DE19817118C1 - Dyskerin und dafür codierende DNA-Moleküle, diese enthaltende Vektoren, Antikörper gegen Dyskerin und die Verwendung dieser Gegenstände - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die Proteine mit der biologischen Aktivität von Dyskerin codieren. Ferner werden diese DNA-Moleküle enthaltende Vektoren beschrieben, wobei diese Vektoren beispielsweise zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle in Prokaryonten oder Eukaryonten geeignet sind. Außerdem werden Arzneimittel mit diagnostische Zusammensetzungen, die die vorstehenden DNA-Moleküle bzw. Vektoren enthalten, das davon codierte Protein oder einen dieses Protein spezifisch erkennenden Antikörper offenbart. Schließlich werden Diagnoseverfahren beschrieben, wobei die vorstehend erwähnten Verbindungen eingesetzt werden und womit Dyskeratosis Congenita (DKC) bzw. eine Prädisposition für DKC nachgewiesen werden können.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die Dyskerin bzw. Proteine mit der biologischen Aktivität von Dyskerin codieren. Die vorliegende Erfindung stellt ferner diese DNA-Moleküle enthaltende Vektoren bereit, wobei in einer bevorzug­ ten Ausführungsform diese Vektoren zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle in Prokaryonten oder Eukaryonten geeignet sind. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Arzneimittel und diagnostische Zusammensetzungen, die die vorstehenden DNA-Moleküle bzw. Vektoren enthalten, das davon codierte Protein oder einen dieses Protein spezifisch erkennenden Antikörper. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Diagnoseverfahren, wobei die vorstehend erwähnten Verbindungen eingesetzt werden und womit Dyskeratosis Congenita (DKC) bzw. eine Prädisposition in den Frühstadien der Krankheit bei Betroffenen für DKC nachgewiesen werden können.

Die Xq28-gekoppelte, rezessive Erkrankung Dyskeratosis Congenita (DKC; oder auch "Zinsser-Cole-Engmann-Syndrom" genannt) ist eine seltene kongenitale Multisystemerkrankung, die spätestens im dritten Lebensjahrzehnt bei den meisten betroffenen Patienten infolge einer fortschreitenden Panzytopenie und Knochenmarksversagen einen letalen Verlauf nimmt (Connor et al., Hum. Genet. 72 (1986), 348-351; Arngrimsson et al., J. Med. Genet. 30 (19931, 618-619; Knight et al., J. Med. Genet. 33, S. 993-995 (1996)). Typisch für die Erkran­ kung ist die frühe Manifestation von bestimmten Symptomen in ektodermalem Gewebe, wie zum Beispiel netzförmige Hautpigmentierung, Nagelwuchsstörun­ gen, Hyperkeratosen oder Mukosa-Leukoplakien (Drachtman und Alter, Am. J. Pediatr. Hemat. Oncol. 14 (1992), S. 297-304 (1992), Dokal et al., Br. J. Haema­ tol. 92 (1996), 775-779). Auf der zytogenetischen Ebene ist das Auftreten von multiplen spontanen Chromosomenbrüchen und Rearrangements in Kulturen von peripheren Blutzellen und Hautfibroblasten zu beobachten. Daraus wurde gefol­ gert, daß DKC eine auf chromosomaler Instabilität beruhende Erkrankung ist (siehe den Übersichtsartikel von Dokal, Br. J. Haematol 92 (1996), 775-779). Bei der Fanconi-Anämie (eine erbliche Knochenmarkserkrankung mit chromosomaler Instabilität) tritt die chromosomale Instabilität vor allem als Reaktion auf Clasto­ gene auf. Es wird jedoch davon ausgegangen, daß Clastogene bei der DKC keine Rolle spielen (Dokal et al., Blood 80 (19921, 3090-3096; Coulthard et al., Br. J. Haemotol. 97S, 12 (1997)). Die beobachtete chromosomale Instabilität in kulti­ vierten DKC-Zellen geht oft mit einer erniedrigten Proliferationsrate und einer veränderten Morphologie einher. Dabei scheinen diese Phänomene vor allem in Zellen von solchen Patienten aufzutreten, die schon Anzeichen für eine fort­ geschrittene Erkrankung zeigen, und es wird daher davon ausgegangen, daß diese Phänomene ein Fortschreiten der Erkrankung widerspiegeln (Dokal et al., Blood 80 (1992), 3090-3096). Schließlich ist noch zu erwähnen, daß Träger von DKC ein vollständig verlagertes Muster der Inaktivierung des X-Chromosoms zeigen. In den Zellen weiblicher Individuen wird normalerweise in den frühen Entwicklungsstadien zufällig entweder das mütterliche oder das väterliche X- Chromosom inaktiviert (Lyonisierung), bei DKC-Trägerinnen jedoch wird das mütterlich X-Chromosom, das die Mutation trägt, bevorzugt inaktiviert. Derzeit wird erhofft, daß die verlagerte X-chromosomale Inaktivierung vorläufig als diagnostischer Marker und als Bestätigung des X-chromosomalen Erbgangs dienen kann. Dies steht in Übereinstimmung mit der Beobachtung, daß der Gendefekt bei DKC zu einem Wachstumsnachteil bei den Zellen führt, bei denen dieser exprimiert wird (Devriendt et al., Am. J. Hum. Genet. 60 (1997), 581-587; Vulliamy et al., Blood 90, S. 2213-2216 (1997)).

Da bisher das für die DKC verantwortliche Gen nicht bekannt war, konnte diese Erkrankung bisher nur aufgrund phänotypischer Merkmale diagnostiziert werden, wobei von Nachteil ist, daß die Diagnose nicht eindeutig und erst nach Ent­ wicklung des Vollbilds der Erkrankung möglich ist. Letzteres hat zur Folge, daß es dann für eine therapeutische Intervention oft zu spät ist. Da die Pathogenese der DKC bisher nicht geklärt werden konnte, ist die Therapie im wesentlichen symptomatisch und palliativ.

Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, diese Nachteile bisheriger Diagnoseverfahren zu überwinden, d. h. eine moleku­ larbiologische Diagnostik, die auch eine Frühdiagnostik erlaubt, bereitzustellen.

Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht. Es konnte ein DNA-Molekül isoliert und identifiziert werden (DKC1-Gen), das in Zusammen­ hang mit DKC steht und das Protein Dyskerin codiert. Alle bislang untersuchten Patienten mit DKC zeigen Änderungen in der Nucleinsäuresequenz der mRNA des DKC1-Gens. Bei weiteren Analysen sind jedoch außerdem Mutationen im Intron bzw. den Exon-/Intron-Übergängen in der genomischen Sequenz zu erwarten.

Die Identifizierung eines für DKC verantwortlichen Gens ist von Interesse, da dies einen Beitrag zur Aufklärung der molekularen Pathogenese der DKC und somit verbesserter Therapien gewährleistet. Parallel dazu bildet die Klonierung des DKC-Gens die Grundlage zur Entwicklung diagnostischer Tests, um zukünf­ tig eine zuverlässigere und frühzeitige Diagnose von DKC-Trägern und Betroffe­ nen zu gewährleisten. Darüber hinaus werden funktionelle Analysen des Proteins zweifellos zum Verständnis der normalen Hämatopoese und der Pathophysiologie anderer ideopathischer aplastischen Anämien beitragen.

In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, daß die DKC genetisch heterogen ist, insofern es die hier beschriebene X-chromosomale Form (am häufigsten), als auch familiär und sporadisch autosomal rezessiv und autosomal dominant vererbte Fälle gibt.

Die Identifizierung des Gens erfolgte durch die Isolierung einer Reihe von poly­ morphen Marken und durch detaillierte Kopplungsanalysen, wodurch der für DKC verantwortliche Bereich innerhalb der 8 Megabasen (Mb) großen Region Xq28 zuerst auf 3,5 Mb und dann auf 1,4 Mb eingeschränkt werden konnte. In diesem Abschnitt von Xq28 waren 57 bzw. 37 mögliche Kandidatengene vorhanden. Mittels Screenen von Southern-Blots mit DNA von DKC-Patienten mit cDNA- Proben von 28 dieser Kandidatengene konnte eine Deletion in einem Patienten mit einer speziellen Probe nachgewiesen werden (Heiss et al., Methods Mol. Cell- .Biol. 5 (1995), 337-344). Auf diese Weise wurde die cDNA des XAP101-Gens als wahrscheinlichstes Kandidatengen für DKC identifiziert. Anschließend konnte in einem zweiten Patienten eine Punktmutation nachgewiesen werden. Nachdem das 5'-Ende der cDNA isoliert worden war, wurden zwei weitere Punktmutatio­ nen, ein 2-bp-Rearrangement und eine 3-bp-Deletion auf cDNA-Ebene nach­ gewiesen. Aufgrund der für diese Proteine beschriebenen biologischen Eigen­ schaften kann davon ausgegangen werden, daß Dyskerin als Chaperon am Transport von ribosomalen Proteinen, bei der Chromosomensegregation und/oder als Pseudouridinsythase an der rRNA-Biosynthese beteiligt ist.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein DNA-Molekül (DKC1), das für das Protein Dyskerin codiert und folgendes umfaßt:

• a) die Nukleinsäure von Fig. 1a, oder eine hiervon durch ein oder meh­ rere Basenpaare unterschiedliche DNA bzw. ein Fragment davon,
• b) eine mit der Nucleinsäure von (a) hybridisierende DNA, oder
• c) eine mit der Nucleinsäure von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.

Die unter (a) und (c) definierten Nucleinsäuremoleküle codieren für Proteine, Polypeptide oder Peptide, die mindestens noch eine der nachstehend beschrie­ benen biologischen Aktivitäten von Dyskerin aufweisen, beispielsweise als Chaperon beim Transport von ribosomalen Proteinen beteiligt sind, an der Chro­ mosomensegregation, als Pseudouridinsynthase an der rRNA-Biosynthese oder dessen Veränderung oder Ausfall zu DKC führt oder führen kann.

Die unter (a) definierten DNA-Moleküle umfassen auch DNA-Moleküle, die sich gegenüber der in Fig. 1a angegebenen Sequenz durch Deletion(en), Inser­ tion(en), Austausch(e) und/oder andere im Stand der Technik bekannte Modifika­ tionen, z. B. alternatives Splicing, unterscheiden bzw. ein Fragment des ur­ sprünglichen Nucleinsäuremoleküls umfassen, wobei das durch diese DNA- Moleküle codierte Protein noch eine oder mehrere der vorstehend beschriebenen biologischen Aktivitäten von Dyskerin aufweist. Dazu zählen auch Allelvarianten. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Nucleinsäurese­ quenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989). Der Fachmann ist auch in der Lage zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nucleinsäuresequenz codiertes Protein noch über eine der biologi­ schen Aktivitäten von Dyskerin verfügt. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß untersucht wird, ob nach Zugabe des Proteins zu primären Hautfi­ broblastenkulturen von DKC-Patienten die erniedrigten Verdopplungszeiten der Zellen (Dokal et al., Blood 80 (1992), 3090-3096) wieder erhöht bzw. normali­ siert werden können. Ein weiterer Test zur Überprüfung ob die Funktion des Proteins noch über die biologische Funktion oder ähnliche biologische Funktionen von Dykerin verfügt, ist das Zwei-Hybrid-System (Fields et al., Nature 340, S. 245.246 (1989)). Um die erfindungsgemäße biologische Funktion von Dyskerin noch zu erfüllen, muß zu den oben definierten Nukleinsäuremolekülen bzw. zu der in Fig. 1a angegebenen Sequenz eine Homologie von mindestens 50% auf Nukleotidebene bestehen.

Der Begriff "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisiert. Der Begriff "hybridisieren" bezieht sich dabei auf konventionelle Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridisierungs­ bedingungen, bei denen als Lösung 5 × SSPE, 1% SDS, 1 × Denhardts-Lösung verwendet wird und die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise zuerst mit 2 × SSC, 1% SDS und danach mit 0,2 × SSC bei Temperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C gewaschen (zur Definition von SSPE, SSC und Denhardts-Lösung siehe Sambrook et al., supra). Besonders bevorzugt sind stringente Hybridisierungsbedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNA-Molekül eine cDNA.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNA- Molekül eine genomische DNA, die vorzugsweise von einem Säuger, beispiels­ weise einem Menschen stammt. Hierzu wird auf Fig. 2 verwiesen. Auf Nuclein­ säurehybridisierung basierende Screening-Verfahren erlauben die Isolierung der erfindungsgemäßen genomischen DNA-Moleküle aus jedem Organismus bzw. abgeleiteten genomischen DNA-Banken, wobei Sonden verwendet werden, die die in Fig. 1a angegebene Nucleinsäuresequenz oder einen Teil davon enthal­ ten. Anhand der genomischen DNA, beispielsweise aus einem Menschen, können weitere Mutationen identifiziert werden, die an der Entstehung von DKC beteiligt sind, beispielsweise Mutationen die zu Aminosäurenaustauschen, zur Hemmung des Spleißens oder zu fehlerhaftem Spleißen führen.

Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können auch in einen Vektor bzw. Ex­ pressionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese Nucleinsäuremoleküle enthaltende Vektoren. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate (z. B. pUC8), pBR322, pBlueScript, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich beson­ ders der Baculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül im Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phäno­ typische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatori­ schen Elementen für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E.coli, zählen der lac-, trp-Promotor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukary­ onten der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe, und der CMV-, SV40-, RVS-40- Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor.

Zu geeigneten Vektoren zählen insbesondere auch T7 basierende Expressions­ vektoren für die Expression in Bakterien (Rosenberg et al., Gene 56(11987), 125) oder pMSXND für die Expression in Säugerzellen (Lee und Nathans, J. Biol. Chem. 263 (1988), 3521).

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die erfindungsgemäßen DNA- Moleküle enthaltene Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia- Virus oder ein AAV-Virus, der bei einer Gentherapie von Nutzen ist. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Lipososmen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 6821.

Allgemeine auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien, Hefe, Insekten- und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugt sind die E. coli Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21, XL1Blue und SG 13009, der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, HeLa sowie die Insektenzellen sf9. Verfahren zur Transforma­ tion dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.

Die für DC1 codierenden Klone XAP101/DC1 (cDNA) und PAC23248/DC1 (genomische DNA) wurden am 2. Februar 1998 bei der DSMZ, Deutsche Samm­ lung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig unter den Hinterlegungsnummern DSM 11981 und DSM 11982 hinterlegt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Dyske­ rin oder eines Proteins mit einer oder mehreren der biologischen Aktivitäten von Dyskerin, umfassend die Kultivierung der vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins erlauben (vorzugsweise stabile Expression), und Gewinnung des Proteins aus der Kultur. Geeignete Verfahren zur rekombinanten Herstellung des Proteins sind allgemein bekannt (siehe beispielsweise Holmgren, Annu. Rev. Biochem. 54 (1985), 237; LaVallie et al., Bio/Technology 11 (1993), 187; Wong, Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 517; Romanos, Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 527; Williams et al., Curr. Opin. Bio­ tech. 6 (1995), 538; und Davies, Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 543. Auch geeignete Reinigungsverfahren (beispielsweise präparative Chromatographie, Affinitätschromatographie, beispielsweise Immunoaffinitätschromatographie, HPLC etc.) sind allgemein bekannt.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein von den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen codiertes oder nach dem vorstehenden Verfahren erhaltenes Protein mit einer oder mehreren der biologischen Aktivitä­ ten von Dyskerin. Die Aminosäuresequenz eines solchen Proteins ist in Fig. 1b gezeigt. In diesem Zusammenhang soll erwähnt werden, daß das erfindungs­ gemäße Protein gemäß üblicher, auf dem Fachgebiet bekannten, Verfahren modifiziert sein kann. Zu diesen Modifikationen zählen Austausche, Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren, die die Struktur des Proteins modifizieren, wobei seine biologische Aktivität im wesentlichen erhalten bleibt. Zu den Aus­ tauschen zählen vorzugsweise "konservative" Austausche von Aminosäure­ resten, d. h. Austausche gegen biologisch ähnliche Reste, z. B. die Substitution eines hydrophoben Rests (z. B. Isoleucin, Valin, Leucin, Methionin) gegen einen anderen hydrophoben Rest, oder die Substitution eines polaren Rests gegen einen anderen polaren Rest (z. B. Arginin gegen Lysin, Glutaminsäure gegen Asparaginsäure etc.). Deletionen können zur Erzeugung von Molekülen führen, die eine deutlich geringere Größe aufweisen, d. h., denen beispielsweise Amino­ säuren am N- oder C-Terminus fehlen. Um die erfindungsgemäße biologische Funktion von Dykerin noch zu erfüllen, sollte eine Homologie von mindestens 60% auf Proteinebene vorliegen.

Das erfindungsgemäße DKC1-Gen codiert für ein Peptid/Protein mit 514 Amino­ säuren und einem geschätzten Molekulargewicht von 57.665. Es stellt ein stark geladenes Peptid mit einem isolelektrischen Punkt (pl) von 10,2 dar. Somit sind die meisten der geladenen Aminosäuren, die 33,6% (173/515) des Peptids ausmachen, basisch (105/173). Dies beruht zum großen Teil auf der Anwe­ senheit vieler Lysinreste (K) die 12% des Peptids ausmachen und am C-Termi­ nus besonders gehäuft auftreten. Die zweithäufigsten Aminosäuren stellen hydrophobe Reste dar (I, L, M, V; 25% des Peptids). Es gibt klare Hinweise darauf, daß Dyskerin ein Phosphoprotein ist. Außerdem zeigten sich vier wahr­ scheinliche Myristylationsstellen und zwei konservierte Signale für die nucleäre Lokalisation (NRLS) am N-Terminus (KKHKKK) und am C-Terminus (KRK) bei Sequenzen der Ratte und beim Menschen. Insgesamt ist Dyskerin hydrophil, enthält jedoch keine hydrophoben Domänen, die eine für eine Lokalisation in der Membran ausreichende Länge aufweisen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Antikörper, die das vorstehend beschrie­ bene Protein spezifisch erkennen. Die Antikörper können monoclonale, polyclo­ nale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon, beispielsweise Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente. Vorzugsweise handelt es sich dabei um mono­ clonale Antikörper. Für die Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kanin­ chen oder Hühner für einen polyclonalen und Mäuse für einen monoclonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fu­ sions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyclonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Die erfindungs­ gemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei das von den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen codierte Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Monoclonale Antikörper können beispielsweise durch das von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495) und Galfré (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3) beschriebene Verfahren herge­ stellt werden, wobei Maus-Myelomzellen mit von immunisierten Säugern stam­ menden Milzzellen fusioniert werden. Diese Antikörper können beispielsweise zur Immunpräzipitation der vorstehend diskutierten Proteine oder zur Isolierung verwandter Proteine aus cDNA-Expressionsbanken verwendet werden. Die Antikörper können beispielsweise in Immunoassays in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebunden werden. Dabei können die Antikörper auf ver­ schiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsver­ fahren sind dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immungssays sind ELISA und RIA.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der vorstehend be­ schriebenen DNA-Moleküle, Vektoren, Proteine und/oder Antikörper. Vorzugs­ weise werden diese zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention oder Behandlung von DKC verwendet. Dabei kann das Arzneimittel in der Gentherapie Verwendung finden, wobei die vorstehend beschriebenen Verfahren bzw. Vektoren zur Einschleusung der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle Anwendung finden können. Andererseits kann das von den erfindungsgemäßen DNA-Molekü­ len codierte Protein direkt verabreicht werden, um so in Zellen, die keine funktio­ nalen Kopien der für Dyskerin oder die vorstehend beschriebenen, verwandten Proteine codierenden Gene mehr besitzen, ausreichende Mengen des biologisch aktiven Proteins zur Verfügung zu stellen. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kommt bevorzugt dann zur Anwendung, wenn in dem betreffenden Patienten biologisch aktives Dyskerin bzw. das verwandte Protein nicht oder in zu gerin­ gen Mengen gebildet werden.

Diese Arzneimittel enthalten gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arznei­ mittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parente­ rale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, sub­ kutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperito­ neale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, bei­ spielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc.

Über das Vorhandensein einer spontanen chromosomalen Instabilität in Hautfi­ broblasten, peripheren Blutzellen und Knochenmarkszellen von DKC-Patienten ist häufig berichtet worden. Untersuchungen von Dokal et al. (s. oben (1992)) zeigten, daß die chromsomale Instabilität mit morphologischen Veränderungen und einer verlangsamten Teilungsrate von kultivierten Hautfibroblasten einher­ geht. Die morphologischen und chromosomalen Veränderungen wurden häufiger bei Patienten mit einer fortgeschrittenen Symptomatik nachgewiesen, weshalb angenommen wird, daß solche Anomalien mit der Progredienz der Krankheit zunehmen. Weiterhin gibt es einige Studien, die über eine mit Klastogenen (Bleomycin, Diepoxybutan, Mitomycin-C, 4-Nitroquinolin-1-Oxid) induzierte Chromosomenbrüchigkeit bei DKC berichten.

Aufgrund der beschriebenen biologischen Funktionen von Dyskerin in der Zelle können die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen DNA-Moleküle, Vektoren, Proteine und Antikörper zur Herstellung eines Arzneimittels (1) zur Verwendung als Wachstumsfaktor, (2) zur Aktivierung des Zellzyklus oder (3) zur Stabilisierung von Chromosomen bei onkologischen Erkrankungen verwendet werden und somit bei den vorstehenden Anomalien eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Dyskerin bzw. die verwandten Proteine mit den gleichen oder ähnlichen biologischen Eigenschaften können auch als Zusatz für Arznei­ mittel zur Verbesserung des Transports des therapeutischen Wirkstoffs ver­ wendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine diagnostische Zusammensetzung, die das vorstehend beschriebene DNA-Molekül oder den Antikörper enthält oder Kombinationen davon, gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten Nach­ weismittel.

Das erfindungsgemäße, wie vorstehend definierte DNA-Molekül kann auch als Sonde verwendet werden, um DNA-Moleküle zu isolieren, die beispielsweise von einer anderen Spezies oder einem anderen Organismus stammen und ein Protein codieren mit einer der biologischen Aktivitäten von Dyskerin. Vorzugsweise weist dazu die Sonde eine Länge von mindestens 10, besonders bevorzugt mindestens 15 Basen auf. Geeignete, auf Hybridisierung basierende Nachweis­ verfahren sind dem Fachmann bekannt. Geeignete Markierungen für die Sonde sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und dazu zählen beispielsweise Markie­ rung mit Radioisotopen, Biolumineszenz-, Chemilumineszenz-, Fluoreszenzmar­ kern, Metallchelaten, Enzymen etc..

Darüber hinaus kann dies auch durch eine PCR (Wiedmann et al., PCR Methods Appl. 3, S. 551-564 (1994); Saiki et al., Nature 324, S. 163-166 (1986)) oder "Ligase chain reaction" (LCR) (Taylor et al., Curr. Opin. Biotechnol. 6, S. 24-29 (1995); Rouwendal et al., Methods Mol. Biol. S. 149-156 (1996)) erfolgen, wobei die Primer von der Sequenz in Fig. 1 abgeleitet sind und wobei geeignete Primer (hinsichtlich Länge, Komplementarität zur Matritze, dem zu amplifizieren­ den Bereich etc.) vom Fachmann gemäß üblicher Verfahren entworfen werden können.

Die vorstehend beschriebenen Verfahren erlauben auch die Identifizierung weiterer Mutationen, die in Zusammenhang mit DKC stehen, wobei die Sequenz von DC1 aus gesunden Personen mit der aus dem jeweiligen Patienten ver­ glichen wird.

Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von DKC oder einer Prädisposition für DKC in vitro, die folgenden Schritte umfassend:

• - Isolierung von Nucleinsäure aus dem Patienten,
• - Durchführung einer LCR oder PCR mit geeigneten Primern oder einer Hybridisierungsanalyse mit einer oder mehreren geeigneten Sonden,
• - Vergleich der Längen der amplifizierten bzw. hybridisieren­ den Fragmente mit den Längen von Kontrollfragmenten aus dem nichtmutierten DC1-Gen, oder
• - Sequenzierung der amplifizierten Fragmente und Vergleich mit der Sequenz von Kontrollfragmenten aus dem nichtmu­ tierten DC1-Gen, wobei Längenunterschiede oder Mutatio­ nen, die zu Substitutionen, Deletionen oder Additionen von Aminosäuren oder zu vorzeitiger Termination der Translation führen, indikativ für DKC oder eine Prädisposition für DKC sind oder wegen der Heterozygotie der Mutation einen Trä­ ger der DKC identifizieren können.

Das Feststellen einer Prädisposition für DKC gibt großen Sinn im Rahmen der pränatalen Diagnostik. Sollte man bei diesen Untersuchungen feststellen, daß der aus dem Embryo entstehende Mensch im späteren Leben DKC entwickeln wird, könnte man schon bei der Geburt Nabelschnurblut entnehmen, daraus hämopoietische Zellen extrahieren und aufbewahren, um bei Ausbruch der Erkrankung diese an den Erkrankten zurückzugeben. Dadurch sollte der Verlauf der Erkrankung gebremst werden.

Bei oben genanntem Verfahren können dem Fachmann bekannte Methoden bezüglich der Präparation von DNA oder RNA aus biologischen Proben, des Restriktionsverdaus der DNA, der Auftrennung der Restriktionsfragmente auf nach Größe auftrennenden Gelen, beispielsweise Agarosegelen, der Herstellung und Markierung der Sonde und des Nachweises der Hybridisierung, beispiels­ weise über "Southern-Blot"; angewandt werden.

Der vorstehende Nachweis kann auch über PCR oder LCR durchgeführt werden. Dabei werden Primer verwendet, die die Dyskerin codierende Sequenz oder geeignete Teilbereiche flankieren. Diagnostisch von Bedeutung sind dabei Am­ plifikationsprodukte von DNA aus dem fraglichen Gewebe, die sich, beispiels­ weise hinsichtlich ihrer Länge und/oder der Sequenz, von den Amplifikations­ produkten von DNA aus gesundem Gewebe unterscheiden.

In einer alternativen Ausführungsform können DKC oder die Prädisposition für DKC auch durch ein Verfahren diagnostiziert werden, das folgende Schritte umfaßt:

• - Isolierung von RNA aus dem Patienten,
• - Durchführung einer Northern-Analyse mit einer oder mehre­ ren geeigneten Sonden,
• - Vergleich der Konzentration und/oder Länge der Dyskerin­ mRNA der Patientenprobe mit einer Dyskerin-mRNA einer gesunden Person, wobei Längenunterschiede oder das Feh­ len bzw. eine geringere Konzentration der Dyskerin-mRNA (beispielsweise bedingt durch Mutationen in regulatorischen Sequenzen, die mit der Transkription in Zusammenhang stehen) im Vergleich zur Kontroll-mRNA indikativ für DKC oder eine Prädisposition für DKC sind.

Bei diesem Verfahren können dem Fachmann bekannte Methoden bezüglich der Präparation von Gesamt-RNA bzw. poly(A) + RNA aus biologischen Proben, der Auftrennung der RNAs auf nach Größe auftrennenden Gelen, beispielsweise denaturierenden Agarosegelen, der Herstellung und Markierung der Sonde und des Nachweises über "Northern-Blot" angewandt werden.

In einer weiteren alternativen Ausführungsform können DKC oder die Prädisposi­ tion für DKC auch durch ein Verfahren diagnostiziert werden, das folgende Schritte umfaßt:

• - Gewinnung einer Zellprobe von dem Patienten,
• - Inkontaktbringen der so erhaltenen Zellprobe mit dem vorste­ hend beschriebenen erfindungsgemäßen Antikörper als Son­ de unter Bedingungen, die die Bindung des Antikörpers an Dyskerin bzw. das verwandte Protein erlauben, wobei eine nichtstattgefundene oder schwache Bindung des Antikörpers auf eine mangelnde oder erniedrigte Expression von Dyskerin hinweisen, die indikativ für DKC oder eine Prädisposition für DKC ist.

Dieser Nachweis kann ebenfalls unter Anwendung von dem Fachmann bekann­ ten Standardtechniken durchgeführt werden. Diesem sind auch Zellaufschluß­ verfahren bekannt, die die Isolierung des Proteins auf eine solche Weise erlau­ ben, daß dieses mit dem Antikörper in Kontakt gebracht werden kann. Der Nachweis des gebundenen Antikörpers erfolgt vorzugsweise über Immungssays, beispielsweise Western-Blot, ELISA oder RIA.

Die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren können auch als pränatale Diagnose­ verfahren gemäß dem Fachmann bekannten Techniken durchgeführt werden.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Kits zur Durchführung der erfin­ dungsgemäßen Diagnoseverfahren, die den erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Fragment davon, ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül als Sonde oder ein für PCR oder LCR geeignetes, auf der Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Mole­ küls basierendes Primerpaar enthalten, gegebenenfalls in Kombination mit einem geeigneten Nachweismittel.

Je nach Ausgestaltung des mit den erfindungsgemäßen Kits durchzuführenden Diagnoseverfahrens können die in dem Kit enthaltenden DNA-Moleküle, Antikör­ per oder Fragmente davon an einem geeigneten Träger immobilisiert sein.

Die Erfindung wird nun weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:

Fig. 1a: Nucleinsäuresequenz der cDNA des DC1-Gens Start- und Stopcodons sind fettgedruckt, unterstrichen und in Kursiv-Schrift. Positionen der bislang identifizierten Missense-Muta­ tionen sind klein fettgedruckt und mit Pfeilen markiert. Der Bereich der aufgefundenen Deletion in einem Patienten ist umrahmt und beginnt mit der fettgedruckten Schrift.

Fig. 1b: von Fig. 1a abgeleitete Aminosäuresequenz

Fig. 2: Nukleinsäuresequenz und Exon-Intron-Strukturdes DKC1-Gens. Die Exonsequenzen sind in fettgedruckter Kursivschrift hervorgehoben und von 1 bis 15 durchnummeriert.

Fig. 3: Expressionsanalyse des DKC1-Transkripts. Northern-Blots, bei denen RNAs aus verschiedenen Geweben ver­ wendet wurden, wurden mit den cDNA-Clonen 31 g K17 und 39 g 1- D14 hybridisiert. Diese erstrecken sich von Nukleotid 744 nach Nukleotid 2143 und decken das 3'-Ende des vollständigen offenen Leserahmens (ORF) ab. In den linken und mittleren Spuren wurde RNA aus erwachsenen Geweben, in den rechten Spalten aus föta­ lem Gewebe aufgetragen.

Fig. 4: Southern-Blot-Analysen Die Southern Blot Analyse zeigt die 3'-End DKC Deletion in Patient HO
a: zeigt die Hybridisierung der Sonde 39 g 1D14 (DKC1 cDNA- Nukleotide 1523-2143) mit Taql-Verdaus von 10 nicht mit­ einander verwandten DKC-Patienten; Patient HO ist in Spur 7; die schwachen Banden, die in allen Spuren zu sehen sind, sind Restsignale früherer Hybridisierungsexperimente, außer für das 1,6 kb Fragment in Spur 7, welches aus dem partiell zerstörten DKC1-Gen in Patient HO stammt;
b: zeigt die Hybridisierung von Sonde 31 g 1K17 (DKC1 cDNA- Nukleotide 744-1565) an Taql-Verdaus von DNA aus Patient HO in Spur 1 und einer normalen Kontrolle in Spur 2.

Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiel 1 Allgemeine Verfahren cDNA-Isolierung und Clonierung

Die Erzeugung von angereicherten cDNA-Selektionsbanken (Korn et al., Hum. M­ ol. Genet. 1 (1992), 235-242), "Alu-long-range"-PCR-Produkten aus YACs (Wilgenbus et al., Methods Mol. Cell. Biol., 5, S. 214-221 (1995)), und die Ver­ wendung dieser Produkte als Substrate für die Bestimmung von Exons ("Exon- Trapping") erfolgte wie beschrieben. Das 5'-Ende des hinterlegten Klons XAP- 101 wurde durch das Screenen einer Zufalls-geprimten und oligo-dT-geprimten menschlichen fötalen Hirn-lambdaZAPII-cDNA-Bank (Clontech) mit den verfüg­ baren cDNA-Selektionsclonen (Korn et al., Hum. Mol. Genet. 1, S. 235-242 (1992)) bestimmt. Positive Plaques wurden solange erneut gescreent bis einzeln isolierbare Clone erhalten werden konnten. Die isolierten in Phagen enthaltenen cDNA-Clone wurden durch Exzisionsreparatur entsprechend den Angaben des Herstellers in Plasmidvektoren eingebracht.

Sonden

An die für die Anreicherungszyklen verwendete cDNA wurden SK-Sequenzadap­ toren ligiert (Korn et al., Hum. Mol. Genet. 1 (1992), 235-242). Die erhaltenen cDNA-Selektionsprodukte wurden in den Vektor pAmp10 (Gibco) cloniert. cDNA-Insertionen wurden direkt aus bakteriellen Clonen über PCR-Amplifikation (94°C, 2 min. 35 Zyklen 94°C, 1 min. 60°C, 1 min. 72°C, 1 min. 72°C, 10 min) mit dem Primer SK isoliert. Die Insertionen wurden Gel-gereinigt (Qiagen) und mit alpha-³²P[dCTP] unter Verwendung von Zufallshexomeren markiert (spezifische Aktivität: 5-10 × 10⁶ cpm).

Southern- und Northern-Blots

Northern-Blots mit RNAs aus verschiedenen Geweben (7760-1, Clontech) wurden bei 42°C über Nacht in einem Hybridisierungspuffer mit 2 × SSC, Den­ hardt-Lösung, Formamid und Heringssperma-DNA sowie der spezifischen Sonde hybridisiert. Zum Screenen der Phagenbank wurden die Filter über Nacht bei 65°C in "Church"-Lösung (1 M Na₂HPO₄, 1 M NaH₂PO₄ × H₂O, pH 7,2; 7% SDS, 10 mM EDTA, pH 8,0) hybridisiert. Die Filter wurden zweimal bis dreimal bei 65 °C in 2 × SSC/0,1% SDS gewaschen und mit diesen bei -70°C ein Kodak-Film oder Fuji-Film 24 bis 48 Stunden belichtet.

Southern Blot fanden analog mit Restriktionsenzym-verdauter DNA statt.

Sequenzierung

Sequenzierungsreaktionen wurden mit der "dye terminator chemistry" (Amers­ ham) durchgeführt und die Sequenz wurde mittels eines automatischen Sequen­ zierungsgeräts (Modell 373A/377 von Applied Biosystems) bestimmt.

Mutationsanalysen RT-PCR Amplifikation der DKC1 cDNA für die Mutationsanalyse

Gesamt-RNA und dann poly(A) mRNA wurden von entweder primären Fibrobla­ sten (Patienten GM 1774A und AR) oder EBV-transformierten Lymphoblastoid- Zellinien (Patienten BD, EV HR) unter Verwendung von RNAeasy und Oligotex system (Qiagen) extrahiert. Der erste cDNA-Strang wurde unter Verwendung von Random-Hexamer-Primern synthetisiert. Die kodierende Region wurde in vier überlappenden cDNA-Fragmenten unter Verwendung folgender Primer abgeleitet von der DKC1 cDNA synthetisiert:

Die PCR wurde mit einem Anfangszyklus von 94°C für 3 Minuten, dann 30 Zyklen von 94°C für 60 sec., 58°C für 60 sec. und 72°C für 60 sec. gefolgt von 72°C für 10 Min. durchgeführt.

Bestätigung der Mutationen und Familiensegregationsanalysen

Die Anwesenheit jeder der Mutationen konnte durch Restriktionsverdau aufgrund des Vorhandenseins oder des Verlusts einer spezifischen Restriktionsschnittstelle bestätigt werden: Patient EV (-Mnll), HR (+Tail), AR (-Apol), GM1774A (-Xmnl). Im Fall der Mutation bei Patient BD wurde das Restriktionsmuster nicht ge­ ändert. Jedoch war es durch Verwendung eines Primers mit einem einzelnen Mismatch möglich eine BspHI-Schnittstelle zu erzeugen. Die Mutationen in den Patienten AR, HR und GM1774A wurden durch genomische Amplifikation gefolgt von geeignetem Restriktionsverdau mit dem Primerpaar XAP191 F25 (5'- ATTGCCAGAAGAAGATGTAGCC-3') und XAP101R27 (5'-TCTCTTCAGAG- GATTTGAACC-3') bestätigt. Die Mutation bei Patient EV wurde durch genom­ ische Amplifikation unter Verwendung des Primerpaares XAP101F26 (5'-AAGTTCTTATCAAACCTGAATCC-3') und XAP101R25 (5'-AAGTATCCGTCGAATCCAGG-3') untersucht. Durch Größenvergleich der PCR-Produkte aus der cDNA und genomischen DNA war sichtbar, daß beide Primerpaare Intronsequenzen flankierten. Die BD-Mutation wurde durch genom­ ische Amplifikation unter Verwendung der Primer NAP7F (5'-CAGGGCCTTCT- GGACAATCATG-3') [das unterstrichene Nukleotid führt ein Mismatch in die Sequenz ein] und DYS3R (5'-GTAGTCAACATACTCCTGC-3') analysiert. Nach­ folgend zu der Amplifikation und dem Verdau wurden die Fragmente auf einem 2% Agarosegel analysiert. Das Vorhandensein jeder dieser Mutationen wurde in der normalen Population durch Amplifikation und Verdau von genomischer DNA überprüft.

Beispiel 2 Hybridisierungs-Screenen und Identifizierung einer partiellen Gendeletion

Durch genetische Kopplungsanalyse konnte ein Intervall von 1.4 Mb zwischen den DNA-Markern Xq3274 und DXS1108 definiert werden. Durch positionelle Clonierung und Sequenzierung in diesem Bereich in großem Maßstab wurden positionelle Kandidaten für DKC identifiziert werden. Insgesamt 28 partielle cDNA-Sonden, die jedem dieser Kandidatengene entsprachen, wurden für die Suche nach Gendeletionen und Rearrangements in Patienten über Southern- Hybridisierung und die Suche nach Expressionsabnormalitäten über Northern- Hybridisierung verwendet. Für das Screenen wurden zuerst Filter mit genom­ ischer DNA von 10 männlichen Patienten mit DKC verwendet, die entweder mit Taql oder Pstl geschnitten worden war. Unter Verwendung des cDNA-Selek­ tionsclons 39 g 1D14 (der das 3'-Ende des XAP101-Gens umfaßt; Korn et al., Hum. Mol. Genet. 1 (1992), 235-242, und Heiss et al., Methods Mol. Cell. Biol. 5 (1995), 337-344) konnte in einem Patienten von dem Stammbaum DCR-015 eine Deletion nachgewiesen werden (s. Fig. 4). Diese Deletion konnte mit dem Clon 31 g 1K17 bestätigt werden, der sich weiter in Richtung des 5 '-Endes des Gens erstreckt. In Fig. 1a wurden die Stellen der Mutationen angegeben. Die Southern-Analysen wurden mit der genomischen DNA von weiteren 18 Patien­ ten durchgeführt, wobei die vorstehenden cDNA-Sonden verwendet wurden. Es konnten jedoch keine weiteren Deletionen oder Rearrangements beobachtet werden. Hybridisierungen mit 39 g 1D14 unter Verwendung von Filtern mit poly(A)RNA von drei EBV-transformierten Lymphoblastoid-DKC-Zellinien ergaben normale Expressionsmuster.

Beispiel 3 Isolierung der DKC1-cDNA mit vollständiger Länge

XAP101 wurde von dem YAC ACA2 (Rogner et al., Hum. Mol. Gen. 3 (1994), 2137-2146) isoliert, wobei "Alu-long-range"-PCR-Produkte als Substrate für das "Exon-Trapping" und die Hybridisierung mit Xq28-spezifischen Selektionsbanken verwendet wurden (Heiss et al., Methods Mol. Cell. Biol. 5 (1995), 337-344). Die partielle cDNA-Konsensus-Sequenz mit einer Länge von 1740 bp entsprach dem 3'-Ende des Transkripts und diese war aus 10 sich überlappenden cDNA- Selektionsclonen und einem "Exon-trap"-Clon zusammengesetzt worden (Heiss et al., Methods Mol. Cell. Biol. 5 (1995), 337-344). In der vorliegenden Erfindung wurde zum Erhalt der vollständigen 5'- und 3'-Enden der cDNA eine Zufalls­ geprimte und Oligo-dT-geprimte menschliche fötale Hirn-lambdaZAPII-cDNA- Bank (Clontech) gescreent. Es wurde ein Clon mit einer Länge von 2, 3 kb isoliert, der zusätzlich 633 bp in Richtung des 5'-Endes, einschließlich des ATG- Startcodons enthielt. Außerdem konnten mittels einer "5'-RACE" mit einem Gen-spezifischen Primer weitere 92 Basenpaare des 5'-UTR bestimmt werden. Insgesamt besitzt die verfügbare Sequenz eine Länge von 2465 bp, wobei sich der ORF von den Nucleotiden 93-1637 erstreckt und ein putatives Polyaden­ ylierungssignal von den Nukleotiden 2419-2424 vorhanden ist. Die Länge der Sequenz einschließlich des PolyA-Tails entspricht dem durch Northern-Blots identifizierten Transkript mit einer Länge von 2,6 kb (s. Fig. 3). Northern-Blot- Hybridisierungen zeigten ebenfalls, daß DKC1 ein in jedem Zelltyp exprimiertes Gen ist, das sowohl in ausgewachsenen als auch in fötalen Geweben vorhanden ist (s. Fig. 3).

Beispiel 4 Nachweis weiterer Mutationen in der DC1-cDNA

Es wurden mittels RT-PCR überlappende cDNA-Fragmente von Patienten sequen­ ziert, wobei Primer verwendet wurden, die von der DKC1-cDNA-Sequenz ab­ stammen. Fünf Einzelbasen-Fehlsinnmutationen und ein 2-bp-Rearrangement, die zu Aminosäureaustauschen führen, konnten identifiziert werden. Außerdem wurde eine Deletion von 3 bp, die zur Deletion eines Leucinrests führt, nach­ gewiesen (Tabelle 1).

Tabelle1

Mutationen, die in der DKC1 cDNA identifiziert wurden

Claims (14)

1. Nukleinsäure, die für das Protein Dyskerin codiert, wobei die Nukleinsäure umfaßt:

• a) die Nukleinsäure von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Nukleinsäure oder ein Fragment davon, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist,
• b) eine mit der Nukleinsäure von (a) hybridisierende Nukleinsäure oder
• c) eine mit der Nukleinsäure von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte Nukleinsäure,

wobei die unter (a) und (c) definierten Nucleinsäuremoleküle für Proteine, Polypeptide oder Peptide codieren, die mindestens noch eine biologische Aktivität von Dyskerin aufweisen.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei sie eine cDNA oder genomische DNA ist.

3. Vektor, umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 1.

4. Vektor nach Anspruch 3, wobei die Nukleinsäure mit regulatorischen Ele­ menten funktionell verknüpft ist, die die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erlauben.

5. Vektor nach Anspruch 3 oder 4, der ein RNA-Virus oder Retrovirus ist.

6. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 3.

7. Transformante nach Anspruch 6, die ein Bakterium, eine Hefe-, Insekten-, Tier- oder Säugerzelle ist.

8. Protein mit der Funktion von Dyskerin umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist oder ein hiervon durch ein oder mehrere Aminosäurenaustausche unterschiedliches Protein bzw. ein Fragment dieser Proteine, wobei diese veränderten oder unvoll­ ständigen Proteine mindestens noch eine biologische Aktivität von Dyskerin aufweisen.

9. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 8, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 6 oder 7 unter Bedingungen, die die Expression des Proteins erlauben, und Gewinnung des Proteins aus der Kultur.

10. Antikörper, gerichtet gegen das Protein nach Anspruch 8.

11. Verwendung des Proteins nach Anspruch 8 als Reagens zur Diagnose und/oder Therapie von Dyskeratosis Congenita bzw. zur Feststellung einer Prädisposition dafür.

12. Verwendung der Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 als Reagens zur Diagnose und/oder Therapie von Dyskeratosis Congenita bzw. zur Fest­ stellung einer Prädisposition dafür.

13. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 10 als Reagenz zur Diagnose und/oder Therapie von Dyskeratosis Congenita bzw. zur Feststellung einer Prädisposition dafür.

14. Verwendung eines Vektors nach Anspruch 1 oder 2, eines Proteins nach Anspruch 8 oder eines Antikörpers nach Anspruch 10 zur Stabilisierung von Chromosomen bei onkologischen Erkrankungen.