EP1137772A1 - Spermatogenese-protein - Google Patents

Spermatogenese-protein

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Publication number
EP1137772A1
EP1137772A1 EP99965394A EP99965394A EP1137772A1 EP 1137772 A1 EP1137772 A1 EP 1137772A1 EP 99965394 A EP99965394 A EP 99965394A EP 99965394 A EP99965394 A EP 99965394A EP 1137772 A1 EP1137772 A1 EP 1137772A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
protein
spermatogenesis
amino acid
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99965394A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Zdenek Sedlacek
Annemarie Poustka
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Publication of EP1137772A1 publication Critical patent/EP1137772A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a spermatogenesis protein, a DNA coding for such a protein and a method for producing such a protein.
  • the invention further relates to antibodies directed against the protein and to the use of the DNA and the protein for examining or influencing spermatogenesis.
  • Spermatogenesis is the formation of sperm in mammals or humans. This formation takes place in the testicles. During spermatogenesis, especially the pachytene stage of meiosis, the X and Y chromosomes attach to each other and form a so-called sex body. In this the X and Y chromosomes are inactive, i.e. they are not transcribed.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a means by which spermatogenesis can be examined and, if necessary, ways can be shown by means of which it is possible to intervene in spermatogenesis.
  • the present invention is based on the applicant's knowledge that the X-chromosomally localized gene XAP-5 has a partner gene which is autosomally localized and is expressed in many tissues. For example, the expression can be found in the testes, where it is particularly strong in spermatogenesis, in particular in the stages of the primary and secondary spermatocytes and the round spermatids.
  • the partner gene is designated X5L and is located in the human genome on chromosome 6 in the 6pter region. The applicant has isolated and characterized X5L on the PAC clone LLNLp 704K12294Q13.
  • the DNA comprises a coding sequence and an intron and leads to an approximately 1.6 kb cDNA.
  • the applicant has also recognized that mutations in the X5L protein can impair spermatogenesis.
  • a spermatogenesis protein comprising the amino acid sequence of FIG. 1 or an amino acid sequence different therefrom by one or more amino acids, with a homology between the latter amino acid sequence and the amino acid sequence of FIG. 1 of at least 80%.
  • an amino acid sequence different from one or more amino acids encompasses any amino acid sequence coding for an X5 protein which has a homology of at least 80% to that of Fig. 1.
  • the amino acid sequence can differ from that of Fig. 1 by additions, deletions , Substitutions and / or inversions of individual amino acids, in particular the amino acid sequence can be that of FIG.
  • nucleic acid which codes for an X5L product.
  • the nucleic acid can be an RNA or a DNA, e.g. B. a cDNA, his.
  • a DNA is preferred which comprises the following:
  • a DNA different by one or more base pairs encompasses any DNA sequence coding for an X5L protein that hybridizes with the DNA of FIG. 1 and codes for an X5L protein whose amino acid sequence has a homology of at least 80% that of Fig. 1.
  • the DNA sequence can differ from the DNA of FIG. 1 by additions, deletions, substitutions and / or inversions of individual base pairs. In particular, the DNA sequence can be that of FIGS. 2-4.
  • hybridization indicates hybridization under normal conditions, in particular at 20 ° C. below the melting point of the DNA sequence.
  • the DNAs of FIGS. 1-4 were h-X5L-c, h-X5L-g, m-X5L-c and m-X5L-g at DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) under DSM 12550, DSM 12553 , DSM 12552 and DSM 12551 on November 26, 1998.
  • DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures
  • a DNA according to the invention can be present as such or in combination with any other DNA.
  • a DNA according to the invention coding for an X5L protein can be present in an expression vector.
  • examples of such are known to the person skilled in the art.
  • an expression vector for E. coli these are, for example, pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T, pET3b and pQE-8.
  • yeast for example, pY100 and Ycpadl are to be mentioned
  • animal cells for example, p CR, pEFBOS, cDM8 and pCEV4 are to be mentioned.
  • the bacculovirus expression vector pAcSGHisNT-A is particularly suitable.
  • suitable cells in order to express the DNA according to the invention which is present in an expression vector.
  • suitable cells include the E. coli strains HB101, DH1, xl776, JM101, JM 109, BL21 and SG 13009, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero and HeLa and the insect cells sf9.
  • DNA according to the invention has to be inserted into an expression vector. He is also aware that this DNA can be inserted in conjunction with a DNA coding for another protein or peptide, so that the DNA according to the invention can be expressed in the form of a fusion protein.
  • Another object of the present invention is an antibody directed against an above protein or fusion protein.
  • Such an antibody can be produced by conventional methods. It can be polyclonal or monoclonal. For its production, it is favorable to immunize animals, in particular rabbits or chickens for a polyclonal and mice for a monoclonal antibody, with an above (fusion) rotein or fragments thereof. Further "boosters" of the animals can be carried out with the same (fusion) protein or fragments thereof. The polyclonal antibody can then be obtained from the serum or egg yolk of the animals. For the monoclonal antibody, animal spleen cells are fused with myeloma cells.
  • Kit Such comprises one or more of the following components:
  • auxiliaries such as carriers, buffers, solvents, controls, etc.
  • the present invention makes it possible to study spermatogenesis.
  • An X5L protein can be detected with an antibody according to the invention. A relationship between an X5L protein and processes in spermatogenesis can be established. An X5L protein can also be used to detect an autoantibody directed against this protein. Both detections can be carried out by conventional methods, in particular a Western blot, an ELISA, immunoprecipitation or by immunofluorescence. Furthermore, the organization and expression of the gene coding for an X5L protein can be detected with a nucleic acid according to the invention, in particular a DNA and primers derived therefrom. This detection can be carried out in the usual way, in particular in a Southern blot, via in situ hybridization or by PCR.
  • the present invention is suitable for taking measures to inhibit or increase the activity of an X5L protein in people.
  • An X5L protein can be inhibited with an antibody according to the invention.
  • an X5L protein especially after coupling to a protein that is not considered foreign by the body, for example transferrin or BSA, the amount of an X5L protein can be increased in people become.
  • a nucleic acid according to the invention in particular a DNA, which is placed under the control of a constitutive or inducible promoter and after its expression to provide an X5L protein in the person or in certain tissues, eg testicles, this leads.
  • the present invention thus represents means for investigating spermatogenesis and intervening in a regulating manner.
  • the latter includes both their activation and their inhibition.
  • the present invention provides means for diagnosing and treating disorders of spermatogenesis.
  • FIG. 1 shows the DNA and amino acid sequences of a spermatogenesis protein (X5L protein) comprising 325 amino acids according to the invention.
  • Sequence is a human cDNA.
  • the DNA comes from the human genome.
  • the cDNA of Fig. 1 begins on
  • Base pair 739 There is an intron between base pairs 828 and 1129.
  • a polyadenylation site is located at base pair 2658.
  • 3 shows the DNA and amino acid sequences of a 334
  • X5L protein comprising amino acids.
  • the DNA sequence is a mouse cDNA.
  • the cDNA of Figure 3 begins at base pair 445 of Figure 4 (A). There is an intron between base pairs 492-1232 of Fig. 4 (A). Between Base pairs 1-1136 of FIG. 4 (B has an intron. A polyadenylation sequence is located on base pair 2306 of FIG. 4 (B).
  • FIG. 6 shows the detection of mRNA of an X5L protein in testes.
  • the presence of such mRNA is limited to tubules (Fig. 6 (A)).
  • mRNA of an X5L protein is present in the stages of the primary and secondary spermatocytes (stars) and round spermatids (RS). Mature sperm are marked with (MS) and sperm togoni with (arrowheads). Sertoli cells (arrows) and Leydig-
  • Cells (L) have no mRNA of an X5L protein.
  • RNA blots from human tissues such as pancreas, adrenal medulla, thyroid, adrenal cortex, testicles, thymus, small intestine, stomach, fetal brain, fetal lungs, fetal liver and fetal kidney obtained from Clontech become one
  • Hybridized A [ ⁇ 32 P] dCTP-labeled X5L protein-specific DNA which lies between base pairs 1073-1409 of the DNA of FIG. 1 is used as the hybridization sample. The hybridization takes place overnight with subsequent washing steps under normal conditions. As a control, the blots are also hybridized with a radioactive ⁇ -actin sample (cf. FIG. 5).
  • mRNA in an X5 L protein is expressed in a wide variety of tissues.
  • the size of the expanded mRNA is 1, 7 and. 4, 3 kb, was on different polyadenylation signals of the DNA of Fig. 1 is due.
  • the expression of mRNA of an X5L protein is shown to be strongest in testes.
  • RNA in situ hybridization to mouse testis tissue is carried out. For this, the method of Wilkinson, D.G. (1992), Oxford University Press, New York. "Antisense” or “sense” RNA samples are used which correspond to base pairs 5-1169 of the DNA from FIG. 1.
  • mRNA of an X5L protein in testicular tissue. It also shows that expression is limited to tubules. At the cellular level, expression of mRNA of an X5L protein is shown in the stages of the primary and secondary spermatocytes as well as the round spermatids. Spermatogonia, mature Sertoli cells and Leyding cells, on the other hand, show no expression of mRNA of an X5L protein.
  • Example 2 Production and purification of a spermatogenesis protein (X5L protein) according to the invention
  • the DNA of FIG. 1 is provided with BAMHI linkers, cleaved with BamHI and inserted into the expression vector pQE-8 (Qiagen) cleaved with BamHI.
  • the expression plasmid pQE-8 / X5L is obtained.
  • pQE-8 / X5L is used to transform E.coli SG 13009 (see Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273).
  • the bacteria are cultivated in an LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicillin and 25 / g / ml kanamycin and induced for 4 h with 60 ⁇ M isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG).
  • Lysis of the bacteria is achieved by adding 6 M guanidine hydrochloride, followed by chromatography (Ni-NTA resin) in the presence of 8 M with the lysate Urea according to the manufacturer's (Qiagen) specifications of the chromatography material.
  • the bound fusion protein is eluted in a pH 3.5 buffer. After neutralization, the fusion protein is subjected to 18% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie blue (cf. Thomas, JO and Kornberg, RD, J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).
  • Example 3 Production and detection of an antibody according to the invention
  • a fusion protein according to the invention from Example 2 is subjected to an 18% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. After staining the gel with 4 M sodium acetate, an approximately 37 kD band is cut out of the gel and incubated in phosphate-buffered saline. Gel pieces are sedimented before the protein concentration of the supernatant is determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, which is followed by a Coomassie blue staining. Animals are immunized with the gel-purified fusion protein as follows:
  • 35 ⁇ g of gel-purified fusion protein in 0.7 ml of PBS and 0.7 ml of complete or incomplete Freund's adjuvant are used per immunization.
  • a fusion protein according to the invention from Example 1 is subjected to SDS polyacrylate gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose filter (cf. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Western blot analysis was performed as in Bock, C.-T. et al.
  • the nitrocellulose filter is incubated for one hour at 37 ° C. with a first antibody.
  • This antibody is rabbit serum (1: 10000 in PBS).
  • the nitrocellulose filter is incubated with a second antibody.
  • This antibody is an alkaline phosphatase-linked monoclonal goat anti-rabbit IgG antibody (Dianova) (1: 5000) in PBS.
  • Antibodies are extracted from egg yolk and tested in a Western blot. There are polyclonal antibodies according to the invention followed up.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Spermatogenese-Protein, eine für ein solches Protein kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Proteins. Ferner betrifft die Erfindung gegen das Protein gerichtete Antikörper sowie die Verwendung der DNA und des Proteins zur Untersuchung bzw. Beeinflussung der Spermatogenese.

Description

Spermatogenese-Protein
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Spermatogenese-Protein, eine für ein solches Protein kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Proteins. Ferner betrifft die Erfindung gegen das Protein gerichtete Antikörper sowie die Verwendung der DNA und des Proteins zur Untersuchung bzw. Beeinflussung der Spermatogenese.
Mit Spermatogenese wird die Bildung von Spermien in Säugetieren bzw. dem Menschen bezeichnet. Diese Bildung erfolgt in den Hoden. Während der Spermatogenese, insbesondere dem Pachytän-Stadium der Meiose, lagern sich die X- und Y- Chromosomen aneinander und bilden einen sog. Sexkörper aus. In diesem liegen die X- und Y-Chromosomen inaktiv vor, d.h. sie werden nicht transkribiert.
Es hat sich nun gezeigt, daß von einigen Genen der X- und Y- Chromosomen Partner-Gene existieren, die autosomal lokalisiert sind. Diese werden u.a. in den Hoden exprimiert, wodurch ihre Genprodukte in der Spermatogenese kompensatorische Funktionen hinsichtlich der entsprechenden inaktivierten Gene der X- und Y-Chromosomen haben.
Ein Eingreifen in die Spermatogenese ist nachwievor ein großes Problem. Dies liegt insbesondere daran, daß die Spermatogenese nicht im Detail verstanden ist.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem die Spermatogenese untersucht und ggfs. Wege aufgezeigt werden können, mit denen in die Spermatogenese eingegriffen werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht. Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß das X-chromosomal lokalisierte Gen XAP-5 ein Partner-Gen aufweist, das autosomal lokalisiert ist und in vielen Geweben exprimiert wird. Beispielsweise ist die Expression in den Hoden zu finden, wobei sie hier besonders stark ist in der Spermatogenese, inbesondere in den Stadien der primären und sekundären Spermatocyten sowie der runden Spermatiden. Das Partner-Gen wird mit X5L bezeichnet und ist im humanen Genom auf Chromosom 6 in der Region 6pter lokalisiert. Der Anmelder hat X5L auf dem PAC-Klon LLNLp 704K12294Q13 isoliert und charakterisiert. Die DNA umfaßt eine kodierende Sequenz und ein Intron und führt zu einer etwa 1.6 kb großen cDNA. Diese kodiert für ein etwa 37 kD großes, 325 Aminosäuren umfassendes mit X5L-Protein bezeichnetes Spermatogenese-Protein (vgl. Figuren 1, 2 und 5,6) . Ferner hat der Anmelder erkannt, daß Mutationen im X5L-Protein die Spermatogenese beeinträchtigen können.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, ein Spermatogenese-Protein (X5L-Protein) bereitzustellen, umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz, wobei zwischen letzterer Aminosäuresequenz und der Aminosäuresequenz von Fig. 1 eine Homologie von mindestens 80 % vorliegt.
Der Ausdruck "eine durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz umfaßt jegliche für ein X5 -Protein kodierende Aminosäuresequenz, die zu jener von Fig. 1 eine Homologie von mindestens 80 % aufweist. Die Aminosäuresequenz kann sich von jener von Fig. 1 durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen einzelner Aminosäuren unterscheiden. Insbesondere kann die Aminosäuresequenz jene von Fig. 3 sein.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukl eins äure , di e für e in X5L- Pro t e in kodi ert . Di e Nukleinsäure kann eine RNA oder eine DNA, z . B . eine cDNA, sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:
(a) Die DNA von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 1 hybridisiert und für ein X5L-
Protein kodiert, dessen Aminosäuresequenz eine Homologie von mindestens 80 % zu jener von Fig. 1 aufweist, oder
(b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
Der Ausdruck "eine durch eine oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA" umfaßt jegliche für ein X5L-Protein kodierende DNA-Sequenz, die mit der DNA von Fig. 1 hybridisiert und für ein X5L-Protein kodiert, dessen Aminosäuresequenz eine Homologie von mindestens 80 % zu jener von Fig. 1 aufweist. Die DNA-Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 1 durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen einzelner Basenpaare unterscheiden. Insbesondere kann die DNA-Sequenz jene der Figuren 2-4 sein. Der Ausdruck "Hybridisierung" weist auf eine Hybridisierung unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA-Sequenz hin.
Die DNAs der Figuren 1-4 wurden als h-X5L-c, h-X5L-g, m-X5L-c bzw. m-X5L-g bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) unter DSM 12550, DSM 12553, DSM 12552 bzw. DSM 12551 am 26. Nov. 1998 hinterlegt.
Eine erfindungsgemäße DNA kann als solche oder in Kombination mit jeglicher anderen DNA vorliegen. Insbesondere kann eine erfindungsgemäße, für ein X5L-Protein kodierende DNA in einem Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z.B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z.B. pYlOO und Ycpadl zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z.B. p CR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4 anzugeben sind. Für die Ex- pression in Insektenzellen eignet sich besonders der Bacculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um die erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E . coli-Stämme HB101, DH1, xl776, JM101, JM 109, BL21 und SG 13009, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise die erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden kann.
Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße DNA exprimierte Protein bzw. Fusionsprotein zu isolieren und zu reinigen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehendes Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions ) rotein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fusions) protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklonalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit. Ein solcher umfaßt eine oder mehrere der folgenden Komponenten:
(a) eine erfindungsgemäße DNA,
(b) ein erfindungsgemäßes Spermatogenese-Protein (X5L- Protein)
(c) einen erfindungsgemäßen Antikörper, sowie
(d) übliche Hilfsstoffe, wie Träger, Puffer, Lösungsmittel, Kontrollen, etc.
Von den einzelnen Komponenten können jeweils ein oder mehrere Vertreter vorliegen. Hinsichtlich der einzelnen Ausdrücke wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen. Diese gelten hier entsprechend .
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, die Spermatogenese zu untersuchen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann ein X5L-Protein nachgewiesen werden. Es kann eine Beziehung zwischen einem X5L-Protein und Vorgängen in der Spermatogenese hergestellt werden. Ferner kann mit einem X5L-Protein ein gegen dieses Protein gerichteter Autoantikörper nachgewiesen werden. Beide Nachweise können durch übliche Verfahren, insbesondere einen Western Blot, einen ELISA, eine Immunpräzipitation oder durch Immunfluoreszenz , erfolgen. Desweiteren kann mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA und hiervon abgeleiteten Primern, die Organisation und die Expression des für ein X5L-Protein kodierenden Gens nachgewiesen werden. Dieser Nachweis kann in üblicher Weise, insbesondere in einem Southern Blot, über in situ Hybridisierung oder durch PCR, erfolgen.
Darüberhinaus eignet sich die vorliegende Erfindung, Maßnahmen zur Inhibition oder Aktivitätssteigerung eines X5L-Proteins in Personen zu ergreifen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann ein X5L-Protein inhibiert werden. Andererseits kann mit einem X5L-Protein, insbesondere nach Kopplung an ein vom Körper nicht als fremd angesehenes Protein, z.B. Transferrin oder BSA, die Menge eines X5L-Proteins in Personen erhöht werden. Entsprechendes kann auch mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA, erreicht werden, die unter die Kontrolle eines konstitutiven bzw. in bestimmten Geweben, induzierbaren Promotors gestellt wird und nach ihrer Expression zur Bereitstellung eines X5L-Proteins in den Personen bzw. in bestimmten Geweben, z.B. Hoden, dieser führt.
Somit stellt die vorliegende Erfindung Mittel dar, die Spermatogenese zu untersuchen und in sie regulierend einzugreifen. Letzteres umfaßt sowohl ihre Aktivierung als auch ihre Inhibierung. Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung Mittel, Störungen der Spermatogenese zu diagnostizieren und zu behandeln.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen.
Fig. 1 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen eines erfindungsgemäßen, 325 Aminosäuren umfassenden Spermatogenese-Proteins (X5L-Protein) . Die DNA-
Sequenz ist eine humane cDNA.
Fig. 2 zeigt die Sequenzen einer genomischen für ein X5L-
Protein kodierenden DNA. Die DNA entstammt dem humanen Genom. Die cDNA von Fig. 1 beginnt am
Basenpaar 739. Zwischen den Basenpaaren 828 und 1129 liegt ein Intron vor. Eine Polyadenylierungsstelle befindet sich am Basenpaar 2658.
Fig. 3 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen eines 334
Aminosäuren umfassenden X5L-Proteins . Die DNA- Sequenz ist eine Maus cDNA.
Fig. 4 zeigt die Sequenz einer genomischen für ein X5L- Protein kodierenden DNA. Die DNA entstammt dem Maus
Genom. Die cDNA von Fig. 3 beginnt am Basenpaar 445 von Fig. 4 (A) . Zwischen den Basenpaaren 492-1232 von Fig. 4 (A) liegt ein Intron vor. Zwischen den Basenpaaren 1-1136 von Fig. 4 (B liegt ein Intron vor. Eine Polyadenylierungssequenz befindet sich am Basenpaar 2306 von Fig. 4(B).
Fig. 5 zeigt den Nachweis von mRNA eines X5L-Proteins in
Geweben .
Fig. 6 zeigt den Nachweis von mRNA eines X5L-Proteins in Hoden. Das Vorliegen solcher mRNA ist auf Tubuli begrenzt (Fig. 6 (A) ) . Auf zellulärer Ebene liegt mRNA eines X5L-Proteins in den Stadien der primären und sekundären Spermatoyten (Sterne) sowieder runden Spermatiden (RS) vor. Reife Spermien sind mit (MS) und Sperma togoni en mit (Pfeilspitzen) ge- kennzeichnet. Sertoli-Zellen (Pfeile) und Leydig-
Zellen (L) weisen keine mRNA eines X5L-Proteins auf.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1: Nachweis von mRNA eines X5L-Proteins in Geweben (A)
RNA-Blots von humanen Geweben, wie Pankreas, Nebennierenmark, Schilddrüse, Nebennierenrinde, Hoden, Thymus , Dünndarm, Magen, fötales Gehirn, fötale Lunge, fötale Leber und fötale Niere, erhalten von Clontech, werden einer
Hybridisierung unterzogen. Als Hybridisierungsprobe wird eine [α32P]dCTP markierte X5L-Protein spezifische DNA verwendet, die zwischen den Basenpaaren 1073-1409 der DNA von Fig. 1 liegt. Die Hybridisierung erfolgt übernacht mit anschließenden Waschschritten unter üblichen Bedingungen. Zur Kontrolle werden die Blots ebenfalls mit einer radioaktiven ß-actin- Probe hybridisiert (vgl. Fig. 5).
Es z e igt s i ch , daß mRNA e ine s X5 L- Prot eins in den verschiedensten Geweben exprimiert wird . Die Größe der exp r i m i e r t e n mRNA i s t 1 , 7 b z w . 4 , 3 kb , wa s au f unterschiedliche Polyadenylierungssignale der DNA von Fig. 1 zurückzuführen ist. Ferner zeigt es sich, daß die Expression von mRNA eines X5L-Proteins in Hoden am stärksten ist.
(B)
Es wird eine RNA in situ Hybridisierung an Maus-Hoden-Gewebe durchgeführt. Hierzu wird auf das Verfahren von Wilkinson, D.G. (1992), Oxford University Press, New York verwiesen. Es werden "antisense"- bzw. "sense" RNA Proben verweden, die den Basenpaaren 5-1169 der DNA von Fig. 1 entsprechen.
Es zeigt sich, daß in Hoden-Gewebe eine starke Expression von mRNA eines X5L-Proteins stattfindet. Ferner zeigt sich, daß die Expression auf Tubuli beschränkt ist. Auf zellulärer Ebene zeigt sich eine Expression von mRNA eines X5L-Proteins in den Stadien der primären und sekundären Spermatocyten sowie der runden Spermatiden. Spermatogonien, reife Sertoli-Zellen und Leyding-Zellen zeigen dagegen keine Expression von mRNA eines X5L-Proteins .
Beispiel 2: Herstellung und Reinigung eines erfindungsgemäßen Spermatogenese-Proteins (X5L- Protein)
Die DNA von Fig. 1 wird mit BAMHI-Linkern versehen, mit BamHI nachgespalten und in den mit BamHI gespaltenen Expressionsvektors pQE-8 (Qiagen) inseriert. Es wird das Expressionsplasmid pQE-8/X5L erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erf indungsgemäßen X5L-Protein von Fig. 1 (C-
Terminuspartner) . pQE-8/X5L wird zur Transformation von E.coli SG 13009 (vgl. Gottesman, S. et al . , J. Bacteriol . 148, (1981), 265-273) verwendet. Die Bakterien werden in einem LB-Medium mit lOOμg/ml Ampicillin und 25/g/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60μM Isopropyl-ß-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wird eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wird mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Qiagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wird in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert . Nach seiner Neutralisierung wird das Fusionsprotein einer 18 % SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie- Blau angefärbt (vgl. Thomas, J.O. und Kornberg, R.D., J.Mol.Biol. 149 (1975), 709-733).
Es zeigt sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions) protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.
Beispiel 3: Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 2 wird einer 18 % SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wird eine ca. 37 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke werden sedimentiert , bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgt, bestimmt wird. Mit dem Gelgereinigten Fusionsprotein werden Tiere wie folgt immunisiert:
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen
Pro Immunisierung werden 35 μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund' s Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund 's Adjuvans) Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund 's Adjuvans; icFA) Tag 28 3. Immunisierung (icFA) Tag 56 4. Immunisierung (icFA) Tag 80: Ausbluten Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacryla id-Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys . Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al . , Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist das Serum des Kaninchens (1:10000 in PBS) . Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist ein mit alkalischer Phospha- tase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-IgG- Antikörper (Dianova) (1:5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgen mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36μM 5' Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat , 400μM Nitroblau-tetrazolium, lOOmM Tris-HCl, pH 9.5, 100 M NaCl, 5 mM MgCl2) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden .
Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn
Pro Immunisierung werden 40μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0. 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans) Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA) Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)
Aus Eigelb werden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es werden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgev/iesen.
Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus
Pro Immunisierung werden 12μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung ist das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag 0. 1. Immunisierung [komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung [icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion
Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungsgemäße, monoklonale Antikörper werden nachgewiesen.

Claims

Patentansprüche
1. Spermatogenese-Protein, umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere
Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz, wobei zwischen letzterer Aminosäuresequenz und jener von Fig. 1 eine Homologie von mindestens 80 % vorliegt.
2. Spermatogenese-Protein nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 3.
3. DNA, kodierend für das Spermatogenese-Protein nach Anspruch 1, umfassend: (a) Die DNA von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 1 hybridisiert und für ein Spermatogenese-Protein kodiert, dessen Aminosäuresequenz eine Homologie von mindestens 80 % zu jener von Fig. 1 aufweist, oder
(b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
4. DNA nach Anspruch 3, wobei die DNA jene von Fig. 2, Fig. 3 oder Fig. 4 ist.
5. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach Anspruch 3 oder 4.
6. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 5.
7. Verfahren zur Herstellung eines Spermatogenese-Proteins , umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 6 unter geeigneten Bedingungen.
8. Antikörper, gerichtet gegen das Spermatogenese-Protein nach Anspruch 1 oder 2.
9. Verwendung des Spermatogenese-Proteins nach Anspruch 1 oder 2 oder einer DNA nach Anspruch 3 oder 4 zur Untersuchung bzw. Beeinflussung von Spermatogenese.
10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Beeinflussung der Spermatogenese ihre Aktivierung bzw. Inhibierung umfaßt.
11. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Untersuchung bzw. Beeinflussung der Spermatogenese eine Diagnose bzw. Behandlung von Störungen der Spermatogenese umfaßt.
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