PT826068E - "metodo de diagnostico de esquizofrenia" - Google Patents

Description

84 411 ΕΡ Ο 826 068/ΡΤ DESCRICÃO “Método de diagnóstico da esquizofrenia" O presente invento refere-se a um método de diagnóstico da esquizofrenia. Refere-se mais particularmente a um processo de detecção de variações numa sequência repetida de ADN presente no gene TH, do qual aparecem certas formas especificamente nos doentes esquizofrénicos. O invento refere-se igualmente a iniciadores utilizáveis para a detecção de alelos específicos desta sequência repetida, associados com a esquizofrenia. A presença de mutações em todas as classes de sequências repetidas de ADN é um fenómeno conhecido. Todavia o significado funcional destas mutações é indeterminado. Assim, os micro- -satélites representam uma classe abundante de sequências repetidas de ADN que apresentam um grande polimorfismo aliado a variações do número de motivos repetidos (ref. 1) e/ou da sequência destes motivos. Estes micro-satélites, por este razão, têm sido utilizados como marcadores genéticos para a construção de mapas genéticos e para a identificação de "loci" implicados nas patologias (ref. 2). O tamanho dos diferentes alelos de um micro-satélite depende de variações do número de motivos repetidos. Experiências de sequenciação de dímeros repetidos permitiram assim mostrar uma variação no número de motivos repetidos e na sua sequência. Estas variações podem corresponder nomeadamente a repetições "perfeitas", isto é, sem interrupções na sequência de bases, ou a repetições "imperfeitas", que contêm uma ou mais interrupções nas sequências de motivos quer se trate de delecções ou de inserções (ref. 3). Da mesma maneira, têm sido observadas igualmente variações de comprimento e/ou de sequência nos motivos triméricos ou tetraméricos repetidos. Assim foram observadas variações deste tipo nos micro-satélites HUMHPRTB (ref. 4) e HUMTH01 (ref. 5). A Requerente interessou-se mais particularmente na pesquisa de alterações genéticas ligadas à esquizofrenia. Para este efeito, a requerente realizou um estudo de associação entre o gene da tirosina-hidroxilase (TH) e a esquizofrenia, orientada mais particularmente para o micro-satélite HUMTH01. A TH é a enzima limitante da via de biossíntese das catecolaminas. Diferentes estudos genéticos das patologias psiquiátricas e neurológicas foram realizados usando marcadores

84 411 ΕΡ Ο 826 068/ΡΤ 2 localizados no gene ΤΗ (ref. 6 e 7). Contudo, até agora, não existe na literatura qualquer demonstração de uma associação genética com a esquizofrenia. O micro-satélite HUMTH01 está localizado no primeiro intrão do gene da tirosina-hidroxilase. Este micro-satélite é constituído por motivos tetraméricos TCAT repetidos. Apresenta um certo polimorfismo, tendo sido descritos diferentes alelos que possuem números de motivos repetidos variáveis. O alelo que se encontra mais vezes comporta 10 motivos repetidos e uma delecção de um par de bases no quinto motivo repetido, que comporta a sequência CAT. A Requerente examinou assim a implicação do gene TH na esquizofrenia, buscando a presença de variações de sequência e de comprimento no micro-satélite HUMTH01. Os resultados obtidos permitiram mostrar que o alelo perfeito era muito raro e estava presente unicamente nos pacientes esquizofrénicos. Estes resultados foram reproduzidos em populações de pacientes de origem étnica diferente. Assim, numa população francesa de 239 indivíduos dos quais 94 doentes com esquizofrenia foram detectados, 6 alelos diferentes designados por A, B, C, D, Ei e Ep. Estes diferentes alelos diferem uns dos outros em 4 pares de bases (1 motivo completo) com excepção dos dois mais compridos que diferem num único par de bases. A sequenciação destes diferentes alelos permitiu mostrar que o motivo repetido do micro-satélite HUMTH01, de sequência TCAT, está perfeitamente repetido nos alelos A, B, C e D, que contêm respectivamente 6, 7, 8 e 9 motivos repetidos. Pelo contrário, o alelo E, que comporta 10 motivos repetidos, apresenta na maioria dos casos a mesma delecção de uma timidina no quinto motivo repetido. Esta delcção dá lugar a um alelo imperfeito de sequência (TCAT)4(CAT)(TCAT)5, designado por Ei (porque imperfeito). O alelo Ei é o alelo mais frequente na população caucasiana (ref. 5). Pelo contrário, o alelo E perfeito de sequência (TCAT)10 (designado Ep) é muito raro. Assim, no conjunto da população de esquizofrénicos testada, só 5 doentes tinham o alelo perfeito. Os resultados obtidos mostram de maneira inesperada que todos os indivíduos portadores do alelo Ep são doentes esquizofrénicos, enquanto que este alelo está ausente em 145 testemunhos sãos (ver tabela 1). Estes resultados demonstram uma associação altamente significativa entre a presença do alelo Ep e a esquizofrenia. Além disso os 5 pacientes esquizofrénicos portadores do alelo Ep são casos esporádicos de esquizofrenia cujo subtipo clínico é uma esquizofrenia paranoica num caso, uma esquizofrenia indiferenciada em 3 casos e uma esquizofrenia desorganizada em 1 caso.

84 411 ΕΡ Ο 826 068/ΡΤ 3 A Requerente em seguida alargou este estudo a uma outra população de origem étnica diferente. Assim foi empreendido um estudo de associação semelhante numa população de 88 tunisinos. Os resultados obtidos mostram que a frequência dos diferentes alelos A-E encontrados na população tunisina testada é significativamente diferente da observada na população francesa (ver tabela 1). Contudo, somente 4 indivíduos mostraram ser portadores do alelo perfeito Ep, sendo todos doentes esquizofrénicos (1 esquizofrenia paranoica e 3 esquizofrenias indiferenciadas) sendo as formas, também neste caso, formas esporádicas.

Estes resultados constituem a primeira demonstração de uma associação entre a TH e a esquizofrenia. Mostram claramente que o alelo perfeito Ep do micro-satélite HUMH01 de sequência (TCAT)10 pode ser associado de maneira significativa à esquizofrenia e constitui por este facto uma ferramenta genética para o rastreio deste tipo de patologia. A especificidade da associação deste alelo com a esquizofrenia foi também confirmada por um estudo numa população de 100 pacientes afectados de psicose maníaco-depressiva esporádica. A presença do alelo Ep não foi detectada em qualquer destes pacientes. A revelação da associação entre este alelo e a esquizofrenia tem numerosas aplicações, no domínio do diagnóstico e da terapêutica. Assim, o presente invento proporciona agora, pela primeira vez, a possibilidade de diagnosticar a esquizofrenia por meio de um teste biológico e já não somente por meio de argumentos clínicos. Um objecto do presente invento reside mais particularmente num método de diagnóstico da esquizofrenia que consiste em detectar a presença do alelo Ep do micro-satélite HUMTH01 no gene TH. Este método é aplicável igualmente ao diagnóstico das patologias do espectro da esquizofrenia, tais como nomeadamente a esquizotipia, os indivíduos esquizóides, etc. O invento permite assim afinar os critérios de diagnóstico destas patologias, que actualmente são de natureza unicamente clínica. Além disso, o invento permite igualmente revelar predisposições para este tipo de perturbação psiquiátrica, através da identificação de uma vulnerabilidade genética nas famílias de pacientes portadores deste alelo Ep. Do ponto de vista terapêutico, o invento permite vantajosamente definir tratamentos médicos mais apropriados em função do tipo de esquizofrenia. Confirmando a hipótese de uma implicação da via das catecolaminas, o invento

84 411 ΕΡ Ο 826 068/ΡΤ permite utilizar terapias mais precisas. Além disso, se as implicações funcionais da presença do alelo Ep não estão estabelecidas definitivamente, deve-se notar que o micro-satélite HUMTH01 está localizado no primeiro intrão do gene TH, região na qual foi demonstrado um entrosamento alternativo que conduz a quatro isoformas do TH (ref. 8). É portanto possível que variações genéticas nesta região afectem a regulação da expressão do gene TH e que isto esteja ligado ao aparecimento da esquizofrenia.

Segundo um primeiro aspecto, o invento refere-se portanto a um método de diagnóstico da esquizofrenia caracterizado pela detecção in vitro da presença do alelo Ep do micro-satélite HUMTH01 no gene TH. A revelação deste alelo, de sequência (TCAT)10, é característica de certas esquizofrenias. A ausência deste alelo não exclui a existência de esquizofrenia, sendo este alelo encontrado em cerca de 5% dos casos. O processo do invento é aplicável igualmente à caracterização genética de esquizofrenias e à sub-tipificação de esquizofrenia. Como acima se indicou, o alelo Ep só parece estar presente nas esquizofrenias esporádicas. O processo do invento é aplicável igualmente para revelar a predisposição para a esquizofrenia.

No processo do invento, a detecção do alelo Ep pode ser realizada através de diferentes técnicas. Entre as técnicas utilizáveis podem ser citadas preferencialmente a sequenciação, a separação sobre gel ou ainda a técnica de SSCP ("single strand conformation polymorphism").

Em referência à sequenciação, qualquer método conhecido dos peritos na arte pode ser aplicado. Nomeadamente é vantajoso utilizar um sequenciador automático de ADN. A sequenciação é efectuada preferivelmente sobre matrizes de cadeia dupla pelo método de terminação de cadeias utilizando iniciadores fluorescentes. Um estojo apropriado para este efeito é o estojo de sequenciação Taq Dye Primer Kit da Applied Biosystem (Applied Biosystem, Foster City, CA). A sequenciação do micro-satélite HUMTH01 ou, mais precisamente de um fragmento isolado portador deste micro-satélite, permite conhecer directamente o alelo presente no paciente e assim revelar ou não a presença do alelo Ep de sequência (TCAT)10. Os resultados obtidos por sequenciação estão apresentados, por exemplo, na figura 2. 84 411 ΕΡ Ο 826 068/ΡΤ 5

Uma técnica preferida para determinar o alelo Ep é a separação sobre gei. Esta técnica tem a vantagem de permitir a discriminação entre os diferentes alelos em função do seu tamanho sem que seja preciso sequenciar os fragmentos de ADN. Esta técnica baseia-se na migração, em condição desnaturante, dos fragmentos de ADN desnaturados num gel de acrilamida (de preferência a 6%). A revelação das bandas pode ser realizada por qualquer técnica conhecida dos peritos na arte, baseada por exemplo no emprego de iniciadores marcados (nomeadamente em τ sobre fosforo), sobre a introdução de α-dCTP nos fragmentos testados, sobre o emprego α (alfa) de sondas frias, sobre uma revelação com brometo de etídio ou ainda por hibridação (“blot”) com uma sonda radiomarcada. Um protocolo preciso de separação sobre gel é dado a título de ilustração nos exemplos. Como está indicado na figura 3, esta técnica permite, rapidamente e sem sequenciação, distinguir entre os alelos A, B, C, D, Ei e Ep do micro-satélite.

Em referência à técnica de identificação por SSCP trata-se igualmente de um método de separação sobre gel de acrilamida mas em condição não desnaturante. Esta técnica permite discriminar os diferentes fragmentos em função da sua conformação (ver exemplos). O processo do invento é realizado sobre uma amostra de ADN do paciente. Esta amostra deve conter pelo menos o micro- -satélite HUMTH01. Contém preferencialmente a totalidade ou parte do primeiro intrão do gene TH. Ainda mais preferivelmente, contém um fragmento do gene TH que contém o micro-satélite HUMTH01 flanqueado por sequências flanqueadoras. A amostra de ADN a testar pode ser obtida a partir de células colhidas do paciente. Trata-se preferivelmente de células sanguíneas (células mononucleadas, por exemplo) que são facilmente obtidas por simples recolha de sangue. Outros tipos celulares podem ser utilizados tais como nomeadamente os fibroblatos, as células epiteliais, os queratinócitos, etc. O ADN é extraído em seguida das células e utilizado para a detecção do alelo Ep. Para isso, o ADN genómico obtido pode ser digerido por enzimas de restrição, clonado em vectores apropriados, seleccionado quanto ao TH por exemplo ou por hibridação com uma sonda correspondente ao primeiro intrão de TH e depois analisado como acima de descreveu. De maneira realmente preferida, o ADN extraído é submetido previamente a uma ou mais reacções de amplificação para se obter uma quantidade importante de material correspondente à região portadora do micro-satélite HUMTH01. A amplificação pode ser realizada por qualquer técnica 84 411 ΕΡ Ο 826 068/ΡΤ 6 -)

conhecida dos peritosos na arte e nomeadamente pela técnica denominada PCR [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Sience 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. e Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350]. A este respeito a amplificação pode ser efectuada utilizando um "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) conforme as especificações do fabricante. As condições de temperatura e de meio utilizadas para a amplificação são as condições gerais tais como descritas por exemplo por Maniatis e outros, 1989. Também são dadas nos exemplos condições específicas. Para pôr em prática o presente invento, é vantajoso utilizar um fragmento de ADN portador do micro-satélite HUMTH01 de tamanho suficientemente pequeno. Isto permite vantajosamente uma discriminação entre os alelos sem ser preciso recorrer à sequenciação. Além disso se são realizadas experiências de controlo da sequenciação, é preferível igualmente ter de sequenciar somente fragmentos de tamanho limitado. Vantajosamente, o fragmento de ADN utilizado é um fragmento amplificado com um tamanho inferior a 300 pb. Este fragmento possui o micro-satélite HUMTH01 e sequências flanqueadoras do gene TH, tais como representadas na figura 1. Ainda mais preferivelmente, o fragmento amplificado inclui menos de 200 pb. Foram obtidos resultados particularmente notáveis com fragmentos amplificados com um tamanho inferior a 160 pb e mesmo a 100 pb. Para este efeito, o presente invento descreve igualmente iniciadores específicos que permitem a amplicação de fragmentos de ADN de pequeno tamanho portadores do micro- -satélite HUMTH01. Assim, o invento descreve particularmente três pares de iniciadores que permitem a amplificação dos fragmentos de 192 pb, 156 pb e 77 pb, respectivamente. A sequência destes iniciadores é dada nos exemplos, bem como a sequência e a posição sobre o gene TH do fragmento amplificado. Qualquer outro iniciador que permite a amplificação de um fragmento de pelo menos 300 pb portador, pelo menos, do micro-satélite HUMTH01 e uma região flanqueadora, derivada da sequência apresentada na figura 1, faz parte igualmente do presente invento. Vantajosamente, os iniciadores de acordo com o invento têm um comprimento compreendido entre 10 e 40 mero e, preferivelmente, entre 15 e 30 mero. A sequência destes iniciadores pode ser determinada a partir da sequência dada na figura 1, em função do tamanho do fragmento amplificado, da sua localização em torno do micro-satélite e do comprimento escolhido dos iniciadores.

Os iniciadores utilizados no âmbito do invento podem ser sintetizados de acordo com qualquer técnica conhecida dos peritos na arte, e nomeadamente utilizando a química dos fosforamiditos, eventualmente protegidos em β por um

84 411 ΕΡ Ο 826 068/ΡΤ 7 grupo cianoetilo (Sinha et al., 1984, Giles 1985), com um sintetizador automático de ADN tal como o sintetizador Applied Biosystem modelo 394, (Applied Biosystem, Foster City, CA), de acordo com as recomendações do fabricante. Os iniciadores também podem ser marcados por meio de qualquer técnica conhecida dos peritos na arte. O pedido de patente W094/03640 descreve um par de iniciadores (SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 63) que podem permitir a amplificação de um segmento de ADN genómico que contém o micro- -satélite HUMTH01. A amostra de ADN a testar pode ser um ADN genómico, um ADNc ou igualmente um ARN. Trata-se, mais preferivelmente, do produto de amplificação do ADN genómico amplificado por meio de iniciadores específicos tais como os descritos anteriormente.

Um outro objecto do invento refere-se a um estojo de detecção do alelo Ep que inclui um par de iniciadores como os referidos anteriormente. Este estojo é vantajosamente um estojo de diagnóstico da esquizofrenia.

Conforme indicado anteriormente, o presente invento fornece pela primeira vez um método genético de detecção e de caracterização genética das doenças do espectro da esquizofrenia. Além das aplicações mencionadas em diagnóstico, este método oferece igualmente potencialidades terapêuticas importantes, associadas nomeadamente com uma melhor precisão do tratamento em função da afecção em questão. O presente invento vai ser descrito em detalhe com o auxílio dos exemplos que seguem, os quais devem ser considerados como ilucidativos e não limitativos.

Lista das Figuras

Fiaura 1 : Sequência de uma parte do primeiro intrão do gene TH que inclui o micro-satélite HUMTH01. A posição dos iniciadores de amplificação está indicada.

Fiaura 2 : Evidenciação por sequenciação do alelo Ep do micro- -satélite HUMTH01.

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Figura 3: Evidenciação por separação sobre gel do alelo Ep do micro-satélite HUMTH01.

Tabela 1: Distribuição dos alelos do micro-satélite HUMTH01 nas populações testadas, atingidas ou não pela esquizofrenia.

EXEMPLOS 1. Preparação do ADN

As amostras de sangue foram colhidas sobre heparina e as células mononucleadas isoladas sobre gradiente Ficoll hypaque (Pharmacia, Upsala, Suécia). O ADN foi extraído em seguida de acordo com técnicas padrão. Para uma extracção directa do ADN, foi utilizado o protocolo seguinte: O sangue recolhido foi vasado em tubos de 50 ml e tampão de lise foi adicionado para fazer rebentar as hemácias (TAMPÃO DE LISE = 40 ml de TRIS HCI 1N pH 7,5 + 20 ml de EDTA 0,5M + H20 miliQ qsp 2 L), volume final: 50 ml. A suspensão é em seguida contrifugada durante 15 min a 2500 rpm a 4°C; o sobrenadante é retirado e 50 ml de tampão de lise são adicionados novamente ao sedimento. A mesma operação (centrifugação, eliminação do sobrenadante, retomada do sedimento no tampão de lise) é repetida duas vezes. No final destas 3 centrifugações, o sedimento é recuperado.

Junta-se então: 5 ml de tampão de lise (para 5 ml de sangue à partida) 125 μΙ de laurilsarcosiio a 20% 50 μΙ de proteínase K (20 ng/ml) A solução obtida é misturada e posta em banho maria agitando-se a 55°C durante a noite.

Na manhã do dia seguinte, 2 volumes de etanol a 95% são adicionados (se 5 ml -> 15 ml terminal) e depois a solução é precipitada por inversão até à formação de um floco. O ADN é então recuperado por meio de uma pipeta P1000 (com a ponta do cone cortada) num tubo de 5 ml. Junta-se em seguida etanol a 80% e põe-se a mistura num frigorífico. Na manhã do dia seguinte o etanol é

84 411 ΕΡ Ο 826 068/ΡΤ 9 mudado e, à tarde, o álcool é retirado e deixa-se secar o floco (o tubo é poisado invertido sobre kleenexR). O ADN é então retomado com TE 1X; conforme a grossura do floco, a quantidade de TE varia de 200 μΙ a 1 ml. Deixa-se toda a noite sobre a máquina rotativa a 37°C e depois a concentração do ADN é determinada por espectrometria. 2. População francesa

Foram estudados 94 pacientes de origens diferentes, atacados de esquizofrenia crónica (62 homens e 32 mulheres, com uma média de idades de 42+/-12,3) incluindo 21 casos familiares. O diagnóstico foi formulado de acordo com o critério DSM III (ref. 9) utilizando os dados provenientes das tabelas médicas e entrevista directa de acordo com a tradução francesa da Tabela de Perturbações Afectivas e da Ansiedade Esquizofrénica (SADSLA, ref. 10). A cada doente foi atribuído um sub-tipo clínico conforme o procedimento descrito. Foram estudadas 145 testemunhas não aparentadas (84 homens e 61 mulheres; média de idades 48+/-8,3) que não apresentavam qualquer perturbação psiquiátrica. 3. População tunisina

Foram estudados 44 pacientes de origens diferentes, atacados de esquizofrenia crónica (33 homens e 11 mulheres, média de idades 37+/-8,2) incluindo 13 casos familiares foram estudados. O diagnóstico foi formulado de acordo com o critério DSM IIIR (ref. 11) utilizando os dados provenientes das tabelas médicas. Estes pacientes foram comparados com 44 pacientes de controlo, sem laços entre eles (37 homens e 7 mulheres; média de idades 35+/-5,9) que não apresentavam qualquer perturbação psiquiátrica. 4. Iniciadores utilisados nas reacções de amplificação A matriz visada para as reacções de amplificação é composta pelo alelo Ep no micro-satélite HUMTH01, cuja sequência é (TCAT)4TCA(TCAT)5. O micro-satélite está localizado na posição 1070 da sequência do gene TH tal como publicada e acessível no Genebank (n° D00269).

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Diferentes pares de inibidores foram utilizados para a amplificação por PCR. Estes pares são dados abaixo bem como o tamanho do fragmento amplificado. A posição destes iniciadores sobre a sequência do gene TH é dada na figura 1 (ver igualmente SEQ ID n° 1).

Par A: 1) 5' GGC AAA TAG GGG GCA AAA 3' (sentido) (SEQ ID n° 1) e 2) 5' TTA TCC AGC CTG GCC CAC 3' (anti-sentido) (SEQ ID n° 2), O comprimento de amplificação previsto é de 192 pb.

Par B 3) 5' GGC AAA TAG GGG GCA AAA 3' (sentido) (SEQ ID n° 3) e 4) 5' GGC TTC CGA GTG CAG GTC 3’ (anti-sentido) (SEQ ID n° 4). O comprimento de amplificação previsto é de 156 pb.

Par C 5) 5' GTT CCT CCC TTA TTT CCC 3' (sentido) (SEQ ID n° 5) e 6) 5' AGG GAA CAC AGA CTC CAT 3' (anti-sentido) (SEQ ID n° 6). O comprimento de amplicação previsto é de 77 bp. 5. Protocolo das reacções de amplificação A mistura utilizada para a reacção de PCR contém: 40 ng de ADN genómico preparado de acordo com o exemplo 1, 200 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 18 pmole (100 ng) de cada iniciador, 50 mM de KCI, 10 mM de Tris-HCI (pH 8,5), 1,5 mM de MgCI e 1,0 mCi (a-32P) dCTP (Amersham, RU) num volume final de 15 ml.

Após uma desnaturação inicial de 3 min. a 96°C, 0,75 unidades de Taq Polimerase são adicionadas a cada amostra (ADN+mix) a 92°C e este passo é

84 411 ΕΡ Ο 826 068/ΡΤ 11 seguido por 30 ciclos que compreendem uma hibridação durante 30s a 56°C, um alongamento durante 30s a 72°C e uma desnaturação 30s a 92°C. 6. Separação sobre gel

Três microlitros do produto da reacção de PCR misturados com 3 microlitros de "stop solution" (0,025 de azul de bromofenol e 0,025 de xilenocianol, 0,95 de formamida desionizada) são carregados num gel desnaturante (6% de Acrilamida/Bisacrilamida 19:1). Após migração electroforética (2500 volt, 55 mA), o gel é desmoldado e seco. É posto numa cassete (sem alvo amplificador) com uma película XOMATR (Kodak) para autorradiografia e é exposto durante a noite à temperatura ambiente.

7. Produto para a reaccão de PCR-SSCP

Esta reacção foi realizada em vários passos conforme o protocolo seguinte: 1 - Amplificação por PCR (Polymerase Chain Reaction) da sequência alvo de ADN (150-200 pb) com marcação radioactiva de duas cadeias (utilização de a32P-ATP) ou de uma só cadeia (quinação de um dos iniciadores com τ32Ρ-ΑΤΡ).

Um ml de produto PCR é misturado com 2,5 ml de tampão de carga (80% de formamida desionizada, 50 mM de TBE, 1 mM de EDTA, 0,5% de Xileno-Cianol, 0,5% de Azul de Bromofenol). 2 - Desnaturação do ADN a 96°C durante 3-5 min. 3 - Arrefecimento rápido das amostras em gelo fundente. 4 - Depósito rápido num gel não desnaturante de poliacrilamida (6% Acril/Bisacrilamida 37,5:1,0,5X TBE). 5 - Migração electroforética a 4°C e 50W ou à temperatura ambiente e a 10W (com 10% de glicerol no gel). 6 - Autorradiografia do gel seco. 12 84 411 ΕΡ Ο 826 068/ΡΤ TABELA 1

FRANÇA** TUNÍSIA ALELO CONTROLOS3 ESQUIZOFRÉNICOS11 CONTROLOS3 ESQUIZOFRÉNICOS A(tcat)6 54 (18,6%) 40 (21,3%) 20 (22,7%) 18(20,5%) B(tcat)7 54 (18,6%) 43 (22,9%) 20 (22,7%) 20 (22,7%) C(tcat)8 38 (13,1%) 18(9,6%) 14(15,9%) 8(9,1%) D(tcat)9 52 (17,9%) 23 (12,2%) 21 (23,9%) 26 (29,5%) El(tcat)4cat(tcat)5 92 (31,8%) 58 (30,8%) 13 (14,8%) 12 (13,6%) Ep(tcat)10 0 (0%) 6** (03,2%) 0 (0%) 4 (4,6%) (Segue Lista de Referências)

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Lista de Referências 1. Weber e outros, Am J. Hum. Genet. 44 (1989) 388 2. Hearne e outros, Trends Genet. 8 (1992) 288 3. Weber e outros, Genomics 7 (1990) 524 4. Edwards e outros, Genomics 12 (1992) 241 5. Purs e outros, Am. J. Hum. Genet. 53 (1993) 953 6. Craddock e outros, Ann. of Medecine 25 (1993) 317 7. Leboyere outros, Lancet 335 (1990) 1219 8. Grima e outros, Nature 326 (1987) 707 9. American Psychiatric Association, Diagnostic and Statistical Manual of mental disorders (3a edição) - Washington, DC = APA (1980). 10. Fyer e outros, Anxiety Disorders clinic, New York : New-York State Psychiatric Institute (1985). 11. American Psychiatric Association, Diagnostic and Statistical Manual of mental disorders (3a edição revista) - Washington, DC = APA (1987).

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÕES GERAIS:

(i) REQUERENTE (A) NOME: RHONE-POULENC RORER S.A.

(B) RUA: 20, avenue Raymond ARON

(C) CIDADE: ANTONY

(E) PAÍS: FRANÇA (F) C/DIGO POSTAL: 92165

(ii) TÍTULO DO INVENTO: MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DA ESQUIZOFRENIA (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 7 (iv) FORMA LEGÍVELVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE SUPORTE: fita (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Release # 1.0, Versão #1.30 (OEB) (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) NÚMERO DE CADEIAS: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: 18

GGCAAATAGG GGGCAAAA 15 84 411 ΕΡ Ο 826 068/ΡΤ (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) NÚMERO DE CADEIAS: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2

TTATCCAGCC TGGCCCAC (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) NÚMERO DE CADEIAS: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3 GGCAAATAGG GGGCAAAA (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) NÚMERO DE CADEIAS: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear 84 411 ΕΡ Ο 826 068/ΡΤ 16

(Η) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: 18

GGCTTCCGAG TGCAGGTC (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) NÚMERO DE CADEIAS: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: GTTCCTCCCT TATTTCCC 18 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) NÚMERO DE CADEIAS: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: AGGGAACACA GACTCCAT 18 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 17 84 411 ΕΡ Ο 826 068/ΡΤ (A) COMPRIMENTO: 636 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) NÚMERO DE CADEIAS: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

CGCCCTCCCC TACCCTCCCC CACCAGGCTC CCCATC AAATCCATCC AAAAAATCCA AGATGGCCAG 60 CC'7' ac^ccc \ CCTGCCCCTG 120 OOk» — OO w « OO TTGGGGAGGC AGoov—wAAGG 130 TGGGGGGTCC TGGGCAAATA GGGGGCAAAA 240 CCCATTGGCC TGTTCCTCCC 300 ATGGAGTCTG TGTTCCCTGT 360 GACTGTGTGG GCCAGGCTGG ATAATCGGGA 420 GCACTCAGAA CCTTGGGCTC 480 TGGACCTTGA TTGAAATGTG GTGTGAGTTG 340 GGACACAGGG CGCCCTCCCC CGTCCTCCCC 600 CCCATC 636

Lisboa, 29. ASO. 2000

Por AVENTIS PHARMA S.A. -O AGENTE OFICIAL-

Claims (16)

1. 84 411 ΕΡ Ο 826 068/ΡΤ 1/2

   REIVINDICAÇÕES 1 - Método de diagnóstico da esquizofrenia caracterizado pelo facto de que se detecta in vitro a presença do alelo Ep do micro-satélite HUMTH01 no gene TH.
2. 2 - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de que a detecção do alelo perfeito Ep é realizada por sequenciação e/ou por separação sobre gel e/ou por SSCP.
3. 3 - Método de acordo com a reivindicação 2 caracterizado pelo facto de que a detecção do alelo perfeito Ep é realizada por separação sobre gel.
4. 4 - Método de acordo com uma das reivindicações anteriores caracterizado pelo facto de que a detecção é realizada sobre o ADN extraído do paciente.
5. 5 - Método de acordo com a reivindicação 4 caracterizado pelo facto de que o ADN é extraído a partir de células mononucleadas.
6. 6 - Método de acordo com as reivindicações 4 ou 5 caracterizado pelo facto de que o ADN é amplificado antes da detecção.
7. 7 - Método de acordo com a reivindicação 4 caracterizado pelo facto de que o ADN amplificado inclui a totalidade ou parte do primeiro intrão do gene TH.
8. 8 - Método de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo facto de que o ADN amplificado é um fragmento com um tamanho inferior a 300 pb portador do micro-satélite HUMTH01 e sequências flanqueadoras.
9. 9 - Método de acordo com a reivindicação 8 caracterizado pelo facto de que o ADN amplificado é um fragmento com um tamanho inferior a 200 pb e, preferivelmente, inferior a 160 pb.
10. 10 - Par de iniciadores que permite a amplificação de um fragmento de menos de 200 pb portador, pelo menos, do micro-satélite HUMTH01 e de uma região flanqueadora. 84 411 ΕΡ Ο 826 068/ΡΤ 2/2
11. 11 - Par de iniciadores de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo facto de que os iniciadores têm um comprimento compreendido entre 10 e 40 mero, preferivelmente entre 15 e 30 mero.
12. 12 - Par de iniciadores de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo facto de que é escolhido o par A que comporta os iniciadores SEQ ID n° 1 e 2, o par B que comporta os iniciadores SEQ ID n° 3 e 4 e o par C que comporta os iniciadores SEQ ID n° 5 e 6.
13. 13 - Estojo de detecção do alelo perfeito Ep do micro- -satélite HUMTH01 que compreende um par de iniciadores de acordo com a reivindicação 10.
14. 14 - Estojo de acordo com a reivindicação 13 para o diagnóstico da esquizofrenia.
15. 15 - Método de caracterização genética de esquizofrenias caracterizado pelo facto de que se detecta in vitro a presença do alelo perfeito Ep do micro-satélite HUMTH01 no gene TH.
16. 16 - Método para revelar a predisposição para a esquizofrenia caracterizado pelo facto de que se detecta in vitro a presença do alelo perfeito Ep do micro-satélite HUMTH01 no gene TH. Lisboa, 29. 2GOO Por AVENTIS PHARMA S.A.