Dyskerin und dafür codierende DNA-Moleküle, diese enthaltende Vektoren, Antikörper gegen Dyskerin und die Verwendung dieser Gegenstände
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die Dyskerin bzw. Proteine mit der biologischen Aktivität von Dyskerin codieren. Die vorliegende Erfindung stellt ferner diese DNA-Moleküle enthaltende Vektoren bereit, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform diese Vektoren zur Expression der erfindungsgemäßen DNA- Moieküle in Prokaryonten oder Eukaryonten geeignet sind. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Arzneimittel und diagnostische Zusammensetzungen, die die vorstehenden DNA-Moleküle bzw. Vektoren enthalten, das davon codierte Protein oder einen dieses Protein spezifisch erkennenden Antikörper. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Diagnoseverfahren, wobei die vorstehend erwähnten Verbindungen eingesetzt werden und womit Dyskeratosis Congenita (DKC) bzw. eine Prädispositioπ in den Frühstadien der Krankheit bei Betroffenen für DKC πach- gewiesen werden können.
Die Xq28-gekoppelte, rezessive Erkrankung Dyskeratosis Congenita (DKC; oder auch "Zinsser-Cole-Engmann-Syndrom" genannt) ist eine seltene kongenitale Multisystemerkrankung, die spätestens im dritten Lebensjahrzehnt bei den meisten betroffenen Patienten infolge einer fortschreitenden Panzytopenie und Knochenmarksversagen einen letalen Verlauf nimmt (Connor et al., Hum.Geπet. 72 (1986), 348-351 ; Amgrimsson et al., J.Med.Genet. 30 (1993), 618-619; Knight et al., J. Med. Geπet. 33, S. 993-995 (1996)). Typisch für die Erkrankung ist die frühe Manifestation von bestimmten Symptomen in ektodermalem Gewebe, wie zum Beispiel netzförmige Hautpigmeπtierung, Nagelwuchsstörungen, Hyperkeratosen oder Mukosa-Leukoplakien (Drachtman und Alter, Am. J. Pediatr. Hemat. Oncol. 14 (1992), S. 297-304 (1992), Dokal et al., Br.J.Haematol. 92 (1996), 775-779). Auf der zytogenetischen Ebene ist das Auftreten von multiplen spontanen Chromosomen- brüchen und Rearrangements in Kulturen von peripheren Blutzelleπ und Hautfibro-
blasten zu beobachten. Daraus wurde gefolgert, daß DKC eine auf chromosomaler Instabilität beruhende Erkrankung ist (siehe den Ubersichtsartikel von Dokal, Br J Haematol 92 (1996), 775-779). Bei der Fanconi-Anamie (eine erbliche Knochenmarkserkrankung mit chromosomaler Instabilität) tritt die chromosomale Instabilität vor allem als Reaktion auf Clastogene auf Es wird jedoch davon ausgegangen, daß Clastogene bei der DKC keine Rolle spielen (Dokal et al , Blood 80 (1992), 3090-3096, Coulthard et al., Br J Haemotol 97S, 12 (1997)) Die beobachtete chromosomale Instabilität in kultivierten DKC-Zellen geht oft mit einer erniedrigten Proliferationsrate und einer veränderten Morphologie einher Dabei scheinen diese Phänomene vor allem in Zellen von solchen Patienten aufzutreten, die schon Anzeichen für eine fortgeschrittene Erkrankung zeigen, und es wird daher davon ausgegangen daß diese Phänomene ein Fortschreiten der Erkrankung widerspiegeln (Dokal et al , Blood 80 (1992), 3090-3096) Schließlich ist noch zu erwähnen, daß Trager von DKC ein vollständig verlagertes Muster der inaktivierung des X-Chromosoms zeigen In den Zellen weiblicher Individuen wird mormalerweise in den frühen Entwicklungsstadien zufällig entweder das mutterliche oder das vaterliche X-Chromosom inaktiviert (Lyonisierung), bei DKC-Träge- πnnen jedoch wird das mütterlich X-Chromosom, das die Mutation tragt, bevorzugt inaktiviert. Derzeit wird erhofft, daß die verlagerte X-chromosomale Inaktivierung vorläufig als diagnostischer Marker und als Bestätigung des X-chrom osomalen Erbgangs dienen kann. Dies steht in Übereinstimmung mit der Beobachtung, daß der Gendefekt bei DKC zu einem Wachstumsnachteil bei den Zellen führt, bei denen dieser exprimiert wird (Devriendt et al., Am.J.Hum.Genet. 60 (1997), 581- 587; Vulliamy et al., Blood 90, S. 2213-2216 (1997)).
Da bisher das für die DKC verantwortliche Gen nicht bekannt war, konnte diese Erkrankung bisher nur aufgrund phanotypischer Merkmale diagnostiziert werden, wobei von Nachteil ist, daß die Diagnose nicht eindeutig und erst nach Entwicklung des Vollbilds der Erkrankung möglich ist Letzteres hat zur Folge, daß es dann für eine therapeutische Intervention oft zu spat ist. Da die Pathogenese der DKC bisher nicht geklart werden konnte, ist die Therapie im wesentlichen symptomatisch und palliativ
Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, diese Nachteile bisheriger Diagnoseverfahren zu überwinden, d.h. eine molekularbiologische Diagnostik, die auch eine Frühdiagnostik erlaubt, bereitzustellen.
Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht. Es konnte ein DNA-Molekül isoliert und identifiziert werden (DKC1-Gen), das in Zusammenhang mit DKC steht und das Protein Dyskerin codiert. Alle bislang untersuchten Patienten mit DKC zeigen Änderungen in der Nucleinsäuresequenz der mRNA des DKC1-Gens. Bei weiteren Analysen sind jedoch außerdem Mutationen im intron bzw. den Exon-/lntron-Übergängen in der genomischen Sequenz und auch im Promotor zu erwarten.
Die Identifizierung eines für DKC verantwortlichen Gens ist von Interesse, da dies einen Beitrag zur Aufklärung der molekularen Pathogenese der DKC und somit verbesserter Therapien gewährleistet. Parallel dazu bildet die Klonierung des DKC- Gens die Grundlage zur Entwicklung diagnostischer Tests, um zukünftig eine zuverlässigere und frühzeitige Diagnose von DKC-Trägem und Betroffenen zu gewährleisten. Darüberhinaus werden funktioneile Analysen des Proteins zweifellos zum Verständnis der normalen Hämatopoese und der Pathophysiologie anderer ideopathischer aplastischen Anämien beitragen. Die Kenntnis des Typs, der Lokalisation und das Clusterπ von Mutationen sind wichtig, um die Pathophysiologie der Erkrankung und das entsprechende Protein Dyskerin funktioneil zu charakterisieren.
In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, daß die DKC genetisch heterogen ist, insofern es die hier beschriebene X-chromosomale Form (am häufigsten), als auch familiär und sporadisch autosomal rezessiv und autosomal dominant vererbte Fälle gibt.
Die Identifizierung des Gens erfolgte durch die Isolierung einer Reihe von poly- morphen Marken und durch detaillierte Kopplungsanalysen, wodurch der für DKC
verantwortliche Bereich innerhalb der 8 Megabasen (Mb) großen Region Xq28 zuerst auf 3,5 Mb und dann auf 1 ,4 Mb eingeschränkt werden konnte. In diesem Abschnitt von Xq28 waren 57 bzw. 37 mögliche Kandidatengene vorhanden. Mittels Screenen von Southem-Blots mit DNA von DKC-Patienten mit cDNA-Proben von 28 dieser Kandidatengene konnte eine Deletion in einem Patienten mit einer speziellen
Probe nachgewiesen werden (Heiss et al., Methods Mol.Cell.Biol. 5 (1995), 337- 344). Auf diese Weise wurde die cDNA des XAP101-Gens als wahrscheinlichstes Kandidatengen für DKC identifiziert. Anschließend konnte in einem zweiten Patienten eine Punktmutation nachgewiesen werden. Nachdem das 5 '-Ende der cDNA isoliert worden war, wurden zwei weitere Punktmutationen, ein 2-bp-Rearrangement und eine 3-bp-Deletion auf cDNA-Ebene nachgewiesen. Aufgrund der für diese Proteine beschriebenen biologischen Eigenschaften kann davon ausgegangen werden, daß Dyskerin als Chaperon am Transport von ribosomalen Proteinen, bei der Chromosomensegregation und/oder als Pseudouridinsythase an der rRNA- Biosynthese beteiligt ist.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein DNA-Molekül (DKC1), das für das Protein Dyskerin codiert und folgendes umfaßt:
(a) die Nukleinsäure von Fig. 1 , oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA bzw. ein Fragment davon,
(b) eine mit der Nucleinsäure von (a) hybridisierende DNA, oder
(c) eine mit der Nucleinsäure von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
Die unter (a) und (c) definierten Nucleiπsäuremoleküle codieren für Proteine, Polypeptide oder Peptide, die mindestens noch eine der nachstehend beschriebenen biologischen Aktivitäten von Dyskerin aufweisen, beispielsweise als Chaperon beim Transport von ribosomalen Proteinen beteiligt sind, an der Chromoso- mensegregation, als Pseudouridinsynthase an der rRNA-Biosynthese oder dessen
Veränderung oder Ausfall zu DKC führt oder führen kann.
Die unter (a) definierten DNA-Moleküle umfassen auch DNA-Moleküle, die sich gegenüber der in Figur 1 angegebenen Sequenz durch Deletion(en), lnsertion(en), Austausch(e) und/oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen, z.B. alternatives Splicing, unterscheiden bzw. ein Fragment des ursprünglichen Nuclein- Säuremoleküls umfassen, wobei das durch diese DNA-Moleküle codierte Protein noch eine oder mehrere der vorstehend beschriebenen biologischen Aktivitäten von Dyskerin aufweist. Dazu zählen auch Alleivarianten. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Nucleinsäuresequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989). Der Fachmann ist auch in der Lage zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nucleinsäuresequenz codiertes Protein noch über eine der biologischen Aktivitäten von Dyskerin verfügt. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß untersucht wird, ob nach Zugabe des Proteins zu primären Hautfibroblastenkulturen von DKC-
Patienten die erniedrigten Verdopplungszeiten der Zellen (Dokal et al., Blood 80 (1992), 3090-3096) wieder erhöht bzw. normalisiert werden können. Ein weiterer Test zur Überprüfung, ob die Funktion des Proteins noch über die biologische Funktion oder ähnliche biologische Funktionen von Dyskerin verfügt, ist das Zwei- Hybrid-System (Fields et al., Nature 340, S. 245.246 (1989)) oder mittels Immun- präzipitation. Desweiteren eignet sich für die Funktionsanalyse die Überprüfung der intrazellulären Lokalisation, die in manchen Fällen von Mutationen verändert sein kann. Um die erfindungsgemäße biologische Funktion von Dyskerin noch zu erfüllen, muß zu den oben definierten Nukleinsäuremolekülen bzw. zu der in Fig. 1 angegebenen Sequenz eine Homologie von mindestens 50% auf Nukleotidebeπe bestehen.
Der Begriff "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisiert. Der Begriff "hybridisieren" bezieht sich dabei auf konventionelle Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridisierungs- bedingungen, bei denen als Lösung 5xSSPE, 1% SDS, IxDeπhardts-Lösung
verwendet wird und die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise zuerst mit 2xSSC, 1% SDS und danach mit 0,2xSSC bei Temperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C gewaschen (zur Definition von SSPE,SSC und Denhardts-Lösung siehe Sambrook et ai.,supra). Besonders bevorzugt sind striπ- gente Hybridisierungsbedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al ., s.o, beschrieben sind. Bevorzugte Sequenzen, die mit der Nucleinsäure gemäß Fig. 1 hybridisieren, sind die in den Figuren 2, 5 und 6 gezeigten genomischen Sequenzen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNA- Molekül eine cDNA.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNA- Molekül eine genomische DNA, die vorzugsweise von einem Säuger, beispielsweise einem Menschen stammt. Hierzu wird auf die Fig. 2, 5 und 6 verwiesen. Auf Nucleinsäurehybridisierung basierende Screening-Verfahren erlauben die Isolierung der erfindungsgemäßen genomischen DNA-Moleküle aus jedem Organismus bzw. abgeleiteten genomischeπ DNA-Banken, wobei Sonden verwendet werden, die die in Figur 1 angegebene Nucleinsäuresequenz oder einen Teil davon enthalten.
Anhand der geπomischen DNA, beispielsweise aus einem Menschen, können weitere Mutationen identifiziert werden, die an der Entstehung von DKC beteiligt sind, beispielsweise Mutationen die zu Aminosäurenaustauschen, zur Hemmung des Spleißens oder zu fehlerhaftem Spleißen führen.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können auch in einen Vektor bzw. Expressionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese Nucleinsäuremoleküle enthaltende Vektoren. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z.B. pGEMEX, pUC-Derivate (z.B. pUC8), pBR322, pBlueScript, pGEX-2T, pET3b, pQE-
8 und pGFP-Vektoren sowie verwandte fluoreszierende Varianten . Für die Expression in Hefe sind z.B. pY100 und Ycpadl zu nennen, während für die Expres-
sion in tierischen Zellen z.B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Bacuiovirus-Ex- pressionsvektor pAcSGHisNT-A. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül im Vektor mit regulatorischen Elementen funktioneil verknüpft, die dessen Expression in prokaryotischen oder eukaryoti- schen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikations- ursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expres- sion in Prokaryonten, beispielsweise E.coli, zählen der lac-,trp-Promotor oder T7-
Promotor, und für die Expression in Eukaryonten der AOX1- oder GAL1 -Promotor in Hefe, und der CMV-, SV40-, RVS-40-Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor.
Zu geeigneten Vektoren zählen insbesondere auch T7 basierende Expressionsvektoren für die Expression in Bakterien (Rosenberg et al., Gene 56(1987), 125) oder pMSXND für die Expression in Säugerzellen (Lee und Nathans, J.Biol.Chem. 263 (1988), 3521).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle enthaltene Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia-Virus oder ein AAV-Virus, der bei einer Gentherapie von Nutzen ist. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen
DNA-Moleküle auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Lipososmen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).
Allgemeine auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von
Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen
beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., s.o,, beschrieben sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien, Hefe, Insekten- und Tierzelleπ, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugt sind die E. coli Stämme HB101 , DH1 , x1776, JM101 , JM109, BL21 , XLI BIue und SG 13009, der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, HeLa sowie die Insektenzeilen sf9. Verfahren zur Transformation dieser
Wirtszeilen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Die für DKC1 codierenden Klone XAP101/DC1 (cDNA) und PAC23248/DC1 (genomische DNA) wurden am 2. Februar 1998 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig unter den Hinterlegungsnummem DSM 11981 und DSM 11982 hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Dyskerin oder eines Proteins mit einer oder mehreren der biologischen Aktivitäten von Dyskerin, umfassend die Kultivierung der vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins erlauben (vorzugsweise stabile Expression), und Gewinnung des Proteins aus der Kultur. Geeignete Verfahren zur rekombinanten Herstellung des Proteins sind allgemein bekannt (siehe beispielsweise Holmgren, Annu. Rev. Biochem. 54 (1985) , 237; LaVallie et al. , Bio/Technology 11 (1993), 187; Wong, Curr.Opin.Biotech.6 (1995), 517; Romanos, Curr.Opin.Biotech.6 (1995), 527; Williams et al., Curr. Opin. Biotech.6 (1995), 538; und Davies, Curr. Opin. Biotech.6 (1995), 543. Auch geeignete Reinigungsverfahren (beispielsweise präparative Chromatographie, Affinitätschromatographie, beispielsweise Immunoaffinitätschromatographie, HPLC etc.) sind allgemein bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein von den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen codiertes oder nach dem vorstehenden Verfahren erhaltenes Protein mit einer oder mehreren der biologischen Aktivitäten von Dyskerin. Die Aminosäuresequenz eines solchen Proteins ist in Fig. 1 b gezeigt In diesem Zusammenhang soll erwähnt werden, daß das erfindungsgemäße
Protein gemäß üblicher, auf dem Fachgebiet bekannten, Verfahren modifiziert sein kann. Zu diesen Modifikationen zählen Austausche, Insertionen oder Deietionen von Aminosäuren, die die Struktur des Proteins modifizieren, wobei seine biologische Aktivität im wesentlichen erhalten bleibt. Zu den Austauschen zählen vorzugs- weise "konservative" Austausche von Aminosäureresten, d.h. Austausche gegen biologisch ähnliche Reste, z.B. die Substitution eines hydrophoben Rests (z.B. Isoleucin, Valin, Leucin, Methionin) gegen einen anderen hydrophoben Rest, oder die Substitution eines polaren Rests gegen einen anderen polaren Rest (z.B. Arginin gegen Lysin, Glutaminsäure gegen Asparaginsäure etc.). Deietionen können zur Erzeugung von Molekülen führen, die eine deutlich geringere Größe aufweisen, d.h., denen beispielsweise Aminosäuren am N- oder C-Terminus fehlen. Um die erfindungsgemäße biologische Funktion von Dykerin noch zu erfüllen, sollte eine Homologie von mindestens 60% auf Proteinebene vorliegen.
Das erfindungsgemäße DKC1-Gen codiert für ein Peptid/Protein mit 514 Aminosäuren und einem geschätzten Molekulargewicht von 57.665. Es stellt ein stark geladenes Peptid mit einem isolelektrischen Punkt (pl) von 10,2 dar. Somit sind die meisten der geladenen Aminosäuren, die 33,6% (173/515) des Peptids ausmachen, basisch (105/173). Dies beruht zum großen Teil auf der Anwesenheit vieler Lysinre- ste (K), die 12% des Peptids ausmachen und am C-Terminus besonders gehäuft auftreten. Die zweithäufigsten Aminosäuren stellen hydrophobe Reste dar (l,L,M,V; 25% des Peptids). Es gibt klare Hinweise darauf, daß Dyskerin ein Phosphoprotein ist. Außerdem zeigten sich vier wahrscheinliche Myristylationsstellen und zwei konservierte Signale für die nucleäre Lokalisation (NRLS) am N-Terminus (KKHK- KK) und am C-Terminus (KRK) bei Sequenzen der Ratte und beim Menschen.
Insgesamt ist Dyskerin hydrophil, enthält jedoch keine hydrophoben Domänen, die eine für eine Lokalisation in der Membran ausreichende Länge aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Antikörper, die das vorstehend beschriebene Protein spezifisch erkennen. Die Antikörper können monocionale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon, beispielsweise Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente. Vorzugsweise handelt es sich dabei um monocionale Antikörper. Für die Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder
Hühner für einen polyclonalen und Mäuse für einen monoclonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions) protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fusions) protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyclonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei das von den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen codierte Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Monocionale Antikörper können beispielsweise durch das von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495) und Galfre (Meth. Enzymol.73 (1981), 3) beschriebene Verfahren hergestellt werden, wobei Maus-Myelomzellen mit von immunisierten Säugern stammenden Milzzellen fusioniert werden. Diese Antikörper können beispielsweise zur Immunprazipitation oder Immunfluoreszenz der vorstehend diskutierten Proteine oder zur Isolierung verwandter Proteine aus cDNA-Expressionsbanken verwendet werden. Die Antikörper können beispielsweise in Immunoassays in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebunden werden.
Dabei können die Antikörper auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markieruπgsverfahren sind dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immunassays sind ELISA und RIA.
Die Erfindung betrifft ferner von den Erfindern hergestellte Zellinien, die endogenes
DKC1 -Protein aus einem Patienten bzw. einer gesunden Person herstellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der vorstehend beschriebenen DNA-Moleküle, Vektoren, Proteine und/oder Antikörper. Vorzugsweise werden diese zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention oder Behandlung von DKC verwendet. Dabei kann das Arzneimittel in der Gentherapie Verwendung finden, wobei die vorstehend beschriebenen Verfahren bzw. Vektoren zur Ein-
Schleusung der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle Anwendung finden können. Andererseits kann das von den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen codierte Protein direkt verabreicht werden, um so in Zellen, die keine funktionalen Kopien der für Dyskerin oder die vorstehend beschriebenen, verwandten Proteine codierenden Gene mehr besitzen, ausreichende Mengen des biologisch aktiven Proteins zur Verfügung zu stellen. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kommt bevorzugt dann zur Anwendung, wenn in dem betreffenden Patienten biologisch aktives Dyskerin bzw. das verwandte Protein nicht oder in zu geringen Mengen gebildet werden.
Diese Arzneimittel enthalten gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung der
Arzneimittel kann oral oder parenterai erfolgen. Zu den Verfahren für die parente- rale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behan- delnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc.
Über das Vorhandensein einer spontanen chromosomalen Instabilität in Hautfi- broblasten, peripheren Blutzellen und Knochenmarkszellen von DKC-Patienten ist häufig berichtet worden. Untersuchungen von Dokal et al. (s. oben (1992)) zeigten, daß die chromsomale Instabilität mit morphologischen Veränderungen und einer verlangsamten Teilungsrate von kultivierten Hautfi broblasten einhergeht. Die morphologischen und chromosomalen Veränderungen wurden häufiger bei Patien- ten mit einer fortgeschrittenen Symptomatik nachgewiesen, weshalb angenommen wird, daß solche Anomalien mit der Progredienz der Krankheit zunehmen. Weiterhin gibt es einige Studien, die über eine mit Klastogenen (Bleomycin, Diepoxybu-
tan, Mitomycin-C, 4-Nitroquiπolin-1-Oxid) induzierte Chromosomenbrüchigkeit bei DKC berichten.
Aufgrund der beschriebenen biologischen Funktionen von Dyskerin in der Zelle können die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen DNA-Moleküle, Vektoren, Proteine und Antikörper zur Herstellung eines Arzneimittels (1) zur Verwendung als Wachstumsfaktor, (2) zur Aktivierung des Zellzyklus, (3) zur Stabilisierung von Chromosomen bei onkologischen Erkrankungen sowie (4) zur Vermeidung vorzeitiger Alterung durch beschleunigte Apoptoseprozesse (Beeinflussung der Telomerase) verwendet werden und somit bei den vorstehenden Anomalien eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Dyskerin bzw. die verwandten Proteine mit den gleichen oder ähnlichen biologischen Eigenschaften können auch als Zusatz für Arzneimittel zur Verbesserung des Transports des therapeutischen Wirkstoffs verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine diagnostische Zusammensetzung, die das vorstehend beschriebene DNA-Molekül oder den Antikörper enthält oder Kombinationen davon, gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten Nachweismittel.
Das erfindungsgemäße, wie vorstehend definierte DNA-Molekül kann auch als Sonde verwendet werden, um DNA-Moleküle zu isolieren, die beispielsweise von einer anderen Spezies oder einem anderen Organismus stammen und ein Protein codieren mit einer der biologischen Aktivitäten von Dyskerin. Vorzugsweise weist dazu die Sonde eine Länge von mindestens 10, besonders bevorzugt mindestens 15 Basen auf. Geeignete, auf Hybridisierung basierende Nachweisverfahren sind dem Fachmann bekannt. Geeignete Markierungen für die Sonde sind dem Fach- mann ebenfalls bekannt und dazu zählen beispielsweise Markierung mit Radioisotopen, Biolumineszenz-, Chemilumineszenz-, Fluoreszenzmarkem, Metallchelaten, Enzymen etc..
Darüber hinaus kann dies auch durch eine PCR (Wiedmann et al., PCR Methods Appl. 3, S. 551-564 (1994); Saiki et al., Nature 324, S. 163-166 (1986)) oder "Ligase chain reaction" (LCR) (Taylor et al., Curr. Opin. Biotechnol. 6, S. 24-29 (1995); Rouwendal et al., Methods Mol. Biol. S. 149-156 (1996)) erfolgen, wobei die Primer von der Sequenz in Figur 1 abgeleitet sind und wobei geeignete Primer (hinsichtlich Länge, Komplementarität zur Matritze, dem zu amplifizierenden Bereich etc.) vom Fachmann gemäß üblicher Verfahren entworfen werden können.
Die vorstehend beschriebenen Verfahren erlauben auch die Identifizierung weiterer Mutationen, die in Zusammenhang mit DKC stehen, wobei die Sequenz von DKC1 aus gesunden Personen mit der aus dem jeweiligen Patienten verglichen wird.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von DKC oder einer Prädisposition für DKC in vitro, die folgenden Schritte umfassend:
Isolierung von Nucleinsäure aus dem Patienten, Durchführung einer LCR oder PCR mit geeigneten Primern oder einer Hybridisierungsanalyse mit einer oder mehreren geeigneten Sonden, - Vergleich der Längen der amplifizierten bzw. hybridisierenden
Fragmente mit den Längen von Kontrollfragmenten aus dem nichtmutierten DKC1-Gen, oder
Sequenzierung der amplifizierten Fragmente und Vergleich mit der Sequenz von Kontrollfragmenten aus dem nichtmutierten DKC1-Gen, wobei Längenunterschiede oder Mutationen, die zu Substitutionen, Deietionen oder Additionen von Aminosäuren oder zu vorzeitiger Termination der Translation führen, indikativ für DKC oder eine Prädisposition für DKC sind oder wegen der Heterozygotie der Mutation einen Träger der DKC identifizieren können.
Das Feststellen einer Prädisposition für DKC gibt großen Sinn im Rahmen der
pränatalen Diagnostik. Sollte man bei diesen Untersuchungen feststellen, daß der aus dem Embryo entstehende Mensch im späteren Leben DKC entwickeln wird, könnte man schon bei der Geburt Nabelschnurblut entnehmen, daraus hämopoieti- sche Zellen extrahieren und aufbewahren, um bei Ausbruch der Erkrankung diese an den Erkrankten zurückzugeben. Dadurch sollte der Verlauf der Erkrankung gebremst werden.
Bei oben genanntem Verfahren können dem Fachmann bekannte Methoden bezüglich der Präparation von DNA oder RNA aus biologischen Proben, des Restriktionsverdaus der DNA, der Auftrennung der Restriktionsfragmeπte auf nach
Größe auftrennenden Gelen, beispielsweise Agarosegelen, der Herstellung und Markierung der Sonde und des Nachweises der Hybridisierung, beispielsweise über "Southern-Blot"; angewandt werden.
Der vorstehende Nachweis kann auch über PCR oder LCR durchgeführt werden.
Dabei werden Primer verwendet, die die Dyskerin codierende Sequenz oder geeignete Teilbereiche flankieren. Diagnostisch von Bedeutung sind dabei Am- plifikationsprodukte von DNA aus dem fraglichen Gewebe, die sich, beispielsweise hinsichtlich ihrer Länge und/oder der Sequenz, von den Amplifikationsprodukten von DNA aus gesundem Gewebe unterscheiden.
In einer alternativen Ausführungsform können DKC oder die Prädisposition für DKC auch durch ein Verfahren diagnostiziert werden, das folgende Schritte umfaßt:
Isolierung von RNA aus dem Patienten, - Durchführung einer Northern-Analyse mit einer oder mehreren geeigneten Sonden,
Vergleich der Konzentration und/oder Länge der Dyskerin- mRNA der Patientenprobe mit einer Dyskerin-mRNA einer gesunden Person, wobei Längenunterschiede oder das Fehlen bzw. eine geringere Konzentration der Dyskerin-mRNA (beispielsweise bedingt durch Mutationen in regulatorischen Sequenzen, die mit der Transkription in Zusammenhang stehen)
im Vergleich zur Kontroll-mRNA indikativ für DKC oder eine Prädisposition für DKC sind.
Bei diesem Verfahren können dem Fachmann bekannte Methoden bezüglich der Präparation von Gesamt-RNA bzw. poly(A) +RNA aus biologischen Proben, der
Auftrennung der RNAs auf nach Größe auftrennenden Gelen, beispielsweise denaturierenden Agarosegelen, der Herstellung und Markierung der Sonde und des Nachweises über "Northern-Blot" angewandt werden.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform können DKC oder die Prädisposition für DKC auch durch ein Verfahren diagnostiziert werden, das folgende Schritte umfaßt:
Gewinnung einer Zellprobe von dem Patienten,
In kontaktbringen der so erhaltenen Zellprobe mit dem vorste- hend beschriebenen erfindungsgemäßen Antikörper als Sonde unter Bedingungen, die die Bindung des Antikörpers an Dyskerin bzw. das verwandte Protein erlauben, wobei eine nicht- stattgefundene oder schwache Bindung des Antikörpers auf eine mangelnde oder erniedrigte Expression von Dyskerin hinweisen, die indikativ für DKC oder eine Prädisposition für
DKC ist.
Dieser Nachweis kann ebenfalls unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Standardtechniken durchgeführt werden. Diesem sind auch Zellaufschiußverfahren bekannt, die die Isolierung des Proteins auf eine solche Weise erlauben, daß dieses mit dem Antikörper in Kontakt gebracht werden kann. Der Nachweis des gebundenen Antikörpers erfolgt vorzugsweise über Immunassays, beispielsweise Westem-Blot, ELISA, RIA, Immunfluoreszeπz oder FACS..
Die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren können auch als pränatale Diagnoseverfahren gemäß dem Fachmann bekannten Techniken durchgeführt werden.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Kits zur Durchführung der erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren, die den erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Fragment davon, ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül als Sonde oder ein für PCR oder LCR geeignetes, auf der Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Mole- küls basierendes Primerpaar enthalten, gegebenenfalls in Kombination mit einem geeigneten Nachweismittel.
Je nach Ausgestaltung des mit den erfindungsgemäßen Kits durchzuführenden Diagnoseverfahrens können die in dem Kit enthaltenden DNA-Moleküle, Antikörper oder Fragmente davon an einem geeigneten Träger immobilisiert sein.
Von den Erfindern wurde herausgefunden, daß DKC hauptsächlich Gewebe betrifft, die sich schnell teilende Zellen, z.B. solche des Epitheliums oder des hämopoieti- schen Systems, enthalten. Dies bedeutet, daß Dyskerin bei der Aufrechterhaltung der Zellproliferation und/oder beim Überleben von Zellen beteiligt ist. Normales
Dyskerin trägt zur Aufrechterhaltung chromosomaler Stabilität bei. Dies bedeutet, daß ein Defekt in DKC eine Anfälligkeit zur Entwicklung bestimmter Krankheiten nach sich zieht, z.B. eine vorzeitige Alterung auslöst, die Wahrscheinlichkeit zur Entwicklung von Krebs erhöht und Apoptose-Prozesse beschleunigt. Weiter wurde bestätigt, daß DKC zu der Gruppe von Krankheiten gehört, bei denen chromosomale Instabilität eine Rolle spielt. Diese beinhalten Fanconi's Anämie (FA), Bloom's Syndrom, Wemer-Syndrom, Ataxia-Telangiectasia (AT) und "Nijmegen Breakage Syndrom".
Die Erfindung wird nun weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:
Fig. 1 : Nukleinsäuresequenz der cDNA des DKC1-Gens
Fig.1a: Nucieinsäuresequenz der cDNA des DKC1-Gens
Start- und Stopcodons sind fettgedruckt, unterstrichen und in Kursiv- Schrift. Positionen einiger identifizierter Missense-Mutationen sind klein fettgedruckt und mit Pfeilen markiert. Der Bereich der aufgefundenen Deletion in einem Patienten ist umrahmt und beginnt mit der
fettgedruckten Schrift
Fig. 1 b: von Fig. 1 abgeleitete Aminosäuresequenz
Fig. 2: Unvollständige Nukleinsäuresequenz (genomische DNA) und Exon-
Intron-Struktur des DKC1-Gens. Die Exonsequenzen sind in fettgedruckter Kursivschrift hervorgehoben und von 1 bis 15 durch- nummeriert.
Fig. 3: Expressionsanalyse des DKC1 -Transkripts.
Northern-Blots, bei denen RNAs aus verschiedenen Geweben verwendet wurden, wurden mit den cDNA-Clonen 31 gK17 und 39g1 D14 hybridisiert. Diese erstrecken sich von Nukieotid 744 nach Nukleotid 2143 und decken das 3'-Ende des vollständigen offenen Leserah- mens (ORF) ab. In den linken und mittleren Spuren wurde RNA aus erwachsenen Geweben, in den rechten Spalten aus fötalem Gewebe aufgetragen.
Fig. 4: Southern-Blot-Analysen Die Southern Blot Analyse zeigt die 3'-End DKC Deletion in Patient
HO a: zeigt die Hybridisierung der Sonde 39g1 D14 (DKC1 cDNA- Nukleotide 1523-2143) mit Taql-Verdaus von 10 nicht miteinander verwandten DKC-Patienten; Patient HO ist in Spur 7; die schwachen Banden, die in allen Spuren zu sehen sind, sind Restsignale früherer Hybridisierungsexperimente, außer für das 1 ,6 kb Fragment in Spur 7, welches aus dem partiell zerstörten DKC1-Gen in Patient HO stammt; b: zeigt die Hybridisierung von Sonde 31 g1 K17 (DKC1 cDNA- Nukleotide 744-1565) an Taql-Verdaus von DNA aus Patient
HO in Spur 1 und einer normalen Kontrolle in Spur 2.
Fig. 5: Gegenüber Fig. 2 vervollständigte genomische Sequenz mit Exon-
Intron-Struktur des DKC1-Gens der Exons 1-11. Die Exonsequenzen sind unterstrichen und von 1 bis 11 durchnummeriert.
Fig. 6: Gegenüber Fig. 2 vervollständigte genomische Sequenz mit Exon-
Intron-Struktur des DKC1-Gens der Exons 12-15. Die Exonsequenzen sind unterstrichen und von 12 bis 15 durchnummeriert.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1 Allgemeine Verfahren
cDNA-lsolierunq und Clonierung
Die Erzeugung von angereicherten cDNA-Selektionsbanken (Korn et al., Hum.M- ol. Genet. 1 (1992), 235-242), "Alu-long-range"-PCR-Produkten aus YACs (Wilgen- bus et al., Methods Mol.Cell.Biol., 5, S. 214-221 (1995)), und die Verwendung dieser Produkte als Substrate für die Bestimmung von Exons ("Exon-Trapping") erfolgte wie beschrieben. Das 5 '-Ende des hinterlegten Klons XAP101 wurde durch das Screenen einer Zufalls-geprimten und oligo-dT-geprimten menschlichen fötalen Him-lambdaZAPII-cDNA-Bank (Clontech) mit den verfügbaren cDNA-Selektions- clonen (Korn et al., Hum. Mol. Genet. 1 , S. 235-242 (1992)) bestimmt. Positive Plaques wurden solange erneut gescreent bis einzeln isolierbare Clone erhalten werden konnten. Die isolierten in Phagen enthaltenen cDNA-Clone wurden durch Exzisionsreparatur entsprechend den Angaben des Herstellers in Plasmidvektoren eingebracht.
Sonden
An die für die Anreicherungszyklen verwendete cDNA wurden SK-Sequeπzadap- toren ligiert (Korn et al., Hum. Mol. Genet. 1 (1992), 235-242). Die erhaltenen cDNA-
Selektionsprodukte wurden in den Vektor pAmplO (Gibco) cloniert. cDNA-lnsertio- nen wurden direkt aus bakteriellen Clonen über PCR-Amplifikation (94°C, 2 min; 35 Zyklen 94 °C , 1 min, 60 °C, 1 min, 72 °C, 1 min; 72 °C, 10 min) mit dem Primer SK isoliert. Die Insertionen wurden Gei-gereinigt (Qiagen) und mit alpha-32P[dCTP] unter Verwendung von Zufallshexomeren markiert (spezifische Aktivität. 5-10 x 106 cpm).
Southern- und Northern-Blots
Northem-Blots mit RNAs aus verschiedenen Geweben (7760-1 , Clontech) wurden bei 42 °C über Nacht in einem Hybridisierungspuffer mit 2xSSC, Deπhardt-Lösung,
Formamid und Heringssperma-DNA sowie der spezifischen Sonde hybridisiert.
Zum Screenen der Phageπbank wurden die Filter über Nacht bei 65°C in "Church"-
Lösung (1 M Na2HP04, 1 M NaH2P04 x H20, pH 7,2; 7% SDS, 10 mM EDTA, pH
8,0) hybridisiert. Die Filter wurden zweimal bis dreimal bei 65 °C in 2xSSC/0,1% SDS gewaschen und mit diesen bei -70 °C ein Kodak-Film oder Fuji-Film 24 bis 48
Stunden belichtet.
Southern Blot fanden analog mit Restriktionsenzym-verdauter DNA statt.
Sequenzierung
Sequenzierungsreaktionen wurden mit der "dye terminator chemistry" (Amersham) durchgeführt und die Sequenz wurde mittels eines automatischen Sequenzierungsgeräts (Modell 373A/377 von Applied Biosystems) bestimmt.
Mutationsanalysen
RT-PCR Amplifikation der DKC1 cDNA für die Mutationsanalyse Gesamt-RNA und dann poly(A) mRNA wurden von entweder primären Fibroblasten (Patienten GM1774A und AR) oder EBV-transformierten Lymphoblastoid-Zellinien (Patienten BD, EV, HR) unter Verwendung von RNAeasy und Oligotex System
(Qiagen) extrahiert. Der erste cDNA-Strang wurde unter Verwendung von Random- Hexamer-Primern synthetisiert. Die kodierende Region wurde in vier überlappenden
cDNA-Fragmenten unter Verwendung folgender Primer abgeleitet von der DKC1 cDNA synthetisiert:
Nukleotide 92-358 DYS1F 5'-GGCGGATGCGGAAGTAAT-3' DYS1R 5'-GTCAAGATTAATGAAACCTG-3'
Nukleotide 297-832: DYS2F 5'-TATACACCTCTTGCATGTG-3' DYS2R 5'-CATGACTCCAGAACGAACCCTCC-3'
Nukleotide 762-1331 DYS3F: 5'-ACCTACATTCGGACATTATG-3' DYS3R 5'-GTAGTCAACATACTCCTGC-3'
Nukleotide 1259-1671 : DYS4F; 5'-GAAGCTGATGATCAAGCAG-3' DYS4R 5'-AACATGTTTTCTCAATAAGGC-3'
Die PCR wurde mit einem Anfangszyklus von 94°C für 3 Minuten, dann 30 Zyklen von 94°C für 60 sec, 58°C für 60 sec. und 72°C für 60 sec. gefolgt von 72°C für 10 Min. durchgeführt.
Bestätigung der Mutationen und Fa iliensegregationsanalysen Die Anwesenheit jeder der Mutationen konnte durch Restriktionsverdau aufgrund des Vorhandenseins oder des Verlusts einer spezifischen Restriktionsschnittsteile bestätigt werden: Patient EV (-Mnll), HR (+Tail), AR (-Apol), GM1774A (-Xmnl). Im
Fall der Mutation bei Patient BD wurde das Restriktionsmuster nicht geändert. . Jedoch war es durch Verwendung eines Primers mit einem einzelnen Mismatch möglich eine BspHI-Schnittstelle zu erzeugen. Die Mutationen in den Patienten AR, HR und GM1774A wurden durch genomische Amplifikation gefolgt von geeignetem Restriktionsverdau mit dem Primerpaar XAP191F25 (5'-ATTGCCAGAAGAA-
GATGTAGCC-3') und XAP101 R27 (5'-TCTCTTCAGAGGATTTGAACC-3') bestätigt. Die Mutation bei Patient EV wurde durch genomische Amplifikation unter Verwendung des Primerpaares XAP101F26 (5'- GTTCTTATCAAACCTGAATCC-3') und XAP101 R25 (5'-AAGTATCCGTCGAATCCAGG-3') untersucht. Durch Größenvergleich der PCR-
Produkte aus der cDNA und genomischen DNA war sichtbar, daß beide Primerpaare Intronsequenzen flankierten. Die BD-Mutation wurde durch genomische
Amplifikation unter Verwendung der Primer NAP7F (5'-CAGGGCCTTCTGGA- CAAICATG-3') [das unterstrichene Nukleotid führt ein Mismatch in die Sequenz ein] und DYS3R (5'-GTAGTCAACATACTCCTGC-3') analysiert. Nachfolgend zu der Amplifikation und dem Verdau wurden die Fragmente auf einem 2% Agarosegel analysiert. Das Vorhandensein jeder dieser Mutationen wurde in der normalen Population durch Amplifikation und Verdau von genomischer DNA überprüft.
Beispiel 2
Hybridisierungs-Screenen und Identifizierung einer partiellen Gendeletion
Durch genetische Koppiungsanalyse konnte ein Intervall von 1.4 Mb zwischen den DNA-Markern Xq3274 und DXS1108 definiert werden. Durch positionelle Clonie- rung und Sequenzierung in diesem Bereich in großem Maßstab wurden positioneile Kandidaten für DKC identifiziert werden. Insgesamt 28 partielle cDNA-Sonden, die jedem dieser Kandidatengene entsprachen, wurden für die Suche nach Gende- letionen und Rearrangements in Patienten über Southem-Hybridisierung und die Suche nach Expressionsabnormalitäten über Northern-Hybridisierung verwendet. Für das Screenen wurden zuerst Filter mit genomischer DNA von 10 männlichen Patienten mit DKC verwendet, die entweder mit Taql oder Pstl geschnitten worden war. Unter Verwendung des cDNA-Selektionsdons 39g1 D14 (der das 3 '-Ende des
XAP101-Gens umfaßt; Korn et al., Hum. Mol. Genet. 1 (1992), 235-242, und Heiss et al., Methods Mol.Cell.Biol. 5 (1995), 337-344) konnte in einem Patienten von dem Stammbaum DCR-015 eine Deletion nachgewiesen werden (s. Fig. 4). Diese Deletion konnte mit dem Clon 31g1K17 bestätigt werden, der sich weiter in Rich- tung des 5 '-Endes des Gens erstreckt. In Fig. 1a wurden die Stellen der Mutationen angegeben. Die Southem-Analysen wurden mit der genomischen DNA von weiteren 18 Patienten durchgeführt, wobei die vorstehenden cDNA-Sonden verwendet wurden. Es konnten jedoch keine weiteren Deietionen oder Rearrangements beobachtet werden. Hybridisierungen mit 39g1 D14 unter Verwendung von Filtern mit poly(A)RNA von drei EBV-traπsformierten Lymphoblastoid-DKC-Zellinien ergaben normale Expressionsmuster.
Beispiel 3
Isolierung der DKCI-cDNA mit vollständiger Länge
XAP101 wurde von dem YAC ACA2 (Rogner et al., Hum. Mol. Gen. 3 (1994), 2137- 2146) isoliert, wobei "Alu-long-range"-PCR-Produkte als Substrate für das "Exon-
Trapping" und die Hybridisierung mit Xq28-spezifischen Selektionsbanken verwendet wurden (Heiss et al., Methods Mol.Cell.Biol. 5 (1995), 337-344). Die partielle cDNA-Konsensus-Sequenz mit einer Länge von 1740 bp entsprach dem 3 '-Ende des Transkripts und diese war aus 10 sich überlappenden cDNA-Selektionsdonen und einem "Exon-trap"-Clon zusammengesetzt worden (Heiss et al., Methods
Mol.Cell.Biol. 5 (1995), 337-344). In der vorliegenden Erfindung wurde zum Erhalt der vollständigen 5'- und 3 '-Enden der cDNA eine Zufalls-geprimte und Oligo-dT- geprimte menschliche fötale Him-lambdaZAPII-cDNA-Bank (Clontech) gescreent. Es wurde ein Clon mit einer Länge von 2,3 kb isoliert, der zusätzlich 633 bp in Richtung des 5 '-Endes, einschließlich des ATG-Startcodons enthielt. Außerdem konnten mittels einer "5 '-RACE" mit einem Gen-spezifischen Primer weitere 92 Basenpaare des 5'-UTR bestimmt werden. Insgesamt besitzt die verfügbare Sequenz eine Länge von 2465 bp, wobei sich der ORF von den Nucleotiden 93- 1637 erstreckt und ein putatives Polyadenylierungssignal von den Nukleotiden 2419-2424 vorhanden ist. Die Länge der Sequenz einschließlich des PolyA-Tails entspricht dem durch Northem-Blots identifizierten Transkript mit einer Länge von 2,6 kb (s. Fig. 3). Northerπ-Blot-Hybridisierungen zeigten ebenfalls, daß DKC1 ein in jedem Zelltyp exprimiertes Gen ist, das sowohl in ausgewachsenen als auch in fötalen Geweben vorhanden ist (s. Fig. 3).
Beispiel 4
Nachweis weiterer Mutationen in der DKCI-cDNA
Es wurden mittels RT-PCR überlappende cDNA-Fragmente von Patienten sequen- ziert, wobei Primer verwendet wurden, die von der DKC1-cDNA-Sequenz abstammen. Einige gefundene Mutationen sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt.
iVIulnlion und l'osilion I?e(rollcικ's Λmi inosiiui :MI.S(:MISC1I Λrl der lYlutnlion IM eque in DKC1 cDINΛ ftxυn im Dyskoπii
C97T 1 Λla-2-Val Misscnse I
1VS2 -5 (7(i IVS2 keine pulative Splcißsite l Mutation
TI9SG (= Patient . AR) 3 Fhc-30Λ/;ιl Misscnsc Ix
CT1" 201-203 tlcl Leu 37 clel einzelne Λminosäiπc Ix
(= Patient GM 1774A) clclion, Missensc
Λ207G 3 Lys-39-Glu Misscnse lx
(.'21 IG (= HR) 3 Pιo-40-Λrg Misscnse lx
G213Λ 3 Glu-41-I,ys Misscnse lx 286G 4 Λrg-65-T r Misscnse lx rT30 - 07l"Λ (= EV) 4 Leu-72-Tyr Misscnse l
G1U53G 10 Lcιι-321-Vπl Misscnsc lx
< .1 I 2Λ 11 Me(-35()-lle Misscnse l
111 1 C 11 Met-350-Tlιι issensc lx
Cl 150T 11 Λla-353-Val Missensc ->llx i i 1290A 12 Gly-492-Glιι issensc l
GI297Λ (= BD) 12 Gly-402-GIu Misscnse lx ab Nukleotid 1507 15 letzt cn 22 Aminosäuren Partielle Gendeletien l delelierl deletieit