JP4824540B2 - サンプル中の前立腺癌を検出する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、従来技術の診断方法とキットよりも特異性と選択性が高い、前立腺癌についての指標を提供するための方法とキットに関する。
本明細書においては、ヌクレオチド配列は一本鎖で、5’から3'の方向を左から右に示し、当業界で一般的に使用されており、IUPAC−IUB生化学命名委員会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)の推奨する記載方法に従って1文字ヌクレオチド記号を用いて示した。
I.PCA3核酸の検出によって、サンプル中の前立腺癌の存在を発見するための方法
II.核酸の合成
III.プローブとプライマー
IV.サンプル中のPCA3核酸を検出するためのキット
存在を発見するための方法
本発明は、生物学的サンプル中のPCA3核酸の存在を、第2前立腺特異的マーカー(例えば、PSA、hK2/KLK2、PSMA、トランスグルタミナーゼ4、酸ホスファターゼやPCGEM1)の存在と共に検出する方法に加えて、サンプル中のPCA3核酸の存在量を測定する方法も包含する。これらの方法はPCA3の過剰発現に関連した前立腺癌の診断に有用である。
本発明を実施するための核酸(例えば、DNAやRNA)は公知の方法に従って得ることができる。
本発明は、前立腺癌に関連するPCA3核酸配列の存在を、サンプルから特異的に検出するための核酸に関し、該核酸は上記した核酸分子またはPCA3核酸にストリンジェントな条件下で結合するその断片を少なくとも含むものである。
別の態様においては、本発明は、高感度であり且つ特異的な(即ち、偽陽性の数を低減した)、前立腺癌を診断するためのキットに関する。このようなキットは、通常、前立腺癌特異的PCA3核酸配列にハイブリダイズする少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーの入った第1の容器を包含する。1つの態様においては、本発明は、PCA3の示す陰性の検出結果を判定するための、第2前立腺特異的マーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーの入った第2容器を更に包含する。
本発明の方法の臨床性能を概算するために、超音波ガイド下穿刺生検を行うことが予定されている、モントリオールとケベックに存在する5つの大学付属病院の患者517人に対して、2001年9月〜2002年6月にかけてパイロット試験を行った。各サンプルは下記の手順に従って処理した。
丁寧な直腸指診に続いて、初めに排出した尿の20〜30mlを滅菌80mlプラスチック容器に回収した(患者は滅菌容器に直接排尿した)。
サンプルを反転によって混合し、容器を作業台に穏やかに打ち付けて、その内壁から細胞をはがした。次にサンプルを、1つまたは(必要であれば)2つのポリプロピレン製の円錐形チューブに移した(40ml/チューブ)。
400μlの溶解バッファー(4.68MのGuSCN、20mMのEDTA、1.2%のTriton X-100TM、46mMのTris−HCl、pH7.2)を尿細胞ペレットに加えた。
所望であれば、溶解細胞を今度は−70℃以下で際限なく保存することができる。
シリカ懸濁液(60gのシリカ(±80%の粒径が1〜5μmのもの)に終量が500mlとなるようにMilliQ水を加えたもの)を、半透明の均一な懸濁液が得られまで、初めにボルテックスで激しく30秒間撹拌した。
シリカを含有するメンブランフィルターユニットを新たな2mlマイクロチューブに移した。500μlの洗浄バッファー(5.3M GuSCN、52mM Tris−HCl、pH6.4)を各メンブランフィルターユニットに加えた。次に、冷蔵状態でないマイクロ遠心機を用い、MicrospinTMカラムを室温、10,000 RPMで5分間の遠心分離に付した。
シリカを含有するメンブランフィルターユニットを新たな2mlマイクロチューブに入れた。600μlの70%エタノール溶液をメンブランフィルターユニットに加えた。次に、冷蔵状態でないマイクロ遠心機を用い、MicrospinTMカラムを室温、10,000 RPMで5分間の遠心分離に付した。
シリカを含有するメンブランフィルターユニットを新たな2mlマイクロチューブに入れた。濾液の入った古いマイクロチューブは廃棄した。
全てのチューブのふたを注意深く開けて蒸発を可能とし、シリカを乾燥するために約10分間インキュベートした。
マイクロ遠心機を用い、メンブランフィルターユニットを室温、10,000 RPMで5分間の遠心分離に付した。
マイクロフィルターユニットは廃棄し、溶出した核酸を含有する2本のマイクロチューブを残した。
各チューブの溶出液を約50μlずつに3等分し、−70℃以下で保存した。
試験のために核酸溶出サンプルを初めに氷上で溶解した。実施する反応の数に基づいて、反応混合物を用意した。各サンプルをそれぞれ少なくとも2本ずつ用意した。
チューブをサーモサイクラーTMに入れて65℃±1℃で5分間加熱し、次に温度を41℃で保持した。41℃で5分間置いた後、チューブを取り出し、凝結による液滴をふたから取り除くために短時間の遠心分離に付した。
5μlの酵素混合物(375mMのソルビトール、0.105μg/μlのBSA、0.08単位のRnaseH、32.0単位のT7 RNAポリメラーゼ、6.4単位のAMV−RT)を速やかに各チューブに加え、穏やかに混合した。
チューブはEasyQTMインキュベーターに戻した。最後のチューブが入った時点からインキュベーターの温度を41℃±0.5℃で5分間保持した。
2時間の増幅の間に生じた蛍光データのあてはめを、以下のBrownの手法[“Computer Methods and Programs in Biomedicine(生物医薬における電算手法とプログラム)”65(2001年)191〜200]に従って行った。
この患者の集団においては、34%(151/443)で組織学的に前立腺癌が確認された。
配列番号6の1番目のnはFAMであり、30番目のnはDABCYLである。
Claims (41)
- ヒト患者の前立腺癌についての指標を提供するためのin vitroの方法であって、
(a)患者から得た尿サンプルまたはその核酸抽出物について、前立腺癌特異的PCA3 mRNAに特異的な第1プライマーペアを用いた第1のin vitroのRNA増幅アッセイを行い、但し、該尿サンプルは、射精直後に採取したものではなく、且つ少なくとも1個の前立腺細胞またはその核酸抽出物を含有する尿サンプルであり、該前立腺癌特異的PCA3 mRNAは以下の配列 (i)〜(iii):
(i)配列番号9、10または13のポリヌクレオチド配列、
(ii)高度にストリンジェントな条件下で上記ポリヌクレオチド配列(i)の全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、および
(iii)上記ポリヌクレオチド配列(i)または(ii)に完全に相補的なポリヌクレオチド配列
からなる群より選ばれるポリヌクレオチド配列に対応するRNA配列からなるものであり、
(b)患者から得た該尿サンプルまたはその核酸抽出物について、該前立腺癌特異的PCA3 mRNA以外の前立腺特異的mRNAに特異的な第2プライマーペアを用いた第2のin vitroのRNA増幅アッセイを行い、そして
(c)該前立腺癌特異的PCA3 mRNAおよび該前立腺特異的mRNA、またはこれらの増幅産物を検出する
ことを包含する方法であって、
正常または非悪性状態の前立腺における該前立腺癌特異的PCA3 mRNAの存在量と比較して、検出した該前立腺癌特異的PCA3 mRNAの存在量が増加しているという結果は、該患者に前立腺癌が発生する危険度が高いことまたは該患者に前立腺癌が存在することの指標となり、
正常または非悪性状態の前立腺における該前立腺癌特異的PCA3 mRNAの存在量と比較して、該前立腺癌特異的PCA3 mRNAが検出されないまたはその存在量が減少しているという結果は、該前立腺特異的mRNAが検出される場合には、該患者に前立腺癌が発生する危険度が低いことまたは前立腺癌が存在しないことの指標となる。 - mRNAの増幅をリアルタイムで行うことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- mRNAの検出を、蛍光検出法、化学発光検出法または比色検出法で行うことを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 該前立腺特異的mRNAの検出によって、該尿サンプル中に少なくとも1個の前立腺細胞が存在することを確認する、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 該前立腺特異的mRNAが、PSA mRNA、ヒト カリクレイン2 mRNA、PSMA mRNA、トランスグルタミナーゼ4 mRNA、酸ホスファターゼ mRNA、PCGEM1 mRNA、および前立腺癌と関連性のない前立腺特異的PCA3 mRNAからなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 該前立腺特異的mRNAがPSA mRNAであることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 該PSA mRNAが、ヒト カリクレイン2 mRNAにハイブリダイズすることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 該RNA増幅法が、
(a)核酸増幅法(NASBA法)、
(b)ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR法)、
(c)転写媒介性増幅法(TMA法)、および
(d)リガーゼ連鎖反応法(LCR法)
からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 - 該前立腺癌特異的PCA3 mRNAの増幅と該前立腺特異的mRNAの増幅を同時に行うことを特徴とする、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 該前立腺癌特異的PCA3 mRNAの増幅を、配列番号3と4の塩基配列からなるプライマーペアを用いて行うことを特徴とする、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 該前立腺癌特異的PCA3 mRNAの検出を、分子ビーコンを用いて行うことを特徴とする、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 該分子ビーコンが配列番号6の塩基配列を有することを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 該PSA mRNAの増幅を、配列番号1と2の塩基配列からなるプライマーペアを用いて行うことを特徴とする、請求項6〜12のいずれかに記載の方法。
- 該PSA mRNAの検出を、PSA分子ビーコンを用いて行うことを特徴とする、請求項6〜13のいずれかに記載の方法。
- 該PSA分子ビーコンが、配列番号5の塩基配列を有することを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 該同時に行う核酸の増幅を、1つの容器内で行うことを特徴とする、請求項10〜15のいずれかに記載の方法。
- PSA mRNAの検出を、化学発光標識を用いたホモジニアス検出法で行うことを特徴とする、請求項6〜16のいずれかに記載の方法。
- 該化学発光標識がアクリジニウムエステルであることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 該少なくとも1個の前立腺細胞からmRNAを抽出することを特徴とする、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- 該mRNAを、
(a) シリカ系精製法、または
(b) ターゲットキャプチャー法
で抽出することを特徴とする、請求項19に記載の方法。 - 該尿サンプルが、前立腺細胞数が増加した、患者の排尿サンプルであることを特徴とする、請求項1〜20のいずれかに記載の方法。
- (a)患者から得た尿サンプルまたはその核酸抽出物から前立腺癌特異的PCA3 mRNAを増幅するための特異的な第1プライマーペアであって、該尿サンプルは、射精直後に採取したものではなく、且つ少なくとも1個の前立腺細胞またはその核酸抽出物を含有する尿サンプルであり、該前立腺癌特異的PCA3 mRNAは、以下の配列 (i)〜(iii):
(i)配列番号9、10または13のポリヌクレオチド配列、
(ii)高度にストリンジェントな条件下で上記ポリヌクレオチド配列(i)の全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、および
(iii)上記ポリヌクレオチド配列(i)または(ii)に完全に相補的なポリヌクレオチド配列
からなる群より選ばれるポリヌクレオチド配列に対応するRNA配列からなるものであることを特徴とする、特異的な第1プライマーペア、
(b)該前立腺癌特異的PCA3 mRNA以外の前立腺特異的mRNAを増幅するための特異的な第2プライマーペア、および
(c)該前立腺癌特異的PCA3 mRNAおよび該前立腺特異的mRNAの少なくとも1種が存在する時に、該前立腺癌特異的PCA3 mRNAと該前立腺特異的mRNAの増幅産物の検出を可能とする試薬
を包含する、患者における前立腺癌の存在または前立腺癌発生危険度を判定するためのキットであって、
(i)正常または非悪性状態の前立腺における該前立腺癌特異的PCA3 mRNAの存在量と比較して、検出した該前立腺癌特異的PCA3 mRNAの存在量が増加しているという結果を、該患者に前立腺癌が発生する危険度が高いことまたは該患者に前立腺癌が存在することの指標に相関させ、そして
(ii)正常または非悪性状態の前立腺における該前立腺癌特異的PCA3 mRNAの存在量と比較して、該前立腺癌特異的PCA3 mRNAが検出されないまたはその存在量が減少しているという結果を、該前立腺特異的mRNAが検出される場合には、該患者に前立腺癌が発生する危険度が低いことまたは前立腺癌が存在しないことの指標に相関させる
ことが可能なキット。 - 該前立腺特異的mRNAが、PSA mRNA、ヒト カリクレイン2 mRNA、PSMA mRNA、トランスグルタミナーゼ4 mRNA、酸ホスファターゼ mRNA、PCGEM1 mRNA、および前立腺癌と関連性のない前立腺特異的PCA3 mRNAからなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項22に記載のキット。
- 該前立腺特異的mRNAがPSA mRNAであることを特徴とする、請求項22に記載のキット。
- (a)患者から得た尿サンプルまたはその核酸抽出物を前立腺癌特異的PCA3 mRNAに特異的にハイブリダイズする少なくとも1種のオリゴヌクレオチドと接触させ、但し、該尿サンプルは、射精直後に採取したものではなく、且つ少なくとも1個の前立腺細胞またはその核酸抽出物を含有する尿サンプルであり、該前立腺癌特異的PCA3 mRNAは、
(i)配列番号9、10または13のポリヌクレオチド配列、
(ii)高度にストリンジェントな条件下で上記ポリヌクレオチド配列(i)の全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、および
(iii)上記ポリヌクレオチド配列(i)または(ii)に完全に相補的なポリヌクレオチド配列
からなる群より選ばれるポリヌクレオチド配列に対応するRNA配列からなるものであり、
(b)該尿サンプルまたはその核酸抽出物を、該前立腺癌特異的PCA3 mRNA以外の前立腺特異的mRNAに特異的にハイブリダイズする少なくとも1種のオリゴヌクレオチドと接触させ、
(c)該患者から得た尿サンプルまたはその核酸抽出物中の該前立腺癌特異的PCA3 mRNAの量および該前立腺特異的mRNAの量を測定し、そして
(d)該前立腺癌特異的PCA3 mRNAの量および該前立腺特異的mRNAの量を予め決められたカットオフ値と比較して、該尿サンプルまたはその核酸抽出物中に前立腺癌が存在するか否かを判定する
ことを包含する、患者における前立腺癌素因または前立腺癌の存在の危険度を検出するためのin vitroの方法。 - 該前立腺特異的mRNAが、PSA mRNA、ヒト カリクレイン2 mRNA、PSMA mRNA、トランスグルタミナーゼ4 mRNA、酸ホスファターゼ mRNA、PCGEM1 mRNA、および前立腺癌と関連性のない前立腺特異的PCA3 mRNAからなる群より選ばれる1種であることを特徴とする、請求項25に記載の方法。
- 該前立腺特異的mRNAがPSA mRNAであることを特徴とする、請求項25に記載の方法。
- (a)該前立腺癌特異的PCA3 mRNAと該前立腺特異的mRNAを同時に同じ容器内で増幅する、
(b)該前立腺癌特異的PCA3増幅産物と該前立腺特異的増幅産物の検出を同じ容器内で行う、または
(c)上記(a)と(b)を共に行う
ことを特徴とする、請求項22または23に記載のキット。 - 内部対照(IC)と共に、該内部対照を増幅、ハイブリダイズまたは検出するためのプライマー、プローブおよび試薬からなる群より選ばれる少なくとも1種を更に包含することを特徴とする、請求項22、23または28に記載のキット。
- 該内部対象(IC)が、
(a)精製核酸、
(b)細胞、
(c)標的核酸を含有するウイルス粒子、および
(d)細胞小器官
からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項29に記載のキット。 - 該内部対照(IC)の検出、該前立腺癌特異的PCA3増幅産物の検出および該前立腺特異的増幅産物の検出を全て異なる方法で行うことを特徴とする、請求項29または30に記載のキット。
- 該前立腺癌特異的PCA3 mRNAと前立腺特異的mRNAの量を、
(a)RNA増幅アッセイ法、および
(b)RNAハイブリダイゼーションアッセイ法
からなる群より選ばれるアッセイ法で求めることを特徴とする、請求項25または26に記載の方法。 - 該前立腺癌特異的PCA3 mRNAと該前立腺特異的mRNAの量の測定を、
(a)ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR法)、
(b)核酸増幅法(NASBA法)、
(c)転写媒介性増幅法(TMA法)、および
(d)リガーゼ連鎖反応法(LCR法)
からなる群より選ばれるアッセイ法で行うことを特徴とする、請求項25、26または32に記載の方法。 - (a)患者から得た尿サンプルまたはその核酸抽出物を、前立腺癌特異的PCA3 mRNAに特異的にハイブリダイズする少なくとも1種のオリゴヌクレオチドと接触させ、但し、該尿サンプルは、射精直後に採取したものではなく、且つ少なくとも1個の前立腺細胞またはその核酸抽出物を含有する尿サンプルであり、該前立腺癌特異的PCA3 mRNAは、
(i)配列番号9、10または13のポリヌクレオチド配列、
(ii)高度にストリンジェントな条件下で上記ポリヌクレオチド配列(i)の全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、および
(iii)上記ポリヌクレオチド配列(i)または(ii)に完全に相補的なポリヌクレオチド配列
からなる群より選ばれるポリヌクレオチド配列に対応するRNA配列からなるものであり、
(b)該尿サンプルまたはその核酸抽出物を、該前立腺癌特異的PCA3 mRNA以外の前立腺特異的mRNAに特異的にハイブリダイズする少なくとも1種のオリゴヌクレオチドと接触させ、
(c)該尿サンプルまたはその核酸抽出物中の、該前立腺癌特異的PCA3 mRNA量および該前立腺特異的mRNA量を測定し、
(d)経時的に該患者から得た、少なくとも1個の前立腺細胞を含有する尿サンプルまたはその核酸抽出物を用いて上記工程(a)と(b)を繰り返し、そして
(e)工程(d)で求めた該前立腺癌特異的PCA3 mRNA量を、工程(c)で求めた該前立腺癌特異的PCA3 mRNA量と比較することで、患者中の前立腺癌の進行を観測し、該前立腺癌特異的PCA3 mRNAは存在しないが、該前立腺特異的mRNAは存在することをもって、前立腺癌が存在しないかまたはその発生危険度が低いことを確認する
ことを包含する、患者中の前立腺癌の進行を観測するin vitroの方法。 - 該前立腺特異的mRNAが、PSA mRNA、ヒト カリクレイン2 mRNA、PSMA mRNA、トランスグルタミナーゼ4 mRNA、酸ホスファターゼ mRNA、PCGEM1 mRNA、および前立腺癌と関連性のない前立腺特異的PCA3 mRNAからなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項34に記載の方法。
- 該前立腺特異的mRNAがPSA mRNAであることを特徴とする、請求項34に記載の方法。
- 該前立腺特異的mRNAがカリクレインファミリーに属する他のmRNAにもハイブリダイズすることを特徴とする、請求項34に記載の方法。
- 該尿サンプルまたはその抽出物が、
(a)精製核酸、
(b)細胞、
(c)標的核酸を含有するウイルス粒子、および
(d)細胞小器官
からなる群より選ばれる内部対象(IC)で強化したものであることを特徴とする、請求項1〜21、25、26および32〜34のいずれかに記載の方法。 - 患者における前立腺癌の発見または前立腺癌発生危険度の判定のための診断キットであって、
(a)以下の配列(i)〜(iii):
(i)配列番号9、10または13のポリヌクレオチド配列、
(ii)高度にストリンジェントな条件下で上記ポリヌクレオチド配列(i)の全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、および
(iii)上記ポリヌクレオチド配列(i)または(ii)に完全に相補的なポリヌクレオチド配列
からなる群より選ばれる1種のポリヌクレオチド配列に対応するRNA配列を有する前立腺癌特異的PCA3 mRNAに特異的にハイブリダイズする、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーの入った容器、
(b)該前立腺癌特異的PCA3 mRNA以外の前立腺特異的mRNAまたはその相補鎖に特異的にハイブリダイズする少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマー、および
(c)該前立腺癌特異的PCA3 mRNAまたは該前立腺特異的mRNAが存在する時に、該前立腺癌特異的PCA3 mRNAと該前立腺特異的mRNAの検出を可能とする試薬
を包含し、該前立腺癌特異的PCA3 mRNAは存在しないが、該前立腺特異的mRNAは存在することをもって、前立腺癌が存在しないかまたはその発生危険度が低いことを確認することを特徴とするキット。 - 検出用の該試薬が、以下の(a)〜(f):
(a)放射性同位元素、
(b)酵素、
(c)蛍光基、
(d)ビオチン、
(e)化学発光基、および
(f)色素粒子
からなる群より選ばれるレポーター基または標識を包含することを特徴とする、請求項39に記載の診断キット。 - 前立腺細胞数が増加した該尿サンプルが、直腸指診(DRE)に続いて採取した尿サンプルであることを特徴とする、請求項21に記載の方法。
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