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Die Erfindung betrifft Sequenzvarianten
des für
neuropsychiatrische Krankheiten verantwortlichen Genbereichs des
Gens 22444 (also auch des 5'- bzw.
3'-terminalen Bereichs mit den entsprechenden Expressionskontrollregionen)
bzw. im engeren Sinne des transkribierten oder in noch engerem Sinne
des translatierten Bereichs des Gens 22444, d.h. 22444-Sequenzen
mit sogenannten Polymorphismen, Verwendungen entsprechender Sequenzen
sowie Derivate derartiger erfindungsgemäßer Sequenzen, wie beispielsweise
Vektoren oder Expressionskonstrukte oder entsprechend transfizierte
Zellen, weiterhin Verfahren zur Diagnose und/oder Ermittlung von
Prädispositionen
für Krankheiten,
die mit Sequenzvarianten des 22444-Gens oder des 22444-Genbereichs
verbunden sein können.
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Schizophrenie und bipolar affektive
Störungen
wurden historisch als nicht-überlappende
nosologische Einheiten mit unterschiedlichen klinischen Charakteristika,
einem einheitlichen Behandlungsspektrum und verschiedenen (wenn
auch unbekannten) Ätiologien
angesehen.
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Bei schizophrenen Erkrankungen handelt
es sich um eine Gruppe von Syndromen, die sich in massiven Störungen des
Denkens, der Stimmung und des allgemeinen Verhaltens sowie einem
ungenügenden
Filtern von Stimuli manifestieren. Momentan basiert die Diagnose
von Schizophrenie auf der Ausprägung
einer Anzahl von Verhaltenscharakteristika über einen Zeitraum von wenigstens
sechs Monaten. Bei diesen Verhaltenscharakteristika handelt es sich
um langsam fortschreitende soziale Abgrenzung, die oftmals mit einer
Vernachlässigung
der Körperpflege
verbunden ist, um den Verlust der Grenzen der eigenen Persönlichkeit
einschließlich
der Unfähigkeit
sich selbst als abgegrenzte Einheit wahrzunehmen, um den Verlust
gedanklicher Assoziationsfähigkeit,
mit der oftmals ein verlangsamter Denkprozeß und ein sprunghaftes Wechseln
von Thema zu Thema einhergeht, um autistische Eingeschlossenheit
in die eigene Gedankenwelt und häufig
sexuelle oder religiöse
Fixiertheit, um akustische Haluzinationen einer oft herabsetzenden
Art und um Wahnvorstellungen, wobei es sich häufig um Größen- oder Verfolgungswahn handelt.
Häufige
zusätzliche
Anzeichen sind: Abflachung der Persönlichkeit und schnell wechselnde
Veränderungen
des Gemütszustands
unabhängig
von den äußeren Umständen; Hypersensibilität in Bezug
auf Umwelteinflüsse
mit dem Gefühl
einer erhöhten
Sinneswahrnehmung; schwankendes oder wechselndes Verhalten, das
mit der externen Umgebung nicht übereinstimmt;
dingliches Denken mit der Unfähigkeit
zur Abstraktion; unangebrachter Symbolismus; gestörte Konzentrationsfähigkeit,
die durch Halluzinationen und Wahnvorstellungen noch verschlechtert
wird; Entpersonalisierung, wobei der Mensch sich wie ein außenstehender
Beobachter seiner eigenen Handlungen verhält.
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Eine auf diesen Verhaltensmustern
basierende Diagnose einer schizophrenen Krankheit kann daher relativ
willkürlich
sein und wird durch soziokulturelle Faktoren und durch – die verschiedenen
psychiatrischen Schulen beeinflußt. Gegenwärtig existiert kein Laborverfahren,
das eine Diagnose von Schizophrenie bestätigen könnte.
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Bipolar affektive Störungen,
auch als manisch-depressive Krankheit bekannt, umfassen Zyklen von Manie
und Depression. Anzeichen und Symptome einer Manie sind: Extreme
Gereiztheit und Unruhe; exzessive euphorische Gefühle; ein
länger
anhaltender Zeitraum mit einem Verhalten, das von dem üblichen
Verhalten abweicht; erhöhte
körperliche
Aktivität,
Rastlosigkeit, rasende Gedanken und schnelles Sprechen; herabgesetztes
Schlafbedürfnis;
unrealistischer Glaube an die eigenen Fähigkeiten und Kräfte; uncharakteristisch schlechte
Urteilskraft; erhöhte
sexuelle Aktivität;
Mißbrauch
von Drogen, insbesondere von Kokain, Alkohol und Schlafmitteln;
widerliches, provozierendes oder aufdringliches Verhalten und das
Verleugnen der Tatsache, daß irgendetwas
nicht stimmt. Anzeichen und Symptome einer Depression sind: hartnäckige Traurigkeit, ängstliche
oder leere Stimmung; Gefühl
der Hoffnungslosigkeit oder Pessimismus; Schuldgefühle, Gefühl der Wertlosigkeit
oder Hilflosigkeit; Verlust des Interesses oder des Vergnügens an
gewohnten Aktivitäten;
verminderter Antrieb, Gefühl
der Ermüdung
oder der Trägheit;
Schwierigkeiten sich zu konzentrieren, sich zu erinnern und Entscheidungen
zu treffen; Rastlosigkeit und Gereiztheit; Schlafstörungen;
Appetit- und Gewichtsverlust oder Gewichtszunahme; chronische Panik
oder andere anhaltende körperliche
Symptome, die nicht durch physische Krankheiten verursacht sind;
Gedanken an Tod oder Suizid.
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Den meisten manisch-depressiven Menschen
kann durch Behandlung geholfen werden. Allerdings wird die Krankheit
der manischen Depression, die momentan ausschließlich basierend auf ihren Symptomen diagnostiziert
wird, häufig
weder durch den Patienten noch durch Verwandte, Freunde oder sogar Ärzte erkannt.
Werden bipolar affektive Störungen
nicht behandelt, so verschlimmern sie sich und die Person erfährt Zeiträume voll
ausgeprägter
Manie und klinischer Depression.
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Es wurden bereits mehrere Gene isoliert
und sequenziert, die mit bipolar affektiven Störungen in Verbindung gebracht
werden. Die
US 5 866 412 ,
die
US 5 914 394 , die
US 5 939 316 und die
US 5 955 355 offenbaren
die Säugergene
fsh15w6, fsh16, fsh22 bzw. fsh05, die mit bipolar affektiven Störungen in
Zusammenhang stehen. Das Säuger-Gen
22444 wird mit neuropsychiatrischen Krankheiten wie Schizophrenie,
schizoaffektive Krankheiten oder ernste Gemütskrankheiten einschließlich bipolarer
affektiver Störung
und wiederholter unipolarer Stö rung
in Verbindung gebracht, und zwar auf Grund sog. familiärer genetischer
Kopplungsanalyseentwickeln. Diese Gen wurde in der chromosomalen
Region 18p11.2 lokalisiert.
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Der vorliegenden Erfindung liegt
die Aufgabe zugrunde, Sequenzvarianten (Polymorphismen) im genetischen
Profil von betroffenen bzw. als Kontrollpersonen dienenden Individuen
aufzufinden, die – jeweils
für sich
betrachtet oder in Kombination, zu einem der vorgenannten mit dem
22444-Gen verbundenen neurologischen Pathologien führen können. Diese
Polymorphismen können
eingesetzt werden, um ein verbessertes Diagnostizierverfahren oder
Verfahren zur Ermittlung von Prädispositionen
für neuropsychiatrische
Krankheiten aufzufinden und insbesondere die bisher auf Krankheitssymptome
beschränkte
Diagnose in den labortechnischen Bereich zu erweitern.
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Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß ein Zusammenhang
zwischen der Ausprägung
neuropsychiatrischer Krankheiten und der genetischen Konstitution
der Patienten besteht. Die erfindungsgemäße Erkenntnis beruht auf der
Feststellung, daß für die humane
22444-Gensequenz bzw. für
den das 22444-Gen einschließenden
Genbereich, der durch 1 definiert
ist, Sequenzvarianten existieren, deren Frequenz bei Menschen mit
neuropsychiatrischen Krankheitsbildern deutlich gegenüber gesunden
Kontrollpersonen erhöht ist.
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Unter 22444-Genbereich wird die Region
gemäß 1 verstanden, die insgesamt
10500 Nukleotide umfaßt
und die Promotor-Region sowie die codierende Region (in 1 in Großbuchstaben, beginnend mit Nukleotid
4754, endend mit Nukleoid 5104) einschließt. In diesem bereich liegen
auch die entsprechenden Kontrollbereiche der Expressionsregulation,
bspw. „Enhancer-„ oder „Silencer"-Elemente.
Unter dem 22444-Gen wird im engeren Sinne in der vorliegenden Erfindung
der transkribierte Abschnitt verstanden (beginnend mit Nukleotid
3759 gemäß 1, Startbase des cDNA-Klons).
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Der vorliegende Erfindungsgegenstand
löst die
vorgenannte Aufgabe in einem ersten Schritt dadurch, daß erfindungsgemäß Sequenzvarianten
(Polymorphismen) gegenüber
der Referenzsequenz des 22444-Gens gemäß 1 zur Verfügung gestellt werden. Diese
Sequenzvarianten (Polymorphismen) des 22444-Genbereichs stellen
einen Indikator für
das Auftreten von neuropsychiatrischen Krankheiten dar und erlauben
somit eine Labordiagnose, die sich durch eine gegenüber einer
auf reiner Symptomatik beruhenden Diagnose deutlich erhöhte Sicherheit
auszeichnet. Die erfindungsgemäßen Polymorphismen
sind in Tabelle 1 (Bestandteile A, B und C) dargestellt und entsprechend
ihrer durchlaufenden Numerierung gemäß 1 in den grau unterlegten Abschnitten
der Tabelle 1 angegeben. Hierbei handelt es sich um Polymorphismen
an den Positionen (jeweils gemäß 1) 2144 (G→T) (Polymorphismus
1), 2147 (T→C)
(2), 2202 (C→A)
(3), 2226 (G→A)
(4), 2253 (A→G)
(5), 2350 (G→A)
(6), 2413 (T→G)
(7), 2827 (G→C)
(8), 2982 (G→A)
(9), 3036 (A→G) (10),
3472 (T→C)
(11), 3635 (T→C)
(12), 3711 (A→G)
(13), 3971 (G→A)
(14), 3974 (A→G)
(15), 4100 (A→C)
(16), 4278 (T→C)
(17), 4306 (A→G)
(18), 4748 (C→T)
(19), 4757 (G→A)
(20), 4941 (A→G)
(21), 5039 (C→T)
(22), 5390 (G→A)
(23), 5421 (G→C)
(24), 5521 (G→C)
(25) und 5584 (G→C)
(Polymorphismus 26) (s. auch Tabelle 1A). Insgesamt handelt es sich
um 26 Polymorphismen, die nach der Position ihres Auftretens in 1 erfindungsgemäß von 1
bis 26 durchnumeriert sind.
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Darüber hinaus werden gemäß der vorliegenden
Erfindung die folgenden Varianten an den Positionen 2208 (T→G) (27),
2588 (A→G)
(28), 3791 (G→A)
(29), 3911 (C→T)
(30), 4785 (G→T)
(31) und 5333 (G→A)
(32) als Polymorphismen 27 bis 32 bezeichnet (s. Tabelle 1 C).
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Die vorliegende Erfindung offenbart
als weiteren Gegenstand solche DNA-Sequenzen von einer Länge von
mindestens 10, bevorzugt 15 Nukleotiden, weiter vorzugsweise von
mindestens 20 Nukleotiden, weiter bevorzugt von mindestens 30 und
ganz besonders bevorzugt von mindestens 50 Nukleotiden Länge, die
sich als Abschnitte aus der Sequenz gemäß 1 ergeben, wobei diese erfindungsgemäßen Nukleotid-Sequenzen
mindestens einen der Polymorphismen 1 bis 26 oder 27 bis 32 gemäß Tabelle
1 bzw. obiger Offenbarung enthalten müssen. Ein solche erfindungsgemäße Nukleotid-Sequenz
von erfindungsgemäßer Länge stimmt also
mit einem Abschnitt einer Referenzsequenz aus 1 überein,
weist in ihrer Sequenz allerdings mindestens eine Position mit einem
der Polymorphismen 1 bis 26 oder 27 bis 32 auf. Vorzugsweise ist
der Polymorphismus in einer solchen erfindungsgemäßen Nukleotid-Sequenz
mindestens 3, weiter bevorzugt mindestens 5 und noch stärker bevorzugt
mindestens 10 Nukleotide vom 5' und mindestens 3, vorzugsweise mindestens 5
und stärker
bevorzugt mindestens 10 Nukleotide vom 3'-Ende entfernt. Als Beispiele
für erfindungsgemäße Nukleotid-Sequenzen seien die
folgenden genannt: 5'-ACAGGGCGAAACCC -3' (Polymorphismus 2 an Position
2147 (T⇒C),
unterstrichen), 5'-GATGGTGAACACCTGT-3'
(Polymorphismus 3 an Position-2202 (C⇒A), unterstrichen) oder 5'-CTCATGAATTCCAA-3'
(Polymorphismus 20 an Position 4757 (G⇒A), unterstrichen. Derartige
erfindungsgemäße Sequenzen – wie auch
die zuvor genannten erfindungsgemäßen Sequenzen – sind insbesondere
als Probenreagens oder zur Herstellung eines Mittels, das als Probenreagens
Verwendung finden kann, geeignet. Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Sequenzen
als Probenreagens dann, wenn ihre Hybridisierung mit anderen Sequenzen
durch Detektionsverfahren nachweisbar ist. Daher sind insbesondere
radioaktiv markierte erfindungsgemäße Sequenzen oder mit einer
Photo- oder Fluoreszenzmarkierung oder mit Enzymen, die eine detektierbare
Reaktion katalysieren, versehene erfindungsgemäße Sequenzen als Probenreagens
bevorzugt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden daher auch
derartig markierte, beispielsweise mit Fluorescein, Rhodamin, 125I, 14C oder Meerettich-Peroxidase
markierte, erfindungsgemäße Sequenzen
offenbart. Ein weiteres Einsatz- oder Verwendungsgebiet erhalten
die vorliegenden erfindungsgemäßen Sequenzen
als PCR-Primer, wobei sie in diesem Fall vorzugsweise eine Sequenzlänge von 10
bis 50, vorzugsweise von 12 bis 30 Nukleotide, aufweisen.
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Ganz besonders bevorzugt sind die
vorgenannten erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen
mit mindestens 10 AS Länge
und mindestens einem erfindungsgemäßen Polymorphismus (im übrigen übereinstimmend
mit der korrespondierenden Referenzsequenz gemäß 1 im 5'- oder 3'-Bereich, ausgehend von
der Position eines der 26 bzw. 32 Polymorphismen) dann, wenn sie
einen Polymorphismus des codierenden Bereichs enthalten, also mindestens
einen der folgenden Polymorphismen umfassen: Polymorphismus 20 an
Position 4757 (G (Nukleotid aus der Referenzsequenz)-→A (Sequenzvariante)),
Polymorphismus 21 an Position 4941 (A→G) und/oder Polymorphismus
22 an Position 5039 (C→T).
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Die erfindungsgemäßen Polymorphismen an den ausgewählten Sequenzpositionen
können
in Alleinstellung auftreten, d.h. eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz entspricht
dem Referenzspektrum für
die gemäß 1 dargestellte DNA-Sequenz
und weist nur einen der Polymorphismen 1 bis 26 oder 27 bis 32 auf. Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind aber auch alle Kombinationen der
gemäß Tabelle
1A aufgelisteten Polymorphismen, d.h. alle Möglichkeiten 2, 3 oder 4 dieser
Polymorphismen beliebig zu kombinieren. Diese Kombinationen von
Polymorphismen weisen an allen übrigen
Positionen die gemäß 1 dargestellte Sequenz auf.
In Hinblick auf die erfindungsgemäßen Referenzsequenzvarianten
für eine
Zweierkombination der 26 erfindungsgemäßen Polymorphismen ergeben
sich also beispielsweise 325 verschiedene Kombinationsmöglichkeiten.
Vorzugsweise weisen erfindungsgemäße 22444-DNA-Sequenzen 2 der
Polymorphismen 1 bis 26 gemäß Tabelle
1A, stärker
bevorzugt mindestens 3 und ganz besonders bevorzugt mindestens 4
dieser Polymorphismen auf.
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Darüber hinaus kann mindestens
einer der Polymorphismen 1 bis 26 auch in Kombination mit mindestens
einem der Polymorphismen 27 bis 32 auftreten.
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Ganz besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Nukleotidsequenzen
dann, wenn sie eine Sequenz aufweisen, die sich entweder von Position
3759 bis mindestens Position 5104 oder weiter distal bzw. von Position
4754 bis mindestens Position 5104 oder weiter distal erstreckt und
mindestens eine, vorzugsweise aber Kombinationen von in diesem Bereich
liegenden Polymorphismen aufweist/aufweisen.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind die zu den vorgenannten erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
mit mindestens 10 Nukleotiden Länge
komplementären
oder entsprechenden RNA-Sequenzen. Diese weisen also ebenfalls auf
der RNA-Ebene mindestens einen Polymorphismus (beispiels weise mindestens
einen der Polymorphismen 1 bis 26 oder 27 bis 32 gemäß Tabelle
1A/B/C gegenüber
der in der 1 angegebenen
Referenzsequenz) auf.
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Zur Lösung der Aufgabe gehören weiterhin
DNA-(Expressions-)Vektoren oder entsprechende DNA-Konstrukte mit
einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz
oder einer erfindungsgemäßen Nukleotid-Sequenz,
sowie mit diesen Genen, Vektoren oder Konstrukten transfizierte
Zellen und deren Abkömmlinge.
Unter Abkömmlingen
der transfizierten Zellen wird in diesem Zusammenhang auch ein die
entsprechenden erfindungsgemäßen, gegenüber der
Referenzsequenz mindestens einen erfindungsgemäß identifizierten Polymorphismus
enthaltenden Sequenzen enthaltendes transgenes Tier verstanden,
insbesondere eine Maus, Ratte, Schwein, oder Pferd.
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Unter Vektoren beziehungsweise Konstrukten
werden in diesem Zusammenhang meist ringförmige Moleküle von DNA verstanden, bei
denen verschiedene funktionelle Einheiten, beispielsweise Strukturelemente,
Promotoren, regulierende Elemente, Enhancer, Resistenzgene, insbesondere
Antibiotika-Resistenz-Gene, und/oder
Aktivatoren, welche beispielsweise für die Expression, Transfektion
oder Selektion wirksam sind, aneinandergekoppelt sein können. Mit
derartigen Vektoren können
beispielsweise eukaryontische Zellen mittels Gentransfer transfiziert
werden, die wiederum eine (Teil-)Lösung der Aufgabe bilden.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist darauf zurückzuführen, daß die erfindungsgemäßen Sequenzen,
d.h. erfindungsgemäße Sequenzvarianten
(ebenso wie erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukte
oder erfindungsgemäße Oligo
oder Polypeptide) mit Polymorphismen (auf dem DNA- oder dem AS-Niveau),
als Arzneimittel oder als Diagnosemittel bzw. als Mittel zur Ermittlung
von Prädispositionen
bspw. in vitro in Betracht kommen. Für derartige Verwendungszwecke
eignen sich insbesondere PCR-Methoden, insbesondere auch RT-PCR-Verfahren,
also die Diagnose auf der Basis von mRNA, die in vitro entsprechend
in cDNA übersetzt
wird und dann mit Hilfe von herkömmlichen
PCR-Verfahren vervielfältigt
wird. Auch entsprechende Array-Techniken, die erfindungsgemäße Oligonukleotide
auf einem Chip positionieren, erlauben die Dia gnostik mit Hilfe
von Hybridisierungsreaktionen. Hierbei wird die Patientenprobe gegen
einen Array mit erfindungsgemäßen Oligonukleotiden,
die die erfindungsgemäßen Polymorphismen
einschließen,
getestet. Positive Signale auf dem Array bei Oligonukleotiden, die
mit neuropsychiatrischen Störungen
gekoppelte Polymorphismen aufweisen, lassen eine entsprechende Diagnose
zu.
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Schließlich kann die Diagnose auch
mit Hilfe von Antikörpern
erfolgen, die spezifisch die mit der Krankheit verbundenen erfindungsgemäßen Polymorphismen
erkennen können,
bspw. Antikörper
gegen entsprechende erfindungsgemäße Nukleotid-Sequenzen des
22444-Genbereichs oder deren erfindungsgemäße Genprodukte. Auch derartige
Antikörper
(monoklonal, polyklonal oder polyklonal-monospezfisch) sind Gegenstand der vorliegenden
Erfindung. Geeignete Testsysteme können bspw. aber auch ELISA-
oder RIA-Verfahren oder die Gelelektrophorese sein. Als weitere
Methode zur Diagnose von Sequenzvarianten können die Patientenproben auch
durch Massenspektrometrie (MALDI-TOF) bestimmt werden.
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Damit wird auch die Verwendung von
erfindungsgemäßen Sequenzen
zur Behandlung von Patienten mit neuropsychiatrischen Krankheiten
und die Verwendung von erfindungsgemäßen Sequenzen zur Herstellung
eines Arzneimittels, das zur Behandlung von Patienten mit neuropsychiatrischen
Krankheiten verwendet wird, offenbart. Insbesondere ist an einen
Einsatz derartiger erfindungsgemäßer Sequenzen
im Rahmen gentherapeutischer Konzepte zu denken. Erfindungsgemäß offenbart
werden auch Zusammensetzungen, die erfindungsgemäße Sequenzen neben weiteren
pharmazeutisch verfügbaren
Hilfs- oder Zusatzstoffen enthalten. Besonders bevorzugt liegen
die erfindungsgemäßen Sequenzen
in Lösung
vor, beispielsweise in einer für
intramuskuläre,
subkutane oder intravenöse
oder intraarterielle Injektionen geeigneten Lösung, vorzugsweise Kochsalzlösung. Die
oben für
die erfindungsgemäßen Sequenzen
beschriebenen Anwendungen zu therapeutischen Zwecken gelangen auch
bei Vektoren oder Konstrukten und deren Abkömmlingen zur Anwendung, insbesondere
bei der Behandlung der vorgenannten neuropsychiatrischen Erkrankungen,
Störungen
oder Pathologien. Dies gilt auch für erfindungsgemäße transfizierte
Zellen und deren Abkömmlinge,
die eine erfindungsgemäße Sequenz,
die als Sequenzvariante mindestens einen der Polymorphismen Polymorphismen
der 22444-Sequenz gemäß 1 aufweist, beziehungsweise
die von diesen erfindungsgemäßen Sequenzen
abgeleitete Vektoren oder Konstrukte enthalten.
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Derartige Vektoren oder Konstrukte
können
beispielsweise auch weitere Gene und ggf. deren Regulationssequenzen
oder artifizielle vektorspezifische Regulationssequenzen, insbesondere
einen geeignet induzierbaren Promotorbereich, enthalten. Erfindungsgemäß kann jedoch
auch eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt werden, die zwei
oder mehr Vektoren oder Expressionskonstrukte umfaßt, wobei
neben dem erfindungsgemäßen Vektor
oder Expressionskonstrukt auch separat mindestens ein Vektor oder
ein Expressionskonstrukt enthalten ist.
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Erfindungsgemäße Sequenzen können aber
auch zur Herstellung von Mitteln für diagnostische Anwendungszwecke
insbesondere in vitro, aber auch in vivo zum Einsatz kommen. Insbesondere
werden erfindungsgemäße Sequenzen
zur Bestimmung von patientenspezifischen Therapiekonzepten Anwendung
finden.
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Damit sind im Rahmen der vorliegenden
Erfindung auch Verfahren zur in vitro Bestimmung von Patienten mit
neuropsychiatrischen Krankheiten mitoffenbart, ggf. auch zur in
vivo Bestimmung. Typischerweise werden hierzu Patientenproben entnommen,
beispielsweise Hautzellen, Haarzellen, Speichel- oder Blutproben,
und das Probenmaterial nach den dem Fachmann geläufigen Verfahren aufbereitet,
unter entsprechend stringenten Bedingungen eine Hybridisierungsreaktion
ausgeführt,
und schließlich
nach einem oder mehreren Waschschritten die Hybridisierungsreaktion
detektiert. Eine derartige Detektion kann beispielsweise chromatographisch,
insbesondere säulenchromatographisch,
ggf. durch HPLC-Methoden, durch Ankopplung von erfindungsgemäßen Sequenzen
mit charakteristischen Polymorphismen an ein Säulenresin, anschließenden Durchfluß von aufbereitetem
Patientenmaterial unter entsprechend stringent gewählten Hybridisierungsbedingungen
und abschließender
Elution durchgeführt
werden.
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Ganz besonders bevorzugt sind in
diesen Zusammenhang jedoch alle dem Fachmann geläufigen in situ Methoden, wobei
die erfindungsgemäßen Sequenzen – wiederum
unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen zur Patientenprobe in
situ hinzugegeben werden.
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Die vorliegende Erfindung stellt
auch Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Nukleotid-Sequenzen, die
also mindestens einen Polymorphismus aufweisen und eine Teilsequenz
aus dem 22444-Genbereich gemäß
1 darstellen, bereit. Im
Rahmen dieses Verfahrens kommen alle dem Fachmann geläufigen Methoden
der Molekularbiologie bzw. Gentechnologie in Betracht, die geeignet
sind, der Herstellung, Modifikation und/oder Detektion von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
zu dienen und beispielsweise in vivo, in situ oder in vitro ausgeführt werden
können.
Zu denken ist an Verfahren der chemischen Synthese oder an PCR-Verfahren,
wie bei Innis et al. (PCR Protocols: A guide to Methods and Applications,
vollinhaltlich Bestandteil der vorliegenden Offenbarung) offenbart.
Durch entsprechende PCR-Primer, beispielsweise durch Primer wie
in der
EP 534 858 offenbart,
können
neue Funktionen eingefügt
werden, beispielsweise Restriktionsschnittstellen, Terminationscodons
etc. Derartige zusätzliche
Funktionen sind insbesondere von Vorteil, wenn hierdurch deren Qualität zum Transfer
in Klonierungsvektoren entsprechend sichergestellt werden kann.
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Erfindungsgemäße DNA-Sequenzen können daher
auch als Bestandteile von Nukleinsäurekonstrukten auftreten, wobei
neben den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
in derartigen Konstrukten auch Regulationselemente, wie z.B. Promotorbereiche
oder gesamte Promotoren (bspw. vom nativen 22444-Gen selbst oder
aus einem anderen bakteriellen oder eukaryotischen, ggf. humanen
Promotorbereich), Silencer und/oder Enhancer, vorliegen können. Diese
Regulationselemente können
am 3'- und/oder am 5'-Ende einer erfindungsgemäßen polymorphen DNA-Sequenz
auftreten, ggf. durch infunktionelle Sequenzbereiche untereinander
und/oder von der erfindungsgemäßen polymorphen
DNA-Sequenz getrennt sein. Bei diesen Regulationselementen im Konstrukt
kann es sich um native Regulationsbereiche handeln oder auch um
Regulatoren anderer Gene oder anderer Wirtsorganismen, beispielsweise
um Promotoren der Hefe oder bak terieller Promotoren. Unter den Promotoren
sind beispielsweise der cos-, lac-, trc- ara-, gal-, IPR- oder tet-Promotor
als für ein
Nukleinsäurekonstrukt
geeignet zu nennen.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegende
Erfindung ist ein Oligopeptid oder ein Polypeptid, das eine (Teil)sequenz
der gemäß 2 angegebenen Aminosäuersequenz
aufweist, wobei ein erfindungsgemäßes Oligo- oder Polypeptid
wenigstens eine der ebenfalls in 2 angegebenen
Modifikationen aufweist und in den übrigen Positionen mit der Referenzsequenz
(Ref) identisch ist. Damit handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen
um Genproduktvarianten oder um Varianten von Fragmenten des Genprodukts
des 22444-Gens mit
wenigstens einem Polymorphismus. Fragmente weisen wenigstens 10
Aminosäuren
auf, wobei vorzugsweise die Sequenzvariante(n) nicht an randständiger Position
eines erfindungsgemäßen Oligo-
oder Polypeptids liegen. Die erfindungsgemäßen Oligo- oder Polypeptide
weisen wenigstens eine der beiden folgenden Modifikationen auf:
An Position 2 ist der Aspartatrest durch einen Asparaginrest ersetzt und
an Position 63 ist der Glutaminrest durch einen Argininrest ersetzt.
Jede dieser Modifikationen der erfindungsgemäßen Oligo- oder Polypeptide
ist auf einen Polymorphismus des 22444-Gens zurückzuführen. Die Modifikation an Position
2 des Proteins wird zum Beispiel durch die Sequenzvariante des 22444-Gens
bedingt, bei der an Position 219 im Unterschied zur Referenzsequenz
auf DNA-Ebene das Nukleotid G anstelle des Nukleotids A aufscheint
(Polymorphismus 20 gemäß Tabelle
1). Hierdurch kommt es zu einer Codonveränderung, die auch einen Aminosäureaustausch
nach sich zieht (Asp→Asn).
Herstellungsverfahren für
diese Aminosäuresequenz
sind nach Maßgabe
aller im Rahmen der Gentechnologie denkbaren Verfahren durchführbar, insbesondere
nach Expression der zugrundeliegenden und im Rahmen der vorliegenden
Offenbarung gleichfalls beanspruchten DNA-Sequenz in einem bakteriellen
oder eukaryotischen Wirtszellsystem, beispielsweise nach Transfektion
eines entsprechenden Konstrukts oder Vektors, insbesondere Plasmidvektors,
in das Wirtszellsystem, und nachfolgender Isolierung des Proteins
aus den Wirtszellen oder vorzugsweise aus dem Überstand mit einem oder mehr
vorzugsweise nachfolgenden Reinigungsschritt(en), beispielsweise
chromatographisch, ggf. verbunden mit einer pro teolytischen Spaltung,
falls das erfindungsgemäße Oligo-
oder Polypeptid als Bestandteil eines Vorläuferproteins exprimiert wird.
Das zugrundeliegende Nukleinsäurekonstrukt
wird dann Sequenzen aufweisen, die für geeignete proteolytische
Schnittstellen an den 5'- und/oder 3'-Grenzen einer erfindungsgemäßen Oligo- oder Polypeptidsequenz
liegen.
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Ganz besonders bevorzugt sind solche
Polypeptide, die mindestens 90 AS umfassen und einem Abschnitt der
Aminosäuresequenz
gemäß 2 entsprechen, allerdings
an der Position 2 (gemäß Referenzsequenz)
und/oder an der Position 83 (gemäß Referenzsequenz
von 2) den (die) Polymorphismus
(men), also einen Asparagin- und oder einen Argininrest aufweist.
Noch stärker
bevorzugt sind Polypeptide mit Vollänge (gemäß 2), also mit 116 AS und mindestens einem
der beiden vorgenannten Polymorphismen.
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Bevorzugt sind weiterhin auch solche
Polypeptide, die an der AS-Position 95 (gemäß Referenzsequenz in 2) enden, bedingt durch
einen Polymorphismus auf der Nukleinsäureebene, der ein Stoppsignal an
Position 96 hervorruft. Damit ergeben sich bevorzugte Oligopeptide,
die mindestens einen der beiden vorgenannten Polymorphismen aufweisen
und an Position 95 (Ser) ihren C-Terminus aufweisen.
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Als weitere Gegenstände der
vorliegenden Erfindung werden ein Kit zur Durchführung eines erfindungsgemäßen in vitro
Verfahrens zur Bestimmung der therapeutischen Ansprechbarkeit von
Patienten mit einer neuropsychiatrischen Krankheit auf eine entsprechende
Medikation, ebenso wie ein Biochip, der zur Durchführung eines
solchen Verfahrens dient, offenbart.
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Schließlich umfaßt die vorliegende Erfindung
auch Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffsubstanzen; beispielsweise
organischen Verbindungen, einschließlich Biomolekülen, insbesondere
Oligonukleotiden, bei dem (a) ein in vitro Testsystem bereitgestellt
wird, das mindestens eine 22444-DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis
3 enthält,
(b) in Form eines Hochdurchsatz"Screenings" potentielle Wikstoffsubstanzen dem
gemäß (a) bereitgestellten
in vitro Testsystem zugeführt
werden, und (c) ein physikalisches, chemisches oder biologisches
Signal in dem Testsystem zur Identifikation von Wirkstoffsubstanzen
detektiert wird. Auf diese Weise kann die jeweilige Wirksamkeit
einer potentiell therapeutisch geeigneten Substanz nach Maßgabe der
polymorphen 22444-Genstruktur
ermittelt werden. Ein erfindungsgemäßes Verfahren ist insbesondere
geeignet, die Aktivität
eines Promotors oder des transkribierten und translatierten Proteins
einer erfindungsgemäßen 22444-DNA-Sequenz
unter dem Einfluß von
Testsubstanzen zu untersuchen. Chemische Bibliotheken können durchsucht
werden, und zwar sowohl nach aktivierenden oder inhibierenden Substanzen.
In diesem Zusammenhang wird auf die Offenbarung des Lehrbuchs von
Böhm, Klebe
und Kubinyi (Wirkstoffdesign, 1996, Spektrum-Verlag, Heidelberg)
verwiesen, auf das diesbezüglich
vollinhaltlich Bezug genommen wird. Insbesondere können derartige
Testsubstanzen geeignet sein, die sich in einem erfindungsgemäßen verfahren als
wirksam erweisen, das Expressionsniveau des 22444-Gens beeinflussen.
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Weiterhin können erfindungsgemäße DNA-Sequenzen
auch Verwendung in Zusammenhang mit anti-sense Technologien finden,
also in Form von anti-sense
DNA oder RNA in Zellen eingeschleust werden und auf diese Weise
durch komplementäre
Bindung transkribierter mRNA die Translation der dazu gehörigen polymorphen
genomischen Sequenz blockieren, insbesondere bei Patienten das Expressionsniveau
von Sequenzvarianten, die krankheitsursächlich sein können, ändern.
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Neben den erfindungsgemäßen Polymorphismen
werden erfindungsgemäß auch weitere
Veränderungen
gegenüber
der in 1 beschriebenen
Referenzsequenz des 22444-Genbereichs offenbart, die im Zusammenhang
mit den vorgenannten neurologisch-psychiatrischen Erkrankungen stehen.
So finden sich in der Patientengruppe die Insertion der Base T zwischen
Position 2164 und 2165, eine Insertion der Base A zwischen Position
3670 und 3671, die Deletion der Base A an Position 5337, die Deletion
der Basen AG an den Positionen 4148 und 4149 und die Deletion von
5 A-Basen an den Positionen 2331 bis 2335. Die in Tabelle 1A (bzw.
Tabellen 1B und 1C) gewählten
Abkürzungen
stehen für:
R (identisch mit der Referenzsequenz), 1 (entsprechende Insertion
vorhanden), D (entsprechende Deletion vorhanden), R1 (heterozygot
für die
entsprechende Insertion) und RD (heterozygot für die entsprechende Deletion).
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Bevorzugt sind im Rahmen der vorliegenden
Erfindung Oligonukleotide oder Polynukleotide, die mindestens eine
der vorgenannten Insertionen oder Deletionen aufweisen, im übrigen aber
der Referenzsequenz gemäß 1 entsprechen. Diese Oligo-
oder Polynukleotide haben eine Länge
von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30, besonders bevorzugt
mindestens 50 und am stärksten
bevorzugt mindestens 100 Nukleotiden und können vorzugsweise mit mindestens
einem der erfindungsgemäßen Polymorphismen
kombiniert sein. Start- und Stoppbase eines solchen erfindungsgemäßen Oligo-
oder Polynukleotids mit entsprechender Länge kann an einer beliebigen
Position auf der Sequenz gemäß 1 angeordnet sein, sofern
sie mindestens eine der erfindungsgemäßen Deletionen oder Insertionen
einschließt.
Zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung gehören dabei sowohl die RNA- als
auch DNA-OIigo- oder Polynukleotide, wobei die DNA-OIigo- oder Polynukleotide
vom kodierenden oder komplementären
nicht-kodierenden Strang stammen können, die RNA-OIigo- oder Polynukleotide
können
zum kodierenden oder zum nicht-kodierenden Strang komplementär sein.
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Die vorliegende Erfindung wird durch
die nachfolgenden Figuren näher
erläutert.
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1 zeigt
die Referenzsequenz für
den humanen 22444-Genbereich unter Angabe der Positionen, auf die
in Tabelle 1A/B/C bzw. bei der Positionsbezeichnung der Polymorphismen
Bezug genommen wird. Großbuchstaben
in der Nukleotidsequenzen geben den codierenden, also transkribierten
und translatierten Bereich des 22444-Gens, wieder. Hervorgehoben
ist das Startcodon ATG (Position 4754). Auch die TATA-Box des 22444-Gens
ist in 1 entsprechend
markiert.
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2 zeigt
die Nukleotidsequenz des codierenden Bereichs (beide Stränge) sowie
jeweils unterhalb davon die dazu gehörige Aminosäuresequenz des 22444-Gens unter
Einfügung
der erfindungsgemäß aufgefundenen
und auch die Aminosäuresequenz
betreffenden Polymorphismen, nämlich
an der Positionen 2 (Asp⇒Asn)
und an der Position 63 (Gln⇒Arg).
Die jeweiligen Aminosäurepositionen
sind in 2 (rechts) angegeben
(insgesamt 116 AS).
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Darüber hinaus zeigen die Tabellen
1A, 1B und 1C die bei der Sequenzierung der Patientengruppe (Tabelle
1A), der Kontrollgruppe (Amerikaner weißer Herkunft, Tabelle 1B) und
der Kontrollgruppe von Amerikanern schwarzer Herkunft) erhaltenen
Ergebnisse, insbesondere der hierbei erhaltenen Polymorphismen, ausgezeichnet
nach den Sequenzpositionen in 1.
Die Tabelle enthält
die spezifischen Sequenzierergebnisse, d.h. die Polymorphismen,
die bei den einzelnen Probanden ermittelt werden konnten. Ferner
enthalten die Tabellen weitere Angaben zur statistischen Auswertung
der Sequenzierergebnisse (Zahl der analysierten Probanden, Zahl
der homozygoten Träger
(mit Referenzsequenz bzw. Variante) und Zahl der heterozygoten Träger).
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Weiterhin sind die in den jeweiligen
Gruppen (Patientengruppe, Kontrollgruppe weißer Amerikaner und Kontrollgruppe
schwarzer Amerikaner) verwendeten amplifizierten und sequenzierten
Fragmente in den Tabellen eingetragen. In allen Fällen wurde
der Genbereich auf 4 Fragmente (Fragmente 1, 2, 3 und 5) aufgeteilt,
wobei sich die Positionierungen in den einzelnen Gruppen geringfügig unterscheiden.
Im Falle der Patientengruppe (Tabelle 1A) liegt bspw. das Fragment
1 zwischen Position 2024 und Position 3035 (1012 Basenpaare wurden
analysiert), das Fragment 2 liegt zwischen Position 2973 und 3972
(1000 Basenpaare wurden analysiert), das Fragment 3 liegt zwischen
Position 3812 und 4764 (953 Basenpaare wurden analysiert), das Fragment
5 liegt zwischen Position 4758 und Position 5785 (1028 Basenpaare
wurden analysiert). Die Positionen sind 1 zu entnehmen. Analog lassen sich auch
aus den Tabellen 1B und 1C die Positionen der im Genbereich untersuchten
Fragmente entnehmen.
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Die vorliegende Erfindung wird durch
das nachfolgende Ausführungsbeispiel
näher erläutert.
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Ausführungsbeispiel
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Zur Erhebung der Daten für das polymorphe
Spektrum des 22444-Gens wurde die Methode der fluoreszenzbasierten
automatischen Cycle-Sequenzierung verwendet. Hierzu wurden alle
Exons und die benachbarten intronischen Bereiche des Gens in Fragmente
unterteilt und mittels PCR amplifiziert und sequenziert (wie bspw.
in „Current
Protocols in Molecular Biology, Ausübet et al. (Editoren), John
Wiley & Sons,
New York). Auch der 5'-Regulationsbereich (ca. 3550 Basen vor der
TATA-Box) wurde sequenziert (1).
Proben von insgesamt Probanden (Patienten und Kontrollgruppe, Zahl
der Probanden aus Tabellen 1A, 1B und 1C entnehmbar) wurden, wie
nachfolgend beschrieben, isoliert, amplifiziert und schließlich sequenziert.
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- (A) Die DNA wurde aus Blutproben mit Hilfe
des „QIAamp® DNA
Blood Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) entsprechend den Vorschriften
des Herstellers isoliert.
- (B) Amplifikation
a) Mit Hilfe von PCR-Primern wurde amplifiziert.
b)
PCR-Bedingungen:
Sämtliche
Fragmente wurden unter Standardbedingungen amplifiziert.
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- C) DNA-Sequenzierung:
Die Sequenzierung
der PCR-Fragmente erfolgte mit der PRISM-Technologie von Applied Biosystems (ABI).
Verwendet wurde der BigDye-Terminator
Cycle Sequencing Kit („ABI
PRISM BigDyeTM Terminators Cycle Sequencing Kit", Applied Biosystems,
Weiterstadt, Deutschland), wobei die entsprechenden Vorschriften
des Herstellers beachtet wurden. Die Auftrennung der Reaktionsprodukte
erfolgte auf einem automatischen Sequenziergerät des Typs ABI 377 unter Beachtung
der Vorschriften des Herstellers.
Sämtliche PCR- und Sequenzierreaktionen
wurden in einem Tetrad PTC 225 Cycler von MJ Research durchgeführt. Die
aus der Sequenzierung gewonnenen Daten wurden unter Verwendung der
Programme des phred/phrap/polyphred-Pakets der University of Washington
analysiert.
Die Ergebnisse des Ausführungsbeispiels sind nachfolgend
sowie in 2 und den Tabellen
1A bis 1C wiedergegeben.
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Die Bestimmung der Polymorphismen
des humanen 22444-Gens wurde durch Sequenzierung des 22444-Gens
bei Patienten mit neuropsychiatrischen Krankheiten und bei einer
Gruppe von gesunden Kontrollpersonen vorgenommen. Zur Auswertung
lagen Daten von 47 Probanden vor, die der Kontrollgruppe zugeordnet
waren, und Daten von 94 Probanden (Tabelle 1A), die ursprünglich die
Patientengruppe charakterisieren sollten. Nach einer ersten Zwischenauswertung
stellte sich nach Rückfrage
und Überprüfung der
Daten heraus, daß sich
die Patientengruppe aus insgesamt 3 verschiedenen ethnischen Gruppen
zusammensetzt und daß ein
angeblicher Patient eine Kontrolle darstellt und gleichzeitig mit
einem Patienten verwandt ist. Dieser Proband wurde von der weiteren
Auswertung ausgeschlossen. Ferner existieren in dieser Gruppe zwei
weitere verwandte Probanden, von denen einer von der weiteren Auswertung
ausgeschlossen wurde.
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Da in der Kontrollgruppe ausschließlich Amerikaner
europäischer
Herkunft enthalten waren, war nur eine Auswertung der Daten für diese
ethnische Gruppe möglich.
Es erfolgte die Sequenzierung von 48 Probanden. In allen ethnischen
Gruppen wurden insgesamt 30 Varianten gefunden, darunter 14 Inversionen.
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Die folgenden Ergebnisse betreffen
nur die Analyse der ethnischen Gruppe von Amerikanern europäischer Herkunft
(Tabelle 1B): Daten zu 47 Probanden in der Kontrollgruppe und 46
Probanden in der Patientengruppe lagen vor. Es wurden insgesamt
19 Varianten gefunden. Eine Variante (Pos. 4278) befindet sich nicht
im Hardy-Weinberg-Gleichgewicht, es gibt eine leichte Verschiebung
der Häufigkeiten
zu Ungunsten des heterozygoten Zustands. Es existieren keine signifikanten
Unterschiede in den Häufigkeiten
der einzelnen Varianten, drei Varianten zeigen eine leichte Tendenz
zu Unterschieden in den Häufigkeiten
der Genotypen (Varianten an Position 2093, 3974 und 4278, p-Werte
zwischen 0,12 und 0,20), wobei die Varianten 2093 und die Referenzvariante
an Position 4278 ausschließlich
in einer Gruppe vorkommen, erstere nur in der Kontrollgruppe, letztere
nur in der Patientengruppe.
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Die Allelfrequenzen der Varianten
wurden bis auf Variante 4278 alle unter 10% geschätzt, bei
Variante 4278 unter 12%. 15 verschiedene Genotypen sowie zwei nicht
in allen Positionen eindeutig bestimmte Genotypen lagen vor. Aus
den Genotypen wurden 13 verschiedene Haplotypen geschätzt. Sowohl
die Menge der Genotypen als auch die Menge der Haplotypen enthält im wesentlichen
zwei Cluster, wobei das zweite Cluster knapp 10% der Genotypen bzw.
ca. 5% der Haplotypen enthält.
Es sind keine signifikanten Unterschiede in den Häufigkeiten
der Genotypen bzw. Haplotypen zwischen der Kontroll- und Patientengruppe
aufgefunden worden. Es deuten sich auch keine Unterschiede in der
Zugehörigkeit
zu den Clustern an. Die Varianten an den Positionen 2093, 3974 und
4278 haben eine Tendenz, bestimmte "Muster" vorwiegend in einer
der beiden Gruppen zu bilden. Erste Ergebnisse aus dem Vergleich
von Patienten europäischer
Herkunft und afrikanischer Herkunft ergeben einen signifikanten
Unterschied beider Populationen hinsichtlich der Genotyp- und Haplotypfrequenzen
bzw. der Positionen, die für
das zweite Cluster charakteristisch sind. Das zweite Cluster kommt
bei den Afroamerikanern signifikant häufiger vor als bei den Patienten
europäischer
Herkunft.
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Tabelle 1C zeigt das Ergebnis der
Sequenzierungen einer weiteren Kontrollgruppe von Amerikanern afrikanischer
Herkunft. Hierbei wurden (gegenüber
der Referenzsequenz aus 1)
die folgenden weiteren Sequenzvarianten identifiziert, die bei Patienten
und der weißen
Kontrollgruppe nicht identifiziert worden waren: Position 2208 (T→G), Position
2588 (A→G),
Position 3791 (G→A),
Position 3911 (C→T),
Position 4785 (G→T)
und Position 5333 (G→A).
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Zusammenfassend bleibt festzustellen,
daß die
vorliegende Erfindung Sequenzvarianten des 22444-Gens und SNPs ("single
nucleotide polymorphisms") dieses Gens zur Verfügung stellt, die durch dem Fachmann
geläufige
gentechnologische Verfahren erhältlich
sind.
