NL8801147A - Werkwijze voor het detecteren van genetische variatie, en daarvoor geschikte kit. - Google Patents

Description

VO 1124

Werkwijze voor het detecteren van genetische variatie, en daarvoor geschikte kit

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het detecteren van genetische variatie door dubbel-strengs DNA van een individu met behulp van een of meer restrictie-enzymen in fragmenten te knippen, de verkregen 5 fragmenten door elektroforese te scheiden, het verkregen scheidingspatroon over te brengen op een membraanfilter, daarop onder DNA-denaturerende omstandigheden te hybridi-seren met een gelabelde DNA- of RNA-probe en het label zichtbaar te maken.

10 Een dergelijke werkwijze ligt op het gebied van de zg. DNA-diagnostiek, d.w.z. het gebruik van analysemethoden voor het aantonen van genetische variatie welke een indicatie kan zijn voor het krijgen van ziektes, het blootgesteld zijn aan carcinogene stoffen, etc., alsmede 15 kan dienen ter Identificatie van een individu. Onder genetische variatie verstaat men in het algemeen verschillen tussen individuen voor wat betreft de basevolgorde van hun DNA. Detektie van genetische variatie kan gebeuren door middel van hybridisatie-analyse na elektroforetische 20 scheiding van DNA fragmenten, gegenereerd door knippen met een restriktie-enzym (Southern Blot hybridisatie-analyse; zie Fig.1 en Southern, 1975). Hybridisatie met een specifiek radioactief gelabeld DNA fragment (probe) resulteert na autoradiografie in één of meer selecte banden. Elke 25 band vertegenwoordigt een DNA fragment dat gehybridiseerd is met de gebruikte probe. De positie van de banden is een maat voor de grootte van de betreffende fragmenten. Indien voor één specifieke probe de positie van de banden 30 varieert tussen individuen, ten gevolge van deleties/ inserties en/of het al of niet aanwezig zijn van de herken-ningsplaats voor het gebruikte restriktie-enzym, spreekt men van een genetisch polymorfisme. De ervaring heeft geleerd dat sommige gebieden in het genoom meer polymorf .8801147 -2- $ zijn dan anderen. Probes voor zulke polymorfe gebieden zijn uitermate nuttig, omdat binnen een familie waarin een erfelijke ziekte voorkomt, overerving van deze ziekte, samen met een variant van de betreffende polymorfe DNA sequentie, erop 5 duidt dat het defecte gen hier dicht in de buurt ligt (voor een overzicht, zie Gusella, 1986). Men noemt dit het genetisch "mappen" (karteren) van ziektegenen. Uiteraard is het dan van groot belang precies te weten waar de polymorfe "marker" sequenties liggen, zowel ten opzichte van elkaar 1D als op een bepaald chromosoom. Uiteindelijk kan op deze wijze het gehele genoom in kaart gebracht worden door het bepalen van de relatieve posities van een groot aantal polymorfe markers (zé als het ware aan elkaar te koppelen) (voor een overzicht, zie White en Lalouel,1988). Recen-15 telijk is men er in geslaagd om een voorlopige koppelings-kaart van het humane genoom te maken op basis van 403 meer of minder polymorfe markers (Donis-Keller et al., 1987).

Met behulp van deze genetische "map" van het menselijk genoom zou in principe elke erfelijke ziekte gekoppeld 20 kunnen worden aan een bepaalde plaats in het genoom. Afhankelijk van de nauwkeurigheid van de plaatsbepaling (en dus van de informativiteit van de koppelingskaart) zou dan uiteindelijk hét ziektegen zelf geïsoleerd kunnen worden (Gusella, 1986).

25 Aan de koppelingskaart volgens Donis-Keller et al.

(1987) kleven echter een aantal nadelen. Ten eerste zijn niet alle markers even informatief, d.w.z. polymorf. Dit betekent dat de kans groot is dat in een familie met de erfelijke ziekte die men wil bestuderen, ieder individu de-30 zelfde variant van de marker heeft. In dat geval kan er dus geen segregatie worden waargenomen. Verder zijn niet alle markers evenredig verdeeld over het genoom. Een potentieel alternatief voor het genereren van een koppelingskaart is het gebruik van zg. hyperpolymorfe minisatellieten. 35 Minisatelliet sequenties (Jeffreys 1985a) zijn z.g. tandem 88 0 1 14 7 -3- gerepeteerde sequenties. Interindividuele variatie in het aantal repeterende eenheden maakt ze uiterst polymorf. Minisatellieten zijn zowel uiterst informatief (hyper-polymorf) als (voor zover bekend) regelmatig verspreid 5 door het genoom. Er is dan ook voorgesteld (Nakamura et al., 1987) om op grote schaal locusspecifieke minisatelliet probes te isoleren en te gebruiken als markers voor een fijnmazige en uiterst informatieve genetische koppelings-kaart.

10 Zodra een set hyperpolymorfe markers, evenredig over het genoom verdeeld, beschikbaar is kan in principe elke erfelijke ziekte in kaart gebracht worden, Echter, om dit te bewerkstelligen zijn zeer veel experimenten nodig als gevolg van de betrekkelijk lage resolutie van de 15 gebruikte scheidingsmethode. Immers, bij gebruikmaking van de locusspecifieke minisatellieten kunnen slechts 2 allelen (1 locus) per individu worden gescoord. Hoewel het in principe mogelijk is om zeer veel zo niet alle minisatellieten in een experiment zichtbaar te maken met 20 behulp van een minisatelliet core sequentie, is dit ten behoeve van linkage analyse met behulp van Southern analyse een onbegonnen zaak.Fig. 2 laat zien dat indien gebruik gemaakt wordt van een minisatelliet core sequentie als DNA probe, er zeer veel fragmenten worden gedetecteerd. 25 Echter, slechts ca. 15 van de grootste banden kunnen gescheiden van elkaar worden waargenomen. Elke band vertegenwoordigt éën allel (aangenomen dat het gebruikte res-triktieenzym niet in de minisatelliet knipt). Het resulterende banden patroon is voor elk individu anders, het-30 geen kan worden aangewend voor identificatie doeleinden (Jeffreys, 1985b; EP-A-0186271). Echter,het feit dat slechts zo weinig loei tegelijkertijd kunnen worden geanalyseerd en men nooit de garantie heeft dat van een bepaald locus beide allelen (zowel het vaderlijk als het 35 moederlijk) tegelijkertijd kunnen worden aangetoond staat toepassing van dit systeem bij linkageanalyse in de weg.

.8801147 % -4-

Het voorstel (Nakamura et al, 1987) om minisatelliet probes te gebruiken voor het genereren van een zg. linkage map, d.w.z. kartering van het menselijk genoom, is beperkt tot het gebruik van locusspecifieke probes, zodat 5 daarbij geen gebruik wordt gemaakt van hun repeterend karakter. Voor linkage analyse kan geen gebruik worden gemaakt van de core-sequentie, die de som laat zien van alle tot die familie behorende minisatelliet bevattende loei, maar dient elk locus afzonderlijk te worden geana-10 lyseerd met behulp van een gedoneerd allel als probe.

Repeterende sequenties in het algemeen zijn niet geschikt voor linkageanalyse omdat de lage resolutie van ééndimensionale Southern blot analyse het niet toestaat alle allelen van een repeterende sequentiefamilie gescheiden van elkaar 15 op één autoradiogram zichtbaar te maken.

Zoals hierboven reeds is aangegeven, is voor het aantonen van genetische variatie totnogtoe vrijwel uitsluitend gebruik gemaakt van de bekende Southern blot hy.bridisatieanalyse (Southern, 1°75). Hiermee zijn een groot aantal variatiepunten 20 opgespoord waaryan sommige een directe medische betekenis hebben, zoals bepaalde variaties in de genen voor globine welke verantwoordelijk zijn voor een aantal ziektes (voor een overzicht, zie Gusella, 1986), en andere anderszins interessant zijn omdat men er identiteitstesten mee kan doen, 25 zoals de zg. minisatellieten (Jeffreys, 1985b; EP-A-0186271).

Tegen het eind van de jaren zeventig is een alternatieve scheidingsmethode ontwikkeld die is gebaseerd op het uitsmeltgedrag van een DNA fragment (Fischer en Lerman, 30 1979). Indien twee DNA fragmenten van identieke lengte maar verschillend voor wat betreft hun basepaarsamenstelling migreren onder invloed van een elektrisch veld door een polyacrylamidegel, waarin een gradient van denaturans (bijvoorbeeld ureum/formamide) is aangebracht, zullen ze 35 op een bepaald punt uitsmelten. Dit punt in de gradient is sterk sequentieafhankelijk. Zo sterk dat indien de .8301147 -5- twee fragmenten slechts op één plaats verschillen dit al resulteert in een verschil in uitsmeltgedrag. Het uitsmelten gebeurt abrupt bij een bepaalde concentratie denaturans en resulteert in een sterke vertraging van de migratie.

5 In het genoemde artikel (Fischer en Lerman, 1979) is

dit scheidingscriterium gecombineerd met scheiding op grootte teneinde een tweedimensionaal patroon te genereren. Dit systeem werd toegepast bij het DNA van de bacterie Escherichia coli om de door knippen met het restrictie-10 enzym EcoRI verkregen fragmenten te scheiden. De DNA

fragmenten werden na de elektroforetische scheiding zichtbaar gemaakt door een kleuring met ethidiumbromide. Vergeleken met het menselijke genoom, dat ongeveer 3 miljard baseparen bevat, is E.coli een organisme met een uiterst 15 simpel DNA, dat na knippen met een restrictie-enzym volledig op een tweedimensionale gel kan worden geresolveerd. Totnogtoe zijn twee-dimensionale gels volgens bovenbeschreven principe niet toegepast bij de analyse van het menselijk genoom. Natuurlijk staat de grote complexiteit van het 20 humane genoom een twee-dimensionale analyse van totaal genomisch DNA op basis van de aankleuring met ethidium bromide in de weg; het aantal te verwachten fragmenten (1 miljoen na knippen met EcoRI) is simpelweg te groot.

Dit probleem zou mogelijk kunnen worden onder-25 vangen indien men het scheidingspatroon, analoog aan de bekende Southern blot hybridisatieanalyse, zou kunnen overbrengen naar bijvoorbeeld nitrocellulose papier om vervolgens te hybridiseren met één of meerdere geschikte probes.

30 In de praktijk heeft men echter ervaren dat de over dracht van DNA scheidingspatrcnen uit polyacrylamidegels problemen geeft, waarvoor nog geen bevredigende oplossing is gevonden. In een in 1984 verschenen artikel (Church en Gilbert, 1984) wordt een protocol voor een dergelijke over-35 dracht naar een nylon membraanfilter beschreven in het kader • 8801147 -6- 'a van een directe bepalingsmethode van de nucleotidensequentie van genen in genomisch DNA, maar het is in de praktijk uiterst lastig gebleken om het protocol met succes uit te voeren. De moeilijkheid om een goede overdracht te reali-5 seren doet zich in het bijzonder voelen bij denaturerende gradient analyse. Bij denaturerende gradient analyse kan geen agarose gebruikt worden omdat dit te grove poriën bevat (slechte scheiding) en vloeibaar is bij de gebruikte elek-troforesetemperatüur (60°C). Vermoedelijk is het juist 10 de fijnmazigheid en de regelmatige netwerkstructuur van polyacrylamide dat de overdracht van (met name dubbelstrengs) DNA zo moeilijk maakt.

De uitvinders hebben veel pogingen ondernomen om denaturerende gradient scheidingspatronen over te dragen 15 op membraanfilters. Daarbij is uitgegaan van het protocol van Church en Gilbert , waarbij gebruik gemaakt wordt van elektroforetische overdracht (electroblotting). Hoewel dit protocol voor denaturerende gradient scheidingspatronen niet goed bleek te werken, zijn de uitvinders er uiteindelijk 20 toch in geslaagd dusdanige variaties aan te brengen dat een bruikbaar en reproduceerbaar protocol is verkregen. Uit de opgedane ervaringen bleek dat niet alleen de efficiëntie van overdracht een rol speelt, maar ook de toestand waarin het DNA uiteindelijk op het filter komt (de grootte van de 25 fragmenten, of ze enkel of dubbelstrengs zijn, binding aan het filter). Dit is dan weer bepalend voor de hybridi-satieëfiEicientie, hetgeen de uiteindelijke uitkomst van het experiment afhankelijk maakt van de gebruikte probe. Gevonden werd dat het gedeeltelijk uitgesmolten DNA, dat zich in 30 de polyacrylamidegel bevindt, alleen goed overgebracht kan worden indien het DNA eerst verder gefragmenteerd, bijvoorbeeld door bestraling met ultraviolet licht (302 nm), en gedenatureerd, bijvoorbeeld door opkoken, wordt.

Inmiddels is door anderen een tweede bruikbaar pro-35 tocol ontwikkeld, hoewel dit duidelijk bewerkelijker en tijdrovender is. (Borresen et al., Mutation Research,1988, ,8801147 -7- in press). Daarbij wordt de elektroforetische scheiding uitgevoerd in een mengsel van agarose en polyacrylamide.

De aanwezigheid van de polyacrylamide staat denaturerende gradientanalyse toe. Echter, anders dan bij normale poly-5 acrylamide gels, waarbij bis-acrylamide wordt gebruikt om de lange acrylamide ketens kruislings te verbinden, wordt hier gebruik gemaakt van een zg. reversibele "cross-linker", nl. diallyltartardiamide. Dit houdt in dat na de elektroforetische scheiding de dwarsverbindingen kunnen worden 10 verbroken door een behandeling met per-joodzuur. Aangezien dit de agarose niet aantast blijft na de behandeling en een aantal spoelingen een zuivere agarose gel over. Overdracht kan nu plaatsvinden door middel van capillair blot-ten zoals normaal ook gebeurt (Southern, 1975).

15 Recentelijk is door de huidige uitvinders gesugge reerd dat twee-dimensionale gelelektroforese gevolgd door hybridisatieanalyse met repeterende DNA sequenties als probes geschikt zou kunnen zijn voor het opsporen van transposities in DNA met veroudering (Vijg en üitterlinden,1987). 20 Een bruikbaar protocol voor overdracht van het scheidings-patroon wordt in deze publikatie echter niet gegeven. Bovendien lijken repeterende DNA sequenties niet bruikbaar als probes bij een onderzoek dat gericht is op koppeling van genetische factoren.Integendeel, bij de bereiding van 25 probes voor dergelijk onderzoek tracht men juist repeterende sequenties zoveel mogelijk te vermijden omdat de2e sequenties bij gebruik als probe in een Southern blot analyse een dusdanig ingewikkeld banden patroon genereren dat analyse van de betrokken genetische factoren onmogelijk is.

30 Eenzelfde graad van ingewikkeldheid wordt ook gevon den na twee-dimensionale analyse van totaal humaan genomisch DNA. Daarbij treedt een duidelijke "clustering" van restric-tiefragmenten in bepaalde gebieden van de 2-D gel op, zowel na kleuring met ethidium bromide (waarbij alle restric-35 tiefragmenten zichtbaar worden gemaakt) als na hybridisatie met probes voor repeterende DNA sequenties.

- 8801 147 -8- i \

Verrassenderwijze is nu gevonden dat een dergelijke clustering niet optreedt wanneer minisatelliet-core sequenties als probe worden toegepast en dat dan een twee-dimen-sionaal patroon wordt verkregen met een zeer goede schei-5 ding , waarin tevens op reproduceerbare wijze overerving van specifieke fragmenten (spots) kan worden waargenomen.

Uit nadere analyse van de uitsmeltkarakteristieken van de gepubliceerde DNA basevolgorden van bepaalde mini-satelliet-allelen bleek een grote variatie in uitsmelt-10 temperatuur, afhankelijk van de specifieke plaats welke het VNTR gebied (VNTR = "variable number of tandem repeat" of minisatelliet) innam in het geanalyseerde restriktie-fragment. Met andere woorden hetzelfde VNTR gebied krijgt totaal andere uitsmeltkarakteristieken wanneer het raamwerk 15 waarbinnen ze worden geanalyseerd (de aangrenzende geno- mische gebieden) enigszins wordt verschoven. De aangrenzende gebieden van de verschillende minisatelliet regio's binnen éën genoom zullen sterk verschillen voor wat betreft de knipplaats van het gebruikte restriktieenzym, 20 hetgeen wordt weerspiegeld in de uitsmeltkarakteristieken van de verkregen VNTR-bevattende restriktiefrag-menten. Dit zou de homogene verspreiding van de verschillende spots (minisatelliet-bevattende fragmenten) door de twee-dimensionale gel voor een belangrijk deel kunnen 25 verklaren. Het gemak waarmee variatie tussen individuen kan worden aangetoond zou daar ook ten dele het gevolg van kunnen zijn, aangezien de aan de minisatelliet grenzende gebieden ook van individu tot individu kunnen verschillen. Echter, ook de interindividuele variatie 30 in het copieaantal zal aanleiding geven tot een verschillend uitsmeltgedrag. Het is thans aannemelijk dat naast de reeds geanalyseerde VNTR sequenties nog andere hyper-polymorfe sequenties vergelijkbaar gunstige eigenschappen hebben.

35 De uitvinding verschaft dan ook een werkwijze van .8801147 •ψ -Side in de aanhef vermelde soort die gekenmerkt wordt doordat de elektroforetische scheiding van de gegenereerde DNA-fragmenten in twee dimensies wordt uitgevoerd, waarbij de fragmenten in één dimensie worden gescheiden op basis 5 van hun lengte en in de andere dimensie worden gescheiden op basis van hun baseparensequentie, en dat als probe in de hybridisatie-analyse een van een label voorzien DNA-of RNA-molecuul wordt gebruikt dat een of meer eenheden of een of meer minisatelliet-core sequenties omvat.

10 Aldus bestaat het wezen van de uitvinding uit het gebruik van core-sequenties een hyper-polymorfe minisatellieten voor het maken van een linkage map of een genetische identiteitskaart van een individu (niet alleen de mens, maar ook dieren, zoals in het bij-15 zonder raspaarden, rashonden, e.d.) middels een elektroforetische scheiding in twee dimensies van restrictie-fragmenten van het DNA van het individu, gevolgd door .overdracht naar een membraan en hybridisatieanalyse.

De uitvinding betekent: 20 (1) dat op basis van de uitsmeltkarakteristieken van enkele specifieke hyperpolymorfe DNA sequenties tweedimensionale individu-specifieke scheidingspatronen met een hoog oplossend vermogen kunnen worden verkregen door middel van hybridisatieanalyse; 25 (2) dat op basis van bovenstaand principe de betrouwbaarheid van identiteitstesten sterk kan worden verbeterd? (3) dat op basis van bovenstaand principe een groot aantal spots (allelen) tegelijkertijd kunnen worden vervolgd tijdens hun overerving in een familie; 30 (4) dat op basis van bovenstaand principe alsmede informatie omtrent de positie van de bestudeerde allelen in het genoom een zg. linkage map van een individu kan worden samengesteld; (5) dat de nauwkeurigheid van deze linkage map af-35 hankelijk is van de afstanden tussen de minisatellieten .8801147 -lO- in het genoom en dus van het aantal spots dat op één gel kan worden gescheiden; (6) dat bovenbeschreven systeem kan worden toegepast om willekeurig welke overerfbare ziekte direct te koppelen 5 aan een polymorfe marker? (7) dat bovenbeschreven systeem zich bij uitstek leent voor het associëren van genetische variatie met het vóórkomen van ziektes; (8) dat bovenbeschreven systeem geschikt is voor het 10 schatten van risico's na mogelijke blootstelling aan agentia welke verdacht worden van carcinogeniciteit; (9) dat bovenbeschreven systeem zich bij uitstek leent voor computerisering door middel van een geavanceerd beeldanalysesysteem.

15 Uit de bovenstaande samenvatting blijkt dat de uitvin ding kan worden toegepast voor identiteitstesten (b.v. in de forensische geneeskunde als bewijsmiddel voor daderschap, vaderschap en moederschap), voor het mappen van ziektegenen en associatie-onderzoeken, en voor het uitvoeren van muta-20 geniciteitstesten. Deze toepassingen zullen onderstaand nader worden toegelicht.

Identiteitstesten: De toepassing van het systeem volgens de uitvinding ter vergroting van de betrouwbaarheid van identiteitstesten is een eerste mogelijkheid. Ervan uitgaande dat 25 bij ouderschapstesten, waarbij 10 polymorfe allelen in één gel zijn betrokken, er een kans van 1 op een miljoen bestaat dat een ander individu die niet de vader is toch de 10 pater-nale allelen van het kind heeft, is eenvoudig in te zien hoe met behulp van het 2-D systeem zoals getoond in fig. 9, waar-30 mee 33 paternalë allelen in één keer zijn gevonden, een zekerheid kan worden verkregen die vele malen hoger is.

Mappen van ziektegenen: Het mappen van ziektegenen gebeurt door middel van linkage-analyse. Linkage-analyse behelst de associatie van polymorfe genetische markers met de ziektege-35 nen. Dit gebeurt door binnen een familie, waarin de overerving van de betreffende ziekte precies bekendis, de verschil- 8801147 * -11- lende varianten van een polymorfe marker (de allelen) te bepalen bij elk familielid. Vervolgens wordt gekeken of een bepaald allel steeds samen met de ziekte overerft. Indien dit het geval is zegt men dat de ziekte gelinked is aan de 5 betreffende polymorfe marker en er dus dicht bij moet liggen. Teneinde erfelijke ziektes op deze wijze te mappen dienen een groot aantal polymorfe markers verspreid over het genoom met een gemiddelde tussenruimte van niet meer dan circa 10 miljoen baseparen te worden geanalyseerd (met behulp van 10 Southern blot analyse) bij de leden van een familie waarbij de erfelijke ziekte voorkomt. Indien er geen enkele indicatie is voor wat betreft de plaats waar het betreffende ziek-tegen ligt, dienen een totaal van ten minste 300 regelmatig door het genoom verspreide polymorfe markers te worden 15 bekeken (het totale haploide genoom is immers 3 miljard baseparen lang). Voor de meest simpele familie, bestaande uit man, vrouw en één kind, betekent dit 900 ééndimensionale Southern blots. Bij wat uitgebreidere families kan dit wel oplopen tot 20000 Southern blots. Zelfs indien men zo'n 10 20 samples op één blot analyseert betekent dit nog altijd 2000 blots. Het is duidelijk dat hier nogal wat tijd en materiaal in gaat zitten.

De uitvinding lost dit probleem op door gebruik te maken van de eigenschappen van minisatellieten.

25 De verschillende minisatelliet regio's in het genoom kunnen onafhankelijk van elkaar worden geanalyseerd door gebruik te maken van probes die een groter gedeelte van de betreffende regio bestrijken dan de core sequenties.

Met de core sequenties als probe worden alle leden van een 30 bepaalde minisatellietfamilie (verspreid over verschillende loei} gedetecteerd, terwijl de langere probes specifiek zijn voor één locus. Inmiddels is van een aantal minisatellieten de plaats in het genoom vastgesteld. Deze locusspe-cifieke minisatellieten (VNTR regio's) bestrijken het 35 gehele genoom met tussenruimtes van circa 10 miljoen baseparen. Elke spot op een tweedimensionale gel vertegenwoordigt één allel van zo'n minisatelliet regio. Indien nu in ,mtu7 -12- een serie éénmalige experimenten wordt uitgezocht welke spot bij welke VNTR hoort (dit kan gebeuren met behulp van de locusspecifieke VNTR probes) kan één 2-D gel met recht een humane genoom map worden genoemd, mits er 600 5 polymorfe allelen tegelijkertijd mee worden aangetoond.

Dit laatste is afhankelijk van de probe(s) en van de resolutie van het gel scheidingssysteem. Met betrekking tot de probes kan gesteld worden dat in plaats van mini-satelliet core sequenties (waarmee naast veel polymorfe 10 sequenties, altijd een groot aantal niet-polymorfe sequenties worden gedetecteerd) ook mengsels van locus-speci-fieke VNTR sequenties zouden kunnen worden gebruikt. Echter, gezien de extra informatie die de tweede dimensie scheiding aan elke probe toevoegt moet het gebruik van 15 polymorfismen op basis van de aan of afwezigheid van een restriktie-site eveneens goed mogelijk worden geacht. Met betrekking tot dit laatste is het dan noodzakelijk tevoren informatie te verkrijgen omtrent het uitsmeltpatroon van de betreffende sequentie. De experimentele resultaten 20 laten duidelijk zien dat bepaalde polymorfe loei zich uitstekend lenen voor een analyse in denaturerende gradiënten. Het één voor één analyseren van de serie bekende polymorfismen is dan ook een reële mogelijkheid.

De tweede faktor die bepalend is voor het toepas-25 singsbereik van het hier gepresenteerde analysesysteem is het totaal aantal allelen dat nog gescheiden van elkaar kan worden waargenomen. Computeranalyse met behulp van een beeldanalyse-svsteem heeft aangetoond dat de experimenteel gerealiseerde scheidingspatronen meer dan 30 700 spots bevatten. Echter, door simpelweg wat grotere gels te gebruiken (en uiteraard met mengsels van meerdere verschillende probes te werken)kan het totaal aantal te detecteren allelen aanzienlijk worden opgevoerd. Indien bijvoorbeeld 1000 spots gescheiden kunnen worden waarge-35 nomen en 600 daarvan polymorfe allelen vertegenwoordigen, die met regelmatige tussenpozen door het genoom verspreid < &80 1147 » -13- liggen, is de totale genetische kaart van een menselijk individu reeds een feit. Het is mogelijk om middels beeldanalyse de standaard 2-D patronen van de bekende polymorfe markers in de computer op te slaan, waarna de patronen van 5 geanalyseerde individuen op eenvoudige wijze daarmee kunnen worden vergeleken. Op deze wijze kunnen in principe genen voor alle erfelijke ziektes zeer snel worden opgespoord mits DNA monsters beschikbaar zijn van families, waarin de ziekte volgens een goed gedefinieerd patroon is overge-10 erfd.

De totale menselijke linkage kaart is om verschillende redenen uiterst interessant. Enerzijds omdat er zeer snel de positie van een ziektegen in het totale genomische DNA mee kan worden bepaald. Dit kan simpelweg gebeuren door 15 van elk lid van de familie een 2-D patroon te genereren met een mengsel van circa 300 polymorfe markersequenties (evenredig verspreid door het genoom) als probe. Vervolgens kan worden vastgesteld welke van de circa 600 polymorfe allelen (spots) met de ziekte mee overerft. Dat wil zeggen, 20 de verwachting is dat bij die familieleden die de ziekte hebben ook steeds een bepaalde spot voorkomt die de niet aangetaste individuen van die familie niet hebben. De betreffende spot kan dan uit de gel worden geponst en worden gedoneerd middels routineprocedures. Op deze wijze kunnen 25 voor alle erfelijke ziektes markers worden verkregen.

Vanuit deze markers kunnen de ziektegenen zelf worden opgespoord, hetgeen een gedetailleerde analyse van het biochemisch defekt mogelijk maakt. De markers kunnen echter ook worden gebruikt voor diagnostische doeleinden. Immers, 30 binnen een familie waar de ziekte voorkomt kan nu van elk niet-aangetast individu worden vastgesteld of hij/zij drager/ draagster is van de ziekte, en welke ongeborene de ziekte zal krijgen. Deze tests zijn op dit moment reeds vrij simpel te verrichten vanuit circa 10 ml bloed ofwel via een 35 vruchtwaterpunktie (in geval van prenatale diagnostiek) en het laat zich aanzien dat dit nog heel wat simpeler zal .8801147 * -14- worden op basis van de recent geïntroduceerde polymerase ketting reaktie. De cruciale faktor bij elke test is echter de polymorfe marker. Indien er bijvoorbeeld een testkit op de markt zal komen voor de familiaire vorm van de ziekte 5 van Alzheimer dan bevat deze, naast wat chemicaliën om de test uit te voeren, de probe voor de marker. Het gaat er dus om voor elke ziekte een er zo dichtbij mogelijk gelegen marker te vinden. Het is juist dit opsporen van ziekte-gekoppelde markers dat het hier beschreven technische sy-10 steem zo waardevol maakt.

Associatiestudies: In veel gevallen worden ziektes en/of andere lichamelijke/geestelijke kenmerken helemaal niet door genen bepaald maar door de omgeving. In veel andere gevallen zijn genen betrokken bij het ontstaan en/of verloop 15 van ziektes zonder dat gesproken kan worden van een alles of niets effect. In dit laatste geval is vaak sprake van zogenaamde risicofaktoren, die vaak wel genetisch bepaald zijn.Het manifesteren van de ziekte kan dan mede bepaald worden door leefstijl en/of omgevingsfaktoren. Informatie 20 omtrent deze genetische faktoren is van groot belang teneinde risicogroepen vast te stellen. Heeft iemand bijvoorbeeld een gen dat predisponeert voor longkanker dan kan vaak een zeer eenvoudige maatregel (zoals stoppen met roken) voorkomen dat de ziekte zich ook daadwerkelijk zal voordoen. 25 Het zal duidelijk zijn dat 2-D analyse, waarmee zeer veel allelen per keer kunnen worden geanalyseerd, het gereedschap bij uitstek is voor het screenen van groepen individuen op erfelijke eigenschappen die predisponeren voor bepaalde ziektes.

30 Een voorbeeld is het screenen van bevolkingsgroepen op erfelijke faktoren welke het ontstaan van bepaalde vormen van kanker (geheel of ten dele) bepalen. Men denkt wel dat sommige vormen van kanker ontstaan omdat er een repressor wegvalt, welke normaal gesproken de aktivite.it van een be-35 paald gen onderdrukt. Dit zou bijvoorbeeld een gen kunnen zijn dat tot expressie dient te komen tijdens de vroege -8801147 * -15- ontwikkeling, maar daarna niet meer, omdat er anders kanker ontstaat. Indien nu in êén van de 2 geslachtscellen, die aanleiding geven tot de foetus, het locus waar het gen voor deze repressor ligt door een deletie wordt getroffen, 5 dan zal het nieuw ontstane individu heterzygoot zijn voor het repressorgen. Dat wil zeggen hij/zij heeft slechts êén repressorgen. Indien nu het andere gen in een of meerdere van de lichaamscellen door een deletie op die plaats wordt getroffen, dan zal er helemaal geen repressor meer 10 worden gemaakt en het onderdrukte gen komt tot expressie met kanker als gevolg. Dit betekent niet dat iemand met maar één repressorgen altijd kanker zal krijgen. Tenslotte hoeft die tweede deletie niet op te treden. Maar gaat het betreffende individu bijvoorbeeld roken, dan zou de DNA 15 beschadigende werking van de sigaretterook veel deleties kunnen aanbrengen, met een grote kans ook het betreffende locus te raken. Dit betekent ook weer niet dat iemand die homozygoot is voor dit locus, met andere woorden beide re-pressorgenen nog heeft, rustig kan roken. Tenslotte zouden 20 ook bij hem/haar wel eens beide genen gedeleteerd kunnen raken. Dit laatste echter is uiterst onwaarschijnlijk en de persoon in kwestie zou accurate gegevens omtrent de volledige integriteit van zijn/haar vaderlijk en moederlijk repressorallel waarschijnlijk (en niet ten onrechte) als 25 een geruststelling ervaren. Andersom zou de roker met een erfelijk bepaalde deletie in zijn/haar repressorgen er verstandig aan doen deze gewoonte op te geven.

Het door ons beschreven 2-D systeem is bij uitstek geschikt om deleties aan te tonen. Immers, het wegvallen 30 van een spot in een 2-D patroon van een tumor in vergelijking tot het patroon van de donor (de betreffende kankerpatiënt) duidt op de aanwezigheid van een deletie (dit soort deleties kunnen vrij groot zijn, namelijk wel een miljoen baseparen). Evenals bij linkageanalyse kan ook 35 hier het DNA fragment dat in de tumor is verdwenen vanuit de gel snel geïsoleerd en gedoneerd worden. Men heeft .8801147 -16- dan een marker in handen welke predisponeert voor het krijgen van een bepaalde vorm van kanker. Ook hier draait het dus om de markers. Algemeen gebruik van het hier beschreven systeem zal er dan ook waarschijnlijk toe leiden dat binnen 5 enkele jaren een zeer groot aantal markers voor ziektes beschikbaar komt.

Mutageniciteitstest: Het testen van stoffen op carcinogeni-citeit is van groot belang in een maatschappij waar steeds meer nieuw gesynthetiseerde chemische stoffen hun intrede 10 doen. Daarbij is het tevens van belang individuen die wellicht hebben blootgestaan aan carcinogene stoffen (of aan straling, zoals bij rampen met kerncentrales) te onderzoeken op mogelijk blijvende nadelige gevolgen zoals een verhoogd kankerrisico of blijvende schade aan hun erfelijk 15 materiaal. Het is inmiddels duidelijk dat zowel verschillende vormen van kanker als erfelijke afwijkingen worden veroorzaakt door veranderingen in het DNA. Mutagene stoffen (dat wil zeggen stoffen die de basevolgorde van het DNA veranderen) zijn vrijwel altijd carcinogeen. Daarom zijn 20 veel tests op carcinogeniciteit gebaseerd op het vermogen van de te testen stof om mutaties te introduceren in het DNA. De bekendste test is de Amestest waarbij gekeken wordt naar mutaties in bacteriën. Omdat bacteriën geen mensen zijn is deze test niet 100 % betrouwbaar en men zoekt naar-25 stig naar methodes die in prijs vergelijkbaar zijn maar betrouwbaarder antwoorden geven. In het algemeen wordt de voorkeur gegeven aan tests met humane cellen. Indien een verdachte stof geen afwijkingen geeft in het DNA van humane cellen is dat veel betrouwbaarder dan een negatieve uitslag 30 bij een bacterie. Dit is eens te meer het geval indien naar zeer veel genen tegelijk kan worden gekeken.

Met behulp van 2-D analyse kan niet alleen naar zeer veel genen tegelijk worden gekeken, maar met name naar die genen waarvan kan worden aangenomen dat ze hypergevoelig 35 zijn voor mutagene agentia. Van de minisatellieten is bekend dat ze niet alleen sterk variëren tussen individuen, hetgeen .8801147 -17- * een hoge mutatiefrequentie suggereert, maar ook dat ze veranderingen ondergaan in bijvoorbeeld tumoren. Indien een agens dat verdacht wordt van mutageniciteit (en daarmee van carcinogeniciteit) geen veranderingen in minisatellieten 5 introduceert kan gevoeglijk worden aangenomen dat het geen gevaar oplevert voor de genetische integriteit van mensen die er aan worden blootgesteld.

Volgens dezelfde redenering kan 2-D analyse van minisatellieten gebruikt worden voor het screenen van indivi-10 duen die zijn blootgesteld aan carcinogene stoffen. Door simpelweg een bloedmonster te nemen en een 2-D analyse te doen van het daarin aanwezige DNA kan snel een indruk worden verkregen van de genetische schade die de betreffende persoon heeft opgelopen.

.*801147 $ -18-

De uitvinding zal thans aan de hand van de onderstaande beschrijving van uitgevoerde experimenten en van de figuren nader worden toegelicht.

Fig. 1 laat schematisch zien hoe een normale Southern 5 blot hybridisatieanalyse verloopt. Totaal genomisch DNA wordt geknipt met een restriktieënzym, bijvoorbeeld Mspl.

De resulterende fragmenten worden op grootte gescheiden door elektroforese in agarosegels. Het scheidingspatroon kan worden zichtbaar gemaakt met ethidiumbromide, een DNA kleurstof. 10 Het resultaat is een smeer van ca. 1 miljoen fragmenten (afhankelijk van het aantal herkenningsplaatsen van het gebruikte restriktieënzym). Vervolgens wordt van het scheidingspatroon een replica gemaakt op DNA-bindend papier (tegenwoordig op nylon-basis en daardoor steviger) omdat er 15 met de gel zelf niet goed valt te werken. Het papier, dat goed hanteerbaar is, wordt vervolgens in een bad met vloeistof gedompeld waarin zich een radioaktief gelabelde zg.

DNA probe bevindt. Zo'n probe is een stukje DNA dat qua base-paarvolgorde identiek is aan de DNA sequenties waar men in 20 geïnteresseerd is. In het hier gegeven voorbeeld zijn dat de genen voor eiwitten die weefselafstoting na transplantatie controleren (zg. weefselantigenen). De hele operatie wordt onder denaturerende condities uitgevoerd, dat wil zeggen al het dubbelstrengig DNA wordt enkelstrengig waar-25 door de probe de kans krijgt met de eraan homologe gebieden te hybridiseren. Na afkoeling zal de probe aan het te onderzoeken gebied vast zitten. Na afspoelen van de overtollige radioaktiviteit wordt het papier in het donker op een gevoelige plaat gelegd, zodat na ontwikkeling de plaatsen op 30 het papier, waar hybridisatie heeft plaatsgevonden, zichtbaar worden als banden. Elke band vertegenwoordigt dus een groot aantal kopieën van een op grootte gescheiden DNA fragment dat homoloog is met de gebruikte probe.

Fig. 2 toont het autoradiogram van een Southern Blot 35 Analyse van totaal genomisch DNA geïsoleerd uit postmortem hersenweefsel van 5 niet-gerelateerde individuen en geknipt .6801147 -19- met het restriktieënzym HaelII. Als probe werd de minisa-telliet consensussequentie 33.15 gebruikt.

Fig. 3 toont een met ethidiumbromide aangekleurde polyacrylamidegel waarin humaan genomisch DNA, dat geknipt 5 is met het restriktieënzym HaelII, in twee dimensies is gescheiden. Scheiding op grootte in de eerste dimensie vond plaats in een neutrale 6% polyacrylamidegel waarna de laan werd uitgesneden en in de breedte werd opgebracht op een polyacrylamidegel waarin een denaturerende gradiënt was 10 aangebracht, waarna scheiding op sequentiecompositie werd uitgevoerd in de tweede dimensie, üit deze figuur blijkt dat het aantal fragmenten gegenereerd door knippen van het zoogdiergenoom met het restriktieënzym HaelII (ca. 1 miljoen) zo groot is dat ze niet gescheiden van elkaar kunnen worden 15 waargenomen. Een ander belangrijke conclusie die uit de resultaten gepresenteerd in fig. 3 getrokken kan worden is de ontoereikendheid van de gebruikte scheidingeeriteria; er is duidelijk sprake van een clustering in twee gebieden.

Om toch een inzicht te krijgen in de struktuur van het 20 totale genoom van een individu (en variaties daarin) werd hybridisatieanalyse met zg. repeterende DNA sequenties als probes onderzocht. Hybridisatieanalyse gebeurt doorgaans door middel van Southern hybridisatie (waaraan een ééndimensionale scheiding ten grondslag ligt) met probes voor 25 unieke genen. Mogelijk zou hybridisatie van 2-D scheidings-patronen met probes voor families van repeterende DNA sequenties, die regelmatig door het genoom verspreid liggen, een interpreteerbaar patroon van spots op kunnen leveren.

Echter, eenzelfde clustering als eerder voor totaal 30 genomisch DNA gevonden (fig. 3) viel waar te nemen na hybridisatie van het naar nylonfilters getransfereerde gel-patroon met probes voor de repeterende DNA sequentiefamilie BI (fig. 4). Aangezien bekend is dat deze muize repeat-familie (het humane homoloog heet Alu) tot de zg. dispersed 35 repeatcategorie behoort (d.w.z. regelmatig en op willekeurige wijze door het genoom verspreid is) werd aanvankelijk .8801147 ♦ -19a- geconcludeerd dat de lage resolutie net als bij totaal genomisch DNA veroorzaakt werd door een ontoereikende scheiding in de tweede dimensie.

Fig. 4 toont derhalve het autoradiogram, verkregen 5 na hybridisatieanalyse van een tweedimensionaal scheidings-patroon van rat genomisch DNA geknipt met HaelII, waarbij als probe een BI sequentie werd gebruikt waarmee alle, verspreid door het genoom voorkomende BI sequenties kunnen worden gedetecteerd in het 2D patroon.

10 Latere experimenten bewezen echter, dat de waarge nomen clustering niet aan een ontoereikende scheiding in de tweede dimensie te wijten was, maar aan de keuze van de probe.

Fig. 5 toont opnieuw een autoradiogram, verkregen 15 na hybridisatieanalyse van een twee-dimensionaal scheidings-patroon van rat genomisch DNA geknipt met HAelII. De probe was in dit geval een zg. satelliet I DNA sequentie, die in bepaalde regio1s van het genoom in tandem gerepeteerd voorkomt in een groot aantal kopieën.

20 Bij het aan fig. 5 ten grondslag liggende experiment is gebruik gemaakt van zg. tandem repeats (ratte satelliet I familie; het humane homoloog heet alpha satelliet) als probe bij de hybridisatieanalyse van 2-D scheidingspatronen. Deze repeatfamilie bevindt zich als zodanig reeds geclusterd 25 in het genoom in de vorm van direkt opeenvolgende (tandem) repeateenheden in centromeren van chromosomen. Fig. 5 laat zien dat het na scheiding in de eerste dimensie verkregen ladderpatroon zich verder opsplitst in de tweede dimensie .8801147 - 20- als gevolg van een variabel uitsmeltgedrag van de sequentie-varianten. De sequentievariatie binnen deze familie is uitgebreid beschreven door sequentieanalyse van de aparte repeateenheden. De verkregen resultaten vormen hiervan een 5 bevestiging en accentueren de deugdelijkheid van het 2-D gelsysteem voor het verkrijgen van extra resolutie bij de analyse van totaal genomisch DNA van zoogdieren.

Bovenbeschreven resultaten tonen aan dat het principe van denaturerende gradiëntanalyse kan worden toegepast 10 bij de analyse van sequentievariatie binnen repeterende DNA sequenties in het zoogdiergenoom. Echter, de gewenste hoge resolutie na hybridisatie met dispersed repeat families was hiermee nog niet bereikt. De vraag deed zich nu voor in hoeverre bovenbeschreven gebrekkige resolutie voor elke 15 repeat familie geldt. Met andere woorden was de vraag of er repeat families zijn die zich door hun karakteristieke uitsmeltpatroon anders gedragen dan willekeurig gekozen fragmenten uit het genoom. De volgende experimenten toonden het bestaan van een dergelijke familie aan.

20 Naast dispersed repeat families en tandem repeterende satellieten bestaat er ook een mengvorm, nl. de zg. dispersed repeterende minisatellieten. Deze sequenties bestaan uit opeenvolgende repeat units van elk 16-64 base-paren en komen verspreid door het genoom voor. Zo bevindt 25 zich bijvoorbeeld aan het 3*-uiteinde van het cHa-ras proto-oncogen een dergelijke minisatelliet.

Fig. 6 toont schematisch de gen-organisatie van het cHa-ras 1 proto-oncogen in het humane genoom. HTF = Hpa II Tiny Fragments regio (= GC-rijk gebied), VNTR = Variable 30 Number of Tandem Repeats.

Een belangrijk aspect van dergelijke minisatellieten is hun hyperpolymorfe karakter. Zeer grote interindividuele verschillen zijn gevonden voor wat betreft het aantal repeatunits in een bepaald locus en tussen loei onderling.

35 Minisatellieten zijn op basis van een zg. core sequentie georganiseerd in families die onderling niet homoloog zijn.

.8601147 -21-

Jeffreys et al. toonden aan dat met behulp van een core sequentie als probe 10-15 minisatellietregio's tegelijk kunnen worden onderscheiden met behulp van Southern analyse. Deze bevinding is door hem toegepast bij de iden-5 tificatie van individuen; het hyperpolymorfe karakter van de minisatellietregio's waarborgt individuele verschillen in de positie van de verschillende banden op de Southern blot die elk een minisatellietregio vertegenwoordigen. Opgemerkt dient te worden dat met behulp van de door Jeffreys toe-10 gepaste Southern analyse slechts 10-15 van de langste mini-satellietbevattende restriktiefragmenten kunnen worden onderscheiden (zie Fig. 2).

Een andere belangrijke toepassing van hyperpolymorfe minisatelliet sequenties is hun gebruik als markers in 15 genetische linkage analyse van ziektegenen. Hun geschiktheid voor linkage analyse wordt bepaald door hun hyperpolymorfe karakter en het feit dat een minisatelliet als geheel, in tegenstelling tot de core sequentie, geen kruishybridisatie vertoont met andere minisatelliet sequenties elders in het 20 genoom.

Zoals eerder opgemerkt is toepassing van minisatel-lieten bij de identificatie van individuen afhankelijk van hun verspreiding door het genoom, terwijl bij linkage analyse deze eigenschap juist niet wenselijk is. Het gebruik 25 van core probes bij linkage analyse is niet voldoende informatief omdat slechts een zeer beperkt gedeelte van de alle-len zichtbaar gemaakt kan worden en: nooit de garantie bestaat dat het moederlijk en het vaderlijk allel tegelijkertijd gescheiden van elkaar kunnen worden waargenomen (één 30 van de twee kan bijvoorbeeld in de slecht gescheiden smeer onderaan de gel zitten; zie bijvoorbeeld Fig. 2).

Besloten werd een poging te doen een minisatelliet core sequentie te gebruiken als probe bij de hybridisatie-analyse van 2-D scheidingspatronen. Verrassenderwijze bleek 35 dit in tegenstelling tot de eerder geteste Bl dispersed repeatfamilie reeds na de eerste poging een uitstekende .0801147 -22- scheiding te geven in de tweede dimensie en een spotpatroon op te leveren dat vrijwel optimaal over de gehele gel verspreid lag.

Pig. 7 toont een autoradiogram, verkregen na hybridi-5 satie van een twee-dimensionaal scheidingspatroon van humaan genomisch DNA geknipt met HaelII, met als probe de mini-satelliet-core sequentie 33.6.

Een indicatie waarom juist bij deze repeatfamilie wel een regelmatig scheidingspatroon in de denaturerende 10 gradiënt optrad werd verkregen door analyse van de uitsmelt-karakteristieken van de minisatellietbevattende restriktie-enzymfragmenten. Analyse van de minisatelliet sequentie gelegen aan de 31 kant van het cHa-ras proto-oncogen toonde aan dat aanmerkelijke variatie kon worden waargenomen af-15 hankelijk van het raamwerk dat de minisatelliet in het genoom omsluit. Fig. 8 laat de uitsmeltkarakteristieken zien van de cHa-ras minisatelliet in 7 raamwerken. Dit is feitelijk een nabootsing van de eigenlijke situatie na restriktieënzym digestie van totaal genomisch DNA; de DNA 20 sequenties die de minisatelliet flankeren zijn voor elk locus anders en geven dus na digestie een ander restriktie-fragment. Zoals uit fig. 8 blijkt resulteren 7 willekeurig gekozen raamwerken elk in een andere uitsmeltcurve. Op grond hiervan kan een andere positie in de denaturerende 25 gradiëntgel worden verwacht. Dit zou de uitstekende scheiding in de denaturerende gradiënt van de verschillende leden van een minisatellietfamilie kunnen verklaren.

Teneinde na te gaan of de verkregen scheidingspa-tronen een voldoende hoge resolutie hadden om segregatie 30 van allelen te volgen werden 2-D analyses verricht van een familie bestaande uit vader, moeder en een zoon.

Fig. 9 toont een autoradiogram verkregen na hybridi-satieanalyse van een twee-dimensionaal scheidingspatroon van humaan genomisch DNA geknipt met HaelII, met als probe 35 de minisatelliet-core sequentie 33.6. Op één gel zijn hier drie DNA samples geëlektroforeerd die afkomstig zijn .8801147 -23- van een vader, een moeder en hun zoon.

Per individu zijn met het oog direkt ca. 450 spots te onderscheiden (computeranalyse liet later zien dat het er een stuk meer zijn) waarvan er 87 polymorf zijn (ver-5 schillend tussen vader en moeder). Hiervan zijn er 67 segregerend (33 paternaal en 34 maternaal) en 20 niet in het patroon van de zoon terug te vinden. Dit laatste wordt veroorzaakt doordat, van een heterozygoot locus, zoals een minisatelliet, nooit alle allelen naar één kind zullen 10 overerven.

Fig. 10 toont nadere details van de in fig. 9 aangeduide gebieden A, B en C. Enkele polymorfismen zijn in detail weergegeven, (cirkel: maternaal allel? blokje: paternaal allel).

15 Fig. 11 toont onder A een computeranalyse van het in fig. 9 (midden) getoonde autoradiogram met behulp van een 2-D scanner en bijpassende analyse-software (BioRad Labs), en onder B eenzelfde computeranalyse na automatische kwantificering van het aantal spots.

20 Het grote belang van het experiment waarvan het re sultaat staat afgebeeld in fig. 9 is het feit, dat alle allelen die behoren tot de betreffende minisatellietfamilie kunnen worden teruggevonden. Hoewel het theoretisch mogelijk is dat onder een bepaalde spot zich nog een geheel 25 andere bevindt, die toevallig zowel van dezelfde grootte is als dezelfde uitsmeltkarakteristieken heeft, mag dit, in tegenstelling tot de situatie bij een klassieke Southern blot analyse, als uiterst onwaarschijnlijk worden beschouwd. De twee-dimensionale spotpatronen afgebeeld in fig. 9 kun-30 nen daarom beschouwd worden als genomische kaarten van individuen, waarbij dient te worden aangetekend dat ze hun waarde als koppelingskaarten pas verkrijgen na identificatie van de individuele spots. Deze identificatie is op dit moment ook al in volle gang met behulp van de unieke 35 minisatelliet probes en de klassieke Southern blot hybridi-satieanalyse. Te verwachten is daarom dat de in één gel -24- gevisualiseerde fragmenten in de nabije toekomst via een databestand in êên keer geïdentificeerd kunnen worden.

De totale genenkaart van een menselijk individu is daarmee een feit.

5 In de uitgevoerde experimenten werden de volgende materialen en methodieken toegepast.

DNA isolatie en restriktieënzymdiqestie: Voor het maken van 2-D patronen zoals bovenbeschreven kan in principe elk weefsel gebruikt worden als bron voor het DNA. Ook gekweek-10 te cellen zijn geschikt. In het algemeen kan gebruik gemaakt worden van de standaard DNA isolatieprocedures. In de experimenten zoals bovenbeschreven werd DNA geïsoleerd uit hersenweefsel van verschillende individuen, alsmede uit bloed, eveneens van verschillende individuen. De volgende 15 procedure werd gevolgd bij de isolatie van DNA uit hersenweefsel. Diepgevroren postmortem cerebellum werd gefragmenteerd en overnacht geïncubeerd bij 65°C in 2 volumes van een oplossing bevattende lOOmM tris, pH 7,5, 250 mM Na-EDTA, 1% natriumdodecylsulfaat (SDS) en 100 yug/ml proteinase 20 K (BRL). Na bijmengen van 1 volume 8M Kaliumacetaat werd de oplossing 2 uur op ijs bewaard en vervolgens geëxtraheerd met 1 volume chloroform. Het DNA werd verkregen uit de waterfase door ethanol precipitatie en vervolgens opgelost in water. De DNA's uit bloed zijn verkregen van 25 Dr. E. Bakker (Afd. Antropogenetica, Leiden) alwaar ze zijn geïsoleerd middels een standaard procedure. DNA (10 ^ig) werd geknipt met de restriktieenzymen endonuclease HaelII of Hinfl (BRL) onder condities zoals beschreven door de fabrikant.

30 Elektroforetische scheiding: Twee-dimensionale scheiding van lO^ig DNA restriktiefragmenten werd uitgevoerd in polyacryl-amidegels (acrylamide: bisacrylamide =37 : 1). De eerste dimensie werd gedaan in een neutrale 6% gel bij 50°C gedurende 2 uur bij 250 V in 1 X TAE (40 mM Tris, pH 7,4, .8801147 -25- 20 mM natriumacetaat, 1 mM natrium EDTA). De 1-D scheidings-patronen werden zichtbaar gemaakt door middel van kleuring (in het donker) met ethidiumbromide (0,1 ^ag/ml) gedurende 10 minuten, gevolgd door ontkleuring voor 'ten minste 30 mi-5 nuten in gedeïoniseerd water. De 0,54-2,8 kb regio werd uit de laan gesneden en dwars op een tweede 6% polyacrylamide-gel gebracht, welke een 10-75% lineaire concentratiegradiënt van denaturans bevatte (100% denaturans = 7,0 M ureum, 40% formamide), parallel aan de elektroforeserichting. Deze gels 10 werden gegoten door het mengen van de grensoplossingen in een lineaire gradiëntmaker met gebruikmaking van een peristaltische pomp. Voor deze tweede dimensie werd naast het 20-cm brede standaardapparaat vaak gebruik gemaakt van een 30-cm breed apparaat, dat ruimte biedt aan 6 laantjes naast 15 elkaar . Na elek troforese gedurende 12 uur bij 225 V en bij 60°C werd de gel gekleurd met ethidiumbromide en weer ontkleurd om het scheidingspatroon zichtbaar te maken.

Overdracht van de scheidingspatronen naar membraanfliters:

De twee-dimensionale scheidingspatronen werden eerst gefrag-20 menteerd door de gel te bestralen met 302-nm ultraviolet licht (UV) gedurende 4 minuten, hetgeen optimaal bleek.

Voor de overdracht werd de gel gedurende 5 minuten gekookt in 1 X TBE (89 mM Tris, 89 mM boorzuur, 2 mM natrium EDTA) en vervolgens overgebracht naar 1 X TBE. Overdracht naar 25 nylonmembraan (Nytran 13N, Schleicher and Schuell of

Zetabind, BioRad) werd bewerkstelligd door elektroblotting bij 400 mA (12-28 V) bij 15°C in een elektroblotting apparaat met grafietplaten (Biometra of Ancos). Elektroblotting gebeurde over twee perioden van 45 minuten tussen 10 vel-30 letjes Whattman 3MM papier gedrenkt in verse 1 X TBE (ververst tussen de twee elektroblottingperioden). Na overdracht werd het filter gespoeld in 2 x SSC (1 x SSC - 150 mM NaCl, 15 mM natriumcitraat), aan de lucht gedroogd, verhit gedurende 1 uur in een oven bij 80°C en met 302-nm ÜV bestraald 35 gedurende 45 seconden.

.8801147 -26-

Bereiding en radioaktieve labeling van de probe; De probe werd bereid door het individueel kineren van twee gedeeltelijk complementaire en overlappende oligonucleotiden. Een zo'n paar vertegenwoordigt een minisatelliet core-5 sequentie. Gebruik is gemaakt van core-sequentie 33.6 (5'-AGGGCTGGAGG-3'). Na kinering werden de twee oligo's gemengd en annealed bij 57°C gedurende 1 uur, gevolgd door ligering volgens standaard procedures (Maniatis et al., 1982). De op deze wijze bereide synthetische probes hadden 10 een gemiddelde lengte van 500 baseparen of meer. Vijftig 32 ng van de ligatieprodukten werd gelabeld met a- P-dCTP, hetzij door middel van de random primed oligolabelling-methode (Boehringer) hetzij door selfpriming na koken gedurende 5 minuten en reannealen in de aanwezigheid van 15 1 eenheid Klenow enzym (Boehringer), 2 yuM dNTP, 50 mM Tris, pH 7,2, 10 mM MgCl,. Specifieke aktiviteiten van 3 tot 8 ^ 8 x 10 c.p.m./^ig werden bereikt.

Hybridisatieanalyse: Het filter werd geprehybridiseerd in 5 x SSC, 20 mM natriumfosfaat, pH 7,2, 1% SDS, 1 mM natrium 20 EDTA, 50 yag/ml heparine gedurende 2 uur bij 65°C. Na toevoegen van de gedenatureerde probe in een concentratie van g 1 x 10 c.p.m./ml, werd gehybridiseerd gedurende 12 uur bij 65®C. Het filter werd hierna gewassen in 2,5 x SSC, 0,1% SDS, driemaal gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en 25 driemaal gedurende 20 minuten bij 65°C. Autoradiografie was bij -80°C gedurende 12-48 uur met Kodak XAR-5 film tussen fijne versterkingsschermen (Kodak).

.8801147

Claims (9)

1. Werkwijze voor het detecteren van genetische variatie door dubbelstrengs DNA van een individu met behulp van een of meer restrictie-enzymen in fragmenten te knippen, de verkregen fragmenten door elektroforese te 5 scheiden, het verkregen scheidingspatroon over te brengen op een membraanfilter, daarop onder DNA-denaturerende omstandigheden te hybridiseren met een gelabelde DNA- of RNA-probe en het label zichtbaar te maken, met het kenmerk, dat de elektroforetische scheiding van de gegenereerde

10 DNA-fragmenten in twee dimensies wordt uitgevoerd, waarbij de fragmenten in één dimensie worden gescheiden op basis van hun lengte en in de andere dimensie worden gescheiden op basis van hun baseparensequentie, en dat als probe in de hybridisatie-analyse een van een label voorzien

15 DNA- of RNA-molekuul wordt gebruikt dat een of meer eenheden van een of meer minisatelliet-core sequenties omvat.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de gegenereerde DNA-fragmenten eerst in een neutrale poly-acrylamide-gel op basis van hun lengte worden gescheiden 20 en vervolgens in de tweede dimensie op basis van hun baseparensequentie worden gescheiden in een polyacrylamide-gel welke evenwijdig aan de elektroforese-richting een lineair toenemende concentratiegradiënt van een DNA-denaturans bevat.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de elektroforetische scheiding op basis van lengte wordt uitgevoerd bij een temperatuur tussen 45 en 55°C en de elektroforetische scheiding op basis van baseparensequentie wordt uitgevoerd bij een temperatuur tussen 55 en 65°C.

4. Werkwijze volgens conclusie 2 of 3, met het ken merk, dat het na de tweedimensionale elektroforese verkregen scheidingspatroon door elektroblotting wordt overgebracht op een membraanfilter, waarbij het scheidingspatroon .8801147 -28- voorafgaande aan deze overdracht door bestraling wordt gefragmenteerd en door verhitting verder wordt gedenatureerd.

5. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, 5 met het kenmerk, dat als membraanfilter een nylon membraan wordt toegepast.

6. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat als probe een DNA molekuul wordt gebruikt, dat 10 - 100 eenheden van een of meer minisatelliet- 10 core sequenties omvat.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat een probe wordt gebruikt die de minisatelliet-core sequentie 33.6 bevat.

8. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, 15 met het kenmerk, dat een met een radioactief isotoop ge- „ 32" labelde probe, bijvoorbeeld een met P gelabelde probe wordt gebruikt.

9. Kit voor gebruik in de werkwijze volgens een of meer van de conclusies 1-8, 'omvattende een gelabelde 20 probe, die een of meer eenheden van een of meer minisatelliet-core sequenties bevat, en een voor scheiding van DNA fragmenten op basis van hun baseparensequentie geschikt elektroforese-materiaal dat een lineaire concentratie-gradiënt van een DNA-denaturans bevat. .8801147 '' 6 LITERATUURREFBRENTIES.