DE19818680C1 - DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein - Google Patents

DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein

Info

Publication number
DE19818680C1
DE19818680C1 DE19818680A DE19818680A DE19818680C1 DE 19818680 C1 DE19818680 C1 DE 19818680C1 DE 19818680 A DE19818680 A DE 19818680A DE 19818680 A DE19818680 A DE 19818680A DE 19818680 C1 DE19818680 C1 DE 19818680C1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
dna
nibrin
strand break
protein
double
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE19818680A
Other languages
English (en)
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Charite Universitaetsmedizin Berlin
Original Assignee
Universitatsklinikum Charite Berlin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitatsklinikum Charite Berlin filed Critical Universitatsklinikum Charite Berlin
Priority to DE19818680A priority Critical patent/DE19818680C1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE19818680C1 publication Critical patent/DE19818680C1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156Polymorphic or mutational markers

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein, eine für ein solches Protein kodierende DNA und Teile davon sowie ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Proteins. Ferner betrifft die Erfindung gegen das Protein gerichtete Antikörper sowie die Verwendung der DNA und des Proteins zur Diagnose und/oder Therapie des "Nijmegen Breakage Syndrome".

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein (nachstehend mit Nibrin bezeichnet), eine für ein solches Protein kodierende DNA und Teile davon sowie ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Pro­ teins. Ferner betrifft die Erfindung gegen das Protein gerichtete Antikörper sowie die Verwendung der DNA und des Proteins zur Diagnose und/oder Therapie des "Nijmegen Breakage Syndrome" (nachstehend mit NBS bezeichnet).
NBS ist eine autosomal-rezessive Erkrankung, die sich durch verschiedenste Merkmale, wie Kleinköpfigkeit, Wachstumsverzögerung und Immundefizienz, auszeichnet. Ferner findet man bei NBS-Patienten häufig eine Chromosomen- Instabilität, eine hohe Sensitivität für ionisierende Strahlung und/oder eine Prädisposition für Krebs, insbesondere lymphoide Krebserkrankungen.
Die Ursache von NBS ist nicht bekannt. Es gibt lediglich Hinweise, daß bei NBS ein Genlocus auf dem Chromosom 8q21 beeinflußt ist, wobei der Genlocus auf einem etwa 8 × 106 Basenpaare langen Abschnitt zwischen den Genmarkern D8S271 und D8S270 liegen soll. Diese Hinweise reichen allerdings nicht aus, NBS auf molekularer Ebene zu verstehen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu­ stellen, mit dem NBS ursächlich untersucht und ggfs. Wege aufgezeigt werden können, mit denen in NBS eingegriffen werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit ein bei NBS beeinflußtes DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein (Nibrin) und eine für ein solches Protein kodierende DNA. Mit diesen Mitteln ist eine ursächliche Untersuchung von NBS und ein gezieltes Eingreifen in diese Erkrankung möglich.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß ein Protein, das sich zur Reparatur eines DNA-Doppelstrangbruchs eignet (Nibrin), bei NBS verändert ist. Der Anmelder hat eine für Nibrin kodierende DNA im humanen Genom in 8q21.13-q21.3 identifiziert. Er hat diese DNA auf dem BAC- Klon 159J23 isoliert und charakterisiert (vgl. Fig. 1). Die DNA umfaßt 16 Exons, die für eine etwa 4,4 kb große cDNA kodieren. Diese führt zu einem etwa 85 kD großen, 754 Aminosäuren umfassenden DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur- Protein (vgl. Fig. 2). Dieses Protein umfaßt zwei aminoterminale Domänen, nämlich zwischen den Aminosäuren 24-100 eine "fork-head associated" Domä­ ne (vgl. Hofmann, K. und Bucher, P., Trends Biochem. Sciences 20, (1995), 347-349) und zwischen den Aminosäuren 105-190 eine Brustkrebs-carbox­ yterminale Domäne (vgl. Bork, P. et al., FASEB J. 11, (1997), 68-76). Der Anmelder hat erkannt, daß Mutationen in Nibrin ursächlich für NBS sein können. Dies hat er in einer Studie erkannt, in der er mehr als 50 NBS-Patienten aus aller Welt untersucht hat. Beispiele solcher Nibrin-Mutationen auf der DNA-Ebene sind in Tabelle 1 angegeben. Diese Mutationen von Tabelle 1 führen zu verkürzten Nibrin-Proteinen, wobei diese noch die vorstehenden Domänen umfassen.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, ein DNA- Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein (Nibrin) bereitzustellen, umfassend die Sequenz von Fig. 2 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz, wobei die DNA der letzteren Aminosäure­ sequenz mit der DNA von Fig. 2 hybridisiert.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz" umfaßt jegliche für ein Nibrin kodierende Aminosäurese­ quenz, deren DNA-Sequenz mit der DNA von Fig. 2 hybridisiert und für die vor­ stehend angegebenen Domänen kodiert. Die DNA-Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 2 durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inver­ sionen von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Insbesondere kann die DNA-Sequenz ein oder mehrere der in Tabelle 1 angegebenen Mutationen aufweisen. Der Ausdruck "Hybridisierung" weist auf eine Hybridisierung unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der Sequenz hin.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für Nibrin kodiert. Die Nukleinsäure kann eine RNA oder eine DNA, z. B. eine cDNA, sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:
  • a) Die DNA von Fig. 2 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 2 hybri­ disiert, oder
  • b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code ver­ wandte DNA.
Die DNA von Fig. 2 wurde als E.coli ORF-5 (Gesamtklon) bei der DSMZ (Deut­ sches Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) unter DSM 12021 am 19. Febr. 1998 hinterlegt. Ferner wurde die DNA von Fig. 2 in Form von über­ lappenden Klonen bei der DSMZ am 19. Febr. 1998 hinterlegt. Diese als E.coli 51343, E.coli 153757 bzw. E.coli 268496 bezeichneten Klone haben die DSM- Nummern DSM 12022, DSM 12023 bzw. DSM 12024.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA" umfaßt jegliche für ein Nibrin kodierende DNA-Sequenz, die mit der DNA von Fig. 2 hybridisiert und für die vorstehend angegebenen Domänen kodiert. Die DNA-Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 2 durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unter­ scheiden. Insbesondere kann die DNA-Sequenz ein oder mehrere der in Tabelle 1 angegebenen Mutationen aufweisen. Desweiteren kann die DNA-Sequenz jene von Fig. 1 sein. Diese DNA wurde als E.coli BAC 159J23 bei der DSMZ unter DSM 12020 am 19. Febr. 1998 hinterlegt. Hinsichtlich des Ausdrucks "Hybri­ disierung" wird auf vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine DNA, die sich zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen von Nibrin, z. B. zum Nachweis von Muta­ tionen, eignet. Insbesondere eignet sich die DNA als Primer bzw. Primer-Paar für ein PCR-Verfahren. Eine solche DNA umfaßt eine der in Fig. 3 angegebenen Sequenzen oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basen unterschiedliche Sequenz, wobei letztere mit der komplementären Sequenz der in Fig. 3 angege­ benen DNA hybridisiert.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basen unterschiedliche Sequenz" umfaßt jegliche Sequenz, die mit der komplementären Sequenz der in Fig. 3 angegebenen DNA hybridisiert. Die Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 3 durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basen unterscheiden. Hinsichtlich des Ausdrucks "Hybridisierung" wird auf vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen.
Eine erfindungsgemäße DNA kann als solche oder in Kombination mit jeglicher anderen DNA vorliegen. Insbesondere kann eine erfindungsgemäße, für Nibrin kodierende DNA in einem Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E.coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4 anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Bacculovirus-Expressions­ vektor pAcSGHisNT-A.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um die erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM 101, JM 109, BL21 und SG 13009, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise die erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fu­ sionsproteins exprimiert werden kann.
Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfin­ dungsgemäße DNA exprimierte Protein bzw. Fusionsprotein zu isolieren und zu reinigen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehen­ des Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklona­ len Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fu­ sions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklo­ nalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit. Ein solcher umfaßt eine oder mehrere der folgenden Komponenten:
  • a) eine erfindungsgemäße DNA,
  • b) ein erfindungsgemäßes DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein (Ni­ brin),
  • c) einen erfindungsgemäßen Antikörper, sowie
  • d) übliche Hilfsstoffe, wie Träger, Puffer, Lösungsmittel, Kontrollen, etc.
Von den einzelnen Komponenten können jeweils ein oder mehrere Vertreter vorliegen. Hinsichtlich der einzelnen Ausdrücke wird auf vorstehende Ausführun­ gen verwiesen. Diese gelten hier entsprechend.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, Erkrankungen, in denen die Reparatur eines DNA-Doppelstrangbruches beeinflußt ist, insbesondere das "Nijmegen Breakage Syndrom" (NBS), ursächlich zu untersuchen. Mit einem erfindungs­ gemäßen Antikörper kann Nibrin nachgewiesen werden. Es kann eine Beziehung von Nibrin in Wildtyp- wie auch in mutierter Form zu NBS hergestellt werden. Ferner kann mit Nibrin ein gegen dieses Protein gerichteter Autoantikörper nach­ gewiesen werden. Beide Nachweise können durch übliche Verfahren, insbeson­ dere einen Western Blot, einen ELISA, eine Immunpräzipitation oder durch Immunfluoreszenz, erfolgen. Desweiteren kann mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA und hiervon abgeleiteten Primern, die Organisation und die Expression des für Nibrin kodierenden Gens nachgewiesen werden. Dieser Nachweis kann in üblicher Weise, insbesondere in einem Sout­ hern Blot oder über "in situ" Hybridisierung, erfolgen.
Darüberhinaus eignet sich die vorliegende Erfindung, Maßnahmen für und gegen das Vorliegen von Nibrin in Personen zu ergreifen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann Nibrin inhibiert werden. Andererseits kann mit Nibrin, insbeson­ dere nach Kopplung an ein vom Körper nicht als fremd angesehenes Protein, z. B. Transferrin oder BSA, die Menge von Nibrin in Personen erhöht werden. Ent­ sprechendes kann auch mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA, erreicht werden, die unter die Kontrolle eines konstitutiven bzw. in bestimmten Geweben, induzierbaren Promotors gestellt wird und nach ihrer Expression zur Bereitstellung von Nibrin in den Personen bzw. in bestimmten Geweben dieser führt.
Somit stellt die vorliegende Erfindung Mittel dar, Erkrankungen, in denen die Reparatur eines DNA-Doppelstrangbruches beeinflußt ist, insbesondere NBS, besser zu diagnostizieren und in diese Erkrankungen therapeutisch eingreifen zu können.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen.
Fig. 1 zeigt die Sequenz einer genomischen, für ein DNA-Doppelstrang­ bruch-Reparatur-Protein (Nibrin) kodierenden DNA.
Fig. 2 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen eines DNA-Doppelstrang­ bruch-Reparatur-Proteins (Nibrin). In der DNA-Sequenz befindet sich das ATG-Startcodon zwischen den Basenpaaren 26-28 und das TAA-Stopcodon zwischen den Basenpaaren 2288-2290. Ferner sind die Exons 1-16 endständig angegeben.
Fig. 3 zeigt Primer-Paare, die sich für eine PCR-Reaktion zum Nachweis von Sequenzen eines DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Proteins (Nibrin) eignen. Fig. 3(A) zeigt Primer-Paare für den kodierenden Bereich einer Nibrin-DNA und Fig. 3(B) Primer-Paare für zwischen den einzelnen Exons gelegenen Intron-Sequenzen.
Fig. 4 zeigt den Nachweis von Sequenzen eines DNA-Doppelstrang-Repa­ ratur-Proteins (Nibrin) in Geweben.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1: Nachweis von Nibrin-Sequenzen in Geweben
Aus Geweben, wie Milz, Thymus, Prostata, Hoden, Ovarium, Dünndarm und Colon, wird Gesamt-RNA isoliert. Diese wird einer Polyacrylamid-Gelektropho­ rese mit anschließender Northern Blot-Hybridisierung unterzogen. Als Hybridi­ sierungsprobe wird eine [a32P]dCTP markierte Nibrin-spezifische DNA verwendet, die zwischen den Basenpaaren 704-1279 der DNA von Fig. 2 liegt. Die Hybridi­ sierung erfolgt übernacht mit anschließenden Waschschritten, wobei die Blots zweimal 20 min in 2 × SSC/0.1% SDS bei 42°C und einmal 20 min in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 55°C gewaschen werden. Ferner werden die Blots in 0,01 × SSC/0,01% SDS bei 65°C gewaschen und mit einer radioaktiven GAPDH- Probe als Kontrolle hybridisiert.
Es zeigt sich, daß Nibrin-Sequenzen in den verschiedensten Geweben exprimiert werden. Die Größen der exprimierten Sequenzen sind 4, 4 bzw. 2,4 kb, was auf zwei Polyadenylierungssignale an den Positionen 2440 bzw. 4786 im 3'-nicht­ translatierten Bereich der DNA von Fig. 2 zurückzuführen ist.
Beispiel 2: Herstellung und Reinigung eines erfindungsgemäßen DNA-Doppel­ strangbruch-Reparatur-Proteins (Nibrin)
Die DNA von Fig. 2 wird mit BAMHI-Linkern versehen, mit BamHI nachgespalten und in den mit BamHI gespaltenen Expressionsvektors pQE-8 (Qiagen) inseriert. Es wird das Expressionsplasmid pQE-8/Nibrin erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungs­ gemäßen Nibrin von Fig. 2 (C-Terminuspartner). pQE-8/Nibrin wird zur Trans­ formation von E.coli SG 13009 (vgl. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273) verwendet. Die Bakterien werden in einem LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60 µM Iso­ propyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guani­ dinhydrochlorid wird eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wird mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Qiagen) des Chromatographie-Materi­ als durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wird in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wird das Fusionsprotein einer 18% SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J. O. und Kornberg, R. D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).
Es zeigt sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.
Beispiel 3: Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 2 wird einer 18% SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wird eine ca. 85 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke werden sedimentiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgt, bestimmt wird. Mit dem Gel-gereinigten Fusionsprotein werden Tiere wie folgt immunisiert:
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen
Pro Immunisierung werden 35 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag O: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten
Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird ein erfin­ dungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid-Gelelek­ trophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse- Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist das Serum des Kaninchens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen- IgG-Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgen mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36 µM 5' Bromo-4-chloro- 3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden.
Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn
Pro Immunisierung werden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag O: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)
Aus Eigelb werden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es werden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.
Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus
Pro Immunisierung werden 12 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung ist das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag O: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion
Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungs­ gemäße, monoklonale Antikörper werden nachgewiesen.
Tabelle 1
Mutationen in einer für Nibrin kodierenden DNA von NBS-Patienten

Claims (11)

1. DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein (Nibrin), umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 2, wobei Fig. 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Amino­ säuresequenz, wobei sich das Protein letzterer Aminosäuresequenz zur Reparatur eines DNA- Doppelstrangbruchs eignet und seine DNA-Sequenz mit der DNA von Fig. 2, wobei Fig. 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist, hybridisiert.
2. DNA, kodierend für Nibrin nach Anspruch 1, umfassend:
  • a) Die DNA von Fig. 2, wobei Fig. 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist, oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA für ein Protein kodiert, das sich zur Reparatur eines DNA-Doppelstrangbuches eignet und mit der DNA von Fig. 2, wobei Fig. 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist, hybridisiert, oder
  • b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
3. DNA nach Anspruch 2, wobei die DNA ein oder mehrere der in Tabelle 1, wobei Tabelle 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, angegebenen Mutationen aufweist.
4. DNA nach Anspruch 2, wobei die DNA jene von Fig. 1 ist, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
5. DNA, geeignet zum Nachweis von Nibrin-Sequenzen, umfassend eine der in Fig. 3, wobei Fig. 3 Bestandteil dieses Anspruchs ist, angegebenen Sequenzen oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basen unterschiedliche Sequenz, wobei letztere Sequenz sich als Primer für eine PCR-Reaktion zum Nachweis von Nibrin-Sequenzen eignet und mit der komplementären Sequenz der in Fig. 3, wobei Fig. 3 Bestandteil dieses Anspruchs ist, angegebenen DNA hybridisiert.
6. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach einem der Ansprüche 2-4.
7. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 6.
8. Verfahren zur Herstellung von Nibrin, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 7 unter geeigneten Bedingungen.
9. Antikörper, gerichtet gegen Nibrin nach Anspruch 1.
10. Verwendung von Nibrin nach Anspruch 1 oder einer DNA nach einem der Ansprüche 2-5 zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, in denen die Reparatur eines DNA- Doppelstrangbruches beeinflußt ist.
11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Erkrankung das Nijmegen Breakage Syndrome (NBS) ist.
DE19818680A 1998-04-27 1998-04-27 DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein Expired - Fee Related DE19818680C1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19818680A DE19818680C1 (de) 1998-04-27 1998-04-27 DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19818680A DE19818680C1 (de) 1998-04-27 1998-04-27 DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE19818680C1 true DE19818680C1 (de) 2000-03-09

Family

ID=7865875

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19818680A Expired - Fee Related DE19818680C1 (de) 1998-04-27 1998-04-27 DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE19818680C1 (de)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Trends Biochem. Sciences 20, S. 347-349, 1995 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE19747418C1 (de) Inhibitor-Protein des wnt-Signalwegs
DE19900635A1 (de) Selektion von monoklonalen Antikörpern
DE19818680C1 (de) DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein
DE19521046C1 (de) Protein mit DNase-Aktivität
DE19845277C1 (de) Transmembran-Protein
DE19816186A1 (de) GDNF-kodierende DNA, Teile davon und GDNF-Varianten
EP1015583B1 (de) Srcr domäne-enthaltendes protein
DE19611234C1 (de) Tyrosin-Phosphatase-verwandtes Protein
DE19527552C2 (de) Transketolase-verwandtes-Protein
DE19856882C1 (de) Spermatogenese-Protein
DE19534763C1 (de) FMR1-verwandtes Protein
DE19847364C1 (de) Tumor-Protein
DE19730997C1 (de) SRCR Domäne-enthaltendes Protein
DE19825621C2 (de) Protein zur Regulation von Apoptose
DE10001377A1 (de) bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 und diesen enthaltendes Arzneimittel
DE19650758C1 (de) PKD1-Fragmente mit Bindungsregionen für PKD1-spezifische Antikörper
DE19835910C1 (de) Gen isoliert auf dem kurzen Arm des menschlichen Chromosoms 17
DE19819476C1 (de) Polypeptid mit immunogenen Eigenschaften und veränderten biologischen Funktionen eines Proteins
EP0973903A2 (de) Protein zur inhibierung von apoptose
WO1998018919A2 (de) Gabaa-rezeptoruntereinheit epsilon-verwandtes protein

Legal Events

Date Code Title Description
8100 Publication of the examined application without publication of unexamined application
D1 Grant (no unexamined application published) patent law 81
8381 Inventor (new situation)

Free format text: VARON-MATEEVA, RAYMONDA, DR., 10117 BERLIN, DE SPERLING, KARL, PROF.DR., 14109 BERLIN, DE WIESMANN DA SILVA REIS, ANDRE, 13435 BERLIN, DE ROSENTHAL, ANDRE, PROF.DR., 10119 BERLIN, DE PLATZER, MATTHIAS, DR., 07743 JENA, DE

8381 Inventor (new situation)

Free format text: VARON-MATEEVA, RAYMONDA, DR., 10117 BERLIN, DE SPERLING, KARL, PROF.DR., 14109 BERLIN, DE WIESMANN DA SILVA REIS, ANDRE, PROF.DR., 13435 BERLIN, DE ROSENTHAL, ANDRE, PROF.DR., 10119 BERLIN, DE PLATZER, MATTHIAS, DR., 07743 JENA, DE

8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee