A0 (fi) * | 1999-02-23 | 1999-02-23 | Arctic Partners Oy Ab | Uusi diagnostinen menetelmä |
US6528260B1 (en) | 1999-03-25 | 2003-03-04 | Genset, S.A. | Biallelic markers related to genes involved in drug metabolism |
CA2368385C (en) * | 1999-03-26 | 2012-05-15 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Prostate-specific gene, pcgem1, and methods of using pcgem1 to detect, treat, and prevent prostate cancer |
ES2260059T3 (es) * | 1999-09-29 | 2006-11-01 | Diagnocure Inc. | Rna mensajero del pca3 en tejidos benignos y malignos de prostata. |
AU7859900A (en) | 1999-10-04 | 2001-05-10 | Corixa Corporation | Compositions and methods for wt1 specific immunotherapy |
WO2001025272A2 (en) | 1999-10-04 | 2001-04-12 | Corixa Corporation | Compositions and methods for therapy and diagnosis of prostate cancer |
AU1656501A (en) | 1999-11-12 | 2001-06-06 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer |
EP1238116B1 (en) | 1999-12-17 | 2008-04-16 | Bio Merieux | Process for labeling a nucleic acid |
EP1261708A2 (en) | 2000-01-14 | 2002-12-04 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer |
AU2001236519A1 (en) * | 2000-01-24 | 2001-07-31 | Millennium Pharmaceuitcals, Inc. | Identification, assessment, prevention, and therapy of prostate cancer |
AU2001241541A1 (en) | 2000-02-17 | 2001-08-27 | Millennium Predictive Medicine, Inc. | Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of human prostate cancer |
EP1311673A2 (en) | 2000-03-27 | 2003-05-21 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer |
FR2810114B1 (fr) | 2000-06-13 | 2002-08-23 | Bio Merieux | Methode, procede, test immunologique et kit de diagnostic d'un adenocarcinome de la prostate ou d'une hypertrophie benigne de la prostate |
AU2001292842A1 (en) | 2000-09-19 | 2002-04-02 | Diadexus, Inc. | Compositions and methods relating to prostate specific genes and proteins |
WO2002030268A2 (en) | 2000-10-13 | 2002-04-18 | Eos Biotechnology, Inc. | Methods of diagnosis of prostate cancer, compositions and methods of screening for modulators of prostate cancer |
US6897024B2 (en) | 2001-05-31 | 2005-05-24 | Stichting Katholieke Universiteit More Particularly The University Medical Centre Nijmegen | Nucleic acid molecules comprising the promoter for PCA3, and uses thereof |
WO2004070056A2 (en) | 2003-02-07 | 2004-08-19 | Diagnocure Inc. | Method to detect prostate cancer in a sample |
CA2432365A1 (en) | 2003-06-30 | 2004-12-30 | Jack A. Schalken | Specific method of prostate cancer detection based on pca3, and kits therefore |
CA2491067A1 (en) | 2004-12-24 | 2006-06-24 | Stichting Katholieke Universiteit | Mrna rations in urinary sediments and/or urine as a prognostic marker for prostate cancer |
-
2004
- 2004-02-09 WO PCT/CA2004/000170 patent/WO2004070056A2/en active Application Filing
- 2004-02-09 ES ES04709177T patent/ES2427853T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-09 EP EP04709177.2A patent/EP1592809B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-09 JP JP2006501412A patent/JP4824540B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-02-09 US US10/773,440 patent/US20050282170A1/en not_active Abandoned
- 2004-02-09 CA CA2513780A patent/CA2513780C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-09 AU AU2004209578A patent/AU2004209578A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-07-10 US US12/500,749 patent/US8192931B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-03-24 AU AU2010201155A patent/AU2010201155B2/en not_active Expired
-
2012
- 2012-05-14 US US13/470,451 patent/US8546551B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2013
- 2013-08-28 US US14/011,988 patent/US20130344487A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-04-07 US US15/093,214 patent/US10006092B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2018
- 2018-06-21 US US16/014,697 patent/US11104958B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2004070056A3 (en) | 2004-09-30 |
US8192931B2 (en) | 2012-06-05 |
EP1592809A2 (en) | 2005-11-09 |
AU2010201155B2 (en) | 2013-01-10 |
WO2004070056A2 (en) | 2004-08-19 |
AU2004209578A1 (en) | 2004-08-19 |
US20120309001A1 (en) | 2012-12-06 |
US20180363064A1 (en) | 2018-12-20 |
US20110165573A1 (en) | 2011-07-07 |
JP4824540B2 (ja) | 2011-11-30 |
AU2010201155A1 (en) | 2010-04-15 |
US20050282170A1 (en) | 2005-12-22 |
US8546551B2 (en) | 2013-10-01 |
CA2513780A1 (en) | 2004-08-19 |
US11104958B2 (en) | 2021-08-31 |
EP1592809B1 (en) | 2013-04-10 |
US10006092B2 (en) | 2018-06-26 |
US20130344487A1 (en) | 2013-12-26 |
CA2513780C (en) | 2014-12-30 |
JP2006518194A (ja) | 2006-08-10 |
AU2004209578A2 (en) | 2004-08-19 |
US20160281174A1 (en) | 2016-09-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2427853T3 (es) | Procedimiento para detectar cáncer de próstata en una muestra | |
JP4944041B2 (ja) | 前立腺癌の予後判定用マーカー及び/又はテラノスティックマーカーとなる、尿沈渣及び/又は尿のmRNA比 | |
JP4741481B2 (ja) | Pca3遺伝子に基づく、前立腺癌の検知のための特異的な方法およびそれを実施するためのキット | |
CN106834426B (zh) | 用于检测胰腺癌的组合物及其用途 | |
US9096905B2 (en) | Detecting DNA methylation of BCL2, CDKN2A and NID2 genes to predict bladder cancer in humans | |
US11667909B2 (en) | Diagnosis of prostate cancer | |
WO2006053442A1 (en) | Calml3 a specific and sensitive target for lung cancer diagnosis, prognosis and/or theranosis | |
CA2530646C (en) | Specific method of prostate cancer detection based on pca3 gene, and kits therefor |