JPH11506916A - Ｄｎａ診断試験の方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ２工程多重ポリメラーゼ連鎖反応増幅及びそれに続く好ましくはサイズ及び塩基対配列の両者に基づく２次元電気泳動による断片の分離を含む遺伝子中の突然変異を検出するための試験法。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ診断試験の方法及び装置 本発明は突然変異による欠陥などの起こり得る遺伝子変異型の検出を目的とす る、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、次いで得られる断片の電気泳動によ る分離を用いるＤＮＡ診断試験に関する。より詳細には、好ましくは変性勾配ゲ ル中での二次元電気泳動による分離と組み合わせた新規かつ改良された多重ＰＣ Ｒ法に関する。 本発明は、特に、生まれながらの欠陥(birth defects)（例えば嚢胞性繊維症 ）や成人慢性病（例えば癌）に至る遺伝的素因等の遺伝性疾患を患う患者におけ るＤＮＡ突然変異の存在を調べるための試験に関する。より詳細には、本発明は 、新規な２工程ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅による遺伝子断片の迅速な 調製及びそれに続く効率的かつ正確な突然変異の検査に関する。 発明の背景 突然変異による欠陥を有する遺伝子（遺伝子変異型又は対立遺伝子）は、ＤＮ Ａ診断試験により同定することができる。遺伝子変異型は親から子へ移転するこ とができる。遺伝子変異型の一部は極めて強い効果を有しており、独力で疾病を 惹起することができる。その例としては、嚢胞性繊維症を惹起する嚢胞性繊維症 膜内外コンダクタンス調節（cystic fibrosis transmembrane conductance regu lator,ＣＦＴＲ）遺伝子の多数の突然変異型がある。他の遺伝子変異型には他の 遺伝子座由来の遺伝子変異型と組んで作用するものがある。その例としては、心 臓病や癌などの普通の（ポリジーン型の）疾病の多くが挙げられる。初期の段階 で、すなわち、胚由来の細胞中で遺伝子欠陥を試験する（出生前の試験）ことが 可能であるが、はるかに遅い段階、すなわち、若年、成人又は老人の個体由来の 細胞でも試験することができる。 ＤＮＡ診断試験により、しばしばそれが発症する前に疾病についての情報が得 られる。これは疾病の管理、例えば防止や処置を非常に容易にする。例えば、疾 病の経過、治療への応答などを予測するため癌や感染症起因体中の特定の遺伝子 変異型の存在を試験することが可能である。また、子孫に遺伝するのを見たくな い特定の遺伝子変異型を持つ個体を試験すること（キャリア試験）も可能である 。最後に、遺伝性の遺伝子にコードされた疾病の素因について如何なる時点（出 生前から老令まで）でも個体を試験することができる。このスペクトルの一端に ある一例は嚢胞性繊維症であり、そのための出生前試験やキャリア・スクリーニ ングが既に比較的普通になっている。このスペクトルの他の端は癌や神経変性疾 患のような後期発症疾病に関するものである。 ＤＮＡ診断試験は個々の遺伝子の配列の完全性の分析に関する。現在では、こ れは正確な試験が労働集約的な遺伝子の配列決定すなわちコードの解読を必要と するので費用がかかる。これまでは、費用−効果的な一般に利用できる標準化さ れたＤＮＡ診断システムは存在しなかった（総説としては、コットン(Cotton)， 1993，現在の突然変異検出法，Mutat．Res．285: 125-144）。費用−効果的であ り広く受け入れられるためにはＤＮＡ診断システムは正確で（９５％より高い） かつ高い処理量を有しそして労働集約的でないものでなければならない。 分析技術の一般的背景 はじめに、順序として、ＰＣＲ増幅に関する一般的技術及び電気泳動による断 片の分離に関する一般的技術そしてこの技術がこれまで適用されてきた分野及び 現在それを適用している分野について簡単に概説する。 血液由来などの細胞の試料を、まず化学的及び物理的に処理して細胞ゲノム中 の総ＤＮＡ量の約２％を占めるに過ぎない遺伝子を担うＤＮＡ鎖を抽出し、残り のＤＮＡは残留物に残す。各細胞は各遺伝子の２個のコピーを持ちそして遺伝子 は文字コードとしての文字Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴの配列によって同定される建築ブロ ックすなわち塩基対により同定され得るが、これらの遺伝子は長いＤＮＡ鎖の極 く小さな部分を構成するのでそれらを検査するためにはそれらの同一物の多数の コピーを作って増幅しなければならない。これは、ＤＮＡ鎖対を加熱−分離すな わち変性させ、適当なプライマーと混合して、後にもっと詳しく論ずるが、検討 すべき遺伝子断片（例えば、遺伝子エキソンすなわちコード領域）のはじめ及び 終わりに結合すなわちアニーリングさせ、そして十分量の建築ブロックを添加し て遺伝子エキソンのコピーを作らせることにより行われる。上記工程のこのサイ クルを連続して反復することにより、このエキソンの集積的複写が行われ純粋な そして増幅された量のエキソンが形成される。このプロセスは一般に上に述べた ポリメラーゼ連鎖反応すなわちＰＣＲ増幅と呼ばれる。もっと詳しい総説として は、例えば、ハインとシルバーマン（Hein and Silverman）著、分子病理学、カ ロリナ・アカデミック・プレス、1994、第2 章、臨床研究室における分子技法と その自動化、5-31頁(Winn-Deen)がある。 この段階で、次の順序として正常からの突然変異があるかどうかを調べるため 遺伝子エキソンを検査すなわち分析することになる。これは一般にＤＮＡの精製 された断片を電気泳動により、好ましくはサイズと塩基対配列の両方に基づいて 、分離することにより行われる。これは共同出願人であるビーグ（Vijg）とウイ ッターリンデン(Uitterlinden，A．G.)による、二次元ＤＮＡタイピング：ゲノ ム分析への平行的アプローチ、エリス・ホルウッド、1994、特に33-40 頁にもっ と詳細に記述されている 電気泳動はＤＮＡ断片の分離だけでなく、エレクトロホレーシス 1993，14，1 091-1198にも述べられているように、例えばタンパクの分析のような遺伝子以外 の物質の分離にも使用されてきた。装置はパーキン・エルマー社製のＡＢＩプリ ズム３７７ＤＮＡシークェンサーなどの蛍光色素標識を用いる一次元ＤＮＡ分離 用として提供され、また共同出願人であるビーグ（Vijg）とムラート（Mullaart ，E.）らによるオランダ国のインゲニーＢ．Ｖ．社の装置を記述する、Nature 3 65，30 September，1993、二次元ＤＮＡタイピングによるゲノム平行分析、469- 471 頁に述べられているように、二次元ＤＮＡタイピング用として提供されてい る。精製されたＤＮＡ断片を導入する適当なゲル媒体（後に論ずる）に最初の次 元（仮に水平とする）の電場を適用することにより、サイズによる断片の分離が 引き起こされ、大きな粒子はより小さな粒子よりもゆっくり動く。ゲル中に配置 された連続的に濃度を増す尿素／ホルムアミドのような化学的勾配をつけた、又 はその方向に設けられた温度勾配をつけた直交方向（縦）に電場をかけることに より、ＤＮＡ断片は、それが融解しその結果配列により定められる特定の縦の位 置でゲル媒体中に固定されるまで、移動（今度は縦に）する。ＤＮＡ断片の全体 が融解するのを防止するため、後者にはＡとＴよりも融解に対してもっと抵抗性 のあるＧとＣのみからなるヌクレオチドに（電気泳動処理の前に）結合させるこ とができる。このいわゆるＧＣ−クランプは各断片をこの断片のエキソン部分の 配列によって専ら決められる位置に効果的に固定する。この配列が、例えばＡＴ 対をＧＣ対で置換することにより一つの位置だけ変えられると、それはより遅く 又はより早く融解し、そのため正常な対照断片とは異なる縦の位置に固定される ようになる。 このような二次元遺伝子走査（ＴＤＧＳ）は費用−効果的で広く受け入れられ るＤＮＡ診断システムとなる見込みがある。このシステムでは、上述のように、 所与のＤＮＡ試料からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により得られる多数 のＤＮＡ断片がサイズと塩基対配列の両方に基づいて電気泳動により分離される 。このシステムは、第２の次元の分離が変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）に基 づいているので極めて正確（すなわち、９９％）である。実際、ＤＧＧＥはこの ように高い精度をもった唯一のシステムである（シェフィールド(Sheffield)ら ，1993，１塩基置換の検出のための１本鎖コンホーメーション・ポリモルフィズ ム分析の感度，Genomics 16，325-332、グロムペ(Grompe)，1993，核酸の未知の 突然変異の迅速な検出，Nature Genet．5，111-117、グルトベルク(Guldberg)ら ，1993，デンマークにおけるフェニルケトン尿症の分子的分析: 突然変異の99 ％が変性勾配ゲル電気泳動により検出された，Genomics 17，141-146）。ＴＤＧ Ｓのための自動装置は一部入手可能でありそして一部開発中である。ＴＤＧＳは １以上の遺伝子から得られるＤＮＡ断片中の起こり得る突然変異のすべてを、高 い処理量でそして最少の人手の介入で、同時に検出することを可能とする。 ＤＮＡ診断にＴＤＧＳを広く適用する場合の一つの主要な障害は同一反応チュ ーブ中で多くの断片を同時にＰＣＲにより増幅すること（多重ＰＣＲ）が困難な ことである。実際、関連する複数の遺伝子断片を増幅するＰＣＲプライマー部位 を見つけ出すことや、ＰＣＲと変性勾配ゲル電気泳動の両方の要求、すなわち、 最適のＰＣＲ反応と増幅された断片の最適の融解挙動、を同時に満たすことなど は、しばしば不可能でさえある。現在行われている手順は、ＰＣＲにより、標的 ＤＮＡの領域、通常遺伝子のタンパクコード領域（エキソン）を増幅することで 始める。この増幅反応は別々に行われる、例えば、１個の遺伝子中の２７個のエ キソンを分析するときは、２７回の別個のＰＣＲ反応を行わなければならない。 実務上は、１個のチューブ中で２〜３個のＰＣＲ反応を一緒に行うことは通常可 能である(例えば、エドワードとギブス(Edwards and Gibbs)，1994，多重ＰＣＲ ：利点、開発、及び応用，ＰＣＲ法及び応用 3，S65-S75)。 被験者の個体数が多くそして２個以上の遺伝子が同じＴＤＧＳ試験を同時に受 けるときは、ピペッティング工程や行われるべき個々の反応の総数が極めて高く なることは明らかである。これはこの試験の労働集約性を増加させ、そして試験 をより一層複雑なものとしその結果人為的過ちの機会を高めることにもなる。実 際、この複雑さからみて、すべてのピペッティング工程が自動的になされる完全 な実験室自動化でさえもこの問題を解決しないであろう。 同一チューブ中同一反応条件の下で多重の断片を同時にＰＣＲ増幅することが できないという問題はＴＤＧＳが臨床試験の基準、すなわち実験室使用者への親 切さに合致するための重要な技術的ハードルである。多重化、すなわち、幾つか のＰＣＲ増幅を多重のプライマーセットを用いて一つの反応で行うことにより、 ＰＣＲ反応の数を減らすことは重大な発展である。 多重化に対する現在の取組みは、ときには反応条件を別々に定めたプライマー の幾つかのセットを組み合わせるという至って単純なものである。しかしながら 、多重ＰＣＲは、多くの場合、増幅されるべき領域、その断片の相対的サイズ、 プライマーの動力学、そして多重の断片を収容するためのＰＣＲ実験条件の最適 化などについての慎重な考慮の基に発展させなければならない。 鍵となる問題はプライマーの位置決めである。遺伝子診断において、エキソン 配列、スプライス部位及び調節領域の増幅が一般に目的とされる。エキソンを増 幅するＰＣＲ反応のためのプライマーはエキソンに隣接するイントロン配列中に 置くのが理想的である。これは断片長又は増幅の質を調節するためのある種の余 白を提供し並びにスプライス部位に影響を与える突然変異についての情報を提供 する。これらはプライマーの選択における第１の制限である。 次いで、プライマーは標的配列以外の部位における非特異的増幅が起こらない ように位置決めすべきである。実際、ヒトゲノムは３×１０⁹塩基対長であり、 これは標的配列と非標的配列の間の偶然の配列相同性が生ずる十分な機会を与え る。この問題は多重化に典型的なものではなく、一度に１個の断片のみを増幅し たい場合にも起こり得る。これはプライマーの選択における第２の制限である。 多重化に際して、プライマーはその予想されるハイブリッド形成動力学が多重 反応における他のプライマーのそれと類似するように選択すべきである。これは プライマーの選択における第３の制限である。鋳型として総ゲノムＤＮＡを用い たときのプライマー選択に対するこれらの制限が、多重グループが通常小さい（ ５未満が代表的）ことの理由である。 ＴＤＧＳにおける最適分離については、プライマーの選択における第４の恐る ベき制限がある。ＴＤＧＳは平均して１００ｂｐ〜６００ｂｐのＤＮＡ断片を必 要とする。２個のプライマーのうちの一つは、ＰＣＲによって形成される断片中 の最高融解ドメインとしてのＧＣ−クランプを付与すべきＧＣの豊富な断片に結 合させるべきである。これは第２（変性勾配）の次元のゲル中で突然変異を検出 するための最高の感度を保証するために不可欠である（マイヤーズ(Myers)ら，1 985，ＧＣクランプに結合したＤＮＡ断片中の１塩基置換のほとんどすべてが変 性勾配ゲル電気泳動により検出され得る，Nucl．Acids Res．13，3131-3145、マ イヤーズ(Myers)ら，1987，変性勾配ゲル電気泳動による１塩基変化の検出及び 位置決定，Meth．Enzymol.，155，501-527）。次いで、プライマーは標的断片が １個の領域のみを含み、それに結合しているＧＣ−クランプよりも容易に（低い 尿素／ホルムアミド濃度又は低い温度で）融解するように位置決めすべきである 。結局、ＰＣＲ（多重化はいうまでもなく）と最適融解プロフィルの両方に最適 なＰＣＲ条件を実現することは不可能ではないにしても困難であることが明らか になった（例えば、ブランクェット(Blanquet)ら，1993，変性勾配ゲル電気泳動 及びポリメラーゼ連鎖反応直接配列決定によるＲＢＩ遺伝子における生殖系列突 然変異の同定，Hum．Molec．Genet．2，975-979によるＲＢ ＤＧＧＥ設計と本 発明の設計とを比較せよ。）。 本発明はいわゆる長鎖−ＰＣＲと短鎖−ＰＣＲの組み合わせを含む。最近、Ｐ ＣＲ増幅法はゲノムＤＮＡ由来の大きな断片（４０ｋｂまで）の増幅を可能とす るまで発展した。本発明者らはこの発展を利用し長鎖−ＰＣＲを用いて可能な最 少数の断片中で標的遺伝子（単数又は複数）のコード領域のすべてをまず増幅す る。これらの長い増幅体を鋳型として用い、次に多重方式中でＴＤＧＳにおいて 要求される小さな断片をＰＣＲ増幅する。このようにして標的配列がまず共存す るゲノムＤＮＡから増幅により分離される、そして小さなＰＣＲ断片は同一の条 件下でこの予め精製された鋳型から得ることができる。 上記の手順を用いると、ＰＣＲ増幅体の最適融解挙動にのみ基づいて選択され たプライマーセットはＰＣＲにおいても最適挙動を示しそして広範な多重化さえ も可能とした。この現象は一部には長鎖−ＰＣＲにより予め精製されたことに起 因するともいえる。実際、長鎖−ＰＣＲは他のゲノムＤＮＡ配列に比べ標的配列 の量を顕著に増加させ、それによって反応の複雑さを大きく減少させそして反応 の特異性を増大させている。 上に述べた現象は精製された鋳型の調製による複雑さの低減により説明するこ とができるけれども、正確な説明をすることはできない。事実、この効果の程度 の大きさは驚くべきものでありそしてＰＣＲ最適化に関与する諸因子の再評価が 必要となる。しかしながら一つのことだけは明らかである。本発明だけが効率的 なＴＤＧＳ試験を設計し実行することを可能とすることである。なぜなら、プラ イマーは今や融解プロフィルのみに基づいて選択することができそして多重化は 極めて容易になるからである。 本発明は一般的にも適用可能である。実際、それぞれのＰＣＲベースの診断反 応ではプライマーの選択が重要な問題でありそして多くの潜在的なプライミング 部位が悪い結果を与えることが明らかとなっている。多重化はこの場合さらに別 の問題を生じさせる。そしてこれが多重化が広く用いられない理由である。長鎖 −ＰＣＲ／短鎖−ＰＣＲ２工程増幅システムはこの問題に対する直接的かつ単純 な解決を提供する。 発明の目的 本発明の目的は、従って、上述の諸困難を回避するＤＮＡ診断試験のための新 規なそして改良された方法及び装置を提供することにある。 さらなる目的は、長鎖及び短鎖多重ＰＣＲを用いる２工程多重ポリメラーゼ連 鎖反応増幅とそれに続くサイズと塩基対配列の両者に基づく二次元電気泳動によ る断片の分離により遺伝子中の突然変異の新規な検出法を提供することである。 他の諸目的は以下に説明し請求の範囲との関連で指摘することにする。 図面の簡単な説明 本発明はこれから添付の図面と関係させて説明する。 図１は本発明を実施するためのプロセス工程の順序を例示する。 図２はＧＣ−クランプがある場合とない場合のＲＢエキソン１２に対する融解 曲線を示す（すなわち、網膜芽腫（retinal blastoma）遺伝子）。 図３は腫瘍サプレッサー遺伝子ＲＢの地図を示し、長鎖−ＰＣＲ反応及び短鎖 −ＰＣＲ反応のためのＰＣＲプライマーの位置を示す。 図４は示された条件での２−Ｄゲル電気泳動パターンにおける短鎖−ＰＣＲ断 片の予測された位置についてのコンピューター印刷を示す。 図５は理論的に予測されたパターンとの対応を示す実際のゲル分離パターンを 示す。 図６は、鋳型としてエキソン１８〜２３に対する長鎖−ＰＣＲ産物を用いたと きは短鎖−ＰＣＲ断片の６個すべてが得られ（レーン７〜１２）、一方鋳型とし て総ゲノムＤＮＡを用いた場合はほとんどの産物は失われている（レーン１〜６ ）ことを示す。図６は、長鎖−ＰＣＲ（レーン１３）にとっては出発物質は僅か ５ｎｇの総ゲノムＤＮＡで十分であることそしてすべての短鎖−ＰＣＲ産物が鋳 型として長鎖−ＰＣＲ産物を用いることにより得られる（レーン２０〜２４）こ とをも示す。 図７は野生型（同型接合の、正常の）断片及び幾つかの異型接合の突然変異体 の断片の詳細を示す。 発明の概要 要するに、重要な側面では、本発明はＤＮＡ由来の予め決定されている遺伝子 エキソン類を分析する方法を包含しており、該方法は遺伝子エキソン類の連続し たグループにプライマー対を添加し、次いで第一工程である比較的長鎖の多重ポ リメラーゼ連鎖反応として一本の共通のチューブ中でそれらのポリメラーゼ連鎖 反応増幅を行う工程、遺伝子エキソン類それぞれに対する別のプライマー対を添 加し、第二工程である短鎖多重ポリメラーゼ連鎖反応として該共通のチューブ中 でそれらのポリメラーゼ連鎖反応増幅を行う工程、及びこれらの遺伝子断片を電 気泳動により分離する工程を含む方法である。 好ましくかつベストモードの技術について以下に説明する。 好ましい態様についての説明 本発明は、前述したように、遺伝子（単数又は複数）中の考えられる突然変異 のすべてを同時に検出することを目的とし、最少の数の２工程多重ＰＣＲ反応を 得られる断片の自動化された二次元分離と組み合わせることによる正確かつ効率 的な突然変異検出試験の設計に関する。 表１はモデルとしてＲＢ（網膜芽腫）腫瘍サプレッサー遺伝子を選んだ場合の ＴＤＧＳ試験の設計における異なる工程を列挙している。第一に、遺伝子配列を データベース（例えば、ゲンバンク）から取り出し、そして標的領域、すなわち 、エキソン、スプライス部位、調節部位を決める。次いで、長鎖−ＰＣＲにより 増幅され得る、すなわち少なくとも２０ｋｂまで（ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ産物挿入物）の、考えられる最小数の断片としてすべての標的領域が得 られるようにプライマーの位置決めを行う。長鎖−ＰＣＲのためのプライマー配 列を選択する際の一般的ガイドラインが幾つか記載されている（フォードとロー ズ(Foord and Rose，1994，長距離ＰＣＲ、PCR Methods and Applications 3，S 149-S161)が、最適なプライマーを決定するには未だに経験的な方法が必要であ る。 表１．ＴＤＧＳ試験の設計 １．データベースから配列を取り出す。 ２．増幅体の数を可能な限り最少とすることにより、必要な領域（例えば、コー ド配列、スプライス部位、調節領域、突然変異多発域）のすべてをカバーするよ うに、長鎖−ＰＣＲのためのプライマーの位置決めをする。 ３．以下の基準に従って短鎖−ＰＣＲのためのプライマーの位置決めをする。 ａ．必要な標的配列が１００ｂｐと６００ｂｐの間の増幅体によりカバーさ れるべきであること。 ｂ．増幅体は最適の融解挙動をもつべきであること、すなわち、増幅体は一 つの最低融解ドメインとプライマーの一つに結合させたＧＣ−クランプから成る ものであるべきこと。 ｃ．２−Ｄゲルの全体にわたって増幅体の最適な分布が得られること。 ｄ．類似の反応動力学を示すこと。 ４．鋳型として長鎖−ＰＣＲ産物を用いて組まれたプライマーセットのそれぞれ に対しＰＣＲ条件を別々に組み立てること。 ５．プライマーセットを配合しそして反応成分を調節することにより多重共−増 幅条件を設定すること。 表１の３項−そこでは長鎖−ＰＣＲ断片を鋳型として使用するが−に示すよう に、短鎖−ＰＣＲのためのプライマーは１００ｂｐ〜６００ｂｐの断片が生ずる ように選ばれる。ここにおける主な選択基準はもちろんこれらの断片の融解挙動 である。理想的な状況では、各増幅体は唯１個の融解ドメインをもつべきであり 、それは増幅体に結合しているＧＣ−クランプよりも低い（より不安定な）もの であるべきである。３０〜４０ｂｐのＧＣ−クランプの結合は、それを一方のプ ライマーの一部とすることにより行われる（シェフィールド(Sheffield)ら，198 9，１塩基置換の検出のための１本鎖コンホーメーション多形性分析の感度，Gen omics 16，325-332）。最適融解挙動はコンピューター・プログラム(例えば、Ｍ ＥＬＴ８７；ラーマンとシルバーシュタイン（Lerman and Silverstein），1987 ，ＤＮＡ融解のコンピューターシミュレーション及び変性勾配ゲル電気泳動への その応用，Meth．Enzymol．155，482-501)を用い候補標的配列それぞれについて 決定される。ＲＢのエキソン１２との関連で、ＧＣ−クランプにより最適化され た融解挙動を持つ増幅体の１例を図２に示す。 一般に、２−Ｄゲル全体にサイズとＤＧＧＥ次元の両面で最適な分布を与える プライマー群の集合が選択される。２−Ｄゲルの高い分解能（５〜１０ｂｐのサ イズの差が容易に分離される）のおかげで、これは概して困難すぎることではな い。実際、５０断片又はそれ以下で、スポットの分布はほとんど問題がなく、そ れ故プライマー類はそれらの融解挙動に従って単純に選択することが可能である 。 図３はＲＢ遺伝子のために選ばれた増幅体の集合を、鋳型として使用した長鎖 −ＰＣＲ断片と共に示す。短鎖−ＰＣＲ断片を合わせれば、ＲＢコード領域の９ ０％を越える部分が表示されている。 図４及び図５は、図３に示した増幅体がカバーするＲＢ遺伝子の２４個のエキ ソンに対する理論的スポット分布及び経験的スポット分布を示す。相違はあるが 、殊にエキソン１１を表すスポットが最も顕著であるが、全体として融解プログ ラムはスポットの位置を正確に予測するというのがわれわれの結論である。 最初の長鎖−ＰＣＲ工程がなければ、最適融解基準は鋳型として総ゲノムＤＮ Ａを用いるＰＣＲに適用される別のプライマー設計基準と通常衝突してしまうこ とを認識するのが重要である。実際、ＲＢ遺伝子について、ＤＧＧＥでの最適分 離とＰＣＲでの最適プライマー決定の両者を満足する条件を選ぶことは困難であ ることが見出された。長鎖−ＰＣＲと表示される前−精製工程はＴＤＧＳにおけ るＰＣＲプライマーの最適セットの設計にとって不可欠の条件(conditio sine q ua non)であることは明らかである。 試験の構成ができ上がったとき、多重構成の中で２工程ＰＣＲ増幅を行う。本 発明の核心となるのは多重ＰＣＲ反応を設計し実施する可能性である。多重ＰＣ Ｒを成功させるために第１の長鎖−ＰＣＲ工程が必要であることは図６に示す結 果によって証明される。図６では、左側の６個のレーンが、種々の量の総ゲノム ＤＮＡを鋳型として用い、ＲＢ遺伝子のエキソン１８〜２３（６断片）の多重Ｐ ＣＲを行った後に得られたＰＣＲ産物を含む。実際に望まれる長さの産物が得ら れていないことが明らかである。後者（レーン１〜６）は、同一の多重ＰＣＲ反 応であるが今度は長鎖−ＰＣＲ産物を鋳型として用いて行われたときの産物が泳 動された場合のレーン７〜１２とは対照的である。長鎖−ＰＣＲは異なるサイク ルで行われた、そして多重ＰＣＲを成功させるのに十分な鋳型を作るためには５ 〜１０サイクルしか必要とされないことが明らかである。 レーン１３〜１９は長鎖−ＰＣＲ産物を鋳型として用い出発原料の量を変えて 、すなわち長鎖−ＰＣＲ反応において使用される総ゲノムＤＮＡの量を変えて得 られた多重短鎖−ＰＣＲ産物を含む。すべての産物を得るのに５ｎｇの総ゲノム ＤＮＡで十分であることは興味深い。臨床の試料は十分な量で入手できないこと がしばしばある（例えば、乳癌の針生検）から、これは重要な結果であり、ＤＮ Ａの極めて少量で試験を成功させることができることを示すものである。 最後に、図６のレーン２０〜２４は６個の長鎖−ＰＣＲセットに対応する５回 の多重ＰＣＲ（長鎖−ＰＣＲグループ１と６は一緒にした。図３及び後に論ずる 表２を見よ）の産物を含む。ＰＣＲ条件及び／又はプライマー類をさらに調節す ると、この遺伝子のためのさらに少ない数の多重セットさえ得ることも可能とな るはずである。実際、ＲＢ遺伝子の全体をコードする領域を唯１回のＰＣＲ反応 で増幅できないという理由はないのである。第２のＰＣＲの後、断片をヘテロ２ 本鎖の形成を容易にさせるため変性／再生の完全な１ラウンドを受けさせること ができる。表２にはＲＢの場合のＴＤＧＳ用プライマー対のリストが示してある 。エキソンの番号は表の最も左側に、６個のエキソングループ（０から２４〜２ ７まで）のための長鎖ＰＣＲプライマーのコード及び個々の２７個のエキソンの ための短鎖ＰＣＲプライマー類と共に示してある。 ＰＣＲに続いて、断片の混合物を変性勾配ゲル中で２−Ｄ電気泳動にかける（ 図１）。自動化装置が入手できれば、このプロセスは大いに単純化される。ここ に用いる装置は、人手の介入なしに一時に１０枚のゲルを泳動させることができ る、すなわち、レーンを切り取りそしてこれらを第２のゲル上に載せる。実験条 件の最適化に関するすべての実験は手動の装置を用いて行われた。２−Ｄ電気泳 動の後、ゲルをガラス板の間から取り出し、エチジウムブロマイド又は他の染料 で染色する。 この結果得られたパターンは、記録され(documented)、そして、突然変異が起 こっているかどうかについて（肉眼分析及び画像分析により）評価された。適用 された条件、すなわち、ＧＣ−クランプ形成及びヘテロ２本鎖形成の下では、異 型接合型の突然変異は４個のスポット、すなわち２個のホモ２本鎖変異型と２個 のヘテロ２本鎖変異型を生ずる（図７に例示）。後者は必ずしも分離されていな い。突然変異は同型接合型の状態でも起こり得るから、ヘテロ２本鎖分子が存在 することを確認するためＰＣＲ前に各試料を対照の試料と混合することが必要と なり得る。 ＤＮＡ診断試験において遺伝子断片の正確かつ効率的な調製及び検査を行うた め、本発明の態様の構成方法及び使用方法の詳細を以下に提供する。この記述は 、例示的な遺伝子あるいはモデルとなる遺伝子、すなわち既に論じた腫瘍サプレ ッサー遺伝子ＲＢに焦点を置いているが、これは本発明を具体的に限定するもの と解すべきではない。この同じ手順は、当技術分野において熟練した者の視界内 で、他の遺伝子についても使用することができ、及び／又は同一チューブ内でも っと多くのＰＣＲ断片を一緒にするために使用することができ、これも本発明の 範囲内にはいるものと考えるべきである。 Ａ．ＲＢ２工程ＰＣＲ・ＴＤＧＳ試験の設計 配列の取り出し。 ＲＢ遺伝子の配列はデータベース、すなわち、ゲンバンク から取り出す。標的領域、すなわち、エキソン、スプライス部位、調節領域を決 める。 多重長鎖−ＰＣＲのためのプライマー選択。 長鎖−ＰＣＲのためのプライマ ー対の位置決めは、長鎖−ＰＣＲによりなお増幅され得る可能な最少の数の断片 により標的領域のすべてをカバーするようになされる。長鎖−ＰＣＲプライマー 類も、多重長鎖−ＰＣＲにおいて最高の特異性、最適のアニーリング温度そして 最小の自己−相補性をもつように、例えばプライマー設計ソフトウェアを用いて 、選択される。長鎖−ＰＣＲ多重性を設計することは、プライマーの位置決めの ためのスペースが広いので、比較的容易である。 多重短鎖−ＰＣＲのためのプライマーの選択。 短鎖−ＰＣＲのためのプライ マー対は下記の基準に基づいて選択される。 ａ．必要な標的配列は１００ｂｐと６００ｂｐの間の増幅体によりカバーされる ベきであること。 ｂ．増幅体は最適融解挙動をすべきこと、すなわち一つの最低融解ドメインとプ ライマーの一つに結合したＧＣ−クランプから成るべきこと。 ｃ．２−Ｄゲル全体にわたる増輻体の最適分布が得られること。 ｄ．類似の反応動力学を示すこと。 上の基準ｂは、総ゲノムＤＮＡに適用すると、標準的プライマー設計基準とし ばしば衝突する。実際、本発明は、ＲＢ遺伝子における突然変異の検出のための 迅速で正確でかつ実用的な道具としてＴＤＧＳの設計及び実施のために必要かつ 十分であることが証明された。 多重グループは様々な多重反応におけるプライマーの挙動に基づいて経験的に 選択される。ＲＢの場合は、多重グループは長鎖−ＰＣＲに従って作成された。 すなわち、鋳型としての１本の長鎖−ＰＣＲ断片を用い、すべての短鎖ＰＣＲが １個の多重グループとして一緒に増幅された。二つの長鎖−ＰＣＲグループが実 際に組み合わされて一つの多重グループとされた。短鎖−ＰＣＲ断片のすべてを 一緒に増幅することもできる。前に説明したように、表２は長鎖及び短鎖ＰＣＲ に使用されるプライマー対、断片サイズ、アニーリング温度、融解温度及び５種 の異なる多重グループをリストする。 Ｂ．ＰＣＲ反応及びヘテロ２本鎖形成 プライマー類（脱保護されそして脱塩されたもの）は様々な出所から得ること ができる。本発明者らのプライマー類はギブコＢＲＬ社から入手した。長期間の 貯蔵のためには、例えば、プライマーを超純水中１００μＭの貯蔵溶液の形で− ２０℃に保存すべきである。短期間の使用の場合は、本発明者らは超純水中１２ ．５μＭの溶液として−２０℃で保存した。 ＰＣＲ反応は、試料の上に油を重層する必要をなくすための加熱された蓋を具 備したジーンＥサーモサイクラー（テクネ社、ケンブリッジ、ＵＫ）中、サーモ ウエル・チューブ（コスター社、ケンブリッジ、ＵＫ）中で行った。多重長鎖Ｐ ＣＲ反応（６個の断片）は、鋳型として５〜５００ｎｇのゲノムＤＮＡ及び０． ２μＭの各プライマーを用い、ＬＡ・ＰＣＲキット（宝酒造社製）を使用して１ ００μｌの容量で実施した。ＰＣＲ反応は製造業者の指示に従って行う。条件は 次のとおりであった。まず、９４℃で１分の１サイクル、続いて９８℃で２０秒 及び６８℃で１２分（サイクル当たり１０秒ずつ増加させる）の３０サイクル、 そして最後に７２℃で１２分の１サイクル。このＰＣＲ産物はさらに使用するた めに−２０℃に保存する。 短鎖ＰＣＲ反応は、２μｌの長鎖−ＰＣＲ産物、０．２〜０．５μＭの各プラ イマー、０．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ、２．５〜４．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、３ユニ ットのＴａｑポリメラーゼ（ギブコＢＲＬ社製又はプロメガ社製）を含む５０μ ｌ容量中で、同じジーンＥサーモサイクラーを用いて行う。ＰＣＲの条件は次の とおりである。９４℃で２分の１サイクル、次いで９４℃で４０秒、４１℃で４ ０秒、６９℃で２分（サイクル当たり２秒ずつ増加させる）の３０サイクル、そ して最後に７２℃で１０分の１サイクル。 短鎖ＰＣＲの後に、断片を変性／再生の完全な１ラウンドによりヘテロ２本鎖 形成に導く。すなわち、９８℃で１０分、５５℃で３０分、４１℃で３０分であ る。 ＰＣＲ及びヘテロ２本鎖形成の後、チューブの内容物を混合しそして１／１０ 量の負荷用緩衝液を添加する。エチジウムブロマイド染色で計算すると、通常、 ５〜６回の実施に十分な試料が含まれる。総容量がスロットの容量に対して多す ぎるときは試料（負荷用緩衝液を添加する前に）をエタノール沈澱させもっと少 ない量に再溶解させねばならない。 Ｃ．二次元電気泳動 手動及び自動両方の２−Ｄ電気泳動装置が既に述べたようにインゲニー社（In geny B.V.）（ライデン、オランダ）から入手できる。手動の電気泳動において は、ＤＮＡ断片の混合物をまず０．７５ｍｍの厚さの９％ＰＡＡゲルを用い４５ ℃で５〜６時間泳動させてサイズにより分離した。分離のパターンは１０分間エ チジウムブロマイドで染色しそしてＵＶ光によるＤＮＡ断片の損傷を保護するた めにガラス板の上に置かれたゲルのＵＶ透過照明により可視化した。レーンの中 央部分（従って端を含まない）にある１００〜６００ｂｐの領域を素早く切り取 り、そして０〜６０％（ＲＢ）又は３０〜９０％（ｐ５３）の尿素／ホルムアミ ド（ＵＦ）勾配を含む１ｍｍ厚の９％ＰＡＡゲルに載せた。勾配はシンプル・グ ラディエント・フォーマー（ギブコＢＲＬ社製）を用いて作成した。電気泳動は ６０℃、２００Ｖで７．５〜１１時間行った。電気泳動の後、ゲルを０．５μｇ ／ｍｌのエチジウム・ブロマイドで１５〜２０分染色しそしてさらに水中で１５ 分間脱染色した。得られたパターンをポラロイドカメラを用いてＵＶ照射の下で 記録した。 自動化２−Ｄ電気泳動においては、自動化２−Ｄ電気泳動装置に附属して来る ゲル形成装置中で、製造業者の指示（インゲニー社、ライデン、オランダ）に従 い一時に１０枚作成された。重合の後、ゲル（ガラス板の間の）をゲル形成箱か ら取り出し湿ったティシューできれいにする。次いでこれを製造業者の指示に従 い装置中に、すなわち、シリコンのサイドシールを施した２個のゲル保持カセッ ト中に置く。４５℃に加温した緩衝液を含むこの装置を電源を切った１−Ｄモー ド中に置く。負荷用緩衝液を添加した後、試料（４０μｌまで）を自動化２−Ｄ 電気泳動装置中のゲルのＶ型穴の中に負荷する。９％アクリルアミド、０．２５ ％ＴＡＥのゲルを０〜６０％の尿素／ホルムアミド勾配と共に用いた。第１の次 元は４５℃、１８０Ｖで４時間行う。第２の次元は６０℃、２００Ｖで７．５〜 １１時間行った。電気泳動の後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色しそして手 動装置で述べたと同様にＵＶ照射の下でパターンを記録した。 要するに、本発明は２工程（長鎖及び短鎖）多重ポリメラーゼ連鎖反応増幅に 続く２−次元電気泳動分離との関連で記述されているが、本発明は１−次元電気 泳動やＰＣＲ−増幅された標的配列を必要とする他の突然変異検出法と共に用い ても有用である。 この技術分野で熟練した者にとってはさらなる改良も生ずるであろうが、この ような改良も附属する請求の範囲に規定したように本発明の範囲内に入ると考え るべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ダイツオング リー アメリカ合衆国、エムエイ 02218、ボス トン、クイーンズベリー ストリート 25 番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＤＮＡ由来の予め決定されている遺伝子エキソン類を分析する方法であっ て、遺伝子エキソンの連続するグループにプライマー対を添加し、続いて第１工 程である比較的長い多重ポリメラーゼ連鎖反応として１本の共通のチューブ内で それらのポリメラーゼ連鎖反応増幅を行う工程、この遺伝子エキソン類のそれぞ れに対するプライマー対をさらに添加しそして第２の工程である短鎖多重ポリメ ラーゼ連鎖反応としてその共通のチューブ内でそれらのポリメラーゼ連鎖反応増 幅を行う工程、及びその遺伝子断片を電気泳動的に分離する工程を含む方法。 ２． 該方法が遺伝子断片を１次元に沿ってサイズに基づき電気泳動的に分離す るものである、請求項１記載の方法。 ３． 該方法が、直交する次元に沿って配列特異的な位置に遺伝子断片を分布さ せるため、直交する次元に沿いそして温度勾配又は化学的変性勾配に沿って遺伝 子断片を塩基対配列に基づく更なる電気泳動的分離に付し、そしてこれらの位置 を正常な遺伝子断片の位置と比較して遺伝子の突然変異を検出するものである、 請求項２記載の方法。 ４． プライマーが蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド・プライマーであ る、請求項３記載の方法。 ５． ポリメラーゼ連鎖反応に用いるヌクレオチド建築ブロックが蛍光的に標識 されているものである、請求項３記載の方法。 ６． 電気泳動による分離が変性勾配ゲル中で行われるものである、請求項３記 載の方法。 ７． 該方法が、断片を分離するため、ゲルに尿素とホルムアミドの勾配を適用 するものである、請求項６記載の方法。 ８． 該方法が、断片を分離するため、ゲルに温度勾配を適用するものである、 請求項６記載の方法。 ９． 長鎖−ＰＣＲ遺伝子エキソングループが網膜芽腫遺伝子のエキソン１〜２ 、３〜６、７〜１１、１２〜１７、１８〜２３及び２４〜２７である、請求項３ 記載の方法。 １０． ＤＮＡ由来の予め決定されている遺伝子エキソン類を分析する方法であ って、遺伝子エキソンの連続するグループにプライマー対を添加し、続いて第１ 工程である比較的長い多重ポリメラーゼ連鎖反応として１本の共通のチューブ内 でそれらのポリメラーゼ連鎖反応増幅を行う工程、及びこの遺伝子エキソン類の それぞれに対するプライマー対をさらに添加しそして第２の工程である短鎖多重 ポリメラーゼ連鎖反応としてその共通のチューブ内でそれらのポリメラーゼ連鎖 反応増幅を行う工程を含む方法。