EP0563089A1 - Serotonin rezeptor der klasse 1: der 5-ht 1x?-rezeptor - Google Patents

Serotonin rezeptor der klasse 1: der 5-ht 1x?-rezeptor

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Publication number
EP0563089A1
EP0563089A1 EP19920900491 EP92900491A EP0563089A1 EP 0563089 A1 EP0563089 A1 EP 0563089A1 EP 19920900491 EP19920900491 EP 19920900491 EP 92900491 A EP92900491 A EP 92900491A EP 0563089 A1 EP0563089 A1 EP 0563089A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sequence
polypeptide
leu
ile
ala
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP19920900491
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Alfred Bach
Liliane Unger
Siegfried Bialojan
Peter Seeburg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP0563089A1 publication Critical patent/EP0563089A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Class 1 serotonin receptor the S-HT ⁇ receptor
  • the invention relates to a serotonin receptor of class 1 • (5-HT ⁇ lich receptor) DNAs that encode this receptor, and the
  • a polypeptide has now been found and obtained in pure form, which is a receptor which has a high affinity binding site for serotonin (5-HT).
  • the invention relates to an optionally glycosylated polypeptide having the amino acid sequence given in formula I and its polypeptides obtainable by deletion, substitution, insertion, inversion, addition or exchange of amino acids with unchanged activity.
  • the invention further relates to DNAs which code for the above-mentioned polypeptides, host organisms which contain these DNAs, and the use of these polypeptides and DNAs to find substances which influence this 5-HT ⁇ receptor. 35
  • the new polypeptides and DNAs can be produced genetically using known methods. In this way, mRNA can be isolated from rat brain and translated into double-stranded cDNA. This cDNA can be used as a template for the polymerase chain reaction, 40 By using specific primers it can be used under suitable conditions
  • the corresponding cDNA are pl a.
  • the amplified cDNA can be sequenced without prior cloning.
  • the methods used are, for example, in "Current Protocols in Molecular Biology” (ed. FM Ausubel et al.) 1989, ISBN 0-471 50338-x (Vol. 1 and 2 set), for the polymerase chain reaction in Saiki et al. (1985) Science 230, 1350-54 and Mullis and Faloona (1987) Meth. Enzymol. 155, 335-350.
  • the cDNA characterized in this way is easily accessible with the aid of restriction enzymes.
  • the resulting fragments possibly in conjunction with chemically synthesized oligonucleotides, adapters or gene fragments, can be used to clone the sequences coding for the protein.
  • the incorporation of the gene fragments or synthetic DNA sequences into cloning vectors e.g. The commercially available plasmids Ml3mpl8 or BlueScript are carried out in a known manner.
  • the genes or gene fragments can also be provided with suitable chemically synthesized control regions or regions isolated from bacteria, phages, eukaryotic cells or their viruses, which enable expression of the proteins.
  • vectors for expression in mammalian cells, vectors can be used which control the gene to be expressed, in this case the cDNA coding for the 5-HT ⁇ receptor described here, under the control of the mouse metallothionone or the SV40 promoter or under the control of the Set cytomegaliev rus promoters (J. Page Martin, Gene, 37 (1985), 139 to 144).
  • the expression of the methionine start codon of the gene which codes for this 5-HT ⁇ receptor is necessary for the expression.
  • Clones are then isolated which have copies of these vectors as episomes or integrated into the genome.
  • the integration of the foreign gene into a vector which contains the promoter of the cytomegalovirus is particularly advantageous.
  • cells can be transfected with a suitable vector such that the transient expression of the DNA thus introduced is sufficient for pharmacological characterization of the heterologous polypeptides expressed.
  • control of expression by the cytomegalovirus promoter is particularly advantageous.
  • the plasmid is first constructed and propagated in bacterial cells; the conversion into the eukaryotic cells then takes place, e.g. into the embryonic human kidney cell line HEK 293.
  • Yeast and other fungi e.g. Yeast and other fungi, insect cells and animal and human cells
  • suitable expression vectors e.g. CH0, COS and L cells
  • the expressed receptor proteins can be solubilized by suitable detergents and purified by suitable affinity chromatography according to known methods. After crystallization and X-ray structure analysis or other suitable physical processes, the pure polypeptide can be used to clarify the spatial structure of the ligand binding site.
  • the annealing temperature was 60 ° C and was maintained for 3 minutes.
  • the primers were then extended at 72 ° C. for 2 minutes.
  • the starting point was the DNA fragment from the polymerase chain reaction described in Example 1. 30 ng of this fragment were ligated at 12 ° C. for 12 h with 100 ng of the commercially available cloning vector Ml3mpl8 or Ml3mpl9 cut with S a I. The volume of the ligation mixture was 10 ⁇ l. The ligation was terminated by heating to 80 ° C for 5 min. 1/10 volume of this ligation mixture was used to transform 100 ⁇ l competent JM 101 cells. After the transformation had ended, 60 ⁇ l of 0.2 M IPTG solution and 120 ⁇ l of XGal (20 mg / l) were added to the transformation mixture.
  • Double-stranded mp 18 RBR-1 DNA was restricted with the enzymes EcoRI and Hindlll.
  • the resulting mp 18 RBR-1 fragment with overhanging ends was treated with the enzymes T 4 -DNA polymerase and Klenow fragment of the E-coli DNA polymerase according to standard conditions (see Current Protocols in Molecular Biology see above) to smooth ends to generate.
  • the commercially available linkers (Invitrogen) with the sequence 5 'CTTA GAG CACA 3'3'GAATCTC5'were then ligated to this fragment.
  • the DNA fragment provided with these linkers was ligated under standard conditions into the commercially available BstXI cut vector pCDM ⁇ (Invitrogen).
  • the resulting recombinant plasmid pCDN8-5HT j ⁇ was propagated under standard conditions.
  • HEK293 cells were cultivated under standard conditions in a 10 cm cell culture cell up to a cell number of 7 to 8 ⁇ 106 cells. After trypsinization, the cells were diluted 1: 3 in MEM medium (Gibco 041 to 1090 M), which contained 2.2 g / 1 NaHC0 3 , and sown again in 10 cm petri dishes. The cells were then cultured at 37 ° C. for 40 to 48 h.
  • the DNA to be transfected, pCDM8-5-HTj ⁇ was prepared as follows: 20 ⁇ g of the DNA solution (1 mg / ml), purified using a CsCl-Grandient, were mixed with 437 ⁇ l H2O, after which 62.5 ⁇ l 2 M CaCl2 added and finally 500 ul BBS. This order must be strictly observed. Ca ++ precipitates formed within 10 min at room temperature.
  • the solution was placed on a 10 cm cell culture dish containing the 293 cells cultured as described above. After thorough mixing, the cells were cultivated for 15 to 20 h in a 3% CO 2 incubator at 37 ° C. After that, were careful 5 ml of serum-free medium was added. After removing all of the medium and repeating the washing process with 5 ml of series-free medium, 10 ml of complete medium were added to the cells. After 48 h of incubation in a 5% CO 2 incubator, the cells could be used for pharmacological and electrophysiological studies.
  • Cell suspension was transferred to a centrifuge tube and centrifuged at approximately 1200 g for 10 minutes. After careful removal of the supernatant, the cells were used for membrane preparation.
  • the cells were homogenized using an ULTRA-TURRAX®.
  • the homogenate was centrifuged at 50,000 g in a Sorvall SS 34 rotor at 4 ° C for 20 min.
  • the membrane pellet was taken up in 1.5 ml of 10 M Tris-HCl pH 7.2 and homogenized again using an ULTRA-TURRAX®. After centrifugation as above, the pellet was taken up in 3.5 ml BB (10 mM Tris-HCl pH 7.2, 100 mM NaCl). After a brief homogenization with a tissue homogenizer, the membranes could be used in the actual binding test.
  • 5-HT serotonin
  • 5-CT 5-carboxyamidotryptamine
  • Ketanserin 6.5 (two different) Mianserin 42.5
  • Sequence no. 2 nucleotide sequence of 1183 nucleotides, corresponding to the amino acid sequence, stored in sequence no. 1
  • Type of molecule cDNA to mRNA
  • the protein coding region described in Sequence No. 1 begins with base 3 and ends with base 1124

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Description

Serotonln Rezeptor der Klasse 1 : der S-HT^-Rezeptor
Beschreibung
*
5 Die Erfindung betrifft einen Serotoninrezeptor der Klasse 1 • (5-HTιχ-Rezeptor) DNAs, die diesen Rezeptor kodieren, sowie die
Verwendung dieses Rezeptors bzw. der DNAs zum Screenen von Substanzen auf deren Fähigkeit, den 5-HTiχ-Rezeptor zu beeinflussen.
10
Serotoninrezeptoren (= 5-HT-Rezeptoren) spielen bei neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen - wie Depression, Migräne und Schizophrenie - eine bedeutende Rolle, da sie den Zielort für Wirkstoffe gegen diese Krankheiten darstellen. Da
15 bislang nur ein Teil der 5-HT-Rezeptoren in nur annähernd reiner Form vorliegt, war eine zielortgerichtete Suche nach Wirkstoffen gegen diese Krankheiten nicht möglich. Dies gilt insbesondere für Migräne.
20 Es wurde nun ein Polypeptid gefunden und in reiner Form erhalten, welches einen Rezeptor darstellt, der eine hochaffine Bindungs¬ stelle für Serotonin (5-HT) besitzt.
Gegenstand der Erfindung sind ein gegebenenfalls glykosyliertes 25 Polypeptid mit der in Formel I angegebenen Aminosäuresequenz sowie dessen durch Deletion, Substitution, Insertion, Inversion, Addition oder Austausch von Aminosäuren erhältliche Polypeptide mit unveränderter Aktivität.
30 Gegenstand der Erfindung sind weiter DNAs, die für die oben genannten Polypeptide kodieren, Wirtsorganismen, die diese DNAs enthalten, sowie die Verwendung dieser Polypeptide und DNAs zum Auffinden von Substanzen, die diesen 5-HTιχ-Rezeptor beeinflussen. 35
Die neuen Polypeptide und DNAs lassen sich gentechnisch nach bekannten Methoden herstellen. So kann man aus Rattenhirn mRNA isolieren und in doppelsträngige cDNA übersetzen. Diese cDNA kann als Matrize für die Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden, 40 Durch die Verwendung spezifischer Primer kann so unter geeigneten
Reaktionsbedingungen die entsprechende cDNA a plifiziert werden. Durch die Verwendung geeigneter Primer kann die amplifizierte cDNA ohne vorherige Klonierung ansequenziert werden. Die dabei verwendeten Methoden sind beispielsweise in "Current Protocols in Molecular Biology" (Hrsg. F.M. Ausubel et al.) 1989, ISBN 0-471 50338-x (Vol. 1 u. 2 set), für die Polymerase-Ketten- reaktion in Saiki et al. (1985) Science 230, 1350-54 bzw. Mullis and Faloona (1987) Meth. Enzymol. 155, 335-350 nachzulesen.
Die so charakterisierte cDNA ist mit Hilfe von Restriktions- enzymen leicht zugänglich. Die dabei entstehenden Fragmente, ggf. in Verbindung mit chemisch synthetisierten Oligonukleotiden, Adaptoren oder Genfragmenten, können benutzt werden, um die für das Protein kodierende Sequenzen zu klonieren. Der Einbau der Genfragmente bzw. synthetischen DNA-Sequenzen in Klonierungs- Vektoren, z.B. die handelsüblichen Plasmide Ml3mpl8 oder Blue- script, erfolgt in bekannter Weise. Auch können die Gene oder Genfragmente mit geeigneten chemisch synthetisierten oder aus Bakterien, Phagen, Eukaryontenzellen oder deren Viren isolierten Kontrollregionen versehen werden, die die Expression der Proteine ermöglichen.
Die Transformation bzw. Transfektion geeigneter Wirtsorganismen mit den so erhaltenen Hybridplasmiden ist ebenfalls bekannt und eingehend beschrieben (M. Wigler et al., Cell 16 (1979), 777 bis 785; F. L. Graham and A. J. van der Eb, Virology 52 (1973), 456 bis 467).
Bei der Expression in Säugerzellen kann man Vektoren verwenden, die das zu exprimierende Gen, in diesem Fall die für den hier beschriebenen 5-HTιχ-Rezeptor kodierende cDNA unter die Kontrolle des Maus-Metallothϊonein- oder des vϊralen SV40-Promotors oder unter die Kontrolle des Cytomegaliev rus-Promotors setzen (J. Page Martin, Gene, 37 (1985), 139 bis 144). Notwendig für die Expression ist das Vorliegen des Methionin-Startcodons des Gens, das für diesen 5-HTιχ-Rezeptor kodiert. Man isoliert dann Klone, die Kopien dieser Vektoren als Episome oder ins Genom integriert besitzen. Besonders vorteilhaft ist die Integration des Fremdgens in einen Vektor, der den Promoter des Cytomegalievirus enthält. Alternativ dazu kann man Zellen mit einem geeigneten Vektor derart transfizieren, daß die transiente Expression der so eingebrachten DNA für eine pharmakologische Charakterisierung der expri ierten heterologen Polypeptide ausreicht. Auch hier ist die Kontrolle der Expression durch den Promoter des Cytomegalievirus besonders vorteilhaft.
In Verbindung mit prokaryontischen Sequenzen, die für die Replikation in Bakterienzellen und eine Antibiotika-Resistenz kodieren, ist der Aufbau von "shuttle"-Vektoren möglich.
Konstruktionen und Vermehrung des Plasmids erfolgen zunächst in Bakterienzellen; anschließend erfolgt die Umsetzung in die Eukaryontenzellen, z.B. in die embryonale menschlichen Nieren- Zellinie HEK 293.
Auch andere Zellsysteme, z.B. Hefe und andere Pilze, Insekten¬ zellen sowie tierische und humane Zellen wie z.B. CH0-, COS und L-Zellen, können in Verbindung mit geeigneten Expressionsvektoren zur Expression der klonierten cDNA verwendet werden.
Diese eukaryontischen Expressionssysteme besitzen den Vorteil, daß sie in der Lage sind, ihre Produkte effektiv und meist in nativer Form zu exprimieren. Ferner besitzen sie die Fähigkeit, ihre Produkte posttranslational zu modifizieren.
Die exprimierten Rezeptorproteine können durch geeignete Detergenzien solubilisiert werden und durch geeignete Affinitäts¬ chromatographie nach bekannten Verfahren gereinigt werden. Das reine Polypeptid kann, nach Kristallisation und Röntgen-Struktur- analyse oder anderen geeigneten physikalischen Verfahren, dazu benutzt werden, die räumliche Struktur der Liganden-Bindungs¬ stelle aufzuklären.
Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ist es aber auch möglich, andere DNA-Sequenzen, z.B. chemisch synthetisierte Gene mit unterschiedlicher DNA-Sequenz für die Expression des be¬ schriebenen 5-HTιχ-Rezeptors zu benutzen.
Mit Hilfe der Erfindung wird es möglich, Substanzen zu identifizieren und zu charakterisieren, die an den hier beschriebenen Rezeptor binden und dort agonistisch oder antagonistisch wirken. Eine Möglichkeit, diese Wirkung zu unter¬ suchen und zu quantifizieren, stellt die Messung des Stromflusses durch die Zellmembran dar oder die Detektion der Ca++-Freisetzung aus internen Speichern.
Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Beispielen näher beschrieben.
Für gentechπische Methoden sei dazu z.B. auf das Handbuch von Maniatis et al. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor
Laboratory, 1982, oder "DNA cloning", Vol I bis III, IRI Press 1985 bis 1987, Herausgeber D.M. Glover, hingewiesen.
Beispiel 1
Isolierung einer cDNA, die für den 5-HTjχ-Rezeptor kodiert
0,5 g Großhirn einer Ratte wurden in 6 M Guanidiniumthiocyanat, 5 mM Natriumeitrat (pH 7,0), 0,1 M 2-Mercaptoethanol, 0,5 % Sarcosyl im U TRA-TURRAX® aufgeschlossen. Grobe Zelltrümmer wurden bei 3.000 rpm abzentrifugiert. Die RNA wurde durch Zentrifugation durch ein 5,7-M-CsCl-Kissen über Nacht bei 45.000 rpm abgetrennt. Anschließend wurde die PolyA+-enthaltende RNA-Fraktion durch Affinitätschromatographie an oligo (dT)-Cellulose abgetrennt.
Mit Hilfe des Enzyms Reverse Transcriptase (AMV) und oligo (dT)12-18 a*s Starter wurden 5 μg dieser polyA+-RNA in einzel- strängige cDNA umgeschrieben. Die Synthese des zweiten Stranges erfolgte mit E.coli DNA-Polymerase. 5 ng dieser cDNA wurde als Matrize in einer Poly erasekettenreaktion eingesetzt. Dazu wurde das DNA Amplifikatioπs-Kit GeneAmp™ (Bestell-Nr. 182 414) von Perkin Eimer verwendet. Es wurde entsprechend den Hersteller¬ angaben verfahren. Die Primersequenz wurde abgeleitet von der publizierten cDNA-Sequenz eines funktionell nicht weiter charakterisierten Rezeptorklons aus der Hundeschilddrüse (Libert et al. (1989) Science 244, S. 69-72). Die Primer hatten folgende Sequenzen:
A: 5' ATG TCC CCG CCA AAC CAG TCA CTG GAA GGC CTT CTC CAG GAG GCC TCC AAC 3' B: 5' ACT AGG AGG CTT TCC GGA CAT GGA CAA CCC TCT GAA ACG CTT GCC GAA ACT
Die Annealingtemperatur lag bei 60°C und wurde 3 min beibehalten. Danach wurden die Primer bei 72°C für 2 min verlängert.
Denaturiert wurde bei 94°C für 1 min..Dieser Temperaturzyklus wurde 40mal wiederholt. In einer Polymerase-Kettenreaktion wurden jeweils 20 pmol Primer A und B eingesetzt. 10 % dieses Ansatzes wurden nach Ablauf der Reaktion auf ein 1 % Agarosegel aufge- tragen, um die Reaktionsprodukte zu analysieren. Die dominante Bande komigrierte mit einer DNA-Bande von ca. 1200 Basenpaaren. Sie wurde elektrophoretisch aus dem Gel eluiert in One-Phor-all Puffer (Pharmacia) aufgenommen und mit dem Klenow-Frag ent der E.coli DNA Polymerase I inkubiert. Die Konzentration an Desoxynukleotidtriphosphaten betrug dabei 50 μM (jeweils für dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
Beispiel 2
Herstellung von einzelsträngiger DNA, die für einen Ratten 5-HTιχ-Rezeptor kodiert.
Ausgangspunkt war das in Beispiel 1 beschriebene DNA-Fragment aus der Polymerase-Kettenreaktion. 30 ng dieses Fragments wurden bei 12°C für 12 h mit 100 ng des mit S a I geschnittenen, kommerziell erhältlichen Klonierungsvektors Ml3mpl8 oder Ml3mpl9 ligiert. Das Volumen des Ligationsansatzes betrug 10 μl. Die Ligation wurde durch 5 min Erhitzen auf 80°C beendet. 1/10 Volumen dieses Ligationsansatzes wurde zur Transformation von 100 μl kompetenten JM 101 Zellen eingesetzt. Nach Beendigung der Transformation wurden dem Transformationsansatz 60 μl 0,2 M IPTG-Lösung und 120 μl XGal (20 mg/ l) zugesetzt. Dieser Ansatz wurde in NZYDT-Topagar auf NZYDT-Agarplatten mit 200 μl JM 101 Zellen (ODβoo = -) ausplattiert. Das Medium NZYDT ist kommerziell erhältlich (GIBCO-BRL). Klone, die das oben genannte DNA-Fragment enthielten, konnten aufgrund fehlender Blaufärbung der Plaques identifiziert werden. Sie wurden als mp RBR-1 bezeichnet. Mittels DNA-Sequenzanalyse (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 1977, 5463) wurde die DNA-Sequenz der den 5-HTiχ-Rezeptor kodierenden cDNA aufgeklärt. Diese DNA-Sequenz ist im Sequenz¬ protokoll der Sequenz Nr. 2 wiedergegeben. Beispiel 3
Transiente Expression des klonierten Rezeptorgens in HEK 293 Zellen
Wenn nicht besonders beschrieben sind .die Methoden zur Zellkultur in "Zeil- und Gewebekultur" von Lindl und Bauer (Gustav Fischer Verlag) nachzulesen.
Doppelsträngige mp 18 RBR-1 DNA wurde mit den Enzymen EcoRI und Hindlll restringiert. Das daraus resultierende mp 18 RBR-1 Fragment mit überhängenden Enden wurden mit Hilfe der Enzyme T4-DNA-Polymerase und Klenow-Fragment der E-coli DNA Polymerase nach Standardbedingungen (vgl. Current Protocols in Molecular Biology s.o.) behandelt, um glatte Enden zu generieren. Danach wurden an dieses Fragment die kommerziell erhältlichen Linker (Invitrogen) mit der Sequenz 5' CTTA GAG CACA 3' 3'GAATCTC5' ligϊert. Das mit diesen Linkern versehene DNA-Fragment wurde unter Standardbedingungen in den kommerziell erhältlichen BstXI geschnittenen Vektor pCDMδ (Invitrogen) ligiert. Das daraus resultierende rekombiπante Plasmid pCDN8-5HTjχ wurde unter Standardbedingungen vermehrt.
HEK293 Zellen wurden unter Standard-Bedingungen in einer 10-cm-Zellkulturscha e bis zu einer Zellzahl von 7 bis 8 x 106 Zellen kultiviert. Nach Trypsinierung wurden die Zellen 1:3 in MEM Medium (Gibco 041 bis 1090 M), das 2,2 g/1 NaHC03 enthielt, verdünnt und erneut in 10 cm Petrischalen ausgesät. Danach wurden die Zellen für 40 bis 48 h bei 37°C kultiviert.
Die zu transfizierende DNA, pCDM8-5-HTjχ wurde wie folgt vorbereitet: 20 μg der DNA-Lösung (1 mg/ml), gereinigt über CsCl-Grandient, wurden mit 437 μl H2O versetzt, danach wurden 62,5 μl 2 M CaCl2 zugesetzt und schließlich 500 μl BBS. Diese Reihenfolge ist streng zu beachten. Innerhalb von 10 min bildeten sich bei Raumtemperatur Ca++-Präzipitate.
Die Lösung wurde auf eine 10-cm-Zellkulturschale mit den nach obiger Vorschrift kultivierten 293 Zellen gegeben. Nach vor- sichtiger Durchmischung wurden die Zellen 15 bis 20 h in einem 3 % Cθ2~Inkubator bei 37°C kultiviert. Danach wurden vorsichtig 5 ml serumfreies Medium zugesetzt. Nach Entfernung des gesamten Mediums und Wiederholung des Waschvorgangs mit 5 ml seriumfreiem Medium wurden den Zellen 10 ml Vollmedium zugesetzt. Nach 48 h Inkubation in einem 5 % Cθ2~Inkubator konnten die Zellen für pharmakologische und elektrophysiologische Untersuchungen verwendet werden.
Beispiel 4
Rezeptor-Bindungstest
Den nach Beispiel 4 transfizierten und kultivierten Zellen wurden 2,5 ml kaltes PBS zugesetzt. Nach 5 min Inkubation bei Raum¬ temperatur wurden weitere 5 ml PBS zugegeben und die Zellen vorsichtig von der Oberfläche der Kulturschale entfernt. Die
Zellsuspension wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt und bei ca. 1.200 g 10 min lang zentrifugiert. Nach sorgfältiger Ent¬ fernung des Überstandes wurden die Zellen zur Membranpräparation verwendet.
Nach Resuspendierung des Zellpellets in 1,5 ml 10 mM Tris-HCl pH 7,2 wurden die Zellen mit Hilfe eines ULTRA-TURRAX® homogeni¬ siert. Das Homogenat wurde bei 50.000 g in einem Sorvall SS 34 Rotor bei 4°C 20 min zentrifugiert. Das Membranpellet wurde in 1,5 ml 10 M Tris-HCl pH 7,2 aufgenommen und erneut mit Hilfe eines ULTRA-TURRAX® homogenisiert. Nach Zentrifugation wie oben wurde das Pellet in 3,5 ml BB (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 100 mM NaCl) aufgenommen. Nach kurzer Homogenisierung mit einem Gewebe-Homogenisator konnten die Membranen in dem eigentlichen Bindungstest eingesetzt werden.
800 μl dieser so hergestellten Membranen wurden bei 4°C mit [3H] Serotonin (Endkonzentration 2 nM) und verschiedenen Konzen¬ trationen der zu testenden Substanz für 2 h inkubiert. Danach wurden die Membranen über Glasfaserfilter (Schleicher & Schuell No. 34) filtriert, um das nicht-gebundene radioaktive markierte Serotonin abzutrennen. Die Menge an gebundenen Spiperon wurde im Flüssigkeits-Szintillationszähler bestimmt. Folgende Substanzen wurden als Testsubstanzen eingesetzt:
5-HT (= Serotonin) 5-CT (= 5-Carboxyamidotryptamin) Ketanserin Mianserin Rauwolscin Propranolol
Dabei wurden folgende Kj-Werte bestimmt:
5-HT 3,6
5-CT 0,65
Ketanserin 6,5 (zwei unterschiedliche) Mianserin 42,5
Rauwolscin 135
Propranolol 3200
Sequenzprotokoll
Sequenz Nr. 1: Aminosäuresequenz aus 374 Aminosäuren
Met Ser Pro Pro Asn Gin Ser Leu Glu Gly Leu Leu Gin Glu Ala Ser
5 10 15
Asn Arg Ser Leu Asn Ala Thr Gly Ala Trp Asp Pro Glu Val Leu Gin 20 25 30
Ala Leu Arg Ile Ser Leu Val Val Val Leu Ser Ile Ile Thr Leu Ala 35 40 45
Thr Val Leu Ser Asn Ala Phe Val Leu Thr Thr Ile Leu Leu Thr Lys 50 55 60
Lys Leu His Thr Pro Ala Asn Tyr Leu Ile Gly Ser Leu Ala Thr Thr 65 70 75 80
Asp Leu Leu Val Ser Ile Leu Val Met Pro Ile Ser Ile Ala Tyr Thr 85 90 95
Thr Thr Arg Thr Trp Asn Phe Gly Gin Ile Leu Cys Asp Ile Trp Val 100 105 110
Ser Ser Asp Ile Thr Cys Cys Thr Ala Ser Ile Leu His Leu Cys Val 115 120 125
Ile Ala Leu Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Thr Asp Ala Leu Glu Tyr Ser 130 135 140
Lys Arg Arg Thr Ala Gly His Ala Ala Ala Met Ile Ala Ala Val Trp 145 150 155 160
Ala Ile Ser Ile Cys Ile Ser Ile Pro Pro Leu Phe Trp Arg Gin Ala 165 170 175
Thr Ala His Glu Glu Met Ser Asp Cys Leu Val Asn Thr Ser Gin Ile 180 185 190
Ser Tyr Thr Ile Tyr Ser Thr Cys Gly Ala Phe Tyr Ile Pro Ser Ile 195 200 205
Leu Leu Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Ile Tyr Val Ala Ala Arg Ser Arg 210 215 220
Ile Leu Asp Pro Pro Ser Leu Tyr Gly Lys Arg Phe Thr Thr Ala Gin 225 230 235 240
Leu Ile Thr Gly Ser Ala Gly Ser Ser Leu Cys Ser Leu Asn Pro Ser 245 250 255
Leu His Glu Ser His Thr His Thr Val Gly Ser Pro Leu Phe Phe Asn 260 265 270 Gin Val Lys Ile Lys Leu Ala Asp Ser Ile Leu Glu Arg Lys Arg Ile 275 280 285 Ser Ala Ala Arg Glu Arg Lys Ala Thr Lys Thr Leu Gly Ile Ile Leu 290 295 300
Gly Ala Phe Ile Thr Cys Trp Leu Pro Phe Phe Val Val Ser Leu Val 305 310 315 320
Leu Pro Ile Cys Arg Asp Ser Cys Trp Ile His Pro Ala Leu Phe Asp 325 330 335
Phe Phe Thr Trp Leu Gly Tyr Leu Asn Ser Leu Ile Asn Pro Val Ile 340 345 350
Tyr Thr Val Phe Asn Glu Glu Phe Arg Gin Ala Phe Gin Arg Val Val 355 360 365
His Val Arg Lys Ala Ser 370 374
Sequenzprotoko11
Sequenz Nr. 2: Nukleotidsequenz aus 1183 Nukleotiden, korrespon¬ diert mit der Aminosäureseqenz niedergelegt in Sequenz Nr.l
Strangform: Dσppelstrang
Topologie: Linear
Art des Moleküls: cDNA zur mRNA
Ursprüngliche Herkunft: Rattenhirn
Die für das in Sequenz Nr. 1 beschriebene Proteinkodierende Region beginnt mit Base 3 und endet mit Base 1124
CCATGTCCCC GCCAAACCAG TCACTGGAAG GCCTTCTCCA GGAGGCCTCC 50
AACAGATCCC TGAATGCTAC AGGGGCTTGG GACCCAGAGG TCCTGCAGGC 100
ACTCAGAATC TCCCTCGTGG TGGTCCTATC CATCATTACA CTGGCCACTG 150
TCCTCTCCAA TGCCTTCGTA CTTACCACCA TCCTGCTCAC CAAGAAGCTC 200
CATACCCCAG CCAACTATCT CATTGGCTCC TTGGCCACCA CCGACCTCCT 250
GGTTTCTATC TTGGTCATGC CCATCAGCAT AGCCTATACC ACCACCCGTA 300
CCTGGAACTT TGGCCAGATC CTGTGTGACA TCTGGGTGTC TTCTGACATC 350
ACATGCTGTA CGGCCTCCAT CCTGCATCTC TGTGTCATCG CTCTGGACAG 400
ATACTGGGCC ATCACCGATG CCCTGGAGTA CAGCAAGCGC CGGACCGCAG 450
GTCACGCGGC GGCCATGATT GCGGCCGTCT GGGCCATCTC CATCTGTATC 500
TCCATCCCAC CGCTCTTCTG GCGGCAGGCC ACGGCTCACG AGGAGATGTC 550
TGACTGCCTG GTGAACACAT CTCAGATTTC TTACACCATC TACTCGACCT 600
GTGGGGCCTT CTACATCCCA TCCATCTTGC TCATTATCCT GTATGGCCGC 650
ATATACGTGG CCGCCCGGAG TCGAATCCTG GACCCACCCT CCCTCTACGG 700
GAAGCGCTTC ACCACAGCAC AGCTTATCAC GGGCTCTGCG GGCTCTTCAC 750
TCTGCTCGCT CAACCCCAGC CTCCACGAGA GCCACACGCA CACAGTCGGT 800
TCCCCTCTTT TTTTCAACCA GGTGAAAATC AAGCTTGCTG ATAGCATCTT 850
AGAACGCAAG AGGATCTCTG CAGCCCGAGA AAGGAAAGCC ACTAAGACAT 900
TGGGCATCAT TCTGGGGGCC TTTATCACCT GCTGGCTGCC TTTCTTTGTG 950
GTATCCTTGG TCCTCCCCAT CTGCAGGGAC TCCTGTTGGA TCCACCCGGC 1000
CCTCTTTGAC TTCTTCACGT GGCTAGGTTA TTTAAACTCT CTCATTAACC 1050
CCGTCATCTA CACTGTGTTC AACGAAGAGT TTCGGCAAGC GTTTCAGAGG 1100
GTTGTCCATG TCCGGAAAGC CTCCTAGTGG GGATCCGTCG ACCTGCAGCC 1150
AAGCTTGGCG TAATCATGGT CATAGCTGTT TCC 1183

Claims

Patentansprüche
1. Ein gegebenenfalls glykosyliertes Polypeptid mit der im Sequenzprotokoll Sequenz Nr. 1 angegebenen Aminosäuresequenz sowie dessen durch Deletion, Substitution, Insertion,
Inversion, Addition oder Austausch von Aminosäuren erhält¬ liche Polypeptide mit vergleichbaren Bindungseigenschaften.
2. DNA-Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 kodieren.
3. Reko binantes DNA-Molekül, welches eine DNA-Sequenz nach Anspruch 2 enthält.
4. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3, das eine
DNA-Sequenz nach Anspruch 2 enthält, welche funktionell mit einer Expressions-Kontrollsequenz verbunden ist, die die Expression in geeigneten Wirtssystemen ermöglicht.
5. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 4, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die Expressions-Kontrollsequenz ein in E.coli wirksames Promotersystem, ein Promotersystem eines E.coli Bakteriophagen, eine Hefe Expressions-Kontrollsequenz oder eine andere eukaryontische Expressions-Kontrollsequenz ist.
6. Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 3, 4 oder 5 enthält.
7. Wirtsorganismus nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Bakterium, ein Pilz, eine tierische oder eine menschliche Zelle ist.
8. Gentechnisches Verfahren zur Herstellung des Polypeptides gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem geeigneten Wirtsorganismus DNA-Sequenzen zur Expression bringt, die für die Peptidsequenz nach Anspruch 1 kodiert.
9. Verwendung des nach Beispiel 8 hergestellten Polypeptids oder eines Wirtsorganismus nach Anspruch 7 zum Screening von Substanzen auf deren Fähigkeit, sich an das Polypeptid gemäß Anspruch 1 zu binden.
10. Verwendung des nach Beispiel 8 hergestellten Polypeptides zur Aufklärung der räumlichen Struktur des Polypeptids gemäß Anspruch 1 zum Zwecke des Designs von Arzneimitteln.
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