DE10004857A1 - MLP-Gen, Nukleinsäuren, Polypeptide und deren Verwendung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft mutierte MLP-Sequenzen, wobei die Mutation an Base Nr. 10 von Exon 2 der translatierten Sequenz oder an der dritten Position von Kodon 112 in Exon 4 der translatierten Sequenz erfolgt. Weiterhin betrifft die Erfindung einen muskelspezifischen Promotor und dessen Verwendungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft für MLP codierende Nukleinsäuren, ein dadurch codiertes Polypeptid, Sonden für diese Nukleinsäuren, Verfahren zum Nachweis von und/oder Scree­ nen auf Myokard-Erkrankungen, Kits zum Nachweis der Nukleinsäuren und des Polypeptids, regulatorische Nukleinsäuren, diese umfassende Vektoren, diese umfassende Zellen und diese umfassende Medikamente.

Die dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist eine Myokarderkrankung unklarer Genese, die mit verminderter Kontraktionskraft (systolische Ventrikelfunktionsstörung) und begleitender ge­ störter Relaxation des linken und/oder rechten Ventrikels (diastolische Ventrikelfunktionsstö­ rung) einhergeht. Typisch ist eine Kardiomegalie mit Dilatation beider Ventrikel, erniedrigter Auswurffraktion und hohem enddiastolischen Volumen. Das Herzzeitvolumen ist vermindert (Vorwärtsversagen) und es kommt zum Rückstau des Blutes vor dem Herzen (Rückwärtsver­ sagen) (Isselbacher K. et al. Harrison's Principles of Internal Medicine (McGraw Hill, New York, 1994)).

Die Inzidenz der DCM beträgt in den westlichen Industriestaaten etwa 5/100.000 Einwoh­ ner/Jahr. Sie stellt damit die am häufigsten auftretende primäre Kardiomyopathie dar. In neue­ ren Untersuchungen wurde in etwa 30% eine familiäre Häufung beschrieben (Towbin, The role of cytoskeletal proteins in cardiomyopathies 10, 13-139 (1998)). Die durch diese Erkran­ kung anfallenden Kosten betragen beispielsweise in den Vereinigten Staaten von Amerika 10- 40 Milliarden US Dollar, d. h. extrapoliert dürften in Deutschland 5 bis 20 Milliarden DM anfallen.

Die Ätiologie der Erkrankung ist jedoch nach wie vor unklar. In etwa 30% der Fälle können enterovirale (Pauschinger M. et al.; Circulation 99(7), 889-895 (1999)) oder adenovirale (Pau­ schinger, M. et al.; Circulation 99(10), 1348-1354 (1999)) DNAs und RNAs im Myokard nachgewiesen werden. Ein möglicher Pathomechanismus wurde von Badorff (Badorff, C. et al.; Nature medicine 5, 320-326 (1999)) nahegelegt. Eine virale Genese kann deshalb als wahrscheinlich gelten. Darüber hinaus wurden Antikörper zum Beispiel gegen Betarezeptoren und den Adeninnunkleotid-Translokator (ANT) nachgewiesen, weshalb auch Autoimmun­ mechanismen als ein pathogenetisches Prinzip diskutiert werden (Schultheiss, H. P. et al.; Circ Res. 76, 64-72 (1995)). Zunehmend wird aber auch bei der DCM, nicht zuletzt aufgrund der familiären Häufungen, eine genetische Ursache als wahrscheinlich erachtet. Am besten do­ kumentiert sind Mutationen im Dystrophin-Gen, z. B. bei der Duchenneschen und der Becker­ schen Muskeldystrophie (Muntoni, F. et al.; N Engl J Med 329, 921-5 (1993)), die neben ei­ ner Muskeldystrophie auch zu einer DCM führen. Darüberhinaus wurden zwei Mutationen im kardialen Aktin-Gen beschrieben, die in den entsprechenden Familien zu einer DCM führen (Olsen, T. et al.; Science 280, 750-752 (1998)). Auch im Metavinculin-Gen wurde eine Mutation gefunden, die sehr wahrscheinlich bei dem betroffenen Patienten zu einer Kar­ diomyopathie führte (Maedam, M. et al.; Circulation 95, 17-20 (1997)). Zusätzlich konnte bei der Kardiomyopathie des syrischen Hamsters eine Mutation im delta Sarkoglykan-Gen als ursächlich nachgewiesen werden (Nigro, V. et al.; Hum Mol Genet 6, 601-607 (1997)). Diese Gene kodieren allesamt für Proteine des Zytoskeletts, weshalb angenommen wird, daß Muta­ tionen in zytoskelettären Proteinen zu einer DCM führen, ganz im Gegensatz zu den Protei­ nen des Sarkomers, bei denen Mutationen offensichtlich zu einer hypertrophen Kardiomyo­ pathie (HCM) führen (Towbin, J. et al.; Nature Medicine 5, 266-267 (1999) und Chen, J. et al.; J Clin Invest 103, 1483-1485 (1999)).

Da das MLP zu den zytoskelettären Proteinen gezählt wird, fügt sich der MLP knock out, der mit einer DCM einhergeht, gut in das oben angeführte Gedankenmodell ein (Arber et al.; Cell 88, 393-403 (1997)).

Das MLP wurde 1994 unter Anwendung einer subtraktiven Klonierungstechnik erstmals als positiver Regulator der Myogenese beschrieben (Arber S. et al.; Cell 79, 221-31 (1994)) und gewann 1997 für die Kardiologie erheblich an Bedeutung, als bekannt wurde (Arber et al.; Cell 88, 393-403 (1997)), daß der MLP-knock out in einem Maus-Modell mit einer DCM einhergeht. Dies war gleichzeitig der erste gentechnisch hergestellte Organismus, der dieses Krankheitsbild ausprägte. Allerdings ist im Stand der Technik bislang vollkommen unklar, ob auch beim Menschen Mutationen in diesem Gen zu einer DCM führen.

Das MLP selbst gehört, wie der Name schon zum Ausdruck bringt, zur Gruppe der LIM- Proteine. Diese Gruppe wurde vor etwa 10 Jahren nach den Anfangsbuchstaben ihrer ersten 3 Mitglieder benannt (lin 11, islet 1, mec3) und hat im wesentlichen drei Subgruppen: 1. Die LIM-Kinasen, d. h. Proteine mit dem LIM-Motiv und Kinaseaktivität, 2. LIM-Homeobox- Gene, d. h. LIM-Proteine, die als Transkriptionsfaktoren fungieren, sowie 3. "LIM only"- Proteine, d. h. LIM-Proteine, die ausschließlich LIM-Motive tragen. Das MLP gehört zur Gruppe der "LIM only"-Proteine (Morgan, M. et al.; Biochem Biophys Res Com 212, 840-­ 846 (1995)).

Das Protein selbst besteht aus 194 Aminosäuren und bildet zwei LIM-Doppelzinkfinger aus, gefolgt von jeweils einer Glycin-reichen Aminosäuresequenz. Das Protein fungiert wahr­ scheinlich aufgrund seiner Lokalisation an der Z-Bande als zytoskelettäres Protein, wo es an f-Aktin-Strukturen bindet (Arber, S. et al.; Genes Dev 10, 289-300 (1996)).

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, das eine präventive Behandlung von dilatativer Kardiomyopathie erlaubt. Das Mittel soll auch den Nachweis der Disposition eines Individuums zur Entwicklung des Krankheitsbildes der dila­ tativen Kardiomyopathie erlauben. Schließlich soll das bereitzustellende Mittel die Diagnose von dilatativer Kardiomyopathie ermöglichen.

Weiterhin ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis von Myokarder­ krankungen, zum Screenen auf Myokarderkrankungen und zum Nachweis der Disposition zur Entwicklung einer Myokarderkankung, jeweils insbesondere der dilatativen Kardiomyopathie, bereitzustellen.

Schließlich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Kit bereitzustellen, welcher im Rahmen der vorstehend genannten Verfahren verwendet werden kann.

In einem weiteren Aspekt liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde eine regulatorische Nu­ kleinsäure bereitzustellen, die die gewebespezifische, insbesondere die muskelspezifische, Expression von Nukleinsäuren erlaubt.

Weiterhin ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Mittel zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen bereitzustellen, die durch gewebespezifische Expression be­ handelbar bzw. verhinderbar sind.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch eine Nukleinsäure, die für ein MLP codiert und eine Sequenz nach SEQ ID NO: 1 umfaßt, wobei die Sequenz eine Mutation an Base Nr. 10 von Exon 2 der translatierten Sequenz aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Mutation ein Austausch von T zu C ist.

Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch eine Nukleinsäure, die für ein MLP codiert und eine Sequenz nach SEQ ID NO: 1 umfaßt, wobei die Sequenz eine Mutation an der dritten Position von Codon 112 im Exon 4 der translatierten Sequenz aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Mutation ein Austausch von A zu G.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren umfaßt die Nukleinsäure lediglich die für eine Aminosäuresequenz codierenden Sequenzen.

Weiterhin wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Nukleinsäure, die für ein MLP codiert und die Sequenz von Position 58 bis 639 der SEQ ID NO: 1 umfaßt, wobei an Position 67 eine Mutation vorhanden ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Mutation eine Mutation von T zu C.

Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch eine Nukleinsäure, die für ein MLP codiert und die Sequenz von Position 58 bis 639 der SEQ ID NO: 1 umfaßt, wobei an Position 393 eine Mu­ tation vorhanden ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Mutation eine Mutation von A zu G.

Es ist anzumerken, daß im Zusammenhang mit den vorstehende gemachten Positionsangaben sich diese auf die Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO: 1 beziehen.

Weiterhin wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Nukleinsäure codierend für MLP, wobei die Sequenz ohne die Degeneriertheit des genetischen Codes einer erfindungs­ gemäßen Nukleinsäure entsprechen würde.

Schließlich wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine für MLP codierende Nu­ kleinsäure, wobei die Nukleinsäure mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure hybridisiert.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Aminosäure­ sequenz, die von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder Teilen davon codiert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz von der Sequenz/den Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder Teilen davon codiert, die eine oder die beiden der vorstehend genannten Mutationen, d. h. an Base No. 10 von Exon 2 der translatierten Sequenz bzw. an der dritten Position von Codon 112 in Exon 4 der trans­ latierten Sequenz, umfaßt/umfassen.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein MLP umfas­ send eine Aminosäuresequenz, die von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder einem Teil davon codiert ist, oder dadurch, daß das MLP eine erfindungsgemäße Aminosäurese­ quenz umfaßt.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Sonde für eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, wobei die Sonde eine Sequenz nach SEQ ID NO: 4 umfaßt.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Sonde für den Nachweis und/oder Amplifi­ kation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verwendet.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Sonde für eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, wobei die Sonde die Sequenz nach SEQ ID NO: 5 um­ faßt.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Sonde für den Nachweis und/oder die Ampli­ fikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verwendet.

In einem weiteren Aspekt werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder die erfin­ dungsgemäßen Sonden, einzeln oder in Kombination, zur Diagnose von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen verwendet.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei die Myckard-Erkrankung die dilatative Kar­ diomyopathie.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, wobei eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder eine erfindungsgemäße Sonde verwendet wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, daß die Myokard-Erkrankung dilatative Kardiomyopathie ist.

In einem weiterer Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, wobei eine Probe umfassend eine für MLP codierende Sequenz mit einem Restriktionsenzym verdaut wird und das Vorlie­ gen einer für MLP codierenden mutierten Sequenz durch das Auftreten eines gegenüber dem Restriktionsenzym-Verdaumuster einer für MLP codierenden nicht-mutierten Sequenz geän­ derten Restriktionsenzym-Verdaumusters nachgewiesen wird.

Dabei ist in einer Ausführungsform vorgesehen, daß es sich bei der Myokard-Erkrankung um dilatative Kardiomyopathie handelt.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Verfahren eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, wobei eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder eine erfin­ dungsgemäße Sonde verwendet wird.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die für MLP codierende Sequenz vor dem Verdau mittels PCR amplifiziert.

In einer weiteren Ausführungsform ist der Nachweis bzw. das Screenen auf eine erfindungs­ gemäße Nukleinsäure gerichtet.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Amplifikation mit einem Primer, wobei der Primer eine Sequenz nach SEQ ID NO: 13 und/oder SEQ ID NO: 14 umfaßt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß der Restriktionsenzym- Verdau durch Nci I erfolgt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß im Falle einer nicht-mutierten Sequenz das PCR-Produkt eine Länge von etwa 308 bp und im Falle einer Mutation an Base Nr. 10 von Exon 2 bzw. einer Mutation an Position 67 der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1, wobei die Mutation in einem Austausch von T zu C besteht, zwei PCR-Produkte mit etwa 205 und etwa 103 bp auftreten.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann vorgesehen sein, daß der Nachweis bzw. das Screenen auf eine erfindungsgemäße Nukleinsäure gerichtet ist, bevorzugterweise auf eine Nukleinsäure, die eine Mutation an der dritten Position von Codon Nr. 112 in Exon 4 der translatierten Sequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist in einer Ausführungsform vorgesehen, daß die Amplifikation mit einem Primer erfolgt, wobei der Primer die Sequenz nach SEQ ID NO: 15 und/oder SEQ ID NO: 16 umfaßt.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Restriktionsenzymverdau durch Cvi RI.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard- Erkrankungen, insbesondere dilatativer Kardiomyopathie, bei dem eine erfindungsgemäße Sonde verwendet wird, kann vorgesehen sein, daß für den Nachweis der bzw. das Screenen auf eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz eine Hybridisierung einer zu untersuchenden Probe mit einer Sonde erfolgt, wobei die Sonde eine Sequenz nach SEQ ID NO: 4 um­ faßt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, daß die Hybridisierung bei 60°C erfolgt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard- Erkrankungen, insbesondere dilatativer Kardiomyopathie, wobei eine erfindungsgemäße Son­ de verwendet wird, kann vorgesehen sein, daß für den Nachweis der bzw. das Screenen auf eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz eine Hybridisierung einer zu untersuchenden Probe mit einer Sonde erfolgt, wobei die Sonde eine. Sequenz nach SEQ ID NO: 5 umfaßt.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe der Erfindung gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, wobei eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz oder ein erfindungsgemäßes MLP nachgewiesen wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Myokard-Erkrankung dilatative Kardiomyopa­ thie.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß die Aminosäuresequenz oder das MLP mittels eines Antikörpers nachgewiesen wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch einen Kit zum Nach­ weis einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, wobei vorgesehen ist, daß der Kit mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder mindestens eine erfindungsgemäße Sonde um­ faßt.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch einen Kit zum Nachweis eines erfindungsgemäßen MLP oder zum Nachweis einer für ein MLP codierenden erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz, wobei der Kit mindestens einen Antikörper gegen das erfindungsgemäße MLP oder gegen eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz umfaßt.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine regulatorische Nukleinsäurese­ quenz, die etwa 500 Basenpaare umfaßt, wobei die 500 Basenpaare jene sind, die stromauf­ wärts von der ersten Base des ersten Exons der für MLP codierenden humanen genomischen Sequenz angeordnet sind.

In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsäure ist vorgese­ hen, daß die regulatorische Nukleinsäure etwa 1000 Basenpaare umfaßt, wobei die 1000 Ba­ senpaare jene sind, die stromaufwärts von der ersten Base des ersten Exons der für MLP co­ dierenden humanen genomischen Sequenz angeordnet sind.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine regulatorische Nukleinsäure, die ausgehend von humaner genomischer DANN darstellbar ist unter Verwendung von zwei Primern in einer PCR-Reaktion, wobei der stromaufwärtige Primer die SEQ ID NO: 9 und der stromabwärtige Primer die SEQ ID NO: 10 umfaßt.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine regulatorische Nukleinsäurese­ quenz umfassend eine Sequenz nach SEQ ID NO: 8.

In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsäure ist vorgese­ hen, daß die regulatorische Nukleinsäure ein Promotor ist.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch einen Vektor um­ fassend eine erfindungsgemäße regulatorische Sequenz.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß die regulatorische SEquenz in dem Vektor pAdCMVssTnI enthalten ist, wobei bei diesem Vektor der CMV-Promotor durch die erfindungsgemäße regulatorische Sequenz ersetzt ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Vektor ein adenoviraler Vektor.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß der erfindungsgemäße Vektor eine codierende Sequenz umfaßt, die unter der Kontrolle der erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsäure ist.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß die codierende Sequenz ausge­ wählt ist aus der Gruppe, die hsp70 und das "slow skeletal troponin I" umfaßt.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine Zelle umfassend eine er­ findungsgemäße regulatorische Nukleinsäure und/oder einen erfindungsgemäßen Vektor.

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle ist die Zelle eine euka­ ryontische Zelle.

In einer bevorzugteren Ausführungsform ist die Zelle eine Säugetierzelle.

In einer ganz bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine humane Zelle.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Medikament umfassend eine erfindungsgemäße regulatorische Nukleinsäure, einen erfindungsgemäßen Vektor und/oder eine erfindungsgemäße Zelle.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Medikament im Rahmen einer Gentherapie verwendet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Medikaments ist vorgesehen, daß das Medikament ein solches ist zur Behandlung und/oder Prävention kardio­ vaskulärer Erkrankungen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß die kardiovaskulären Erkrankun­ gen solche sind, bei denen eine Punktmutation in einem Gen zu einem Krankheitsbild führt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Medikamentes ist vorgesehen, daß die Punktmutation in Genen liegt, die für Proteine des Sarkomers, des Dystrophins und kardialen Aktins codieren.

In ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Medikamentes ist vorgesehen, daß die kardiovaskuläre Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, die hypertro­ phe Kardiomyopathie, long QT-Syndrom und dilatative Kardiomyopathie umfaßt.

Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß genetische Ursachen für die Entwicklung bzw. Disposition zur Entwicklung von dilatativer Kardiomyopahtie beim Men­ schen von entscheidender Bedeutung sind. Diese Erkenntnis gründet sich auf der Entdeckung des Erfinders, daß sich in verschiedenen Exons des humanen MLP-Gens Varianten finden, die mit dilatativer Kardiomyopathie einhergehen.

Die nun vorliegende genomische humane Sequenz des MLP-Gens ist in sechs Exons organi­ siert, wobei alle Exons die klassischen Intron-Exon-Übergänge aufweisen und am 5'-Ende Elemente gefunden wurden, die charakteristisch für einen Promotor sind. Die Lage der ein­ zelnen Exons in der humanen genomischen Sequenz des MLP-Gens kann wie folgt beschrie­ ben werden:
Exon 1 von 12983-13011 (insgesamt 28 bp)
Exon 2 von 22480-22620 (insgesamt 140 bp)
Exon 3 von 26653-26823 (insgesamt 170 bp)
Exon 4 von 28611-28746 (insgesamt 135 bp)
Exon 5 von 29912-30005 (insgesamt 93 bp)
Exon 6 von 32211-32923 (insgesamt 712 bp)

Das ganze Gen erstreckt sich somit auf etwa 20000 bp.

Das Exon 1 des Gens codiert nur für einen 5'-nicht-translatierten Bereich; die translatierten Bereiche sind auf den Exons 2 bis 6 codiert. Eine rechnergestützte Promotoranalyse ergab, daß sich vor dem 1. Exon eine klassische TATA-Box befindet.

Es wurde eine Vielzahl von Patienten mit familiärer DCM analysiert und dabei überraschen­ derweise gefunden, daß Punktmutationen in der codierenden Sequenz der genomischen hu­ manen Sequenz des MLP-Gens, und damit auch in der hierzu korrespondierenden mRNA bzw. der abgeleiteten cDNA auftreten.

Ein Patient aus einer solchen Familie zeigte im Exon 2 einen Basenpaaraustausch (T → C) der an Position 4 zu einem Aminosäureaustausch von Tryptophan zu Arginin führt (W4R). Die diesen Austausch verursachende Mutation erfolgt genauer an Base Nr. 10 von Exon 2 der translatierten humanen genomischen Sequenz für MLP. Die Position entspricht Position 67 der Sequenz gemäß SEQ ID No. 1. Die mutierte Sequenz findet sich hierin als SEQ ID No. 2

Die von dem Erfinder entdeckte Variante im MLP-Gen führt zu einer neuen Restriktions­ schnittstelle, weshalb schnell große Patientenkollektive analysiert werden können. Ausgehend von diesem Ergebnis wurde ein weiteres Patientenkollektiv, dessen Mitglieder unter DCM leiden, untersucht, wobei von genomischer DNA von Patienten mit DCM das Exon 2 amplifi­ ziert und mit dem entsprechenden Enzym verdaut wurde. Auf diese Weise konnte aus einem Kollektiv von 500 Patienten sechs weitere Patienten mit der Variante detektiert werden. Es wurden daraufhin Familienstammbäume erstellt und, soweit möglich, die Familienangehöri­ gen zur Blutentnahme einbestellt. Auf der Grundlage dieser Untersuchungen wurden bislang zwei Familien gefunden, bei denen die Erkrankung mit dem Genotyp kosegregiert.

Ohne im folgenden darauf festgelegt sein zu wollen, sollen die folgenden Überlegungen be­ treffend die vorstehend beschriebene Variante (Mutante) der für MLP codierenden Nuklein­ säuresequenz angestellt werden.

Die im Wildtyp vorhandene Aminosäure Tryptophan gehört zu den heterozyklischen Ami­ nosäuren, das hierfür eingetauschte, d. h. in der mutierten Nukleinsäure vorhandene Arginin ist die am stärksten basische Aminosäure. Es handelt sich also um einen strukturbrechenden Austausch. Der Aminosäurenaustausch liegt in einem hochkonservierten Bereich des Proteins, wobei nicht nur das Tryptophan an dieser Stelle zwischen den MLPs verschiendener Spezies (Mensch, Schwein, Ratte, Maus) hochkonserviert ist, sondern gleichzeitig auch die benach­ barten Aminosäuren am aminoterminalen Ende des Proteins. Dies gilt nicht nur für das MLP selbst, sondern auch für die am nächsten verwandten Proteine (CRPI und CRP2). Daraus kann gefolgert werden, daß der aminoterminale Bereich des Proteins benötigt wird, um das MLP an seinen Bestimmungsort in der Myozyte zu transportieren ("andocken", solche Sequenzen sind bei vielen Proteinen gleich und kommen deshalb ubiquitär vor). Wenn dem so ist, könnte das veränderte MLP nicht mehr an seinen Bestimmungsort transportiert werden und hätte biolo­ gisch möglicherweise keinen Effekt. Eine rechnergestützte Analyse ergab, daß die aminoter­ minalen 10 Aminosäuren nur zum MLP, CRP1 und CRP2 eine signifikante Homologie auf­ weisen. Nach dem Austausch W4R zeigte sich keine signifikante Homologie mehr zu einem bekannten Protein. Bei dem aminoterminalen Ende des Proteins kann es sich somit nicht um eine häufig vorkommende, typische Transporter-Sequenz handeln, darüberhinaus ergibt die Variante W4R ebenfalls keine Homologie zu bekannten Proteinen.

Aus dem oben Ausgeführten läßt sich schlußfolgern, daß der Variante im Exon 2 mit an Si­ cherheit grenzender Wahrscheinlichkeit eine pathogenetisch wichtige Funktion bei der Gene­ se einer DCM bei den entsprechenden Patienten zukommt.

Neben der vorstehend beschriebenen Punktmutation wurde noch eine weitere gefunden, die mit DCM in Beziehung steht. Dabei handelt es sich um eine Mutation im Exon 4 des genomi­ schen humanen MLP-Gens, genauer um einen Basenaustausch an der dritten Position von Codon 112, wobei ein Austausch von G zu A erfolgt. Dieser Austausch geht mit keiner Ver­ änderung der Primärsequenz des dadurch codierten MLP-Genproduktes einher. Die zu der besagten genomischen Position korresponierende Position in der translatierten Sequenz, wie sie dargestellt ist in SEQ. ID. No. 1, ist Position 393. Die mutierte Sequenz findet sich hierin als SEQ ID No. 3

Diese mutierte Form des MLP-Gens bzw. seines Genproduktes wurde bei einem Patienten gefunden, der an schwerer dilatativer Kardiomyopathie erkrankt war und sich einer Herz­ transplantation unterziehen mußte. Die Genese der Erkrankung war unklar. Es konnte jedoch gezeigt werden, daß bei diesem Patienten eine deutlich verminderte MLP-mRNA vorlag und daß dieser Patient im Exon 4 im Kodon 112 an Position 3 einen homozygoten Basenpaaraus­ tausch von A zu G aufwies. Es scheint so zu sein, daß diese Variante zu einer verminderten Halbwertszeit der mRNA oder z. B. über ein verändertes differentielles Prozessieren zu einer mRNA mit anderen Eigenschaften führt. Es ist daher davon auszugehen, daß der homozygote Basenpaaraustausch im Codon 112 ebenfalls einen pathogenetisch wichtigen Effekt hat.

Die hierin offenbarten Nukleinsäuren sind in vielerlei Hinsicht von Bedeutung. Durch die Korrelation der offenbarten mutierten MRL-Sequenzen mit Herzerkrankungen, insbesondere der dialatativen Kardiomyopathie, können somit Untersuchungen an biologischem Material vorgenommen werden, um zu überprüfen, ob die Probe und damit die Person, von der die Probe stammt, an einer Herzerkrankung leidet oder zumindest infolge der genetisch Ausstat­ tung das Risiko in sich trägt, an dieser Herzerkrankung zu erkranken. Somit kann die Ver­ wendung der offenbarten Nukleinsäuren sowohl zu Zwecken der Prävention als auch der Dia­ gnose erfolgen. Dabei kann neben einer auf die Einzelperson abgestellten Untersuchung auch ein Patientenkollektiv Gegenstand von Untersuchungen sein, die die offenbarten Nukleinsäu­ ren verwenden oder auf diese zurückgreifen.

Die hierin beanspruchten Sequenzen sollen dabei nicht nur die Sequenzen gemäß SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 3 umfassen, sondern auch alle anderen davon ableitbaren Sequenzen, so­ lange die hierin speziell offenbarten Mutationen noch vorhanden sind. Insbesondere sind sol­ che abgeleiteten Sequenzen hierin darunter zu verstehen, die über die offenbarten beiden spe­ ziellen Mutationen hinaus noch weitere Mutationen aufweisen, insbesondere auch solche Se­ quenzen, die trotz dieser Mutationen noch für ein MLP codieren. Derartige Mutationen kön­ nen weitere Punktmutationen, aber auch eine Deletion oder Addition eines Nukleotids oder einer ganzen Nukleotidfolge sein. Denkbar ist auch, daß mehrere Deletionen oder Additionen in einer derartigen Sequenz vorhanden sind. Diese Additionen und Deletionen können an ver­ schiedenen Stellen der Sequenz erfolgen. Von den hierin offenbarten Nukleinsäuren sind auch solche umfaßt, die die Sequenzen nach SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 umfassen, wobei Teile einer jeder der beiden Sequenzen durch ein Nukleotid oder eine Abfolge mehrerer Nu­ kleotide getrennt sind. Ein Beispiel für eine derartige Sequenz ist die genomische MLP- Sequenz, die die besagten Mutationen aufweist, und deren codierenden Bereiche durch Introns voneinander getrennt sind.

Die Darstellung der genomischen humanen MLP-Sequenz ist in den Beispielen hierin be­ schrieben.

Die hierin offenbarten Sonden sind Allel-spezifische Oligonucleotide, die komplementär zu denjenigen Bereichen der Nukleinsäuren sind, die die offenbarten Mutationen tragen. Diese Sonden können insbesondere bei der Polymerase-Ketten-Reaktion als Primer für die Amplifi­ kation der Nukleinsäure verwendet werden und erlauben den Nachweis selbst bei geringen Probenmengen. Die Sonden können entweder nach der Polymerase-Reaktion oder direkt zum Nachweis der die Mutationen aufweisenden Nukleinsäuren verwendet werden. Zu diesem Zweck können die Sonden in markierter Form vorliegen. Derartige Markierungen können, u. a., radioaktive oder fluoreszierende Marker sein.

Die Sequenzen der Sonden oder Primer zum Nachweis der Mutation in Exon 2 lauten:

AGA TGC CAA ACC GGG GCG

und ist als SEQ ID No. 4 hierin beschrieben, und
für den Nachweis der Mutation in Exon 4:

TTC ACT GCG AAG TTT GGA

und ist hierin als SEQ ID No. 5 beschrieben.

Die Sequenz der Sonden oder Primer zum Nachweis der zu den jeweiligen Mutationen ent­ sprechenden Wildtyp-Sequenz lautet im Falle von Exon 2:

AGA TGC CAA ACT GGG GCG

und ist hierin als SEQ ID No. 6 beschrieben, und
im Falle von Exon 4:

TTC ACT GCA AAG TTT GGA

und ist hierin als SEQ ID No. 7 beschrieben.

Bei den erfindungsgemäßen Verfahren werden die für den Nachweis von Nukleinsäuren oder Genprodukten üblichen Probenaufarbeitungsschritte durchgeführt, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Als Ausgangsmaterial kann, bspw., Blut oder Biopsiematerial ver­ wendet werden.

Stellt das erfindungsgemäße Verfahren auf den Nachweis der Mutation über die Erzeugung einer zusätzlichen Schnittstelle für ein Restriktionsenzym ab, die in der Wildtyp-Sequenz, sei es nun in der genomischen Sequenz, der mRNA oder einer cDNA, nicht vorhanden ist, wer­ den die erhaltenen Nukleinsäure-Fragmente in der Regel auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Es sind jedoch auch andere Trenntechniken denkbar, so z. B. Kapillarelektrophorese. Im Falle der Verwendung eines Agarose-Gels können die verschiedenen Nukleinsäurefragmente durch Färbung mit bspw. Ethidiumbromid oder infolge eines radioaktiven Markers sichtbar gemacht werden.

Wird bei einem der erfindungsgemäßen Verfahren das Genprodukt eines der hierin offenbar­ ten Nukleinsäuren nachgewiesen, können hierzu alle für den Nachweis von Peptiden oder Proteinen geeigneten Verfahrensweisen herangezogen werde. Ein Möglichkeit besteht in der Verwendung von Antikörpern, insbesondere monoklonaler Antikörper.

Es ist für die Fachleute offensichtlich, daß beim Nachweis des durch eine Nukleinsäure, die die Mutation im Exon 4 aufweist, bei der es zu einem Austausch an der Position 3 von Codon 112 von A zu G kommt, codierten Peptids oder Proteins auf andere Nachweisverfahren aus­ gewichen werden muß, die nicht auf die infolge der Mutation Andersartigkeit des Genpro­ duktes abstellen, da es sich bei dieser Mutation um eine stille Mutation handelt, die sich auf der Ebene der Primärsequenz, d. h. auf der Aminosäuresequenz nicht äußert. Wie oben festge­ stellt kommt es jedoch bei dieser Mutation, insbesondere bei Vorliegen eines homozygoten Basenpaaraustausches, d. h. beide Allele weisen diese Mutation auf, zu einer deutlich vermin­ derten MLP-mRNA, so daß auf der Ebene des Genproduktes der Nachweis der Mutation durch Quantifizieren der mRNA bzw. des Genproduktes erfolgen kann.

Die erfindungsgemäßen Kits umfassen zumindest eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Sonden oder ein Genprodukt der besagten Nukleinsäuren. Besonders bevorzugt umfaßt der erfindungsgemäße Kit zumindest eine für eine der beiden beschriebenen Mutationen spezifi­ sche Sonde. Dabei kann die zum Wildtyp korrespondierende Sonde als Negativkontrolle ent­ halten sein. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können als Positiv- und/oder Negativkon­ trolle in dem Kit enthalten sein. Alternativ oder ergänzend zu der Sonde kann ein Restriktion­ senzym in dem Kit enthalten sein, das an der durch die Mutation neu erzeugten Schnittstelle schneidet und somit einen Restriktionsverdau an der mutierten Sequenz gegenüber der nicht- mutierten Sequenz erlaubt und damit zu einem anderen Muster der - geschnittenen - Nuklein­ säure, d. h. zu einem Restriktionslängenpolymorphismus, führt. Die Nukleinsäuren, Sonden oder Genprodukte können in dem Kit dabei in einem geeigenten Puffer vorliegen. Der Kit kann erfindungsgemäß auch einen Träger umfassen, auf eine Nukleinsäure oder ein Polypep­ tid bzw. Protein immobilisiert werden können.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine regulatorische Nukleinsäure, insbesonde­ re einen Promotor.

Hierin werden die Begriffe regulatorische Nukleinsäure, Promotorstruktur und Promotor syn­ onym verwendet.

Bei den vom Erfinder durchgeführten Untersuchungen wurde erkannt, daß eine vor dem 1. Exon der genomischen humanen MLP-Sequenz angeordnete Sequenz mit einer Länge von ca. 2000 bp für die muskelspezifische Expression von erheblicher Bedeutung zu sein scheint. Insbesondere wird vor dem ersten Exon sowohl eine TATA-Box als auch eine CAAT-Box gefunden, die beide für die Expression des Gens von Bedeutung sind. Darüberhinaus wurden AP-1 cis-regulatorische Elemente gefunden, von denen man weiß, daß sie für muskelspezifi­ sche Gene von Bedeutung sind. Die beschriebene regulatorische Nukleinsäuresequenz führt im übrigen dazu, daß die Expression des MLP stressinduzierbar ist. Somit stellt die regulato­ rische Nukleinsäuresequenz eine gewebespezifische Promotorstruktur dar, die darüber hinaus noch durch Stress induzierbar ist.

Die vorstehend genannte Gewebespezifität der regulatorischen Nukleinsäure ergibt sich dar­ aus, daß das MLP-Gen nur in Muskelgewebe (d. h. quergestreifte und glatte Muskulatur) vor­ kommt; es handelt sich somit um einen muskelspezifischen Promotor. Das Genprodukt bzw. die mRNA, ist relativ einfach mit verschiedenen Techniken nachweisbar (z. B. Northern Blot, PCR), was auf einen starken Promotor schließen läßt. Das erste Exon kodiert nur etwa 30 Ba­ senpaare des 5' nicht translatierten Bereiches. Etwa 20-30 Basenpaare vor dem ersten Exon liegen mehrere TATA-Box-Elemente, also genau die Bereiche, an die die DNA-abhängige RNA-Polymerase II binden muß, um das Gen abzuschreiben. Darüber hinaus liegen etwa 10 bis 20 Basenpaare vor dem ersten Exon mehrere Transkriptionsinitiations-Sequenzen. Zu­ sätzlich sind unmittelbar vor dem ersten Exon mehrere AP-1 Sequenzen vorhanden. Diese Sequenzen binden die sogenannten "leucine zipper"-Transkriptionsfaktoren, die wichtige Funktionen, unter anderem bei der Stressinduzierbarkeit von Genen, einnehmen. Das Vorhan­ densein dieser Sequenzen untermauert die vom Erfinder gefundene Stressinduzierbarkeit des MLP-Gens.

Eine ganze Reihe von AP-1 Sequenzen werden "upstream" in den ersten 1000 Basenpaaren gefunden. Etwa 500 Basenpaare upstream wird eine CAAT Box gefunden. In der Regel wer­ den diese Elemente 80-120 Basenpaare vor dem Gen gefunden, eine wichtige Funktion die­ ses Elementes in dem vom Erfinder entdeckten Promotor ist jedoch nicht auszuschließen. Al­ lerdings muß angemerkt werden, daß es auch Promotoren, vor allem gewebespezifische, ohne CAAT-Boxen gibt, es sich somit nicht um ein zwingend notwendiges Element handelt.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß bis etwa 1000 Basenpaare vor dem ersten Exon AP-1- und CAAT-Sequenzen gefunden werden. Der Bereich von etwa 1000 Basenpaa­ ren vor dem ersten Exon erscheint somit von erheblicher Bedeutung für die Expression des Gens zu sein. Als Kern-Region wird auf jeden Fall der Bereich von etwa 500 Basenpaaren (also von der CAAT Box ausgehend) vordem ersten Exon zu bezeichnen sein.

Die verschiedenen Elemente der hierin offenbarten regulatorischen Nukleinsäure sind in Fig. 2 dargestellt.

Die erfindungsgemäße regulatorische Sequenz kann in einer weiteren Ausführungsform auch durch die Sequenz gemäß SEQ ID No. 8 dargestellt werden.

Die Darstellung der erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenz oder Promotorstruktur kann auch dadurch erfolgen, daß die entsprechende Sequenz aus humaner, genomischer DNA mit Hilfe der Polymerasen-Ketten-Reaktion mit zwei Primern amplifiziert wird. Dazu wird als stromaufwärtiger ("upstream") Primer der Primer gP1 mit der Sequenz

ATC TGA TGT GAA GGC TGG

verwendet, wie sie auch im Sequenzprotokoll als SEQ ID No. 9 angegeben ist.

Als stromabwärtiger ("downstream") Primer wird der Primer gP2 mit der Sequenz

CCT GCC TGT GTG GAC TCC

verwendet, wie sie auch im Sequenzprotokoll als SEQ ID No. 10 angegeben ist.

Die erfindungsgemäße regulatorische Sequenz kann auch in einem Vektor integriert vorlie­ gen. Derartige Vektoren können sowohl Plasmid- als auch virale Vektoren sein. Typischer­ weise sind Vektoren Nukleinsäuremoleküle, die für - bevorzugt fremde - Nukleinsäuren als Rezipient oder Träger dienen. Vektoren tragen im allgemeinen einen Replikationsursprung ("origin") und genetische Marker, die erlauben, daß der Vektor in Wirtszellen nachgewiesen werden kann. Darüberhinaus kann der Vektor weitere Elemente umfassen, die der Steuerung der Translation und/oder Transkription der aufgenommenen bzw. im Vektor enthaltenen Nu­ kleinsäure dienen.

Sowohl die erfindungsgemäße regulatorische Sequenz als auch der erfindungsgemäße Vektor kann in einer Zelle enthalten sein. Grundsätzlich kann hierzu eine jegliche Zelle oder Zellinie herangezogen werden. Die Zelle kann ausgewählt sein aus der Gruppe, die prokaryontische und eukaryontische Zellen umfaßt. Innerhalb der Gruppe der eukaryontischen Zellen kann die Zelle wiederum ausgewählt werden aus der Gruppe, die insbesondere Hefezellen, Insekten­ zellen und Säugetierzellen umfaßt. Insbesondere bei den Säugetierzellen kann vorgesehen sein, daß es sich um primäre Zellen, Primärzellkulturen oder etablierte Zellkulturen handelt.

Für die regulatorischen Sequenzen und die verschiedenen diese enthaltenden biologischen Systeme ergeben sich eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten, die auf den folgenden Überlegungen sowie der Tatsache basieren, daß die hierin offenbarte regulatorische Nuklein­ säure eine gewebespezifische und insbesondere muskelspezifische Expression von unter der Kontrolle der besagten regulatorischen Sequenz stehenden Nukleinsäuresequenzen erlaubt.

Eine Vielzahl von Erkrankungen des Menschen lassen sich auf genetische Defekte zurückfüh­ ren. Ein Großteil dieser Krankheitsbilder wiederum wird durch monogene Erkrankungen, d. h. Mutationen in einem einzigen Gen, ausgelöst. Bei Kenntnis dieser molekularen Veränderun­ gen läßt sich durch Gentherapie eine Reparatur des molekularen Defektes durchführen.

Im kardiovaskulären System sind eine Reihe von Erkrankungen bekannt, bei denen Punkt­ mutationen in einem einzigen Gen zu schweren Krankheitsbildern führen. Dazu zählen Muta­ tionen in den Genen, die Proteine des Sarkomers codieren und zur hypertrophen Kardiomyo­ pathie führen (Towbin. The role of cytoskeletal proteins in cardiomyopathies. 10, 131-139 (1998)), das long QT Syndrom (Jerve Lange Nielson-Syndrom und Romano Ward-Syndrom) (Neyround, N. et al.; Cire Res 84, 290-297 (1999)) sowie Mutationen im Dystrophin (Muntni F. et al.; N Engl J Med 329, 921-5 (1993)) oder kardialen Aktin-Gen (Olsen, T. et al.; Science 280, 750-752 (1998)), die zur dilatativen Kardiomyopathie führen. Diese Erkrankungen sind prinzipiell durch Applikation des korrekten Gens kausal therapierbar.

Erst kürzlich wurde von verschiedenen Autoren über die erfolgreiche Applikation von Ade­ noviren in Kardiomyozyten in vitro und in vivo berichtet (Hajjar, R. et al.; Proc Natl Acad Sci USA 95, 5251-5256 (1998); Donahue J. et al.; Proc Natl Acad Sci USA 94, 4664-4668 (1997) und Westfall, M. et al.; Proc Natl Acad Sci USA 94, 5444-5449 (1997)). Allerdings haben die bislang verwendeten Vektoren den Nachteil, daß sie über einen Cytomegalie-Virus (CMV)-Promotor gesteuert werden. Sie werden deshalb nicht nur im Myokard oder dem Muskelgewebe exprimiert, sondern in jeder anderen Körperzelle auch. Die oben aufgeführten Krankheitsbilder betreffen allerdings nur Kardiomyozyten. Eine Expression des zu übertra­ genden Gens in andere Zellen als in Kardiomyozyten macht keinen Sinn und erhöht nur die Gefahren einer Gentherapie, nämlich das Auftreten von weiteren Mutationen bzw. von uner­ wünschten Interaktionen im Sinne von Immunreaktionen. Die erfindungsgemäße regulatori­ sche Nukleinsäure wird im Gegensatz zum ubiquitär exprimierten CMV-Promotor nur im Muskelgewebe exprimiert und eignet sich deshalb und aufgrund seiner Stärke hervorragend zur Gentherapie in bzw. von Muskelgewebe.

Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsäure können generell und besonders, wenn die Darstellung mittels der beiden oben beschriebenen Primer erfolgt, an deren Enden entsprechende, von einem Restriktionsenzym erkennbare Sequenzen angebaut sein (z. B. Eco RI oder jedes andere beliebige Enzym, über dessen Schnittstellen die Einklo­ nierung erfolgen soll).

Bei der Herstellung eines erfindungsgemäßen Vektors kann dabei so vorgegangen werden, daß aus dem Shuttle-Vector pAdCMVssTnI, wie beschrieben in Westfall et al. (Westfall, M. et al.; Proc Natl Acad Sci USA 94, 5444-5449 (1997)), mit dem entsprechenden Enzym der CMV-Promotor ausgeschnitten und der MLP-Promotor (d. h. eine erfindungsgemäße regulato­ rische Nukleinsäure) in das Shuttle-Plasmid pAdCMVssTnI eingebaut wird. Das jetzt ent­ standene Plasmid pAdMLPssTnI kann zusammen pJM17 über die Kalziumphosphat- Methode, wie bei Westfall et al. (Westfall, M. et al.; Proc Natl Acad Sci USA 94, 5444- 5449 (1997)) beschrieben, in HEK 293 Zellen kotransfiziert und über homologe Rekombina­ tion ein Adenovirus mit MLP-Promotor erhalten werden, der gewebespezifisch exprimiert wird. Dieser Virus würde als Spezialfall das sogenannte "slow skeletal troponin I" exprimie­ ren. Es kann jedoch jedes gewünschte Genprodukt in bekannter Weise vor den MLP- Promotor in einem geeigneten Vektor, bspw. einem Shuttle-Vector, kloniert und zur Expres­ sion gebracht werden. Zum Beispiel könnte das hsp70-Gen, das am Myokard protektive Funktionen einnimmt, vorgeschaltet werden (Yellon, D. et al.; J Mol Cell Card 24, 113-124 (1992)). Dabei werden nur klassische Klonierungsmethoden erforderlich, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind und bspw. beschrieben sind in Maniatis, Fritsch & Sambrook. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratories, 1989.

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß sich der erfindungsgemäße Promotor vor jedes gewünschte Genprodukt klonieren läßt und der erfindungsgemäße Promotor somit mit jedem gewünschten Virus oder Vektorsystem die unter der Kontrolle des Promotors befindliche Nu­ kleinsäure gewebespezifisch zur Expression bringen kann. Insoweit kann der hierin offenbarte Promotor insbesondere bei den vorstehend genannten und hierin offenbarten Erkrankungen verwendet werden, einschließlich bei der gentherapeutischen Behandlung der DCM. Neben den explizit hierin genannten Erkrankungen sind des weiteren all jene Erkrankungen unter Verwendung der erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenz therapierbar, bei denen es der gewebespezifischen und insbesondere der muskelspezifischen Expression einer Nukleinsäure bedarf.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele, der Figuren und des Sequenzprotokolls weiter erläutert, woraus sich weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben können.

Dabei zeigt

Fig. 1 eine Restriktionsanalyse von Exon 2 des genomischen humanen MLP-Gens; und

Fig. 2 die Sequenz der erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsäure mit den promotor­ spezifischen Elementen.

BEISPIELE 1. Darstellung der humanen MLP-cDNA

Die humane MLP-cDNA wurde mit Hilfe der Polymerase-Ketten-Reaktion (= PCR) unter Verwendung der beiden Primer KMLP1 und KLMP2 hergestellt.

Die Sequenz von KMLP1 ist dargestellt als SEQ ID No. 11 und lautet wie folgt:

GGC AGA CTT GAC CTT GAC CA

Die Sequenz von KMLP2 ist dargestellt als SEQ ID No. 12 und lautet wie folgt:

GAG GTG CGC CGT TTC TCA GA

Die solchermaßen als Produkt der PCR erhaltene cDNA weist eine Länge von etwa 650 bp auf und enthält den gesamten codierenden Bereich der mRNA.

2. Darstellung der humanen genomischen MLP-Sequenz

Ausgehend von der in Beispiel 1 beschriebenen cDNA wurde die humane genomische MLP- Sequenz dadurch dargestellt, daß eine humane genomische Genbank unter Verwendung der cDNA gescreent wurde. Hierzu wurde die als Sonde eingesetzte cDNA radioaktiv markiert (Feinberg, A. et al.; Anal Biochem 132, 6-13 (1983)) und mit einer in den Bakteriophagen P1 einklonierten Genbank hybridisiert (Ioannou, P. A. et al.; Nature Genetics 6, 84-89 (1994)). Das Screening erfolgte unter Anwendung der üblichen, den Fachleuten bekannten Verfah­ rensweisen, wie sie z. B. beschrieben sind in Maniatis, Fritsch & Sambrook. Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratories, (1989).

Das MLP-Gen selbst ist auf dem Chromosom 11p15.1 lokalisiert (Fung, Y. W. et al.; Geno­ mics 28, 602-603 (1995)).

Der solchermaßen erhaltene Klon der humanen genomischen MLP-Sequenz wurde anschlie­ ßend mittels eines automatischen DNA-Sequenzierers sequenziert. Der positive Klon umfaßte insgesamt 80000 Basenpaare und enthält das gesamte humane MLP-Gen, das in insgesamt sechs Exons organisiert ist, wie bereits oben offenbart.

3. Nachweis der Mutationen in Exon 2 und in Exon 4 der humanen genomischen MLP- Sequenz

Wie oben festgehalten, handelt es sich bei den beiden durch den Erfinder gefundenen Muta­ tionen in der MLP-Sequenz um eine solche an Base 10 von Exon 2 der translatierten humanen genomischen MLP-Sequenz, wobei ein Austausch von T zu C erfolgt, und um eine solche an der dritten Position von Codon 112 von Exon 4 der translatierten Sequenz, wobei ein Aus­ tausch von A zu G erfolgt. Beide Mutationen finden ihre Entsprechung in der mRNA bzw. der davon ableitbaren cDNA, wobei im Falle der Mutation im Exon 2 die Position der Muta­ tion der Base 67 der mRNA bzw. der cDNA entspricht, und im Falle der Mutation im Exon 4 die Position der Mutation der Base 393 der mRNA bzw. der cDNA, wie auch dargestellt in SEQ ID No. 1, entspricht.

3.1 Isolieren der genomischen DNA Herstellung des "buffy coats"

Gesamtblut wird für etwa 10 Minuten bei 3300 g und Raumtemperatur zentrifugiert. Nach Zentrifugation erhält man drei Phasen, die obere klare Phase entspricht dem Plasma, die dün­ ne weiße Phase entspricht den Leukozyten und die untere rote Phase den Erythrozyten. Die Leukozyten können jetzt leicht mit einer Pipette abgenommen werden. Sie entsprechen dem "buffy coat".

Isolierung der genomischen DNA

Die Isolierung der genomischen DNA wurde mit Hilfe eines "Qiagen Blood Kits" von 1997 und einer Standard "Eppendorf-Tischzentrifuge" wie folgt vorgenommen:

• 1. a.) Etwa 200 µl des buffy coats wurden in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß gegeben. Dazu wur­ den 25 µl Proteinase K und 20 µl eines Puffers AL gegeben und für 15 Sekunden gevor­ text (heftig geschüttelt, gemischt).
• 2. b.) Diese Mischung wurde für 10 Minuten in einem Wasserbad bei 70°C erhitzt.
• 3. c.) Zu diesem Gemisch wurden 210 µl Ethanol (100%ig) gegeben und erneut kräftig ge­ mischt.
• 4. d.) Eine Qiagen-Säule wurde in ein 2 ml Eppendorf-Gefäß gegeben und die Mischung aus c) auf die Säule aufgetragen. Es erfolgte eine Zentrifugation für 1 Minute bei 6000 g und die Säule wurde auf ein neues 2 ml Eppendorf-Gefäß gegeben. Die abzentrifugierte Flüssig­ keit wurde verworfen, die genomische DNA hatte an die Säule gebunden.
• 5. e.) Auf die Säule wurden 500 µl Puffer AW gegeben und erneut bei 6000 g für 1 Minute zentrifugiert. Die abzentrifugierte Flüssigkeit wurde erneut verworfen und die Säule auf ein neues 2 ml Eppendorf-Gefäß gegeben.
• 6. f.) Es wurden erneut 500 µl Puffer AW auf die Säule gegeben und mit höchster Geschwin­ digkeit (etwa 15.000 Umdrehungen bei einer Eppendorf-Tischzentrifuge) für 3 Minuten zentrifugiert. Die abzentrifugierte Flüssigkeit wurde erneut verworfen.
• 7. g.) Die Säule wurde jetzt auf ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß gesetzt und es wurden 200 µl reines Wasser, vorher auf 70°C erhitzt, auf die Säule gegeben. Es erfolgte eine Inkubation für eine Minute bei Raumtemperatur und eine Zentrifugation bei 6000 g für eine Minute. In der abzentrifugierten Flüssigkeit, dem Eluat, befand sich die genomische DNA, die für die weiteren Zwecke Verwendung fand. Die Konzentration wurde in einem weiteren Schritt photometrisch bestimmt.

Für die Polymerase-Ketten-Reaktion wurden etwa 50 ng der genomischen DNA eingesetzt.

Amplifikation von Exon 2 der humanen genomischen MLP-Sequenz

Zur Amplifikation des Exons 2 wurden die Primer GMLP 3 mit der Sequenz

ACT CTT AGA GAT TGG TTC ACT CC

entsprechend SEQ ID No. 13 und
GMLP 4 mit der Sequenz

ACC ACA CTA TGA GAA CCA CTG GC

entsprechend SEQ ID No. 14 verwendet.

Dabei wurden die folgenden Amplifikationsbedingungen angewandt:

• 1. 94°C für 4 Minuten

Dann beginnen insgesamt 36 Zyklen mit

• 1. 94°C für 45 Sekunden
• 2. 62°C für 45 Sekunden
• 3. 72°C für 1 Minute

Im Anschluß an die 36 Zyklen dann:

• 1. 72°C für 5 Minuten

3.2 Restriktionsverdau von Exon 2 der humanen genomischen MLP-Sequenz

Von den unter 3.1 beschriebenen und erhaltenen PCR-Produkten wurde ein Teil auf einem Agarose-Gel aufgetrennt und auf ihre korrekte Größe hin analysiert. Bei korrekten Größen, was in der Regel der Fall war, wurde ein anderer Teil über Nacht bei 37°C mit dem Restrik­ tionsenzym Nci I verdaut und am nächsten Morgen erneut auf einem Agarose-Gel aufge­ trennt.

Die PCR zur Amplifikation von Exon 2 ergibt ein PCR Produkt mit einer Größe von 308 Ba­ senpaaren. Sollte sich im Codon 4 an Position 1 ein Basenpaaraustausch von T zu C ereignet haben, schneidet das Restriktionsenzym Nci I und es entstehen 2 Bruchstücke mit einer Größe von 103 Basenpaaren und 205 Basenpaaren.

Im homozygoten Fall würde man kein PCR-Produkt mit einer Größe von 308 Basenpaaren, sondern nur noch die beiden Bruchstücke vorfinden. Im heterozygoten Fall, d. h. es liegt ein gesundes, d. h. bezüglich der speziellen Base nicht mutiertes Allel, und ein bezüglich der spe­ ziellen Base mutiertes Allel vor, findet man das PCR Produkt mit 308 Basenpaaren zusätzlich zu den beiden kleineren Bruchstücke.

Das Ergebnis dieser Restriktionsanalyse ist in Fig. 1 dargestellt, wobei Fig. 1 genauer das Ergebnis eines Restriktionsverdaus von amplifiziertem Exon 2 der humanen genomischen MLP-Sequenz zeigt, das auf ein Agarose-Gel aufgetragen und aufgetrennt wurde. Die beiden jeweils äußeren Spuren des Agarose-Gels zeigen einen Molekulargewichtsstandard. Die mit "wt" übschriebene Spur zeigt Exon 2 in seinem Wildtyp, wobei zu dem aufgetragenen Re­ striktionsansatz kein Restriktionsenzym hinzugesetzt wurde. Die mit "wt + E" überschriebene Spur zeigt Exon 2 in seinem Wildtyp, wobei zu dem aufgetragenen Restriktionsansatz das Restrktionsenzym Nci I hinzugegeben wurde. Infolge des Fehlens der hierin offenbarten Mu­ tation an Base 10 von Exon 2 bei der humanen genomischen Wildtyp-MLP-Sequenz ist in Exon 2 keine Schnittstelle für Nci I vorhanden, so daß sich gegenüber dem Restriktionsansatz mit der Wildtyp-Sequenz ohne Restriktionsenzym kein geändertes Schnittmuster ergibt. Die mit "M" überschriebene Spur zeigt einen Restriktionsansatz, der mit der mutierten Form von Exon 2 der humanen genomischen MLP-Sequenz ohne Restriktionsenzym durchgeführt wur­ de. Es finden sich ohne Zusatz des Restriktionsenzyms keine zusätzlichen Banden im Gel, so daß, wie auch aus dem Vergleich mit dem mit "wt" bezeichneten Ansatz hervorgeht, die Grö­ ße des Exon 2 umfassenden Nukleinsäurefragment infolge der Mutation nicht geändert ist. Führt man einen Restriktionsansatz mit dem an Base 10 mutierten Exon 2 durch und setzt das Restriktionsenzym Nci I zu, so kommt es infolge der mutationsbedingten Ausbildung einer Schnittstelle für das besage Retriktionsenzym zu einem Schneiden der Nukleinsäure von Exon 2 und Ausbildung der beiden vorhergesagten Nukleinsäurefragmente, wie dies auch in Fig. 1 in der mit "M + E" überschriebenen Spur gezeigt ist.

Unter Anwendung dieser Technik wurden bislang etwa 500 Patienten auf das Vorkommen der von dem Erfinder entdeckten Variante untersucht. Es wurden sechs Patienten mit der Variante gefunden.

3.3 Restriktionsverdau von Exon 4 der humanen genomischen MLP-Sequenz

Zur Analyse des Exons 4 wurde im Prinzip genauso wie bei Exon 2 vorgegangen. Es wurden jedoch dabei die Primer gMLP7.2 mit der Sequenz

CAA CAA CGC TAT gAg AAA gAC ACC

entsprechend SEQ ID No. 15 und
gMLP8.2 mit der Sequenz

ggA gCT AgA gAg AAT gAC AgC TgC

entsprechend SEQ ID No. 16 unter den folgenden PCR-Bedingungen benutzt:

• 1. 94°C für 4 Minuten

Dann beginnen insgesamt 36 Zyklen mit

• 1. 94°C für 45 Sekunden
• 2. 60°C für 45 Sekunden
• 3. 72°C für 1 Minute

Im Anschluß an die 36 Zyklen dann:

• 1. 72°C für 5 Minuten

Von den erhaltenen PCR-Produkten wurde ein Teil auf einem Agarose-Gel aufgetrennt und auf ihre korrekte Größe hin analysiert. Bei korrekten Größen, was in der Regel der Fall war, wurde ein anderer Teil über Nacht bei 37°C mit dem Restriktionsenzym Cvi RI verdaut und am nächsten Morgen erneut auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Betreffend die Inkubation ist anzumerken, daß eine Inkubation des Restriktionsansatzes auch für 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur hätte erfolgen können. Die Inkubation über Nacht erfolgte nur aus Gründen der Sorgfalt.

3.4 Nachweis der Mutationen in Exon 2 bzw. Exon 4 mittels Allel-spezifischer Oligo­ nucleotide

Neben der Durchführung von Restriktionsanalysen lassen sich zum Auffinden der hierin of­ fenbarten Varianten bzw. Mutationen in Exon 2 und Exon 4 der genomischen humanen MLP- Sequenz bzw. der korrespondierenden cDNA. Sonden (sogenannte Allel-spezifische Oligo­ nucleotide, ASO) herstellen.

Für den Nachweis der Variante oder Mutation im Exon 2 kann dabei eine Sonde mit der fol­ genden Sequenz verwendet werden, die SEQ ID No. 4 entspricht:

AGA TGC CAA ACC GGG GCG

Zum Nachweis der Wildtyp-Form von Exon 2 kann eine Sonde mit der folgenden Sequenz verwendet werden, die SEQ ID No. 6 entspricht:

AGA TGC CAA ACT GGG GCG

Die Schmelztemperatur beim Nachweis der Mutation unter Verwendung der Sequenz nach SEQ ID No. 4 beträgt 60°C, die Schmelztemperatur beim Nachweis des Wildtyps unter Ver­ wendung der Sequenz nach SEQ ID No. 6 beträgt ca. 58°C.

Für den Nachweis der Variante oder Mutation im Exon 4 kann dabei eine Sonde mit der fol­ genden Sequenz verwendet werden, die SEQ ID No. 5 entspricht:

TTC ACT GCG AAG TTT GGA

Zum Nachweis der Wildtyp-Form von Exon 4 kann eine Sonde mit der folgenden Sequenz verwendet werden, die SEQ ID No. 7 entspricht:

TTC ACT GCA AAG TTT GGA

Die Schmelztemperatur beim Nachweis der Mutation unter Verwendung der Sequenz nach SEQ ID No. 5 beträgt 52°C, die Schmelztemperatur beim Nachweis des Wildtyps unter Ver­ wendung der Sequenz nach SEQ ID No. 7 beträgt ca. 50°C.

Mit den angeführten Primern wurden die Exons 2 und 4 aller mittels der Restriktionsanalyse und der Sondenanalyse ermittelten Träger der Mutation(en) unter Verwendung von Standard- Techniken auch sequenziert. Die Sequenzanalyse bestätigte in allen Fällen das Ergebnis der Restriktions- und der Sondenanalyse. Somit kann auch die Sequenzierung der Exons 2 bzw. 4 bzw. der korresondierenden cDNA bzw. der korrespondierenden cDNA des genomischen humanen MLP-Gens bzw. des genomischen MLP-Gens, insbesondere unter Verwendung der hierin beschriebenen Sonden, als ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, insbesondere dilatativer Kardiomyopathie, verwendet werden.

3.5 Struktur der regulatorischen Nukleinsäure(sequenz)

Die in SEQ ID No. 8 angegebene regulatorische Nukleinsäure ist in Fig. 2 zusammen mit den markierten promotorspezifischen Elementen dargestellt. Die Isolierung dieser regulatorischen Nukleinsäure ist unter Verwendung der oben beschriebenen Primer gP1 und gP2, entspre­ chend SEQ ID No. 9 und SEQ ID No. 10, möglich. Unter Verwendung der beiden genannten Primer kann die regulatorische Nukleinsäuresequenz bzw. der hierzu korrespondierende MLP-Promotor (1000 bp) amplifiziert werden.

Unter Bezugnahme auf Fig. 2 sei hierin noch folgendes angemerkt:

Die letzte am 3'-Ende unterstrichene Sequenz entspricht dem ersten Exon.

Die AP-1-Sequenzen sind durch Unterstreichung markiert, wobei von der Konsensus- Sequenz TGAG/CTCA maximal zwei Fehlpaarungen akzeptiert wurden.

CAAT-Sequenzen sind durch Fettdruck markiert, wobei diesbezüglich festzuhalten ist, daß zu Beginn des Promotors sich eine AP-1 und eine CAAT-Sequenz überschneiden.

TATA-Boxen sind durch Fettdruck und Unterstreichung markiert.

Die Offenbarung der verschiedenen hierin zitierten Literaturstellen wird hiermit durch Be­ zugnahme vollständig aufgenommen.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und der Zeichnung offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebigen Kombinationen für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (48)

1. Nukleinsäure, die für ein MLP codiert und eine Sequenz nach SEQ ID NO: 1 umfaßt, wo­ bei die Sequenz eine Mutation an Base Nr. 10 von Exon 2 der translatierten Sequenz aufweist.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutation ein Austausch von T zu C ist.

3. Nukleinsäure, die für ein MLP codiert und eine Sequenz nach SEQ ID NO: 1 umfaßt, wo­ bei die Sequenz eine Mutation an der dritten Position von Codon 112 im Exon 4 der transla­ tierten Sequenz aufweist.

4. Nukleinsäure nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutation ein Austausch von A zu G ist.

5. Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie lediglich die für eine Aminosäuresequenz codierenden Sequenzen umfaßt.

6. Nukleinsäure, die für ein MLP codiert und die Sequenz von Position 58 bis 639 der SEQ ID NO: 1 umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß an Position 67 eine Mutation vorhanden ist, insbesondere eine Mutation von T zu C.

7. Nukleinsäure, die für ein MLP codiert und die Sequenz von Position 58 bis 639 der SEQ ID NO: 1 umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß an Position 393 eine Mutation vorhanden ist, insbesondere eine Mutation von A zu G.

8. Nukleinsäure codierend für MLP, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz ohne die De­ generiertheit des genetischen Codes einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7 entsprechen würde.

9. Nukleinsäure codierend für MLP, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8 hybridisiert.

10. Aminosäuresequenz, codiert von einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder Teilen davon, insbesondere die Sequenzen oder Teile davon, die die Mutation(en) tragen.

11. MLP umfassend eine Aminosäuresequenz, die von einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder einem Teil davon codiert ist oder eine Aminosäuresequenz nach An­ spruch 10.

12. Sonde für eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9, insbesondere für deren Nachweis oder Amplifikation, umfassend die Sequenz von SEQ ID NO: 4.

13. Sonde für eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9, insbesondere für deren Nachweis oder Amplifikation, umfassend die Sequenzen nach SEQ ID NO: 5.

14. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder einer Sonde nach Anspruch 12 oder 13 zur Diagnose von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, insbesondere dilatative Kardiomyopathie.

15. Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, insbeson­ dere dilatative Kardiomyopathie, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder eine Sonde nach Anspruch 12 oder 13 verwendet wird.

16. Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, insbeson­ dere dilatative Kardiomyopathie, insbesondere nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß
eine Probe umfassend eine für MLP codierende Sequenz mit einem Restriktionsenzym verdaut wird und
das Vorliegen einer für MLP codierenden mutierten Sequenz durch das Auftreten ei­ nes gegenüber dem Restriktionsenzym-Verdaumuster einer für MLP codierenden nicht-mutierten Sequenz geänderten Restriktionsenzym-Verdaumusters nachgewiesen wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die für MLP codierende Se­ quenz vor dem Verdau mittels PCR amplifiziert wird.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis bzw. das Screenen auf eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 gerichtet ist.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation mit einem Primer erfolgt, wobei der Primer eine Sequenz nach SEQ ID NO: 13 und/oder SEQ ID NO: 14 umfaßt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Restrik­ tionsenzym-Verdau durch Nci I erfolgt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß im Falle einer nicht-mutierten Sequenz das PCR-Produkt eine Länge von etwa 308 bp und im Falle einer Mutation an Base Nr. 10 von Exon 2 bzw. einer Mutation an Position 67 der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1, wobei die Mutation in einem Austausch von T zu C besteht, zwei PCR-Produkte mit etwa 205 und etwa 103 bp auftritt.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Nach­ weis bzw. das Screenen auf eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 3 bis 9 gerichtet ist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation mit einem Primer erfolgt, wobei der Primer die Sequenz nach SEQ ID NO: 15 und/oder SEQ ID NO: 16 umfaßt.

24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Restriktionsen­ zymverdau durch Cvi RI erfolgt.

25. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß für den Nachweis der bzw. das Screenen auf eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9 eine Hybridisie­ rung einer zu untersuchenden Probe mit einer Sonde umfassend eine Sequenz nach SEQ ID NO: 4 erfolgt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierung bei 60°C erfolgt.

27. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß für den Nachweis der bzw. das Screenen auf eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 3 bis 9 eine Hybridisie­ rung einer zu untersuchenden Probe mit einer Sonde umfassend eine Sequenz nach SEQ ID NO: 5 erfolgt.

28. Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, insbeson­ dere dilatativer Kardiomyopathie, dadurch gekennzeichnet, daß eine Aminosäuresequenz nach Anspruch 10 oder ein MLP nach Anspruch 11 nachgewiesen wird.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz oder das MLP mittels eines Antikörpers, bevorzugterweise eines monoklonalen Antikörpers, nach­ gewiesen wird.

30. Kit zum Nachweis einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch ge­ kennzeichnet, daß er mindestens eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder mindestens eine Sonde nach Anspruch 12 oder 13 umfaßt.

31. Kit zum Nachweis eines MLP nach Anspruch 11 oder einer für ein MLP codierenden Aminosäuresequenz nach Anspruch 10 umfassend mindestens einen Antikörper gegen ein MLP nach Anspruch 11 oder gegen eine Aminosäuresequenz nach Anspruch 10.

32. Regulatorische Nukleinsäure umfassend etwa 500 Basenpaare stromaufwärts von der er­ sten Base des ersten Exons der für MLP codierenden humanen genomischen Sequenz.

33. Regulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 32 umfassend etwa 1000 Basenpaare strom­ aufwärts von der ersten Base des ersten Exons der für MLP codierenden humanen genomi­ schen Sequenz.

34. Regulatorische Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß ausgehend von humaner ge­ nomischer DNA unter Verwendung von zwei Primern in einer PCR-Reaktion die regulatori­ sche Nukleinsäure darstellbar ist, wobei der stromaufwärtige Primer die SEQ ID NO: 9 und der stromabwärtige Primer die SEQ ID NO: 10 umfaßt.

35. Regulatorische Nukleinsäure umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8.

36. Regulatorische Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 32 bis 35, dadurch gekennzeich­ net, daß die regulatorische Nukleinsäure ein Promotor ist.

37. Vektor umfassend eine regulatorische Sequenz nach einem der Ansprüche 32 bis 36.

38. Vektor nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorische Sequenz in dem Vektor pAdCMVssTnI enthalten ist, wobei bei diesem Vektor der CMV-Promotor durch die regulatorische Sequenz nach einem der Ansprüche 32 bis 36 ersetzt ist.

39. Vektor nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen adenoviralen Vektor handelt.

40. Vektor nach einem der Ansprüche 37 bis 39 umfassend eine codierende Sequenz, die un­ ter der Kontrolle der regulatorischen Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 32 bis 36 ist.

41. Vektor nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß die codierende Sequenz ausge­ wählt ist aus der Gruppe, die hsp70 und das "slow skeletal troponin I" umfaßt.

42. Zelle umfassend eine regulatorische Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 32 bis 36 und/oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 37 bis 40.

43. Zelle nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine eukaryontische Zelle, bevorzugterweise eine Säugetierzelle und bevorzugtesterweise eine humane Zelle ist.

44. Medikament umfassend eine regulatorische Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 32 bis 36, einen Vektor nach Anspruch 37 bis 41 oder eine Zelle nach einem der Ansprüche 42 oder 43.

45. Medikament nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament im Rah­ men einer Gentherapie verwendet wird.

46. Medikament nach Anspruch 44 oder 45, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament ein solches ist zur Behandlung und/oder Prävention kardiovaskulärer Erkrankungen, insbe­ sondere kardiovaskuläre Erkrankungen, bei denen eine Punktmutation in einem Gen zu einem Krankheitsbild führt.

47. Medikament nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß die Punktmutation in Genen liegen, die für Proteine des Sarkomers, des Dystrophins und kardialen Aktins codieren.

48. Medikament nach Anspruch 46 oder 47, dadurch gekennzeichnet, daß die kardiovaskuläre Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, die hypertrophe Kardiomyopathie, long QT- Syndrom und dilatative Kardiomyopathie umfaßt.