JP2002533054A

JP2002533054A - Ｂｒｃａ２の癌罹患性突然変異

Info

Publication number: JP2002533054A
Application number: JP2000523381A
Authority: JP
Inventors: ジェニファーエル．レスカレット; タミーローレンス; アントネットピー．アレン; シェリジェイ．オルソン; デニスビー．サーバー; マーガビー．ホワイト
Original assignee: ジーンロジックインコーポレイテッド
Priority date: 1997-12-02
Filing date: 1998-12-02
Publication date: 2002-10-08
Also published as: WO1999028506A3; WO1999028506A2; CA2311680A1; US6051379A; EP1036197A1

Abstract

(57)【要約】新しい突然変異が、BRCA2遺伝子中に見い出された。該突然変異は、BRCA2遺伝子の公開されたヌクレオチド配列のヌクレオチド番号2192、3772、5193、5374、6495または6909に局在する。BRCA2ポリヌクレオチド配列中の配列変異を同定するプロセスが開示されている。同定プロセスは、公知の配列変異のアレレ特異的配列に基づくアッセイを含む。該方法は、供試BRCA2遺伝子サンプル中の突然変異の効率的で正確な検出に使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、乳癌罹患性遺伝子BRCA2に関する。より詳細には、本発明は、乳癌
、卵巣癌および関連する癌への疾病素質と関連するBRCA2遺伝子の生殖系列突然
変異を検出する。これらの突然変異の存在を検出する方法および試薬が含まれる
。

【０００２】（発明の背景） BRCA2は、染色体13q12-q13に位置し、70kb超のゲノムDNAからなる。コーディ
ング配列は、3,418アミノ酸のタンパク質を産生する。殆どのエクソンは小さい
けれども、エクソン10および11は、全コーディング領域の約60%に相当する。BRC
A2は、乳癌および卵巣癌に関連する腫瘍サプレッサー遺伝子であると考えられて
いる。従って、変化した腫瘍サプレッサーまたは腫瘍サプレッサーの変化した濃
度を形成する突然変異は、特定の癌に対するより高い罹患性(susceptibility)の
表示であり得る。

【０００３】少なくとも１種のBRCA2遺伝子に関するヌクレオチド配列は、公知であり、GEN
BANK受付番号U43746中で報告されている。BRCA2遺伝子配列は、Breast Cancer I
nformation Core上で利用可能である。

【０００４】 BRCA2の生殖系列突然変異は、多発性症例、早期開始型女性乳癌を有する家族
の約35%の原因であると予想され、それらは、男性乳癌、卵巣癌、前立腺癌およ
び膵臓癌の増加したリスクとも関連する。

【０００５】１種以上の突然変異のBRCA2遺伝子の位置は、ハイリスク女性の早期検出によ
り、乳癌および卵巣癌に関連する高い発生率および死亡率を減少させるのに有望
なアプローチを提供する。これらの女性は、一度確認されると、より積極的な予
防プログラムに標的化され得る。スクリーニングは、核型分析(karyotyping)、
プローブ結合およびDNA配列決定を含む様々な方法によって行われる。１種また
は数種のみの公知の突然変異が疾患に関与する場合、家族構成員をテストするよ
うな突然変異を検出する方法は、それらが起こることが公知である遺伝子内の部
位に標的化される。

【０００６】多くの突然変異および通常の多形性が、BRCA2遺伝子中で既に報告されている
。ワールドワイドウェブサイトが、乳癌罹患性遺伝子中の変化の検出および特徴
付けを促進するのに構築された。BRCA2中のそのような突然変異は、HTTP://www.
nchgr.nih.gov/dir/lab transfer/bicにあるBreast Cancer Information Coreに
よりアクセス可能である。

【０００７】突然変異は、BRCA2遺伝子全体に起こるが、高いサンプル数(スループット)、
感度、精度およびコスト効果に対する必要性がある。BRCA2遺伝子の突然変異の
同定は、遺伝性の乳癌および卵巣癌に関して現在可能であるよりも広い診断的ス
クリーニングを可能にし、観察される突然変異スペクトルから推定される機能的
区域の同定を可能にするであろう。

【０００８】（発明の概要）本発明は、乳癌および卵巣癌の罹患性および発生と関連するBRCA2遺伝子配列
中の６種の突然変異の発見に基づく。具体的には、ヌクレオチド番号2192、3772
、5193、5374、6495および6909に位置する突然変異が、発見された。

【０００９】本発明の目的は、乳癌、卵巣癌および他の癌に対する疾病素質またはより高い
罹患性を決定するための方法を提供することである。

【００１０】本発明の他の目的は、BRAC2突然変異を含むDNAの領域を検出および増幅するた
めのプライマーを提供することである。

【００１１】本発明の他の目的は、BRCA2突然変異を含むDNAの領域を検出するためのプロー
ブを提供することである。

【００１２】本発明の更なる目的は、腫瘍を分類および特徴付け、および存在する突然変異
のタイプに依存して治療を決定する方法を提供することである。

【００１３】本発明の目的は、突然変異体BRCA2遺伝子および薬剤開発のために発現された
突然変異体タンパク質、遺伝子療法および他の使用を提供して、突然変異体BRCA
2遺伝子の又はそれから生じる効果を予防または改善することでもある。

【００１４】（好ましい実施態様の詳細な説明）本発明を定義するために、下記の呼称を使用して、公開されている文献中にあ
る不一致による突然変異を記載する。Beaudetら, Human Mutations, 2:245-248
(1993)、Antonarakisら, Human Mutations, 4:166 (1994)、Cotton, Human Muta tions , 8:197-202 (1996)、およびBeutlerら, Human Mutations, 8:203-206 (19
96)。突然変異の定義において、番号は、突然変異が最初に起きるBRCA2遺伝子配
列に対応するヌクレオチド番号を示す。BRCA2の多形性または遺伝子的変異であ
る他のBRCA2配列(ハプロタイプ)が使用され得、そこでは、対応するヌクレオチ
ド番号での対応する突然変異が存在する。正常なBRCA1遺伝子中の異なる配列変
異が、本発明者により既に発見され(米国特許第5,654,155号)、正常なBRCA2遺伝
子配列中の配列変異が予想される。Shattuck-Eidensら、Journal of the Americ an Medical Association , 278: p.1242 (1997)も注目のこと。一般にセンス鎖が
参照される。本出願の単純化された同定目的のために、上記で参照されたBRCA2
配列が参照されるが、しかしながら、本発明は正常なBRCA2配列の全てに等しく
適用される。

【００１５】挿入突然変異は、"ins"で示され、欠失突然変異は、"del"で示される。"ins"
または"del"の後の文字は、挿入または欠失されたヌクレオチドを指す。２個の
ヌクレオチド上の挿入および欠失は、挿入または欠失されたヌクレオチドの数に
よって示される。突然変異が、別のもので置換された１個のヌクレオチドをもた
らすとき、BRCA2遺伝子配列のヌクレオチドは、番号の左に置かれ、突然変異中
で見い出されたヌクレオチドは、番号の右に置かれる。

【００１６】第１の突然変異は、C2192Gと称される。この突然変異または遺伝子的変化は、
ヌクレオチド番号2192でＣからGに変化を生じ、コドン655でプロリンからアルギ
ニンに変化する。任意のアミノ酸変化は、生物学的活性に劇的な変化を有し得る
。或る人々は、プロリンがタンパク質中でアミノ酸鎖中の曲がりを形成し得るの
で、この曲がりの除去は、特に荷電したアミノ酸で置換されるとき、タンパク質
の３次元コンフィギュレーションを変化させ得、または得られたタンパク質の生
物学的活性に少なくとも負に影響し得ると考えている。

【００１７】第２の突然変異は、3772delTTと称される。この突然変異は、ヌクレオチド番
号3772のTTを欠失して、フレームシフト突然変異を生じ、コドン1182でインフレ
ーム停止コドンを形成する。切型の、最も非機能性の傾向があるタンパク質が、
この突然変異により産生されることが実証された。

【００１８】第３の突然変異は、C5193Gと称される。この突然変異は、ヌクレオチド番号51
93でCをGに置換し、コドン1655で形成される停止コドン(TAG)を生じる。切型の
、最も非機能性の傾向があるタンパク質が、この突然変異により産生されること
が実証された。

【００１９】第４の突然変異は、5374del4と称される。この突然変異は、ヌクレオチド番号
5374でTATGを欠失し、フレームシフト突然変異を生じ、コドン1723でインフレー
ム停止を形成する。切型の、最も非機能性の傾向があるタンパク質が、この突然
変異により産生されることが実証された。

【００２０】第５の突然変異は、6495delGCと称される。この突然変異は、ヌクレオチド番
号6495でGCを欠失し、フレームシフト突然変異を生じ、コドン2090でインフレー
ム停止コドンを形成する。切型の、最も非機能性の傾向があるタンパク質が、こ
の突然変異により産生されることが実証された。

【００２１】第６の突然変異は、6909insＧと称される。この突然変異は、ヌクレオチド番
号6909でGを挿入し、フレームシフト突然変異を生じ、コドン2232でインフレー
ム停止コドンを形成する。切型の、最も非機能性の傾向があるタンパク質が、こ
の突然変異により産生されることが実証された。

【００２２】切型タンパク質の存在は、突然変異遺伝子のオーバーラッピング部分を発現さ
せ、ゲル電気泳動による分子量測定により、実証された。

【００２３】本発明による有用なDNA分子は、C2192G、3772delTT、C5193G、5374del4、6495
delGCまたは6909insG突然変異の領域で、BRCA2配列に特異的にハイブリダイズす
るものである。代表的には、これらのDNA分子は、17〜20ヌクレオチドの長さ(大
きな挿入のためにより長い)であり、BRCA2遺伝子配列上のそれらのそれぞれのヌ
クレオチド位で突然変異領域に対応するヌクレオチド配列を有する。そのような
分子は、当業者に公知の任意の技術により、例えば、放射性標識、蛍光標識、酵
素標識、配列標識、ビオチン、他のリガンドなどで標識され得る。

【００２４】本発明の１つの局面によれば、DNA分子、またはオリゴヌクレオチドは、１種
以上の特異的突然変異を含む。一般に、それぞれのDNAプローブが、１つのみの
突然変異を含むことが好ましい。そのような分子は、標識され得、興味ある突然
変異を検出するためのアレレ特異的オリゴヌクレオチドプローブとして使用され
得る。

【００２５】血液のような生物学的サンプルを含むポリヌクレオチドは、BRCA2遺伝子が、
上記リストされた特異的突然変異の１つを含むかどうか決定するためにテストさ
れ得る。BRCA2遺伝子を増幅するために、エクソンの末端またはエクソンにフラ
ンキングするイントロンにハイブリダイズするプライマーを用いて、ポリメラー
ゼ連鎖反応(PCR)を使用し得る。エクソン11の位置では、エクソンはあまりにも
大きくて、オーバーラッピング領域を増幅する複数対のプライマーを用いるのが
好ましい。そのようなものが、下記の実施例で実際に使用された。

【００２６】増幅は、遺伝子をクローニングし、サンプル中のBRCA2遺伝子またはそのフラ
グメントをベクターに連結するなどのような、多くの他の技術によっても、行わ
れ得る。「ショットガン」クローニングが、特に好ましい。この適用のために、
ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、トランスポゾン、またはその一
部のような複製を誘発する任意のポリヌクレオチド含有システムであり得る。

【００２７】本発明の１つの実施態様では、一対の単離されたオリゴヌクレオチドプライマ
ーが提供される。 BRCA2-11F 5'TGG TAC TTT AAT TTT GTC ACT T3' 配列番号１ BRCA2-11R 5'TGC AGG CAT GAC AGA GAA T3' 配列番号２呼称BRCA2-11は、BRCA2遺伝子のエクソン11内または近傍の配列を指す。Fおよ
びRは、順方向および逆方向を指す。

【００２８】オリゴヌクレオチドプライマーは、配列決定する前に、標的オリゴヌクレオチ
ドの増幅を指令するのに有用である。これらのユニークなBRCA2エクソン11オリ
ゴヌクレオチドプライマーは、BRCA2遺伝子をスキャンして突然変異を見い出す
ために使用された。配列情報から、プローブがデザインされ、C2192G突然変異の
同定に基づき突然変異をアッセイするために産生された。

【００２９】本発明の他の実施態様では、一対の単離されたアレレ特異的オリゴヌクレオチ
ドプローブが提供される。 5'TGA AGA ACC AAC TTT GT3' 配列番号３ 5'TGA AGA ACG AAC TTT GT3' 配列番号４これらのアレレ特異的オリゴヌクレオチドは、乳癌または卵巣癌を有するリス
クのある被験体の診断に有用である。アレレ特異的オリゴヌクレオチドは、C219
2G突然変異を含む標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする。5'TGA AGA
ACC AAC TTT GT3'、配列番号３は、野生型配列と優先的にハイブリダイズし、コ
ントロール配列として有用である。5'TGA AGA ACG AAC TTT GT3'、配列番号４は
、突然変異体配列と優先的にハイブリダイズするようデザインされている。

【００３０】本発明の第２の実施態様では、一対の単離されたオリゴヌクレオチドプライマ
ーが提供される。 BRCA2-11F 5'CTC AGA TGT TAT TTT CCA AGC3' 配列番号５ BRCA2-11R 5'CTG TTA AAT AAC CAG AAG CAC3' 配列番号６オリゴヌクレオチドプライマーは、配列決定する前に、標的化ポリヌクレオチ
ドの増幅を指令するのに有用である。これらのユニークなBRCA2エクソン11オリ
ゴヌクレオチドプライマーは、BRCA2遺伝子をスキャンして突然変異を見い出す
ために使用された。配列情報から、プローブがデザインされ、3772delTT突然変
異の同定に基づき突然変異をアッセイするために産生された。

【００３１】本発明の他の実施態様では、一対の単離されたアレレ特異的オリゴヌクレオチ
ドが提供される。 5'GCA AGC AAT TTG AAG GT3' 配列番号７ 5'GCA AGC AAT GAA GGT AC3' 配列番号８これらのアレレ特異的オリゴヌクレオチドは、乳癌または卵巣癌を有するリス
クのある被験体の診断に有用である。アレレ特異的オリゴヌクレオチドは、3772
delTT突然変異を含む標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする。5'GCA A
GC AAT TTG AAG GT3'、配列番号７は、野生型配列と優先的にハイブリダイズし
、コントロール配列として有用である。5'GCA AGC AAT GAA GGT AC3'、配列番号
８は、突然変異体配列と優先的にハイブリダイズするようデザインされている。

【００３２】本発明の第３の実施態様では、一対の単離されたオリゴヌクレオチドプライマ
ーが提供される。 BRCA2-11F 5'GCA AAG ACC CTA AAG TAC AG3' 配列番号９ BRCA2-11R 5'CAT CAA ATA TTC CTT CTC TAA G3' 配列番号１０オリゴヌクレオチドプライマーは、配列決定する前に、標的ポリヌクレオチド
の増幅を指令するのに有用である。これらのユニークなBRCA2エクソン11オリゴ
ヌクレオチドプライマーは、BRCA2遺伝子をスキャンして突然変異を見い出すた
めに使用された。配列情報から、プローブがデザインされ、G5193G突然変異の同
定に基づき突然変異をアッセイするために産生された。

【００３３】本発明の他の実施態様では、一対の単離されたアレレ特異的オリゴヌクレオチ
ドが提供される。 5'ACT TGT TAC ACA AAT CA3' 配列番号１１ 5'ACT TGT TAG ACA AAT CA3' 配列番号１２これらのアレレ特異的オリゴヌクレオチドは、乳癌または卵巣癌を有するリス
クのある被験体の診断に有用である。アレレ特異的オリゴヌクレオチドは、C519
3G突然変異を含む標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする。5'ACT TGT
TAC ACA AAT CA3'、配列番号１１は、野生型配列と優先的にハイブリダイズし、
コントロール配列として有用である。5'ACT TGT TAG ACA AAT CA3'、配列番号１
２は、突然変異体配列と優先的にハイブリダイズするようデザインされている。

【００３４】本発明の第４の実施態様では、一対の単離されたオリゴヌクレオチドプライマ
ーが提供される。 BRCA2-11F 5'GAA AAT TCA GCC TTA GC3' 配列番号１３ BRCA2-11R 5'ATC AGA ATG GTA GGA AT3' 配列番号１４オリゴヌクレオチドプライマーは、配列決定する前に、標的ポリヌクレオチド
の増幅を指令するのに有用である。これらのユニークなBRCA2エクソン11オリゴ
ヌクレオチドプライマーは、BRCA2遺伝子をスキャンして突然変異を見い出すた
めに使用された。配列情報から、プローブがデザインされ、5374del4突然変異の
同定に基づき突然変異をアッセイするために産生された。

【００３５】本発明の他の実施態様では、一対の単離されたアレレ特異的オリゴヌクレオチ
ドが提供される。 5'ATT ATT TGT ATG AAA AT3' 配列番号１５ 5'ATT ATT TGA AAA TAA TT3' 配列番号１６これらのアレレ特異的オリゴヌクレオチドは、乳癌または卵巣癌を有するリス
クのある被験体の診断に有用である。アレレ特異的オリゴヌクレオチドは、5374
del4突然変異を含む標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする。5'ATT AT
T TGT ATG AAA AT3'、配列番号１５は、野生型配列と優先的にハイブリダイズし
、コントロール配列として有用である。5'ATT ATT TGA AAA TAA TT3'、配列番号
１６は、突然変異配列と優先的にハイブリダイズするようデザインされている。

【００３６】本発明の第５の実施態様では、一対の単離されたオリゴヌクレオチドプライマ
ーが提供される。 BRCA2-11F 5'TAC AGC AAG TGG AAA GC3' 配列番号１７ BRCA2-11R 5'AAG TTT CAG TTT TAC CAA T3' 配列番号１８オリゴヌクレオチドプライマーは、配列決定する前に、標的化ポリヌクレオチ
ドの増幅を指令するのに有用である。これらのユニークなBRCA2エクソン11オリ
ゴヌクレオチドプライマーは、BRCA2遺伝子をスキャンして突然変異を見い出す
ために使用された。配列情報から、プローブがデザインされ、6495delGC突然変
異の同定に基づき突然変異をアッセイするために産生された。

【００３７】本発明の他の実施態様では、一対の単離されたアレレ特異的オリゴヌクレオチ
ドが提供される。 5'GAA CTG AGC ATA GTC TT3' 配列番号１９ 5'GAA CTG AAT AGT CTT CA3' 配列番号２０これらのアレレ特異的オリゴヌクレオチドは、乳癌または卵巣癌を有するリス
クのある被験体の診断に有用である。アレレ特異的オリゴヌクレオチドは、6495
delGC突然変異を含む標的化ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする。5'GAA
CTG AGC ATA GTC TT3'、配列番号１９は、野生型配列と優先的にハイブリダイ
ズし、コントロール配列として有用である。5'GAA CTG AAT AGT CTT CA3'、配列
番号２０は、突然変異配列と優先的にハイブリダイズするようデザインされてい
る。

【００３８】本発明の第６の実施態様では、一対の単離されたオリゴヌクレオチドプライマ
ーが提供される。 BRCA2-11F 5'ACT TTT TCT GAT GTT CCT GTG3' 配列番号２１ BRCA2-11R 5'TAA AAA TAG TGA TTG GCA ACA3' 配列番号２２オリゴヌクレオチドプライマーは、配列決定する前に、標的化ポリヌクレオチ
ドの増幅を指令するのに有用である。これらのユニークなBRCA2エクソン11オリ
ゴヌクレオチドプライマーは、BRCA2遺伝子をスキャンして突然変異を見い出す
ために使用された。配列情報から、プローブがデザインされ、6909insG突然変異
の同定に基づき突然変異をアッセイするために産生された。

【００３９】本発明の他の実施態様では、一対の単離されたアレレ特異的オリゴヌクレオチ
ドが提供される。 5'CAG AAG CAG TAG AAA TT3' 配列番号２３ 5'CAG AAG CAG GTA GAA AT3' 配列番号２４これらのアレレ特異的オリゴヌクレオチドは、乳癌または卵巣癌を有するリス
クのある被験体の診断に有用である。アレレ特異的オリゴヌクレオチドは、6909
insG突然変異を含む標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする。5'CAG AA
G CAG TAG AAA TT3'、配列番号２３は、野生型配列と優先的にハイブリダイズし
、コントロール配列として有用である。5'CAG AAG CAG GTA GAA AT3'、配列番号
２４は、突然変異配列と優先的にハイブリダイズするようデザインされている。

【００４０】本発明のプライマーは、多形性座においてかなりの数の核酸上の重合開始をも
たらすのに充分な長さと適切な配列のオリゴヌクレオチドを包含する。

【００４１】本発明のために好ましい配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列
番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１
７、配列番号１８、配列番号２１、および配列番号２２である。伸張産物の合成
に相応しい環境的条件は、ヌクレオシド三リン酸、DNAポリメラーゼのような重
合のための薬剤の存在、および温度、イオン強度およびpHのような好適な条件を
含む。プライマーは、増幅における最大の効率のために、好ましくは一本鎖であ
るが、二本鎖であっても良い。二本鎖の場合、プライマーは、先ず、伸張産物を
調製するのに使用される前に、その鎖に分離するよう処理される。プライマーは
、重合のための誘発剤の存在下で、伸張産物の合成をプライムするために充分に
長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、緩衝液、およびヌク
レオチド組成を含む多くのファクターに依存する。オリゴヌクレオチドプライマ
ーは、代表的には12-20またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少ないヌ
クレオチドを含んでも良い。

【００４２】本発明のプライマーは、増幅されるべきゲノム遺伝子座の各鎖に「実質的に」
相補性であるようデザインされている。これは、プライマーが、薬剤に重合を行
わせる条件下で、それらのそれぞれの鎖とハイブリダイズするのに充分に相補性
でなければならないことを意味する。換言すれば、プライマーは、それとハイブ
リダイズする突然変異をフランキングする5'および3'配列との充分な相補性を有
し、ゲノム遺伝子座の増幅を可能にすべきである。

【００４３】本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、関連する反応ステップの数と比較
して多形性座の指数関数的量を産生する、酵素的連鎖反応である増幅プロセスに
おいて使用される。代表的には、一方のプライマーは、多形性座のマイナス(−)
鎖に相補性であり、他方は、プラス(＋)鎖に相補性である。変成した核酸にプラ
イマーをアニーリングし、その後、DNAポリメラーゼＩ(クレノウ)の長フラグメ
ントおよびヌクレオチドのような酵素を用いる伸張は、標的多形性座配列を含む
新しく合成された＋および−鎖を生じる。これらの新しく合成された配列も鋳型
であるので、変性、プライマーアニーリング、および伸張の繰返しサイクルは、
プライマーで明示される領域(即ち、標的多形性座配列)の指数関数的産生を生じ
る。連鎖反応の産物は、使用される特異的プライマーの末端に対応する末端を有
する、慎重な(discreet)核酸デュプレックスである。

【００４４】本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、慣用されているホスホトリエステ
ル法およびホスホジエステル法またはその自動化された態様のような任意の好適
な方法を用いて、調製され得る。１つのそのような自動化された実施態様では、
ジエチルホスホルアミダイトが、出発物質として使用され、Beaucageら、Tetrah edron Letters , 22:1859-1862, (1981)に記載されるように合成され得る。修飾
された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する１つの方法は、米国特許第
4,458,066号に記載されている。

【００４５】任意の核酸検体が、精製形態または非精製形態で、出発核酸(１種または複数
種)として利用され、但しそれは、多形性座を含む特異的核酸配列を含むか、又
は含むことが推測されるものである。従って、プロセスは、例えば、DNAまたは
メッセンジャーRNAを含むRNAを増幅し得、そこでは、DNAまたはRNAは一本鎖また
は二本鎖であり得る。RNAが鋳型として使用される場合には、鋳型をDNAに逆転写
するのに最適な酵素、および／または条件が利用されるであろう。さらに、それ
ぞれの１本の鎖を含むDNA-RNAハイブリッドが、利用され得る。核酸の混合物も
使用され得、または本明細書中の先の増幅反応で産生された核酸が、同じ又は異
なるプライマーを用いて、そのように利用され得る。増幅される特異的核酸配列
、即ち、多形性座は、より大きい分子の分画であり得、又は特異的配列が全核酸
を構成するように、最初は分離した分子として存在し得る。増幅される配列は、
最初に純粋形態で存在する必要はない；それは、全ヒトDNAに含まれるようなコ
ンプレックス混合物のマイナーな分画であり得る。

【００４６】本明細書中で利用されるDNAは、血液、組織材料などのような身体サンプルか
ら、Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harb
or, ニューヨーク, p 280-281, 1982)に記載されるような様々な技術によって、
抽出され得る。抽出されたサンプルが非純粋である場合、それは、増幅前に、サ
ンプルの細胞または動物細胞膜を開け、核酸の鎖を露出および／または分離する
のに有効な量の試薬で処理され得る。鎖を露出および分離するための、この溶解
および核酸変性工程は、増幅がさらにより容易に起こるのを可能にする。

【００４７】デオキシリボヌクレオチド三リン酸dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPは、別々に
又はプライマーと一緒のいずれかで、合成混合物に適切な量で加えられ、得られ
た溶液は、約１〜10分間、好ましくは１〜４分間、約90゜〜100℃に加熱される
。これは、任意の二本鎖を変性するのに充分である。この加熱期間の後、溶液を
、プライマーハイブリダイゼーションに好ましい速度で冷却させる。冷却された
混合物に、プライマー伸張反応を起こすための好適な薬剤(本明細書中では、「
重合のための薬剤」と称する)を加え、反応を、当分野で公知の条件下で起こさ
せる。重合のための薬剤も、それが熱安定性である場合、他の試薬とともに加え
られ得る。この合成(または増幅)反応は、室温から、それより上では重合のため
の薬剤がもはや機能しない温度で、起こり得る。従って、例えば、DNAポリメラ
ーゼが薬剤として使用される場合、温度は一般に、約40℃以下である。Taqポリ
メラーゼのような熱安定性DNAポリメラーゼは、より高い温度で機能し得る。

【００４８】重合のための薬剤は、プライマー伸張産物の合成を達成するように機能する、
酵素を含む、任意の化合物またはシステムであり得る。この目的に好適な酵素は
、例えば、E. coli DNAポリメラーゼＩ、E. coli DNAポリメラーゼのクレノウフ
ラグメント、ポリメラーゼ突然変異タンパク質、逆転写酵素、Taqポリメラーゼ
のような熱安定性酵素(即ち、変性を起こすのに充分に高い温度に供した後でプ
ライマー伸張を行なう酵素)を含む他の酵素、を含む。好適な酵素は、それぞれ
の多形性座核酸鎖に相補性であるプライマー伸張産物を形成するよう、ヌクレオ
チドの組合せを適切な様式で促進する。一般に、合成は、各プライマーの3'末端
で開始され、合成が終了するまで鋳型鎖に沿って5'方向に進み、異なる長さの分
子を産生する。

【００４９】新しく合成された鎖およびその相補性核酸鎖は、上記のハイブリダイズ条件下
で二本鎖分子を形成し、このハイブリッドは、プロセスの次のステップで使用さ
れる。次のステップで、新しく合成された二本鎖分子は、上記の任意の手順を用
いる変性条件に供され、一本鎖分子を提供する。

【００５０】変性、アニーリング、伸張産物合成のステップは、標的多形性座核酸配列を検
出に必要な程度まで増幅するのに必要な回数だけ繰返され得る。産生された特異
的核酸配列の量は、指数関数的に蓄積する。PCR. A Practical Approach, ILR P
ress, M.J. McPherson, P. Quirke, およびG.R. Taylor編, 1992。

【００５１】増幅産物は、放射性プローブを用いることなく、サザンブロットによってそれ
を分析することにより検出され得る。そのようなプロセスでは、例えば、非常に
少量のレベルの多形性座の核酸配列を含むDNAの小さいサンプルを増幅し、サザ
ンブロット技術を介して、または同様にドットブロット分析を用いて、分析する
。非放射性プローブまたは標識の使用は、高レベルの増幅されたシグナルによっ
て促進される。或いは、増幅された産物を検出するのに使用されるプローブは、
例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属
キレート化剤または酵素を用いて、直接的または間接的に、検出可能なように標
識され得る。当業者は、プローブに結合するための他の好適な標識について知り
、またはルーチンの実験を用いて、そのようなものを確認し得る。好ましい実施
態様では、増幅産物は、DNAに蛍光性を生じさせる臭化エチジウムを含むアガロ
ースゲル上で混合物を分離することにより測定可能である。

【００５２】本発明方法により増幅される配列は、さらに、溶液中で又は固体支持体に結合
した後のいずれかで特異的DNA配列の検出に通常適用される任意の方法、例えば
、PCR、オリゴマー制限(Saikiら、Bio/Technology, 3:1008-1012, 1985)、アレ
レ特異的オリゴヌクレオチド(ASO)プローブ分析(Connerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 80:278, 1983)、オリゴヌクレオチド連結アッセイ(OLAs)(Landgre
nら、Science, 241:1007, 1988)などによって、評価、クローン化、配列決定な
どがされ得る。DNA分析に関する分子的技術が、概説されている(Landgrenら、Sc ience , 242:229-237, 1988)。

【００５３】好ましくは、増幅の方法は、本明細書中に記載されているように及び当業者に
共通に使用されるように、PCRによる。増幅の代替的方法は、記載されており、
本発明のプライマーを用いPCRにより増幅されたBRCA2座が代替的手段によって同
様に増幅される限り、使用もされ得る。そのような代替的な増幅システムは、興
味あるRNAの短い配列およびT7プロモーターと共に開始する自立的配列複製を含
むがそれに限定されない。逆転写酵素は、RNAをcDNAにコピーし、RNAを分解し、
その後、逆転写酵素はDNAの第２鎖を重合する。他の核酸増幅技術は、核酸配列
に基づく増幅(NASBA)であり、それは、逆転写およびT7 RNAポリメラーゼを使用
し、２つのプライマーを組込んでそのサイクル化スキームを標的化させる。NASB
Aは、DNAまたはRNAのいずれかと共に開始し、いずれかと共に終了し得、60〜90
分以内に10⁸コピーに増幅する。或いは、核酸は、連結活性化転写(LAT)により増
幅され得る。LATは、部分的に一本鎖であり部分的に二本鎖である単一のプライ
マーを用いて、一本鎖鋳型から働く。増幅は、cDNAをプロモーターオリゴヌクレ
オチドに連結することによって開始され、数時間以内に、増幅は10⁸〜10⁹倍にな
る。QBレプリカーゼシステムは、MDV-1と呼ばれるRNA配列を、興味あるDNA配列
に相補性のRNAに結合することによって利用され得る。サンプルと混合すると、
ハイブリッドRNAは、検体のmRNA中にその相補体を見つけて結合し、レプリカー
ゼを活性化し、興味あるタッグ沿い(tag-along)配列をコピーする。別の核酸増
幅技術である、リガーゼ連鎖反応(LCR)は、サンプル中の隣接配列の存在下に、
リガーゼによって共有結合される興味ある配列の２つの別々に標識した半分を用
いて働き、新しい標的を形成する。修復連鎖反応(RCR)核酸増幅技術は、２つの
相補性で標的特異的オリゴヌクレオチドプローブ対、熱安定性ポリメラーゼおよ
びリガーゼ、およびDNAヌクレオチドを用いて、標的化された配列を幾何学的に
増幅する。２塩基ギャップは、オリゴヌクレオチドプローブ対を分離し、RCRは
ギャップを満たして結合し、正常なDNA修復を模倣する。鎖置換活性化(SDA)によ
る核酸増幅は、標的DNAに結合する5'末端上に短いオーバーハングを有する、Hin c IIの認識部位を含む短いプライマーを利用する。DNAポリメラーゼは、オーバ
ーハングと反対側のプライマーの部分を、硫黄含有アデニンアナローグで埋める
。Hinc IIを加えるが、非修飾DNA鎖を切るのみである。5'エキソヌクレアーゼ活
性を欠くDNAポリメラーゼは、ニックのサイト(cite)に入り、重合を開始し、初
期プライマー鎖を下流に置換し、より多くのプライマーとして機能する新しい一
つを構築する。SDAは、２時間37℃で、10⁷倍超の増幅を生じる。PCRおよびLCRと
異なり、SDAは、装置化された温度サイクル化を必要としない。本発明の方法に
有用な他の増幅システムは、QBレプリカーゼシステムである。PCRは、本発明に
おける増幅の好ましい方法であるけれども、これらの他の方法も、本発明方法に
記載されるように、BRCA2座を増幅するために使用され得る。

【００５４】本発明の他の実施態様では、乳癌または卵巣癌の疾病素質またはより高い罹患
性を有する(危険のある)被験体を診断する方法が提供され、該方法は、被験体か
らのサンプルの標的核酸を、標的核酸を増幅した後でジデオキシ配列決定により
配列決定することを包含する。そのような実施態様では、プライマーであろうと
プローブであろうと、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドのいずれも使
用する必要はない。BRCA2遺伝子、またはそのフラグメントは、直接クローン化
され、続いて配列決定(ジデオキシ法によるなど)されて、突然変異の存在または
不存在を決定し得る。そのような状況では、得られた配列を、天然に生じる(野
生型)BRCA2遺伝子、またはその部分と比較することのみ必要である。

【００５５】 Sangerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463 (1977)またはMaxamら、Pro c. Natl. Acad. Sci. USA , 74:560 (1977)のもののようなDNA配列決定の他の方
法または当業者に公知の他の方法が、使用され得る。

【００５６】本発明の他の実施態様では、乳癌または卵巣癌の疾病素質またはより高い罹患
性を有する(危険のある)被験体を診断する方法が提供され、該方法は、被験体か
らのサンプルの標的核酸を、本発明の突然変異の１種を検出する試薬と接触させ
ること、および突然変異を検出することを包含する。

【００５７】本発明の他の実施態様では、少なくとも幾つかの細胞中の遺伝子突然変異を、
オリゴマーを適用することによって修復する方法および試薬が提供され、該オリ
ゴマーは、三本鎖ハイブリダイゼーションによって個体のゲノムを修復するため
の野生型プローブの配列を含む。例えば、米国特許第5,650,316号および米国特
許第5,624,803号を参照。これは、明らかに正常な組織または活性な腫瘍のいず
れかにおける欠陥を矯正する遺伝子療法の一形態である。遺伝子修復は、切除さ
れた腫瘍細胞にも為され得、使用される好ましい療法、特に遺伝子療法に使用さ
れる試薬を決定するのに有用であり得る。正常なBRCA2遺伝子の完全なコピーを
提供することのような、他の形態の遺伝子療法も、使用され得る。

【００５８】本発明の他の実施態様では、腫瘍を特徴付ける方法が提供される。組織学的タ
イプ、形態学的段階、遺伝性と散在性の乳癌の間の相違は、区別されるように見
えない。１つの方法は、腫瘍または他の生物学的サンプルから単離された標的核
酸を配列決定して、突然変異が起きたか又は存在するかどうかを決定することを
包含する。Sanger, F.ら、J. Mol. Biol., 142:1617 (1980)。

【００５９】腫瘍を遺伝性乳癌遺伝子に由来するものとして特徴付けることは、両側性乳癌
の罹患率が散在性の症例よりも高いので、臨床的に重要であり得る。Weber, Sci entific American , JAN-FEB p.12-21 (1996)。腫瘍は、腫瘍それ自身から又はゲ
ノムDNAを含む非腫瘍部位から採取された組織に基づいて、分類され得る。

【００６０】本発明のさらに他の実施態様は、全配列、そのエクソンまたはそのフラグメン
トであり得る、単離された突然変異体BRCA2 DNA配列である。DNA配列は、リスト
：C2192G、3772delTT、C5193G、5374del4、6495delGCまたは6909insGからの少な
くとも１種の突然変異を含まなければならない。好ましくは、単離されたDNA配
列は、次のもの：配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列
番号２０、または配列番号２４の少なくとも１種に相補性である配列を含む。こ
の配列は、そのままで、または、クローニングおよび好適な治療を決定するため
の発現後に、腫瘍形成を防ぎ、子孫への突然変異体遺伝子の伝達を防ぎ、または
他の予防的診断および治療のプロトコールを決定するのに有用性を有する。単離
されたDNA配列はまた、タンパク質置換、タンパク質模倣、公知および未知の化
合物、免疫原またはワクチンの調製のためのBRCA2活性部位への抗イディオタイ
プ抗体のスクリーニング、および突然変異体BRCA2遺伝子と関連する病態に対抗
する適切な遺伝子療法を決定することによる、ドラッグデザインのために使用さ
れ得る。診断的目的のために、突然変異体BRCA2配列を比較目的で知ることは、
診断において重要なステップである。

【００６１】他の方法は、被験体からのサンプルの標的核酸を突然変異の存在を検出する試
薬と接触させること、および突然変異を検出することを包含する。多くのハイブ
リダイゼーション法が、当業者に周知である。それらの多くは、本発明を遂行す
るのに有用である。

【００６２】本発明方法に使用される材料は、診断キットの調製に理想的に好適である。そ
のようなキットは、バイアル、チューブなどのような１種以上の容器手段を密接
に閉じこめて受けるよう区画された担体手段を含み、それぞれの容器手段は、本
方法で使用される１種以上の別々のエレメントを含む。例えば、容器手段の１つ
は、BRCA2 DNAを増幅する手段を含み得、該手段は、被験体からの該標的DNAを増
幅するための必要な酵素およびオリゴヌクレオチドプライマーを含む。他の容器
は、突然変異の存在または不存在を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ
を含み得る。

【００６３】オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配
列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号
１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２の配列を有するプライマー、
またはそれと実質的に相補性もしくは実質的に相同性のプライマー配列を含む。
BRCA2座または突然変異部位の１つを含む領域をフランキングする他のプライマ
ーが、使用され得る。標的をフランキングする5'および3'ポリヌクレオチド配列
は、BRCA2座を増幅する他のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、当業者に公
知であり容易に確認され得る。

【００６４】配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号
１２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２
３、および配列番号２４の配列を実質的に有するプローブを含むオリゴヌクレオ
チドプローブ。１種以上のBRCA2突然変異部位およびそれに実質的に相補性また
は相同性である配列にハイブリダイズする他のオリゴヌクレオチドプローブが、
使用され得る。突然変異を検出する他のオリゴヌクレオチドプローブが、当業者
に公知または容易に確認され得る。

【００６５】以下の定義は、本発明を理解する目的で提供される。

【００６６】本明細書中で使用される用語「プライマー」は、２個以上のデオキシリボヌク
レオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは３個を超える、より好ましくは８
個を超える、最も好ましくは少なくとも２０個のBRCA2遺伝子のヌクレオチドを
含む配列を指し、該配列は、突然変異の１種もしくは突然変異部位に対応するBR
CA2の野生型配列をフランキングする配列に対応する。プライマーは、PCRによっ
てDNA合成を開始するのに使用され得る。本発明のプライマーは、言及された配
列およびサンプル標的の逆側DNA鎖にアニールするであろう相補性配列を含む。D
NAの両方の鎖は、相補性であり、互いのミラーイメージであるので、DNAの同じ
セグメントが増幅される。

【００６７】用語「実質的に相補性」または「実質的にその配列」は、ストリンジェントな
条件下で、提供される配列および／または(例えば、配列番号３および配列番号
４)と充分な相同性を有する配列にハイブリダイズする配列を指し、その結果、
本発明のアレレ特異的オリゴヌクレオチドは該配列にハイブリダイズする。「実
質的に」とは、それがオリゴヌクレオチド配列を指すと同じように、突然変異の
存在または不存在を区別する充分な特異性を有して、ハイブリダイズまたはアニ
ールする機能的能力も指す。これは、融解温度で測定可能であり、該融解温度は
、オリゴヌクレオチドが正常または突然変異体BRCA2遺伝子配列に結合している
かどうか容易に同定可能とするよう充分に異なる。

【００６８】本明細書中で使用される用語「単離された」は、他のポリ核酸、タンパク質、
脂質、炭水化物またはそれらが関連し得る他の物質を実質的に含まないことを指
す。そのような関連は、細胞物質中または合成媒体中のいずれかにある。

【００６９】「生物学的サンプル」は、生物学的ソースを起源とするポリヌクレオチド含有
サンプルを指す。サンプルは、様々な組織および細胞からの生きた、死んだ又は
考古学的ソースからのものでさえあり得る。それらの例には：体液[血液(白血球
)、尿(上皮細胞)、唾液、頸部および膣分泌物...]、皮膚、毛根／毛包、粘膜(例
えば、頬または舌の細胞掻取り物)、頸膣部細胞(PAP塗抹標本などからの)内部組
織(正常または腫瘍)、絨毛膜絨毛組織、羊膜細胞、胎盤細胞、胎児細胞、臍帯細
胞、精子または卵を含む。

【００７０】「コーディング配列」または「DNAコーディング配列」は、共にペプチド(タン
パク質)をコードする、または核酸それ自身が機能を有する、遺伝子のそれらの
部分を指す。

【００７１】「標的ポリヌクレオチド」は、興味ある核酸配列、例えば、BRCA2をコードす
るポリヌクレオチドを指す。

【００７２】「コンセンサス」は、ポピュレーション中で最も共通に起こることを意味する
。

【００７３】「癌」、「腫瘍」および他の類似の用語は、良性または悪性であろうと、およ
びそれが転移した、或いは「癌」もしくは「腫瘍」の位置を有するかどうかに関
わらず、任意の新生物を指す。

【００７４】「実質的に相補性」とは、リストされた配列にストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするプローブまたはプライマー配列、および／または供試ポリヌク
レオチド配列との充分な相同性を有する配列を指し、その結果、アレレ特異的オ
リゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、それらが相補性である供試ポリ
ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。

【００７５】本明細書中で使用される「配列変異」は、２つの異なるオリゴヌクレオチドま
たはポリヌクレオチド配列間での、ヌクレオチド配列の任意の相違を指す。

【００７６】本明細書中で使用される「多形性」とは、病態と必ずしも関連しない遺伝子中
の配列変異を指す。

【００７７】本明細書中で使用される「突然変異」は、非機能性タンパク質または実質的に
低下した又は変化した機能を有するタンパク質をコードする遺伝子をもたらす変
化した遺伝子配列を指す。一般に、欠失突然変異は、病態または病態の可能性と
関連する。

【００７８】本明細書中で使用される「予め決められた配列変異」は、参照ヌクレオチド配
列中の対応する配列とは異なるようにデザインされているヌクレオチド配列を指
す。予め決められた配列変異は、BRCA2遺伝子中の公知の突然変異であり得る。

【００７９】「BRCA2遺伝子」は、一群の化合物であり、公開された遺伝子配列を指し、そ
れらはGENBANKデータベースおよびBICデータベースに現れている。他の異なる配
列は、多形性および遺伝子変化、特にBRCA2遺伝子の他のハプロタイプを定義す
るものを含む。一般に、アミノ酸変化を生じない又は天然に生じる(野生型)、病
態と関連しない多形性も、BRCA2遺伝子と考えられる。次に、対応するヌクレオ
チドは、たとえそのヌクレオチド番号が異なるとしても、使用されるであろう。
本明細書中で議論されたBRCA2遺伝子はヒトBRCA2遺伝子であるけれども、他の動
物における該遺伝子に関する対応するアッセイおよび試薬も使用され得る。BRCA
2遺伝子は、コーディング配列、非コーディング配列(例えば、イントロン)およ
び遺伝子発現に影響する制御領域を含む。

【００８０】本明細書中で使用される「アレレ特異的検出アッセイ」は、供試ポリヌクレオ
チドまたはオリゴヌクレオチド中の予め決められた配列変異の存在または不存在
を、予め決められた配列のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとアニー
リングさせることにより検出するアッセイを指し、その結果、異なるDNA配列に
基づく技術またはDNA増幅方法は、正常および突然変異体を区別する。

【００８１】本明細書中で使用される「配列変異位置決めアッセイ」は、供試ポリヌクレオ
チドまたはオリゴヌクレオチド中の配列変異を検出し、正確な塩基変化または配
列変異の位置を必ずしも決定することなく、配列変異の位置を供試ポリヌクレオ
チドの下位領域(subregion)に局在化するアッセイを指す。

【００８２】本明細書中で使用される「領域」は、一般に、言及された特異的配列からの、
数ヌクレオチド上流から数ヌクレオチド下流までの区域を指す。「領域」は、サ
ンプルDNAのアンチセンス鎖上の相補性ヌクレオチドも含む。

【００８３】本明細書中で使用される「標的確認配列決定」は、１つの配列変異が配列変異
位置決めアッセイによって位置決めされた領域中でポリヌクレオチドを配列決定
することを指し、正確な塩基変化および／または配列変異の位置を決定する。

【００８４】「プローブ」は、BRCA2または突然変異体BRCA2配列にハイブリダイズする任意
のオリゴヌクレオチドを含む。プローブは、(直接的または間接的に)標識され得
またはそれはPCRプライマーのようなプライマーとして作用し得る。本発明のプ
ローブは、説明された配列およびサンプル標的DNAのアンチセンス鎖にアニール
するであろう相補性配列を含む。DNAの両鎖は相補性であり、互いにミラーイメ
ージであるので、突然変異の相補性バージョンは、等しくユニークであり、アッ
セイされる突然変異を表示する。

【００８５】アレレ特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、ときどき、ASO
またはASO法と称される。

【００８６】本発明は、その実施態様の幾つかにおいて、下記を含む：予め決められた配列変異の検出ステージＩ分析は、予め決められたヌクレオチド配列変異；好ましくは、供試
遺伝子中の公知の突然変異または公知突然変異のセット、の存在または不存在を
決定するのに使用され得る。本発明によれば、そのような予め決められた配列変
異は、アレレ特異的ハイブリダイゼーション、つまり、正常と突然変異体アレレ
との区別を可能にする配列依存に基づく技術によって検出される。アレレ特異的
アッセイは、マッチング(例えば、正常：正常または突然変異体：突然変異体)配
列と比較して、ミスマッチしたヌクレオチド配列(例えば、正常：突然変異体)の
互いにハイブリダイズする異なる能力に依存する。

【００８７】アレレ特異的ハイブリダイゼーションを用いた予め決められた配列変異の検出当分野で周知の様々な方法が、アレレ特異的ハイブリダイゼーションによる予
め決められた配列変異の検出のために使用され得る。好ましくは、供試遺伝子は
、アレレ特異的オリゴヌクレオチド(ASOs)でプローブされ、それぞれのASOは公
知の突然変異の配列を含む。ASO分析は、標的ポリヌクレオチドフラグメント中
の特定の配列変異を、特異的オリゴヌクレオチドプローブの標的ポリヌクレオチ
ドフラグメントにハイブリダイズする能力をテストすることによって検出する。
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、突然変異体配列(またはその相補体)を含む
。標的配列中の配列変異の存在は、正常配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ
が標的フラグメントにハイブリダイズしない条件下で、オリゴヌクレオチドプロ
ーブと標的フラグメントをハイブリダイゼーションすることによって示される。
配列変異(例えば、突然変異体)オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリヌクレオ
チドフラグメントとの間でのハイブリダイゼーションの欠如は、標的フラグメン
ト中での特異的配列変異(例えば、突然変異)の不存在を示す。好ましい実施態様
では、供試サンプルは、標準的なドットブロット・フォーマットでプローブされ
る。ASOに対応する配列を含む供試遺伝子内のそれぞれの領域は、例えば、膜上
での個々のドットのように、固体表面に個々に適用される。それぞれの個々の領
域は、例えば、当分野で周知の方法(例えば、Mullis, K.B., 1987, 米国特許第4
,683,202号に記載される実験的実施態様を参照)を用い、別々のPCR増幅産物とし
て産生され得る。そのようなドットブロット・フォーマットの使用は、下記の実
施例で詳細に説明され、ヒトBRCA2遺伝子のステージＩ分析を詳述しており、６
種の対応するASOを用いて６種の異なる公知の突然変異の存在または不存在を検
出する。

【００８８】 ASO分析を行なうためのドットブロット・フォーマットの代替物として使用さ
れ得る膜に基づくフォーマットは、逆ドットブロット(マルチプレックス増幅ア
ッセイ)、およびマルチプレックス・アレレ特異的診断アッセイ(MASDA)を含むが
、それらに限定されない。

【００８９】逆ドットブロット・フォーマットでは、公知配列を有するオリゴヌクレオチド
またはポリヌクレオチドプローブを固体表面上に固定し、続いて、標識された供
試ポリヌクレオチドサンプルとハイブリダイズさせる。この状況で、プライマー
は標識され得、或いはNTPsは増幅前に標識されて、標識された供試ポリヌクレオ
チドサンプルを調製し得る。或いは、供試ポリヌクレオチドサンプルは、単離お
よび／または合成後に、標識され得る。

【００９０】マルチプレックス・フォーマットでは、個々のサンプルは、正に単一の標的配
列の代わりに、供試遺伝子内に複数の標的配列を含む。例えば、それぞれが少な
くとも１種のASO標的配列を含む複数のPCR産物が、同じサンプルドット内で適用
される。複数のPCR産物は、Caskeyら、米国特許第5,582,989号の方法を用いて、
単一の増幅反応中で同時に産生され得る。従って、同じブロットが、その対応す
る配列が同じドット中に示される各ASOによってプローブされ得る。

【００９１】 MASDAフォーマットは、各ブロット(複数の標的配列を有するドットを含む)を
プローブする複数のASOを用いて、マルチプレックス・フォーマットの複雑さの
レベルを拡大する。この手順は、A.P. Shuberによる米国特許第5,589,330号、お
よびMichalowskyら、American Journal of Human Genetics, 59(4):A272, ポス
ター1573, 1996年10月に詳細に記載されており、そのいずれも、その全体として
、本明細書中に参考として援用される。先ず、複数のASOプローブと固定化サン
プルとのハイブリダイゼーションが検出される。この方法は、所与のドット中の
複数の標的配列中の突然変異の存在が充分に稀であるため、任意の陽性ハイブリ
ダイゼーションシグナルが、対応する突然変異体標的とハイブリダイズするプロ
ーブ混合物内の単一ASOから生じるという予測に依拠する。ハイブリダイズするA
SOは、続いて、それをハイブリダイゼーション部位から単離し、そのヌクレオチ
ド配列を決定することによって同定される。

【００９２】ドットブロット、逆ドットブロット、マルチプレックス、およびMASDAフォー
マットで使用され得る好適な材料は、当分野で周知であり、ナイロンおよびニト
ロセルロース膜を含むが、それらに限定されない。

【００９３】標的配列が、PCR増幅によって産生されるとき、出発物質は、染色体DNAであり
得、その場合、DNAは直接的に増幅される。或いは、出発物質は、mRNAであり得
、その場合、mRNAは先ずcDNAに逆転写され、続いて、RT-PCRの周知の技術(例え
ば、Gelfandらによる米国特許第5,561,058号を参照)に従って増幅される。

【００９４】上記の方法は、限定された数の配列変異の穏和なスクリーニングに好適である
。しかしながら、迅速で、コスト効果的で大規模なスクリーニングのための分子
診断中における必要性によって、ASOの基本的概念を統合するが、突然変異検出
およびサンプル数に関する処理能力をはるかに超える技術が発達した。上記のも
のに代わるこれらの方法は、大規模なチップアレー配列に基づく技術を含むが、
それに限定されない。大規模アレーの使用は、多くの配列変異の迅速な分析を可
能にする。チップアレーの適用および展開の相違の概説は、Southern, E.M., Tr ends In Genetics , 12:110-115 (1996年3月)およびChengら, Molecular Diagnos is , 1:183-200 (1996年9月)にカバーされている。チップアレーの製造を含む、
幾つかのアプローチが存在する。相違は、固定オリゴヌクレオチドを結合する固
体支持体のタイプ、変異を同定するための標識技術およびプローブに対する標的
オリゴヌクレオチドの配列に基づく技術における変化を含むが、それらに限定さ
れない。

【００９５】「DNAチップ」に対する大規模分析のための有望な方法は、Haciaら、Nature G enetics , 14:441-447, (1996)に詳細に記載されており、その全体として本明細
書中に参考として援用される。Haciaらに記載されるように、96,000超のオリゴ
ヌクレオチドの高密度アレーは、それぞれ20ヌクレオチド長で、光誘導化学合成
を用いて、単一のガラスまたはシリコンチップに固定化される。オリゴヌクレオ
チドプローブの数およびデザインに対して偶発的であるが、配列中の可能性とし
て全ての塩基が、変化に対して調べられる得る。チップに適用されるオリゴヌク
レオチドは、従って、ポピュレーション中で起こることがまだ知られていない配
列変異を含み得、或いは、それらは、ポピュレーション中で起こることが公知の
突然変異に限定され得る。

【００９６】チップ上でオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションする前に、
供試サンプルを、当業者に周知である手段によって単離し、増幅し、標識(例え
ば、蛍光マーカー)する。続いて、供試ポリヌクレオチドサンプルを、固定され
たオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。固定化プローブに対する、標的
ポリヌクレオチドの配列に基づく技術の強度を、定量し、参照配列と比較する。
得られた遺伝子情報は、分子診断で使用され得る。

【００９７】分子診断での「DNAチップ」の一般的であるが限定されない利用性は、公知の
突然変異についてスクリーニングである。しかしながら、これは、当分野で記載
された突然変異を見ることによってのみ、技術に対して限定を賦課し得る。本発
明は、アレレ特異的ハイブリダイゼーション分析が、既に利用可能なものよりも
、はるかに多数の突然変異で為されることを可能にする。従って、大規模ASO分
析の有効性および包括性は拡大され得、公知の突然変異のみでなく、包括的な様
式で、許容される原理によって予測されるように起こり得る全ての突然変異に関
する、厄介な末端から末端への配列分析の必要性を減らし、これらの厄介なテス
トに関連するコストと時間が減少される。

【００９８】実施例ゲノムDNA(少なくとも100ng)を、乳癌、卵巣癌または他の癌の家族歴を有する
被験体の血液細胞から単離する。ジデオキシ配列分析を、エクソン11のセグメン
トのポリメラーゼ連鎖反応増幅の後に行なう。

【００９９】 BRCA2遺伝子のエクソン11を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、非対称的
増幅による直接的ジデオキシ配列分析に供し、このDNAサンプルから増幅される
一本鎖産物を生じさせる。Shuldinerら、Handbook of Techniques in Endocrine
Research, p.457-486, DePablo, F., Scanes, C.編、Academic Press, Inc., 1
993。自動化された配列決定のために、TAQ DYE TERMINATOR KIT(PERKIN-ELMER
カタログ番号401628)を用いて、蛍光染料を結合させる。DNA配列決定を、APPLIE
D BIOSYSTEMS, INC.(ABI)自動シークエンサー(モデル373または377)上で、順方
向および逆方向の両方向に行なう。得られたデータを分析するために使用される
ソフトウェアは、ABIから購入される"SEQUENCE NAVIGATOR"である。

【０１００】本発明の方法は、任意のポリヌクレオチドサンプル中の配列変異を検出するの
に使用され得、特に１つの遺伝子、つまりヒトBRCA2遺伝子を例示する目的で、
この章に示される実施例で説明される。BRCA2コーディング配列は、3418アミノ
酸のBRCA2タンパク質をコードする約10,248塩基対である。

【０１０１】アレレ特異的オリゴヌクレオチド(ASO)プローブのデザインアレレ特異的オリゴヌクレオチドプローブは、所与のセットの条件下で標的配
列に正しくハイブリダイズするよう設計された短い、一本鎖のポリヌクレオチド
である。ルーチンには、ASOプローブは、正常アレレに同一である配列および配
列変異をそれぞれ含むようデザインされている。プローブの標的へのハイブリダ
イゼーションは、変異サンプルの区別を可能にする。ストリンジェントな条件下
では、単一塩基対と同じくらい単純な変異を有するプローブは、正常-突然変異
体デュプレックスの脱安定化効果により、正常配列にハイブリダイズしない(Iku
ta, S.ら、Nucleic Acids Research, 15:797-811 (1987))であろう。本発明で使
用するために、野生型または正常配列を突然変異したものから区別するプローブ
を使用した。それぞれのプローブ対は、BRCA2遺伝子の選択された突然変異を同
定するであろう区域を包含するポリヌクレオチド配列を含んでいた。

【０１０２】 ASOハイブリダイゼーションプローブのデザインは、２つの基本的要件を満た
さなければならない。(Current Protocols in Human Genetics, section 9.4, (
1995))。先ず、同じプール中で共に使用されるプローブは、ほぼ同じ長さである
べきである。プローブの標準的長さは、最適には17塩基対であるけれども、範囲
は、約14ほど短く又は約24ほど長くあり得る。次に、ミスマッチ領域は、17塩基
対プローブの末端に置かれるべきでないが、配列のほぼ中央、プローブの5'末端
から約5-7塩基であるべきである。さらに、ミスマッチの配置は、より長いプロ
ーブの場合、末端であるべきでないが、ポリヌクレオチド鎖の強力なハイブリダ
イゼーションおよび安定化を可能にする位置であるべきである。プローブの塩基
組成中の変化の効果を最小にするために、ASOハイブリッド緩衝液中でのように
、テトラメチルアンモニウムクロライドを使用する(Shuber, T.,米国特許第5,63
3,134号)。慣用的には、ASOプローブは、DNAシンセサイザー上で合成される。そ
れらは、当業者に知られた手段を用いて、同位体または非同位体の検出剤で標識
され得る。プローブを作製し使用するための、本願で概説されたプロセスは、他
の遺伝子配列に適用可能であり得る。

【０１０３】ポリヌクレオチドにおける配列変異の検出のための詳細な方法ゲノムDNAの単離白血球は患者から集められ、ゲノムDNAは周知の方法（Sambrook, et al., Mol
ecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laborat
ory Press, at 9.16 - 9.19）に従って白血球から抽出された。

【０１０４】配列決定のためのPCR増幅ゲノムDNAは、テストされる突然変異部位を含む分離DNA断片を増幅させるため
に、鋳型として用いられる。25μlのPCR反応物は、以下の構成要素を含んでいた
：1μlの鋳型（100ng/μl）DNA，2.5μlの10X PCRバッファー（PERKIN-ELMER）
，1.5μlのdNTP（2 mMのそれぞれdATP, dCTP, dGTP, dTTP），1.5μlの順方向プ
ライマー（10μM）, 1.5μlの逆方向プライマー（10μM），0.5μl（合計2.5 U
）AMPLITAQ GOLD^TM TAQ DNAポリメラーゼまたはAMPLITAQ（登録商標） TAQ DNA
ポリメラーゼ（PERKIN-ELMER），1.0から5.0μl（25 mM）のMgCl₂（プライマー
に依存）及び蒸留水（dH₂O）を25μlまで。ゲノムDNAを除いたそれぞれのエクソ
ンのための全試薬は、マスターミックス中で組み合わされ、プールされた混合物
として反応管に等分され得る。

【０１０５】分析されたそれぞれのエクソンのために、以下のコントロールPCRsがセットア
ップされた： (1)“ネガティヴ”DNAコントロール（100ngの胎盤DNA（SIGMA CHEMICAL CO., St. Louis, MO） (2) 3つの“鋳型のない”コントロール全エクソンのためのPCRは、以下のサーモサイクリング条件を用いて行われる
：温度時間サイクル数 95℃ 5分（AMPLITAQ） 1 または10分（GOLD） 95℃ 30秒＼ 55℃ 30秒｝ 30サイクル 72℃ 1分／ 72℃ 5分 1 4℃ 無限 1PCR増幅の品質管理アガロースゲル PCR産物の品質は、アガロースゲル上でそれぞれのPCR反応サンプルのアリコー
トを電気泳動することによりさらに分析する前に試験された。5μlのそれぞれの
PCR反応物は、DNA 100BP DNA LADDER（Gibco RBLカタログ番号15628-019）と並
んでアガロースゲル上でランされる。電気泳動されたPCR産物は、以下の基準に
従って分析された：それぞれの患者のサンプルは、順方向プライマーから逆方向プライマーまでの
PCR産物の長さから期待される、塩基対の数に対応するサイズの一本のバンドを
示さなければならない。もし患者のサンプルが不鮮明になるか多数のバンドを示
すと、PCR反応は、明瞭な一本のバンドが検出されるまで繰り返されなければな
らない。もしPCR産物が全く見えないか、または弱いバンドしか見えないけれど
も、胎盤DNAの鋳型とのコントロール反応が強いバンドを形成したとすると、患
者のサンプルは鋳型DNAの2Xの量を再増幅されるべきである。

【０１０６】全ての3つの“鋳型のない”反応は、全く増幅産物を示さないに違いない。3つ
の反応中に存在するPCR産物はどれであっても、汚染の結果である。もし“鋳型
のない”反応のうちのどれか1つでも汚染したことを示すと、全PCR産物は捨てら
れるべきであり、反応のPCRセット全体は、適切なPCR汚染除去方法が採られた後
に繰り返されるべきである。

【０１０７】ゲル上でのPCR産物の最適量は、50と100ngの間であるべきであり、それは患者
のサンプルのPCR産物の強さをDNAラダーの強さと比較することによって決定され
得る。もし患者のサンプルのPCR産物が50から100ngより少量しか含まれていない
とすると、PCR反応は十分な量が得られるまで繰り返されるべきである。

【０１０８】 DNA配列決定 DNA配列決定のために、二本鎖のPCR産物は、サイクル配列決定反応において、
1つが各ヌクレオチドに特異的である4つの異なる蛍光色素で標識される。ダイタ
ーミネーター方式を用いて、これらのヌクレオチドのうちの１つが延長している
配列の中に組み込まれるとき、その時点で終結する。サイクル配列決定反応の進
行中に、色素標識されたヌクレオチドは、多くの異なる長さの断片を生成するPC
R産物の長さに沿って組み込まれる。

【０１０９】色素標識されたPCR産物は、ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動された
ときにサイズに従って分離するだろう。ABI自動シークエンサーでの少量のゲル
では、断片はレーザー光線が連続的にゲルを通して走査する領域を通過する。レ
ーザーは、断片に付着した蛍光色素を励起し、それぞれの色素の特異的な波長で
の光の放射を生じる。光電子増倍管（PMT）が蛍光を検出してそれを電気シグナ
ルに変換する（ABI 373）か、または光が収集されて、冷やされた電荷結合素子
（CCD）カメラへ分光器により波長に従って分離される（ABI 377）。どちらの場
合も、データ収集ソフトウェアがシグナルを収集し、後に続く配列分析のために
蓄えるだろう。

【０１１０】 PCR産物はまず、キアクウィック-スピン（QIAQUICK-SPIN）PCR精製キット（QI
AGEN #28104）を使用して配列決定のために精製された。精製されたPCR産物は、
PERKIN ELMER GENEAMP 9600サーモサイクラー中で、ABIプリズムダイターミネー
ターサイクルシークエンシングキット（PERKIN ELMER/ABI カタログ番号02154）
において、プライマー、蛍光標識されたdNTPs及びTaqポリメラーゼFSを添加する
ことにより標識された。

【０１１１】各構成要素の量は次の通りである：サンプル用コントロール用試薬量試薬量色素混合物 8.0μL PGEM 2.0μL プライマー（1.6 mM） 2.0μL M 13 2.0μL PCR産物 2.0μL 色素混合物 8.0μL sdH2O 8.0μL sdH2O 8.0μL サーモサイクリング条件は：温度時間サイクル数 96℃ 15秒＼ 50℃ 5秒｝ 25 60℃ 4分／ 4℃ 無限 1 次に、その産物はゲルにロードされ、ABI DNAシークエンサー（モデル373A &
377）中に置かれ、ランされた。得られた配列は、シークエンスナヴィゲータ中
で野生型（参照）配列と比較することにより解析された。配列が一直線上に並ば
ないときは、突然変異の可能性がある。DNA配列は、順方向、逆方向の両方から
決定された。全ての結果は、再検討のためにセカンドリーダーに提供された。

【０１１２】ヘテロ接合／ホモ接合の点突然変異及び多形性は、両方の鎖に見られなければ
ならない。フレームシフト突然変異は、両方の鎖に見られるだろうし、そのよう
に同定されたフレームシフト領域において明瞭な2本のピークを有していなけれ
ばならない。

【０１１３】 ASOのためのPCR増幅ゲノムDNAは、テストされる突然変異部位を含む分離DNA断片を増幅させるため
に、鋳型として用いられる。50μlのPCR反応物は、以下の構成要素を含んでいた
：1μlの鋳型（100ng/μl）DNA，5.0μlの10X PCRバッファー（PERKIN-ELMER）
，2.5μlのdNTP（2 mMのそれぞれdATP, dCTP, dGTP, dTTP），2.5μlの順方向プ
ライマー（10μM）, 2.5μlの逆方向プライマー（10μM），0.5μl（合計2.5 U
）AMPLITAQ（登録商標） TAQ DNAポリメラーゼまたはAMPLITAQ GOLD^TM DNAポリ
メラーゼ（PERKIN-ELMER），1.0から5.0μl（25mM）のMgCl₂（プライマーに依存
）そして蒸留水（dH₂O）50μlまで。ゲノムDNAを除いたそれぞれのエクソンのた
めの全試薬は、マスターミックス中で組み合わせられ、プールされた混合物とし
て反応管に等分され得る。

【０１１４】分析されたそれぞれのエクソンのために、以下のコントロールPCRsがセットア
ップされた： (1)“ネガティヴ”DNAコントロール（100 ngの胎盤DNA（SIGMA CHEMICAL CO., St. Louis, MO） (2) 3つの“鋳型のない”コントロール全エクソンのためのPCRは、以下のサーモサイクリング条件を用いて行われる
：温度時間サイクル数 95℃ 5分（AMPLITAQ） 1 または10分（GOLD） 95℃ 30秒＼ 55℃ 30秒｝ 30サイクル 72℃ 1分／ 72℃ 5分 1 4℃ 無限 1 PCR増幅の品質管理アガロースゲルは、上記のようになされた。 PCR産物のナイロンメンブレンへの結合 PCR産物をナイロンメンブレンへ結合させるに先立ち、PCR産物を３０分以内で
変性させる。PCR産物を変性させるには、残存するPCR反応物（45μl）及び適当
なポジティブコントロール突然変異遺伝子増幅産物を、PCR希釈液（500mM NaOH,
2.0M NaCl, 25mM EDTA）により最終体積２００μlまで希釈し、完全に混合する
。該混合物を９５℃で５分間加熱し、直ちに氷上に載せて氷上で保持したのち、
後述するようにドットブロッターにロードする。

【０１１５】該PCR産物を、BIO-RADドットブロッター装置を用いて、９cm×１３cmのナイロ
ン製ZETA PROBE BLOTTING MEMBRANE（BIO-RAD, Hercules, CA, カタログ番号 16
2-0153）に結合させる。メンブレンを操作するASO分析の間はピンセットと手袋
を常時用い、決して素手またはラテックス手袋でメンブレン表面に触れないよう
注意する。

【０１１６】３MM濾紙［WHATMAN(登録商標), Clifton, NJ］複数枚およびナイロンメンブレ
ンを、２０X SSCバッファーストックより新たに調製した１０X SSC中であらかじ
め湿らせる。メンブレンへのアセンブリに先立ち、真空装置をdH₂Oで完全にすす
ぐ。変性PCR産物の各１００μlをブロッティング装置のウェルに加える。ブロッ
ティング装置の各列には、胎盤DNA（ネガティブ）コントロール、所望の突然変
異をもつ合成オリゴヌクレオチドまたは既知の突然変異サンプル由来のPCR産物
（ポジティブコントロール）、及び３つの鋳型のないDNAコントロールを含む、
分析すべき１エクソンについての１セットの反応物が含まれる。

【０１１７】 PCR産物をアプライしたのち、ナイロンフィルターを５分間変性液（1.5M NaCl
, 0.5M NaOH）で飽和した１枚の３MM濾紙上に、DNA側を上にしてを置く。該メン
ブレンを、５分間中和液（1M Tris-HCl, pH8, 1.5M NaCl）で飽和した１枚の３M
M濾紙へ移す。次に、中和されたメンブレンを、乾燥した３MM濾紙へDNA側を上に
して移し、DNAをメンブレンに固定するため、紫外線（STRALINKER, STRATAGENE,
La Jolla, CA）に正確に４５秒間さらす。この紫外線架橋は、変性／中和ステ
ップの３０分以内に行うべきである。次に、１エクソンについての１セットの反
応物ブロット１列を各ストリップが含むように、該ナイロンメンブレンをストリ
ップに切る。

【０１１８】標識オリゴヌクレオチドのナイロンメンブレンへのハイブリダイジングプレハイブリダイゼーション該ストリップを、HYBAID(登録商標)（SAVANT INSTRUMENTS, INC., Holbrook,
NY）ハイブリダイゼーションオーブンを用いて５２℃でプレハイブリダイズする
。2X SSC（１５から２０ml）を湯浴中で５２℃に予熱する。各ナイロンストリッ
プにつき、ナイロンメンブレンストリップよりわずかに大きく切った（約１”×
５”）ナイロンメッシュ１枚を2X SSCであらかじめ湿らせる。各ナイロンメンブ
レン１枚をプレハイブリダイゼーション液から取り出し、ナイロンメッシュ上面
に置く。次に該メンブレン／メッシュ“サンドイッチ”を１枚のパラフィルム上
に移す。該メンブレン／メッシュ“サンドイッチ”を縦長に巻き、適当なHYBAID
(登録商標)ボトルの中に入れ、HYBAID(登録商標)装置の回転作用によりメンブレ
ンを展開させた。該ボトルに蓋をし、穏やかに回転させてメンブレン／メッシュ
を展開し、また2X SSCを均一に行き渡らせ、メンブレンとメッシュの間、もしく
はメッシュとボトル側面の間に空気の泡が生じないことを確認する。2X SSCは捨
て、３M TMAC（テトラメチルアンモニウムクロライド-SIGMA T-3411）、１００m
M Na₃PO₄（pH6.8）、１mM EDTA、５Xデンハート液（１％フィコール、１％ポリ
ビニルピロリドン、１％ BSA (フラクションＶ)）、０．６％ SDS 、および１００μg/mlニシン精子DNAを含む５mlのTMACハイブリダイゼーション
液と交換する。濾紙ストリップを中回転（HYBAID(登録商標)速度コントロールで
およそ８．５目盛り）で少なくとも１時間、５２℃でプレハイブリダイズする。
プレハイブリダイゼーションは一晩行なってもよい。

【０１１９】オリゴヌクレオチドの標識 BRCA2突然変異の検出に用いたオリゴヌクレオチドプローブのDNA配列は以下の
通り（各突然変異につき、突然変異体及び正常なオリゴヌクレオチドを標識しな
ければならない）： C2192G-正常 5'TGA AGA ACC AAC TTT GT3' 配列番号3 C2192G-ミュータント 5'TGA AGA ACG AAC TTT GT3' 配列番号4 3772delTT-正常 5'GCA AGC AAT TTG AAG GT3' 配列番号7 3772delTT-ミュータント 5'GCA AGC AAT GAA GGT AC3' 配列番号8 C5193G-正常 5'ACT TGT TAC ACA AAT CA3' 配列番号11 C5193G-ミュータント 5'ACT TGT TAG ACA AAT CA3' 配列番号12 5374del4-正常 5'ATT ATT TGT ATG AAA AT3' 配列番号15 5374del4-ミュータント 5'ATT ATT TGA AAA TAA TT3' 配列番号16 6495delGC-正常 5'GAA CTG AGC ATA GTC TT3' 配列番号19 6495delGC-ミュータント 5'GAA CTG AAT AGT CTT CA3' 配列番号20 6909insG-正常 5'CAG AAG CAG TAG AAA TT3' 配列番号23 6909insG-ミュータント 5' CAG AAG CAG GTA GAA AT3' 配列番号24 各標識反応物は、５Xキナーゼバッファー２-μl（又は１０Xキナーゼバッファ
ー１μl）、ガンマ‐ATP³²P（１週間を経ないもの）５μl、T4ポリヌクレオチド
キナーゼ１μl、オリゴヌクレオチド３μl（２０μMストック）、要すれば最終
体積１０μlまでの滅菌H₂Oを含む。該反応物を３７℃で３０分間、次に６５℃で
１０分間インキュベートし、キナーゼを加熱失活させる。該キナーゼ反応物を、
等量（１０μl）の滅菌dH₂O（蒸留水）で希釈する。

【０１２０】該オリゴヌクレオチドを、メーカーの使用説明書に従ってSTE MICRO SELECT-D
、G-25スピンカラム（カタログno.5303-356769）で精製する。合成オリゴヌクレ
オチド溶出液２０μlを８０μlのdH₂Oで希釈する（最終体積＝１００μl）。オ
リゴヌクレオチドサンプルの放射能量を、１分当たりの放射性カウント（cpm）
を計ることにより測定する。放射能総量は少なくとも２００万cpmでなければな
らない。総量２００万より少なく含むどのサンプルについても、標識反応を繰り
返す。

【０１２１】突然変異体オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション標識された変異変異体オリゴヌクレオチドプローブのおよそ２００〜５００万
カウントを、２０μMの非標識正常オリゴヌクレオチドストックを４０μl含むTM
ACハイブリダイゼーション液５mlに希釈する。該プローブミックスは、ハイブリ
ダイゼーションオーブン中で５２℃まで予熱する。プレハイブリダイゼーション
液を各ボトルより除き、プローブミックスと入れ替える。該濾紙を１時間５２℃
で穏やかに揺り動かしながらハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの次
に、プローブミックスを保管チューブにデカントし、−２０℃で保存する。およ
そ２０mlの2X SSC＋0.1% SDSを室温で添加し、蓋をしたボトルを約３０秒間穏や
かに回転し、すすぎ液を流し出すことにより、該濾紙をすすぐ。次に該濾紙を室
温で２０から３０分間振とうしながら、2X SSC＋0.1% SDSで洗浄する。

【０１２２】該メンブレンを洗浄液より取り出し、乾燥した１枚の３MM WHATMAN濾紙に載せ
、次に１層のプラスチックラップに包み、オートラジオグラフィーフィルムに載
せ、放射能のレベルを示す測量メーターに応じて約５時間露光する。該フィルム
は自動フィルムプロセッサーにて現像する。

【０１２３】正常オリゴヌクレオチドとのコントロールハイブリダイゼーション本ステップの目的は、PCR産物のナイロンメンブレンへの有効な移動を確実に
することである。

【０１２４】上記の実施例に示したような突然変異体オリゴヌクレオチドとのハイブリダイ
ゼーションに続き、各ナイロンメンブレンを2X SSC、0.1% SDS中、２０分間６５
℃で洗浄して、突然変異体オリゴヌクレオチドプローブを融解する。次に該ナイ
ロンストリップをあわせて、TMACハイブリダイゼーション液４０ml中で少なくと
も１時間、５２℃の湯浴中で振とうし、プレハイブリダイズした。非標識正常オ
リゴヌクレオチドの２０μMストック４０μlを加えた、各正常標識オリゴヌクレ
オチドプローブの２００〜５００万カウントを、ナイロンメンブレンおよびプレ
ハイブリダイゼーション液を含む容器に直接加える。該濾紙および該プローブを
５２℃で少なくとも１時間振とうしてハイブリダイズする。ハイブリダイゼーシ
ョンは要すれば一晩行い得る。ハイブリダイゼーション液を流し出し、ナイロン
メンブレンを2X SSC、0.1% SDS中、１分間手で静かに渦動させてすすぐ。すすぎ
液を流し出し、メンブレンを2X SSC、0.1% SDS中、室温で２０分間振とうし、洗
浄する。

【０１２５】該ナイロンメンブレンを取り出し、乾燥した１枚の３MM WHATMAN濾紙に載せる
。次に該ナイロンメンブレンを１層のプラスチックラップに包み、オートラジオ
グラフィーフィルムに載せ、少なくとも１時間露光する。

【０１２６】各サンプルについて、強いオートラジオグラフィック・ハイブリダイゼーショ
ン・シグナルは、メンブレンへの十分な移動を示す。各サンプルにつき、その正
常オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした場合のシグナルが全くないかあるい
は弱ければ、PCR産物の移動が不成功であることを意味し、これは偽のネガティ
ブである。ナイロンメンブレンへうまく移動しなかったどのサンプルについても
、ASO分析を繰り返さねばならない。

【０１２７】結果の解釈突然変異体オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした後、各エクソンについて
の結果を以下のように解釈する：

【０１２８】

【表４Ａ】

【０１２９】正常オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後、結果を以下のように
解釈する：

【０１３０】

【表４Ｂ】

【０１３１】サンプル＃１はコントロール群より薄く（lighter）なるべきである。突然変異
体を含んだ患者サンプルは一般にヘテロ接合であり、正常オリゴヌクレオチドプ
ローブおよび突然変異体オリゴヌクレオチドプローブの両方にハイブリダイズす
るであろう。本発明は、本明細書中に記載する特定の実施態様の範囲に限定され
るべきものでなく、該実施態様は本発明の個々の側面の１説明として意図された
ものであり、機能的に同等の方法および構成部分は本発明の範囲内である。更に
、本明細書中に示し記載したものの他、本発明の様々な改良は、先の記載および
添付図面から当業者にとり明らかになるであろう。こうした改良は添付の請求項
の範囲内であるよう意図される。

【０１３２】本明細書中に言及した全ての参考文献は、参考として援用されている。

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１１年７月２日（１９９９．７．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】 <110> レスカレットジェニファーエル．ローレンスタミーサーバーデニスビー．オルセンシェリジェイ．アレンアントネットピー．ホワイトマーガビー． <120> ＢＲＣＡ２の癌罹患性突然変異 <130> 31421-PCT <140> PCT/US 98/25511 <141> 1998-02-12 <150> US 08/984,034 <151> 1997-12-02 <160> 24 <170> FastSEQ フォーウィンドウズバージョン 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 1 tggtacttta attttgtcac tt 22 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 2 tgcaggcatg acagagaa 18 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 3 tgaagaacca actttgt 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 4 tgaagaacga actttgt 17 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 5 ctcagatgtt attttccaag c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 6 ctgttaaata accagaagca c 21 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 7 gcaagcaatt tgaaggt 17 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 8 gcaagcaatg aaggtac 17 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 9 gcaaagaccc taaagtacag 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 10 catcaaatat tccttctcta ag 22 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 11 acttgttaca caaatca 17 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 12 acttgttaga caaatca 17 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 13 gaaaattcag ccttagc 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 14 atcagaatgg taggaat 17 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 15 attatttgta tgaaaat 17 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 16 attatttgaa aataatt 17 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 17 tacagcaagt ggaaagc 17 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 18 aagtttcagt tttaccaat 19 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 19 gaactgagca tagtctt 17 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 20 gaactgaata gtcttca 17 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 21 actttttctg atgttcctgt g 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 22 taaaaatagt gattggcaac a 21 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 23 cagaagcagt agaaatt 17 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> ホモサピエンス <400> 24 cagaagcagg tagaaat 17

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月７日（２０００．２．７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 37/00 １０２Ｆ (72)発明者アレンアントネットピー．アメリカ合衆国メリーランド 21144 セヴァーンハワイアベニュー 1405 (72)発明者オルソンシェリジェイ．アメリカ合衆国ヴァージニア 22024 フォールズチャーチヤーリングコート 2854 (72)発明者サーバーデニスビー．アメリカ合衆国メリーランド 20902 シルバースプリングパーカーコート 2813 (72)発明者ホワイトマーガビー．アメリカ合衆国メリーランド 21701 フレデリックシャロンドライブ 8323 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA36 CA02 CA09 HA01 HA14 4B029 AA07 FA12 4B063 QA01 QA08 QA13 QA19 QQ08 QQ58 QR32 QR55 QR62 QR77 QS25 QS34 QX02 QX07

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 BRCA2遺伝子配列のコドン655でプロリンからアルギニンへの
アミノ酸変化を検出するための第１オリゴヌクレオチド、ここで、該第１オリゴ
ヌクレオチドはBRCA2遺伝子のヌクレオチド番号2192を含む領域に特異的にハイ
ブリダイズする、 BRCA2遺伝子配列のヌクレオチド番号3772で２個のヌクレオチド欠失を検出す
るための第２オリゴヌクレオチド、ここで、該第２オリゴヌクレオチドはBRCA2
遺伝子のヌクレオチド番号3772を含む領域に特異的にハイブリダイズする、 BRCA2遺伝子配列のコドン1655でトリプトファンから停止コドンへのアミノ酸
変化を検出するための第３オリゴヌクレオチド、ここで、該第４オリゴヌクレオ
チドはBRCA2遺伝子のヌクレオチド番号5193を含む領域に特異的にハイブリダイ
ズする、 BRCA2遺伝子配列のヌクレオチド番号5374で４個のヌクレオチド欠失を検出す
るための第４オリゴヌクレオチド、ここで、該第５オリゴヌクレオチドはBRCA2
遺伝子のヌクレオチド番号5374を含む領域と特異的にハイブリダイズする、 BRCA2遺伝子配列のヌクレオチド番号6495で２個のヌクレオチド欠失を検出す
るための第５オリゴヌクレオチド、ここで、該第６オリゴヌクレオチドはBRCA2
遺伝子のヌクレオチド番号6495を含む領域に特異的にハイブリダイズする、およ
び BRCA2遺伝子配列のヌクレオチド番号6909で１個のヌクレオチド挿入を検出す
るための第６オリゴヌクレオチド、ここで、該第７オリゴヌクレオチドはBRCA2
遺伝子のヌクレオチド番号6909を含む領域に特異的にハイブリダイズする、からなる群から選択される単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２】オリゴヌクレオチドが、BRCA2遺伝子のヌクレオチド番号219
2を含む領域に特異的にハイブリダイズすることによってヌクレオチド番号2192
でGを検出し得る、請求項１に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３】配列5'TGA AGA ACC AAC TTT GT3'、配列番号３を有する請求
項２に記載の単離された野生型アレレ特異的オリゴヌクレオチド、またはそれに
対する相補性オリゴヌクレオチド。
【請求項４】配列5'TGA AGA ACG AAC TTT GT3'、配列番号４を有する請求
項２に記載の単離された突然変異体アレレ特異的オリゴヌクレオチド、またはそ
れに対する相補性オリゴヌクレオチド。
【請求項５】オリゴヌクレオチドが、BRCA2遺伝子のヌクレオチド番号377
2を含む領域に特異的にハイブリダイズすることによってヌクレオチド番号3772
でTT欠失を検出し得る、請求項１に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項６】配列5'GCA AGC AAT TTG AAG GT3'、配列番号７を有する請求
項５に記載の単離された野生型アレレ特異的オリゴヌクレオチド、またはそれに
対する相補性オリゴヌクレオチド。
【請求項７】配列5'GCA AGC AAT GAA GGT AC3'、配列番号８を有する請求
項５に記載の単離された突然変異体アレレ特異的オリゴヌクレオチド、またはそ
れに対する相補性オリゴヌクレオチド。
【請求項８】オリゴヌクレオチドが、BRCA2遺伝子のヌクレオチド番号519
3を含む領域に特異的にハイブリダイズすることによってヌクレオチド番号5193
でのCのGへの置換を検出し得る、請求項１に記載の単離されたオリゴヌクレオチ
ド。
【請求項９】配列5'ACT TGT TAC ACA AAT CA3'、配列番号１１を有する請
求項８に記載の単離された野生型アレレ特異的オリゴヌクレオチド、またはそれ
に対する相補性オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】配列5'ACT TGT TAG ACA AAT CA3'、配列番号１２を有する
、請求項８に記載の単離された突然変異体アレレ特異的オリゴヌクレオチド、ま
たはそれに対する相補性オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】オリゴヌクレオチドが、BRCA2遺伝子のヌクレオチド番号5
193を含む領域に特異的にハイブリダイズすることによってヌクレオチド番号519
3でGを検出し得る、請求項１に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】配列5'ACT TGT TAG ACA AAT CA3'、配列番号１２を有する
、請求項１１に記載の単離された野生型アレレ特異的オリゴヌクレオチド、また
はそれに対する相補性オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】配列5'ACT TGT TAC ACA AAT CA3'、配列番号１１を有する
請求項１１に記載の単離された突然変異体アレレ特異的オリゴヌクレオチド、ま
たはそれに対する相補性オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】オリゴヌクレオチドが、BRCA2遺伝子のヌクレオチド番号5
374を含む領域に特異的にハイブリダイズすることによってヌクレオチド番号537
4でTATG欠失を検出し得る、請求項１に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】配列5'ATT ATT TGT ATG AAA AT3'、配列番号１５を有する
請求項１４に記載の単離された野生型アレレ特異的オリゴヌクレオチド、または
それに対する相補性オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】配列5'ATT ATT TGA AAA TAA TT3'、配列番号１６を有する
請求項１４に記載の単離された突然変異体アレレ特異的オリゴヌクレオチド、ま
たはそれに対する相補性オリゴヌクレオチド。
【請求項１７】オリゴヌクレオチドが、BRCA2遺伝子のヌクレオチド番号6
495を含む領域に特異的にハイブリダイズすることによってヌクレオチド番号649
5でGC欠失を検出し得る、請求項１に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】配列5'GAA CTG AGC ATA GTC TT3'、配列番号１９を有する
請求項１７に記載の単離された野生型アレレ特異的オリゴヌクレオチド、または
それに対する相補性オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】配列5'GAA CTG AAT AGT CTT CA3'、配列番号２０を有する
請求項１７に記載の単離された突然変異体アレレ特異的オリゴヌクレオチド、ま
たはそれに対する相補性オリゴヌクレオチド。
【請求項２０】オリゴヌクレオチドが、BRCA2遺伝子のヌクレオチド番号6
909を含む領域に特異的にハイブリダイズすることによってヌクレオチド番号690
9でG挿入を検出し得る、請求項１に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】配列5'CAG AAG CAG TAG AAA TT3'、配列番号２３を有する
請求項２０に記載の単離された野生型アレレ特異的オリゴヌクレオチド、または
それに対する相補性オリゴヌクレオチド。
【請求項２２】配列5'CAG AAG CAG GTA GAA AT3'、配列番号２４を有する
請求項２０に記載の単離された突然変異体アレレ特異的オリゴヌクレオチド、ま
たはそれに対する相補性オリゴヌクレオチド。
【請求項２３】更に、それに結合した標識を含む、請求項１に記載の単離
されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】標識が、放射性標識、蛍光標識、生物発光標識、化学発光
標識、酵素標識およびリガンド標識からなる群から選択される、請求項２３に記
載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】 BRCA2にハイブリダイズしDNA合成を開始してプライマーを
伸張可能である単離されたオリゴヌクレオチドプライマーであって、該単離され
たオリゴヌクレオチドプライマーは下記オリゴヌクレオチド： BRCA2-11F 5'TGG TAC TTT AAT TTT GTC ACT T3' (配列番号１)、 BRCA2-11R 5'TGC AGG CAT GAC AGA GAA T3' (配列番号２)、 BRCA2-11F 5'CTC AGA TGT TAT TTT CCA AGC3' (配列番号５)、 BRCA2-11R 5'CTG TTA AAT AAC CAG AAG CAC3' (配列番号６)、 BRCA2-11F 5'GCA AAG ACC CTA AAG TAC AG3' (配列番号９)、 BRCA2-11R 5'CAT CAA ATA TTC CTT CTC TAA G3' (配列番号１０)、 BRCA2-11F 5'GAA AAT TCA GCC TTA GC3' (配列番号１３)、 BRCA2-11R 5'ATC AGA ATG GTA GGA AT3' (配列番号１４)、 BRCA2-11F 5'TAC AGC AAG TGG AAA GC3' (配列番号１７)、 BRCA2-11R 5'AAG TTT CAG TTT TAC CAA T3' (配列番号１８)、 BRCA2-11F 5'ACT TTT TCT GAT GTT CCT GTG3' (配列番号２１)、または BRCA2-11R 5'TAA AAA TAG TGA TTG GCA ACA3' (配列番号２２) の１つがハイブリダイズする領域をオーバーラップする領域でBRCA2遺伝子に
ハイブリダイズする。
【請求項２６】配列BRCA-2-11F：5'TGG TAC TTT AAT TTT GTC ACT T3' (
配列番号１)または相補性ポリヌクレオチドにハイブリダイズし該相補性ポリヌ
クレオチドに沿ってDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む順方向プラ
イマーである、請求項２５に記載の単離されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２７】配列BRCA-2-11R：5'TGC AGG CAT GAC AGA GAA T3' (配列
番号２)または相補性ポリヌクレオチドにハイブリダイズし該相補性ポリヌクレ
オチドに沿ってDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む逆方向プライマ
ーである、請求項２５に記載の単離されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２８】配列BRCA-2-11F：5'CTC AGA TGT TAT TTT CCA AGC3' (配
列番号５)または相補性ポリヌクレオチドにハイブリダイズし該相補性ポリヌク
レオチドに沿ってDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む順方向プライ
マーである、請求項２５に記載の単離されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２９】配列BRCA-2-11R：5'CTG TTA AAT AAC CAG AAG CAC3' (配
列番号６)または相補性ポリヌクレオチドにハイブリダイズし該相補性ポリヌク
レオチドに沿ってDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む逆方向プライ
マーである、請求項２５に記載の単離されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３０】配列BRCA-2-11F：5'GCA AAG ACC CTA AAG TAC AG3'、配列
番号９、または相補性ポリヌクレオチドにハイブリダイズし該相補性ポリヌクレ
オチドに沿ってDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む順方向プライマ
ーである、請求項２５に記載の単離されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３１】配列BRCA-2-11R：5'CAT CAA ATA TTC CTT CTC TAA G3'、
配列番号１０、または相補性ポリヌクレオチドにハイブリダイズし該相補性ポリ
ヌクレオチドに沿ってDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む逆方向プ
ライマーである、請求項２５に記載の単離されたオリゴヌクレオチドプライマー
。
【請求項３２】配列BRCA-2-11F：5'GAA AAT TCA GCC TTA GC3' (配列番号
１３)または相補性ポリヌクレオチドにハイブリダイズし該相補性ポリヌクレオ
チドに沿ってDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む順方向プライマー
である、請求項２５に記載の単離されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３３】配列BRCA-2-11R：5'ATC AGA ATG GTA GGA AT3' (配列番号
１４)または相補性ポリヌクレオチドにハイブリダイズし該相補性ポリヌクレオ
チドに沿ってDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む逆方向プライマー
である、請求項２５に記載の単離されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３４】配列BRCA-2-11F：5'TAC AGC AAG TGG AAA GC3' (配列番号
１７)または相補性ポリヌクレオチドにハイブリダイズし該相補性ポリヌクレオ
チドに沿ってDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む順方向プライマー
である、請求項２５に記載の単離されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３５】配列BRCA-2-11R：5'AAG TTT CAG TTT TAC CAA T3' (配列
番号１８)または相補性ポリヌクレオチドにハイブリダイズし該相補性ポリヌク
レオチドに沿ってDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む逆方向プライ
マーである、請求項２５に記載の単離されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３６】配列BRCA-2-11F：5'ACT TTT TCT GAT GTT CCT GTG3' (配
列番号２１)または相補性ポリヌクレオチドにハイブリダイズし該相補性ポリヌ
クレオチドに沿ってDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む順方向プラ
イマーである、請求項２５に記載の単離されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３７】配列BRCA-2-11R：5'TAA AAA TAG TGA TTG GCA ACA3' (配
列番号２２)または相補性ポリヌクレオチドにハイブリダイズし該相補性ポリヌ
クレオチドに沿ってDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む逆方向プラ
イマーである、請求項２５に記載の単離されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３８】一方がBRCA2遺伝子のエクソン11に効果的にハイブリダイ
ズし得、他方がエクソン11またはエクソン11をフランキングする２つのイントロ
ン領域の１つのいずれかに効果的にハイブリダイズし得る、BRCA2遺伝子に特異
的にハイブリダイズする１対の単離されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３９】前記対が、配列BRCA-2-11F：5'TGG TAC TTT AAT TTT GTC
ACT T3' (配列番号１)を有するプライマーおよび配列BRCA-2-11R：5'TGC AGG CA
T GAC AGA GAA T3' (配列番号２)を含むプライマー、または相補性ポリヌクレオ
チドにハイブリダイズしDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む、請求
項３８に記載の１対のプライマー。
【請求項４０】前記対が、配列BRCA-2-11F：5'CTC AGA TGT TAT TTT CCA
AGC3' (配列番号５)を有するプライマーおよび配列BRCA-2-11R：5'CTG TTA AAT
AAC CAG AAG CAC3' (配列番号６)を含むプライマー、または相補性ポリヌクレオ
チドにハイブリダイズしDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む、請求
項３８に記載の１対のプライマー。
【請求項４１】前記対が、配列BRCA-2-11F：5'GCA AAG ACC CTA AAG TAC
AG3'、配列番号９を有するプライマー、および配列BRCA-2-11R：5'CAT CAA ATA
TTC CTT CTC TAA G3'、配列番号１０を含むプライマー、または相補性ポリヌク
レオチドにハイブリダイズしDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む、
請求項３８に記載の１対のプライマー。
【請求項４２】前記対が、配列BRCA-2-11F：5'GAA AAT TCA GCC TTA GC3' (配列番号１３)を有するプライマーおよび配列BRCA-2-11R：5'ATC AGA ATG GTA GGA AT3' (配列番号１４)を含むプライマー、または相補性ポリヌクレオチドに
ハイブリダイズしDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む、請求項３８
に記載の１対のプライマー。
【請求項４３】前記対が、配列BRCA-2-11F：5'TAC AGC AAG TGG AAA GC3' (配列番号１７)を有するプライマーおよび配列BRCA-2-11R：5'AAG TTT CAG TTT TAC CAA T3' (配列番号１８)を含むプライマー、または相補性ポリヌクレオチ
ドにハイブリダイズしDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む、請求項
３８に記載の１対のプライマー。
【請求項４４】前記対が、配列BRCA-2-11F：5'ACT TTT TCT GAT GTT CCT
GTG3' (配列番号２１)を有するプライマーおよび配列BRCA-2-11R：5'TAA AAA TA
G TGA TTG GCA ACA3' (配列番号２２)を含むプライマー、または相補性ポリヌク
レオチドにハイブリダイズしDNA合成を開始し得る実質的に類似の配列を含む、
請求項３８に記載の１対のプライマー。
【請求項４５】それぞれのプライマーが標識に結合されている、請求項３
８に記載の１対の単離されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項４６】前記標識のそれぞれが、放射性標識、蛍光標識、生物発光
標識、化学発光標識、酵素標識およびリガンド標識からなる群から選択される、
請求項４５に記載の１対のプライマー。
【請求項４７】標識に結合された、請求項２５に記載の単離されたオリゴ
ヌクレオチドプライマー。
【請求項４８】前記標識が、放射性標識、蛍光標識、生物発光標識、化学
発光標識、酵素標識およびリガンド標識からなる群から選択される、請求項４５
に記載のプライマー。
【請求項４９】遺伝子サンプル中の配列変異の存在または不存在を決定す
る方法であって、 (a)１種以上の予め決められた配列変異の存在または不存在に関するアレレ特
異的検出アッセイを行なうこと；および (b)BRCA2遺伝子サンプル中の配列変異の存在または不存在をヌクレオチド番号
2192、3772、5193、5374、6495または6909で決定すること、を包含する方法。
【請求項５０】予め決められた配列変異がC2192G、3772delTT、C5193G、5
374del4、6495delGCまたは6909insGである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】アレレ特異的検出アッセイがマルチプレックス増幅アッセ
イ・フォーマットの一部として行なわれる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】アレレ特異的配列に基づくアッセイが、ドットブロット・
フォーマット、逆ドットブロット・フォーマット、MASDAフォーマット、または
チップアレーフォーマットを用いて行なわれる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】さらに、 (a)１種以上の参照配列の存在または不存在に関するアレレ特異的検出アッセ
イを予め決められた配列変異を用いずに行なうこと、を包含する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】前記参照配列がBRCA2コーディング配列である、請求項５
３に記載の方法。
【請求項５５】前記参照配列がBRCA2ゲノム配列である、請求項５３に記
載の方法。
【請求項５６】前記参照配列がBRCA2遺伝子の１種以上のエクソンである
、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】アレレ特異的配列に基づく技術を行なうための"n"個のセ
ルを有するチップアレーであって、 "n"個のセルを有する固相チップおよび "n"個の異なるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド、少なくとも１
種の配列は請求項１に記載のオリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし得
る、を含み、ここで、"n"は、１より大きい整数である、該オリゴヌクレオチドは、相補性オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド
に効果的に該オリゴヌクレオチドをハイブリダイズ可能とする様式で該固相チッ
プに結合されており、および異なるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドは異なるセルで該固相チ
ップに結合され、該固相チップ上の特定の位置は１ヌクレオチド配列を排他的に
有するオリゴヌクレオチドを含む、チップアレー。
【請求項５８】個体における癌に対する疾病素質またはより高い罹患性を
検出する方法であって、 (a)該個体からのDNAをフラグメントに消化すること、 (b)該消化から得た該DNAフラグメントを分離すること、 (c)BRCA2遺伝子配列のヌクレオチド番号2192、3772、5193、5374、6495または
6909を含むDNAフラグメント、またはBRCA2遺伝子配列のヌクレオチド番号2192、
3772、5193、5374、6495または6909での配列変異を配列決定により検出すること
； (d)ヌクレオチド番号2192、3772、5193、5374、6495または6909での配列変異
の存在に関して該DNAフラグメント配列をBRCA2遺伝子配列と比較すること、ここ
で、配列変異の存在は癌に対する疾病素質またはより高い罹患性を示す、ことを包含する方法。
【請求項５９】検出工程(c)の前に前記DNAフラグメントを増幅することを
更に包含する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】配列変異が、下記配列： 5'TGG TAC TTT AAT TTT GTC ACT T3' 配列番号１、 5'TGC AGG CAT GAC AGA GAA T3' 配列番号２、 5'CTC AGA TGT TAT TTT CCA AGC3' 配列番号５、 5'CTG TTA AAT AAC CAG AAG CAC3' 配列番号６、 5'GCA AAG ACC CTA AAG TAC AG3' 配列番号９、 5'CAT CAA ATA TTC CTT CTC TAA G3' 配列番号１０、 5'GAA AAT TCA GCC TTA GC3' 配列番号１３、 5'ATC AGA ATG GTA GGA AT3' 配列番号１４、 5'TAC AGC AAG TGG AAA GC3' 配列番号１７、 5'AAG TTT CAG TTT TAC CAA T3' 配列番号１８、 5'ACT TTT TCT GAT GTT CCT GTG3' 配列番号２１、 5'TAA AAA TAG TGA TTG GCA ACA3' 配列番号２２または相補性オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド上で特異的ハイブリダ
イゼーションおよびDNA合成開始をし得る配列、を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅される、請求項５８に記
載の方法。
【請求項６１】前記オリゴヌクレオチドプライマーが、放射性標識、蛍光
標識、生物発光標識、化学発光標識、酵素標識、またはリガンド標識で標識され
る、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】個体における癌に対する疾病素質またはより高い罹患性を
検出する方法であって、 (a)該個体からのDNAを消化すること、 (b)該消化から得たDNAフラグメントを分離すること、 (c)DNAフラグメントを、BRCA2遺伝子配列内に含まれる配列を有するポリヌク
レオチドまたはBRCA2遺伝子配列のヌクレオチド番号2192、3772、5193、5374、6
495または6909での配列変異のいずれかにハイブリダイズし得るヌクレオチド配
列を有するアレレ特異的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせること、およ
び (d)該配列変異の存在または不存在を、BRCA2遺伝子のそれぞれの存在または不
存在と相関させて、それにより癌に対する疾病素質またはより高い罹患性を決定
すること、を包含する方法。
【請求項６３】前記アレレ特異的オリゴヌクレオチドが、 5'TGA AGA ACC AAC TTT GT3' 配列番号３、 5'TGA AGA ACG AAC TTT GT3' 配列番号４、 5'GCA AGC AAT TTG AAG GT3' 配列番号７、 5'GCA AGC AAT GAA GGT AC3' 配列番号８、 5'ACT TGT TAC ACA AAT CA3' 配列番号１１、 5'ACT TGT TAG ACA AAT CA3' 配列番号１２、 5'ATT ATT TGT ATG AAA AT3' 配列番号１５、 5'ATT ATT TGA AAA TAA TT3' 配列番号１６、 5'GAA CTG AGC ATA GTC TT3' 配列番号１９、 5'GAA CTG AAT AGT CTT CA3' 配列番号２０、 5'CAG AAG CAG TAG AAA TT3' 配列番号２３、 5'CAG AAG CAG GTA GAA AT3' 配列番号２４、または BRCA2遺伝子上の領域に特異的ハイブリダイゼーションし得る配列または配列番
号３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１９、２０、２３、または２４に
対する相補性領域をオーバーラップするBRCA2遺伝子の前記配列変異である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】配列決定の前に前記DNAフラグメントを増幅することを更
に包含する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】前記オリゴヌクレオチドが、放射性標識、蛍光標識、生物
発光標識、化学発光標識、酵素標識、またはリガンド標識で標識される、請求項
６２に記載の方法。
【請求項６６】１種以上の容器手段を密接に閉じこめて受けるよう区画さ
れた担体手段、および少なくとも１種の容器手段を含むキットであって、ここで、該少なくとも１種の容器手段は、請求項１に記載のオリゴヌクレオチ
ドを含む、キット。
【請求項６７】更に、少なくとも１種の容器手段を含むキットであって、
該容器手段は、BRCA2にハイブリダイズしDNA合成を開始してプライマーを伸張し
得る単離されたオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該単離されたオリゴヌク
レオチドプライマーは、下記オリゴヌクレオチド： BRCA2-11F：5'TGG TAC TTT AAT TTT GTC ACT T3' (配列番号１)、 BRCA2-11R：5'TGC AGG CAT GAC AGA GAA T3' (配列番号２)、 BRCA2-11F：5'CTC AGA TGT TAT TTT CAA AGC3' (配列番号５)、 BRCA2-11R：5'CTG TTA AAT AAC CAG AAG CAC3' (配列番号６)、 BRCA2-11F：5'GCA AAG ACC CTA AAG TAC AG3' (配列番号９)、 BRCA2-11R：5'CAT CAA ATA TTC CTT CTC TAA G3' (配列番号１０)、 BRCA2-11F：5'GAA AAT TCA GCC TTA GC3' (配列番号１３)、 BRCA2-11R：5'ATC AGA ATG GTA GGA AT3' (配列番号１４)、 BRCA2-11F：5'TAC AGC AAG TGG AAA GC3' (配列番号１７)、 BRCA2-11R：5'AAG TTT CAG TTT TAC CAA T3' (配列番号１８)、 BRCA2-11F：5'ACT TTT TCT GAT GTT CCT GTG3' (配列番号２１)、または BRCA2-11R：5'TAA AAA TAG TGA TTG GCA ACA3' (配列番号２２) の１つがハイブリダイズする領域をオーバーラップする領域でBRCA2遺伝子に
ハイブリダイズする、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】更に、少なくとも１種の容器手段を含み、該容器手段はBR
CA2遺伝子に特異的にハイブリダイズする１対の単離されたオリゴヌクレオチド
プライマーを含み、その一方はBRCA2遺伝子のエクソン11に効果的にハイブリダ
イズし得、他方はエクソン11またはエクソン11をフランキングする２つのイント
ロン領域の１つに効果的にハイブリダイズし得る、請求項６６に記載のキット。
【請求項６９】１種以上の容器手段を密接に閉じこめて受けるよう区画さ
れた担体手段、および少なくとも１種の容器手段を含むキットであって、ここで、該少なくとも１種の容器手段は、請求項２５に記載のオリゴヌクレオ
チドプライマーを含む、キット。
【請求項７０】１種以上の容器手段を密接に閉じこめて受けるよう区画さ
れた担体手段、および少なくとも１種の容器手段を含むキットであって、ここで、少なくとも１種の容器手段は、請求項３８に記載の１対のオリゴヌク
レオチドプライマーを含む、キット。
【請求項７１】リスト：C2192G、3772delTT、C5193G、5374del4、6495del
GCまたは6909insGからの少なくとも１種の突然変異を含むBRCA2遺伝子の少なく
とも一部をコードするDNAから本質的になる単離されたDNA配列、またはそれに対
して相補性の単離されたDNA配列。
【請求項７２】単離されたDNA配列の少なくとも１つの末端によってベク
ターに連結された、請求項７１に記載の単離されたDNA配列を含むベクター。
【請求項７３】単離されたDNA配列が、次のもの：配列番号４、配列番号
８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、または配列番号２４の少なく
とも１種に相補性の配列を含む、請求項７１に記載の単離されたDNA配列、また
はそれに対して相補性の単離されたDNA配列。
【請求項７４】単離されたDNA配列の少なくとも１つの末端によってベク
ターに連結された、請求項７３に記載の単離されたDNA配列を含むベクター。
【請求項７５】 BRCA2遺伝子に突然変異が存在するかどうか決定する方法
であって、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、また
は配列番号２４に相補性の配列、またはそれに対して相補性の単離されたDNA配
列、あるいは、リスト：C2192G、3772delTT、C5193G、5374del4、6495delGCまたは6909insGか
らの少なくとも１種の突然変異、のいずれかを含むBRCA2遺伝子の少なくとも１部を配列決定することを包含す
る、方法。