DE4041464A1

DE4041464A1 - 5-ht(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)-rezeptor

Info

Publication number: DE4041464A1
Application number: DE19904041464
Authority: DE
Inventors: Alfred Dr Bach; Liliane Dr Unger; Siegfried Dr Bialojan; Peter Prof Dr Seeburg
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1990-12-22
Filing date: 1990-12-22
Publication date: 1992-06-25
Also published as: WO1992011362A1; JPH06504669A; CA2098706A1; EP0563089A1

Description

Die Erfindung betrifft einen Serotoninrezeptor der Klasse 1 (5-HT₁-Rezeptor) DNAs, die diesen Rezeptor kodieren, sowie die Verwendung dieses Rezeptors bzw. der DNAs zum Screenen von Substanzen auf deren Fähigkeit, den Dopamin-D2-Rezeptor zu beeinflussen.

Serotoninrezeptoren (=5-HT-Rezeptoren) spielen bei neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen - wie Depression, Migräne und Schizophrenie - eine bedeutende Rolle, da sie den Zielort für Wirkstoffe gegen diese Krankheiten darstellen. Da bislang nur ein Teil der 5-HT-Rezeptoren in nur annähernd reiner Form vorliegt, war eine zielortgerichtete Suche nach Wirkstoffen gegen diese Krankheiten nicht möglich. Dies gilt insbesondere für Migräne.

Es wurde nun ein Polypeptid gefunden und in reiner Form erhalten, welches einen Rezeptor darstellt, der eine hochaffine Bindungsstelle für Serotonin (5-HT) besitzt.

Gegenstand der Erfindung sind ein gegebenenfalls glykosyliertes Polypeptid mit der in Formel I angegebenen Aminosäuresequenz sowie dessen durch Deletion, Substitution, Insertion, Inversion, Addition oder Austausch von Aminosäuren erhältliche Polypeptide mit unveränderter Aktivität.

Gegenstand der Erfindung sind weiter DNAs, die für die oben genannten Polypeptide kodieren, Wirtsorganismen, die diese DNAs enthalten, sowie die Verwendung dieser Polypeptide und DNAs zum Auffinden von Substanzen, die diesen 5-HT₁-Rezeptoren beeinflussen.

Die neuen Polypeptide und DNAs lassen sich gentechnisch nach bekannten Methoden herstellen. So kann man aus Rattenhirn mRNA isolieren und in doppelsträngige cDNA übersetzen. Diese cDNA kann als Matrize für die Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden. Durch die Verwendung spezifischer Primer kann so unter geeigneten Reaktionsbedingungen die entsprechende cDNA amplifiziert werden. Durch die Verwendung geeigneter Primer kann die amplifizierte cDNA ohne vorherige Klonierung ansequenziert werden. Die dabei verwendeten Methoden sind beispielsweise in "Current Protocols in Molecular Biology" (Hrsg. F. M. Polymerase-Kettenreaktion in Saiki et al. (1985) Science 230, 1350-54 bzw. Mullis and Faloona (1987) Meth. Enzymol. 155, 335-350 nachzulesen.

Die so charakterisierte cDNA ist mit Hilfe von Restriktionsenzymen leicht zugänglich. Die dabei entstehenden Fragmente, ggf. in Verbindung mit chemisch synthetisierten Oligonukleotiden, Adaptoren oder Genfragmenten, können benutzt werden, um die für das Protein kodierende Sequenzen zu klonieren. Der Einbau der Genfragmente bzw. synthetischen DNA-Sequenzen in Klonierungsvektoren, z. B. die handelsüblichen Plasmide M13mp18 oder Bluescript, erfolgt in bekannter Weise. Auch können die Gene oder Genfragmente mit geeigneten chemisch synthetisierten oder aus Bakterien, Phagen, Eukaryontenzellen oder deren Viren isolierten Kontrollregionen versehen werden, die die Expression der Proteine ermöglichen.

Die Transformation bzw. Transfektion geeigneter Wirtsorganismen mit den so erhaltenen Hybridplasmiden ist ebenfalls bekannt und eingehend beschrieben (M. Wigler et al., Cell 16 (1979), 77 bis 785; F. L. Graham and A. J. van der Eb, Virology 52 (1973), 456 bis 467).

Bei der Expression in Säurezellen kann man Vektoren verwenden, die das zu exprimierende Gen, in diesem Fall die für den hier beschriebenen 5-HT₁-Rezeptor kodierende cDNA unter die Kontrolle des Maus-Metallothionein- oder des viralen SV40-Promotors oder unter die Kontrolle des Cytomegalievirus-Promotors setzen (J. Page Martin, Gene, 37 (1985), 139 bis 144). Notwendig für die Expression ist das Vorliegen des Methionin-Startcodons des Gens, das für diesen 5-HT₁-Rezeptor kodiert. Man isoliert dann Klone, die Kopien dieser Vektoren als Episome oder ins Genom integriert besitzen. Besonders vorteilhaft ist die Integration des Fremdgens in einen Vektor, der den Promotor des Cytomegalievirus enthält.

Alternativ dazu kann man Zellen mit einem geeigneten Vektor derart transfizieren, daß die transiente Expression der so eingebrachten DNA für eine pharmakologische Charakterisierung der exprimierten heterologen Polypeptide ausreicht. Auch hier ist die Kontrolle der Expression durch den Promotor des Cytomegalievirus besonders vorteilhaft.

In Verbindung mit prokaryontischen Sequenzen, die für die Replikation in Bakterienzellen und eine Antibiotika-Resistenz kodieren, ist der Aufbau von "shuttle"-Vektoren möglich. Konstruktionen und Vermehrung des Plasmids erfolgen zunächst in Bakterienzellen; anschließend erfolgt die Umsetzung in die Eukaryontenzellen, z. B. in die embryonale menschliche Nieren-Zellinie HEK 293.

Auch andere Zellsysteme, z. B. Hefe und andere Pilze, Insektenzellen sowie tierische und humane Zellen wie z. B. CHO-, COS- und L-Zellen, können in Verbindung mit geeigneten Expressionsvektoren zur Expression der klonierten cDNA verwendet werden.

Diese eukaryontischen Expressionssysteme besitzen den Vorteil, daß sie in der Lage sind, ihre Produkte effektiv und meist in nativer Form zu exprimieren. Ferner besitzen sie die Fähigkeit, ihre Produkte posttranslational zu modifizieren.

Die exprimierten Rezeptorproteine können durch geeignete Detergenzien solubilisiert werden und durch geeignete Affinitätschromatographie nach bekannten Verfahren gereinigt werden. Das reine Polypeptid kann, nach Kristallisation und Röntgen-Strukturanalyse oder anderen geeigneten physikalischen Verfahren, dazu benutzt werden, die räumliche Struktur der Liganden-Bindungsstelle aufzuklären.

Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ist es aber auch möglich andere DNA-Sequenzen, z. B. chemisch synthetisierte Gene mit unterschiedlicher DNA-Sequenz für die Expression des beschriebenen 5-HT₁-Rezeptors zu benutzen.

Mit Hilfe der Erfindung wird es möglich, Substanzen zu identifizieren und zu charakterisieren, die an den hier beschriebenen Rezeptor binden und dort agonistisch oder antagonistisch wirken. Eine Möglichkeit, diese Wirkung zu untersuchen und zu quantifizieren, stellt die Messung des Stromflusses durch die Zellmembran dar oder die Detektion der Ca⁺⁺-Freisetzung aus internen Speichern.

Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Beispielen näher beschrieben.

Für gentechnische Methoden sei dazu z. B. auf das Handbuch von Maniatis et al. "Molecular Clonin", Cold Spring Harborr Laboratory, 1982, oder "DNA clonin", Vol. I bis III, IRI Press 1985 bis 1987, Herausgeber D. M. Glover, hingewiesen.

Beispiel 1 Isolierung einer cDNA, die für einen 5-HT₁-Rezeptor kodiert

0,5 g Großhirn einer Ratte wurden in 6 M Guanidiniumthiocyanat, 5 mM Natriumcitrat (pH 7,0), 0,1 M 2-Mercaptoethanol, 0,5% Sarcosyl im ULTRA-TURRAX® aufgeschlossen. Grobe Zelltrümmer wurden bei 3000 rpm abzentrifugiert. Die RNA wurde durch Zentrifugation durch ein 5,7-M-CsCl-Kissen über Nacht bei 45 000 rpm abgetrennt. Anschließend wurde die PolyA⁺-enthaltende RNA-Fraktion durch Affinitätschromatographie an oligo (dT)-Cellulose abgetrennt.

Mit Hilfe des Enzyms Reverse Transcriptase (AMV) und oligo (dT)_12-18 als Starter wurden 5 µg dieser polyA⁺-RNA in einzelsträngige cDNA umgeschrieben. Die Synthese des zweiten Stranges erfolgte mit E. coli DNA-Polymerase. 5 ng dieser cDNA wurde als Matrize in einer Polymerasekettenreaktion eingesetzt. Dazu wurde das DNA Amplifikations-Kit GeneAmp^TM (Bestell-Nr. 182 414) von Perkin Elmer verwendet. Es wurde entsprechend den Herstellerangaben verfahren. Die Primersequenz wurde abgeleitet von der publizierten cDNA-Sequenz eines funktionell nicht weiter charakterisierten Rezeptorklons aus der Hundeschilddrüse (Libert et al. (1989) Science 244, S. 69-72). Die Primer hatten folgende Sequenzen:

Die Annealingtemperatur lag bei 60°C und wurde 3 min beibehalten. Danach wurden die Primer bei 72°C für 2 min verlängert. Denaturiert wurde bei 94°C für 1 min. Dieser Temperaturzyklus wurde 40mal wiederholt. In einer Polymerase-Kettenreaktion wurden jeweils 20 pmol Primer A und B eingesetzt. 10% dieses Ansatzes wurden nach Ablauf der Reaktion auf ein 1% Agarosegel aufgetragen, um die Reaktionsprodukte zu analysieren. Die dominante Bande komigrierte mit einer DNA-Bande von ca. 1200 Basenpaaren. Sie wurde elektrophoretisch aus dem Gel eluiert in One-Phor-all Puffer (Pharmacia) aufgenommen und mit dem Klenow-Fragment der E. coli DNA Polymerase I inkubiert. Die Konzentration an Desoxynukleotidtriphosphaten betrug dabei 50 µM (jeweils für dATP, dTTP, dCTP, dGTP).

Beispiel 2 Herstellung von einzelsträngiger DNA, die für einen Ratten 5-HT₁-Rezeptor kodiert

Ausgangspunkt war das in Beispiel 1 beschriebene DNA-Fragment aus der Polymerase-Kettenreaktion. 30 ng dieses Fragments wurden bei 12°C für 12 h mit 100 ng des mit Sma I geschnittenen, kommerziell erhältlichen Klonierungsvektors M13mp18 oder M13mp19 ligiert. Das Volumen des Ligationsansatzes betrug 10 µl. Die Ligation wurde durch 5 min Erhitzen auf 80°C beendet. 1/10 Volumen dieses Ligationsansatzes wurde zur Transformation von 100 µl kompetenten JM 101 Zellen eingesetzt. Nach Beendigung der Transformation wurden dem Transformationsansatz 60 µl 0,2 M IPTG-Lösung und 120 µl XGal (20 mg/ml) zugesetzt. Dieser Ansatz wurde in NZYDT-Topagar auf NZYDT-Agarplatten mit 200 µl JM 101 Zellen (OD₆₀₀=1) ausplattiert. Das Medium NZYDT ist kommerziell erhältlich (GIBCO-BRL). Klone, die das oben genannte DNA-Fragment enthielten, konnten aufgrund fehlender Blaufärbung der Plaques identifiziert werden. Sie wurden als mp RBR-1 bezeichnet. Mittels DNA-Sequenzanalyse (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1977, 5463) wurde die DNA-Sequenz der den D2-Rezeptor kodierenden cDNA aufgeklärt. Diese DNA-Sequenz ist im Sequenzprotokoll der Sequenz Nr. 2 wiedergegeben.

Beispiel 3 Transiente Expression des klonierten Rezeptorgens in 293 Zellen

Wenn nicht besonders beschrieben, sind die Methoden zur Zellkultur in "Zell- und Gewebekultur" von Lindl und Bauer (Gustav Fischer Verlag) nachzulesen.

Doppelsträngige mp 18 RBR-1 DNA wurde mit den Enzymen EcoRI und HindIII restringiert. Das daraus resultierende mp 18 RBR-1 Fragment mit überhängenden Enden wurden mit Hilfe der Enzyme T₄-DNA-Polymerase und Klenow-Fragment der E-coli DNA Polymerase nach Standardbedingungen (vgl. Current Protocols in Molecular Biology s. o.) behandelt, um glatte Enden zu generieren. Danach wurden an dieses Fragment die kommerziell erhältlichen Linker (Invitrogen) mit der Sequenz 5′ CTTA GAG CACA 3′ 3′GAATCTC5′ ligiert. Das mit diesen Linkern versehene DNA-Fragment wurde unter Standardbedingungen in den kommerziell erhältlichen BstXI geschnittenen Vektor pCMD8 (Invitrogen) ligiert. Das daraus resultierende rekombinante Plasmid wurde unter Standardbedingungen vermehrt.

HEK293 Zellen wurden unter Standard-Bedingungen in einer 10-cm-Zellkulturschale bis zu einer Zellzahl von 7 bis 8×10⁶ Zellen kultiviert. Nach Trypsinierung wurden die Zellen 1 : 3 in MEM Medium (Gibco 041 bis 1090 M), das 2,2 g/l NaHCO₃ enthielt, verdünnt und erneut in 10 cm Petrischalen ausgesät. Danach wurden die Zellen für 40 bis 48 h bei 37°C kultiviert.

Die zu transfizierende DNA wurde wie folgt vorbereitet: 20 µg der DNA-Lösung (1 mg/ml), gereinigt über CsCl-Grandient, wurden mit 437 µl H₂O versetzt, danach wurden 62,5 µl 2 M CaCl₂ zugesetzt und schließlich 500 µl BBS. Diese Reihenfolge ist streng zu beachten. Innerhalb von 10 min bildeten sich bei Raumtemperatur Ca⁺⁺-Präzipitate.

Die Lösung wurde auf eine 10-cm-Zellkulturschale mit den nach obiger Vorschrift kultivierten 293 Zellen gegeben. Nach vorsichtiger Durchmischung wurden die Zellen 15 bis 20 h in einem 3% CO₂-Inkubator bei 37°C kultiviert. Danach wurden vorsichtig 5 ml serumfreies Medium zugesetzt. Nach Entfernung des gesamten Mediums und Wiederholung des Waschvorgangs mit 5 ml seriumfreiem Medium wurden den Zellen 10 ml Vollmedium zugesetzt. Nach 48 h Inkubation in einem 5% CO₂-Inkubator konnten die Zellen für pharmakologische und elektrophysiologische Untersuchungen verwendet werden.

Beispiel 4 Rezeptor-Bindungstest

Den nach Beispiel 4 transfizierten und kultivierten Zellen wurden 2,5 ml kaltes PBS zugesetzt. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden weitere 5 ml PBS zugegeben und die Zellen vorsichtig von der Oberfläche der Kulturschale entfernt. Die Zellsuspension wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt und bei ca. 1200 g 10 min lang zentrifugiert. Nach sorgfältiger Entfernung des Überstandes wurden die Zellen zur Membranpräparation verwendet.

Nach Resuspendierung des Zellpellets in 1,5 ml 10 mM Tris-HCl pH 7,2 wurden die Zellen mit Hilfe eines ULTRA-TURRAX® homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 50 000 g in einem Sorvall SS 34 Rotor bei 4°C 20 min zentrifugiert. Das Membranpellet wurde in 1,5 ml 10 mM Tris-HCl pH 7,2 aufgenommen und erneut mit Hilfe eines ULTRA-TURRAX® homogenisiert. Nach Zentrifugation wie oben wurde das Pellet in 3,5 ml BB (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 100 mM NaCl) aufgenommen. Nach kurzer Homogenisierung mit einem Gewebe-Homogenisator konnten die Membranen in dem eigentlichen Bindungstest eingesetzt werden.

800 µl dieser so hergestellten Membranen wurden bei 4°C mit [³H] Serotonin (Endkonzentration 2 nM) und verschiedenen Konzentrationen der zu testenden Substanz für 2 h inkubiert. Danach wurden die Membranen über Glasfaserfilter (Schleicher & Schuell No. 34) filtriert, um das nicht-gebundene radioaktive markierte Serotonin abzutrennen. Die Menge an gebundenen Spiperon wurde im Flüssigkeits-Szintillationszähler bestimmt.

Folgende Substanzen wurden als Testsubstanzen eingesetzt:

5-HT (=Serotonin)
5-CT (=5-Carboxyamidotryptamin)
Ketanserin
Mianserin
Rauwolscin
Propranolol

Dabei wurden folgende K_i-Werte bestimmt:

5-HT
3,6
5-CT	0,65
Ketanserin	6,5 (zwei unterschiedliche)
Mianserin	42,5
Rauwolscin	135
Propranolol	3200

Claims

1. Ein gegebenenfalls glykosyliertes Polypeptid mit der im Sequenzprotokoll Sequenz Nr. 1 angegebenen Aminosäuresequenz sowie dessen durch Deletion, Substitution, Insertion, Inversion, Addition oder Austausch von Aminosäuren erhältliche Polypeptide mit vergleichbaren Bindungseigenschaften.

2. DNA-Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 kodieren.

3. Rekombinantes DNA-Molekül, welches eine DNA-Sequenz nach Anspruch 2 enthält.

4. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3, das eine DNA-Sequenz nach Anspruch 2 enthält, welche funktionell mit einer Expressions-Kontrollsequenz verbunden ist, die die Expression in geeigneten Wirtssystemen ermöglicht.

5. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressions-Kontrollsequenz ein in E. coli wirksames Promotersystem, ein Promotersystem eines E. coli Bakteriophagen, eine Hefe Expressions-Kontrollsequenz oder eine andere eukaryontische Expressions-Kontrollsequenz ist.

6. Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 3, 4 oder 5 enthält.

7. Wirtsorganismus nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Bakterium, ein Pilz, eine tierische oder eine menschliche Zelle ist.

8. Gentechnisches Verfahren zur Herstellung des Polypeptides gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem geeigneten Wirtsorganismus DNA-Sequenzen zur Expression bringt, die für die Peptidsequenz nach Anspruch 1 kodiert.

9. Verwendung des nach Beispiel 8 hergestellten Polypeptids oder eines Wirtsorganismus nach Anspruch 7 zum Screening von Substanzen auf deren Fähigkeit, sich an das Polypeptid gemäß Anspruch 1 zu binden.

10. Verwendung des nach Beispiel 8 hergestellten Polypeptides zur Aufklärung der räumlichen Struktur des Polypeptids gemäß Anspruch 1 zum Zwecke des Designs von Arzneimitteln.