CN1151269C - 用于诊断性dna检测的方法 - Google Patents

用于诊断性dna检测的方法

Info

Publication number
CN1151269C
CN1151269C CNB961946105A CN96194610A CN1151269C CN 1151269 C CN1151269 C CN 1151269C CN B961946105 A CNB961946105 A CN B961946105A CN 96194610 A CN96194610 A CN 96194610A CN 1151269 C CN1151269 C CN 1151269C
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcr
gene
primer
fragment
gel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB961946105A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1198188A (zh
Inventor
�ά��
扬·维吉
李代宗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of CN1198188A publication Critical patent/CN1198188A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1151269C publication Critical patent/CN1151269C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

检测基因中突变的测定法，包括两步多重聚合酶链反应扩增，然后以大小和碱基对序列这两者为基础，优选进行片段的双向电泳分离。

Description

用于诊断性DNA检测的方法
本发明涉及使用聚合酶链反应(PCR)扩增，再通过电泳分离所得片段以检测突变缺损等可能的基因变体的DNA诊断检测方法；本发明更具体地涉及与在变性梯度凝胶中进行双向电泳分离相结合的新的和改良的多重PCR技术。
本发明具体地涉及检测患有遗传疾病的病人中DNA突变的存在，所述遗传疾病包括出生时即有的缺陷(如囊性纤维化)和成人慢性病(如癌症)的遗传倾向。本发明更具体地涉及通过新的两步聚合酶链反应(PCR)扩增快速制备基因片段，随后有效并精确地检查它们中的突变。
发明背景
通过DNA诊断检测可鉴定出具有突变缺损的基因(基因变体或等位基因)。基因变体可由父母遗传给孩子，一些基因变体的作用很强，它们独自作用即可导致疾病，例如导致囊性纤维化的囊性纤维化跨膜传导性调节物(CFTR)基因的多种突变体。其他基因变体与其他基因座的基因变体联合作用，例如许多常见(多基因)病，如心脏病和癌症。可以在早期，即从胚胎细胞中检测(出生前检测)基因缺损，也可以在晚期检测幼儿，成人或老年人细胞中的基因缺损。
通过DNA诊断检测，可以得到疾病的有关信息，有时在疾病发生前即可得到该病的信息，这大大便利了对疾病的处理，如预防、治疗。例如可以检测癌症或传染性病因中特殊基因变体的存在以预测例如疾病的进程，对治疗的反应。也可以检测个体携带特殊基因变体的情况，他们不愿意眼睁睁地让这些基因变体传递给他们的后代(携带者检测)。最后，还可以在任何时候(从出生前至晚年)检测个体患遗传性基因编码的疾病的倾向。该适用谱的一端的例子是囊性纤维化，对它而言，出生前检测和携带者筛选已经相对常见，该谱的另一端涉及后期爆发的疾病，如癌症和神经变性病。
DNA诊断检测包括分析个体基因的序列完整性。目前，该项工作花费大，因为精确的检测需要进行劳动强度大的对基因的测序或解码。迄今为止，还没有经济实惠普遍适用的DNA诊断标准化系统可供使用(参见Cotton，1993，突变检测的现有方法，Mutat.Res.285：125-144)。为了经济实惠又能被广泛接受，DNA诊断系统必须是准确的(超过95％)，具有高的生产率，而且劳动强度要低。
分析技术的一般背景
首先有必要简单回顾涉及PCR扩增和电泳分离片段的一般技术，本技术领域已经使用过并正在使用该技术。
首先用化学和物理的方法处理如来自血液的细胞样品以提取仅占细胞基因组总DNA材料百分之二的携带基因的DNA链，其余的DNA材料将背景占满。当每个细胞具有两拷贝每种基因时(这一点可通过构件或碱基对来鉴定，所述构件或碱基对由字母A、C、G和T作为字母密码的序列来辨认)，它们构成了DNA长链如此小的一部分以致于必须通过制备多拷贝的基因扩增之以使它们被检测出。通过热分离或变性DNA链对，与适当的引物混合以与欲研究的基因片段(如基因外显子或编码区)的始端和末端结合或退火(下文将更详细地讨论)并加入足够的构件以产生基因外显子的拷贝可完成基因扩增。连续重复此循环步骤产生渐增拷贝的外显子以得到纯化和扩增的数量，此方法通常指的是前述的聚合酶链反应或PCR扩增，它更详细地阐述于例如分子病理学，Hein and Silvenman，Carolia学术出版社，1994，第2章，分子技术及其在临床实验室中的自动化，5-31页(Winn-Deen)。
在此阶段，然后是检查或分析基因外显子以测定与正常状态相比是否有突变，一般优选以大小和碱基对序列为基础，通过电泳分离DNA纯化片段可做到这一点，更详细的描述见共同申请人Vijg和A.G.Uitterlinden的双向DNA分型：基因组分析的平行方法，EllisHorwood，1994，尤其是p33-40。
电泳不仅已用于DNA片段的分离，还可用于分离除基因外的其他物质，如Electrophoresis 1993，14，1091-1198中描述的蛋白质分析。通过带荧光染料标记的电泳进行单向DNA分离的机器已有提供，如Perkin Elmer的ABI Prism 377 DNA测序仪；双向DNA分型(typing)的机器也有提供，如共同申请人Vijg和E.Mullaart等人在Nature，365，1993年9月30日中所述：通过双向DNA分型平行分析基因组，p 469-471，描述了荷兰的Ingeny B.V.的装置。将电场的第一维(称为水平向)施加到其中已引入纯化的DNA片段的适当凝胶基质(下文将讨论)中，通过大小的不同(较大颗粒移动得比较小颗粒要慢)可导致片段的分离。通过在具有化学梯度(如在凝胶中设置连续的越来越浓的脲/甲酰胺)或沿胶设置的温度梯度的垂直方向(竖向)施加电场，DNA片段将迁移(此次为竖直方向)，直至它们在特定的垂直序列所决定的位置处解链并被阻留在凝胶基质中的某处。为了防止整个DNA片段的解链，需让它附着(电泳前)大量的G和C，G和C与A、T相比对解链的抗性更大。所谓的GC-加强(clamping)在完全由片段外显子一部分之序列决定的位置处有效地阻留了每个片段。如果此序列仅在一个位置发生改变，例如AT对代替了GC对，解链将会延迟或提前，因此与正常的参照片段相比，被阻留至不同的垂直位置。
这种双向基因扫描(TDGS)有望成为经济实惠而又能被广泛接受的DNA诊断系统。在此系统中，如上所述，通过聚合酶链反应(PCR)扩增从给定DNA样品中得到的大量DNA片段基于大小和碱基对序列被电泳分离。此系统高度精确(即99％)，因为第二向分离是以变性的梯度凝胶电泳(DGGE)为基础的。实际上，DGGE是唯一的具有如此高精确度的系统(Sheffield et al.，1993，用于检测单碱基取代的单链构象多态性分析的灵敏度，Genomics 16，325-332；Grompe，1993，核酸中未知突变的快速检测，Nature Genet.5，111-117；Guldberg et al.，1993，在丹麦对苯丙酮尿症的分子学分析：99％的突变被变性梯度凝胶电泳检出，Genomics 17，141-146)。用于TDGS的自动化仪器在某种程度上是可以使用的，在某种程度上还有待开发。TDGS能够同时检测得自一个或多个基因的DNA片段中所有可能的突变，其生产率高，人为干扰最低。
在DNA诊断中广泛使用TDGS的一个主要障碍是在同一反应试管中通过PCR(多重PCR)同时扩增许多片段的困难。实际上，经常甚至不可能同时满足PCR和变性梯度凝胶电泳的需求，即最适的PCR反应和扩增片段最适的解链行为。最新的方法开始于通过PCR扩增靶DNA区，通常是基因的蛋白质编码区(外显子)。这些扩增反应是分开进行的，例如，如果需分析基因中27个外显子，则需进行27个独立的PCR反应。在实际操作中，通常可以在一个试管中进行几个PCR反应(例见Edwards and Gibbs，1994，多重PCR：优点、发展及应用，PCR Methods and Applications 3，565-575)。
显然，在大量个体需被检测的情况下，以及当在相同的TDGS试验中需同时检测一个以上基因时，移液步骤和需进行的单个反应的总数会很高。这增加了试验的劳动强度，也使工作更复杂，人为出错的机会升高。实际上，鉴于这种复杂性，甚至在所有移液步骤都可以自动进行的完全自动化的实验室中也解决不了这一难题。
不能在同一试管中的同一反应条件下同时PCR扩增多个片段这一难题是TDGS满足临床检测标准(即对实验者友好)的重大技术障碍。通过多重PCR，即通过使用多套引物在一个反应中进行几个PCR扩增以减少PCR反应的数目是非同寻常的进步。
目前的多重PCR法有时简单到混合其反应条件已分别被确定的几套引物。然而，大多情况下，应仔细考虑欲扩增的区域，片段的相对大小，引物的动力学和PCR实验条件的最佳化来开发多重PCR以适应多种片段。
主要的难题是引物的定位，为了基因诊断，人们一般的目的是扩增外显子序列，剪接位点和调节区。外显子扩增PCR反应的引物理想的是被置于与外显子相邻的内含子序列中。这提供了一些调节片段长度或扩增质量以及受突变影响的剪接位点的有关信息的限制，这些是选择引物的首要限制。
其次，引物的定位必须使除靶序列外的其他位点处非特异性扩增不会发生。实际上，人类基因组为3×109个碱基对长，这给靶序列和其他非靶序列之间偶然发生的序列同源性提供了充足的机会。这对多重PCR而言不是一典型的难题，但是当人们希望一次仅扩增一个片段时也会出现这一难题。这是选择引物的第二个限制。
为了进行多重PCR，应选择引物以使其预测的杂交动力学与多重反应中其他引物的相类似，这是选择引物的第三个限制。以总基因组DNA作为模板选择引物的这些限制是为何多重组通常较小(典型地少于5个片段)的原因。
为了在TDGS中最好地分离，选择引物有第四个难以克服的限制。TDGS需要平均为100-600bp的DNA片段，两个引物中的一个应与富含GC的片段偶联以提供GC夹(GC-clamp)作为欲通过PCR产生的片段中最高的解链区，这对于确保在第二(变性梯度)向凝胶中检测突变的最高敏感性是必需的(Myers et al.，1985，在与GC夹结合的DNA片段中几乎所有的单碱基取代均可被变性梯度凝胶电泳检出，Nucl.Acids Res.13，3131-3145；Myers，et al.，1987，通过变性梯度凝胶电泳检测和定位单碱基变化，Meth.Enzymol.，155，501-527)。然后，引物应按下述方法定位，即靶片段仅含有一个这样的单一功能区，它与其上结合有GC夹时相比，解链较早(在较低的脲、甲酰胺浓度或温度下)，这证明对于PCR(不只是多重的)和最适解链曲线都最适合的PCR条件是难以(如果不是不可能的话)实现的(如将Blanquet等人，1993，通过变性梯度凝胶电泳鉴别RB1基因中的种系突变，Hum.Molec.Genet.2，975-979所述的RB DGGE设计与本发明的设计相比较)。
本发明涉及将所谓长-PCR与短-PCR相联合。最近，PCR扩增法的发展已允许扩增来自基因组DNA的大片段(高至40kb)。我们已经利用了这一进展，通过使用长-PCR以尽可能最少数目的片段起始扩增靶基因的所有编码区。然后我们使用这些长的扩增子作为模板以多重形式PCR扩增TDGS所需的小片段。借此，首先从混杂的基因组DNA中扩增出靶序列，它允许在同一条件下从该预纯化的模板得到小的PCR片段。
使用上述方法，仅以PCR扩增子的最适解链行为为基础选择引物套，也显示了PCR的最适行为，甚至允许广泛的多重PCR。此现象可部分归于经长-PCR的预纯化，实际上，相对于其他基因组DNA序列而言，长-PCR大大增加了靶序列的量，从而大大降低了反应的复杂性并增加了它的特异性。
尽管上述现象可以由通过制备纯化的模板可降低复杂性来解释，但仍未得到精确的解释。实际上，作用的绝对值是惊人的，迫使我们重新评价PCR最优化所涉及的因子。然而有一件事是清楚的，仅通过本发明就使得能设计和进行有效的TDGS试验，因为现在可以仅以解链曲线为基础选择引物，多重PCR十分的便利。
本发明也是通用的，实际上，在每一个以PCR为基础的诊断反应中选择引物是一项重要的问题，很多潜在的引物位点最终的结果却很差，而多重PCR又会带来另外的问题，这就是它不能被广泛使用的原因。长-PCR/短-PCR两步扩增系统提供一直接而简单的解决问题的方法。
发明目的
因此，本发明的一个目的是提供克服了上述困难的用于诊断性DNA检测的新的改良的方法和装置。
另一个目的是提供通过两步多重聚合酶链反应扩增检测基因突变的新方法，所述扩增使用长和短的多重PCR，接着以大小和碱基对序列为基础进行片段的双向电泳分离。
其他目的将在下文解释，并联系所附权利要求被指出。
附图简述
以下将参照附图描述本发明，其中：
图1阐明了进行本发明方法步骤的顺序。
图2表示带和不带GC夹的RB外显子12(即成视网膜细胞瘤基因)的解链曲线。
图3显示了肿瘤抑制基因RB的图谱，示出长和短-PCR反应的PCR引物位置。
图4是2-D凝胶电泳模式中短-PCR片段预测位置的计算机图。
图5显示出与理论预测模式一致的实际凝胶分离模式。
图6表示以外显子18-23的长-PCR产物为模板，得到所有6个短的PCR片段(泳道7-12)，而以总基因组DNA为模板，大多数产物丢失了(泳道1-6)，还显示出仅5ng总基因组DNA就足以作为长-PCR的起始物质(泳道13)，并且用长-PCR产物作为模板得到所有短的PCR产物(泳道20-24)。
图7表示野生型(纯合正常)片段和几个杂合突变体的详细情况。
发明概述
简单地说，在重要的一方面，本发明包含分析来自DNA的预定基因外显子的方法，该方法包括，作为第一步和相对较长的多重聚合酶链反应，加入针对连续的基因外显子组的引物对，接着在一共用试管中完成聚合酶链反应扩增；作为第二步和短的多重聚合酶链反应，进一步加入针对每种基因外显子的引物对，在所述共用试管中完成聚合酶链反应扩增；电泳分离基因片段。优选地，本发明的方法使用的引物是荧光标记的寡核苷酸引物，聚合酶链反应中所用的核苷酸构件是荧光标记的。优选地，本发明的电泳在凝胶中使用温度梯度以分离片段。
下面将描述优选的和最好的技术模式。
具体实施方式
如上文所提及，本发明涉及以最低数目的两步多重PCR反应与片段的自动双向分离的联合为基础，设计精确而有效的突变检测试验以同时检测基因中所有可能的突变。
表1列出了以RB(成视网膜细胞瘤)肿瘤抑制基因作为模型设计的TDGS试验的不同步骤。首先，从数据库(如Genbank)中获取基因序列，靶区域(即外显子、剪接位点，调节区)是确定的。然后定位引物以得到作为尽可能最少数目的仍可以通过长-PCR(即高至至少20kb)(TakaRa LA PCR试剂盒，Product Insert)扩增之片段的所用靶区域。选择长-PCR引物序列的一些一般性指南已有描述(Foord and Rose，1994，长距离PCR，PCR方法和应用3，S149-S161)，但凭经验确定最理想的引物仍有必要。
表1 TDGS试验的设计
1、从数据库中获取序列。
2、定位长-PCR的引物以用最少数目的扩增子覆盖所有想要的区域(如编码序列，剪接位点，调节区，突变热点)。
3、根据下列标准定位短-PCR的引物；
a、所希望的靶序列应该被100-600bp的扩增子覆盖
b、扩增子应该具有最理想的解链行为，即由一个最低解链区加上与引物之一结合的GC夹组成
c、扩增子在2-D凝胶中最理想地分布
d、类似的反应动力学
4、以长-PCR产物作为模板，为每套引物单独建立PCR条件
5、通过将引物套分组并调节反应成分来开发多重共扩增条件
如表1第3项所列，然后使用长-PCR片段作为模板，选择短-PCR的引物以产生100-600bp的片段。此处主要选择标准必需是片段的解链行为，在理想状态下，每个扩增子应仅含有一个解链区，它应该比与之结合的GC夹低(较不稳定)。通过使GC夹成为引物之一的一部分可完成30-40bp的GC-夹的引入(Sheffield etal.，1989，用于检测单碱基取代的单链构象多态性分析的灵敏度，Genomics 16，325-332)。通过使用计算机程序可确定每个候选靶序列的最理想的解链行为(例如MELT 87；Lerman and Silverstein，1987，DNA解链的计算机模拟及其在变性梯度凝胶电泳中的应用，Meth.Enzymol.155，482-501)。通过GC-加强具有最优化解链行为的扩增子例子示于图2，它是有关RB的外显子12的。
一般而言，引物集合的选择是允许针对大小和DGGE方面在2-D凝胶中都有最理想的分布。由于2-D凝胶的高分辨率(5-10bp大小的差异很容易辨认)，一般做到这一点不太难。实际上，50个或更少片段的点分布几乎不是问题，根据它们的解链行为可简单地选择引物。
图3示出为RB基因选择的扩增子集合，以及用作模板的长-PCR片段。所有短-PCR片段加在一起代表90％以上的RB编码区。
图4和5示出被图3所示扩增子覆盖的RB基因的24个外显子在理论上和经验上的点分布。尽管有差异，最明显的是表示外显子11的点，我们的结论是整个解链程序精确地预示出点的位置。
没有第一个长-PCR步骤，最理想的解链标准通常会与以总基因组DNA作为模板的PCR所用的其他引物设计标准相冲突，认识到这一点很重要。实际上，对于RB基因而言，发现不可能选择到对于在DGGE中最理想的分离和在PCR中最适宜的引发都适合的条件。由长-PCR代表的预纯化步骤对于TDGS最优化PCR引物套的设计显然是绝对重要的。
当确立了试验形式后，以多重形式进行两步PCR扩增，设计和进行多重PCR反应的可能性代表了本发明的核心。图6所示结果阐明了第一步，即长-PCR步骤对于成功的多重PCR的必要性。图6中左边6个泳道含有使用不同量的总基因组DNA作模板，对RB基因的外显子18-23(6个片段)进行多重PCR之后得到的PCR产物。显然，基本上没有得到所需长度的产物，后者与使用相同多重PCR反应产物，但此次是以长-PCR产物作为模板的泳道7-12形成对照。以不同的循环进行长-PCR，显然仅需要5-10个循环即可为成功的多重PCR产生足够的模板。
泳道13至19含有以长-PCR产物作为模板，将不同量的起始物质，即不同量的总基因组DNA用于长-PCR反应得到的多重短-PCR产物。令人感兴趣的是5ng总基因组DNA即足以得到所有产物。由于临床材料有时不能获得足够的量(如乳腺癌针活检)，这-结果就很重要，表示很少量的DNA也可以进行成功的试验。
最后，图6的泳道20-24含有与6套长-PCR相对应的5个多重PCR的产物(长-PCR组1和6合并；也见图3和下文将讨论的表2)。进一步调整PCR条件和/或引物会得到此基因更小数目的多重套。实际上，没有理由在仅单个PCR反应中不能扩增完整的RB基因编码区。在第二个PCR之后，将片段进行一轮完全的变性/复性循环以促进异源双链的形成。表2列出了对RB而言的TDGS引物对；外显子数目列于表格最左边，长PCR引物密码是针对6个外显子组(0至24-27)，短PCR引物是针对单个27个外显子的。
PCR过后，使片段混合物在变性梯度凝胶中进行2-D电泳(图1)，使用自动化仪器会大大简化这一步骤。这里所用的仪器可允许10块凝胶同时跑，而不需人工干预(即切下泳道并将之上样于第二块凝胶)，使用手工操作的仪器进行涉及实验条件最优化的所有实验。2-D电泳后，将凝胶从玻璃板之间取下，用溴化乙锭或任何其他染料染色。
              表2  用于RB TDGS的引物对
RB：长-PCR
外显子                   引物5’-3’                                     大小
0-2           TGTCAGGCCTGCCTGACAGACTTCTATTCAGCA      4.5kb
              ATGTTAGCAGAGGTAAATTTCCTCTGGGTAATGG
3-6           GCAGTCATTTCCCAACACCTCCCCTCTGT          9kb
              AAGCCAAGCAGAGAATGAGGGAGGAGTACATTAC
7-11          TCAGCAGTTTCTCCCTCCAAGTCAGAGAGGC        10kb
              GAGACCAGAAGGAGCAAGATCAGGTAGTAG
12-17         ACCATTCCCCCTACTCTCCATGGTCCATG          12.4kb
              CTCACAGGAAAAATACACAGTATCCTGTTTGTGTGGC
18-23         CCAGCCTTGCATTCTGGGGATGAAGC
    14kb
              AGTCGTAAATAGATTTTCTTCACCCCGCCCC
RB：短-PCR
外显子             引物5’-3’                        大小       Tm(％UF)     多重套
2           [GC1]TTGATTTATAAGTATATGCCA   229bp       30          E
            CAAAACGTTTTAAGAAAATCC
3           [GC1]CCAGTGTGTGAATTATTTAA    239bp       27          A
            CCTTTTATGGCAGAGGCTTATA
4    [GC1]GAATTGAAATATCTATGATT       270bp    24    A
     ATCAGAGTGTAACCCTAATA
5    [GC1]TACTATGACTTCTAAATTACG      157bp    27    A
     GTGAAAAATAACATTCTGTG
6    TGGAAAACTTTCTTTCAGTG            237bp    17    A
     [GC1]GAATTTAGTCCAAAGGAATGC
7    [GC1]CCTGCGATTTTCTCTCATAC       257bp    26    B
     GCAACTGCTGAATGAGAAAG
8    GTTCTTATCTAATTTACCACT           229bp    27    B
     [GC1]TTTTAAAGAAATCATGAAGTT
9    [GC1]AGTCAAGAGATTAGATTTTG       227bp    20    B
     ATCCTCCCTCCACAGTC
10   [GC1]GACATGTAAAGGATAATTGT       222bp    21    B
     GCAAATCAATCAAATATACC
11   AGTATGTGAATGACTTCACT            174bp    21    B
     [GC1]TATAATATAATTAAAAGTAGG
12   CTCCCTTCATTGCTTAACAC            211bp    24    C
     [GC1]TTTCTTTGCCAAGATATTAC
13   [GC1]GATTACACAGTATCCTCGAC       224bp    34    C
     GCAGTACCACGAATTACAATG
14   [GC1]GTGATTTTCTAAAATAGCAGG      179bp    35    C
     ACCGCGCCCGGCTGAAAT
17   [GC1]TTCTTTGTCTGATAATAAC        380bp    26    C
     CTCTCACTAACAATAATTTGTT
18   [GC1]GACTTTTAAATTGCCACTGT       393bp    33    D
     ATTCCCTACAGTTTCTTTAT
19   [GC1]CAACTTGAAATGAAGAC          248bp    34    D
     CGTCCCGCTGCTCTTGAAAATAATCATC
20   [GC1]AAAATGACTAATTTTTCTTATTCCC  227bp    44    D
     AGGAGAGAAGGTGAAGTGC
21   [GC2]CATTCTGACTACTTTTACATC      201bp    28    D
     CGGGCTTACTATGGAAAATTAC
22    [GC3]CTTTTTACTGTTCTTCC       194bp    33    D
      CCAATCAAAGGATACTTTTG
23    [GC1]TCTAATGTAATGGGTCCACC    281bp    38    D
      CCCTACTTCCCTAAAGAGAAAAC
24    CGGAATGATGTATTTATGCTCA       195bp    22    E
      [GC1]TTCTTTTATACTTACAATGC
25    [GC1]ATGATTTAAAGTAAAGAATTCT  245bp    38    E
      CATCTCAGCTACTGGAAAAC
26    [GC1]TCCATTTATAAATACACATG    161bp    32    E
      ATTTCGTTTACACAAGGTG
27    [GC1]TACCCAGTACCATCAATGC     191bp    43    E
      TCCAGAGGTGTACACAGTG
GC夹：
GC1： CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCC(30聚体)
GC2： CGCCCCGCGCCGCCGCCCCGCCCCCGCCCGTCCCGCCC(38聚体)
GC3： CGCCCCGCCGCGCCCCGCGCGCCCGGTCCCCGCGC(35聚体)
记录并评价(通过肉眼和图象分析)所得模式中突变的存在。在所用条件下，即GC-加强和异源双链化，杂合突变形成4个点：2个同源双链变体和2个异源双链变体(图7中阐明的)，后者并不总能被分离。由于突变也可在纯合状态下发生，因而在PCR之前有必要将每种样品与对照样品混合以确信异源双链分子会存在。
下文提供了详细的方法，其中本发明的实施方案得以实施和使用以在DNA诊断检测中精确而有效地制备和检查基因片段。针对举例性或模型基因(即前文讨论过的肿瘤抑制基因RB)的这一描述不构成对本发明的特殊限制。将相同的方法用于其他基因和/或在同一个试管中混合更多的PCR片段属于本领域技术人员的范围，它被认为属于本发明的保护范围。
A.RB两步PCR TDGS试验的设计
序列的获得  从数据库(即Genbank)中获取RB基因的序列，靶区域(即外显子，剪接位点，调节区)是确定的。
用于多重长-PCR的引物的选择以用最可能少数目的仍可通过长-PCR扩增的片段覆盖整个靶区域的方式定位长-PCR的引物对。选择长-PCR引物还应使多重长-PCR有最高的特异性，最适的退火温度和最低限度的自身互补作用，例如通过使用引物设计软件而选择。考虑到引物充足的定位空间，设计多重长-PCR相对容易。
用于多重短-PCR的引物的选择  以下述标准为基础选择短-PCR的引物对。
a.所需的靶序列应被100至600bp的扩增子覆盖
b.扩增子应具有最理想的解链行为，即由一个最低解链区外加与引物之一结合的GC-夹组成
c.在2-D凝胶中扩增子最理想的分布
d.类似的反应动力学
如果用于总基因组DNA，上述标准b经常与标准的引物设计标准相冲突。实际上，经证实本发明对于设计和完成作为检测RB基因中突变的快速、精确和实用的工具的TDGS而言是必需的，也是足够的。
以不同多重反应中引物的行为为基础，凭经验选择多重组，根据长-PCR制定RB的多重组，即以一个长-PCR片段为模板的所有短-PCR作为一个多重组一起扩增。实际上将两个长-PCR组联合作为一个多重组，所有短-PCR片段也可一起扩增。如上文所解释，表2列出了长和短PCR所用的引物对，片段大小，退火温度，解链温度和5个不同的多重组。
B.PCR反应和异源双链化
可从多种来源得到引物(去保护并去盐的)。我们的引物得自Gibco BRL。为了长期贮存，例如应在-20℃下将引物以在超纯水中的100μM贮存溶液保存，短期使用的话，在-20℃下将引物作为超纯化水中的12.5μM溶液保存。
在带有加热盖的Gene E热循环仪(Techne，Cambridge，UK)的热孔(thermowell)试管(Costar，Cambridge，MA.)中进行PCR反应，不必在样品上覆盖油。使用LA PCR试剂盒(TaKaRa)，在100μl体积中以5-500ng基因组DNA作为模板，每种引物为0.2μM进行多重长PCR反应(6个片段)，根据厂商的说明进行PCR反应，条件如下所示。首先，94℃，1分钟一个循环，接着98℃，20秒/68℃，12分钟30个循环(每次循环渐增10秒)，最后72℃，12分钟一个循环。PCR产物贮存于-20℃下供进一步使用。
使用相同的Gene E热循环仪，于50μl体积中，以2μl长-PCR产物，0.2-0.5μM每种引物，0.25mM dNTP，2.5-4.5mMMgCl2，3单位Taq聚合酶(Gibco BRL或Promega)进行短PCR反应。PCR条件如下述。94℃，2分钟一个循环，然后94℃，40秒/41℃，40秒/69℃，2分钟(每次循环渐增2秒)30个循环，最后72℃，10分钟一个循环。
短PCR之后，通过一个完全的变性/复性循环使片段异源双链化。即98℃，100分钟/55℃，30分钟/41℃，30分钟。
PCR和异源双链化之后，混合试管中的内含物，加入1/10体积的加样缓冲液。根据溴化乙锭染色，通常有足够跑几次电泳的样品，当总体积对狭线而言太大时，需用乙醇沉淀样品(加入加样缓冲液之前)并重新溶解到小体积中。
C.双向电泳
手工操作的和自动化的2-D电泳仪器均来自前述的Ingeny B.V.(Leiden，荷兰)。对于手工操作的电泳而言，首先使用0.75mm厚的9％PAA凝胶在45℃电泳5-6小时以按大小分离DNA片段的混合物，通过溴化乙锭染色10分钟并用紫外线透照凝胶(凝胶置于玻璃板上以防止DNA片段被紫外光损坏)可用肉眼看到分离的模式。快速切下泳道中部(不包括边缘)100-600bp的区域，加到1mm厚的含0-60％(RB)或30-90％(p53)脲/甲酰胺(UF)梯度的9％PAA凝胶中。使用简单的梯度形成仪(Gibco BRL)倾倒梯度，在60℃，200V下电泳7.5-11小时。电泳后用0.5μg/ml溴化乙锭染凝胶15-20分钟并在水中脱色15分钟，使用宝丽来照相机在紫外光照射下记录电泳模式。
对于自动化的2-D电泳而言，根据厂商说明(Ingeny B.V.，Leiden，荷兰)用自动化2-D电泳仪所附带的凝胶浇铸装置一次倾倒10块凝胶。凝聚之后，从凝胶浇铸箱中取出凝胶(在玻璃板之间)并用湿吸水纸清洁，然后根据厂商说明置于仪器中，即置于两个用硅氧烷封住边缘的支持凝胶的盒中。含有加热后45℃的缓冲液的仪器被置于电源开关关闭的1-D模式下。加入加样缓冲液之后，将样品(至多40μl)上样于自动化2-D电泳仪中的凝胶的V-形孔中。使用带有0-60％脲/甲酰胺梯度的9％丙烯酰胺，0.25％TAE凝胶。第一向在45℃，180V下电泳4小时，第二向在60℃，200V下电泳7.5-11小时。电泳后用溴化乙锭将凝胶染色，与手工操作的仪器所描述的一样，在紫外光照射下记录电泳模式。
总之，尽管本发明描述的是后接双向电泳分离的两步(长和短)多重聚合酶链反应扩增，但它可与单向电泳或需要PCR-扩增之靶序列的检测突变的其他方法联合应用。
本领域技术人员会对本发明进行进一步修改，这种修改也被认为在本发明附加权利要求所限定的精神和范围之内。

Claims (7)

1、一种分析来自DNA的预定基因外显子的方法，包括，作为第一步的相对较长片段的多重聚合酶链反应，加入针对连续的基因外显子组的引物对，接着在一共用试管中完成聚合酶链反应扩增；作为第二步的短片段的多重聚合酶链反应，进一步加入针对每种基因外显子的引物对，在所述共用试管中完成聚合酶链反应扩增；电泳分离基因片段。
2、权利要求1所述的方法，其中所述电泳分离基因片段的步骤包括，第一步沿一个第一方向以大小为基础电泳分离基因片段，第二步将所述的基因片段沿与所述第一方向垂直的方向、并沿温度或化学变性梯度进行进一步的碱基对序列电泳分离，以沿与所述第一方向垂直的方向将基因片段分布在各特定的序列位置处；将这些位置与正常基因片段的位置相比较以检测基因突变。
3、权利要求2所述的方法，其中引物是用荧光染料标记的寡核苷酸引物。
4、权利要求2所述的方法，其中聚合酶链反应中所用的核苷酸构件是经荧光标记过的。
5、权利要求2所述的方法，其中第二步电泳分离在变性梯度凝胶中完成。
6、权利要求5所述的方法，其中第二步在凝胶中使用脲和甲酰胺梯度以分离片段。
7、权利要求5所述的方法，其中第二步在凝胶中使用温度梯度以分离片段。
CNB961946105A 1995-06-06 1996-06-03 用于诊断性dna检测的方法 Expired - Fee Related CN1151269C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US47124995A 1995-06-06 1995-06-06
US08/471,249 1995-06-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1198188A CN1198188A (zh) 1998-11-04
CN1151269C true CN1151269C (zh) 2004-05-26

Family

ID=23870865

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB961946105A Expired - Fee Related CN1151269C (zh) 1995-06-06 1996-06-03 用于诊断性dna检测的方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5814491A (zh)
EP (1) EP0873419B1 (zh)
JP (1) JP4484967B2 (zh)
CN (1) CN1151269C (zh)
CA (1) CA2223061C (zh)
DE (1) DE69617274T2 (zh)
ES (1) ES2168472T3 (zh)
WO (1) WO1996039535A1 (zh)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6673534B1 (en) 1995-10-26 2004-01-06 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods for detection of mutations in myostatin variants
US20030074680A1 (en) * 1993-03-19 2003-04-17 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
US7393682B1 (en) * 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
US6465239B1 (en) 1993-03-19 2002-10-15 The John Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptides from aquatic species and non-human transgenic aquatic species
US7332575B2 (en) * 1994-03-18 2008-02-19 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptide from aquatic species, and transgenic aquatic species
WO1998033887A1 (en) * 1997-02-05 1998-08-06 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
US6333179B1 (en) 1997-06-20 2001-12-25 Affymetrix, Inc. Methods and compositions for multiplex amplification of nucleic acids
AU1390999A (en) * 1997-11-10 1999-05-31 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Methods for detection of mutations in myostatin variants
US6277578B1 (en) 1998-03-13 2001-08-21 Promega Corporation Deploymerization method for nucleic acid detection of an amplified nucleic acid target
US6703211B1 (en) 1998-03-13 2004-03-09 Promega Corporation Cellular detection by providing high energy phosphate donor other than ADP to produce ATP
US6312902B1 (en) 1998-03-13 2001-11-06 Promega Corporation Nucleic acid detection
US6235480B1 (en) 1998-03-13 2001-05-22 Promega Corporation Detection of nucleic acid hybrids
US7090975B2 (en) * 1998-03-13 2006-08-15 Promega Corporation Pyrophosphorolysis and incorporation of nucleotide method for nucleic acid detection
US6268146B1 (en) 1998-03-13 2001-07-31 Promega Corporation Analytical methods and materials for nucleic acid detection
US6391551B1 (en) 1998-03-13 2002-05-21 Promega Corporation Detection of nucleic acid hybrids
US6270974B1 (en) 1998-03-13 2001-08-07 Promega Corporation Exogenous nucleic acid detection
US6270973B1 (en) 1998-03-13 2001-08-07 Promega Corporation Multiplex method for nucleic acid detection
CA2996759A1 (fr) * 1998-11-19 2000-06-02 Aventis Pharma S.A. Mutations du gene de la parkine, compositions, methodes et utilisations
DE69941300D1 (de) 1998-11-19 2009-10-01 Aventis Pharma Sa Fahren und verwendungen
EP1230393A1 (en) * 1999-11-12 2002-08-14 Charles L.M. Dunlop Approaches to identify genetic traits
US7741028B2 (en) * 1999-11-12 2010-06-22 Ambry Genetics Methods of identifying genetic markers in the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene
US6753141B2 (en) 2000-01-25 2004-06-22 The University Of Utah Simultaneous screening and identification of sequence alterations from amplified target
AUPQ687600A0 (en) * 2000-04-13 2000-05-11 Flinders Technologies Pty Ltd A method of detection
DK1296713T3 (da) 2000-06-08 2004-01-26 Intercell Biomedizinische Forschungs & Entwicklungs Gmbh Immunstimulerende oligodeoxynukleotider
CA2425904A1 (en) * 2000-10-23 2002-05-02 Cancer Research Technology Limited Materials and methods relating to nucleic acid amplification and profiling
GB0025913D0 (en) 2000-10-23 2000-12-06 Guldberg Per Materials and methods relating to nucleic acid amplification and profiling
AU2007221860B2 (en) * 2001-03-02 2012-03-15 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education PCR method
AU2002247248B2 (en) * 2001-03-02 2007-07-05 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education PCR method
FR2829154B1 (fr) * 2001-09-05 2003-10-17 Assist Publ Hopitaux De Paris Nouveau procede de detection d'une mutation en phase de lecture dans une sequence codante et appareil pour sa mise en oeuvre
WO2003031646A1 (en) * 2001-10-12 2003-04-17 The University Of Queensland Multiple genetic marker selection and amplification
US7824857B2 (en) * 2003-12-02 2010-11-02 Musc Foundation For Research Development Methods and compositions for diagnosing epithelial cell cancer
WO2005084254A2 (en) * 2004-02-27 2005-09-15 Musc Foundation For Research Development Enhanced detection of rna using a panel of truncated gene-specific primers for reverse transcription
EP2275578A3 (en) 2004-07-09 2011-11-30 University of Pittsburgh of the Commonwealth System of Higher Education Identification of markers in esophageal cancer, colon cancer, head and neck cancer and melanoma
WO2006034215A2 (en) * 2004-09-20 2006-03-30 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Multiple mode multiplex reaction quenching method
US8119352B2 (en) 2006-06-20 2012-02-21 Cepheld Multi-stage amplification reactions by control of sequence replication times
US20100086918A1 (en) * 2006-07-31 2010-04-08 The Regents Of The University Of California Methods for High Sensitivity Detection of Genetic Polymorphisms
US20130059762A1 (en) 2011-04-28 2013-03-07 Life Technologies Corporation Methods and compositions for multiplex pcr
US20130059738A1 (en) 2011-04-28 2013-03-07 Life Technologies Corporation Methods and compositions for multiplex pcr
EP2702170B1 (en) 2011-04-28 2015-12-16 Life Technologies Corporation Methods and compositions for multiplex pcr
CN106995851B (zh) * 2017-04-25 2020-07-03 郑州大学第一附属医院 扩增pkd1外显子超长片段的pcr引物、检测pkd1基因突变的试剂盒及应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
NL8801147A (nl) * 1988-05-02 1989-12-01 Tno Werkwijze voor het detecteren van genetische variatie, en daarvoor geschikte kit.
CA1339731C (en) * 1988-10-12 1998-03-17 Charles T. Caskey Multiplex genomic dna amplification for deletion detection
JPH0491790A (ja) * 1990-08-02 1992-03-25 Shionogi & Co Ltd ２段階ｐｃｒ法
NL9100132A (nl) * 1991-01-25 1992-08-17 Ingeny Bv Werkwijze voor het detecteren van dna sequentievariatie.
US5364759B2 (en) * 1991-01-31 1999-07-20 Baylor College Medicine Dna typing with short tandem repeat polymorphisms and identification of polymorphic short tandem repeats
NL9202000A (nl) * 1992-11-17 1994-06-16 Ingeny Bv Inrichting voor twee-dimensionale elektroforese en een elektroforese-eenheid daarvoor.
US5340728A (en) * 1992-12-09 1994-08-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for amplification of targeted segments of nucleic acid using nested polymerase chain reaction

Also Published As

Publication number Publication date
CN1198188A (zh) 1998-11-04
ES2168472T3 (es) 2002-06-16
JPH11506916A (ja) 1999-06-22
AU699613B2 (en) 1998-12-10
EP0873419B1 (en) 2001-11-21
CA2223061A1 (en) 1996-12-12
DE69617274D1 (de) 2002-01-03
CA2223061C (en) 2008-04-22
US5814491A (en) 1998-09-29
WO1996039535A1 (en) 1996-12-12
EP0873419A1 (en) 1998-10-28
JP4484967B2 (ja) 2010-06-16
DE69617274T2 (de) 2002-08-08
MX9709706A (es) 1998-10-31
AU5775596A (en) 1996-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1151269C (zh) 用于诊断性dna检测的方法
EP0364255B2 (en) Multiplex genomic DNA amplification for deletion detection
CN1332805A (zh) 短串联重复基因座的多重扩增
CN1816636A (zh) 功能性dna元件和细胞蛋白的基因组作图
CN1283235A (zh) 复杂dna甲基化指纹的制备方法
CN1185181A (zh) 扩增特异核酸序列的方法
JP2002533054A (ja) Ｂｒｃａ２の癌罹患性突然変異
Bono et al. Genetic screening of Fabry patients with EcoTILLING and HRM technology
CN1501982A (zh) 等位基因的测定方法
Vijg et al. Two‐dimensional gene scanning: Exploring human genetic variability
Dirks et al. Authentication of cancer cell lines by DNA fingerprinting
Girald-Rosa et al. High-throughput mitochondrial genome screening method for nonmelanoma skin cancer using multiplexed temperature gradient capillary electrophoresis
CN113234838A (zh) 高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型的引物对、产品和方法
CN1302121C (zh) 苯丙酮尿症诊断的dna芯片
Kousoulidou et al. Multiplex Amplifiable Probe Hybridization (MAPH) methodology as an alternative to comparative genomic hybridization (CGH)
Kousoulidou et al. Array-MAPH: a methodology for the detection of locus copy-number changes in complex genomes
Szantai et al. Multicapillary electrophoresis analysis of single-nucleotide sequence variations in the deoxycytidine kinase gene
AU699613C (en) Method of and apparatus for diagnostic DNA testing
Hakkarainen et al. TP53 mutation detection by SSCP and sequencing
Chen et al. Rapid and simple subtyping of the HLA-DRB3 gene in Graves' disease by using temperature-gradient gel electrophoresis
JP2007512231A5 (zh)
US20100035261A1 (en) Method of detecting large genomic rearrangements
WO2006089366A1 (en) Detection of dna sequence motifs in ruminants
Li et al. Two-dimensional gene scanning
Ward et al. Molecular Genetic Methods in Diagnosis and Treatment

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20040526