KR19990008221A - 정신분열증 진단방법 - Google Patents

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사비나자크
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Abstract

본 발명은 TH 유전자내 미소부수체 HUMTH01의 대립유전자 Ep의 존재유무의 시험관내 검출에 기초한, 정신분열증 진단방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 방법의 실행에 사용된 프라이머에 관한 것이다.

Description

정신분열증 진단방법
모든 부류의 반복 DNA 서열에서의 돌연변이의 존재는 알려진 현상이다. 그러나, 이들 돌연변이의 기능적 중요성은 알려져있지 않다. 즉, 미소부수체(microsatellite)는 반복 모티프(참조 1)의 수 및/또는 이들 모티프의 서열에서의 변화와 연관된 고도의 다형현상을 보이는 풍부한 계통의 반복 DNA 서열을 나타낸다. 이러한 이유로 해서, 이들 미소부수체는 유전자 지도 작도 및 병리에 관련된 좌의 동정을 위한 유전자 마커로서 사용되어 왔다(참조 2). 미소부수체의 상이한 대립유전자의 크기는 반복 모티프 수의 변화에 좌우된다. 즉, 반복 이량체에 대하여 수행된 서열분석 실험 결과 반복 모티프의 수와 이들의 서열에 있어서의 변화가 입증되었다. 이러한 변화는 특히, 염기서열에서의 중단이 없는 완전반복, 또는 (a) 결실(들) 또는 삽입(들)일 수 있는, 모티프 서열에 하나 이상의 중단을 지닌 불완전반복에 상응한다(참조 3). 이와 동일한 방식으로, 길이 및/또는 서열에서의 변화도 반복성 삼량체 또는 사량체 모티프에서 관찰되어 왔다. 따라서, 이러한 유형의 변화는 HUMHPRTB(참조 4) 및 HUMTH01(참조 5) 미소부수체에서 관찰되어 왔다.
본 출원인은 정신분열증과 연관된 유전적 변화에 대한 연구에 각별히 관심을 가져왔다. 이로해서, 본 출원인은 타이로신 하이드록실라제(TH)에 대한 유전자와 정신분열증간의 연관에 관한 연구를 수행하였으며, 이러한 연구는 특히 HUMTH01 미소부수체쪽으로 방향이 설정되어 왔다. TH는 카테콜아민 생합성 경로에서의 제한 효소이다. 정신병학적 및 신경학적 병리에 대한 각종 유전 연구가 TH 유전자에 자리잡고 있는 마커를 이용하여 수행되어 왔다(참조 6 및 7). 그러나, 현재까지는 정신분열증과의 유전적 연관에 대한 어떠한 증거도 문헌에 나와있지 않다.
HUMTH01 미소부수체는 타이로신 하이드록실라제 유전자의 제 1 인트론에 위치하고 있다. 이러한 미소부수체는 반복되는 사량체 TCAT 모티프로 이루어져 있다. 이는 특정 정도의 다형현상을 보이며, 다양한 수의 반복 모티프를 보유하는 상이한 대립유전자가 기술되어 있다. 가장 빈번히 조우하게 되는 대립유전자는 10개의 반복 모티프를 포함하고 있으며, CAT 서열을 지닌 제 5 반복 모티프에 하나의 염기쌍이 결실되어 있다.
본 출원인은 계속해서 HUMTH01 미소부수체에서의 서열 및 길이 변화의 존재를 찾아냄으로써 정신분열증에서의 TH 유전자의 관련여부를 검사하였다. 수득된 결과는 완전 대립유전자는 극히 희박하고 정신분열증 환자에서만 존재하였음을 보여주었다. 이들 결과는 상이한 인종 기원의 환자 집단에서도 동일하였다. 따라서, A, B, C, D, Ei 및 Ep로 명명된 6종의 상이한 대립유전자가 239명의 피검자로 이루어진 프랑스인 집단에서 검출되었고, 이중 94명이 정신분열증을 앓고 있었다. 이들 상이한 대립유전자는 하나의 단일 염기쌍이 상이한 2개의 최장 대립유전자를 제외하고는, 상호간에 4개의 염기쌍(1개의 완전한 모티프)이 상이하다. 이들 상이한 대립유전자를 서열분석한 결과 TCAT 서열을 갖는 HUMTH01 미소부수체의 반복 모티프가 각각 6개, 7개, 8개 및 9개의 반복 모티프를 함유하는 A, B, C 및 D 대립유전자에서 완전하게 반복되고 있음이 증명되었다. 한편, 10개의 반복 모티프를 포함하는 E 대립유전자는 대다수의 경우 제 5 반복 모티프에 하나의 티미딘이 동일하게 결실되었음을 보여준다. 이러한 결실로 인하여 (TCAT)4(CAT)(TCAT)5 서열을 갖고 Ei(불완전의 표시)로 명명되는 불완전 대립유전자를 초래한다. Ei 대립유전자는 카프카스인 집단에서 가장 빈번하게 발견되는 대립유전자이다(참조 5). 이와는 대조적으로, (TCAT)10 서열을 갖는 완전 E 대립유전자(Ep로 명명)는 극히 희박하다. 즉, 시험된 전 정신분열증 집단중에서 단지 5명의 환자만이 완전 대립유전자를 보유하였다. 수득된 결과는 예기치않게도 Ep 대립유전자를 지닌 모든 피검자가 정신분열증 환자인 반면에, 이러한 대립유전자는 145명의 건강한 대조군 피검자에는 존재하지 않음을 보여주었다(표 1 참조). 이러한 결과는 Ep 대립유전자의 존재와 정신분열증간에 매우 유의할만한 연관이 있음을 입증한다. 더욱이, Ep 대립유전자를 보유하는 5명의 정신분열증 환자는 임상적인 서브타입이 1명의 사례에서 편집증성 정신분열증, 3명의 사례에서 미분화 정신분열증 및 1명의 사례에서 혼란성 정신분열증인 정신분열증의 산발성 사례이다.
이어서, 본 출원인은 본 연구를 상이한 인종 기원의 다른 하나의 집단에까지 확장시켰다. 이에 따라, 유사한 연관 연구를 88명의 튀니지인 집단에 대하여 착수하였다. 수득된 결과는 시험된 튀니지인 집단에서 보이는 상이한 A-E 대립유전자의 빈도가 프랑스인 집단에서 관찰된 것과 상당히 상이함을 보여준다(표 1 참조). 그럼에도 불구하고, 단지 4명의 개인이 완전 Ep 대립유전자를 보유하고 있는 것으로 증명되었으며, 이들 개개인 모두는 정신분열증 환자였으며(1명은 편집증성 정신분열증이고 3명은 미분화 정신분열증); 정신분열증 형태는 이 경우에도 또한 산발성 형태였다.
이러한 결과는 TH와 정신분열증간의 연관에 대한 제 1 증거를 구성한다. 이들은 (TCAT)10 서열을 지닌 HUMTH01 미소부수체의 완전 Ep 대립유전자가 정신분열증과 상당히 연관될 수 있음을 명백히 보여주며 이러한 이유로 해서 이러한 유형의 병리를 선별하기 위한 유전적 도구를 나타낸다.
이러한 대립유전자와 정신분열증간의 연관에 대한 특이적인 특성은 산발성 조병-우울성 정신병을 앓고있는 100명의 환자로 이루어진 집단에 대한 연구에 의하여 확인되었다. Ep 대립유전자는 이들 환자 어느 누구에도 존재하지 않는 것으로 밝혀졌다.
이러한 대립유전자와 정신분열증간의 연관 증명은 진단 및 치료분야에의 다수의 적용을 제공한다. 따라서, 본 발명은 최초로, 더 이상은 임상적인 추론에 의하여 배타적으로가 아니라, 생물학적 시험에 의한 정신분열증의 진단 가능성을 제공한다. 본 발명의 요지의 일부는 더욱 상세히 말하여 TH 유전자내 HUMTH01 미소부수체의 Ep 대립유전자의 존재유무 검출에 있는 정신분열증 진단방법이다. 이러한 방법은 또한 특히, 분열기질성 사람, 분열병질인 사람 등과 같이 정신분열증 영역의 병리 진단에도 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명으로 해서 기준이 현재로는 단지 임상적 특징에 있는 이러한 병리 진단을 위한 기준을 정밀하게 할 수 있게된다. 더욱이, 본 발명은 이러한 Ep 대립유전자를 보유하고 있는 환자 가족에서의 유전적 취약성을 동정함에 의하여 이러한 유형의 정신병 장애에 대한 질병소질을 증명할 수 있게한다. 치료적 관점에서 볼 때, 본 발명은 유리하게는 정신분열증의 유형에 의하여 더욱 적절한 의학적 치료를 규정할 수 있게 한다. 카데콜아민 경로 개입의 가설을 확인함으로써, 본 발명은 더욱 표적화되는 요법을 사용가능하게 한다. 더욱이, 심지어는 Ep 대립유전자 존재의 기능적인 연루가 정확하게 정립되지 않았지만, HUMTH01 미소부수체가 TH의 4종의 동위형을 유도하는 교번적 스플라이싱이 입증된, TH 유전자의 제 1 인트론에 위치되어 있음이 주목된다(참조 8). 따라서, 이러한 영역에서의 유전적 변화가 TH 유전자의 발현 조절에 영향을 미치고 이러한 현상이 정신분열증의 출현과 결부됨이 가능하다.
본 발명은 정신분열증의 진단방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로 말해서, 본 발명은 정신분열증 환자에서 특이적으로 출현하는 특정 형태인, TH 유전자에 존재하는 반복 DNA 서열에 있어서의 변화 검출방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 정신분열증과 결부되어 있는 상기 반복 서열의 특이적 대립유전자의 검출에 사용될 수 있는 프라이머에 관한 것이다.
도 1: HUMTH01 미소부수체를 포함하는 TH 유전자의 제 1 인트론의 부분 서열도. 증폭 프라이머의 위치를 표시하였음.
도 2: HUMTH01 미소부수체의 Ep 대립유전자의 서열분석 설명도.
도 3: HUMTH01 미소부수체의 Ep 대립유전자의 겔 분리 설명도.
표 1: 정신분열증을 앓거나 앓지 않는 시험 집단에서의 HUMTH01 미소부수체의 대립유전자의 분포.
제 1 양태에 따라, 본 발명은 따라서 TH 유전자내 HUMTH01 미소부수체의 Ep 대립유전자의 존재유무를 시험관내에서 검출해 냄을 특징으로 하는, 정신분열증의 진단방법에 관한 것이다. (TCAT)10 서열을 갖는 이러한 대립유전자의 입증은 특정 정신분열증의 특징이다. 이러한 대립유전자가 사례의 대략 5%에서 직면하게 되므로, 이의 부재가 정신분열증의 존재를 배제하지는 않는다. 본 발명의 방법은 또한 정신분열증의 유전학적 특정화 및 정신분열증의 서브타이핑에도 적용될 수 있다. 전술한 바와 같이, Ep 대립유전자만이 산발성 정신분열증에 존재하는 것으로 보인다. 또한, 본 발명의 방법은 정신분열증에 대한 질병소질 증명에도 적용될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, Ep 대립유전자는 각종 기술로 검출해 낼 수 있다. 바람직하게 언급될 수 있는 사용가능한 기술은 서열분석, 겔 분리 또는 SSCP 기술이다.
당해 분야의 전문가에게 공지되어 있는 여타의 서열분석법도 사용될 수 있다. 특히, 자동화 DNA 서열분석기를 사용하는 것이 유리하다. 서열분석은 바람직하게는, 형광 프라이머를 사용하는 쇄 종결법에 의하여 이본쇄 주형상에서 수행된다. 이러한 목적에 적당한 키트는 Applied Biosystem(Applied Biosystem, Foster City, CA)로부터의 Tag Dye Primer 서열분석 키트이다. HUMTH01 미소부수체, 더 정확하게는 이러한 미소부수체를 함유하는 분리된 단편을 서열분석함으로써 해서 환자에 존재하는 대립유전자의 직접 동정 및 이에 따라 (TCAT)10 서열을 갖는 Ep 대립유전자의 존재 또는 부재 증명도 가능해진다. 서열분석에 의하여 수득된 결과를 예로서 도 2에 제시하였다.
Ep 대립유전자 증명을 위한 바람직한 기술은 겔상에서의 분리 기술이다. 이러한 기술은 DNA 단편의 서열분석이 필요없이 크기로서 상이한 대립유전자를 구별할 수 있게하는 장점이 있다. 이러한 기술은 변성 조건하, (바람직하게는 6%) 아크릴아미드겔내 변성 DNA 단편의 이동을 토대로 하다. 밴드는 예를 들면, 표지된 프라이머(특히, 인 상에서 γ 위치)의 사용, 시험 단편중으로의 α-dCTP 도입, 콜드 탐침의 α 사용 또는 에티듐 브로마이드를 사용한 가시화를 토대로 한 당해분야의 전문가에 공지된 여타의 기술 또는 방사능표지 탐침과의 하이브리드화(블롯팅)에 의하여 가시화시킬 수 있다. 겔 분리를 위한 특정 프로토콜은 예시로서 실시예에 제시된다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 이러한 기술로 말미암아 서열분석 없이 미소부수체의 A, B, C, D, Ei 및 Ep 대립유전자간을 신속히 구별가능하다. SSCP 동정기술 또한 비변성 조건하 아크릴아미드겔상에서의 분리를 수반하는 방법이다. 이러한 기술로 해서 형태로서 상이한 단편간을 구별할 수 있다.
환자로부터의 DNA 샘플에 대하여 본 발명의 방법을 수행한다. 이러한 샘플은 적어도 HUMTH01 미소부수체를 함유하여야 한다. 이는 바람직하게는 TH 유전자의 제 1 인트론의 전부 또는 일부를 함유한다. 더욱 바람직하게는, 이는 플랭킹 서열에 의하여 경계지워지는 HUMTH01 미소부수체를 함유하는 TH 유전자의 단편을 포함한다. 시험될 DNA 샘플은 환자로부터 취출되는 세포로부터 수득될 수 있다. 이들 세포는 바람직하게는, 혈액의 단순취출에 의하여 손쉽게 수득되는 혈구이다(예를 들면, 단핵구). 특히, 섬유아세포, 상피세포, 케라틴세포 등과 같은 기타 세포 유형도 사용될 수 있다. 이어서, DNA를 세포로부터 추출해내어 Ep 대립유전자 검출에 사용한다. 이를 위하여, 수득된 게놈 DNA를 예를 들면, 제한효소로 분해하고, 적당한 벡터중으로 클로닝하여 TH에 대하여 선별하거나, 또는 TH의 제 1 인트론에 상응하는 탐침과의 하이브리드화에 의하여 전술한 바와 같이 분석할 수 있다. 가장 바람직하게는, DNA 추출물을 HUMTH01 미소부수체를 함유하는 영역에 상응하는 물질의 상당량을 수득하기 위하여 하나 이상의 증폭반응에 초기에 투입한다. 증폭과정은 당해분야의 전문가에 공지된 여타 기술, 특히 소위 말하는 PCR 기술[폴리머라제-촉매 연쇄 반응, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350]에 의하여 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 증폭은 제조업자의 명세에 따라 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer Cetus)를 사용하여 수행될 수 있다. 증폭에 사용되는 온도와 배지 조건은 예를 들면 문헌[참조: Maniatis et al., 1989]에 기술된 바와 같은 일반적인 조건이다. 특정 조건 또한 실시예에 나타냈다. 본 발명을 이행하기 위하여, 크기가 충분히 작은 HUMTH01 미소부수체를 함유하는 DNA 단편을 사용하는 것이 유리하다. 이에 따라 유리하게는 서열분석으로 재분류할 필요없이 대립유전자간을 식별하는 것이 가능해진다. 더욱이, 대조군 서열분석 실험이 수행될 경우, 서열에 대하여 한정된 크기의 단편만을 구비하는 것이 바람직하다. 유리하게는, 사용되는 DNA 단편은 크기가 300 bp 이하인 증폭 단편이다. 이러한 단편은 도 1에 도시된 바와 같이, TH 유전자의 HUMTH01 미소부수체 및 플랭킹 서열을 함유한다. 더욱 바람직하게는, 증폭 단편은 200bp 이하를 포함한다. 크기가 160bp 이하, 심지어는 100bp 이하인 증폭 단편으로 특히 주목할만한 결과가 수득되었다. 이로 인하여, 본 발명은 또한 크기가 작고 MUMTH01 미소부수체를 함유하는 DNA 단편을 증폭시키는 것을 가능케하는 특정의 프라이머에 대해서도 기술한다. 따라서, 본 발명은 특히, 각각 192bp, 156bp 및 77bp의 단편을 증폭시키는 것이 가능한 3쌍의 프라이머에 대해서 기술한다. 이들 프라이머의 서열은 증폭 단편의 TH 유전자상의 위치와 서열로서 실시예에 제시되었다. 적어도 HUMTH01 미소부수체 및, 도 1에 도시한 서열로부터 유도되는 플랭킹 영역을 함유하는 300bp 이하의 단편을 증폭가능케 하는 여타의 프라이머도 본 발명의 일부를 형성한다. 유리하게는, 본 발명에 따른 프라이머는 길이가 10 내지 40량체, 바람직하게는 15 내지 30량체이다. 이들 프라이머의 서열은 증폭 단편의 크기, 미소부수체 주위에서의 이의 위치 및 프라이머의 선택된 길이에 따라, 도 1에 도시된 서열로부터 결정될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 프라이머는 당해분야의 전문가에 공지된 여타의 기술에 의하여, 특히 제조업자의 권장에 따라 Applied Biosystem 모델 394 합성기(Applied Biosystem, Foster City, CA)와 같은 자동화 DNA 합성기를 사용하여, 포스포라미다이트 화학을 이용함으로써(여기에서, 포스포라미다이트는 필요에 따라 시아노에틸 그룹에 의하여 β 위치에서 보호된다)[참조문헌:Sinha et al;, 1984, Giles 1985] 합성할 수 있다. 프라이머는 또한 당해분야의 전문가에 공지된 여타의 기술에 의하여 표지할 수 있다.
시험될 DNA 샘플은 게놈 DNA 또는 cDNA, 또는 동등하게는 RNA이다. 더욱 바람직하게는, 전술한 바와 같이 특이적 프라이머를 사용하여 증폭시킨 게놈 DNA 증폭 산물이다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같은 한쌍의 프라이머를 포함하는, Ep 대립유전자 검출용 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 유리하게는 정신분열증 진단용 키트이다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 정신분열증 영역의 질환을 검출하고 유전학적으로 특정화하는 유전학적 방법을 최초로 제공한다. 언급한 진단적인 적용과는 별도로, 본 방법은 또한, 특히 관련 질병에 따라 치료의 개선된 표적화와 연관되는 중요한 치료 가능성도 제공한다.
본 발명은 하기 실시예로 더욱 상세히 기술되며 이는 단지 예시에 불과하며 이로써 본 발명이 제한되지는 않는다.
1. DNA의 제조
혈액 샘플을 헤파린상으로 수집하여 단핵구를 피콜 하이팩(Ficoll hypaque) 구배(Pharmacia, Upsala, Sweden)상에서 분리한다. 이어서, DNA를 표준 기술을 사용하여 추출해낸다. DNA 직접 추출에 하기의 프로토콜을 사용한다:
수집된 혈액을 50㎖ 용량 튜브에 붓고 용해 완충액을 가하여 적혈구를 파열시킨다(용해 완충액 =1N 트리스/HCl 40㎖, pH 7.5 + 0.5M EDTA 20㎖ + milliQ H2O →2ℓ가 되도록), 최종 용량: 50㎖. 이어서, 현탁액을 4℃에서 15분간 2500 rpm의 속도로 원심분리하고; 상등액을 버린 다음 용해 완충액 50㎖를 1회 더 펠릿에 가한다. 동일작업(원심분리, 상등액의 제거 및 용해 완충액내 펠릿의 용해)을 2회 반복한다. 펠릿을 이러한 3회의 원심분리의 결말에 가서 회수한다.
이어서, 다음의 것들을 가한다: 용해 완충액 5㎖(최초 혈액 5㎖당)
20% 라우로일사코신 125㎕
프로테이나제 K 50㎕(20 ng/㎖)
생성되는 용액을 혼합하여 교반 수조내 55℃에서 밤새 둔다.
익일 아침, 95% 에탄올 2 용량을 가하고(5㎖ → 15㎖ 최종용량일 경우) 이어서 용액을 응집체가 형성될 때까지 뒤집어 침전시킨다. 이어서, DNA를 5㎖ 용량 튜브내 P1000 피펫(원추 말단이 절두된)을 사용하여 회수한다. 이어서, 80% 에탄올을 가하고 혼합물을 냉장고에 넣어둔다. 익일 아침에 에탄올을 교환해주고 이어서 알콜을 저녁에 제거한 다음 응집체를 방치하여 건조시킨다(튜브를 티슈상에 거꾸로 놓아둔다).
이어서, DNA를 1 x TE중에 용해시키며; 응집체의 크기에 따라, TE의 양은 200㎕ 내지 1㎖로 다양하다. 혼합물을 회전기상 37℃에서 밤새 방치하고 이어서 분광측정술로 DNA 농도를 측정한다.
2. 프랑스인 집단:
21 가족 사례를 포함하여, 기원이 상이하고 만성 정신분열증을 앓고 있는 94명의 환자(남성 62명 및 여성 32명, 평균 연령 42±12.3)를 연구하였다. 진료표에서 유도된 데이터 및 Table of affective Disorders and of Schizophrenic Anxiety(SADSLA, 참조 10) 불어판에 따른 직접 면담을 이용하여 DSM III 기준(참조 9)에 따라 진단을 처방한다. 임상적인 서브타입을 기술된 절차에 따라 각각의 환자에 할당한다. 어떠한 정신병적 장애도 보이지 않는 145명의 불명확성 대조군 피검자를 연구한다(남성 84명 및 여성 61명; 평균 연령 48±8.3).
3. 튀니지인 집단:
13 가족 사례를 포함하여, 기원이 상이하고 만성 정신분열증을 앓고 있는 44명의 환자(남성 33명 및 여성 11명, 평균 연령 37±8.2)를 연구하였다. 진료표에서 유도된 데이터를 이용하여 DSM IIIR 기준(참조 11)에 따라 진단을 처방한다. 이들 환자를 어떠한 정신병적 장애도 보이지 않는 44명의 비관련 대조군 환자와 비교한다(남성 37명 및 여성 7명; 평균 연령 35±5.9).
4. 증폭반응에 사용된 프라이머
증폭반응용의 표적화 주형은 대립유전자의 서열이 (TCAT) 4TCA (TCAT)5인, HUMTH01 미소부수체의 Ep 대립유전자로 이루어진다. 미소부수체는 알려져 있는 바와 같이 TH 유전자 서열의 1070번 위치에 위치하며 유전자은행에서 입수가능하다(No. D00269).
상이한 쌍의 프라이머를 PCR 증폭에 사용한다. 이들 프라이머쌍은 증폭 단편의 크기로서 하기에 제시하였다. TH 유전자의 서열상의 이들 프라이머의 위치를 도 1에 도시하였다(또한 서열번호 1 참조).
쌍 A:
1) 5′GGC AAA TAG GGG GCA AAA 3′(센스)(서열번호 1) 및
2) 5′TTA TCC AGC CTG GCC CAC 3′(안티센스)(서열번호 2).
예상된 증폭 길이는 192 bp이다.
쌍 B:
3) 5′GGC AAA TAG GGG GCA AAA 3′(센스)(서열번호 3) 및
4) 5′GGC TTC CGA GTG CAG GTC 3′(안티센스)(서열번호 4).
예상된 증폭 길이는 156 bp이다.
쌍 C:
5) 5′GTT CCT CCC TTA TTT CCC 3′(센스)(서열번호 5) 및
6) 5′AGG GAA CAC AGA CTC CAT 3′(안티센스)(서열번호 6).
예상된 증폭 길이는 77bp이다.
5. 증폭 반응용 프로토콜
PCR 반응에 사용된 혼합물은 최종 용량 15㎖중의 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조한 게놈 DNA 40ng, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 200mM, 각각의 프라이머 18pmol(100ng), 50mM KCl, 10mM 트리스/HCl(pH 8.5), 1.5mM MgCl 및 (a-32p)dCTP(Amersham, UK) 1.0mCi를 함유한다.
96℃에서 3분간 초기 변성시킨 후, 0.75 단위의 Taq 폴리머라제를 92℃에서 각각의 샘플(DNA+혼합물)에 가한다; 이 단계 뒤에 56℃에서 30″간의 하이브리드화, 72℃에서 30″간 연장반응 및 92℃에서 30″간 변성을 포함한 30 사이클이 뒤따른다.
6. 겔 분리
종결 용액(브로모페놀 블루 0.025 및 자일렌 시아놀 0.025, 및 탈이온화 포름아미드 0.95) 3㎕와 혼합된 PCR 반응산물 3㎕를 변성겔(6% 아크릴아미드/비스아크릴아미드 19:1)중으로 로딩한다. 전기영동 이동시킨 다음(2500 볼트, 55mA), 겔을 제거하여 건조시킨다. 이를 방사선촬영 XOMAT (Kodak) 필름과 함께 카세트에(스크린 강화없이) 넣고 주위온도에서 밤새 노출시킨다.
7. PCR-SSCP 반응용 프로토콜
본 반응은 하기 프로토콜에 따라 수 단계로 수행된다:
1- 이본쇄(α-32P-ATP의 사용) 또는 일본쇄(γ-32P-ATP로 프라이머 중 하나를 카이네이션)의 방사능 표지와 더불어 표적 DNA 서열(150 내지 200bp)의 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)증폭.
PCR 산물 중 하나를 로딩 완충액(80% 탈이온화 포름아미드, 50mM TBE, 1mM EDTA, 0.5% 자일렌 시아놀, 0.5% 브로모페놀 블루)과 혼합한다.
2- 96℃에서 3 내지 5분간 DNA 변성.
3- 녹고있는 얼음 중에서 샘플의 신속한 냉각.
4- 비-변성 폴리아크릴아미드겔(6% 아크릴/비스아크릴아미드 37.5:1, 0.5 x TBE)내 신속한 침착.
5- 4℃, 50W에서 또는 주위온도, 10W에서 전기영동 이동(겔중의 10% 글리세롤 사용).
6- 건조시킨 겔의 방사선촬영
프랑스인** 튀니지인
대립유전자 대조군피검자a 정신분열증 피검자b 대조군피검자a 정신분열증 피검자
A(tcat)6 54(18.6%) 40(21.3%) 20(22.7%) 18(20.5%)
B(tcat)7 54(18.6%) 43(22.9%) 20(22.7%) 20(22.7%)
C(tcat)8 38(13.1% 18(9.6%) 14(15.9%) 8(9.1%)
D(tcat)9 52(17.9%) 23(12.2%) 21(23.9%) 26(29.5%)
EI(tcat)4cat 92(31.8%) 58(30.8%) 13(14.8%) 12(13.6%)
Ep(tcat)10 0(0%) 6**(30.2%) 0(0%) 4(4.6%)
참조문헌 목록
서열목록
(1) 일반정보
(I) 출원인:
(A) 성명: 롱프랑 로라 소시에테 아노님
(B) 거리명: 아브뉴 레이몽 아롱 20
(C) 도시명: 앙토니
(E) 국가명: 프랑스
(F) 우편번호: 92165
(ii) 발명의 명칭: 정신분열증 진단방법
(iii) 서열수: 7
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체형: 테이프
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 운영 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 #1.30(EPO)
(2) 서열번호 1에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오타이드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D)위상: 선형
(ii) 분자형: cDNA
(iii)가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열번호 1:
(2) 서열번호 2에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오타이드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D)위상: 선형
(ii) 분자형: cDNA
(iii)가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(xi) 서열 기술:서열번호 2:
(2) 서열번호 3에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이: 18 염기쌍
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(ii) 분자형: cDNA
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(iv) 안티센스: 없음
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(2) 서열번호 4에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오타이드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D)위상: 선형
(ii) 분자형: cDNA
(iii)가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(xi) 서열 기술:서열번호 4:
(2) 서열번호 5에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오타이드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D)위상: 선형
(ii) 분자형: cDNA
(iii)가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(xi) 서열 기술:서열번호 5:
(2) 서열번호 6에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오타이드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D)위상: 선형
(ii) 분자형: cDNA
(iii)가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(xi) 서열 기술:서열번호 6:
(2) 서열번호 7에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이: 636 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오타이드
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D)위상: 선형
(ii) 분자형: cDNA
(iii)가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(xi) 서열 기술:서열번호 7:

Claims (16)

  1. TH 유전자내 HUMTH01 미소부수체의 Ep 대립유전자의 존재가 시험관내에서 검출됨을 특징으로 하는 정신분열증 진단방법.
  2. 제 1 항에 있어서, Ep 대립유전자가 서열분석 및/또는 겔 분리 및/또는 SSCP에 의하여 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, Ep 대립유전자가 겔 분리에 의하여 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 검출이 환자로부터 추출된 DNA상에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, DNA가 단핵구로부터 추출됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4 항 또는 5 항에 있어서, DNA가 검출에 앞서 증폭됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4 항에 있어서, 증폭된 DNA가 TH 유전자의 제 1 인트론 전부 또는 일부를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 증폭된 DNA가 크기가 300bp 이하이고 HUMTH01 미소부수체 및 플랭킹 서열을 함유하는 단편임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 증폭된 DNA가 크기가 200bp 이하, 바람직하게는 160bp 이하인 단편임을 특징으로 하는 방법.
  10. 적어도 HUMTH01 미소부수체 및 플랭킹 영역을 함유하는 300bp 이하 단편의 증폭을 가능하게 하는 프라이머쌍.
  11. 제 10 항에 있어서, 프라이머가 길이가 10 내지 40량체, 바람직하게는 15 내지 30량체임을 특징으로 하는 프라이머쌍.
  12. 제 11 항에 있어서, 프라이머 서열번호 1 및 2를 포함하는 쌍 A; 프라이머 서열번호 3 및 4를 포함하는 쌍 B; 및 프라이머 서열번호 5 및 6을 포함하는 쌍 C 중에서 선택됨을 특징으로 하는 프라이머쌍.
  13. 제 10 항에 따른 프라이머쌍을 포함하는, HUMTH01 미소부수체의 Ep 대립유전자 검출용 키트.
  14. 제 13 항에 있어서, 정신분열증 진단용 키트.
  15. 제 1 항에 있어서, 정신분열증을 유전학적으로 특정화하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 정신분열증에 대한 질병소질을 입증하는 방법.
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