JP2006518194A5 - - Google Patents
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Description
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）． ポリメラーゼ連鎖反応は公知の技術に従って実施することができる。例えば、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号および第4,965,188号を参照されたい（これら４つの米国特許の内容はこの記載によって本明細書に組み込まれているものとする）。一般的に、ＰＣＲは、検出すべき特定配列の各核酸鎖に対して１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた、ハイブリダイゼーション条件下における核酸サンプルの（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下における）処理を含む。各プライマーの合成した伸長産物は２本の核酸鎖のそれぞれに相補的であり、プライマーは、特定配列とハイブリダイズするのに十分に相補的である。各プライマーから合成した伸長産物は、同じプライマーを用いた伸長産物の更なる合成のためのテンプレートとしても機能する。伸長産物の合成を十分な回数行った後には、検出すべき配列が存在するか否かを求めるためにサンプルを解析する。増幅配列の検出は、ゲル電気泳動後のＤＮＡのＥｔＢｒ染色による視覚化、公知の技術などに従った検出可能なラベルの使用などによって行うことができる。ＰＣＲ技術の総論については、“PCR Protocols、A Guide to Methods and Amplifications（ＰＣＲプロトコル、方法と増幅に関する手引き）”、Michael et al. 編、Acad. Press、１９９０年を参照されたい。
Ｉ．ＰＣＡ３核酸の検出によって、サンプル中の前立腺癌の
存在を発見するための方法
本発明は、生物学的サンプル中のＰＣＡ３核酸の存在を、第２前立腺特異的マーカー（例えば、ＰＳＡ、ｈＫ２／ＫＬＫ２、ＰＳＭＡ、トランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼやＰＣＧＥＭ１）の存在と共に検出する方法に加えて、サンプル中のＰＣＡ３核酸の存在量を測定する方法も包含する。これらの方法はＰＣＡ３の過剰発現に関連した前立腺癌の診断に有用である。
存在を発見するための方法
本発明は、生物学的サンプル中のＰＣＡ３核酸の存在を、第２前立腺特異的マーカー（例えば、ＰＳＡ、ｈＫ２／ＫＬＫ２、ＰＳＭＡ、トランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼやＰＣＧＥＭ１）の存在と共に検出する方法に加えて、サンプル中のＰＣＡ３核酸の存在量を測定する方法も包含する。これらの方法はＰＣＡ３の過剰発現に関連した前立腺癌の診断に有用である。
II．核酸の合成
本発明を実施するための核酸（例えば、ＤＮＡやＲＮＡ）は公知の方法に従って得ることができる。
本発明を実施するための核酸（例えば、ＤＮＡやＲＮＡ）は公知の方法に従って得ることができる。
III．プローブとプライマー
本発明は、前立腺癌に関連するＰＣＡ３核酸配列の存在を、サンプルから特異的に検出するための核酸に関し、該核酸は上記した核酸分子またはＰＣＡ３核酸にストリンジェントな条件下で結合するその断片を少なくとも含むものである。
本発明は、前立腺癌に関連するＰＣＡ３核酸配列の存在を、サンプルから特異的に検出するための核酸に関し、該核酸は上記した核酸分子またはＰＣＡ３核酸にストリンジェントな条件下で結合するその断片を少なくとも含むものである。
IV．サンプル中のＰＣＡ３核酸を検出するためのキット
別の態様においては、本発明は、高感度であり且つ特異的な（即ち、偽陽性の数を低減した）、前立腺癌を診断するためのキットに関する。このようなキットは、通常、前立腺癌特異的ＰＣＡ３核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーの入った第１の容器を包含する。１つの態様においては、本発明は、ＰＣＡ３の示す陰性の検出結果を判定するための、第２前立腺特異的マーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーの入った第２容器を更に包含する。
別の態様においては、本発明は、高感度であり且つ特異的な（即ち、偽陽性の数を低減した）、前立腺癌を診断するためのキットに関する。このようなキットは、通常、前立腺癌特異的ＰＣＡ３核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーの入った第１の容器を包含する。１つの態様においては、本発明は、ＰＣＡ３の示す陰性の検出結果を判定するための、第２前立腺特異的マーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーの入った第２容器を更に包含する。
Claims (44)
- ヒト患者の前立腺癌を発見するためのin vitroの方法であって、
（ａ）患者から得た、少なくとも１個の前立腺細胞を含有する尿サンプルまたはその核酸抽出物について、前立腺癌特異的なＰＣＡ３核酸配列に特異的な第１プライマーペアを用いた第１のin vitroの核酸増幅アッセイを行い、但し、該ＰＣＡ３核酸配列は以下の配列 (i)〜(iii)：
（i）配列番号９、１０または１３のポリヌクレオチド配列、
（ii）６×ＳＳＣまたは５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳと１００μｇ／ｍｌの変性キャリアーＤＮＡの存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行い、そして６５℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄を行う、高度にストリンジェントな条件下で上記ポリヌクレオチド配列（i）にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、および
（iii）上記ポリヌクレオチド配列（i）または（ii）に完全に相補的なポリヌクレオチド配列
からなる群より選ばれるものであり、
（ｂ）患者から得た、少なくとも１個の前立腺細胞を含有する該尿サンプルまたはその核酸抽出物について、第２前立腺特異的核酸配列に特異的な第２プライマーペアを用いた第２のin vitroの核酸増幅アッセイを行い、
（ｃ）該ＰＣＡ３核酸配列および該第２前立腺特異的核酸配列を検出し、
（ｄ）前立腺の正常または非悪性状態に関連する他のＰＣＡ３核酸配列の存在またはその量を対照とした、該ＰＣＡ３核酸配列の検出またはその存在量を、該患者が前立腺癌を発生する危険度または該患者において前立腺癌が存在することに相関させ、そして
（ｅ）該第２前立腺特異的核酸配列が検出される時には、前立腺の正常または非悪性状態に関連する他のＰＣＡ３核酸配列の存在またはその量を対照とした、該ＰＣＡ３核酸配列の検出なしまたはその存在量が低いという結果を、前立腺癌が存在しないかまたはその発生危険度が低いことに相関させる
ことを包含する方法。 - 核酸の増幅をリアルタイムで行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 核酸配列の検出を、蛍光検出法、化学発光検出法または比色検出法で行うことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
- 該第２前立腺特異的核酸配列の検出によって、該尿サンプル中に少なくとも１個の前立腺細胞が存在することを確認する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 該第２前立腺特異的核酸配列が、ＰＳＡ、ヒト カリクレイン２、ＰＳＭＡ、トランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼおよびＰＣＧＥＭ１核酸からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 該第２前立腺特異的核酸配列がＰＳＡであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
- 該ＰＳＡの配列が、ヒト カリクレイン２にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
- 核酸の増幅を、in vitro ＲＮＡ増幅法で行うことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
- 該ＲＮＡ増幅法が、
（ａ）核酸増幅法（ＮＡＳＢＡ法）、
（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）、
（ｃ）転写媒介性増幅法（ＴＭＡ法）、および
（ｄ）リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ法）
からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。 - 該ＰＣＡ３核酸配列の増幅と該第２前立腺特異的核酸配列の増幅を同時に行うことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
- 該ＰＣＡ３核酸配列の増幅を、配列番号３と４の塩基配列からなるプライマーペアを用いて行うことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
- 該ＰＣＡ３核酸配列の検出を、分子ビーコンを用いて行うことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
- 該分子ビーコンが配列番号６の塩基配列を有することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
- 該ＰＳＡの増幅を、配列番号１と２の塩基配列からなるプライマーペアを用いて行うことを特徴とする、請求項６〜１３のいずれかに記載の方法。
- 該ＰＳＡの検出を、ＰＳＡ分子ビーコンを用いて行うことを特徴とする、請求項６〜１４のいずれかに記載の方法。
- 該ＰＳＡ分子ビーコンが、配列番号５の塩基配列を有することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
- 該同時に行う核酸の増幅を、１つの容器内で行うことを特徴とする、請求項１０〜１６のいずれかに記載の方法。
- ＰＳＡの検出を、化学発光標識を用いたホモジニアス検出法で行うことを特徴とする、請求項６〜１７のいずれかに記載の方法。
- 該化学発光標識がアクリジニウムエステルであることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
- 該少なくとも１個の前立腺細胞から核酸を抽出することを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
- 該核酸がＲＮＡであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
- 該ＲＮＡを、
(a) シリカ系精製法、または
(b) ターゲットキャプチャー法
で抽出することを特徴とする、請求項２１に記載の方法。 - 該尿サンプルが、前立腺細胞数が増加した、患者の排尿サンプルであることを特徴とする、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
- （ａ）以下の配列 (i)〜(iii)：
（i）配列番号９、１０または１３のポリヌクレオチド配列、
（ii）６×ＳＳＣまたは５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳと１００μｇ／ｍｌの変性キャリアーＤＮＡの存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行い、６５℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄を行う、高度にストリンジェントな条件下で上記ポリヌクレオチド配列（i）にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、および
（iii）上記ポリヌクレオチド配列（i）または（ii）に完全に相補的なポリヌクレオチド配列
からなる群より選ばれる前立腺癌に関連するＰＣＡ３核酸を、患者から得た、少なくとも１個の前立腺細胞を含有する尿サンプルまたはその核酸抽出物から増幅するための、特異的な第１プライマーペア、
（ｂ）第２前立腺特異的核酸を増幅するための、特異的な第２プライマーペア、および
（ｃ）ＰＣＡ３核酸または第２前立腺特異的核酸が存在する時に、ＰＣＡ３核酸と第２前立腺特異的核酸の増幅産物の検出を可能とする試薬
を包含する、患者における前立腺癌の存在または前立腺癌発生危険度を判定するためのキットであって、
（ｉ）前立腺の正常または非悪性状態に関連する他のＰＣＡ３核酸配列の存在またはその存在量を対照とした、該ＰＣＡ３核酸配列の検出またはその存在量を、該患者が前立腺癌を発生する危険度または該患者において前立腺癌が存在することに相関させ、そして
（ii）該第２前立腺特異的核酸配列が検出される時には、前立腺の正常または非悪性状態に関連する他のＰＣＡ３核酸配列の存在またはその存在量を対照とした、該ＰＣＡ３核酸配列の検出なしまたはその存在量が低いという結果を、前立腺癌が存在しないかまたはその発生危険度が低いことに相関させる
ことが可能なキット。 - 第２前立腺特異的核酸が、ＰＳＡ、ヒト カリクレイン２、ＰＳＭＡ、トランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼおよびＰＣＧＥＭ１核酸からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項２４に記載のキット。
- 該第２前立腺特異的核酸がＰＳＡ核酸であることを特徴とする、請求項２４に記載のキット。
- （ａ）患者から得た、少なくとも１個の前立腺細胞を含有する尿サンプルまたはその核酸抽出物をＰＣＡ３ポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させ、但し、該ＰＣＡ３ポリヌクレオチドは
（i）配列番号９、１０または１３のポリヌクレオチド配列、
（ii）高度にストリンジェントな条件下で上記ポリヌクレオチド配列（i）にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、および
（iii）上記ポリヌクレオチド配列（i）または（ii）に完全に相補的なポリヌクレオチド配列
からなる群より選ばれるものであり、
（ｂ）少なくとも１個の前立腺細胞を含有する尿サンプルまたはその核酸抽出物を第２前立腺特異的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させ、
（ｃ）患者から得た、少なくとも１個の前立腺細胞を含有する尿サンプルまたはその核酸抽出物中のＰＣＡ３ポリヌクレオチド量および第２前立腺特異的ポリヌクレオチド量を測定し、そして
（ｄ）該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするＰＣＡ３ポリヌクレオチドの量を予め決められたカットオフ値と比較して、尿サンプルまたはその抽出物中に前立腺癌が存在するか否かを判定する
ことを包含する、患者における前立腺癌素因または前立腺癌の存在を検出するためのin vitroの方法。 - 該第２前立腺特異的ポリヌクレオチドが、ＰＳＡ、ヒト カリクレイン２、ＰＳＭＡ、トランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼおよびＰＣＧＥＭ１核酸からなる群より選ばれる１種であることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
- 該第２前立腺特異的ポリヌクレオチドがＰＳＡ核酸であることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
- （ａ）該ＰＣＡ３核酸と該第２前立腺特異的核酸を同時に同じ容器内で増幅する、
（ｂ）該ＰＣＡ３核酸と該第２前立腺特異的核酸の検出を同じ容器内で行う、または
（ｃ）上記（ａ）と（ｂ）を共に行う
ことを特徴とする、請求項２４または２５に記載のキット。 - 内部対照（ＩＣ）と共に、該内部対照を増幅、ハイブリダイズまたは検出するためのプライマー、プローブおよび試薬からなる群より選ばれる少なくとも１種を更に包含することを特徴とする、請求項２４、２５または３０に記載のキット。
- 該内部対象（ＩＣ）が、
（ａ）精製核酸、
（ｂ）細胞、
（ｃ）標的核酸を含有するウイルス粒子、および
（ｄ）細胞小器官
からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項２９に記載のキット。 - 該内部対照（ＩＣ）の検出方法、該ＰＣＡ３核酸の検出方法および該第２前立腺特異的核酸の検出方法が全て異なることを特徴とする、請求項３１または３２に記載の方法。
- ＰＣＡ３ポリヌクレオチドと第２前立腺特異的ポリヌクレオチドの量を、
（ａ）増幅アッセイ法、および
（ｂ）ハイブリダイゼーションアッセイ法
からなる群より選ばれるアッセイ法で求めることを特徴とする、請求項２７または２８に記載の方法。 - 該ＰＣＡ３ポリヌクレオチドと該第２前立腺特異的ポリヌクレオチドの量の測定を、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）、
（ｂ）核酸増幅法（ＮＡＳＢＡ法）、
（ｃ）転写媒介性増幅法（ＴＭＡ法）、および
（ｄ）リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ法）
からなる群より選ばれるアッセイ法で行うことを特徴とする、請求項２７、２８または３４に記載の方法。 - （ａ）患者から得た、少なくとも１個の前立腺細胞を含有する尿サンプルまたはその核酸抽出物を、前立腺癌に関連するＰＣＡ３ポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させ、但し、該ＰＣＡ３ポリヌクレオチドは
（i）配列番号９、１０または１３のポリヌクレオチド配列、
（ii）高度にストリンジェントな条件下で上記ポリヌクレオチド配列（i）にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、および
（iii）上記ポリヌクレオチド配列（i）または（ii）に完全に相補的なポリヌクレオチド配列
からなる群より選ばれるものであり、
（ｂ）少なくとも１個の前立腺細胞を含有する尿サンプルまたはその核酸抽出物を、第２前立腺特異的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させ、
（ｃ）患者から得た、少なくとも１個の前立腺細胞を含有する尿サンプルまたはその核酸抽出物中の、ＰＣＡ３ポリヌクレオチド量および第２前立腺特異的ポリヌクレオチド量を測定し、
（ｄ）経時的に患者から得た、少なくとも１個の前立腺細胞を含有する尿サンプルまたはその核酸抽出物を用いて上記工程（ａ）と（ｂ）を繰り返し、そして
（ｅ）工程（ｄ）で求めた該ＰＣＡ３ポリヌクレオチド量を、工程（ｃ）で求めた該ＰＣＡ３ポリヌクレオチド量と比較することで、患者中の前立腺癌の進行を観測し、該ＰＣＡ３核酸配列は存在しないが、第２前立腺特異的ポリヌクレオチドは存在することをもって、前立腺癌が存在しないかまたはその発生危険度が低いことを確認する
ことを包含する、患者中の前立腺癌の進行を観測するin vitroの方法。 - 該第２前立腺特異的ポリヌクレオチドが、ＰＳＡ、ヒト カリクレイン２、ＰＳＭＡ、トランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼおよびＰＣＧＥＭ１核酸からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
- 該第２前立腺特異的ポリヌクレオチドがＰＳＡ核酸であることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
- 該第２前立腺特異的ポリヌクレオチドがカリクレインファミリーに属する他の核酸にもハイブリダイズすることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
- 該尿サンプルまたはその抽出物が、
（ａ）精製核酸、
（ｂ）細胞、
（ｃ）標的核酸を含有するウイルス粒子、および
（ｄ）細胞小器官
からなる群より選ばれる内部対象（ＩＣ）で強化したものであることを特徴とする、請求項１〜２３、２７、２８および３４〜３６のいずれかに記載の方法。 - 患者における前立腺癌の発見または前立腺癌発生危険度の判定のための診断キットであって、
（ａ）以下の配列（i）〜（iii）：
（i）配列番号９、１０または１３のＰＣＡ３核酸配列、
（ii）上記配列（i）に完全に相補的な配列、および
（iii）高度にストリンジェントな条件下で上記配列（i）または（ii）にハイブリダイズする配列
からなる群より選ばれる１種にハイブリダイズする、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーの入った容器、
（ｂ）第２前立腺特異的核酸またはその相補鎖にハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマー、および
（ｃ）ＰＣＡ３核酸または第２前立腺特異的核酸が存在する時に、ＰＣＡ３核酸と第２前立腺特異的核酸の検出を可能とする試薬
を包含し、該ＰＣＡ３核酸配列は存在しないが、第２前立腺特異的ポリヌクレオチドは存在することをもって、前立腺癌が存在しないかまたはその発生危険度が低いことを確認することを特徴とするキット。 - 検出用の該試薬が、以下の（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）放射性同位元素、
（ｂ）酵素、
（ｃ）蛍光基、
（ｄ）ビオチン、
（ｅ）化学発光基、および
（ｆ）色素粒子
からなる群より選ばれるレポーター基または標識を包含することを特徴とする、請求項４１に記載の診断キット。 - 前立腺細胞数が増加した該尿サンプルが、直腸指診（ＤＲＥ）に続いて採取した尿サンプルであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
- 該尿サンプルが、精液を含有することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
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