NL9202000A - Inrichting voor twee-dimensionale elektroforese en een elektroforese-eenheid daarvoor. - Google Patents

Description

INRICHTING VOOR TWEE-DIMENSION ALE ELEKTRQFQRESE EN EEN ELEKTRQFORE SE-EENHEID DAARVOOR

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een inrichting voor twee-dimensionale elektroforese, meer in het bijzonder op een inrichting voor twee-dimensionale elektroforese, waarbij de elektroforese-eenheid die een tussen twee platen opgenomen elektroforese-medium omvat verticaal is opgesteld in de elektroforese-inrichting.

De inrichting volgens de uitvinding is ontwikkeld voor met name twee-dimensionale elektroforese in geval van DNA-typering (US octrooischrift 5.068.167) maar kan ook worden toegepast voor twee-dimensionale elektroforese van eiwitten (O'Farrell, PH et al. Journal Biological Chemistry, 250. pag. 4007-4021 (1975)). In principe is de twee-dimensionale elektroforese-inrichting volgens de uitvinding geschikt voor het elektroforeren van allerhande geladen stoffen.

Op dit moment wordt bijvoorbeeld twee-dimensionale elektroforese toegepast bij genetische studies, waarin dikwijls grote aantallen monsters van individuen onder identieke condities moeten worden geëlektroforeerd. De bekende twee-dimensionale elektroforese van DNA, omvat het elektroforeren in de eerste dimensie in een gel, waarna de verschillende gelstroken worden uitgesneden en geplaatst op een gel voor de elektroforese in de tweede dimensie. Deze procedure is arbeidsintensief en vereist hoogwaardig personeel. Bovendien treden als gevolg van de diverse bewerkingen artefacten (bijvoorbeeld door strekken of breken van de gel) op, hetgeen aanleiding geeft tot een verlaging van de reproduceerbaarheid van de verkregen scheidingspatronen.

De onderhavige uitvinding beoogt een inrichting voor twee-dimensionale elektroforese te verschaffen, dat in hoofdzaak de voornoemde nadelen niet bezit, en waarmee bovendien grote aantallen elektroforeses van verschillende monsters tegelijkertijd kunnen worden uitgevoerd onder in hoofdzaak identieke condities, terwijl het hanteren of prepareren van het elektroforese-medium tussen de eerste en tweede dimensie elektroforese in hoofdzaak volledig wordt vermeden. Bovendien is afgezien van een in hoofdzaak horizontaal opstellen van de elektroforese-eenheid in de elektroforese-inrichting, aangezien een verticaal opgestelde elektroforese-eenheid handzamer is te bemonsteren. Desondanks is het volgens de uitvinding mogelijk de constructie van de inrichting zo eenvoudig mogelijk te laten.

Dit wordt overeenkomstig de uitvinding bereikt met een inrichting voor twee-dimensionale elektroforese van een elektroforese-eenheid die een tussen twee platen opgenomen elektroforese-medium omvat, doordat een eerste paar en een tweede paar van elektroden voorziene compartimenten voor elektroforesevloeistof, die aan weerszijden en onderling dwars op elkaar elektroforetisch contact maken met het elektroforese-medium van de elektroforese-eenheid, waarbij de compartimenten zodanig zijn opgesteld en ingericht, dat de elektroforese-eenheid in de inrichting een staande positie inneemt.

Doordat de elektroforese-eenheid in hoofdzaak verticaal is opgesteld kan na plaatsen van de elektroforese-eenheid in de inrichting en conditioneren daarvan monster aangebracht worden in het elektroforese-medium via een bovenste zijkant, waarna door het starten van de elektroforese via de paren elektrolyten achtereenvolgens in de eerste dimensie en de tweede dimensie geëlektroforeerd kan worden.

Een bijzonder eenvoudige constructie van de inrichting volgens de uitvinding wordt verkregen, indien bij voorkeur een elektroforese-vat is onderverdeeld door twee scheidingswanden in twee buitenste, één van de beide paren vormende compartimenten, en een middencompartiment dat met een in de inrichting te plaatsen elektroforese-vloeistofbak het andere paar compartimenten vormt. In dit geval strekt de elektroforese-eenheid zich uit in het middencompartiment dat voor een deel of voor een overgroot deel kan zijn gevuld met elektroforese-vloeistof. Desondanks kan een scheiding worden gerealiseerd met een daarboven te plaatsen elektroforese-vloeistofbak. Opgemerkt wordt evenwel, dat van een vloeistofbak kan worden afgezien en in plaats daarvan het middencompartiment kan zijn voorzien van een bovenste scheidingswand waar doorheen de elektroforese-eenheid passeert.

Voor een optimaal aanbrengen van de elektroforese-eenheid in de inrichting volgens de uitvinding heeft het verder voorkeur dat in de scheidingswanden sleuven zijn aangebracht, waardoorheen de elektroforese-eenheid contact maakt met de buitencompartimenten, en verder bij voorkeur dat in de elektroforese-vloeistofbak sleuven zijn aangebracht waardoorheen de elektroforese-eenheid contact maakt met de in de elektroforese-vloeistofbak aanwezige elektroforese-vloeistof.

Teneinde artefacten door elektroforese te vermijden, heeft het voorkeur dat de elektroforese-stroom tussen de twee elektroden in hoofdzaak alleen passeert door het elektroforese-medium en in hoofdzaak een goede afdichting tussen de compartimenten tijdens de elektroforese aanwezig moeten zijn. De vloeistofafdichting kan worden gerealiseerd door op de platen en/of sleuven aangebrachte vloeistofafstotende stoffen, maar bij voorkeur dat sleuven zijn voorzien van middelen voor het vormen van een vloeistof afdichting tussen de sleuven en de tot in de sleuven reikende elektroforese-eenheid. Indien meer dan één elektroforese-eenheid kan worden opgenomen in de inrichting volgens de uitvinding, heeft het verder voorkeur dat de afdichtmiddelen de sleuven tevens afdichten indien in een sleuf geen elektroforese-eenheid is opgenomen.

Doordat de elektroforese voor de eerste dimensie in het algemeen wordt uitgevoerd in horizontale richting, is het mogelijk dat onder invloed van de zwaartekracht en/of de vorm en wijze van aanbrengen van het te elektroforeren monster artefacten of vervormingen optreden. Deze afwijkingen kunnen worden vermeden door het patroon van de elektrische veldlijnen in het elektroforese-medium te beïnvloeden. Bijvoorbeeld doordat in de elektroforese-richting de elektrische veldlijnen convergeren tegen de richting van de zwaartekracht in. Derhalve heeft het voorkeur dat de elektroforese-eenheid met zijn staande zijkanten contact maakt met het eerste paar compartimenten en met zijn liggende zijkanten met het tweede paar compartimenten, en tenminste één van de staande zijkanten is voorzien van een elektrisch isolerend element, dat over een deel van de zijkantlengte het elektroforetisch contact onderbreekt.

Afhankelijk van de vorm en grootte van de monsterholte en de breedte waarover de eerste dimensionale elektroforese in horizontale richting wordt uitgevoerd, kan het voordelig zijn indien verder bij voorkeur de beide staande zijkanten zijn voorzien an een elektrisch isolerend element. In dit geval worden optimale scheidingspatronen in het algemeen gerealiseerd indien verder bij voorkeur de beide elektrisch isolerende elementen van ongelijke lengte zijn. In het algemeen worden de meest optimale scheidingen gerealiseerd indien verder bij voorkeur aan de bovenste liggende zijkant het elektroforese-medium is voorzien van een monsterholte en het of het langste elektrisch isolerend element is gelegen aan de staande zijkant die op de grootste afstand is gelegen van de monsterholte.

Dit elektrisch isolerende element heeft bij voorkeur een zodanige lengte dat zijn boveneinde zich uitstrekt tot enige afstand onder de onderzijde van de monsterholte (bijvoorbeeld 10-100% van de monsterholtelengte). Het aan de andere zijde gelegen elektrisch isolerende element heeft eenzelfde of kleinere lengte, bijvoorbeeld 100-10%, in het algemeen 100-50% van de lengte van het aan de andere zijde gelegen elektrisch isolerend element.

Teneinde een uitzakken van het in het elektroforese-medium aangebrachte monster en daarmee gepaard gaande artefacten zoveel mogelijk te vermijden, heeft het verder voorkeur dat een in het elektroforese-medium aangebrachte monsterholte een in de richting in het elektroforese-medium vernauwende vorm bezit. Met name heeft de monsterholte een zodanig vernauwde vorm, dat een achterste vormholtewand in hoofdzaak loodrecht staat op het aan te leggen elektrische veld.

Een ander aspect van de onderhavige uitvinding heeft betrekking op een elektroforese-eenheid die kan worden gebruikt in de elektroforese-inrichting volgens de uitvinding. Met name is deze elektroforese-eenheid gekenmerkt door de aanwezigheid, vorm en lengte van één of meer elektrisch isolerende elementen die zich langs of tussen de platen kan uitstrekken.

Genoemde en andere kenmerken van de elektroforese-inrichting en de elektroforese-eenheid volgens de uitvinding, zullen hierna verder verduidelijkt worden aan de hand van een aantal bij wijze van voorbeeld gegeven, niet limitatieve uitvoeringsvoorbeelden, waarbij wordt verwezen naar de bijgevoegde tekening.

In de tekening is figuur 1, 3-5 elk een variant van een elektroforese-inrichting volgens de uitvinding; figuur 2 op grotere schaal detail II uit figuur 1; figuur 6-9 elk een vooraanzicht van een andere elektroforese-eenheid volgens de uitvinding; en figuur 10-12 elektroforese-patronen verkregen met de inrichting volgens de uitvinding.

Figuur 1 toont een inrichting 1 volgens de uitvinding voor twee-dimensionale elektroforese van in dit geval zes elektroforese-eenheden die omvatten tussen twee platen, bijvoorbeeld glasplaten 7 en 8 opgenomen elektroforese-medium 9.

De inrichting 1 omvat een eerste paar compartimenten 10 en 11 en een tweede paar compartimenten 12 en 13. Elk compartiment 10-13 is voorzien van een in dit geval niet-getoonde elektrode en is gevuld met elektroforese-vloeistof die afhankelijk van het uit te voeren type elektroforese in beide dimensies eenzelfde of onderling verschillende samenstelling kan hebben.

De inrichting 1 is opgebouwd uit een elektroforese-vat 15 dat door twee scheidingswanden 16 en 17 is onderverdeeld in de buitenste compartimenten 10 en 11 van het eerste paar en een middencompartiment 12 van het tweede paar. Het andere compartiment 13 van het tweede paar wordt gevormd door een elektroforese-vloeistofbak 18 die in het elektroforese-vat 15 is geplaatst boven het compartiment 12.

Zoals getoond in figuur 2 zijn de scheidingswanden 16 en 17 voorzien van sleuven 19 waar doorheen de elektroforese- eenheid 6 uitsteekt tot in de buitenste compartimenten 10 en 11 en daarin contact maakt met de aanwezige elektroforese-vloeistof 14.

Ook de elektroforese-bak 18 is voorzien van sleuven 20, waar doorheen de elektroforese-eenheid uitsteekt tot in het compartiment 13.

De sleuven 19 en 20 zijn voorzien van middelen waarmee een vloeistofafdichting wordt gerealiseerd tussen de sleuven 19 en 20 en de tot door de sleuven heen reikende elektroforese-eenheid 6. Deze afdichtende middelen bestaan bijvoorbeeld uit gehoekte, elastische rubber profielen 21 met een zodanige vorm, dat wanneer de elektroforese-eenheid 6 is verwijderd de sleuven zijn afgesloten door de samenwerkende rubber profielen. Doordat de elektroforese-bak rust op de scheidingswanden 16 en 17 is een adequate vloeistofafdichting gerealiseerd tussen enerzijds de elektroforese-bak 18 en anderzijds de andere compartimenten 10-12.

De compartimenten 10 en 11 zijn via een van een pomp 22 voorziene kringloop 23 onderling verbonden, zodat de samenstelling van de elektroforese-vloeistof 14 in beide compartimenten in hoofdzaak gelijk is. Bovendien worden zoveel mogelijk temperatuurverschillen vermeden.

De niet-getoonde elektroden zijn verbonden met een besturingseenheid, opdat semi-automatisch of automatisch de elektroforeses in beide dimensies kunnen worden uitgevoerd, nadat de elektroforese-eenheden 6 zijn geplaatst in de inrichting 1. Activering van de pomp 22 vindt plaats door dezelfde besturingseenheid.

Figuur 3 toont een elektroforese-inrichting 2 volgens de uitvinding die in hoofdzaak dezelfde constructie bezit als de inrichting 1 uit figuur 1. De compartimenten 10 en 11 en het middencompartiment 12 zijn onderling gescheiden door de scheidingswanden 16 en 17, en het compartiment 13 wordt wederom gevormd door een elektroforese-bak 18. Alle compartimenten zijn zoals getoond voorzien van een elektrode 24-27 die via een elektrische aansluiting 28 is verbonden met de niet-getoonde besturingseenheid. Zoals getoond omvat de kringloop 23 tevens een communicerende leiding 29.

De elektroforese-eenheid 30 die is opgenomen in een inrichting 2 omvat twee staande zijkanten die zich uitstrekken tot in de compartimenten 10 respectievelijk 11.

De onderste liggende zijkant 33 bevindt zich in het compartiment 12 en de bovenste liggende zijkant bevindt zich in het bakvormige compartiment 13.

De elektroforese-eenheid 30 omvat twee elektrisch isolerende elementen 35 en 36 die liggen tussen de beide glasplaten 7 en 8. Het elektrisch element 35 onderbreekt slechts over een gering deel van de zijkantlengte het elektroforetisch contact met het elektroforese-medium 9, maar het elektrisch isolerende element 36 onderbreekt het elektroforetisch contact over een aanzienlijk deel van de zijkantlengte tot enige afstand onder de monsterholte 37 die een in de richting van het elektroforetisch medium vernauwende vorm bezit.

De elektroforese-inrichting 3 volgens figuur 4 heeft in hoofdzaak dezelfde constructie als de inrichting 2 uit figuur 3. Echter in dit geval vormen de compartimenten 12 en 13 eveneens een kringloop 38 met een daarin opgenomen pomp 39. Vanuit het bakvormige compartiment 13 stroomt elektroforese-vloeistof 14 via een opening 40 naar het compartiment 12. In dit geval is in de inrichting 3 opgenomen een elektroforese-eenheid 41, die alleen aan zijn zijkant 31 is voorzien van een elektrisch isolerend element 35.

De pomp 39 is in dit geval eveneens aangesloten op de niet-getoonde besturingseenheid.

Figuur 5 toont een elektroforese-inrichting 4 volgens de uitvinding met in hoofdzaak dezelfde constructie als de inrichtingen 2 en 3. Deze inrichting is voorzien van slechts één kringloop 41 met een daarin opgenomen pomp 42, zodat de compartimenten 10-13 onderling met elkaar in contact staan. Door indien nodig afsluiters in de kringloop 41 op te nemen, kan in elke gewenste zin elektroforese-vloeistof worden gecirculeerd in en uit elk van de compartimenten 10-13.

Figuur 6 toont een elektroforese-eenheid 43 volgens de uitvinding, met een aan de bovenste zijkant in het elektroforese-medium gevormde monsterholte met een vernauwende vorm, terwijl een holtewand 44 in hoofdzaak dwars staat op het aan te leggen elektrische veld.

De elektroforese-eenheid 45 die is getoond in figuur 7, omvat een zeer nauwe monsterholte 37 aan de bovenste liggende zijkant 32. Bovendien is de staande zijkant 33 voorzien van een elektrisch isolerend element 46 dat zich over een aanzienlijk deel van de zijkantlengte uitstrekt tot op enige afstand van het onderste punt van de monsterholte 37.

Figuur 8 toont een elektroforese-eenheid 47 volgens de uitvinding, waarbij de staande zijkanten 31 en 33 elk zijn voorzien van een elektrisch isolerend element 48 en 49 van onderling gelijke lengte, die elk ook een aanzienlijk deel van de zijkantlengte zich uitstrekken tot enige afstand onder de monsterholte 44.

Figuur 9 toont een elektroforese-eenheid 50 met een zeer nauwe monsterholte, waarbij in dit geval de staande zijkanten 31 en 33 elk zijn voorzien van een elektrisch isolerend element 51 en 52 van onderling ongelijke lengte. De lengte van het elektrisch isolerend element 52 is groter dan die van het element 51, zodat een convergering van de elektrische veldlijnen vanaf de monsterholte 37 naar het elektroforetisch contact makende deel van de zijkant 33 optreedt.

Figuur 10 en 11 tonen het effect van het gebruik van elektrisch isolerende elementen volgens de uitvinding.

Figuur 10 toont het bovenste deel van de elektroforese-eenheid 30 en figuur 12 het bovenste deel van de elektroforese-eenheid 47, nadat in de monsterholten 37 respectievelijk 44 een mengsel was gebracht van Marker-DNA-fragmenten verkregen na een behandeling met restrictie-enzymen van Faag-Lambda-DNA.

Tenslotte toont figuur 12 de elektroforese-eenheid 30 nadat in twee dimensies elektroforese is uitgevoerd in de inrichting 2 volgens figuur 3.

Het zal duidelijk zijn dat voor de elektroforese-eenheid volgens de uitvinding elk type geschikt elektroforese-medium kan worden gebruikt. Bijvoorbeeld agarose en polyacrylamide, en verder koolvormige dragers, zoals silica en alumina. Bovendien kunnen verschillende typen elektroforese-media in één elektroforese-eenheid worden toegepast voor de twee opeenvolgende in verschillende dimensies uitgevoerde elektroforeses.Tenslotte is het mogelijk om na bijvoorbeeld elektroforeren in één dimensie op het verkregen patroon een biochemische reactie uit te voeren en eerst daarna elektroforese in de volgende richting te laten plaatsvinden.

Claims (11)

1. Inrichting voor twee-dimensionale elektroforese van tenminste één elektroforese-eenheid die een tussen twee platen opgenomen elektroforese-medium omvat, welke inrichting omvat een eerste paar en een tweede paar van elektroden voorziene compartimenten voor elektroforesevloeistof, die aan weerszijden en onderling dwars op elkaar elektroforetisch contact maken met het elektroforese-medium van de elektroforese-eenheid, waarbij de compartimenten zodanig zijn opgesteld en ingericht, dat de elektroforese-eenheid in de inrichting een staande positie inneemt.

2. Inrichting volgens conclusie 1, waarin een elektroforese-vat is onderverdeeld door twee scheidingswanden in twee buitenste, één van de beide paren vormende compartimenten, en een middencompartiment dat met een in de inrichting te plaatsen elektroforese-vloeistofbak het andere paar compartimenten vormt.

3. Inrichting volgens conclusie 2, waarin in de scheidingswanden sleuven zijn aangebracht, waardoorheen de elektroforese-eenheid contact maakt met de buitencompartimenten.

4. Inrichting volgens conclusie 2 of 3, waarin in de elektroforese-vloeistofbak sleuven zijn aangebracht waardoorheen de elektroforese-eenheid contact maakt met de in de elektroforese-vloeistofbak aanwezige elektroforesevloeistof.

5. Inrichting volgens conclusie 3 of 4, waarin de sleuven zijn voorzien van middelen voor het vormen van een vloeistof afdichting tussen de sleuven en de tot in de sleuven reikende elektroforese-eenheid.

6. Inrichting volgens conclusie 1-5, waarin de elektroforese-eenheid met zijn staande zijkanten contact maakt met het eerste paar compartimenten en met zijn liggende zijkanten met het tweede paar compartimenten, en tenminste één van de staande zijkanten is voorzien van een elektrisch isolerend element, dat over een deel van de zijkantlengte het elektroforetisch contact onderbreekt.

7. Inrichting volgens conclusie 6, waarin de beide staande zijkanten zijn voorzien an een elektrisch isolerend element.

8. Inrichting volgens conclusie 7, waarin de beide elektrisch isolerende elementen van ongelijke lengte zijn.

9. Inrichting volgens conclusie 6-8, waarin aan de bovenste liggende zijkant het elektroforese-medium is voorzien van een monsterholte en het of het langste elektrisch isolerend element is gelegen aan de staande zijkant die op de grootste afstand is gelegen van de monsterholte.

10. Inrichting volgens conclusie 1-9, waarin een in het elektroforese-medium aangebrachte monsterholte een in de richting in het elektroforese-medium vernauwende vorm bezit.

11. Elektroforese-eenheid volgens conclusie 1-10, bestemd voor een inrichting volgens conclusie 1-10.